DE102005030786A1

DE102005030786A1 - Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten

Info

Publication number: DE102005030786A1
Application number: DE200510030786
Authority: DE
Inventors: Thorsten Montag; Ulf Dr. Baus; Marvin Dr. Karos; Thomas Dr. Subkowski; Volker Dr. Schwendemann; Richard Dr. Baur; Christine Mendera; Claus Dr. Bollschweiler; Hans-Georg Dr. Lemaire
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2007-01-04

Abstract

Verfahren zur Beschichtung von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, unter Verwendung von mindestens einem Hydrophobin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, unter Verwendung von mindestens einem Hydrophobin. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung beschichtete faserige Substrate, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, und Verfahren zur Herstellung von Kleidungsstücken unter Verwendung von erfindungsgemäßen faserigen Substraten.

Aus WO 02/59413 ist bekannt, Textil, beispielsweise Polyester, Polyacryl, Polyamid, mit Proteinen oder Polypeptiden, insbesondere oxidierter in Wasser gelöster Wolle zu behandeln, um sie mit einem flauschigen Griff zu verwenden. Dabei beobachtet man häufig, dass nach WO 02/59413 ausgerüstete Textilien zunächst einen sehr unangenehmen Griff aufweisen. Auch wird beobachtet, dass ein gleichmäßiger Auftrag im Einstufenverfahren schwierig sein kann (S: 10). Um dies zu vermeiden, wird ein mehrstufiges sehr umständliches Verfahren vorgeschlagen, das unter anderem auf die Verwendung von Epichlorhydrin zurückgreift. Die Verwendung von Epichlorhydrin ist jedoch im Allgemeinen unerwünscht.

Es bestand also die Aufgabe, ein Verfahren bereit zu stellen, mit dem die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile vermieden werden können.

Demgemäß wurde das eingangs definierte Verfahren gefunden.

Das eingangs definierte Verfahren geht aus von einer oder mehreren Oberflächen, die glatt oder strukturiert sein können. Die zu beschichtende Oberfläche gehört zu einem faserigen Substrat, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder.

Unter textilen Substraten sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Textilfasern, textile Halb- und Fertigfabrikate und daraus hergestellte Fertigwaren zu verstehen, die neben Textilien für die Bekleidungsindustrie beispielsweise auch Teppiche und andere Heimtextilien sowie technischen Zwecken dienende textile Gebilde umfassen. Dazu gehören auch ungeformte Gebilde wie beispielsweise Flocken, linienförmige Gebilde wie Bindfäden, Fäden, Garne, Leinen, Schnüre, Seile, Zwirne sowie Körpergebilde wie beispielsweise Filze, Gewebe, Gewirke, Vliesstoffe und Watten. Textile Substrate können aus Materialien natürlichen Ursprungs sein, beispielsweise Baumwolle, Wolle oder Flachs, oder Mischgewebe, beispielsweise mit Baumwolle/Polyester, Baumwolle/Polyamid. Bevorzugt handelt es sich bei Textil bzw. Textilien im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Polyacrylnitril, Polyamid und insbesondere Polyester bzw. Mi schungen von Materialien natürlichen Ursprungs mit Polyacrylnitril, Polyamid und insbesondere Polyester.

Unter Leder sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise gegerbte und gefinishte Tierhäute sowie sogenanntes Spaltleder zu verstehen.

Unter Beschichtung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine monomolekulare Schicht von mindestens einem Hydrophobin verstanden, die mindestens 10%, bevorzugt mindestens 25% und besonders bevorzugt mindestens 50% der Fläche des erfindungsgemäß zu beschichtenden Substrates bedeckt. Den Grad der Bedeckung von faserigem Substrat kann man nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch mikroskopische Methoden ermitteln.

Erfindungsgemäß verwendet man zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten mindestens ein Hydrophobin. Man kann ein Hydrophobin oder ein Gemisch mehrerer verschiedener Hydrophobine eingesetzen.

