DE102005018337A1

DE102005018337A1 - Mikrooptisches Detektionssystem und Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten

Info

Publication number: DE102005018337A1
Application number: DE102005018337A
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth
Original assignee: TDK Micronas GmbH
Current assignee: TDK Micronas GmbH
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2006-11-02
Also published as: EP1872127A1; WO2006111325A1; US20080160548A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrooptisches Detektionssystem sowie ein Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels zeitaufgelöster Lumineszenz. Dieses dient der Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, insbesondere der Bestimmung von Punktmutationen von Nukleinsäuren (DNA), für die eine zeitaufgelöste Detektion erforderlich ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrooptisches Detektionssystem sowie ein Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels zeitaufgelöster Lumineszenz. Dieses dient der Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, insbesondere der Bestimmung von Punktmutationen von Nukleinsäuren (DNA), für die eine zeitaufgelöste Detektion erforderlich ist.
Zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von bestimmten Substanzen, wie z.B. Biomolekülen in einer zu analysierenden Probe ist die Verwendung von im Wesentlichen planaren Systemen bekannt, welche in der Fachwelt als Biosensoren bzw. Biochips bezeichnet werden. Diese Biochips bilden eine Trägerstruktur, auf dessen Oberfläche i.d.R. eine Vielzahl von zumeist rasterartig angeordneten Detektionsbereichen ausgebildet ist, wobei sich die einzelnen Bereiche bzw. Bereichsgruppen jeweils durch ihre Spezifität gegenüber einem bestimmten nachzuweisenden Analyten voneinander unterscheiden. Im Falle von nachzuweisenden DNA-Analyten befinden sich innerhalb der einzelnen Bereiche der Trägeroberfläche – direkt oder indirekt immobilisiert – spezifische Nukleinsäuresonden, wie z.B. Oligonukleotide oder cDNA in zumeist einzelsträngiger Form, deren jeweilige Spezifität gegenüber der nachzuweisenden Nukleinsäure im Wesentlichen durch die Sequenzabfolge vorgegeben ist. Die auf diese Weise funktionalisierte Chipoberfläche wird im Rahmen eines entsprechenden Nachweisverfahrens mit der die nachzuweisenden DNA-Analyten ggf. enthaltenden Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche im Falle des Vorhandenseins der zuvor nachweisbar markierten Zielnukleinsäure(n) deren Hybridisierung mit den immobilisierten Sondenmolekülen gewährleisten. Die qualitative und ggf. quantitative Detektion eines bzw. mehrer spezifisch gebildeter Hybridisierungskomplexe erfolgt anschließend zumeist durch optophysikalische Lumineszenzmessung und Zuordnung der erhaltenen Daten zu den jeweiligen Detektionsbereichen, wodurch die Bestimmung der Anwesenheit des bzw. der DNA-Analyten in der Probe und ggf. deren Quantifizierung ermöglicht wird.
Ein Bereich der DNA-Forschung, der von den bislang aus dem Stand der Technik bekannten Biochips nur unzureichend abgedeckt werden kann, betrifft die Punktmutationen von Nukleinsäuren. Der Identifizierung von Punktmutationen im menschlichen Genom kommt dabei in der Wissenschaft eine große Bedeutung zu. Die Entdeckung einer Vielzahl von Punktmutationen, also Mutationen einzelner Basen, die bei mehr als 1 % der Bevölkerung auftreten, und die Erkenntnis, dass Punktmutationen die Nebenwirkung von Medikamenten determi nieren können, führt zu der Vision einer personenbezogenen Therapie. Hiernach erhält der Patient nach einer Genotypisierung das für ihn verträglichste Medikament verschrieben. Notwendige Bedingung für eine solche Entwicklung ist eine schnelle und hoch durchsatzfähige DNA-Analytik. Dies führte jedoch bislang bei den aus dem Stand der Technik bekannten Systemen zu erheblichen Problemen, da der bei einer Punktmutation auftretende einzelne Basentausch nur eine geringe Änderung in der Bindungsenergie zu dem komplementären Strang ausmacht. So beträgt die Änderung des Schmelzpunktes, also der Temperatur, bei der 50 % der DNA dissoziiert sind, in der Regel nur wenige Grad Celsius, teilweise auch weniger als 1 °C.

Aus der DE 101 33 844 A1 ist eine Vorrichtung zur DNA-Analytik auf Basis eines Biochips bekannt, wobei auf dem Biochip Rezeptoren zur Ausbildung von Rezeptor/Liganden-Komplexen immobilisiert sind. Weiterhin sind in der Vorrichtung eine Anregungsquelle sowie ein optischer Detektor integriert. Eine zeitaufgelöste Analytik lässt sich mit dem hier beschriebenen System nicht realisieren.

Aus der EP 1 248 948 B1 ist ein Verfahren zur parallelen Bestimmung temperaturabhängiger Parameter, wie z.B. der Assoziations-/Dissoziationskonstanten oder Gleichgewichtskonstanten von Komplexen, bekannt, das auf der Totalen Internen Reflexions-Fluoreszenz (TIRF) basiert. Diese Technologie, die sich des Evanescentfeldes bedient, ist apparativ jedoch sehr aufwendig, was zu einem für die Routineanalytik nicht vertretbaren Kostenfaktor führt. Ein weiterer Nachteil, der derartige Systeme für den Bereich der Routineanalytik ausschließt, ist der mit diesen Systemen verbundene hohe Zeitaufwand der Messung.

Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Detektionssystem für Analyten bereitzustellen, das zum einen die für Biochips bekannte Miniaturisierung verfolgt und dabei gleichzeitig eine zeitaufgelöste Messung ermöglicht. Der hiermit verbundene apparative und zeitliche Aufwand eines derartigen Systems soll dabei möglichst gering gehalten werden.

Diese Aufgabe wird durch das mikrooptische Detektionssystem mit den Merkmalen des Anspruchs 1, die Diagnosevorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 30 und das Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter mit den Merkmalen des Anspruchs 32 gelöst. In Anspruch 49 werden Verwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens genannt. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird ein mikrooptisches Detektionssystem zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten bereitgestellt. Dieses basiert auf den folgenden Elementen:

a) Eine Trägerstruktur mit mindestens einer Oberfläche, auf der Rezeptoren für die Analyten immobilisiert sind, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden,
b) mindestens eine Anregungsquelle, die die Emission von Lumineszenzlicht induzieren kann,
c) mindestens einen monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten optischen Detektor,
d) mindestens eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen eines Fluids mit den Messpunkten an der Oberfläche der Trägerstruktur sowie
e) mindestens ein Temperierelement für das Fluid.

Das erfindungsgemäße Detektionssystem beruht auf dem wesentlichen Merkmal, dass zumindest der Detektor in die Trägerstruktur monolithisch integriert ist. Hierdurch wird ermöglicht, dass das mikrooptische Detektionssystem in Form eines Biochip bzw. DNA-Chip konzipiert werden kann. Bislang sind aus dem Stand der Technik derartig miniaturisierte Systeme nicht bekannt, die es ermöglichen, im Rahmen der Chip-Technologie Systeme zu entwickeln, die eine Bestimmung temperaturabhängiger Parameter ermöglichen.

