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Die
Erfindung bezieht sich auf ein elektrochemisches Transducer-Array
und weiterhin auf spezifische Verwendungen eines solchen Transducer-Arrays.
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Elektrochemische
Transducer werden im Allgemeinen in die drei Gruppen potentiometrisch,
konduktometrisch und amperometrisch unterteilt. Bei den potentiometrischen
Transducern wird das Potenzial gegen eine Referenzelektrode gemessen.
Auf dieser Basis funktionieren ionenselektive Sensoren. Dabei wird
die Elektrode mit einer ionenselektiven Membran beschichtet. Das
Potenzial der Elektrode ist dann ein Maß für die Konzentration der entsprechenden
Ionen. Mittels einer gaspermeablen Membran kann so auch ein potentiometrischer
pCO2-Sensor realisiert werden.
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Bei
den amperometrischen Transducern hingegen wird eine Spannungsdifferenz
zwischen zwei Elektroden erzeugt, bei der die zu detektierende Substanz
umgesetzt wird. Die bei der Reduktion oder Oxidation fließenden Ströme ergeben
das Messsignal. Eine breite Anwendung finden sie als Sauerstoffsensoren
oder biochemische Sensoren. Beim Clark-analogen Sauerstoffsensor
wird eine gaspermeable Membran auf den amperometrischen Sensor gebracht.
Bei den biochemischen Sensoren werden molekulare Erkennungssysteme,
z. B. Haptene, Antigene oder Antikörper, auf oder in der Nähe der Elektroden
platzieren. Das Zielmolekül bindet
daran und wird entweder direkt oder über Zwischenschritte mit einem
Enzymlabel versehen. Wird nun das entsprechende Enzymsubstrat zugegeben,
setzt das Enzym eine Substanz frei, die detektiert werden kann.
Dies geschieht entweder optisch oder elektrochemisch. Es handelt
sich hier um den so genannten ELISA-Test (Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay). Auf ähnlichem
Weg lassen sich auch DNA-Analyseverfahren durchführen.
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Die
für die
elektrochemische Detektion verwendeten Transducer müssen Elektroden
beinhalten, die elektrisch einzeln kontaktiert sind. Im Anwendungsfall
des potentiometrischen Transducers muss das sich einstellende Gleichgewichtspotenzial
gegen eine Referenzelektrode messbar sein. Bei amperometrischen
und konduktometrischen Transducern müssen die Elektroden potentiostatierbar
sein und der Stromfluss über
die Elektroden muss einzeln erfasst werden können.
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Ein
Beispiel für
planare ionenselektive Sensoren ist in E. Jacobs et al, "Analytical Evaluation
of i-STAT Portable Clinical Analyzer and Use by Nonlaboratory Health-Care
Professionals",
Clinical Chemistry, 39, 1069 ff. (1993) beschrieben. Es handelt
sich hier um ein Siliziumsubstrat mit Dünnfilm-Elektroden und ionenselektiven
Membranen. Sensorelektroden und Kontakte liegen dabei auf derselben
Seite des Silizium-Substrats. Um daher die Kontaktflächen und
die Durchflusszelle für
den Analyten zu trennen, muss das Substrat deutlich größer sein
als die eigentlich von den Sensoren benötigte Fläche.
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Ebenfalls
in Silizium-Technologie sind verschiedene Biochips gefertigt und
in R. Thewes et al, "Sensor Arrays
for Fully Electronic DNA Detection on CMOS", ISSCC Digest of Tech. Papers, 2002,
350 ff., beschrieben. Vorteilhaft ist hier die Integration von CMOS-Schaltungstechnik,
Signalverarbeitung (Multiplexing) und Analog-Digital-Wandlung in
die Sensorplattform selbst. So kann eine hohe Anzahl von Sensoren
auf kleinster Fläche
realisiert werden. Nachteilig wirken sich die Kosten für die Herstellung
eines solchen Chips und die aufwändige
Handhabung (Kontaktierung) aus. Für die so genannten low-density
Arrays mit weniger als 100 Sensoren pro Quadratzentimeter sind daher
die Kosten pro Einzelsensor hoch.
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Eine
Alternative bietet theoretisch die Verwendung von Polymerträgern mit
aufgebrachten Elektroden. Diese können aufge dampft oder aufgedruckt
sein. Mit dieser Methode lassen sich preisgünstig einzelne Sensoren, z.