Hydrophobine sind an sich bekannte Proteine, vorzugsweise kleine Peptide, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel acht Cystein-Einheiten auf. Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Es können aber auch natürlich nicht vorkommende Hydrophobine mittels chemischer und/oder biotechnologischer Herstellverfahren synthetisiert werden.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen vorzugsweise Proteine der allgemeinen Strukturformel (I) X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m (I)verstanden werden, wobei X für jede beliebige der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Die bei X stehenden Indices stellen jeweils die Anzahl an Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin mit der Maßgabe, dass mindestens vier der mit C benannten Aminsäuren für Cystein stehen, und die Indices n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen im Bereich von 0 bis 500, bevorzugt von 15 bis 300.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Hydrophobine durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens (5 μl) von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, verglichen mit dem Kon taktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche, wobei jeweils bei Zimmertemperatur gemessen wird.

Die mit C¹ bis C⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens fünf, besonders bevorzugt mindestens sechs und insbesondere mindestens sieben der Positionen C¹ bis C⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in erfindungsgemäß verwendeten Proteinen reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt drei und ganz besonders bevorzugt vier intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt verwendet man Proteine der allgemeinen Formel (II) X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m (II)wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, jedoch stehen die Indizes n und m für Zahlen im Bereich von 0 bis 300, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen und es sich weiterhin bei mindestens sechs der mit C benannten Aminosäuren um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen mit C benannten Aminosäuren um Cystein.

Bevorzugt verwendet man Proteine der allgemeinen Formel (III) X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m (III)eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, jedoch stehen die Indizes n und m für Zahlen im Bereich von 0 bis 200, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Bei den Resten X_n und X_m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise mit einem Hydrophobin verknüpft sein können. Es kann sich aber auch bei ei nem oder beiden Resten X_n und X_m um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X_n und/oder X_m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X_n und/oder X_m um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartnerteil bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass erfindungsgemäß verwendete Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartnerteile mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X_n) und am Carboxyterminus (X_m) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartnerteile mit einer Position (X_n oder X_m) des erfindungsgemäß verwendeten Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartnerteile sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartnerteile sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO:15 und 16), yaae(SEQ ID NO:17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate der vorstehend genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70 bis 99%, besonders bevorzugt 80 bis 98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich Angaben in Prozent jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren beziehen.

Erfindungsgemäß verwendete Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung einer Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhafte geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt.

Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und II (Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437).

Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1 Gew.-% wässriger Lösung von Natrium-n-dodecylsulfat (SDS) bei erhöhter Temperatur wie beispielsweise 80°C) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA) bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse II Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60 Gew.-% Ethanol bzw. 1 Gew.-% SDS (jeweils in Wasser, bei Raumtemperatur) aufgelöst werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C³ und C⁴ bei Klasse II Hydrophobinen deutlich kürzer ist als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse II Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Besonders geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Fusionsproteine mit den in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellten Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 22, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Erfindungsgemäß verwendete Proteine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese herstellen, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann man außerdem Expressionskonstrukte als Hydrophobine verwenden, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Expressionskonstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und derglei chen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno-logy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-,lpp-lac-,laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR- oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1,MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.

Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen an sich bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons,IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium-System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,pIN-III''3-B1, tgt11 oder pBdCl, in StreptomycespIJ101, pIJ364,pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind an sich bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams-terdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind an sich bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Proteine eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Expressionskonstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise an sich bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel etal., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in an sich bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Erfindungsgemäß verwendete Proteine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Proteine-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Erfindungsgemäß verwendete Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls erfindungsgemäß verwendetes Protein nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organi schen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung von erfindungsgemäß verwendetem Protein kann mit an sich bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.

Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartnerteils als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartnerteils vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).

Zur erfindungsgemäßen Verwendung von Hydrophobinen zur Beschichtung von Oberflächen kann man Hydrophobine auch in Substanz verwenden. Bevorzugt werden die Hydrophobine aber in wässriger Formulierung eingesetzt.

Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist im Grunde nicht beschränkt. Es können ein Hydrophobin oder auch mehrere verschiedene eingesetzt werden. Beispielsweise können Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21) eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß verwendet man wie vorstehend beschriebene Hydrophobine zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder.

Erfindungsgemäß kann man wie vorstehend beschriebene Hydrophobine zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, verwenden, ohne auf stark alkylierend wirkenden Verbindungen wie Epichlorhydrin oder auf Vernetzer wie beispielsweise DMDHEU zurückgreifen zu müssen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Beschichtung von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, unter Verwendung von mindestens einem Hydrophobin. Dabei sind Hydrophobine, faserige Substrate, textile Substrate und Leder sowie Beschichtung wie vorstehend beschrieben definiert.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt man das erfindungsgemäße Verfahren so durch, dass man zu beschichtendes faseriges Substrat mit mindestens einer wässerigen Formulierung, bevorzugt einer wässrigen Flotte kontaktiert, die mindestens ein Hydrophobin enthält.

