DE102005036542A1 - CTL prodrug - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit vorzugsweise antitumoralen und/oder immunmodulierenden Zytokineigenschaften, welches durch Prozessierung in vivo aktivierbar ist, umfassend eine C-terminale Region mit spezifischer biologischer Aktivität, an dessen N-terminalen Ende eine inhibitorische Region, eine Region mit einer Prozessierungsstelle und eine Region, die ein Makromolekül auf einer Zelloberfläche oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, angeordnet ist.The present invention relates to a polypeptide with preferably antitumor and / or immunomodulating cytokine properties, which can be activated by processing in vivo, comprising a C-terminal region with specific biological activity, at the N-terminal end of an inhibitory region, a region with a processing site and a region that selectively recognizes a macromolecule on a cell surface or a component of the extracellular matrix is arranged.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit vorzugsweise antitumoralen und/oder immunmodulierenden Zytokineigenschaften, welches durch Prozessierung in vivo aktivierbar ist, umfassend eine C-terminale Region mit spezifischer biologischer Aktivität, an dessen N-terminalen Ende eine inhibitorische Region, eine Region mit einer Prozessierungsstelle und eine Region, die ein Makromolekül auf einer Zelloberfläche oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, angeordnet ist.The The present invention relates to a polypeptide having preferably antitumoral and / or immunomodulatory cytokine properties by Processing in vivo is activatable comprising a C-terminal Region of specific biological activity at the N-terminal end an inhibitory region, a region with a processing site and a region containing a macromolecule on a cell surface or a component of the extracellular Matrix selectively recognizes, is arranged.

Der Einsatz von rekombinanten Liganden der TNF-Familie, z.B. TNF oder FasL (CD95L), zur Behandlung von beispielsweise Tumorerkrankungen ist bisher aufgrund von starken systemischen Nebenwirkungen, die als therapiebegrenzend anzusehen sind, stark eingeschränkt. So ist z.B. eine Behandlung mit TNF nur unter speziellen, aufwendigen Behandlungsprotokollen (z.B. mittels sog. "Isolated Limb Perfusion") bei sehr begrenzten Indikationen (Melanom/Sarkom-Metastasen der Extremitäten) mit Erfolg durchführbar. Aus diesen klinischen Daten kann man abschätzen, daß etwa eine 10- bis 100-fach höhere TNF-Dosis als die MTD (engl. "Maximum Tolerated Dose") zur anti-tumoralen Wirksamkeit erforderlich wäre, als es die massiven systemischen Nebenwirkungen zulassen würden. Behandlungskonzepte, die auf der Aktivierung von Fas, dem Rezeptor des FasL, beruhen, sind bisher keine versucht worden, da eine systemische Aktivierung dieses Rezeptors sehr schnell Apoptose in Hepatozyten induziert und so zu akutem, im Experimentaltier tödlich verlaufendem Leberversagen führt.Of the Use of recombinant ligands of the TNF family, e.g. TNF or FasL (CD95L), for the treatment of, for example, tumors So far, due to strong systemic side effects that as Therapy limiting are to be regarded, strongly limited. So is e.g. a treatment with TNF only under special, elaborate Treatment protocols (e.g., by so-called "Isolated Limb Perfusion") in very limited Indications (melanoma / sarcoma metastases of the extremities) with success feasible. From these clinical data one can estimate that about a 10 to 100-fold higher TNF dose as the MTD (Engl Tolerated can ") would be required for anti-tumoral efficacy, as it is the massive systemic Side effects would allow. Treatment concepts based on the activation of Fas, the receptor FasL, are so far no attempts have been made since a systemic Activation of this receptor very rapidly induces apoptosis in hepatocytes and thus to acute, in the experimental animal fatal liver failure leads.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die unerwünschten Folgen einer Behandlung mit therapeutisch wirksamen Polypeptidwirkstoffen, wie z.B. FasL- oder TNF-haltigen Substanzen, zu vermeiden oder zu vermindern, während gleichzeitig die therapeutisch wirksamen, beispielsweise antitumoralen Eigenschaften der aktiven Substanz, wie FasL oder TNF, beibehalten oder sogar verstärkt werden.Of the The present invention is therefore based on the object, the undesirable Consequences of treatment with therapeutically active polypeptide active ingredients, such as. FasL or TNF-containing substances to avoid or to diminish while at the same time the therapeutically effective, for example antitumoral properties the active substance, such as FasL or TNF, or even enhanced.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.These The object is achieved by the embodiments characterized in the claims solved the present invention.

Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bereitgestellt, umfassend von N- nach C-terminal

  • (1) eine Region („Inhibitor"), welche die biologische Aktivität der Region (4) durch intramolekulare oder intermolekulare Bindung und/oder Wechselwirkung hemmt,
  • (2) eine Region, die mindestens eine Prozessierungsstelle aufweist,
  • (3) eine Region(„Targeting-Modul"), die ein spezifisches Makromolekül auf einer Zelloberfläche und/oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, und
  • (4) eine Region („therapeutisch wirksame Region oder Substanz") mit einer biologischen Aktivität für ein spezifisches Zielmolekül,
wobei die biologische Aktivität der Region (4) durch Prozessierung in vivo der mindestens einen Prozessierungsstelle in Region (2) freisetzbar ist. Ohne Prozessierung der Region (2) bleibt die Aktivität der Region (4) inhibiert und das Polypeptid daher biologisch, z.B. im Sinne der Zytokinwirkung (beispielsweise der FasL oder TNF-Wirkung), inaktiv.In particular, the invention provides a polypeptide having an amino acid sequence comprising N- to C-terminal
  • (1) a region ("inhibitor") which inhibits the biological activity of the region (4) by intramolecular or intermolecular bonding and / or interaction,
  • (2) a region having at least one processing station,
  • (3) a region ("targeting module") that selectively recognizes a specific macromolecule on a cell surface and / or a component of the extracellular matrix, and
  • (4) a region ("therapeutically effective region or substance") having a biological activity for a specific target molecule,
wherein the biological activity of the region (4) is releasable by processing in vivo the at least one processing site in region (2). Without processing of the region (2), the activity of the region (4) remains inhibited and the polypeptide is therefore biologically inactive, eg in the sense of cytokine action (for example FasL or TNF action).

Die Begriffe „Region" und „Modul" werden im folgenden synonym verwendet. Der Begriff „Fragment" bezeichnet eine verkürzte Form eines Moleküls. Die Begriffe „Derivat" und „Mutante" bezeichnen jedes Derivat bzw, jede Mutante eines Moleküls, die im wesentlichen die gleiche funktionalen und/oder biologischen Eigenschaften des Moleküls aufweisen. In Bezug auf Nukleinsäuren können Derivate bzw. Mutanten Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Basen enthalten, deren Abwesenheit, Anwesenheit oder Substitution keinen wesentlichen Einfluß auf die Akti vität des Genprodukts hat, beispielsweise Basen, die in einem transkriptionell inaktiven Teil einer Nukleotidsequenz liegen. Dies schließt auch Derivate und Mutanten ein, welche bei unterschiedlicher Nukleotidsequenz die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen, die zu einer geringfügigen Steigerung oder Verringerung der Transkriptionsrate führen, sind ebenfalls mit eingeschlossen. In Bezug auf Aminosäuresequenzen können Derivate bzw. Mutanten Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren enthalten, deren Abwesenheit, Anwesenheit oder Substitution keinen wesentlichen Einfluß auf die Aktivität des Polypeptids hat, beispielsweise konservative Substitutionen von Aminosäuren, d.h. Ersetzen von Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften. Der Begriff „Derivat" schließt auch post-translationale Modifikationen, wie beispielsweise zum Wildtyp unterschiedliche Glykosylierungsmuster, ein.The Terms "region" and "module" are hereafter used synonymously. The term "fragment" refers to a truncated form of a molecule. The terms "derivative" and "mutant" refer to each Derivative, or each mutant of a molecule, which is essentially the have the same functional and / or biological properties of the molecule. In Terms of nucleic acids can Derivatives or mutants deletions, additions and / or substitutions of bases, their absence, presence or substitution no significant influence the activity of the gene product has, for example, bases that are transcriptional inactive part of a nucleotide sequence. This also includes Derivatives and mutants, which at different nucleotide sequence the same amino acid sequence encode. Deletions, additions and / or substitutions that belong to a slight increase or reduction in transcription rate are also included. In terms of amino acid sequences can Derivatives or mutants deletions, additions and / or substitutions of amino acids whose absence, presence or substitution does not exist significant influence the activity of the polypeptide, for example conservative substitutions of amino acids, i.e. Replacing amino acids by amino acids with similar ones chemical properties. The term "derivative" also includes post-translational Modifications, such as different from the wild type Glycosylation pattern, a.