B. Glucose-Sensoren realisieren [WO 2002/02796-A2]. Für Arrays
ist sie jedoch weniger geeignet, da die Leiterbahnstrukturen grob
sind und daher die Zahl der elektrischen Kontakte stark eingeschränkt ist.
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Im
vorbekannten eSensorTM von der Fa. Motorola
wird zur Realisierung eines "low-density"-DNA-Detektions-Systems
Leiterplattentechnik verwendet. Dabei werden auf der Metallisierungsebene
sowohl die Sensorflächen
als auch die Leiterbahnen und Kontakte ausgeführt. Das Produkt ist eine starre
Leiterplatte mit Sensoren und Kontakten auf der gleichen Seite.
Rückseitige
Kontakte sind mit einer Durchkontaktierung zu realisieren. Diese
Technik ist bei großtechnischen
Fertigungen aber nur teuer umzusetzen.
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Weiterhin
sind beispielsweise aus der
EP
0 504 196 B1 sowie der
DE 197 17 809 U1 so genannte Mikroelektroden-Arrays
bekannt, bei denen die Sensorkavitäten eine möglichst geringe Fläche haben.
Aus der
DE 199 16
921 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung von paarweise
angeordneten Arrays aus Mikroelektroden bekannt, bei denen der Träger entweder
Silicium oder Kunststoff ist. Dabei sollen die einzelnen Elektroden
separat ansteuerbar sein. Als Anwendung wird speziell die DNA-Analyse
genannt.
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Schließlich ist
aus der WO 2004/001404 A1 ein Array von Mikroelektroden bekannt,
bei dem die Struktur variiert werden kann. Träger des Arrays sind hier Glas
und/oder Captanfolien, wobei eine einzige Bezugselektrode benutzt
wird. Schließlich
ist aus der
DE 199
29 264 A1 ein Universaltransducer für Chemo- und Biosensoren bekannt,
bei dem ein mehrlagiges System mit isolierenden Schichten und Elektrodenschichten,
die als Arbeits-, Bezugs- und Gegenelektroden genutzt werden, vorhanden
sind.
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Bei
der Vielzahl der bekannten Transducer-Aarrays wird also insbesondere
Wert auf spezifische Mikroelektroden gelegt, wobei die Kontaktierung
immer von oben erfolgt.
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Ausgehend
von dem gesamten umfassend abgehandelten Stand der Technik ist es
Aufgabe der Erfindung, ein geeignetes Transducer-Array zu schaffen,
das einfach zu handhaben und preiswert in der Herstellung ist. Daneben
sollen vorteilhafte Verwendungen des Transducer-Arrays vorgeschlagen
werden.
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Die
Aufgabe ist erfindungsgemäß durch
die Merkmale des Patentanspruches 1 gelöst. Weiterbildungen sind in
den abhängigen
Ansprüchen
angegeben. Bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen Transducer-Arrays
sind Gegenstand der Ansprüche
26 und 27.
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Beim
erfindungsgemäßen Transducer-Array
ist wenigstens ein flexibles, planares Metallsubstrat vorhanden,
auf dem mindestens ein flexibler Isolator mit fester Verbindung
von Metalloberfläche
und Isolatoroberfläche
angeordnet ist. Dabei sind sowohl das freitragende Metallsubstrat
als auch der Isolator derart strukturiert, dass elektrisch gegeneinander
isolierte Metallflächen,
die Sensorflächen
realisieren, gebildet werden, wobei die strukturierten Metallbereiche
des freitragenden Metallsubstrates von der der Sensorfläche abgewandten
bzw. von der dem Sensor gegenüberliegenden
Seite e kontaktierbar sind. Dadurch ergibt sich eine einfache Messmöglichkeit
mittels Nadelkontakte, insbesondere bei der dezentralen Messung
mittels Chipkarten.
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Besonders
vorteilhaft ist bei der Erfindung die gute Handhabbarkeit des Produktes.
Es handelt sich um einen Werkstoffverbund, der nur 100 μm bis 200 μm dick ist
und eine beliebige Fläche
einnehmen kann. Dadurch ist das Sensorarray hoch flexibel und kann
bei entsprechender Geometrie auf Rollen geführt werden. Der Verbund besteht
im einfachsten Fall aus einer Metall- und einer Isolatorschicht.