Es ist beispielsweise möglich, mit einem Flottenverhältnis im Bereich von 1:10 bis 1 : 1000, bevorzugt 1 : 70 bis 1 : 500 zu arbeiten.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man zu beschichtendes faseriges Substrat mit mindestens einer wässerigen Formulierung, bevorzugt einer wässrigen Flotte kontaktiert, die mindestens ein Hydrophobin enthält, nach dem Ausziehverfahren.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man zu beschichtendes faseriges Substrat mit mindestens einer wässerigen Formulierung, bevorzugt einer wässrigen Flotte kontaktiert, die mindestens ein Hydrophobin enthält, nach einem Klotzverfahren.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man faseriges Substrat und insbesondere textiles Substrat mit Hydrophobin beispielsweise in einem Kessel oder bevorzugt mit Hilfe eines Foulards.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man faseriges Substrat und insbesondere textiles Substrat mit Hydrophobin bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 90°C, bevorzugt im Bereich von Zimmertemperatur bis 85°C.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man faseriges Substrat und insbesondere textiles Substrat beispielsweise in einem Kessel oder bevorzugt mit Hilfe eines Foulards, mit Hydrophobin, und trocknet danach, beispielsweise bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 120°C.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man faseriges Substrat und insbesondere textiles Substrat beispielsweise in einem Kessel oder bevorzugt mit Hilfe eines Foulards, mit Hydrophobin, und trocknet danach, beispielsweise bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 120°C, beispielsweise über einen Zeitraum von 5 Sekunden bis 15 Minuten, bevorzugt bis 5 Minuten. Für die Trocknung sind beispielsweise Temperaturen im Bereich von 20°C bis 120°C, bevorzugt bis 105°C geeignet. Dabei ist die Trocknungszeit um so länger, je niedriger man die Temperatur wählt, und umgekehrt.

Wünscht man erfindungsgemäß faseriges Substrat mit Hydrophobin mit Hilfe eines Foulards zu kontaktieren, so kann man beispielsweise Auftragsgeschwindigkeiten im Bereich von 0,1 bis 10 m/min, bevorzugt 1 bis 5 m/min wählen und einen Anpressdruck der Walzen im Bereich von 0,5 bis 4 bar, bevorzugt 1 bis 3 bar.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kontaktiert man faseriges Substrat und insbesondere Leder mit Hydrophobin, indem man faseriges Substrat einmal oder mehrmals mit einer wässrigen Formulierung bedeckt, beispielsweise besprüht, die mindestens ein Hydrophobin enthält.

Als Einwirkzeit von wässriger Formulierung auf faseriges Substrat kann man beispielsweise 1 bis 24 Stunden wählen, bevorzugt 12 bis 17 Stunden.

Bevorzugt setzt man zur Herstellung von im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzter wässriger Formulierung Wasser als Lösungsmittel ein oder Gemische aus Wasser und mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln. Beispiele für mit Wasser mischbaren, organischen Lösemittel umfassen mit Wasser mischbare einwertige oder mehrwertige Alkohole, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Glycerin. Weiterhin kann es sich auch um Etheralkohole handeln. Beispiele umfassen Monoalkylether von (Poly)ethylen- oder (Po ly)propylenglykolen wie Ethylenglykolmonobutylether. Art und Menge der wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel sind an sich unkritisch und können beispielsweise im Bereich von 1 bis 50 Gew.-% liegen, bezogen auf erfindungsgemäß eingesetzte wässrige Formulierung.

Auch können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten wässrigen Formulierungen noch 0,1 bis 5 Gew.-% anorganisches Salz, beispielsweise NaCl enthalten, bezogen auf erfindungsgemäß eingesetzte wässrige Formulierung.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verzichtet man bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Verwendung von stark alkylierend wirkenden Verbindungen wie Epichlorhydrin.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verzichtet man bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Verwendung von Vernetzern wie beispielsweise N,N-Dimethylol-4,5-dihydroxyethylenharnstoff (DMDHEU).