Erfindungsgemäße Polypeptide werden nachstehend auch allgemein als "C-terminal TNF family Ligand (CTL)-Prodrug" bezeichnet. Sind im nachfolgenden erfindungsgemäße Polypeptide gemeint, in denen die Region (4) aus einem bestimmtem Liganden der TNF-Familie, z.B. dem FasL oder TNF abgeleitet ist, so werden diese entsprechend dieser Region benannt. Besteht die Region (4) z.B. aus einem FasL-Derivat so wird das erfindungsgemäße Polypeptid als FasL-Prodrug bezeichnet. Die erfindungsgemäßen CTL-Prodrugs sind modular aufgebaute Wirkstoffe und gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein vorzugsweise homotrimeres oder homohexameres Fusionsprotein mit beispielsweise einem Zytokin als antitumoral wirksamer Substanz in Region (4), welches seine biologische Wirkung durch Verknüpfung mit drei weiteren Funktionsmodulen gezielt im erkrankten Gewebe, z.B. einem Tumorareal, freisetzt. Dies wird erreicht durch gentechnisches Anknüpfen der therapeutisch wirksamen Substanz, z.B. des FasL-Moleküls, an den C-Terminus eines für das Zielgewebe spezifischen Targeting-Moduls (3), z.B. tumorspezifische Antikörper oder Derivate davon, wie scFv-Antikörper, dem N-terminal durch eine prozessierbare Region (2) ein Inhibitor (1) gegen die therapeutisch wirksame Substanz (4) vorangeht, welcher selektiv im Zielgewebe, wie z.B. dem Tumorareal, durch Prozessierung der Region (2) inaktiviert wird, vorzugsweise durch gezielte proteolyti sche Abspaltung aus dem Fusionsprotein entfernt wird, und so ein am selektiven Targeting-Modul gebundener, bioaktiver Wirkstoff, z.B. FasL, entsteht.Polypeptides of the invention will also be referred to hereinafter generally as the "C-terminal TNF family ligand (CTL) prodrug". If in the following polypeptides according to the invention are meant in which the region (4) is derived from a particular ligand of the TNF family, for example the FasL or TNF, these are named corresponding to this region. Is the region (4) eg from a FasL derivative so the polypeptide of the invention is referred to as FasL prodrug. The CTL prodrugs according to the invention are modular active compounds and, according to a particularly preferred embodiment, a preferably homotrimeric or homohexameric fusion protein with, for example, a cytokine as antitumoral active substance in region (4), which specifically targets its biological activity in the diseased tissue by linking with three further functional modules, eg a tumor area, releases. This is achieved by genetically linking the therapeutically active substance, for example the FasL molecule, to the C terminus of a targeting tissue-specific targeting module (3), eg tumor-specific antibodies or derivatives thereof, such as scFv antibodies, N-terminally preceded by a processable region (2) an inhibitor (1) against the therapeutically active substance (4) which is selectively inactivated in the target tissue, such as the tumor area, by processing the region (2), preferably by targeted proteolytic cleavage from the Fusion protein is removed, and so bound to the selective targeting module, bioactive agent, such as FasL arises.

Das beispielsweise als therapeutisch wirksame Substanz einsetzbare Zytokin ist vorzugsweise ein Ligand der TNF-Familie, besonders bevorzugt FasL, TNF, TRAIL, CD40L, LIGHT oder APRIL oder ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante dieser Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor (1) ein Peptid-Inhibitor, vorzugsweise eine extrazelluläre Domäne des zur Region (4) korrespondierenden Rezeptors. Der C-Terminus von Liganden der TNF-Familie kann für die optimale Aktivität des Moleküls sehr wichtig sein. Nach der Fusion von Peptiden an den C-Terminus ist die Aktivität dieser Zytokine daher oft sehr stark eingeschränkt. Dies gilt insbesondere für den FasL. Das CTL-Prodrug-Prinzip hat daher u.a. den Vorteil, daß bei der Konstruktion der Prodrug der C-Terminus der eigentlichen biologischen Wirkkomponente des Fusionsproteins frei bleibt und so nach der Prozessierung ein Zytokin-Derivat mit maximaler Aktivität entstehen kann.The For example, as a therapeutically effective substance usable cytokine is preferably a ligand of the TNF family, more preferably FasL, TNF, TRAIL, CD40L, LIGHT or APRIL or a biologically active Derivative or a biologically active mutant of these molecules. In a preferred embodiment In the present invention, the inhibitor (1) is a peptide inhibitor, preferably an extracellular domain of the receptor corresponding to the region (4). The C-terminus of ligands the TNF family can be used for the optimal activity of the molecule be very important. After the fusion of peptides to the C-terminus is the activity Therefore, these cytokines are often very severely restricted. This is especially true for the FasL. The CTL prodrug principle has therefore u.a. the advantage that in the construction the prodrug the C-terminus of the actual biological active component remains free of the fusion protein and so after processing a cytokine derivative with maximum activity can arise.

Viele Antikörperdomänen aggregieren spontan. Die Herstellung von Antikörper-Zytokin Fusionsproteinen nach dem Stand der Technik führt deshalb typischerweise häufig auch zur Aggregation des Fusionsproteins. Bei Verwendung von FasL im Zytokinmodul bewirkt diese Aggregation eine konstitutive Aktivierung des FasL, was eine ungerichtete, d.h. potentiell systemische Aktivität des betreffenden Fusionsproteins und damit gravierende Nebenwirkungen nach sich zieht. Das CTL-Prodrug-Prinzip hat daher u.a. den Vorteil, daß zur Konstruktion von Prodrugs mit freiem Liganden C-Terminus auch aggregierende Antikörperdomänen verwendet werden können.Lots Aggregate antibody domains spontaneous. The preparation of antibody-cytokine fusion proteins according to the state the technology leads therefore typically common also for the aggregation of the fusion protein. When using FasL In the cytokine module, this aggregation causes constitutive activation FasL, which is an undirected, i. potentially systemic activity of the subject Fusion protein and thus serious side effects. The CTL prodrug principle therefore has u.a. the advantage that to Construction of prodrugs with free ligand C-terminus also used aggregating antibody domains can be.

Mit dem erfindungsgemäßen Prodrug-Aufbau wird es ermöglicht, lokal hohe Wirkkonzentrationen der therapeutisch wirksamen Substanz, z.B. des FasL, zu erreichen, ohne daß es zu systemisch erhöhten Therapeutikum-Spiegeln (z.B. FasL im Serum) und damit therapielimitierenden Nebenwirkungen kommt. Insbesondere wird beispielsweise im Fall von FasL als therapeutisch wirksamer Region nach der Prozes sierung durch die Targeting-Modul- (z.B. Antikörper-) vermittelte zellständige Präsentation des FasL eine Wirkung erzielt, die der des natürlichen Membran-FasL entspricht, d.h. es kommt zur optimalen Aktivierung von Fas. Die differentielle biologische Wirkung löslicher und membranständiger Liganden einiger Mitglieder der TNF Familie, v.a. FasL, TNF, TRAIL, CD40, ist bekannt und hängt mit der Affinität der verschiedenen Formen der Liganden zu ihren Rezeptoren, der unterschiedlichen Bindung an Rezeptorsubtypen und/oder der unterschiedlichen Fähigkeit zur Rezeptor-Clusterbildung in der Membran und damit Aktivierung der Signalprozesse zusammen.With the prodrug structure according to the invention is it possible locally high active concentrations of the therapeutically active substance, e.g. FasL, without causing systemically elevated therapeutic levels (for example FasL in serum) and thus therapy-limiting side effects comes. In particular, in the case of FasL, for example, it is considered therapeutic effective region after being processed by the targeting module (e.g., antibody) mediated cellular presentation the FasL achieves an effect similar to that of the natural membrane FasL, i.e. Optimal activation of Fas occurs. The differential biological effect more soluble and membrane-bound Ligands of some members of the TNF family, v.a. FasL, TNF, TRAIL, CD40, is known and hangs with the affinity of different forms of ligands to their receptors, the different ones Binding to receptor subtypes and / or different ability for receptor clustering in the membrane and thus activation the signal processes together.