Das erfindungsgemäße Detektionssystem kann zur Detektion von Nukleinsäuren ebenso wie für nachweisbar markierte Analyten, insbesondere proteinöse Substanzen, z.B. Peptide, Proteine, Antikörper und funktionelle Fragmente derselben, eingesetzt werden kann. Somit umfasst die vorliegende Erfindung jeglichen Nachweis eines aus einem nachweisbar markierten Analyten, also einer Komponente aus der zu analysierenden Probe, und einem Rezeptor, d.h. einer immobilisierten Trägerkomponente, gebildeten Komplexes, wobei erfindungsgemäß auch solche Systeme umfasst sind, bei denen sich der Analyt bereits z.B. durch eine nachweisbare Eigenfluoreszenz auszeichnet und daher keiner weiteren Markierungen bedarf. Als Beispiel hierfür ist die Aminosäure Thyroxin zu nennen, die eine Eigenfluoreszenz aufweist, und zwar auch ohne zusätzliche Markierung einer Thyroxin-Reste aufweisenden proteinösen Substanz. So können erfindungsgemäß durch Verwendung von Peptiden als Rezeptoren proteinöse Substanzen, wie z.B. Antikörper oder Fragmente derselben, als Analyten nachgewiesen werden, auch ohne diese zuvor mit einem erfindungsgemäß geeigneten Luminophor markiert zu haben.

Das erfindungsgemäße Detektionssystem weist eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Inkontaktbringen auf, die vorzugsweise als Flusszelle, als Küvette oder als Probenbehälter ausgebildet sein kann.

Hinsichtlich der Anordnung der Vorrichtung zum Inkontaktbringen des Fluids mit den Messpunkten bestehen grundsätzlich keinerlei Beschränkungen.

So sieht eine bevorzugte Variante vor, dass die genannte Vorrichtung zum Inkontaktbringen kanalförmig ausgebildet ist. Hierbei ist es dann auch möglich, dass z.B. mehrere kanalförmige Vorrichtungen parallel zueinander in der arrayartigen Trägerstruktur integriert sind.

Eine andere bevorzugte Variante sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkontaktbringen als Ausnehmung in der Trägerstruktur ausgebildet ist, die auf der der Oberfläche der Trägerstruktur abgewandten Seite mit einer Abdeckschicht versehen ist. Eine derartige Ausnehmung kann beispielsweise in die Trägerstruktur eingeätzt sein. Diese Abdeckschicht weist dabei vorzugsweise mindestens zwei punktförmige Ausnehmungen auf, die den Zufluss und den Abfluss des Fluids erlauben.

Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die mindestens eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen aus einem photogehärteten Polymer besteht, und durch Photopolymerisation auf der Trägerstruktur aufgebracht ist.

Eine weitere bevorzugte Variante sieht vor, dass eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen aus einem beliebigen Material auf die Trägerstruktur aufgebracht ist, wobei diese mittels eines Klebers, mittels Bonding und/oder einen Pressvorgang erfolgt.

Vorzugsweise ist die Flusszelle mit mindestens einer Pumpe für den Transport von Fluiden gekoppelt. Es findet somit ein ständiger Transport des Analyten oder auch der Waschlösung an der Oberfläche des Chips entlang statt.

Ein weiterer wesentlicher Punkt des erfindungsgemäßen Detektionssystems ist die Verwendung eines Temperierelementes. Das Temperierelement ermöglicht dabei je nach Wunsch eine Temperaturerhöhung bzw. eine Temperaturerniedrigung des Fluids bzw. der Oberfläche der Trägerstruktur. Um dies gewährleisten zu können, muss das Temperierelement mit dem Fluid oder zumindest mit einer mit dem Fluid in Kontakt stehenden Oberfläche thermisch verbunden sein. Dies stellt jedoch die einzige Beschränkung hinsichtlich der Anordnung des Temperierelements dar. Vorzugsweise ist das Temperierelement monolithisch in die Trägerstruktur integriert.

Für die Temperierung der Vorrichtung zum Inkontaktbringen stehen alle aus dem Stand der Technik bekannten Temperierungsmöglichkeiten zur Verfügung. Eine bevorzugte Variante sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkontaktbringen mit einem Peltierelement verbunden ist, wodurch eine effiziente Aufheizung und Abkühlung der Vorrichtung ermöglicht wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Detektionssystems sieht vor, dass die Vorrichtung zum Inkontaktbringen mit einem Thermosensor bzw. Temperaturfühler verbunden ist, der z.B. in Kombination mit einem Regler und dem Temperierelement einen Regelkreis bildet. Hierdurch wird eine gezielte Steuerung der Temperatur des Fluids in der Vorrichtung zum Inkontaktbringen ermöglicht.

Die Trägerstruktur des Biochips besteht bevorzugt aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z.B. Silicium-Wafer, Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas oder einem Polymer.

Die Trägerstruktur des erfindungsgemäßen Detektionssystems besteht bevorzugt aus einem Halbleitermaterial mit einer integrierten, vorzugsweise mehrere Detektoren umfassenden optischen Detektorschicht, wobei als Detektoren vorzugsweise Photodioden eingearbeitet sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Signalverarbeitung zumindest teilweise innerhalb des Biosensors.

Der Rezeptor kann nun an diese Trägerstruktur sowohl direkt als auch über einen Spacer angebunden werden. Für die Anbindung an einen Spacer, d.h. ein bifunktionelles Molekül, werden bevorzugt Verbindungen eingesetzt, die eine Halogensilan- oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung mit der Oberfläche der Trägerstruktur aufweisen. Besonders bevorzugt ist hierunter eine Chlorsilangruppe. So kann beispielsweise die Trägerstruktur mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z.B. durch Eintauchen in eine Lösung von 1 % Silan in Toluol, langsames Herausziehen und Immobilisieren durch Trocknen bei 120 °C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im Allgemeinen eine Dicke von wenigen Å auf. Die Kopplung zwischen Spacer und Rezeptor erfolgt über eine geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder eine Alkoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Spacer für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptormolekülen an eine Vielzahl von Trägerstrukturoberflächen ist dem Fachmann gut bekannt (G.T. Hermanson, „Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996).

Sofern es sich bei den zu detektierenden Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt, können anschließend geeignete DNA-Sonden mittels gängiger Druckgeräte aufgebracht und immobilisiert werden.