Zur Herstellung von im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeter wässriger Formulierung und vorzugsweise Flotte können bevorzugt die bei der Synthese, Isolierung und/oder Reinigung der Hydrophobine erhaltenen wässrigen Lösungen der Hydrophobine eingesetzt werden. Diese können je nach Reinheit noch Reste von Hilfsstoffen aus der Synthese enthalten. Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und erst in einem zweiten Schritt formuliert werden.

Die erforderliche Konzentration an Hydrophobin von im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeter wässriger Formulierung kann man je nach der Art der zu beschichtenden Oberfläche und/oder der Anwendung bestimmt werden. Es sind aber schon relativ geringe Konzentrationen an Hydrophobin ausreichend, um eine die beabsichtigte Wirkung zu erzielen.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt man das erfindungsgemäße Verfahren mit mindestens einer wässrigen Formulierung durchführt, die im Bereich von 1 mg/l bis 10 g/l mindestens eines Hydrophobins enthält.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete wässrige Formulierung und insbesondere Flotte einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 9, bevorzugt 4 bis 8.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung behandelt man zu beschichtendes faseriges Substrat vor dem Kontaktieren mit Hydrophobin vor und kontaktiert erst danach mit Hydrophobin.

Beispielsweise kann man beispielsweise durch mehrminütiges Spülen mit Wasser, bevorzugt mit vollentsalztem Wasser, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 5 Minuten bis 5 Stunden vorbehandeln.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung behandelt man erfindungsgemäß zu beschichtende Oberfläche von faserigem Substrat vor, indem man mit einer anderen wässrigen Formulerung kontaktiert, die mindestens eine Aktivsubstanz enthält. Aktivsubstanz kann man aus organischen Chemikalien wählen, beispielsweise aus anionischen, kationischen oder nicht-ionischen Detergenzien, und aus Enzymen wie beispielsweise Proteasen oder Lipasen.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung behandelt man erfindungsgemäß vor, indem man erfindungsgemäß zu beschichtendes faseriges Substrat bleicht. Diese Ausführungsform ist dann bevorzugt, wenn es sich bei zu beschichtendem faserigem Substrat um Baumwolle oder Baumwolle-Synthesefaser-Mischungen handelt.

Erfindungsgemäß eingesetzte wässrige Formulierung kann optional darüber hinaus noch weitere Komponenten, beispielsweise Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel umfassen. Beispiele derartiger Komponenten umfassen Säuren oder Basen, beispielsweise Carbonäuren oder Ammoniak, Puffersysteme, Polymere, anorganische Partikel wie SiO₂ oder Silikate, Farbmittel wie beispielsweise Farbstoffe, Duftstoffe oder Biozide. Weitere Beispiele von Zusatzstoffen sind in DE-A 101 60 993, insbesondere Abschnitte [0074] bis [0131] aufgeführt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist eine beschichtete Oberfläche von faserigem Substrat und bevorzugt beschichtetem textilem Substrat oder Leder erhältlich, die eine schmutzabweisende, mindestens ein Hydrophobin umfassende Beschichtung aufweist.

Bei der Beschichtung handelt es sich in der Regel mindestens um eine monomolekulare Schicht von Hydrophobin auf der beschichteten Oberfläche.

Erfindungsgemäß behandelte Oberflächen von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, weisen nicht nur einen verbesserten flauschigen Griff und eine optisch gleichmäßige Beschichtung auf, sondern sind auch Schmutz abweisend.

Bei Schmutz handelt es sich in bekannter Art und Weise um alle Arten unerwünschter Kontamination von harten Oberflächen mit festen und/oder flüssigen Stoffen. Beispiele von Schmutz umfassen Fette, Öle, Eiweiße, Speisereste, Staub oder Erde. Bei Verschmutzungen kann es sich auch um Kalkablagerungen wie beispielsweise eingetrocknete Wasserspuren handeln, die sich aufgrund der Wasserhärte bilden. Weitere Beispiele umfassen Reste von Reinigungs- und Pflegemitteln zur Körperpflege oder auch unlösliche Kalkseifen, die sich aus derartigen Reinigungs- und Pflegemitteln in Verbindung mit Wasserhärte bilden können, und die sich auf Oberflächen von faserigen Substraten wie beispielsweise textilen Substraten oder Leder niederschlagen können.

