DE102005002672B4 - Method for rapid differentiation of microorganisms at subspecies level using MALDI-TOF MS - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Differenzierung von Mikroorganismen in einer Probe auf Subspezies-Ebene mittels Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS),
wobei
a) aus der Probe durch Kultivierung auf einem Medium, das für die auf ihre Subspezies zu untersuchende Spezies selektiv ist, Einzelkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden, die zur gleichen Spezies gehören,
b) MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen aufgenommen werden,
c) durch eine mathematische Ähnlichkeitsanalyse aus natürlichen MALDI-MS-Referenzspektren von verschiedenen Mikroorganismen-Subspezies, die zur gleichen Spezies wie die aus der Probe gewonnen Einzelkulturen gehören, die Werte s₁ (Homogenitätsgrenze) und s₂ (Heterogenitätsgrenze) ermittelt werden, wobei die Homogenitätsgrenze s₁ der maximalen Distanz verschiedener Spektren der gleichen Referenzsubspezies bei Mehrfachmessungen der Referenzsubspezies und die Heterogenitätsgrenze s₂ der kleinsten beobachteten Distanz zwischen Spektren von zwei verschiedenen Referenzsubspezies entspricht,
d) die MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen paarweise miteinander und mit den Referenzspektren durch eine mathematische Ähnlichkeitsanalyse verglichen werden,...Method for Differentiation of Microorganisms in a Subspecies-Level Sample Using Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)
in which
a) recovering from the sample by culturing on a medium which is selective for the species to be tested for its subspecies, single cultures of microorganisms belonging to the same species,
b) MALDI-MS spectra of the individual cultures obtained from the sample are recorded,
c) by a mathematical similarity analysis of natural MALDI-MS reference spectra of different microorganism subspecies that belong to the same species as the individual cultures obtained from the sample, the values s ₁ (homogeneity limit) and s ₂ (heterogeneity limit) are determined, the Homogeneity limit s ₁ corresponds to the maximum distance of different spectra of the same reference subspecies in the case of multiple measurements of the reference subspecies and the heterogeneity limit s ₂ corresponds to the smallest observed distance between spectra of two different reference subspecies,
d) the MALDI-MS spectra of the individual cultures obtained from the sample are compared in pairs with each other and with the reference spectra by a mathematical similarity analysis, ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Differenzierung von Mikroorganismen auf Subspeziesebene mittels MALDI(matrix assisted laser desorption ionization)-TOF(time of flight)-Massenspektrometrie.The The invention relates to a method for the rapid differentiation of Microorganisms at subspecies level using MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) -TOF (time of flight) mass spectrometry.

Die Erfindung ist dort anwendbar, wo eine schnelle Identifizierung und Differenzierung von Mikroorganismen erforderlich ist, z. B. in der Mikrobiologie, Human- und Zahnmedizin, Veterinärmedizin oder Biotechnologie.The Invention is applicable where rapid identification and Differentiation of microorganisms is required, for. B. in the Microbiology, human and dental medicine, veterinary medicine or biotechnology.

Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen mittels Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) sind publiziert. Diese beruhen entweder auf dem gezielten Nachweis einer für den jeweiligen Mikroorganismus charakteristischen, bekannten Substanz über deren Massenpeak im Spektrum (Allmaier et al., 1995) oder auf der vergleichenden Analyse von reduzierten (Kallow et al., 2002) oder gesamten Massenspektren (Bright et al., 2002).method to identify microorganisms using Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) are published. These are based either on targeted detection one for the respective microorganism characteristic, known substance on their Mass peak in the spectrum (Allmaier et al., 1995) or on the comparative Analysis of reduced (Kallow et al., 2002) or entire mass spectra (Bright et al., 2002).

Die bisher bekannten Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen mittels MALDI-TOF MS funktionieren bis zur Speziesebene, weil die Massenspektren verschiedener Spezies in der Regel deutlich voneinander verschieden sind und durch das Auftreten relativ weniger, typischer Peaks charakterisiert werden können.The previously known methods for the characterization of microorganisms using MALDI-TOF MS work up to the species level because the mass spectra of different Species are usually distinct and different from each other the occurrence of relatively fewer, typical peaks can be characterized.

Eine Differenzierung auf Subspeziesebene über bekannte, charakteristische Substanzen über deren Massenpeak im Spektrum setzt voraus, daß für jede Subspezies mindestens eine solche Substanz bekannt ist. Solche Substanzen sind allerdings nur für äußerst wenige Mikroorganismensubspezies bekannt (Hathout et al., 1999; Elhahnany et al., 2001; Hatout et al., 2003; McNall et al., 2003; Whiteaker et al., 2004). Derartige Verfahren sind somit nicht allgemein anwendbar.A Differentiation at subspecies level over known, characteristic Substances over their mass peak in the spectrum implies that for each subspecies at least such a substance is known. Such substances are however only for very few Microorganism subspecies known (Hathout et al., 1999; Elhahnany et al., 2001; Hatout et al., 2003; McNall et al., 2003; Whiteaker et al., 2004). Such methods are thus not generally applicable.