Auf derart hergestellten Biosensoren können nun unter Anwendung etablierter Verfahren Hybridisierungen mit, z.B. biotinylierter DNA durchgeführt werden. Diese kann z.B. mittels PCR und dem Einbau von Biotin-dUTP erzeugt werden. Beim Hybridisieren bindet nun die biotinylierte DNA an den auf dem Sensor vorhandenen Gegenstrang (sofern vorhanden). Positive Hybridisierungsereignisse können nun durch Zugabe von Farbstoffkonjugaten, wie z.B. Streptavidin-/Avidin-Konjugaten, nachgewiesen werden. Als Farbstoffkonjugate sind erfindungsgemäß besonders geeignet: Europium-, Terbium- und Samarium-Chelate, Microspheres („Beads"), die z.B. über Avidin-/Streptavidin mit Eu-, Sm-, Tb-Chelaten beladen sind, wobei sich die genannten Chelate durch ihre Eigenschaft auszeichnen, bei geeigneter Anregung Lumineszenzlicht mit einer Halbwertszeit des angeregten Zustandes von über 5 ns abzugeben. Besonders geeignet sind hierbei lumines zierende Microspheres, wie z.B. l1uoSpheres Europium (Molecular Probes F-20883), da sie in der Lage sind, eine große Zahl von Fluorochromen mit einem Bindungsereignis zu immobilisieren. Erfindungsgemäß ferner geeignet sind Nanokristalle, wie sie z.B. von der Quantum Dot Corp. unter der Bezeichnung „Quantum-Dots^®" angeboten werden.

Nach dem Waschen zum Entfernen nicht gebundener markierter Liganden bzw. frei flottierender Lumineszenzfarbstoffe erfolgt die Messung der Bindung über eine geeignete Anregung und die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz bei ausgeschalteter Anregungslichtquelle.

Unter dem Begriff „Lumineszenz" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche, durch eine Anregungsquelle hervorgerufenen Lichtemissionen (im weiteren Sinne auch die Aussendung von ultravioletter und infraroter Strahlung) von gasförmigen, flüssigen und festen Stoffen zusammengefasst, die nicht durch hohe Temperaturen, sondern durch vorangegangene Energieabsorption und Anregung verursacht wird. Diese Stoffe werden Luminophore genannt. Auch wenn die vorliegende Erfindung z.T. unter Verwendung der Begriffe „Fluoreszenz" und „Fluorophore" näher erläutert wird, kennzeichnen diese Begriffe lediglich bevorzugte Ausführungsformen des erfinderischen Grundgedankens und stellen somit keine Beschränkung der Erfindung dar.

Wie dem Fachmann bekannt ist, kann eine Lumineszenz hervorgerufen werden durch Bestrahlung aus einer Anregungsquelle mit Licht, d.h. vorzugsweise kürzerwelliges Licht sowie Röntgenstrahlen, Photolumineszenz, mit Elektronen, z.B. Kathodolumineszenz, Ionen, z.B. Ionolumineszenz, Schallwellen, z.B. Sonolumineszenz, mit radioaktiven Stoffen, z.B. Radiolumineszenz, durch elektrische Felder, z.B. Elektrolumineszenz, durch chemische Reaktionen, z.B. Chemolumineszenz oder mechanische Vorgänge, z.B. Tribolumineszenz. Demgegenüber handelt es sich bei der Thermolumineszenz um durch thermischen Einfluss initiierte oder verstärkte Lumineszenz. Alle diese Prozesse unterliegen den allgemeinen Grundsätzen der Quantenmechanik und bewirken eine Anregung der Atome und Moleküle, die anschließend unter Emission von Licht, welches erfindungsgemäß detektiert wird, in den Grundzustand zurückkehren. Die Auswahl und ggf. unterschiedliche Ausführung geeigneter Anregungsquellen ist demnach davon abhängig, welcher Typ der Lumineszenzenerzeugung angewendet werden soll. Eine bevorzugte Variante der Lumineszenzerzeugung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Chemolumineszenz. Hierbei erfolgt die elektronische Anregung durch eine chemische Reaktion mit anschließender Lichtemission.

Vorzugsweise wird die Chemolumineszenz in der Weise durchgeführt, dass die Analyten mit einem Enzym-Marker gekoppelt werden, der die chemische Reaktion eines Substrates unter Freisetzung lumineszenter Strahlung katalysieren kann. Hierfür sind alle Enzyme geeignet, die die entsprechende Anregung des Substrates katalysieren können, z.B. Alkalische Phosphatase (AP), Meerrettichperoxidase und andere Peroxidasen, insbesondere thermostabile Peroxidasen, Glucose-6-Phosphatase-Dehydrogenase oder Xanthinoxidase. Als Substrate kommen alle chemilumineszenten Moleküle in Frage, insbesondere Luminol, Isoluminol, Lucigenin, Peroxioxalate, Acridinester, Thioester, Sulfonamide und Phenantridiniumester.

Besonders bevorzugt ist ein System bestehend aus Meerrettichperoxidase als Enzymmarker, das mit einem Rezeptor für ein Hapten konjugiert ist, und Luminol zusammen mit Wasserstoffperoxid als Substrat. Als Rezeptor kommt hier beispielsweise Avidin oder Streptavidin in Frage, die dann mit einem mit Biotin oder dessen Derivaten biotinylierten Analyten gekoppelt werden können.

Eine andere besonders bevorzugte Variante sieht ein System aus Alkalischer Phosphatase mit Adamantyl-1,2-dioxethanphenylphosphat als Substrat vor. Auch hier liegt wieder eine Konjugation mit beispielsweise Avidin, Streptavidin oder Anti-Dioxygenin als Rezeptor vor. Diese können dann mit Analyten, die mit den entsprechenden Partnern, wie z.B. Biotin oder dessen Derivate und Dioxygenin, modifiziert sind, gekoppelt werden. Es ist dabei bevorzugt, dass es sich bei den genannten Enzymen um temperaturstabile Enzyme handelt. Durch die Verwendung temperaturstabiler Enzyme wird es ermöglicht, die temperaturabhängigen Parameter der Analyten zu bestimmen.

Eine weitere Variante betrifft die Photolumineszenz.

Hinsichtlich der Photoluminophore wird auf die DE 101 33 844 A1 ausdrücklich Bezug genommen. Die hier genannten organischen wie anorganischen Luminophore sind allesamt dann einsetzbar, wenn das Detektionsprinzip auf der Photolumineszenz beruht.

Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine zeitaufgelöste Fluoreszenz direkt auf dem Chip mit analogen Schaltungen ausgewertet werden, indem man nach Abschalten der Anregungsquelle, z.B. jede Nanosekunde, einen Wert aufnimmt, der dann z.B. auch mit einem Referenzwert einer zuvor durchgeführten Mes sung, welcher ebenfalls auf dem Chip gespeichert wurde, verglichen wird. Darüber hinaus wird auf diese Weise ermöglicht, dass man unspezifische Störsignale, wie z.B. Eigenfluoreszenz von gegebenenfalls anwesenden Systemkomponenten, herausrechnen kann. Geht man davon aus, dass man mittlerweile auch bis in de GHZ-Bereich (< 1 ns) auflösen kann, so kann die Eigenfluoreszenz von der künstlichen Fluoreszenz unterschieden werden.

Sofern die Sensoroberfläche das Design einer Microarray-Anordnung aufweist, bei der eine Vielzahl von Detektionsfeldern auszuwerten sind, erfolgt die Detektion der Messfeld- bzw. -punktsignalwerte vorzugsweise sequentiell, indem z.B. ganze Zeilen oder Spalten der Sensoroberfläche bzw. Teile derselben nacheinander detektiert werden (Multiplexanwendung).