Durch Auswahl der Spezifität des Targeting-Moduls (3) und der Prozessierungsregion (2) kann ein auf die jeweilige Tumorentität spezifisch abgestimmtes/optimiertes Therapeutikum hergestellt werden. Durch die Herstellung einer CTL-Prodrug mit freiem C-Terminus, die sich im gewünschten Zielort durch einen Antikörperanteil anreichern lässt und dort durch Proteolyse aktiviert wird, wird eine lokale Aktivierung des entsprechenden Liganden und damit des zu diesem korrespondierenden Rezeptors in vivo ermöglicht. Die Aktivierung erfolgt dabei durch zellassoziierte Proteasen, die insbesondere am gewünschten Zielort vorkommen. Die lokale Aktivität wird dann zum einen durch die Spezifität des verwendeten Antiköpers bedingt, zum anderen aber auch durch die bevorzugte Expression entsprechender Proteasen am Zielort.By Selection of specificity of the targeting module (3) and the processing region (2) can be to the respective tumor entity specifically tailored / optimized therapeutic agent are produced. By preparing a CTL prodrug with free C-terminus, the in the desired Destination by an antibody portion enriched and there is activated by proteolysis, becomes a local activation the corresponding ligand and thus the corresponding to this Receptor in vivo allows. The activation takes place by cell-associated proteases, the especially at the desired Destination occur. The local activity is then on the one hand the specificity of the antibody used conditionally, but also by the preferred expression corresponding Proteases at the destination.

Die (Aminosäuresequenz-)Regionen bzw. Module des erfindungsgemäßen Polypeptids werden nachstehend in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen im Einzelnen beschrieben.The (Amino acid sequence) regions or modules of the polypeptide according to the invention are described in detail below with respect to preferred embodiments.

Das erfindungsgemäße Polypeptid basiert auf einer neuartigen Prodrug-Technologie und ist ein Konstrukt, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein rekombinantes Fusionsprotein ist, welches prinzipiell eine definierte Abfolge der folgenden Strukturelemente (im Monomer) umfaßt (N-terminal nach C-terminal): (1) ein spezifisch an die Region (4) bindendes und diese inaktivierendes Protein bzw. Peptid, (2) ein variables Linkerpeptid mit spezifischen Protease-Spaltstellen, (3) ein murines, humanisiertes oder humanes Einzelkettenantikörperfragment (scFv) definierter Anti genspezifität, bestehend aus VH-Linker-VL oder ein Peptid mit vergleichbarer Eigenschaft, und (4) einen Ligand der TNF-Familie, welcher beispielsweise dem Wildtyp-Ligand oder dessen extrazellulärer Domäne oder davon abgeleiteten biologisch aktiven Varianten entspricht.The polypeptide of the invention is based on a novel prodrug technology and is a construct which, according to a preferred embodiment, is a recombinant fusion protein which comprises in principle a defined sequence of the following structural elements (in the monomer) (N-terminal to C-terminal): (1 (2) a variable linker peptide having specific protease cleavage sites, (3) a murine, humanized or human single chain antibody fragment (scFv) of defined anti-gageneity, consisting of: (3) a protein or peptide specifically binding to and inactivating the region (4) V H -linker V L or a peptide with comparable property, and (4) a ligand of the TNF family which corresponds, for example, to the wild-type ligand or its extracellular domain or biologically active variants derived therefrom.

Das Inhibitor-Modul (1) ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids ein Rezeptor bzw. dessen Ligandenbindungsdomäne für den Zytokinteil im Modul (4). Das Inhibitor-Modul weist bevorzugt mindestens eine Bindungsstelle für die therapeutisch wirksame Region (4) auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Inhibitor-Modul im Falle der Verwendung von FasL in Region (1) die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines humanen Fas-Rezeptors. Andere, spezifisch FasL bindende Proteine, beispielsweise Fas-Fragmente oder Fas anderer Spezies-Herkunft oder Proteine viralen Ursprungs sowie jeweils davon abgeleitete synthetische Peptide, die FasL-Bindungseigenschaft besitzen und mit der FasL-Bindung an Fas-Rezeptoren interferieren, sind ebenfalls geeignet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Zytokin-Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines Rezeptors der TNF-Rezeptorfamilie und/oder ein TNF-Ligand-bindendes Virus-Protein oder eine biologisch aktive Mutante dieser Domäne oder eine synthetische TNF-Ligand-bindende Verbindung. Aufgrund der Bindung bzw. Wechselwirkung des Inhibitors mit dem therapeutisch wirksamen Modul ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein in diesem Zustand biologisch inaktiv, d.h. es befindet sich in der Proform (Prodrug).The Inhibitor module (1) is in accordance with a preferred embodiment of the polypeptide of the invention a receptor or its ligand binding domain for the cytokine part in the module (4). The inhibitor module preferably has at least one binding site for the therapeutically effective region (4). In a preferred embodiment of the present invention the inhibitor module in case of using FasL in region (1) the complete or partial extracellular domain a human Fas receptor. Other, specifically FasL binding proteins, for example Fas fragments or Fas of other species origin or Proteins of viral origin and synthetic derived therefrom Peptides, the FasL binding property and interfere with FasL binding to Fas receptors, are also suitable. In a further preferred embodiment In the present invention, the cytokine receptor is the full or partial extracellular domain a receptor of the TNF receptor family and / or a TNF ligand-binding Virus protein or a biologically active mutant of this domain or a synthetic TNF ligand-binding compound. Because of the bond or interaction of the inhibitor with the therapeutically effective Module is the fusion protein according to the invention biologically inactive in this state, i. it is in the proform (Prodrug).