Die Vorderseite des Metallsubstrats ist von dem Isolator bedeckt,
wobei nur kleinere Metallflächen
frei bleiben, welche die Sensoren darstellen. In der Regel ist es
erforderlich, dass die Sensoren im wässrigen Elektrolyten beständig sind
und auch eine katalytische Aktivität für die Umsetzung der zu detektierenden
chemischen Substanz haben. Um dies zu erreichen, können sie
mit Edelmetallen wie Platin, Gold oder Silber beschichtet sein.
Einige Flächen können je
nach den Erfordernissen der Schaltungstechnik als Referenzelektroden
oder Gegenelektroden ausgeführt
werden. Insbesondere kann eine mit Silber beschichtete und chlorierte
Sensorfläche
als Referenzelektrode dienen.
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Vorteilhafterweise
wird die Metallschicht kann beidseitig genutzt. Die Sensoren liegen
wie beschrieben auf der Vorderseite. Die Rückseite dient der Kontaktierung
der Sensoren. Dabei ist die Metallschicht so strukturiert, dass
jeder Sensor elektrisch von den anderen isoliert ist. Die dadurch
entstehende rückseitige
Metallfläche,
die vorderseitig einem einzelnen Sensor entspricht, ist deutlich
größer als
die Sensorfläche.
Daher kann die Kontaktierung an einer Stelle erfolgen, die nicht
direkt unterhalb einer Sensorfläche
liegt und von dem Isolator verstärkt
ist. Da das Metallsubstrat selbsttragend ist, kann die Rückseitenkontaktierung
aber auch unmittelbar unterhalb der Sensorfläche erfolgen, um somit eine
besonders platzsparende Ausführungsform
zu ermöglichen.
Ein vorgeschlagener Weg zur Kontaktierung ist der Einsatz von Nadelkarten,
die auch in den Anwendungsbeispielen zum Einsatz kamen.
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Bei
einem sehr großen
bandförmigen
Sensorarray ist es möglich
die Sensoren nicht alle gleichzeitig zu kontaktieren, sondern in
Form eines Magazins durch die Messvorrichtung zu schieben. Die Nadeln
würden automatisch
die aktuellen Sensorflächen
kontaktieren und das Teilarray eines "Endlosarrays" stünde
für die Messungen
bereit. Dieses Vorgehen ist insbesondere für die Anwendung bei automatisierter Überwachung von
Prozessen wichtig.
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Eine
wichtige Rolle in der Analytik (z. B. HTS: High Throughput Screening)
spielen Titerplatten. Diese enthalten 96 (8·12), 384 (16·24) bzw.
1536 (32·48)
Plastikreaktionstöpfchen
in den Rastermaßen
9 mm, 4,5 mm bzw. 2,25 mm. Teilweise können in solchen Titerplatten
optische Detektionsvorgänge
direkt durchgeführt werden.
Dazu besitzen die Titerplatten z. B. planare, optisch transparente
Böden.
Die erfindungsgemäßen Transducer-Arrays
können
hier vorteilhaft zur elektrochemischen Detektion eingesetzt werden.
Dazu werden diese an die äußeren Abmessungen
der Titerplatten bzw. an das Raster der Reaktionstöpfchen angepasst.
Sie bilden den Boden der Titerplatten, so dass jedem Reaktionstöpfchen mindestens
eine Elektrode zugeordnet ist. Aufgrund der rückseitigen Kontaktierungsmöglichkeit
der erfindungsgemäßen Transducer-Arrays
können alle
Elektroden der Titerplatte gleichzeitig kontaktiert und somit ausgelesen
werden.
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Ein
weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Transducer-Arrays vor allem
gegenüber
der Silizium-Chip-Technologie besteht in der Struktur der Arrayoberfläche. Sie
ist nicht eben. Stattdessen befindet sich jeder Sensor in einer
Vertiefung, die durch die Dicke des verwendeten Isolators vorgegeben
wird. Diese Kavitäten
sind besonders geeignet, um Beschichtungen aufzunehmen. Sie können die
erwähnten
Fänger
für die DNA-Analyse enthalten,
Antikörper
oder selektive Membranen.
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In
einer speziellen Anwendungsform kann die Kavität sogar ein abgeschlossenes
elektrochemisches System darstellen. Dazu wird mindestens eine zweite
Elektrode pro Kavität
benötigt.