Beispielsweise können die elektronischen Ausgangssignale der Detektoren mittels geeigneter Schaltungseinrichtungen nach einer Analog-Digitalumsetzung einer externen Auswerteeinrichtung zugeführt werden. Als erfindungsgemäß geeignete optische Detektoren bzw. Sensoren kommen neben der Photodiode (pn, p-i-n, avalanche) CCD-Sensoren, Photoleiter oder eine Kamera in Betracht, die vorzugsweise in Form einer Zeilen- oder Arrayanordnung in das Halbleitersubstrat der Vorrichtung monolithisch eingearbeitet sind. Photodioden können vorteilhaft im Rahmen einer zeitaufgelösten Lumineszenzmessung eingesetzt werden, da sie im Vergleich zu Photomultipliern eine geringe Detektionsfläche aufweisen. Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung von CMOS-Photodioden oder CMOS-Kameras.

Für den Fachmann ist klar, dass die Wahl des Detek tors bzw. des Materials von der zu detektierenden Emissionswellenlänge des Farbstoffes abhängt. Grundsätzlich ist zu sagen, dass der Detektor aufgrund des sog. „Halbleiterbandgaps" je nach Materialwahl (z.B. Silizium oder Germanium) unterschiedliche Empfindlichkeiten bezüglich der Wellenlänge hat. Im bevorzugten Falle der Verwendung einer Silizium-Photodiode wird daher ein Empfindlichkeitsbereich geschaffen, der vom infraroten bis in das ultraviolette Wellenspektrum reicht, wobei die Empfindlichkeit zwischen diesen Bereichen am größten ist (B. Streetman, Prentice-Hall, Inc., „Solid State Electronic Devices", 1995, ISBN 0-13-436379-5, S. 201–227).

Nach einer bevorzugten Ausführungsform besteht die ggf. freigelegte Oberfläche einer jeden Photodiode aus SiO₂ oder Si₃N₄. Weiterhin können bestimmte Verfahrensparameter der Rezeptor/Analyt-Bindung und der Detektion durch Wahl des Oberflächenmaterials für den Sensorchip positiv beeinflusst werden. Beispielsweise kann an manchen Stellen Si₃N₄, an anderen dagegen SiO₂ oder z.B. Al₂O₃ oder ein Edelmetall aufgebracht sein, wodurch auf dem Sensorchip oder sogar im Detektionsfeld für die Biomoleküle oder Spacer bevorzugte Bereiche mit z.B. eher hydrophoben bzw. eher hydrophilen Eigenschaften bereitgestellt werden können, um das Aufbringen von z.B. DNA-Rezeptoren ortsgerichtet zu fördern oder zu verhindern. Des weiteren können durch Aufbringen von ansteuerbaren Edelmetallelektroden erfindungsgemäß bevorzugte Vorrichtungen geschaffen werden, bei denen z.B. durch Anlegen ggf. pro Detektionspunkt- bzw. -feld unterschiedlicher Spannungen Hybridisierungsereignisse beschleunigt oder eine Fluoreszenz ausgehend von elektrisch anregbaren Farbstoffen ausgelöst werden kann.

Selbstverständlich können die Detektoren zusätzlich in Gruppen angeordnet sein, wodurch einzelne Detektionsfelder geschaffen werden, deren Eingangssignale ein zuverlässiges Ergebnis gewährleisten als es bei einer Einzelbelegung pro Detektionsbereich der Fall wäre.

Weiterhin kann man durch mehrere Detektoren pro Detektionsfeld Profile aufnehmen, mit deren Hilfe sich die ortsspezifische Zuordnung eines Bindungsereignisses von Rezeptor und Ligand im Wege der Zentrierung verbessern lässt. Im Rahmen dieser speziell auf die als solche bekannten Mikroarray-Anordnungen gerichteten Ausführungsformen können die einzelnen Photodioden vorteilhafterweise zu definierten Detektionsgruppen bzw. Messfeldern zusammengefasst sein, wodurch die Sensitivität der nachfolgenden Lumineszenzmessung sowie die Reproduzierbarkeit und Verlässlichkeit der hierdurch erhaltenen Messdaten signifikant erhöht werden.

Durch eine Mehrfachbelegung pro Detektionsfeld kann auch eine messtechnische Zentrierung des Liganden-Bindungsereignisses gewährleistet werden, was im Wege der Signalaufbereitung zu einer deutlichen Sensitivitätssteigerung beitragen kann.

Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Anregungsquelle integraler Bestandteil des Detektionssystems und wird durch den Detektor selbst bereitgestellt. Die Wahl einer pn-Diode aus direktem Halbleitermaterial ermöglicht folgendes: Im ersten Fall bedeutet die Aktivierung die Anlegung einer Spannung, wodurch ein Lichtsignal (pn-Diode wird als LED benutzt) ausgesendet wird, welches je nach Art und Beschaffenheit der pn-Diode in einem bestimmten Emissionswellenlängenband liegt und die Anregung eines im Bereich dieser pn-Diode gebundenen Liganden bewirkt. Nach Deaktivierung der pn-Diode (pn-Diode wird als Photodiode benutzt) und nach Verstreichen einer gewissen Karenzzeit wird sie dann noch einmal aktiviert, um die gewünschte(n) Messung(en) durchzuführen.

Dadurch, dass die Anregungsstrahlung in der zuvor beschriebenen Ausführungsform über dieselbe Komponente eingekoppelt wird, mit der auch die Lumineszenzstrahlung aufgefangen wird, kann erreicht werden, dass selektiv ein sehr kleiner Bereich der Sensoroberfläche bzw. des Detektorfeldes bestrahlt wird und von diesem Bereich ausgehende Lumineszenzstrahlung ausgewertet wird. Durch diese Vorgehensweise ist das untersuchte Detektorfeld sehr genau abzubilden und eine Störung der Messung durch die Lumineszenz von außerhalb des untersuchten Bereichs kann verhindert werden.

Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensors kann unter Anwendung des an sich bekannten CMOS (complementary metal-oxide semiconductor)-Verfahrens erfolgen, weshalb alle Schaltungsbibliotheken für die Integration von Signalkonditionierung und Auswertung ohne Modifikationen verfügbar sind und im Rahmen der vorliegenden Erfindung implementiert werden können. Erfindungsgemäß ebenfalls geeignete Herstellungsverfahren sind z.B. NMOS-Prozesse oder Bipolar-Prozesse (Wolf, Silicon Processing for the VLSI ERA, Vol. 1, Lattice Press, Sunset Beach (1986)). Ferner besteht die insbesondere nach Kostengesichtspunkten interessante Möglichkeit der Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors auf der Basis von organischen Halbleitern (EP-A-1 085 319).