Die vergleichende Analyse der gesamten Massenspektren verschiedener Mikroorganismen ist sehr komplex, da die Spektren viele Informationen enthalten, die mittels geeigneter Verfahren extrahiert werden müssen. Welche Peaks bzw. Peakgruppen für welche taxonomische Ebene charakteristisch sind, lasst sich a priori nicht erkennen bzw. vorhersagen. Auf der Subspeziesebene wurden zwar unterscheidbare Spektren für verschiedene bekannte Bakteriensubspezies beobachtet und diese konnten den jeweiligen Subspezies zugeordnet werden (Bright et al., 2002), aber eine systematische Differenzierung unbekannter Kulturen auf Subspeziesebene wurde bisher nicht beschrieben und ist mit den bisher beschriebenen Verfahren nicht möglich.The comparative analysis of the total mass spectra of various Microorganisms is very complex because the spectra have a lot of information contained, which must be extracted by suitable methods. Which Peaks or groups of peaks for which taxonomic levels are characteristic let a priori do not recognize or predict. At the subspecies level although distinguishable spectra for different known bacteria subspecies observed and these could the respective Subspecies are assigned (Bright et al., 2002), but a systematic Differentiation of unknown cultures at subspecies level has been reported so far not described and is with the methods described so far not possible.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das eine schnelle Differenzierung von Mikroorganismen auf Subspeziesebene ermöglicht. Eine Spezies umfasst alle Organismen, die den gleichen Gattungs- und Artnamen tragen. Verschiedene Spezies differieren typischerweise hinsichtlich ihrer 16S rDNA um mehr als 3%. Umgekehrt sind Subspezies (oder Stämme) Organismen, die den gleichen Gattungs- und Artnamen tragen und sich in ihrer 16S rDNA nur sehr geringfügig, d. h. weniger als 3%, unterscheiden.task The invention is to provide a method which is fast Differentiation of microorganisms at subspecie level allows. A species includes all organisms that belong to the same genus and bear species names. Different species typically differ in terms of its 16S rDNA by more than 3%. Conversely, subspecies (or tribes) Organisms that carry the same genus and species name and themselves in their 16S rDNA only very slightly, d. H. less than 3%, differ.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen nach Anspruch 1 gelöst. Weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhalten die Merkmale der untergeordneten Ansprüche 2 bis 9.According to the invention Problem solved by a method having the features of claim 1. Further Embodiments of the method according to the invention include the Features of the subordinate claims 2 to 9.

Die Homogenitätsgrenze σ₁ entspricht der maximalen Distanz verschiedener Spektren der gleichen Referenzsubspezies bei Mehrfachmessungen der Referenzsubspezies.The homogeneity limit σ ₁ corresponds to the maximum distance of different spectra of the same reference subspecies in multiple measurements of the reference subspecies.

Die Heterogenitätsgrenze σ₂ entspricht der kleinsten beobachteten Distanz zwischen Spektren von zwei verschiedenen Referenzsubspezies.The heterogeneity limit σ ₂ corresponds to the smallest observed distance between spectra of two different reference subspecies.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch die Kombination von Anzucht der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen auf einem spezies-selektiven Medium, MALDI-TOF MS-Analyse der erhaltenen Einzelkulturen sowie Differenzierung der in der Regel sehr ähnlichen MALDI TOF-MS Spektren mit Hilfe multivariater statistischer Analyse unter Verwendung unterschiedlicher Clustering-Verfahren aus.The inventive method characterized by the combination of cultivation of those contained in the sample Microorganisms on a species-selective medium, MALDI-TOF MS analysis the obtained individual cultures as well as differentiation of the usually very similar MALDI TOF-MS spectra using multivariate statistical analysis using different clustering methods.

Durch geeignete Kultivierungsmethoden wird zunächst erreicht, dass alle aus einer biologischen Probe isolierten Einzelkulturen zur gleichen Spezies bzw. Speziesgruppe gehören. Durch die Kombination von MALDI-TOF MS und geeigneten Verfahren des mathematischen Spektrenvergleiches wird anschließend erreicht, dass die Massenspektren dieser Einzelkulturen trotz ihrer hohen Ähnlichkeiten reproduzierbar und mit angebbarer Trennschärfe auf Subspeziesebene differenziert werden können.By appropriate cultivation methods is first achieved that all off of a biological sample isolated individual cultures at the same time Species or species group. By combining MALDI-TOF MS and suitable procedures the mathematical spectral comparison is then achieved that the mass spectra of these individual cultures, despite their high similarities reproducible and differentiated with specifiable selectivity on subspecies level can be.

Bei der biologische Probe handelt es sich beispielsweise um eine menschliche Speichelprobe, eine Plaqueprobe oder eine durch eine Abstrich aus der Mundhöhle gewonnene Probe.at the biological sample is for example a human one Saliva sample, a plaque sample or a smear through a swab the oral cavity won sample.

Die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen werden zunächst kultiviert. Die Kultivierung erfolgt auf einem Selektivmedium, das das Wachstum einer bestimmten Mikroorganismus-Spezies oder einer Speziesgruppe fördert und das Wachstum möglichst vieler anderer Mikroorganismen hemmt. Ein solches Spezies-selektives Medium ist beispielsweise Mitis- Salivarius Agar mit Bacitrazin. Dieses Kulturmedium ist ein Selektivmedium für humanpathogene Mutans-Streptokokken.The microorganisms contained in the sample are first cultured. The cultivation is carried out on a selective medium that growth of a particular microorganism species or a species group and growth as possible many other microorganisms inhibits. Such a species-selective Medium is for example Mitis Salivarius Agar with bacitrazine. This culture medium is a selective medium for human pathogens Mutans streptococci.