Das Prozessierungsmodul (2) ist beispielsweise Protease-sensitiv (d.h. die Prozessierungsstelle entspricht der Erkennungssequenz einer Protease) und vorzugsweise in Aminosäurezusammensetzung und Gesamtlänge derart beschaffen, daß es eine hochaffine, stabile Bindung des im Molekül N-terminal befindlichen Moduls (1), z.B. eines FasL-Inhibitors (z.B. die extrazelluläre Fas-Rezeptordomäne) an die Region (4), z.B. FasL erlaubt, so daß hierdurch die Bindung des Liganden-Anteils des Moduls (4) an die zu diesem Liganden korrespondierenden, zellexprimierten Rezeptoren in vivo verhindert wird. Das Prozessierungsmodul („Linker") ist weiterhin vor zugsweise derart beschaffen, daß er mindestens eine, vorzugsweise mehrere selektive Spaltstellen für solche extrazellulären oder zellassozierten Proteasen enthält, die vorzugsweise selektiv im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Beispiele für geeignete Spaltstellen sind diejenige für Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogenaktivator (tPA), den aktivierten Gerinnungsfaktor VIIa, Matrix-Metalloproteasen, wie MMP-2 und MMP-9, und für die hochselektiv im Stroma von Tumoren membranständig exprimierte FAP-Protease. Besonders bevorzugte Protease-sensitive Spaltstellen sind diejenige von mit dem Vorgang der Metastasierung und der Angiogenese in Verbindung stehenden Matrix-Metalloproteasen (z.B. MMP-9-Erkennungssequenz Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys), von Heparanase, von Enzymen, die bevorzugt in nekrotischen Läsionen auftreten, sowie von Enzymen, die mit Prostatakrebs assoziiert sind (z.B. PSMA, PSA, spaltbares Prozessierungsmodul Glutaryl-(4-hydroxypropyl)-Ala-Ser-cyclohexaglycyl-Gln-Ser-Leu-COOH). Die Struktur des Linkers wird derart gewählt, daß die Protease-Erkennungssequenz frei zugänglich ist, d.h. eine effektive Prozessierung durch spezifische Proteasen möglich ist, und nach Spaltung des Fusionsproteins ggf. an dem abgespaltenen Teil, der das therapeutisch wirksamen Modul enthält, verbleibende Aminosäuren des Linkers die Bioaktivität der therapeutisch wirksamen Region nicht negativ beeinflussen.The Processing module (2) is, for example, protease-sensitive (i.e. the processing station corresponds to the recognition sequence of a Protease) and preferably in amino acid composition and total length so get that one high-affinity, stable binding of the N-terminal module in the molecule (1), e.g. a FasL inhibitor (e.g., the extracellular Fas receptor domain) to the Region (4), e.g. FasL allows, so that thereby the binding of the Ligand portion of the module (4) to the corresponding to this ligand, cell-expressed receptors in vivo is prevented. The processing module ("Linker") is still preferably before in such a way that he at least one, preferably a plurality of selective cleavage sites for such extracellular or cell-associated proteases, which are preferably selective be detected in tumor tissue. Examples of suitable cleavage sites are the one for Urokinase-type plasminogen activator (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), the activated coagulation factor VIIa, matrix metalloproteases, like MMP-2 and MMP-9, and for the highly selectively in the stroma of tumors membrane-bound expressed FAP protease. Particularly preferred protease-sensitive cleavage sites are those of the process of metastasis and angiogenesis standing matrix metalloproteases (e.g., MMP-9 recognition sequence Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys), of heparanase, of enzymes that preferentially occur in necrotic lesions, and enzymes associated with prostate cancer (e.g., PSMA, PSA, fissionable processing module glutaryl- (4-hydroxypropyl) -Ala-Ser-cyclohexaglycyl-Gln-Ser-Leu-COOH). The structure of the linker is chosen such that the protease recognition sequence freely accessible is, i. effective processing by specific proteases possible and after cleavage of the fusion protein, optionally at the cleaved Part containing the therapeutically effective module, remaining amino acids of the Linker's bioactivity therapeutically effective region.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polypeptid zusätzlich ein Trimerisierungsmodul zwischen dem Inhibitor-Modul (1) und dem Prozessierungsmodul (2) oder zwischen dem Prozessierungsmodul (2) und dem Targeting-Modul (3) auf. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Trimerisierungsmodul ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften. Ein besonders geeignetes Beispiel eines derartigen Peptids ist eine Domäne des Tenascin-Moleküls (AA 110-139, Swissprot #P10039, (Huhn) oder Swissprot #P24821 (Mensch)). Es gewährleistet die kovalente, homotrimere Verknüpfung des Fusionsproteins während der Biogenese und kann die Bindung des Inhibitor Moduls (1) an das therapeutisch wirksame Modul (4) verbessern. Die Liganden der TNF-Familie, insbesondere auch der FasL, haben intrinsische Trimerisierungseigenschaften. Eine optionale Trimerisierungsregion dient da her hauptsächlich dazu, Ligandentrimere zu stabilisieren. Wie wichtig eine Stabilisierung für den Erhalt der trimeren, potentiell aktiven Form ist, hängt vom Einzelfall ab.In a preferred embodiment has the polypeptide of the invention additionally a trimerization module between the inhibitor module (1) and the Processing module (2) or between the processing module (2) and the targeting module (3). According to a particularly preferred embodiment comprises the trimerization module is natural occurring or synthetic peptide having intrinsic trimerization properties. A particularly suitable example of such a peptide is one domain of the tenascin molecule (AA 110-139, Swissprot # P10039, (chicken) or Swissprot # P24821 (human)). It guarantees the covalent, homotrimeric linkage of the Fusion protein during biogenesis and can bind the inhibitor module (1) to the therapeutically effective module (4) improve. The ligands of the TNF family, especially the FasL, have intrinsic trimerization properties. An optional trimerization region is therefore mainly used to Stabilize ligand trimer. How important stabilization for the Preservation of the trimeric, potentially active form depends on Isolated case.

Das Targeting-Modul (3) bindet vorzugsweise an ein Zelloberflächenmolekül, das in Tumorläsionen und/oder proliferierenden Endothelzellen, die mit dem Prozeß der Angiogenese assoziiert sind, exprimiert wird. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting-Modul (3) für eine Komponente der extrazellulären Matrix spezifisch, die in Tumorläsionen und/oder Angiogenesebereichen pathologischer Läsionen vorhanden ist. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting-Modul (3) für eine Komponente der malignen Tumorzelle selbst spezifisch. Vorzugsweise umfaßt die Region bzw. das Modul (3) einen Antikörper (z.B. murin, humanisiert oder human) oder ein Fragment davon, z.B. ein Fab-Fragment oder ein typisches, nach dem Stand der Technik hergestelltes Einzelkettenantikörperfragment (scFv) murinen, durch CDR-Grafting humanisierten oder vollständig humanen Ursprungs mit einer Spezifität für ein z.B. im Tumorgewebe vorzugsweise selektiv bzw. dominant exprimiertes Antigen, wobei dies prinzipiell auf den malignen Zellen selbst exprimiert sein kann, vorzugsweise aber im nicht-malignen Anteil des Tumors, den Stromazellen oder dem Tumorendothel, exprimiert wird. Derartige Antigene nicht-maligner Gewebeanteile eines soliden Tumors (Karzinoms) sind einerseits genetisch invariant, andererseits bei unterschiedlichsten Tumorentitäten vorkommend und damit universelle Tumormarker. Beispielsweise seien hier der VEGFR- bzw. der VEGFR/VEGF-Komplex (als Beispiel für Rezeptor-Liganden-Komplexe) sowie das Integrin αvβ3, das Endosialin und die Fibronektin-Isoform bFn als selektive Zielstrukturen des Tumorendothels und das sog. Fibroblast Activation Protein (FAP) als selektiver Marker für eine als Target dienende Komponente der extrazellulären Matrix, welche im Tumorstroma vorhanden ist, genannt, die beispielsweise mit spezifischen, hochaffinen scFv wirksam erfaßt werden können. Weitere Beispiele für geeignete Targeting-Module sind Peptide bzw. Proteindomänen, die z.B. natürlicherweise an eine Tumor- bzw. Tumorstroma- bzw. Tumorendothel-typische Struktur binden, aber auch artifizielle Antikörper und Spiegelmere.The targeting module (3) preferably binds to a cell surface molecule that is expressed in tumor lesions and / or proliferating endothelial cells associated with the process of angiogenesis. In another preferred embodiment, the targeting module (3) is specific for a component of the extracellular matrix present in tumor lesions and / or angiogenesis regions of pathological lesions. According to another preferred embodiment, the targeting module (3) is specific for a component of the malignant tumor cell itself. Preferably, the region or module (3) comprises an antibody (eg murine, humanized or human) or a fragment thereof, eg a Fab fragment or a typi In other words, a single-chain antibody fragment (scFv) produced by the prior art may be murine, CDR-grafted or completely human with specificity for, for example, an antigen which is preferentially or predominantly expressed in tumor tissue, and this may in principle be expressed on the malignant cells themselves , but preferably in the non-malignant portion of the tumor, the stromal cells or the tumor endothelium. Such antigens of non-malignant tissue portions of a solid tumor (carcinoma) are on the one hand genetically invariant, on the other hand occurring in a wide variety of tumor entities and thus universal tumor markers. Examples include the VEGFR or VEGFR / VEGF complex (as an example of receptor-ligand complexes) and the integrin αvβ3, the endosialin and the fibronectin isoform bFn as selective target structures of the tumor endothelium and the so-called fibroblast Activation Protein ( FAP) as a selective marker for a targeting component of the extracellular matrix present in the tumor stroma, which can be efficiently detected, for example, with specific, high affinity scFv. Further examples of suitable targeting modules are peptides or protein domains which, for example, naturally bind to a tumor or tumor stroma or tumor endothelium-typical structure, but also to artificial antibodies and spiegelmers.

Wie vorstehend ausgeführt, enthält das therapeutisch wirksame Modul (4) vorzugsweise eine Aminosäuresequenz eines Zytokins oder eines therapeutisch wirksamen Fragments davon. Vorzugsweise enthält die Region (4) die Aminosäuresequenz eines Liganden der TNF-Familie, vorzugsweise von FasL, mehr bevorzugt eines TNF-Liganden-Vorläuferproteins, vorzugsweise eines FasL-Vorläuferproteins, besonders bevorzugt von einem dem prozessierten, reifen Wildtyp-TNF-Liganden-Molekül identischen Protein oder davon abgeleiteten Derivaten oder Mutanten mit selektiven Rezeptorbindungseigenschaften oder Mutanten bzw. Derivaten, die hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften (Stabilität, Proteaseresistenz) optimiert wurden, und am meisten bevorzugt von einem dem prozessierten, reifen Wildtyp-FasL-Molekül identischen Protein, oder davon abgeleiteten Derivaten oder Mutanten mit selektiven Rezeptorbindungseigenschaften oder Mutanten bzw. Derivaten, die hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften (Stabilität, Proteaseresistenz) optimiert wurden.As stated above, contains the therapeutically active module (4) preferably an amino acid sequence a cytokine or a therapeutically effective fragment thereof. Preferably contains the region (4) the amino acid sequence of a Ligands of the TNF family, preferably FasL, more preferred a TNF ligand precursor protein, preferably a FasL precursor protein, particularly preferably identical to the processed, mature wild-type TNF ligand molecule Protein or derived derivatives or mutants with selective Receptor binding properties or mutants or derivatives that in terms of their specific bioactivity or other properties (Stability, Protease resistance), and most preferably from identical to the processed, mature wild-type FasL molecule Protein, or derived derivatives or mutants with selective Receptor binding properties or mutants or derivatives that in terms of their specific bioactivity or other properties (Stability, Protease resistance).