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen Detektionspunkte oder -felder voneinander in der Weise getrennt, dass im Wesentlichen keine Lichtemission eines Punktes oder Feldes von dem oder den Detektoren eines anderen Punktes oder Feldes empfangen werden kann. So können die einzelnen Detektionsorte in jeweiligen Vertiefungen angeordnet sein, wie sie z.B. von üblichen Mikrotiterplatten bekannt sind. Bevorzugt sind erfindungsgemäß muldenartige Vertiefungen und solche, deren seitliche Wandungen im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Sensorchips angeordnet sind. Die jeweiligen Abmessungen einer solchen Vertiefung kann der Fachmann in Kenntnis des Anwendungsbereichs frei wählen, solange sich der bzw. die Luminophoren des zu erwartenden Liganden/Rezeptor-Komplexes innerhalb der Vertiefung befinden und im Wesentlichen kein Emissionslicht in benachbarte Vertiefungen eindringen kann. Eine besonders bevorzugte Vertiefung ist um mindestens 100 nm in die Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesenkt. Der gleiche Effekt kann alternativ erzielt werden, indem auf der im Wesentlichen planaren Detektoroberfläche senkrecht nach oben gerichtete Trennmittel angeordnet sind, deren Abmessungen vom Fachmann in Kenntnis des gewünschten Anwendungsbereiches und der räumlichen Abmessung eines antizipierten Rezeptor/Liganden-Komplexes leicht ausgewählt werden kann. Die Anbringung entsprechend geeigneter Trennmittel kann beispielsweise durch anodische Bonden oder durch sog. Flip-Chip-Verfahren erfolgen. Ein derartiges System ermöglicht erfindungsgemäß ein sensorgestütztes elektrooptisches Bildaufnahmeverfahren.

In einer bevorzugten Ausführung sind auf dem Detektorchip Kanäle aufgebracht, sodass auf einem Chip parallel mehrere verschiedene Analyte gemessen werden können. Die Kanäle können z.B. Reihen von Sensorelementen versorgen, auf denen die Arrays der Rezeptoren gebunden sind. So ließen sich z.B. Kalibrationsmessungen durchführen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Parallelemessung von n identischen Arrays durchgeführt, um so die Kosten pro Analyse drastisch zu senken. Dazu wird der Chip durch Mikrokanäle in beispielsweise 8 identische Kompartimente unterteilt.

Wenn man als Trägereinrichtung für die Rezeptoren und die Ausbildung der Sensoren ein monolithisch integriertes Halbleitermaterial verwendet, lässt sich auch eine monolithisch integrierte Schaltung auf demselben Substrat herstellen, wodurch in unmittelbarer Nähe zum Untersuchungsobjekt (Rezeptor/Analyt-Komplex) eine Vorverarbeitung der elektronischen Sensor-Ausgangssignale erfolgen kann. Somit handelt es sich bei dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um eine „intelligente" Sensoreinrichtung, die wesentlich mehr leistet, als rein passive Sensoren. Beispielsweise können die Ausgangssignale der elektrooptischen Sensoren durch eine mitintegrierte Schaltung so aufbereitet werden, dass sie über Ausgangsschaltungen und Anschlusskontakte relativ problemlos nach außen geführt werden können. Ferner kann die Vorverarbeitung aus der Digitalisierung der analogen Sensorsignale und ihre Umwandlung in einen geeigneten Datenstrom bestehen. Des weiteren kann das signal-to-noise ratio, d.h. Signal-Rausch-Verhältnis, durch die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwirklichten Nähe des Detektors zum Ort der Signalverarbeitung aufgrund kurzer Signalwege sehr stark verbessert werden. Darüber hinaus sind auch weitere Verarbeitungsschritte möglich, mit denen z.B. die Datenmenge reduziert werden kann oder die der externen Verarbeitung und Darstellung über einen Personal Computer (PC) erfolgen kann. Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung so ausgestaltet sein, dass die vorzugsweise verdichteten bzw. aufbereiteten Daten über Infrarot- oder Funkverbindung an entsprechend ausgestattete Empfangsstationen übermittelt werden können.

Die Steuerung der zugehörigen Einrichtungen auf dem Substrat kann über Steuersignale aus einer Steuereinrichtung erfolgen, die vorzugsweise ebenfalls ganz oder teilweise auf dem Substrat ausgebildet sein kann oder extern angeschlossen wird.

Die mögliche Auswertung der optischen/elektrischen Signale im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens über einen handelsüblichen Computer hat den weiteren Vorteil, dass über geeignete Programme eine weitgehende Automatisierung der Datenauswertung sowie -speicherung möglich ist, sodass man im Rahmen der Datenanalyse durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung keinerlei Einschränkungen gegenüber mit Hilfe herkömmlicher externer Abbildungsoptiken generierter Daten unterliegt.

Das direkte Erfassen der Lumineszenzen auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird dadurch realisiert, dass sich die für einen spezifischen Nachweis erforderlichen Rezeptormoleküle – direkt oder z.B. über einen üblichen Abstandshalter, d.h. Spacer, bzw. eine Kopplungsmatrix – auf der Oberfläche eines optischen Detektors befinden, welcher als integraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgestaltet ist.

Die Anregungsquelle, wie sie z.B. in Form einer oder mehrerer Weißlichtlampen LED's, (Halbleiter-)Laser, UV-Röhren, sowie durch Piezoelemente (Ultraschall) bzw. durch Lichtenergie abgebende Gase und/oder Flüssigkeiten (chemische Anregung) bereitgestellt werden kann, sollte ausreichend leistungsstark und vorzugsweise mit hoher Frequenz repetierbar sei. Letztere Eigenschaft ist dann gegeben, wenn die Lichtquelle sowohl kurzzeitig aktiviert als auch gelöscht werden kann. Im Falle der Verwendung einer optischen Anregungsquelle sollte diese so abschaltbar sein, dass nach dem Abschalten im Wesentlichen keine weiteren Photonen, wie z.B. durch Nachglühen, auf den Detektor treffen. Dies kann erforderlichenfalls beispielsweise durch die Verwendung von mechanischen Verschlussblenden (engl. „shutter"), sowie durch Auswahl von LED's oder Lasern als optische Anregungsquelle gewährleistet werden.

Vorzugsweise ist die Anregungsquelle mit der Vorrichtung optisch und mechanisch derartig mit den optischen Detektoreinheiten gekoppelt, dass ein Strahlungsfeld in Richtung der Optosensoren erzeugt wird, wobei der räumliche Abstand der Anregungsquelle zur Detektionsebene möglich klein ist. Der Abstand muss jedoch ausreichend sein, damit die für den bestimmungsgemäßen Einsatz erforderlichen Reaktionen zwischen Ligand und Rezeptor nicht beeinträchtigt werden.