Um zu gewährleisten, dass beispielsweise nur Mikroorganismen massenspektroskopisch untersucht werden, die zur Spezies Streptococcus mutans gehören, werden die durch selektive Kulturbedingungen gewonnenen Einzelkulturen vorzugsweise zusätzlich mittels biochemischer Tests (z. B. die sog. „Bunte Reihe", eine Reihe von Flüssigkulturen zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften, z. B. der Bildung von Säuren aus verschiedenen Zuckern, wobei ein positiver Testausfall eine pH-Verschiebung und den Farbumschlag eines zugesetzten Indikators bewirkt) und/oder über ihr Membranfettsäurespektrum (Kato, 1989; Stößer et al., 2000) auf Speziesebene identifiziert.Around to ensure, that, for example, only microorganisms are examined by mass spectroscopy, which belong to the species Streptococcus mutans, which are by selective Culture conditions obtained individual cultures preferably additionally by means of biochemical tests (eg the so-called "Bunte Reihe", a series of liquid cultures for determining physiological properties, eg. B. education of acids from different sugars, with a positive test failure a pH shift and the color change of an added indicator causes) and / or over their Membranfettsäurespektrum (Kato, 1989; Stößer et al., 2000) at species level.

Zur Aufnahme der MALDI-TOF-MS-Spektren werden geeigneterweise 10⁵ bis 10⁶ Zellen einer Einzelkultur eingesetzt. Liegen nicht genügend Zellen je Einzelkultur vor, ist ein weiterer Kultivierungsschritt in einem selektiven oder auch nicht-selektiven Medium nötig.To accommodate the MALDI-TOF MS spectra, suitably 10 ⁵ to 10 ⁶ cells of a single culture are used. If there are not enough cells per individual culture, a further cultivation step in a selective or non-selective medium is necessary.

Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen werden bei Bedarf beispielsweise mit Wasser gereinigt und entweder direkt auf einen MALDI-MS-Probenträger aufgetragen und mit einer geeigneten Matrix-Lösung versetzt oder sie werden erst mit einer Matrix-Losung versetzt und danach auf einen geeigneten MALDI-MS-Probenträger aufgetragen.The Cells are collected by centrifugation. The cells will be if necessary, for example, cleaned with water and either directly on a MALDI-MS sample carrier applied and mixed with a suitable matrix solution or they are first offset with a matrix solution and then to a suitable one MALDI-MS sample support applied.

Als MALDI-Matrix-Lösung wird beispielsweise α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) in Acetonitril/0,1% Trifluor-Essigsäure (TFA) (2:1) eingesetzt. Bevorzugt wird dieselbe Einzelkultur mehrmals auf verschiedenen Positionen auf dem Probenträger aufgetragen.When MALDI-matrix solution For example, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (HCCA) in acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (2: 1). Preferably, the same single culture is repeated several times Positions on the sample carrier applied.

Der MALDI-Probenträger wird in ein geeignetes MALDI-TOF Massenspektrometer (z. B. Bruker Biflex III, N₂-laser (Wellenlänge 337 nm, Puls 5 ns, Flugstrecke 1200 mm) eingeführt. Die Messungen werden geeigneterweise im linear positiven Modus (Verzögerung 400 ns, Spannung 20 kV) durchgeführt. Die Spektren werden bevorzugt intern kalibriert. Zur Eichung wird z. B. der Peptide Mix (Sigma, Taufkirchen) verwendet.The MALDI sample carrier is inserted into a suitable MALDI-TOF mass spectrometer (eg Bruker Biflex III, N ₂ laser (wavelength 337 nm, pulse 5 ns, flight distance 1200 mm).) The measurements are suitably performed in linear positive mode (delay 400 ns, voltage 20 kV) The spectra are preferably calibrated internally, for example the Peptide Mix (Sigma, Taufkirchen) is used for the calibration.

Die MALDI-TOF-MS-Spektren werden bevorzugt in einem Massebereich von 2000 bis 20000 Dalton aufgenommen.The MALDI-TOF MS spectra are preferably in a mass range of 2000 to 20,000 daltons recorded.

Von jeder Einzelkultur auf dem Probenträger werden bevorzugt mehrere Einzelspektren aufgenommen, aus denen durch Überlagerung ein MALDI-TOF-MS-Summenspektrum gebildet wird. Besonders vorteilhaft ist es, mindestens sechs MALDI-TOF-MS-Summenspektren, die von derselben Einzelkultur stammen, aber auf unterschiedlichen Positionen auf dem Probenträger aufgetragen wurden, zu einem Superspektrum zu überlagern. Auf diese Weise wird für jede Einzelkolonie ein Superspektrum mit höherer Reproduzierbarkeit erhalten.From each individual culture on the sample carrier are preferably several Single spectra recorded from which by overlay a MALDI-TOF-MS sum spectrum is formed. It is particularly advantageous to have at least six MALDI-TOF-MS sum spectra, the come from the same single culture, but in different positions on the sample carrier were superimposed to superimpose to a super spectrum. In this way is for Each single colony received a superspektrum with higher reproducibility.

Unter den gleichen Bedingungen werden auch MALDI-TOF-MS-Superspektren von mehreren bekannten Subspezies der betreffenden Mikroorganismen als Referenz aufgenommen. Die Referenzmikroorganismen gehören zur gleichen Spezies wie die aus der biologischen Probe isolierten Einzelkulturen. Zur Differenzierung von Subspezies von S. mutans in einer biologischen Probe eigen sich beispielsweise die Subspezies von S. mutans wie Ingbritt, JB 1600, NCTC 10449, OMZ 125, GS 5, SE 11, OMZ 175, LM 7 oder QP 50-1 als Referenz.Under the same conditions are also used for MALDI-TOF-MS super spectra of several known subspecies of the microorganisms in question added as a reference. The reference microorganisms belong to the same species as isolated from the biological sample individual cultures. Differentiation of subspecies of S. mutans in a biological Sample, for example, the subspecies of S. mutans like Ingbritt, JB 1600, NCTC 10449, OMZ 125, GS 5, SE 11, OMZ 175, LM 7 or QP 50-1 for reference.