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann weitere Regionen umfassen. Beispielsweise können zur vereinfachten Reinigung des rekombinant hergestellten Proteins und der in vitro Analytik geeignete Markierungssequenzen angefügt werden. So kann das erfindungsgemäße Polypeptid z.B. am N-Terminus und/oder zwischen zwei benachbarten Regionen mindestens eine detektierbare Markierung aufweisen. Eine solche detektierbare Markierung kann ein „tag", z.B. zur Reinigung, sein, z.B. ein Flag tag.The polypeptide of the invention may include other regions. For example, for simplified cleaning recombinantly produced protein and in vitro analysis appropriate labeling sequences are added. Thus, the polypeptide of the invention e.g. at the N-terminus and / or between two adjacent regions at least have a detectable label. Such a detectable Marking may be a "day", for example for cleaning, be, e.g. a flag day.

Die erfindungsgemäß bevorzugte FasL-Prodrug ist ein nicht kovalent verknüpftes, homotrimeres Molekül oder, wenn eine entsprechende Trimersierungsregion eingefügt wurde, ein kovalent verknüpftes, homotrimeres Molekül, oder bei intermolekularer Wechselwirkung ein homohexameres Molekül bestehend aus der oben im Detail erläuterten Fusion von vier Funktionsregionen, dem tumorspezifischem Antikörpermodul (3), dem FasL-Modul (4) und dem blockierendem FasL-Bindeprotein (extrazelluläre Rezeptordomäne oder davon abgeleitetes Peptid)-Modul (1) sowie dem zwischen Modul (1) und Modul (3) liegenden spezifischen Protease-Spaltstellen Modul (2), welches in diesem kompletten Zustand in Bezug auf die FasL-Wirkung inaktiv ist.The according to the invention preferred FasL prodrug is a non-covalently linked, homotrimeric molecule or, if a corresponding trimerization region has been inserted, a covalently linked, homotrimeric molecule, or in the case of an intermolecular interaction, a homohexameric molecule from the above explained in detail Fusion of four functional regions, the tumor-specific antibody module (3), the FasL module (4) and the blocking FasL binding protein (Extracellular receptor domain or derived peptide) module (1) and the between module (1) and module (3) specific protease cleavage module (2), which in this complete state in terms of FasL effect is inactive.

Die FasL-Prodrug wird nach in vivo Verabreichung durch den Antikörper-Anteil zunächst spezifisch im Tumorareal angereichert und dort durch die vom Tumor selbst oder vom reaktiven Tumorstroma/Tumorgefäßsystem gebildete Proteasen (z.B. FAP, uPA, tPA, MMP2, Faktor VIIa) prozessiert, d.h. das inhibierende Modul/Peptid (1) wird abgespalten. Nach selektiver proteolytischer Spaltung dissoziiert das FasL-Rezeptor-Fragment/Inhibitorpeptid vom FasL-Modul (4), letzteres wird somit bioaktiv (d.h. die biologische Aktivität der Region wird durch Prozessierung der Prozessierungsstelle in Region (2) freigesetzt). Der derart prozessierte FasL bindet nun bevorzugt an zellständige Fas-Rezeptoren, da diese sich nicht durch Diffusion vom Bindungsort entfernen. Die Selektivität der FasL-Wirkung wird mit der erfindungsgemäßen FasL-Prodrug also durch zwei Maßnahmen erreicht: Einerseits über die Region (3)-vermittelte selektive Anreicherung der inaktiven Prodrug im Tumor und der Retention des biologisch aktiven Fragments, bestehend aus Region (3) und Region (4), auch nach proteolytischer Aktivierung und andererseits über die ortsspezifische Umwandlung des Prodrugs durch Proteasen, welche ausschließlich oder bevorzugt im Tumorareal in signifikanter Aktivität nachweisbar sind.The FasL prodrug becomes in vivo administration by the antibody portion first specifically enriched in the tumor area and there by the tumor or proteases formed by the reactive tumor stroma / tumor vasculature (e.g., FAP, uPA, tPA, MMP2, Factor VIIa), i. the inhibiting Module / peptide (1) is cleaved off. After selective proteolytic Cleavage dissociates the FasL receptor fragment / inhibitor peptide from the FasL module (4), the latter thus becomes bioactive (i.e. activity The region is being processed by processing the processing center in Region (2) released). The thus processed FasL now binds preferred to cellular Fas receptors, as these are not diffused from the binding site remove. The selectivity the FasL effect is thus carried out with the FasL prodrug according to the invention two measures achieved: on the one hand over the region (3) -mediated selective enrichment of the inactive Prodrug in the tumor and the retention of the biologically active fragment, consisting of region (3) and region (4), also proteolytic Activation and on the other hand over the site-specific conversion of the prodrug by proteases, which exclusively or are preferably detectable in the tumor area in significant activity.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das CTL-Prodrug die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 auf.In a preferred embodiment In the present invention, the CTL prodrug has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert. Der Begriff „Nukleinsäure" bedeutet ein natives, halbsynthetisches, synthetisches oder modifiziertes Nukleinsäuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 2 auf.Another object of the present invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide of the invention. The term "nucleic acid" means a native, semisynthetic, synthetic or modified nucleic acid molecule of deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides and / or modified nucleotides In a preferred embodiment In accordance with the present invention, the nucleic acid has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind.Furthermore becomes a vector according to the invention, containing the above-defined nucleic acid. The vector according to the invention is not subject to any particular restriction, with suitable vectors are known in the art.

Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden.Of the Vector is preferably for expression and / or amplification in a prokaryotic and / or eukaryotic cell. To contains the vector preferably contains suitable regulatory elements, such as promoters, Enhancers, termination sequences, etc. The vector may also be stable Integration of the nucleic acid according to the invention in the genetic material of a host cell.

Ein weiterer Gegenstand betrifft erfindungsgemäß eine Wirtszelle, enthaltend die vorstehend genannte Nukleinsäure und/oder den vorstehend genannten Vektor. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise alle Säugerzellen, insbesondere kultivierte Zellinien wie z.B. COS- oder CHO-Zellen.One Another subject of the invention relates to a host cell containing the aforementioned nucleic acid and / or the aforementioned vector. Suitable host cells For example, all mammalian cells, in particular cultured cell lines, e.g. COS or CHO cells.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, umfassend die Schritte

  • (a) des Züchtens der vorstehenden Wirtszelle in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen und
  • (b) des Isolierens des erfindungsgemäßen Polypeptids aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.
The present invention also provides a method of producing the polypeptide of the invention comprising the steps
  • (A) growing the above host cell in a culture medium under suitable conditions and
  • (b) isolating the polypeptide of the invention from the host cells and / or the culture medium.

Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe von geeigneten Expressionssystemen, vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer, stabiler Transfektanden der Zellinie CHO DG44 oder nach transienter Expression in COS7-Zellen, hergestellt. Andere, dem Stand der Technik entsprechende eukaryontische Expressionssysteme, z.B. Pichia pastoris, Insekten- oder Säugerzellen, mit den für das jeweilige Zellsystem für Sekretion geeigneten Expressionsvektoren, werden z.B. in Brocks et al. (Immunotechnology 3:173-184,1997) für Säuger- und Insektenzellen beschrieben. pPICZalpha-Vektoren (INVITROGEN) zur Expression und Sekretion in der Hefe Pichia pastoris, sind ebenfalls geeignet.The polypeptide of the invention is preferably expressed by expression with the aid of suitable expression systems, preferably selectable as a secreted product, more stable Transfectants of the cell line CHO DG44 or after transient expression in COS7 cells. Other, according to the prior art eukaryotic expression systems, e.g. Pichia pastoris, insect or mammalian cells, with the for the respective cell system for Secretion of suitable expression vectors, e.g. in Brocks et al. (Immunotechnology 3: 173-184, 1997) for mammalian and insect cells. pPICZalpha vectors (INVITROGEN) for expression and secretion in the yeast Pichia pastoris, are also suitable.