Diese kann entweder durch Teilung der Sensorfläche gebildet werden oder durch
die Einführung
einer weiteren Elektrode, die als Deckel über die Kavität gelegt
wird. Wobei dieser Deckel kein fester Bestandteil des Sensorarrays
ist, da zunächst
der Analyt in die Kavität
eingebracht werden muss. Er kann z. B. ebenfalls als Band mit dem
Sensorarray zusammengeführt
werden. Der Vorteil einer solchen geschlossenen Anord nung liegt
darin, dass die zu detektierende Substanz in der Kavität eingeschlossen
ist. Sie kann weder wegdiffundieren und damit das Signal schwächen, noch
an einen anderen Sensor gelangen und dort eine falsches Signal auslösen.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen
anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
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Es
zeigen jeweils in schematischer Vereinfachung
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1 und 2 die
Vorderseite und die Rückseite
eines Transducer-Arrays,
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3 eine
Schnittdarstellung eines Transducer-Arrays gemäß 1/2,
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4 ein
zweidimensionales Array in der Draufsicht,
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5 eine
Schnittdarstellung als Teilausschnitt des Transducer-Arrays gemäß 4 mit
zugehöriger Kontaktierung,
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6 bis 14 – Schnittdarstellungen
verschiedener Varianten eines Transducer-Arrays gemäß 1/2,
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15 eine
Messvorrichtung unter Verwendung eines Transducer-Arrays aus 3 bis 14,
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16 Ergebnisse
der Anwendung eines Transducer-Arrays als ionenselektiver Sensor
und
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17 Ergebnisse
der Anwendung eines Transducer-Arrays entsprechend einer der 1 bis 14 als
DNA-Sensor.
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Die 1 und 2 zeigen
die Vorder- und Rückseite
eines Sensorarrays bestehend aus einem Metallsubstrat 1 und
einer Isolatorschicht 2. Auf der Vorderseite sind beispielsweise
kreisförmige
Vertiefungen 3i , die als Kavitäten bezeichnet
werden, dargestellt. Die Kavitäten 3i entstehen durch die Strukturierung
des Isolators 2. Auf dem Grund der Vertiefungen 3i liegt die Oberfläche des Metallsubstrats frei.
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Die
Darstellung der Rückseite
zeigt durch Striche die Auftrennung des Metallsubstrats 1 in
voneinander isolierte Teile 10i .
Jede Metallinsel 10i korrespondiert
mit der Kavität 3i einer
Isolatoraussparung auf der Vorderseite. Auf der Rückseite
sind durch Punkte die möglichen
Kontaktstellen für
eine sog. Nadelkarte zur selektiven elektrischen Kontaktierung der
Metallflächen
angedeutet.
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3 zeigt
ein Sensorarray in Seitenansicht und im Schnitt durch eine Reihe
von Elektroden bzw. Sensoren. Die Trennlinien im Metallsubstrat 1 sind
als singuläre
Messelektroden 10i mit Messfläche 12i und gegenüberliegender Seite als Kontaktierungsfläche 11i verdeutlicht. Darüber befindet sich der Isolator 2 aus einzelnen
Elementen 20i , welche die freitragenden
Metallflächen
zusammenhält
und gegeneinander isoliert.
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4 zeigt
die Draufsicht auf ein zweidimensionales m × n-Sensorarray, bei dem die Kavitäten 3i mit den Messflächen 12i eng beieinander
liegen. Angedeutet sind im Array die benachbarten Kavitäten 3i und 3i+1 mit Messflächen, wobei
das Array auf der der Sensorfläche 12i abgewandten bzw. gegenüberliegenden
Seite 11i her kontaktierbar sein
soll. Während
in der Fläche
des m × n-Arrays
ein Sensor mit den anderen Sensoren unmittelbar benachbart ist,
bleibt an der äußeren Sensorreihe
ein seitlicher Metallbereich an der Rückseite zur Kontaktierung frei.
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5 zeigt
einen Ausschnitt des Sensorarrays gemäß 4 mit von
der Unterseite des Metallsubstrats 1 angesetzten Elektroden
zwecks Messsignalabnahme. Auf die Messtechnik mit der zugehörigen Messvorrichtung
und der dabei vorteilhafterweise verwendeten Elektrodenanordnung
wird weiter unten anhand 10 im
Einzelnen eingegangen.
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Bei
der ersten Sensorfläche
ist ein Kontakt 4a unmittelbar gegenüber der Sensorfläche zentrisch
an der beidseitig frei liegenden Metallfläche 11i angesetzt.