Vorzugsweise werden für jede Referenzsubspezies mehrere, besonders bevorzugt mindestens zwei unabhängige Superspektren ermittelt.Preferably be for each reference subspecies more, more preferably at least two independent Superspektren determined.

Aus den erhaltenen Superspektren werden Peaklisten erstellt. Die Peaklisten werden auf geeignete Weise transformiert, z. B. log-transformiert. Peaks gleicher Masse/Ladung innerhalb der unterschiedlichen Superspektren werden ermittelt, indem vorzugsweise ein Masse-Fenster entlang der x-Achse (m/z) der Superspektren geführt wird. Das Zentrum dieses Massen-Fensters repräsentiert die mittlere Position der vergleichbaren Peaks in allen untersuchten Spektren. Die Fenster-Breite wird durch die Präzision der experimentellen m/z-Bestimmung bestimmt. Ein linearer Zusammenhang zu m/z wird angenommen. Somit resultiert: Fenster-Breite = absolute Breite + relative Breite·Peakmasse. (Formel 1) Peak lists are created from the super spectra obtained. The peak lists are suitably transformed, e.g. B. log-transformed. Peaks of equal mass / charge within the different super spectra are determined by preferentially passing a mass window along the x-axis (m / z) of the superspec spectra. The center of this mass window represents the mean position of the comparable peaks in all spectra studied. The window width is determined by the precision of the experimental m / z determination determined. A linear relationship to m / z is assumed. Thus results: Window width = absolute width + relative width · peak mass. (Formula 1)

Das Masse-Fenster wird jedem Masse-Peak zugeordnet. Fenster, die in unterschiedlichen Superspektren dieselben Peaks enthalten, werden zusammengefasst. Diese Peaks werden durch ihr mittleres m/z und ihre mittlere Intensität repräsentiert. Überlappende Fenster werden mit der halben Fenster-Weite aufgelöst.The Mass window is assigned to each mass peak. Windows in different superspectra containing the same peaks summarized. These peaks are indicated by their mean m / z and their medium intensity represents. overlapping Windows are resolved with half the window width.

Durch das beschriebene Verfahren wird beispielsweise eine Matrix η_ij konstruiert. Ihre Zeilen i werden durch die mittleren Peak-Massen, ihre Spalten j durch das jeweilige Superspektrum bestimmt. Bei Abwesenheit eines Peaks in einem Superspektrum wird η_ij = 0 angenommen.By the method described, for example, a matrix η _{ij is} constructed. Their lines i are determined by the middle peak masses, their columns j by the respective superspec spectrum. In the absence of a peak in a superspec spectrum, η _ij = 0 is assumed.

Die Ähnlichkeit der Superspektren wird vorzugsweise durch eine Euklidische Distanzmatrix dargestellt.The similarity the superspectral spectrum is preferably given by a Euclidean distance matrix shown.

Der Euklidische Distanzkoeffizient d_mn vergleicht zwei Superspektren m und n, und wird definiert als:

η_kj stellt die Intensität des idealisierten Peak k im Spektrum j dar, w_kmn ist ein Maß dafür, ob die k-te Peak Masse in einem Spektrum einen vorgegebenen Grenzwert überschreitet. Unter Berücksichtigung einer variablen Anzahl Peaks je Superspektrum wird der Distanzkoeffizient d_mn korrigiert:

wobei n_m und n_n die Anzahl der Peaks in den normalisierten Superspektren m und n darstellen, die einen vorgegebenen Grenzwert überschreiten. Diese Korrektur ist entscheidend, um den Einfluss der unterschiedlichen Anzahl Peaks je Superspektrum auszugleichen.The Euclidean distance coefficient d _mn compares two super spectra m and n, and is defined as:

η _kj represents the intensity of the idealized peak k in the spectrum j, w _kmn is a measure of whether the k-th peak mass in a spectrum exceeds a predetermined limit. Taking into account a variable number of peaks per super spectrum, the distance coefficient d _{mn is} corrected:

where n _m and n _{n represent} the number of peaks in the normalized super spectra m and n that exceed a predetermined threshold. This correction is crucial to compensate for the influence of the different number of peaks per superspace.

Aus der Distanzmatrix der mehrfach bestimmten Referenzsupersspektren der Subspezies einer Spezies werden zwei Distanzmaße, σ₁ und σ₂, ermittelt: σ₁ entspricht der maximalen Distanz zwischen Mehrfachmessungen der Referenzsubspezies und ist ein Maß für die minimale auflösbare Distanz zweier Subspezies (Homogenitätsgrenze). Das bedeutet, Isolate, deren Superspektren zueinander eine Distanz kleiner σ₁ aufweisen, können nicht differenziert werden und müssen folglich als identisch angesehen werden.Two distance measures, σ ₁ and σ ₂ , are determined from the distance matrix of the multiply determined reference super spectra of the subspecies of a species: σ ₁ corresponds to the maximum distance between multiple measurements of the reference subspecies and is a measure of the minimum resolvable distance of two subspecies (homogeneity limit). This means that isolates whose super-spectra have a distance smaller than σ ₁ to one another can not be differentiated and must therefore be regarded as identical.

σ₂ entspricht der kleinsten beobachteten Distanz zwischen Superspektren von zwei als verschieden bekannten Subspezies einer Spezies (Heterogenitätsgrenze). Dann werden σ₂ und σ₁ miteinander verglichen. Die Methode ist nur valide, wenn σ₂ größer oder gleich σ₁ ist.σ ₂ corresponds to the smallest observed distance between superspec- tive spectra of two differently known subspecies of a species (heterogeneity limit). Then, σ ₂ and σ ₁ are compared with each other. The method is only valid if σ _{2 is} greater than or equal to σ ₁ .