Das erfindungsgemäße Polypeptid, die Nukleinsäure und/oder der Vektor kann (können) vorteilhafter Weise zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammenset zungen zur Behandlung krankhafter Störungen beispielsweise von Tumorerkrankungen in einem Individuum/Patient verwendet werden.The polypeptide of the invention, the nucleic acid and / or the vector can (can) Advantageously for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of pathological disorders for example, of tumor diseases in an individual / patient be used.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in pharmazeutisch wirksamer Menge das erfindungsgemäße Polypeptid und/oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder den erfindungsgemäßen Vektor, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder Trägern. Die pharmazeutische Zusammensetzung dient vorzugsweise zur therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Infektionskrankheiten und/oder metabolischen Erkrankungen. Besonders bevorzugte Einsatzgebiete der pharmazeutischen Zusammensetzung sind die Behandlung solider Tumoren sowie die Angiogenese in pathologischen Läsionen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann jegliche im vorliegenden Fachgebiet als geeignet bekannte Form annehmen. Vorzugsweise ist sie fest, flüssig oder aerosolartig.A another embodiment The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition, containing in a pharmaceutically effective amount the polypeptide of the invention and / or the nucleic acid according to the invention and / or the vector of the invention, optionally in conjunction with one or more pharmaceutically acceptable Excipients, diluents and / or carriers. The pharmaceutical composition is preferably for therapeutic use Treatment of cancers and / or infectious diseases and / or metabolic diseases. Particularly preferred applications the pharmaceutical composition are the treatment solid Tumors and angiogenesis in pathological lesions. The inventive pharmaceutical Composition may be any suitable in the art take known form. Preferably, it is solid, liquid or of an aerosol.

Die vorliegende Erfindung umfaßt somit ebenfalls ein Behandlungsverfahren, welches die Verabreichung einer therapeutisch ausreichenden Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen die Behandlung benötigenden Patienten einschließt. Geeignete Verabreichungswege der pharmazeutischen Zusammensetzung sind einem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die orale, intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, nasale, rektale und topische Applikation. Eine intravenöse Verabreichung kann z.B. in Form einer Bolusinjektion mit nachfolgenden Injektionsintervallen und/oder in Form einer Infusion durchgeführt werden. Mit der pharmeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können sowohl menschliche als auch tierische Patienten behandelt werden. Das Behandlungsverfahren wird bevorzugt bei Patienten mit den vorstehend genannten Erkrankungen angewendet.The present invention thus also a treatment method, which administration a therapeutically sufficient amount of the pharmaceutical composition of the invention to a treatment requiring Including patients. Suitable routes of administration of the pharmaceutical composition are known to a person skilled in the art and include, for example, the oral, intravenous, intra-arterial, intramuscular, nasal, rectal and topical application. Intravenous administration can e.g. in the form of a bolus injection with subsequent injection intervals and / or in the form of an infusion. With the pharmaceutical Composition of the present invention may be both human and also animal patients are treated. The treatment procedure is preferred in patients with the aforementioned disorders applied.

Die Figuren zeigen:The Figures show:

1: Aufbau und Aktivität verschiedener FasL-Fusionsproteine. 1 : Structure and activity of various FasL fusion proteins.

1(a) zeigt die schematische Darstellung der Modulstruktur der monomeren Untereinheiten der verschiedenen FasL-Fusionsproteine. L, Leaderpeptid; Fas, extrazelluläre Domäne des Fas-Moleküls (bindet FasL); FasL, extrazelluläre Domäne des FasL; F, Flag-tag; PL, Linker mit Proteaseschnittstelle(n); SC40, single chain Fragment „40" (bindet FAP); TNC, Tenascin-Trimerisierungsregion. (1) L-F-FasL, löslicher Flag-getaggter FasL; (2) L-SC40-F-FasL, FAP-bindender löslicher FasL (= FasL-AMAIZE); (3) L-SC40-F-FasL-PL-Fas, FasL-Prodrug ohne freien FasL-C-Terminus (Aufbau analog zu TNF-Selektokin); (4) L-SC40-F-FasL-PL, FAP-bindender löslicher FasL mit C-terminalem PL-Rest, der dem durch Prozessierung verbleibenden Rest von L-SC40-F-FasL-PL-Fas entspricht; (5) L-Fas-PL-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus; (6) L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne, Variante 1; (7) L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne, Variante 2. 1 (a) shows the schematic representation of the modular structure of the monomeric subunits of the different FasL fusion proteins. L, leader peptide; Fas, extracellular domain of the Fas molecule (binds FasL); FasL, extracellular domain of FasL; F, flag-tag; PL, linker with protease interface (s); SC40, single chain fragment "40" (binds FAP); TNC, tenascin trimerization region. (1) LF-FasL, soluble flag-tagged FasL; (2) L-SC40-F FasL, FAP-binding soluble FasL (= FasL-AMAIZE); (3) L-SC40-F-FasL-PL-Fas, FasL prodrug without free FasL-C-terminus (construction analogous to TNF-selectokine); (4) L-SC40-F-FasL- PL, FAP-binding soluble FasL with C-terminal PL residue, similar to that described by Pro Zessierung remaining remainder of L-SC40-F-FasL-PL-Fas corresponds; (5) L-Fas-PL-SC40-F-FasL, FasL prodrug with free FasL-C terminus; (6) L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL, FasL prodrug with FasL-C free terminus and TNC domain, variant 1; (7) L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL, FasL prodrug with free FasL-C-terminus and TNC-domain, variant 2.

1(b) zeigt ein Schema der nativen Struktur von löslichem FasL (2) und FasL-Prodrug Fusionsproteinen mit freiem FasL C-Terminus in trimerer Anordnung (1) (intramolekulare Wechselwirkung der Fas und der FasL Module) und in hexamerer Anordnung (3) (intermolekulare Wechselwirkung der Fas und der FasL Module). 1 (b) Figure 2 shows a scheme of the native structure of soluble FasL (2) and FasL prodrug fusion proteins with free FasL C-terminus in trimeric arrangement (1) (intramolecular interaction of Fas and FasL modules) and in hexameric arrangement (3) (intermolecular interaction of Fas and FasL modules).

1(c) zeigt die Vitalität in % von HT1080-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Prodrugs. HT1080-Zellen und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten wurden in 96-well Platten kultiviert und mit den angegebenen Konzentrationen der in „A" dargestellten Reagenzien über Nacht (üN) inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Zellvitalität bestimmt. Zur Sensitivierung der Zellen für die Fas-vermittelte Apoptose wurde CHX (2,5 μg/ml) zugegeben. Um die Effizienz der intra/intermolekularen Inhibition des FasL-Anteils durch die Fas-Region zu erfassen, wurden die Reagenzien durch sekundäre Aggregation mit einem anti-Flag mAb (M2) artifiziell aktiviert und auf FAP-negativen HT1080 Zellen analysiert. Ergebnis: Nur FasL-Prodrugs mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne werden effizient autoinhibiert und nach FAP-abhängiger Prozessierung aktiviert. Die FAP-abhängige Prozessierung der Prodrug ist in 4 gezeigt. 1 (c) shows the vitality in% of HT1080 cells after treatment with different prodrugs. HT1080 cells and FAP-expressing HT1080 transfectants were cultured in 96-well plates and incubated overnight with the indicated concentrations of the reagents shown in "A." The cell vitality was determined the next day to sensitize the cells for Fas mediated apoptosis was added to CHX (2.5 μg / ml) To assess the efficiency of intra / intermolecular inhibition of FasL content by the Fas region, the reagents were assayed by secondary aggregation with an anti-Flag mAb (M2). activated and analyzed on FAP-negative HT1080 cells Result: Only FasL prodrugs with free FasL-C-terminus and TNC-domain are efficiently autoinhibited and activated after FAP-dependent processing.The FAP-dependent processing of the prodrug is in 4 shown.

2: FasL-Prodrugs mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne aktivieren FAP-abhängig die nicht-apoptotische Fas-Signaltransduktion. 2 : FasL prodrugs with free FasL-C terminus and TNC domain activate FAP-dependent non-apoptotic Fas signal transduction.