Die schmutzabweisende Wirkung kann mittels prinzipiell bekannter Methoden bestimmt werden, beispielsweise, indem man die Ablösbarkeit von Schmutz durch Abspülen mit Wasser von einer unbehandelten und einer mit Hydrophobinen behandelten Oberfläche vergleicht.

Erfindungsgemäß eingesetzte wässrige Formulierungen kann man beispielsweise herstellen durch Vermischen von einem oder mehreren Hydrophobinen mit Wasser und/oder einem oder mehreren der vorstehend genannten Lösungsmittel. Wenn man es wünscht, so kann man weitere Komponenten, beispielsweise Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel, zusetzen, wobei die Reihenfolge der Zugabe von Hydrophobin und Wasser, gegebenenfalls Lösungsmittel sowie gegebenenfalls einer oder mehreren weiteren Komponenten unkritisch ist.

Erfindungsgemäße Formulierungen sind in der Regel frei von stark alkylierend wirkenden Verbindungen wie Epichlorhydrin oder Vernetzern wie beispielsweise DMDHEU und lange zersetzungsfrei lagerbar.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind faserige Substrate, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, beschichtet nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren. Sie weisen nicht nur vorzügliche Schmutz abweisende Eigenschaften auf, sondern auch gute Wasch- und Reibechtheiten sowie einen angenehmen Griff. Sie eignen sich beispielsweise zur Herstellung von Heimstextilien wie beispielsweise Bettwäsche, Vorhänge und Gardinen, Bad- und Sanitärtextilien sowie Tischdecken, weiterhin zur Herstellung von Textlien für den Outdoor-Bereich wie beispielsweise Markisen, Zelten, Bootüberzügen, LKW-Planen, Cabrioletdächern und insbesondere zur Herstellung von Bekleidungsstücken wie beispielsweise Schuhen, Jacken, Mänteln, Hosen, Pullovern, Strümpfen, Gürteln, weiterhin Heimtextilien wie beispielsweise Bettwäsche, Vorhänge und Gardinen, Bad- und Sanitärtextilien sowie Tischdecken. Erfindungsgemäß beschichtete Leder eignen sich besonders zur Herstellung von Bekleidungsstücken wie Stiefel, weiterhin zur Herstellung von Leerartikeln für den technischen Gebrauch.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Teil A:
Herstellung und Test der erfindungsgemäß verwendeten Hydroghobine
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-His₆/yaaE-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (Hal 572/Hal 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD/yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine NcoI bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS₆ bzw. YAAE::HIS₆ verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Beispiel 2
Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 kloniert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS₆ verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-His₆
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-His₆
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF1 – eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-His₆
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF2 – eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-His₆
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7
Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His₆ exprimierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 1l Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) wurden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13.5l LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 20l Fermenter mit 0,5l Vorkultur (OD_600nm 1:10 gegen H₂O gemessen) animpfen. Bei einer OD_600nm von ~3.5 Zugabe von 140ml 100mM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrophobin-Fusionsproteins (Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100–500 mg Hydrophobin) wurden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wurde mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wurde mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA wurden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wurde zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren wurden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wurde für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschließenden Zentrifugation im Überstand enthalten (1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes wurden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wurde die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
1 zeigt die Reinigung des so hergestellten Hydrophobins HP1:
Spur 1: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)
Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren 3–5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das Hydrophobin der 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Technische Prüfung; Charakterisierung des Hydrophobins HP1 durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
Konzentration Hydrophobin: 100 mg/l
Inkubation von Glasplättchen über 15 Stunden (Temperatur 80°C) in 50mM Na-Acetat (pH-Wert 4) + 0,1 Gew.-% Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat in Wasser
danach Beschichtung waschen in destilliertem Wasser
danach Inkubation 10min/80°C/1 Gew.-% wässrige Natrium-n-dodecylsulfat-Lösung (SDS)
Waschen in destiliertem Wasser