Auf der Sensorseite können unterschiedliche oder durchstimmbare Sensoren für die Erfassung der aus einem Rezeptor/Liganden-Komplex emittierten Lichtenergie vorhanden sein. Sofern es sich hierbei um Photodioden handelt, werden entweder wellenlängenspezifische Photoelemente oder aber herkömmliche Photodioden ausgewählt, die mit aufgelegten, aufgebrachten, auf gedampften oder integrierten Wellenlängenfiltern ausgestattet sind. So ist z.B. bekannt, dass Siliziumnitrid im Gegensatz zu Siliziumoxid UV-Licht nicht durchlässt, und dass Polysilizium UV-Strahlung absorbiert (V.P. Iordanov et al., Integrated high rejection filter for NADH fluorescence measurements, Sensors 2001 Proceedings, Vol. 1, 8–10 Mai, S. 106–111, AMA-Service (2001)). Daher kann auf die Gateoxidschicht im Rahmen des üblichen CMOS-Prozesses Nitrid oder Polysilizium deponiert werden, wodurch auf der Photodiode entsprechende Filter geschaffen werden. So hat z.B. NADH (Nicotinamid Adenine Dinucleotid) eine Anregungswellenlänge von 350 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Durch Aufbringung eines Filters, der 350 nm ausfiltert, kann daher die Sensitivität erhöht werden. Erfindungsgemäß kann dieser Effekt genutzt werden, um bei paralleler Verwendung von z.B. zwei unterschiedlichen Luminophoren, von denen beispielsweise nur einer Licht im UV-Bereich emittiert, eine differentielle Detektion zu ermöglichen, da die hierfür vorgesehenen Detektoren UV-sensitiv ausgestaltet sind oder nicht. Ferner bietet dieser Effekt die Möglichkeit, gegebenenfalls störende Eigenfluoreszenzen anwesender Materialien mit bekannter Emissionswellenlänge durch Bereitstellung entsprechender Filter aus dem Messverfahren herauszunehmen. Ein Beispiel hierfür ist die parallele Verwendung von Europium-Chelaten (Emission bei ca. 620 nm) und mit Kupfer dotiertem Zinksulfid (Emission bei ca. 525 nm), die durch hinreichend voneinander verschiedenen Emissionswellenlängenbereichen eine Zweifarbdetektion ermöglichen, z.B. innerhalb eines Bereiches eines Detektorpunktes bzw. -feldes, indem z.B. die Hälfte der Sensoren eines Detektorpunktes bzw. -feldes mit einem Tiefpassfilter und die andere Hälfte der Sensoren des gleichen Punktes oder Feldes mit einem Hochpassfilter ausgestattet ist.

Zusätzlich oder alternativ können unterschiedliche Luminophore parallel eingesetzt werden, sofern ihre physikalischen bzw. optischen Eigenschaften hinreichend voneinander abweichen. Beispielsweise werden erfindungsgemäß die unterschiedlichen Anregungswellenlängen zweier zu verwendender Luminophore A und B und/oder deren unterschiedlichen Halbwertzeiten genutzt. Dies kann z.B. durch Bereitstellung von zwei unterschiedlich dotierten Nanokristallen erfolgen.

Um mit dieser Schicht aus Optosensoren eine Rezeptor/Analyt-spezifische Detektion durchführen zu können, kann sie nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit einer kopplungsfähigen Substanz beschichtet werden. Typischerweise werden hierzu die Sensor-Chip-Oberflächen aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z.B. Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen, sog. „Linker", die beispielsweise eine Halogensilan-, z.B. Chlorsilan, oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung an die Trägerstruktur aufweisen, getaucht, so dass sich eine sich selbst organisierende Monoschicht (SAM) bildet, durch welche die kovalente Bindung zwischen Sensoroberfläche und Rezeptor erzeugt wird. Beispielsweise kann mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z.B. durch Eintauchen in eine Lösung von 1 % Silan in Toluol, langsames Herausziehen und Immobilisieren durch „Backen" bei 120 °C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im Allgemeinen eine Dicke von wenigen Ångström auf. Die Kopplung zwischen Linker und Rezeptormolekül(n) erfolgt über eine geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder Epoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Molekülen, insbesondere auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise „Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press 1996.

Erfindungsgemäß wird ebenso eine Diagnosevorrichtung bereitgestellt, die ein mikrooptisches Detektionssystem, wie es zuvor beschrieben wurde, enthält. Unter Diagnosevorrichtungen sind hierbei sämtliche Messanordnungen zu verstehen, für die der Einsatz von mikrooptischen Detektionssystemen, z.B. in Form von Biochips, technisch sinnvoll und praktizierbar ist. Hier sind insbesondere Handheld-Geräte bevorzugt, die vor Ort, d.h. z.B. im Krankenhaus oder in einer Arztpraxis, im portablen Einsatz verwendet werden können.

Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten bereitgestellt. Dieses basiert auf den folgenden Verfahrensschritten:

A) Zunächst werden Rezeptoren für die Analyten an mindestens eine Oberfläche einer Trägerstruktur gebunden, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden.
B) Die Rezeptoren werden mit den Analyten in Kontakt gebracht, wobei es zur Ausbildung von Rezeptor-Analyt-Komplexen kommt.
C) Die Rezeptor-Analyt-Komplexe werden mit mindestens einer Anregungsquelle angeregt, um eine detektierbare optische Änderung des Komplexes, des Rezeptors oder des Analyten zu bewirken.
D) Die hervorgerufene optische Änderung wird dann mit mindestens einem in der Trägerstruktur monolithisch integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten Detektor registriert und anschließend ausgewertet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird dabei die zuvor beschriebene Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29 eingesetzt.

Besonderes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Anregung und die Detektion bei mindestens zwei unterschiedlichen Temperaturen erfolgt, um die temperaturabhängigen Parameter bei den mindestens zwei Temperaturen zu registrieren und auszuwerten.

Die zuvor beschriebenen Verfahrensschritte werden bei unterschiedlichen Temperaturen unter ansonsten gleiche Bedingungen durchgeführt. Hier ist es also möglich, ein Temperaturprogramm zu fahren, sodass z.B. in einem Temperaturfenster von 20 bis 80 °C in 10 °C-Schritten die Temperatur erhöht wird und für diese jeweiligen Temperaturstufen das Nachweisverfahren für den Analyten durchgeführt wird. Dies ermöglicht dann, die Bestimmung einer Schmelzkurve der Analyten, die die Temperaturabhängigkeit der Dissoziation der Rezeptor-Analyt-Komplexe wiedergibt.

Vorzugsweise erfolgt die Detektion in Form eines ELISA, wie er aus dem Stand der Technik bekannt ist.

So lassen sich erfindungsgemäß als temperaturabhängige Parameter die Assoziationskonstante, die Dissoziationskonstante und/oder die Gleichgewichtskonstante bestimmen.

Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren in allen Bereichen, in denen die Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten von Bedeutung ist. Konkrete Beispiele für derartige Anwendungsfelder sind der Erregernachweis im Krankenhaus, der Vaterschaftsnachweis, der Täternachweis oder auch eine P450-Isoenzymanalyse. Diesbezüglich ist insbesondere die maligne Hyperthermie, die auf einer Mutation des Ryanodin-Rezeptors beruht, zu nennen. Das erfindungsgemäße Detektionssystem kann hier eine frühzeitige Erkennung der Hyperthermie ermöglichen. Ein anderes wichtiges Anwendungsfeld ist die Überwachung der Blutgerinnungskaskade, um bei Patienten mit erhöhter Blutgerinnungsneigung die Thrombosegefahr rechtzeitig erkennen und behandeln zu können.