Ein Vergleich der Distanzen der Superspektren der Einzelkulturen mit den Superspektren von Referenzsubspezies, die zu anderen Spezies gehören, erlaubt vorteilhaft eine Überprüfung der korrekten Zuordnung der Einzelkultur zu der zu untersuchenden Spezies.One Comparison of the distances of the super spectra of the individual cultures with the superspectral spectra of reference subspecies to other species belong, allows a favorable review of the correct assignment of the individual culture to the species to be examined.

Zur Subspezies-Populationsanalyse biologischer Proben, aus denen Einzelkulturen einer Spezies gewonnen wurden, werden die Superspektren der Einzelkulturen zunächst einem paarweisen Vergleich miteinander und mit den Superspektren der bereits bekannten Referenz-Subspezies unterzogen. Im Anschluss wird bevorzugt eine globale Ähnlichkeitsanalyse durchgeführt.to Subspecies population analysis of biological samples from which single cultures of a species are obtained, the superspectrics of the individual cultures first a pairwise comparison with each other and with the super spectra the already known reference subspecies subjected. Following is preferred a global similarity analysis carried out.

Für jede Einzelkultur wird dabei geprüft, ob ihr Superspektrum zu dem eines der Referenzsubspezies eine Distanz kleiner σ₁ aufweist. Ist die Distanz kleiner als σ₁, ist die Einzelkultur mit der jeweiligen Referenzsubspezies identisch.For each individual culture, it is checked whether their superspec spectrum has a distance smaller than σ ₁ to that of one of the reference subspecies. If the distance is smaller than σ ₁ , the individual culture is identical to the respective reference subspecies.

Trifft dies nicht zu, wird geprüft, ob die Superspektren jeweils zweier Einzelkulturen zueinander eine Distanz kleiner σ₁ aufweisen. Dann sind sie miteinander identisch und werden in der weiteren Analyse durch ihr Zentroid ersetzt. Das Zentroid ist der Mittelpunkt des durch die Massenpeaks der beiden Spektren definierten vieldimensionalen Raums. Das Zentroid ist ein idealisiertes Spektrum, das alle Massen enthält, die in beiden Spektren auftreten. Jeder dieser Massen wird eine Intensität zugeordnet, die sich als Mittelwert der Intensitäten für diese Masse errechnet.

S₁ S₂

seien 2 Spektren, die ein Cluster bilden.

m₁ ..... m_n

seien die Massen aller Peaks, die in S₁ und S₂ auftreten.

ζζ_i,j (i = 1 .. n, j = 1:2)

ist die Matrix der Intensitäten.

If this is not true, it is checked whether the superspectra of each of two individual cultures to each other have a distance smaller σ ₁ . Then they are identical to each other and will go through in further analysis replaced her centroid. The centroid is the midpoint of the multidimensional space defined by the mass peaks of the two spectra. The centroid is an idealized spectrum that contains all the masses that occur in both spectra. Each of these masses is assigned an intensity that is calculated as the average of the intensities for that mass.

S ₁ S ₂

Let 2 spectra form a cluster.

m ₁ ..... m _n

Let the masses of all peaks appear in S ₁ and S ₂ .

ζζ _{i, j} (i = 1 .. n, j = 1: 2)

is the matrix of intensities.

Die Intensität zur Masse i für das Zentroid erhält man entsprechend als Mittelwert der Intensitäten in den Spalten 1 bis 2.The intensity to earth i for the centroid gets one accordingly as the average of the intensities in columns 1 to 2.

Für Superspektren und Zentroide von Isolaten, die weder mit einem der Referenzstämme noch mit einem weiteren Isolat identisch sind, wird geprüft, ob ihre Distanz zu allen vorhandenen Superspektren und Zentroiden größer als σ₂ is. Ist dies der Fall, wird das Isolat als neue Subspezies erfaßt.For superspectrums and centroids of isolates that are not identical to one of the reference strains or to another isolate, it is checked whether their distance to all available super spectra and centroids is greater than σ ₂ . If this is the case, the isolate is detected as new subspecies.

Ist die Distanz des Superspektrums eine Einzelkultur zu einem Superspektrum einer anderen Einzelkultur bzw. dem einer Referenzsubspezies zwischen σ₁ und σ₂, wird die Einzelkultur als mit der anderen Einzelkultur bzw. der Referenzsubspezies „nahe verwandt, möglicherweise identisch" erfaßt.If the distance of the superspectral spectrum is a single culture to a superspec spectrum of another single culture or of a reference subspecies between σ ₁ and σ ₂ , the single culture is considered to be "closely related, possibly identical" to the other single culture or reference subspecies.

Die Distanzmatrix erlaubt einerseits einen paarweisen Vergleich der Spektren von Referenzsubspezies oder Einzelkulturen unter Angabe eines Quantitativen Ähnlichkeitsmaßes und bildet andererseits die Basis zur Anwendung unterschiedlicher Clustering-Verfahren, bevorzugt hierarchisches Clustering, K-means Clustering, Fuzzy Clustering und Quantum Clustering (Hoppner et al., 1999; Hastie et al., 2003, Horn & Axel, 2003). Diese Verfahren dienen dazu, die Ähnlichkeitsbeziehungen aller untersuchten Subspezies zueinander gleichzeitig zu erfassen.The Distance matrix allows on the one hand a pairwise comparison of the Spectra of reference subspecies or single cultures with indication of a quantitative similarity measure and on the other hand forms the basis for the application of different clustering methods, prefers hierarchical clustering, K-means clustering, fuzzy clustering and quantum clustering (Hoppner et al., 1999; Hastie et al., 2003, Horn & Axel, 2003). These procedures serve the similarity relationships of all investigated subspecies to capture each other simultaneously.