Bei der zweiten Sensorfläche
können
dagegen Kontaktierungen 4b gegenüber den Sensorflächen seitlich
versetzt an der einseitig freiliegenden Metallfläche angesetzt werden, da hier
hinreichend Platz verbleibt.
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6 zeigt
ein Sensorarray mit zwei Elektroden pro Kavität. Dazu wird das Metallsubstrat
an dieser Stelle geteilt. Der entstandene Spalt wird durch eine
zusätzliche
Isolatorschicht 40i von der Unterseite her verschlossen.
Dabei bleiben Kontaktflächen
frei, die Messelektroden definieren. Eingetragen sind abwechselnd eine
Arbeitselektrode WE und eine Gegenelektrode CE.
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7 zeigt,
dass mehrere Kavitäten
vom gleichen Elektrolyten benetzt werden. Dann kann die Metallfläche der
einen gegen die Metallfläche
einer anderen Kavität
polarisiert werden.
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8 zeigt,
dass eine der offenen Metallflächen
auf der Vorderseite von einer dünnen
Silber/Silberchloridschicht bedeckt ist. Diese Schicht 40l kann zusammen mit zwei weiteren benetzten
Metallflächen
in einer Dreielektrodenanordnung als Arbeitselektrode (WE), Counterelektrode
(CE) und Referenzelektrode (Ref) mit einem Potentiostaten verbunden
werden.
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9 zeigt
die Verwendung einer externen Referenzelektrode 15, die
in den gemeinsamen Elektrolyten eintaucht, der auch mindestens zwei
Metallflächen
benetzt. Zusammen können
sie in einer Drei-Elektrodenanordnung mit einem Potentiostaten verbunden
werden.
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10 zeigt
eine externe Referenzelektrode, die in den gleichen Elektrolyten
eintaucht, der auch mehrere Kavitäten mit jeweils zwei Elektroden
benetzt. Die zwei Elektroden bilden zusammen mit der Referenzelektrode
jeweils eine Dreielektrodenanordnung.
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11 zeigt,
dass die Elektrolyträume
in jeder Kavität
von den anderen Elektrolyträumen
elektrisch isoliert sein können.
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12 zeigt,
dass ein elektrischer Leiter, der über den Kavitäten liegt
als gemeinsame Gegenelektrode CE für alle Kavitäten verwendet
werden kann. Jeweils zwischen der Metallfläche in der Kavität und der
gemeinsamen Gegenelektrode wird eine Spannung angelegt.
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13 zeigt,
dass bei einem Sensorarray mit zwei Elektroden pro Kavität 3i und 3i eine der beiden Elektroden
mit Silber/Silberchlorid(Ag/AgCl) beschichtet ist. Diese beschichtete
Elektrode wird als Referenzelektrode zusammen mit der zweiten Elektrode
in der Kavität
als Arbeitselektrode und der bedeckenden Gegenelektrode in einer
Dreielektrodenanordnung mit einem Potentiostaten verbunden.
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14 zeigt,
dass eine die Messanordnung bedeckende Elektrode auf der Elektrolytseite
mit Silber/Silberchlorid beschichtet ist. Das Sensorarray hat pro
Kavität
zwei Elektroden. Damit lässt
sich mit diesen zwei Elektroden als Arbeitselektrode WE und Gegenelektrode
CE und der Deckelektrode als Referenzelektrode eine Drei-Elektrodenanordnung
realisieren.
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Aus
der 15 ist die Messvorrichtung im Einzelnen ersichtlich.
Dabei wird von der Methodik des "gepulsten" Redox-Cyclings gebraucht
gemacht, das im Einzelnen in einer parallelen Anmeldung der Anmelderin mit
gleicher Anmeldepriorität
und der Bezeichnung "Verfahren
zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung
einer redoxaktiven Substanz und zugehörige Vorrichtung" beschrieben.