Anhand der nachfolgenden Figuren und des nachfolgenden Beispiels soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten erfindungsgemäßen Varianten zu beschränken.

1 zeigt anhand einer schematischen Darstellung den Aufbau einer Variante des erfindungsgemäßen optischen Detektionssystems.

2 zeigt in einer schematischen Darstellung die Detektion von Proteinen unter Verwendung des erfindungsgemäßen mikrooptischen Detektionssystems.

3 zeigt anhand einer schematischen Darstellung die Detektion von Nukleinsäuren mit einem erfindungsgemäßen mikrooptischen Detektionssystem.

In 1 ist ein erfindungsgemäßes mikrooptisches Detektionssystem 1 dargestellt. Dies beruht auf einer Trägerstruktur 2, die aus den aus dem Stand der Technik bekannten Materialien für die Herstellung von Chips besteht. Hierzu zählt insbesondere eine Trägerstruktur aus polychloriertem Biphenylen (PCB). Auf der Trägerstruktur 2 ist ein Detektor 3 angeordnet, im vorliegenden Fall in Form eines einzigen Sensorchips. Diese Variante betrifft eine Chemoluminszenz-Messung. Beispielsweise kann im Falle einer Photoluminszenz-Messung in dem Sensorchip 3 zusätzlich eine Anregungsquelle enthalten sein. Der Sensorchip 3 kann auch direkt in das Substrat integriert sein. Der Sensorchip wird über zwei Haftungsstellen 8 und 8', die z.B. aus einem Klebstoff oder einem Lot bestehen können, am Substrat befestigt. Auf dem Sensorchip ist eine Flusszelle 4 angeordnet, die der kontinuierlichen Inkontaktbringung eines Fluids mit der Oberfläche des Sensorchips dient. Die Flusszelle weist dabei einen Zufluss 6 und einen Abfluss 7 auf, über die das Fluid in bzw. aus der Flusszelle transportiert werden kann. Weiterhin ist in der Flusszelle 4 ein Temperierelement 5 integriert, das eine Temperaturerhöhung bzw. auch eine Temperaturerniedrigung des Fluids ermöglicht. Alternativ kann das Temperierelement 5 auch zur Temperierung der Oberfläche der Trägerstruktur 2 bzw. des Sensorchips eingesetzt werden. Die Anordnung des Temperierelementes 5 ist daher beliebig wählbar, solange die Anordnung eine entsprechende Temperierung erlaubt. Als Temperierelement 5 wird im vorliegenden Fall ein Peltierelement verwendet. Weiterhin kann die Flusszelle mit weiteren Komponenten gekoppelt sein, die in der vorliegenden 1 jedoch nicht dargestellt sind. Eine Möglichkeit ist die Kopplung der Flusszelle mit einer Pumpe für den Transport von Flu iden, die direkt an den Zufluss 6 bzw. Abfluss 7 gekoppelt werden kann.
In 2 ist das Messprinzip für die Bestimmung von Proteinen dargestellt. In die Trägerstruktur 2 ist hier ein Detektor 3 in Form einer Photodiode integriert. Auf der Oberfläche der Trägerstruktur 2 im Bereich der Photodiode 3 ist ein Primärantikörper 9 immobilisiert, der als Rezeptor fungiert. Der derart immobilisierte Rezeptor wird dann mit der den Analyten 10 enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, wobei es zu einer Bindung zwischen Rezeptor 9 und Analyt 10 kommt. In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird dann die Oberfläche des Chips mit einem Detektormolekül in Kontakt gebracht, das an den Analyten 10 binden kann. Dieses Detektormolekül besteht aus einem Rezeptor 11, im vorliegenden Fall einem Sekundärantikörper, und einem hiermit gekoppelten thermisch stabilen Enzym 12, das eine optische Nachweisreaktion katalysieren kann. Im vorliegenden Fall wird als thermisch stabiles Enzym Meerrettich-Peroxidase eingesetzt. Im Anschluss wird dann das Substrat, bestehend aus Wasserstoff-Peroxid und Luminol, zugesetzt. Die damit verbundene Leuchtreaktion kann dann mittels der Photodiode 3 registriert und ausgewertet werden.
Auch hier ist wieder eine Trägerstruktur 2 dargestellt, in die eine Photodiode als Detektor 3 integriert ist. in der Oberfläche der Trägerstruktur ist hier ein DNA-Rezeptor 14 immobilisiert. In einem folgenden Verfahrensschritt wird nun die Probe mit den Analyten 15 in Form eines DNA-Moleküls mit dem Biochip in Kontakt gebracht. Das DNA-Molekül kann z.B. durch Biotin-dUTP markiert werden. In einem folgenden Verfahrensschritt wird dann das Substrat, bestehend aus Luminol und Wasserstoff-Peroxid, zugesetzt. Das Detektionsprinzip entspricht auch hier dem unter 2 beschriebenen.
Beispiel 1
Mikroorganismen werden in einem geeigneten Extraktionssystem aufbereitet (Buchholz et al., 2002). Bei der PCR können über geeignete Primer (Consensus Primer) alle bekannten und auch unbekannten Bakterien mit der PCR erfasst und deren 16s rRNA amplifiziert werden. Die PCR wird bevorzugt asymmetrisch durchgeführt, d.h. von einem der beiden PCR-Primer liegt in der Reaktion ein Mangel vor, sodass neben Doppelstrang DNA auch Einzelstrang DNA gebildet wird. Durch den Einbau von Biotin-dUTP in der PCR werden die DNA Moleküle markiert. Diese markierten Moleküle werden dann auf dem Chip hybridisiert. Die Temperatur liegt dabei unter dem zu erwartenden Schmelzpunkt (z.B. 20 °C tiefer als der Schmelzpunkt). Nach ca. 1h wird die Flusszelle des Chips mit Waschpuffer gespült und Streptavidin-HRP wird zugegeben. Nach ca. 10 Minuten wird die ungebundene HPR durch Waschen mit Waschpuffer entfernt und ECL-Substrat wird zugegeben (Luminol plus Wasserstoffperoxid). Nach Einsetzen der Leuchtreaktion wird die Temperatur schrittweise von 20 °C auf 80 °C erhöht und das Signal wird bei jedem Temperaturschritt gemessen. Dabei findet eine langsame Perfusion der Flusszelle statt, sodass abgelöstes Analyt die Messung nicht mehr stört.
Anschließend wird eine Temperaturkorrektur der Enzymaktivität (der Umsatz des Enzyms ist temperaturabhängig) durchgeführt, um vergleichbare Messwerte zu erhalten. Nun können auch problematische Punktmutationen sicher erkannt werden. Da die Bakterien sich in den Sequenzen zwischen dem Primer stark unterschei den, kann durch die Wahl der Sonden eine genaue Identifizierung bekannter Mikroorganismen stattfinden.