Vorzugsweise werden die nach dem paarweisen Vergleich verbliebenen Superspektren bzw. Zentroide der Einzelkulturen nun gemeinsam mit denen der Referenzsubspezies mittels unterschiedlicher Verfahren der Clusteranalyse hinsichtlich ihrer phänotypischen Ähnlichkeiten charakterisiert. Mittels hierarchischem Clustering, K-means clustering oder Quantum Clustering wird das Superspektrum jeder Einzelkultur bzw. jedes Zentroid eindeutig einem Cluster zugeordnet.Preferably become the superspectrels remaining after pairwise comparison or centroids of the individual cultures now together with those of the reference subspecies by means of different methods of cluster analysis in terms their phenotypic similarities characterized. Using hierarchical clustering, K-means clustering or quantum clustering becomes the superspectrum of every single culture or each centroid clearly assigned to a cluster.

Die Distanzmatrix wird beispielsweise durch agglomeratives hierarchisches Clustering mittels der "farthest neighbor"-Methode, die auf der maximalen Distanz zwischen den Superspektren basiert, analysiert (Hastie et al., 2003). Um die Qualität des Clusterings zu bewerten werden Cophenetic-Korrelationskoeffizienten zwischen den einzelnen Clustern berechnet. Die Ergebnisse werden als korrekt betrachtet, wenn die Distanzen zwischen den Superspektren innerhalb der Cluster mit den Distanzen, die in der Distanzmatrix d_mn errechnet wurden, korrelieren. Niedrige Werte des Cophenetic-Korrelationskoeffizienten werden als Artefakte ausgeschlossen. Die Ergebnisse werden in Dendrogrammen dargestellt.For example, the distance matrix is analyzed by agglomerative hierarchical clustering using the farthest neighbor method, which is based on the maximum distance between the superspectrics (Hastie et al., 2003). To assess the quality of clustering, Cophenetic correlation coefficients are calculated between the individual clusters. The results are considered correct if the distances between the super spectra within the clusters correlate with the distances calculated in the distance matrix d _mn . Low values of the cophenetic correlation coefficient are excluded as artifacts. The results are displayed in dendrograms.

Beim Quantum clustering z. B. wird die Matrix in einem ersten Schritt in Eigenvektoren und Eigenwerte umgewandelt. Danach wird vorzugsweise die „Singular Value Decomposition" Methode angewendet. Für die Reduktion der Matrix werden lediglich die bestimmenden Eigenwerte verwendet. Durch dieses Verfahren können die Superspektren durch Vektoren in einen Raum geringerer Dimensionalität ersetzt werden. Der Parameter σ welcher die relative Cluster Größe charakterisiert, wird auf empirischer Basis angepasst. Die Methode ermittelt eine variable Anzahl Cluster und ordnet jedes Superspektrum zu genau einem von ihnen hinzu. Die Zuverlässigkeit der Methode wird durch Kreuzvalidierung mittels "jack-knife testing" (Auslassen eines Wertes) überprüft.At the Quantum clustering z. For example, the matrix becomes a first step converted into eigenvectors and eigenvalues. Thereafter, preferably the "singular Value Decomposition "method applied. For the reduction of the matrix only becomes the determining eigenvalues used. Through this method, the superspectrons can pass through Vectors are replaced in a space of lesser dimensionality. The parameter σ which characterizes the relative cluster size, is adjusted on an empirical basis. The method determines a variable number of clusters and assigns each superspectrum to exactly to one of them. The reliability of the method is through Cross-validation by means of "jack-knife testing "(omitting of a value).

Zusätzlich durchgeführtes Fuzzy Clustering erlaubt für jede Einzelkultur die Wahrscheinlichkeit der korrekten Zuordnung zu ermitteln. In allen Fällen dient die Stabilität der Zusammenhänge zwischen den Referenzsubspezies als interne Kontrolle. Die Verteilung der Superspektren der Einzelkulturen auf verschiedene Cluster, deren Distanz und innere Struktur bilden die Basis der Differenzierung der Subspezies sowohl hinsichtlich der individuellen Eigenschaften jeder einzelnen Einzelkultur als auch hinsichtlich der Populationsstruktur aller Einzelkulturen aus einer biologischen Probe.In addition, fuzzy clustering allows the probability of correct assignment to be determined for each individual culture. In all cases, the stability of the relationships between the reference subsites serves as an internal control. The distribution of the super-spectra of the individual cultures on different clusters, their distance and internal structure form the basis of the differentiation of the subspecies both visibly the individual characteristics of each individual individual culture as well as with regard to the population structure of all individual cultures from a biological sample.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Differenzierung auf Subspezieseben bei pathogenen Bakterien, beispielsweise oralen Bakterien wie Streptokokken, angewendet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Differenzierung von Mutans-Streptokokken, insbesondere zur Differenzierung von Subspezies der Spezies Streptococcus mutans oder Streptococcus sobrinus.Prefers becomes the method according to the invention for differentiation to subspecies subsidence in pathogenic bacteria, For example, oral bacteria such as streptococci, applied. Especially preferred is the use of the method of differentiation of mutans streptococci, in particular for the differentiation of subspecies of the species Streptococcus mutans or Streptococcus sobrinus.