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Außer durch
ein Transducer-Array 100, das anhand der 3 bis 14 in
verschiedenen Varianten beschrieben wurde, ist der Messaufbau im
Wesentlichen durch einen geeigneten Potentiostaten 5 in
Kombination mit einem Pulsgenerator 6 reali siert, der optional
Rechteck-, Dreieck- oder Sinuspulse liefert. Durch zwei Operationsverstärker 7 bzw. 7', von denen,
von denen einer mit "Ground"-Potenzial verbunden
ist und einem definierten Messwiderstand wird der Potentiostat 5 derart
konzipiert, dass geeignete Potenziale bereitgestellt werden. Dabei
können
die Pulslänge,
die Wiederholrate und die Höhe
des Potenzials vorgegeben werden. Insbesondere die Pulslängen der
Messphasen und die Relaxationsphasen können separat einstellbar und
unterschiedlich lang sein. Auch die Potenziale können unterschiedlich groß sein.
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Dem
Transducer-Array 100 sind die einzelnen Elektroden zugeordnet,
die bestimmungsgemäß eine Referenzelektrode
RE (= reference electrode), eine Gegenelektrode CE (= counter electrode)
und wenigstens eine Messelektrode WE (= working electrode) realisieren.
Diese Elektroden sind als Drei-Elektrodenanordnung mit dem Potentiostaten 5 verbunden.
Das Signal des Potentiostaten 5 wird an eine in 9 nicht
im Einzelnen dargestellte Signalverarbeitungseinheit angeschlossen,
mit welcher eine Auswertung unter Berücksichtigung obiger Ausführungen
zur Messmethodik und Genauigkeit erfolgt. Im Allgemeinen ergibt
sich Uout~ I als zur Auswertung des in 15 dargestellten
Signalverlaufes.
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In
spezifischer Weiterbildung wird ein Transducer-Array gemäß einem
der vorstehend beschriebenen Beispiele als ionenselektiver Sensor
verwendet: Für
diese Beispielanwendung kommt ein Sensorarray bestehend aus einer
Metall- und einer Isolatorschicht zum Einsatz. Der Durchmesser der
Kavitäten
beträgt
0,8 mm, die Tiefe 90 μm
und der Abstand zwischen zwei benachbarten Elektroden 1 mm. Die
Elektrodenoberflächen sind
mit einer 2,3 μm
dicken Goldschicht bedeckt. Insgesamt besteht das Array aus 4 Elektroden,
wovon eine als Silberchlorid-Referenzelektrode
ausgeführt
ist. Die anderen 3 Elektroden wurden mit einer ionenselektiven Membran
beschichtet. Als Beispiel sei hier die Ammonium-selektive Membran
angeführt.
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Die
Membranzusammensetzung entsprach der Empfehlung von Fluka:
- – 1.00
wt% Ammonium Ionophore I (Fluka 09877)
- – 33.00
wt% Poly (vinyl chlorid) high molecular weight (Fluka 81392)
- – 66.00
wt% Dibutyl sebacate (Fluka 84838)
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Insgesamt
100 mg der Reagenzien wurden in 550 μl eines Gemischs aus Cyclohexan
und THF im Verhältnis
8:2 gelöst.
Von dieser Lösung
wurden jeweils 35 nl, 45 nl und 60 nl in die drei Sensorkavitäten gespottet, so
dass drei Membranen unterschiedlicher Dicke entstanden sind. Sie
wurden mehrere Stunden an der Luft getrocknet.
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Das
Sensorarray wurde in einen 100 μm
tiefen Durchflusskanal eingesetzt und dann Lösungen verschiedener NH4NO3-Konzentrationen
darübergepumpt.
Die Lösungen
enthielten außerdem
100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Salzsäure zur Pufferung bei pH8. Über einen
hochohmigen Widerstandsmesser wurde dann die Potenzialdifferenz
zwischen den membranbeschichteten Elektroden und der Bezugselektrode gemessen.
Die folgende Abbildung zeigt die Potenzialänderung des Sensors als Funktion
der NH4 +-Konzentration
für die
drei Membrandicken.
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Die 16 zeigt
die Abhängigkeit
des Potenzials von der Säurekonzentration.
Aufgetragen auf der Abszisse ist die Konzentration von NH4NO3 in mol/l und
auf der Ordinate das elektrochemische Potenzial φ gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode.
Die Graphen 161 bis 164 zeigen Kennlinien für unterschiedliche Membranen.
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Die
Steigungen der Ausgleichsgeraden betragen von der dünnsten zur
dicksten Membran 54 mV, 52 mV und 48 mV. Diese Werte liegen etwas
unterhalb des theoretischen Werts bei Raumtemperatur von 59 mV.