Die so erhältlichen Proben wurden an der Luft getrocknet (Zimmertemperatur) und bei Zimmertemperatur der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäß den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit dem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his₆) ergab Kontaktwinkel von 67 ± 5°.
Teil B:
Verwendung des Hydrophobins HP1 zur Beschichtung von Oberflächen von faserigem Substrat
Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Hydrophobins (Fusionsprotein) HP1 (yaad-Xa-dewA-his) (SEQ ID NO: 19) in Wasser eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins HP1 in Lösung: 100 mg/l (0,02 Gew.-%).
B.1 Erfindungsgemäße Beschichtung von textilem Substrat:
Weißes Polyestergewebe, Flächengewicht 226 g/m², wurde zunächst 45 Minuten mit vollentsalztem Wasser gespült und danach in eine 0,02 Gew.-% wässrige Lösung von HP1 in Wasser getaucht und 17 Stunden bei 80°C behandelt. Danach wurde das so behandelte Polyestergewebe eine Minute mit vollentsalztem Wasser gespült und bei Zimmertemperatur getrocknet. Man erhielt erfindungsgemäßes behandeltes Substrat PES-HP1. Es wies einen sehr angenehmen Griff auf.
B.2 Erfindungsgemäße Beschichtung von textilem Substrat
Der Versuch nach B.1 wurde wiederholt, jedoch wurde bei Zimmertemperatur statt bei 80°C behandelt.
Man erhielt erfindungsgemäßes behandeltes Substrat PES-HP2. Es wies einen sehr angenehmen Griff auf.
Verwendeter Schmutz:
Für die Tests wurde als Schmutz verwendet:
Triolein
Lippenstift
Gebrauchtes Motoröl
Mehrere erfindungsgemäß behandelte Substrate PES-HP1 wurden mit je einem der oben genannten Schmutze 18 Stunden lang angeschmutzt, wobei etwa 0,1 g Schmutz pro dm² verwendet wurden.
Herstellung eines Testwaschmittels und Waschen von erfindungsgemäßem PES-HP1
Es wurden miteinander vermischt:
5 g n-Dodecylbenzolsulfonsäure Natriumsalz
5 g eines C₁₃-C₁₅-Oxoalkoholgemischs, ethoxyliert mit im Mittel 7 Äquivalenten Ethylenoxid/mol
5,8 g 40 Gew.-% wässrige Lösung eines statistischen Copolymers von Acrylsäure (70 Gew.-%) and Maleinsäure (30 Gew.-%), neutralisiert with NaOH, pH-Wert 7.9, M_w 70,000 g/mol.
1,4 g Kernseife
1,2 g Carboxymethylcellulose (Tylose CR 1500 p)
14 g Na₂CO₃
30 g Zeolith A
21 g Natriumperborat Tetrahydrat
6 g Ethylendiamintetraessigsäure Tetranatriumsalz
3,6 g Natriummetasilikat Pentahydrat
7 g Na₂SO₄
Man erhielt das Testwaschmittel 1.
In einer Waschmaschine des Typs Launder-O-Meter der Fa. Atlas, USA, wurden erfindungsgemäß behandelte und danach angeschmutzte PES-HP1 gewaschen, und zwar mit 3 Vorwaschzyklen und einem Hauptwaschzyklus. Es wurde Wasser mit einer Härte von 3 mmol/l (Ca : Mg : HCO₃ wie 4 : 1 : 8) eingesetzt, Flottenverhältnis 1 : 12,5, Dosierung 4,5 g Testwaschmittel 1/l, Wassertemperatur 40°C. Gesamte Waschzeit: 30 Minuten.
Triolein und Motorölanschmutzung waren vollständig beseitigt, Lippenstiftreste waren nur noch äußerst schwach und unter der Lupe zu erkennen.
Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Beschichtung von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder, unter Verwendung von mindestens einem Hydrophobin.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man es durch Kontaktieren von faserigem Material mit mindestens einer wässrigen Formulierung durchführt, die mindestens ein Hydrophobin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man es mit einem Foulard durchführt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man es mit mindestens einer wässrigen Formulierung durchführt, die mindestens ein Hydrophobin im Bereich von 1 mg/l bis 10 g/l enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man faseriges Substrat vorbehandelt und danach mit Hydrophobin kontaktiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Kontaktieren von faserigem Substrat mit Hydrophobin bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 120 °C trocknet.
Faserige Substrate, beschichtet nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6.
Bekleidungsstücke, Heimtextilien, technische Textilien, Lederartikel zur Bekleidung oder zu technischem Gebrauch, hergestellt unter Verwendung von mindestens einem faserigem Substrat nach Anspruch 7.
Verwendung von Hydrophobinen zur Beschichtung von Oberflächen von faserigen Substraten, ausgewählt aus textilen Substraten und Leder.