Das Verfahren eignet sich ebenfalls zur Differenzierung von einzelligen Pilzen, wie oralen Pilzen. Beispielsweise kann das Verfahren zur Differenzierung von Subspezies von Candida albicans eingesetzt. Dabei kann als Selektivmedium „Chromagar Candida" (Mast Diagnostica GmbH, Reinfeld) eingesetzt werden.The Method is also suitable for the differentiation of unicellular Mushrooms, like oral mushrooms. For example, the method can be used for Differentiation of subspecies of Candida albicans used. It can be used as a selective medium "Chromagar Candida "(Mast Diagnostica GmbH, Reinfeld).

Anhand eines Ausführungsbeispiels wird die Erfindung näher erläutert.Based an embodiment the invention will be closer explained.

Ausführungsbeispiel 1embodiment 1

Differenzierung von aus menschlichem Speichel gewonnenen Subspezies-Isolaten von Streptococcus mutansDifferentiation from human saliva obtained subspecies isolates of Streptococcus mutans

Zur Differenzierung von Subspezies-Isolaten von Streptococcus mutans aus menschlichem Speichel werden folgende Schritte durchgeführt:to Differentiation of subspecies isolates of Streptococcus mutans from human saliva following steps are performed:

1. Kultivierung der Referenz-Subspezies von Streptococcus mutans1. Cultivation of the reference subspecies of Streptococcus mutans

Die Referenzstämme Ingbritt, JB 1600, NCTC 10449, OMZ 125, GS 5, SE 11, OMZ 175, LM 7, QP 50-1 von S. mutans werden auf Mitis-Salivarius Agar mit Bacitrazin (MSB, Difco) einem Selektivmedium für humanpathogene Mutans-Streptokokken, bei 37°C kultiviert.The reference strains Ingbritt, JB 1600, NCTC 10449, OMZ 125, GS 5, SE 11, OMZ 175, LM 7, QP 50-1 from S. mutans are on Mitis-Salivarius agar with Bacitrazin (MSB, Difco) a selective medium for human pathogenic mutans streptococci, at 37 ° C cultured.

2. Kultivierung der in der biologischen Probe enthaltenen Mikroorganismen2. Cultivation of in the biological sample contained microorganisms

Jede der 10 Testpersonen kaut ca. 1 Minute auf einem handelsüblichen Paraffinblock für Speicheltests und sammelt den entstehenden Speichel. Eine Menge von 0,1–1 ml Speichel wird auf Mitis-Salivarius Agar mit Bacitrazin, einem Selektivmedium für humanpathogene Mutans-Streptokokken, ausgestrichen und bei 37°C für 24–48 Stunden inkubiert.each The 10 test persons chew about 1 minute on a commercial Paraffin block for Saliva tests and collects the resulting saliva. A lot from 0.1-1 Saliva is added to Mitis Salivarius Agar with Bacitrazin, a Selective medium for human pathogenic mutans streptococci, streaked and incubated at 37 ° C for 24-48 hours incubated.

Die Isolate werden mittels biochemischer Tests (bunte Reihe) und über ihr Membranfettsäurespektrum untersucht. Isolate, die zur Spezies S. mutans gehören, werden massenspektrometrisch untersucht.The Isolates are determined by means of biochemical tests (colorful series) and above it Membrane fatty acid spectrum examined. Isolates belonging to the species S. mutans become mass spectrometric examined.

3. Probenvorbereitung für MALDI-TOF-MS3. Sample preparation for MALDI-TOF-MS

Einzelne Zellkolonien der S. mutans Referenzstämme und der Isolate aus der Mundhöhle werden vorsichtig ein bis zwei mal in gereinigtem Wasser gewaschen. Die Kolonien werden in frisch präparierte MALDI-Matrix-Lösung (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) in Acetonitril/0,1% Trifluor-Essigsäure (TFA) (2:1)) gegeben. 1 μl dieser Suspension wird auf einen MALDI-Probenträger gegeben und getrocknet. Die Probe wird mit 5 μl 0,1% TFA gewaschen, um Salz und eventuell vorhandene Reste des Kulturmediums herauszulösen. Die Probe wird unter Verwendung von Acetonitril/0,1% TFA (2:1) rekristallisiert.Separate Cell colonies of S. mutans reference strains and isolates from oral cavity are carefully washed one to two times in purified water. The colonies are freshly prepared MALDI-matrix solution (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (HCCA) in acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (2: 1)). 1 μl of this Suspension is placed on a MALDI sample carrier and dried. The sample is filled with 5 μl 0.1% TFA washed to salt and any residues of the culture medium extract. The Sample is recrystallized using acetonitrile / 0.1% TFA (2: 1).

Alternativ können die Zellen auch direkt auf einen Probenträger gebracht werden und auf diesem mit MALDI-Matrix-Lösung versetzt werden. Das weitere Vorgehen erfolgt wie bereits beschrieben.alternative can The cells are also placed directly on a slide and on this with MALDI matrix solution be offset. The further procedure is carried out as already described.

Es werden mehrere Proben von ein und derselben Kolonie aufgetragen (mehrere Spots).It several samples are applied from one and the same colony (several spots).

4. Aufnahme der MALDI-TOF-Massenspektren4. Recording the MALDI-TOF mass spectra

Der MALDI-Probenträger wird in ein MALDI-TOF Massenspektrometer (Bruker Biflex III, N₂-laser, (Wellenlänge 337 nm, Puls 5 ns, Flugstrecke 1200 mm) eingeführt. Die Messungen werden im linear positiven Modus (Verzögerung 400 ns, Spannung 20 kV, Massenbereich: 2000 bis 20000 Dalton) durchgeführt. Je Probenspot werden insgesamt 120 Schüsse (4 Aufnahmezyklen zu je 30 Schüssen) appliziert.The MALDI sample carrier is inserted into a MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker Biflex III, N ₂ laser, (wavelength 337 nm, pulse 5 ns, flight distance 1200 mm) .The measurements are carried out in linear positive mode (deceleration 400 ns, voltage 20 kV, mass range: 2000 to 20000 daltons) For each sample spot, a total of 120 shots (4 picking cycles of 30 shots each) are applied.