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In
anderer Weiterbildung wird ein Transducer-Array gemäß einem
der anhand der 3 bis 14 angegebenen
Beispiele als DNA-Sensor verwendet:
Das verwendete Sensorarray
entspricht der in vorangehendem Beispiel bereits beschriebenen Anordnung, wobei
vier Elektrodenflächen
verwendet werden. Eine der Elektrodenflächen ist als Referenzelektrode
Ref ausgeführt,
eine andere wird als Gegenelektrode CE (Counter Electrode) verwendet
und die zwei weiteren Elektrodenflächen dienen als Messelektroden
bzw. sog. Arbeitselektrode WE (Working Electrodes). Auf der einen
Arbeitselektrode wird eine synthetische Oligonukleotidsequenz der
Länge 25
mittels einer endständigen Thiolgruppe
an der Goldoberfläche
verankert. Die zweite Messelektrode bleibt frei.
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Es
wurden beide Oberflächen
mit einer Lösung
von 1 mg Rinderserumalbumin pro ml 15 Minuten inkubiert und anschließend das
Sensorarray in einen 100 μm
tiefen Durchflusskanal eingesetzt. Zunächst werden 10 μl einer 10 μM biotinilierten
Zielsequenz innerhalb von ca. 5 Minuten über die Elektroden gepumpt. Dann
wird nach einem Waschschritt eine Lösung von Streptavidin markierter
alkalischer Phophatase darüber gegeben.
Das Waschen erfolgt mit einer Pufferlösung von 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan
titriert auf pH8 mit Salzsäure,
130 mM NaCl. Nach abermaligem Waschen wird eine 2 mM Lösung des
Enzymsubstrats Paraaminophenylphosphat (pAPP) in der Pufferlösung über das
Sensorarray gepumpt. Bei Anwesenheit des Enzyms alkalische Phosphatase
wird das Enzymsubstrat pAPP zu Paraaminophenol (pAP) umgesetzt.
Das pAP wird bei entsprechendem Potenzial an der Elektrode zu Chinonimin
oxidiert. Dieser Vorgang lässt
sich auch umkehren, wobei das Chinonimin zu pAP wieder reduziert
wird. Es gilt:
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Referenzelektrode,
Gegenelektrode und jeweils eine der beiden Messelektroden befinden
sich in einer Dreielektrodenanordnung an einen Potentiostaten angeschlossen.
Aufgrund der großen
Elektrodenflächen würde ein
potentiostatisches Messverfahren zu einer starken Verarmung des
pAP führen.
Es wird daher ein geeignetes Pulsverfahren verwendet.
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Zu
Beginn der Messung ist die Positivprobe, also die Elektrode mit
der Fängersequenz
angeschlossen. Die Lösung
mit dem Enzymsubstrat fließt
zunächst über die
Negativprobe, dann über
die Positivprobe. Durch die Fließbewegung wird von dem Enzym
gebildetes pAP von den Elektroden weggespült, so dass bei eingeschalteter
Pumpe der Strom konstant und gering ist. Wird nun die Pumpe gestoppt
steigt die pAP-Konzentration durch die Enzymaktivität mit der
Zeit an. In der Messung zeigt sich dies durch einen starken Anstieg des
Stromsignals mit 20 nA/s. Wird die Pumpe wieder eingeschaltet, so
sinkt das Signal wieder auf den ursprünglichen Wert. Dieser Vorgang
kann beliebig oft wiederholt werden.
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In 17 ist
der Verlauf des Messstromes bei Pumpe "on"/"stopp" am Sensor mit positiver
und negativer Probe gezeigt. Aufgetragen ist auf der Abszisse die
Zeit t in s und auf der Ordinate der Strom I in nA. Der Graph 171
zeigt den Messstrom im Verlauf bei einer experimentellen Untersuchung.
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Bei
t = 400s wurde auf die Negativprobe umgeschaltet. Hier sinkt der
Strom beim Stoppen der Pumpe zunächst,
bleibt dann kurze Zeit konstant und steigt dann langsam an. Dieser
Anstieg wird durch die Diffusion von pAP von der positiven zur negativen
Probe hin verursacht. Bei Pumpe on kommt ein Peakstrom hinzu, da der
Elektrolyt zunächst
von der positiven zur negativen Probe fließt und damit eine erhöhte pAP-Konzentration zur
benachbarten Elektrode transportiert. Insgesamt ist die Diskriminierung
von positiver und negativer Probe sehr gut.