Claims

Mikrooptisches Detektionssystem (1) zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten enthaltend a) eine Trägerstruktur (2) mit mindestens einer Oberfläche, auf der Rezeptoren (9, 14) für die Analyten zur Ausbildung von Rezeptor-Analyt-Komplexen immobilisiert sind, wobei die Rezeptoren eine Vielzahl von Messpunkten bilden, b) mindestens eine Anregungsquelle, die eine detektierbare optische Änderung des Rezeptor-Analyt-Komplexes induzieren kann, c) mindestens einen monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur gerichteten optischen Detektor (3), d) mindestens eine Vorrichtung (4) zum kontinuierlichen Inkontaktbringen eines Fluids mit den Messpunkten an der Oberfläche der Trägerstruktur sowie e) mindestens ein Temperierelement (5) für das Fluid.
Mikrooptisches Detektionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) eine Flusszelle, eine Küvette oder ein Probenbehälter ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) in die Trägerstruktur (2) eingeätzt ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) aus einem photogehärteten Polymer besteht und durch Photopolymerisation auf der Trägerstruktur (2) aufgebracht ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) auf der Trägerstruktur (2) durch Kleber, Bonding und/oder Pressen aufgebracht ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) kanalförmig ausgebildet ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) als Ausnehmung in der Trägerstruktur (2) ausgebildet ist, die auf der der Oberfläche der Trägerstruktur (2) abgewandten Seite mit einer mindestens zwei punktförmigen Ausnehmungen für den Zu- und Abfluss des Fluids aufweisenden Abdeckschicht versehen ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Vorrichtung (4) mit mindestens einer Pumpe für den Transport von Fluiden gekoppelt ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) ein Peltierelement ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) mit der Vorrichtung (4) thermisch gekoppelt ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Temperierelement (5) monolithisch in die Trägerstruktur (2) integriert ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionssystem (1) zusätzlich einen Thermosensor zur Bestimmung der Temperatur des Fluids und/oder der Oberfläche der Trägerstruktur (2) aufweist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Thermosensor mit der Oberfläche der Trägerstruktur (2) in thermischem Kontakt steht.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle eine zur Anregung von Chemolumineszenz geeignete Verbindung ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle eine Strahlungsquelle für Strahlen insbesondere Licht, Elektronen, Ionen und Schallwellen ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsquelle aus einem elektrischen Feld besteht.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Detektor (3) eine Photodiode, ein Photomultiplier, ein Photoleiter oder eine Kamera ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Detektor (3) eine CMOS-Photodiode und/oder eine CMOS-Kamera ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) direkt oder über einen Linker an die Oberfläche der Trägerstruktur (2) kovalent gebunden sind.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker aus mindestens einer Schicht eines bifunktionellen Silans besteht.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, Haptenen, Proteinen, Peptiden, Antikörpern oder deren Fragmenten, Zuckerstrukturen, Rezeptoren oder Liganden.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren (9, 14) in voneinander getrennten Nachweisfeldern, die die Messpunkte darstellen, immobili siert sind.
Mikrooptisches Detektionssystem nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder arrayartig angeordnet sind.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder als muldenartige Vertiefung in der Oberfläche der Trägerstruktur (2) ausgebildet sind.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisfelder durch im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche ausgerichtete Trennmittel voneinander getrennt sind.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Detektionssystem (1) mindestens eine weitere Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Steuereinheit, einem Verstärker, einem Signalwandler, einer Speichereinheit, einem Filter, einer Optik, Lichtleitern und Schutzschichten integriert ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt (10, 15) mit einem Detektormolekül gekoppelt wird, das ein thermostabiles Enzym (12) enthält.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym (12) Peroxidase oder alkalische Phosphatase ist.
Mikrooptisches Detektionssystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten (10, 15) Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörper und deren funktionellen Fragmenten sind.
Diagnosevorrichtung enthaltend ein mikrooptisches Detektionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
Diagnosevorrichtung nach Anspruch 30 in Form einer Handheld-Vorrichtung.
Verfahren zur Bestimmung temperaturabhängiger Parameter von Analyten, bei dem A) Rezeptoren (9, 14) für die Analyten (10, 15) an mindestens eine Oberfläche einer Trägerstruktur (2) gebunden werden, wobei die Rezeptoren (9, 14) eine Vielzahl von Messpunkten bilden, B) die Rezeptoren (9, 14) mit den Analyten (10, 15) in Kontakt unter Ausbildung von Rezeptor-Analyt-Komplexen gebracht werden, C) die Rezeptor-Analyt-Komplexe mit mindestens einer Anregungsquelle zu einer detektierbaren optischen Änderung angeregt werden, D) die optische Änderung mit mindestens einem monolithisch in die Trägerstruktur integrierten und auf die Oberfläche der Trägerstruktur (2) gerichteten Detektor (3) registriert und ausgewertet wird, wobei die Schritte C) und D) bei mindestens zwei unterschiedlichen Temperaturen erfolgen, um die temperaturabhängigen Parameter bei den mindestens zwei Temperaturen zu registrieren und auszuwerten, und das Verfahren unter Verwendung des mikrooptischen Detektionssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 29 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet dass die Anregung mittels Licht, insbesondere kurzwelliges Licht oder Röntgenstrahlung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet dass die Anregung mittels Elektronen, Ionen, Schallwellen, radioaktiven Stoffen, elektrischen Feldern, Induktion oder mechanisch erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung mittels Chemolumineszenz erfolgt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt (10, 15) mit einem Detektormolekül gekoppelt wird, das aus einem eine optische Nachweisreaktion katalysierenden, thermisch stabilen Enzym (12) und einem mit dem Enzym konjugierten Rezeptor (11) für den Analyten besteht.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das thermisch stabile Enzym (12) eine Peroxidase und/oder eine alkalische Phosphatase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines Korrekturfaktors die Temperaturabhängigkeit arithmetisch korrigiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor (11) Avidin und/oder Streptavidin ist und der Analyt (10, 15) biotinyliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Photodioden, Photomultiplier, Photoleiter oder Kamera erfolgt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mit CMOS-Photodiode und/oder CMOS-Kamera erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoren (3) seriell ausgelesen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Temperatur des Fluids und/oder der Oberfläche der Trägerstruktur ein Thermosensor verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Verfahrensschritte bei unterschiedlichen Temperaturen unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass bei verschiedenen Temperaturen vor der Detektion die Oberfläche der Trägerstruktur mit einer Waschlösung zur Entfernung von dissoziierten Analyten gespült wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten (10, 15) Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörper und deren funktionellen Fragmenten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion als ELISA durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass als temperaturabhängige Parameter die Assoziationskonstante, die Dissoziationskonstante und/oder die Gleichgewichtskonstante bestimmt wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 32 bis 48 zur Bestimmung der Bindungsstärke von Analyten.
Verwendung nach Anspruch 49 zur Bestimmung der Assoziationskonstanten, der Dissoziationskonstanten und/oder der Gleichgewichtskonstanten von Analyten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 49 oder 50 für Erregernachweise im Krankenhaus, insbesondere zur Erkennung von Hyperthermie oder der überwachung der Blutgerinnungskaskade, Vaterschaftstests, Täternachweise und/oder P450-Isoenzymanalyse.