2 zeigt die relative IL-8-Produktion (vertikale Achse) in Abhängigkeit von der Prodrug-Konzentration [ng/ml] (horizontale Achse). HT1080-Zellen (A) und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten (B) wurden in 96-well Platten kultiviert und mit den auf der horizontalen Achse in ng/ml angegebenen Konzentrationen an anti-Flag quervernetztem L-F-FasL, L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL und anti-Flag quervernetztem L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL in für 6 h stimuliert. Dann wurde der IL8-Gehalt im Überstand mittels ELISA bestimmt. Ergebnis: Die FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne ist autoinhibiert und induziert FAP-abhängig, Fas-vermittelt IL8. Die effiziente Autoinhibition der FasL-Prodrug, die sie von einem FasL-AMAIZE unterscheidet, folgt aus dem Umstand, daß die anti-Flag Quervernetzung auf FAP-negativen Zellen zu keiner IL8-Induktion führt. Die FAP-abhängige Prozessierung der Prodrug ist in 4 gezeigt. 2 shows the relative IL-8 production (vertical axis) as a function of the prodrug concentration [ng / ml] (horizontal axis). HT1080 cells (A) and FAP-expressing HT1080 transfectants (B) were cultured in 96-well plates and incubated with the concentrations of anti-Flag cross-linked LF-FasL, L-Fas-TNC- on the horizontal axis in ng / ml. PL-SC40-F-FasL and anti-Flag cross-linked L-Fas TNC-PL-SC40-F-FasL in stimulated for 6 h. Then, the IL8 content in the supernatant was determined by ELISA. Result: The FasL prodrug with free FasL-C terminus and TNC domain is autoinhibited and induces FAP-dependent, Fas-mediated IL8. The efficient auto-inhibition of the FasL prodrug, which distinguishes it from a FasL-AMAIZE, follows from the fact that anti-Flag cross-linking on FAP-negative cells does not lead to IL8 induction. The FAP-dependent processing of the prodrug is in 4 shown.

3: Selektive Bindung von L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL und L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL an Zellmembran-exprimiertes FAP. 3 : Selective binding of L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL and L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL to cell membrane-expressed FAP.

3 zeigt die relative Zellzahl (vertikale Achse) gegen die logarithmische Intensität (horizontale Achse) von HT1080-Zellen (HT1080-wt) und FAP-transfizierten HT1080-Zellen (HT1080-FAP) nach der Inkubation mit verschiedenen Prodrugs (A-C). HT1080-Zellen und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten wurden mit den FasL-Prodrugs sowie L-SC40-F-FasL als Positivkontrolle inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurden die verbleibenden Zell-gebundenen Moleküle mittels FITC-markiertem anti-Flag M2 durch FACS-Analysen nachgewiesen. 3 shows the relative cell number (vertical axis) versus the logarithmic intensity (horizontal axis) of HT1080 cells (HT1080-wt) and FAP-transfected HT1080 cells (HT1080-FAP) after incubation with various prodrugs (AC). HT1080 cells and FAP-expressing HT1080 transfectants were incubated with the FasL prodrugs and L-SC40-F-FasL as positive control. After washing the cells, the remaining cell-bound molecules were detected by FITC-labeled anti-Flag M2 by FACS analyzes.

4: Endogene Matrix-Metalloproteasen (MMPs) vermitteln die Prozessierung und Aktivierung der FasL-Prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL) auf FAP- exprimierenden HT1080 Zellen. 4 Endogenous matrix metalloproteases (MMPs) mediate the processing and activation of the FasL prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL) on FAP-expressing HT1080 cells.

4(a) zeigt eine Western-Blot-Analyse von mit Prodrug inkubierten HT1080-Zellen. L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL wurde für 16 Stunden zu HT1080 und HT1080-FAP-Transfektanten gegeben. In einem Teil der Ansätze wurde zusätzlich der selektive MMP-Inhibitor Ilomastat zugegeben. Anschließend wurde der Mediumüberstand der Zellen gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend im Western-Blot mittels anti-Flag analysiert. 4 (a) shows a Western blot analysis of prodrug incubated HT1080 cells. L-Fas TNC-PL-SC40-F-FasL was added to HT1080 and HT1080-FAP transfectants for 16 hours. In some of the batches, the selective MMP inhibitor Ilomastat was additionally added. Subsequently, the medium supernatant of the cells was separated by gel electrophoresis and then analyzed in the Western Blot by means of anti-Flag.

4(b) zeigt die Vitalität in % von HT1080-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Prodrugs. HT1080-FAP Zellen wurden mit den angegebenen Kombinationen der FasL-Prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL), mit anti-FasL (NOK-1), anti-FAP (MB36) und Ilomastat über Nacht inkubiert. Dann wurde die Vitalität der Zellen bestimmt. – = Negativkontrolle, unbehandelte Zelten. 4 (b) shows the vitality in% of HT1080 cells after treatment with different prodrugs. HT1080-FAP cells were incubated overnight with the indicated combinations of the FasL prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL), with anti-FasL (NOK-1), anti-FAP (MB36) and Ilomastat , Then the vitality of the cells was determined. - = negative control, untreated tents.

5: Kodierende DNA-Sequenz (oben) und Aminosäuresequenz (Einbuchstabencode, unten) eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL. 5 : Coding DNA sequence (top) and amino acid sequence (one-letter code, below) of a polypeptide according to the invention "FasL prodrug" of the module structure L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL.

6: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID Nr. 1). 6 : Amino acid sequence of a polypeptide according to the invention "FasL prodrug" of the module structure L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID NO: 1).

7: DNA-Sequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID Nr. 2). 7 : DNA sequence of a polypeptide according to the invention "FasL prodrug" of the module structure L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID NO: 2).

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.The The present invention is illustrated by the following, non-limiting Examples explained in more detail.

Beispiel 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen PolypeptidsExample 1 Preparation a polypeptide of the invention

Das mit einem N-terminalen Targeting-Modul versehene FasL-Modul wurde durch gentechnisches N-terminales Anhängen des ligandenbindenden Moduls des korrespondierenden Rezeptors Fas inhibiert, welches jedoch durch Tumor-assoziierte Proteasen abgespalten werden kann. Hierzu wurde das Rezeptorfragment mittels eines Linkers angehängt, der entsprechenden Schnittstellen enthält (1). Durch sein Targeting-Modul kann diese als L-Fas-TNC-PL-SC40-FasL bezeichnete FasL-Prodrug im Zielgebiet angereichert werden (3, 4(b)). Dieses FasL-Fusionsprotein wird FAP-abhängig prozessiert und somit aktiviert (1, 3, 4). Das aktivierte Fusionsprotein induziert Zelltod (1, 4(b)) bzw. nicht-apoptotische Fas vermittelte zelluläre Reaktionen, z.B. IL8- Produktion (2).The FasL module provided with an N-terminal targeting module was inhibited by genetically engineered N-terminal attachment of the ligand-binding module of the corresponding receptor Fas, which, however, can be cleaved off by tumor-associated proteases. For this purpose, the receptor fragment was attached by means of a linker which contains corresponding interfaces ( 1 ). Through its targeting module, this FasL prodrug, designated as L-Fas TNC-PL-SC40 FasL, can be enriched in the target area ( 3 . 4 (b) ). This FasL fusion protein is processed in a FAP-dependent manner and thus activated ( 1 . 3 . 4 ). The activated fusion protein induces cell death ( 1 . 4 (b) ) or non-apoptotic Fas-mediated cellular reactions, eg IL8 production ( 2 ).

Beispiel 2: Eine nach dem Schema des TNF-Selektokins (WO 02/22833) aufgebaute FasL-Prodrug ist zwar prozessierbar aber nicht oder nur sehr wenig aktiv.Example 2: One after FasL prodrug constructed according to the scheme of TNF-Selektokins (WO 02/22833) is indeed processable but not or only very little active.

Das FasL-Modul wurde durch gentechnisches C-terminales Anhängen des ligandenbindenden Moduls des korrespondierenden Rezeptors Fas inhibiert, welches jedoch durch Tumor-assoziierte Proteasen abgespalten werden kann. Hierzu wurde das Rezeptorfragment mittels eines Linkers angehängt, der entsprechende Schnittstellen enthält. Durch ein N-terminates Antikörper-Targeting-Modul kann dieses als L-SC40-F-FasL-PL-Fas bezeichnete FasL-Fusionsprotein im Zielgebiet angereichert werden. Dieses FasL-Fusionsprotein wird nicht FAP-abhängig aktiviert (1(c)), obwohl eine Prozessierung stattfindet. Folgestudien zeigten, daß die kurzen C-terminalen Aminosäuren-Additionen, die nach Prozessierung am nativen C-Terminus des FasL verbleiben (wie im Konstrukt L-SC40-F-FasL-PL exemplarisch nachvollzogen), die Aktivität des FasL drastisch reduzieren (1(c)).The FasL module was inhibited by genetically engineered C-terminal attachment of the ligand-binding module of the corresponding receptor Fas, which, however, can be cleaved off by tumor-associated proteases. To this end, the receptor fragment was attached by means of a linker containing appropriate interfaces. By means of an N-terminal antibody-targeting module, this FasL fusion protein, designated as L-SC40-F-FasL-PL-Fas, can be enriched in the target area. This FasL fusion protein is not activated FAP-dependent ( 1 (c) ), although processing takes place. Subsequent studies showed that the short C-terminal amino acid additions remaining after processing at FasL's native C-terminus (as exemplified in construct L-SC40-F-FasL-PL) drastically reduce the FasL activity ( 1 (c) ).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims (28)

Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, umfassend von N- nach C-terminal (1) eine Region, welche die biologische Aktivität der Region (4) durch intramolekulare oder intermolekulare Bindung und/oder Wechselwirkung hemmt, (2) eine Region, die mindestens eine Prozessierungsstelle aufweist, (3) eine Region, die ein spezifisches Makromolekül auf einer Zelloberfläche und/oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, und (4) eine Region mit einer biologischen Aktivität für ein spezifisches Zielmolekül, wobei die biologische Aktivität der Region (4) durch Prozessierung in vivo der mindestens einen Prozessierungsstelle in Region (2) freisetzbar ist.A polypeptide having an amino acid sequence comprising of N- after C-terminal (1) a region representing the biological activity of the region (4) by intramolecular or inhibits intermolecular binding and / or interaction, (2) a region that has at least one processing station, (3) a region containing a specific macromolecule on a cell surface and / or a component of the extracellular Selectively detects matrix, and (4) a region with a biological activity for a specific one Target molecule, in which the biological activity the region (4) by processing in vivo the at least one Processing center in region (2) is releasable. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Region (4) eine Aminosäuresequenz eines Zytokins oder ein Fragment davon enthält.Polypeptide according to claim 1, wherein the region (4) an amino acid sequence a cytokine or a fragment thereof. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das Zytokin ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante davon ist.The polypeptide of claim 2, wherein the cytokine is a Member of the TNF ligand family, a biologically active derivative or a biologically active mutant it is. Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das Zytokin Fas-Ligand (FasL), ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante davon ist.The polypeptide of claim 3, wherein the cytokine is Fas ligand (FasL), a biologically active derivative or a biologically active Mutant of it is. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das spezifische Zielmolekül der Region (4) ein Zellmembran-gebundener Zytokinrezeptor ist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 4, wherein the specific target molecule Region (4) is a cell membrane-bound cytokine receptor. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mindestens eine Prozessierungsstelle in Region (2) eine Spaltstelle für eine Protease aufweist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 5, wherein the at least a processing site in region (2) a cleavage site for a protease having. Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Protease ein Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogen-Aktivator (tPA), aktivierter Gerinnungsfaktor VIIa, eine Matrix-Metalloprotease oder eine FAP-Protease ist.The polypeptide of claim 6, wherein the protease is a Urokinase-type plasminogen activator (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), activated coagulation factor VIIa, a matrix metalloprotease or a FAP protease. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Region (1) mindestens eine Bindungsstelle für die Region (4) aufweist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 7, wherein the region (1) has at least one binding site for the region (4). Polypeptid nach Anspruch 8, wobei die Region (1) ein Rezeptor für ein Zytokin oder ein Fragment davon ist.Polypeptide according to claim 8, wherein the region (1) a receptor for is a cytokine or a fragment thereof. Polypeptid nach Anspruch 9, wobei der Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines Rezeptors der TNF-Rezeptorfamilie und/oder ein TNF-Ligand-bindendes Virus-Protein oder eine biologisch aktive Mutante dieser Domäne oder eine synthetische TNF-Ligand-bindende Verbindung umfaßt.The polypeptide of claim 9, wherein the receptor is the full or partial extracellular domain of a Receptor of the TNF receptor family and / or a TNF ligand-binding Virus protein or a biologically active mutant of this domain or a synthetic TNF ligand-binding compound. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei der Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines humanen Fas-Rezeptors und/oder ein FasL-bindendes Virus-Protein oder eine Mutante davon oder eine synthetische FasL-bindende Verbindung umfaßt.The polypeptide of claim 10, wherein the receptor is the complete or partial extracellular domain of a human Fas receptor and / or a FasL binding virus protein or a mutant thereof or a synthetic FasL binding compound. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polypeptid zwischen der Region (1) und der Region (2) oder zwischen der Region (2) und der Region (3) ein Trimerisierungsmodul aufweist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 11, wherein the polypeptide between the region (1) and the region (2) or between the region (2) and the region (3) has a trimerization module. Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Trimerisierungsmodul ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften umfaßt.The polypeptide of claim 12, wherein the trimerization module a natural one occurring or synthetic peptide having intrinsic trimerization properties includes. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Polypeptid am N-Terminus und/oder zwischen zwei benachbarten Regionen mindestens eine detektierbare Markierung aufweist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 13, wherein the polypeptide at the N-terminus and / or between two adjacent regions at least one detectable label having. Polypeptid nach Anspruch 14, wobei die detektierbare Markierung zwischen der Region (3) und der Region (4) liegt.The polypeptide of claim 14, wherein the detectable Mark between the region (3) and the region (4) is located. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für ein Zelloberflächenmolekül spezifisch ist, welches in Tumorläsionen und/oder proliferierenden Endothelzellen, die mit dem Prozeß der Angiogenese assoziiert sind, exprimiert wird.A polypeptide according to any one of claims 1 to 15, wherein the region (3) for a cell surface molecule specific which is in tumor lesions and / or proliferating endothelial cells involved in the process of angiogenesis are expressed. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für eine Komponente der extrazellulären Matrix spezifisch ist, die in Tumorläsionen, und/oder Angiogenesebereichen pathologischer Läsionen vorhanden ist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 15, wherein the region (3) for a component of the extracellular Matrix specific to tumor lesions and / or angiogenesis pathological lesions is available. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für eine Komponente der malignen Tumorzelle selbst spezifisch ist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 15, wherein the region (3) for a component of the malignant tumor cell itself is specific. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Region (3) ein muriner, humanisierter oder humaner Antikörper oder ein Fragment davon mit definierter Antigenspezifität ist.A polypeptide according to any one of claims 1 to 18, wherein the region (3) a murine, humanized or human antibody or a fragment thereof of defined antigenic specificity. Polypeptid nach Anspruch 19, wobei das Antikörperfragment ein scFv- oder Fab-Fragment ist.The polypeptide of claim 19, wherein the antibody fragment is an scFv or Fab fragment. Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 kodiert.Nucleic acid, which comprises a nucleotide sequence, which for the polypeptide of any one of claims 1 to 20 encoded. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach Anspruch 21.Vector containing the nucleic acid according to claim 21. Vektor nach Anspruch 22, der zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle befähigt ist.Vector according to claim 22, for expression and / or Amplification in a prokaryotic and / or eukaryotic Cell enabled is. Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure nach Anspruch 21 und/oder den Vektor nach Anspruch 22 oder 23.A host cell containing the nucleic acid of claim 21 and / or the vector according to claim 22 or 23. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 20, umfassend die Schritte (a) des Züchtens der Wirtszelle nach Anspruch 24 in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen und (b) des Isolierens des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 20 aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.Process for the preparation of the polypeptide according to the claims 1 to 20, comprising the steps (a) after culturing the host cell Claim 24 in a culture medium under suitable conditions and (B) isolating the polypeptide according to any one of claims 1 to 20 from the host cells and / or the culture medium. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in pharmazeutisch wirksamer Menge das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und/oder die Nukleinsäure nach Anspruch 21 und/oder den Vektor nach Anspruch 22 oder 23, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder Trägern.Pharmaceutical composition containing in pharmaceutical effective amount of the polypeptide according to any one of claims 1 to 20 and / or the nucleic acid according to claim 21 and / or the vector according to claim 22 or 23, optionally in association with one or more pharmaceutically acceptable Excipients, diluents and / or Carriers. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 zur therapeutischen Behandlung solider Tumoren und/oder der Angiogenese in pathologischen Läsionen eines Patienten.Pharmaceutical composition according to claim 26 for the therapeutic treatment of solid tumors and / or angiogenesis in pathological lesions a patient. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 oder 27, die fest, flüssig oder aerosolartig ist.Pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, the solid, liquid or aerosol.
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