Zur Eichung wird je ein Peptid-Mix (Sigma, Taufkirchen) benutzt (Somatostatin 28 (synthetisch, M⁺H⁺ = 3148.0 Dalton), Insulin (Rinderpankreas, M⁺H⁺ = 5733.5 Dalton), Cytochrom C (Pferdeherz, M⁺H⁺ = 12360.0 Dalton) und Myoglobin (Pferdeherz, M⁺H⁺ = 16951.0 Dalton). Die Spektren werden intern kalibriert.For calibration, a peptide mix (Sigma, Taufkirchen) is used (somatostatin 28 (synthetic, M ⁺ H ⁺ = 3148.0 daltons), insulin (bovine pancreas, M ⁺ H ⁺ = 5733.5 daltons), cytochrome C (horse heart, M ⁺ H ⁺ = 12360.0 Dalton) and myoglobin (horse heart, M ⁺ H ⁺ = 16951.0 daltons). The spectra are calibrated internally.

Es werden mehrere Summenspektren von unterschiedlichen Spots der gleichen Probe aufgenommen. Sechs der Summenspektren werden übereinandergelagert, um Superspektren höherer Reproduzierbarkeit zu erhalten.It become multiple sum spectra of different spots of the same Sample taken. Six of the sum spectra are superimposed, higher spectra To obtain reproducibility.

Von diesen Superspektren werden 120 Masse/Ladungspeaks erfasst. Listen, welche die Masse/Ladungspeaks und ihre Intensitäten enthalten, werden als ASCII Dateien in das Programm MatLab 6.5 (The MathWorks Inc., Natick, U.S.A.) exportiert. Alle weiteren Verfahrensschritte werden unter Nutzung der entsprechenden MATLAB-Funktionen computergestützt ausgeführt.From 120 mass / charge peaks are detected in these superspectrons. lists which contain the mass / charge peaks and their intensities are called ASCII Files into the MatLab 6.5 program (The MathWorks Inc., Natick, U.S.A.). All further steps are under Using the corresponding MATLAB functions computer-aided execution.

1 zeigt Superspektren der S. mutans Referenzstämme. 1 shows super spectra of S. mutans reference strains.

5. Klassifizierung und Identifizierung von Peaks in Superspektren5. Classification and identification of peaks in super spectra

Die Peak-Intensitäten jedes Superspektrums werden log-transformiert, mittels eines „Loess smoothers" wird die Basislinie festgelegt.The Peak intensities every superspeed is log-transformed by means of a "Loess smoothers " set the baseline.

Zum Vergleich unterschiedlicher Superspektren wird ein Masse-Fenster entlang der x-Achse (m/z) geführt. Das Zentrum dieses Massen-Fensters repräsentiert die mittlere Position der vergleichbaren Peaks in allen untersuchten Spektren. Die Fenster-Breite wird durch die Präzision der experimentellen m/z-Bestimmung bestimmt. Ein linearer Zusammenhang zu m/z wird angenommen. Somit resultiert: Fenster-Breite = absolute Breite + relative Breite·Peakmasse. To compare different super spectra, a mass window is guided along the x-axis (m / z). The center of this mass window represents the mean position of the comparable peaks in all spectra studied. The window width is determined by the precision of the experimental m / z determination. A linear relationship to m / z is assumed. Thus results: Window width = absolute width + relative width · peak mass.

Für die Fenster-Breite wurden 3 Da, für die relative Breite 2 e^–4 ermittelt. Das Masse-Fenster wird jedem Masse-Peak zugeordnet. Fenster, die in unterschiedlichen Superspektren dieselben Peaks enthalten, werden zusammengefasst. Diese Peaks werden durch ihr mittleres m/z und ihre mittlere Intensität repräsentiert. Überlappende Fenster werden mit der halben Fenster-Weite aufgelöst.For the window width 3 Da, for the relative width 2 e ^{-4 were} determined. The mass window is assigned to each mass peak. Windows containing the same peaks in different super spectra are combined. These peaks are represented by their mean m / z and their mean intensity. Overlapping windows are resolved with half the window width.

Durch das beschriebene Verfahren wird eine Matrix η_ij konstruiert. Ihre Zeilen werden durch die mittleren Peak-Massen, ihre Spalten durch das jeweilige Superspektrum bestimmt. Bei Abwesenheit eines Peaks in einem Superspektrum wurde η_ij = 0 angenommen. Eine typische Matrix enthält also 100–200 Zeilen. Die Anzahl der Spalten ist gleich der Anzahl der analysierten Superspektren.The described method constructs a matrix η _ij . Their lines are determined by the middle peak masses, their columns by the respective superspec spectrum. In the absence of a peak in a superspec spectrum, η _ij = 0 was assumed. A typical matrix contains 100-200 lines. The number of columns is equal to the number of superspectrons analyzed.

6. Erstellen der Distanzmatrix und Analyse der Distanzmatrix unter Verwendung verschiedener Clustering-Verfahren6. Create the distance matrix and analysis of the distance matrix using various clustering methods

Die Ähnlichkeit der Superspektren der Referenzsubspezies wird durch eine Euklidische Distanzmatrix dargestellt. Die Distanzmatrix wird unter Verwendung verschiedener Clustering-Verfahren (Hierarchisches Clustering und Qantum Clustering) analysiert. Die Ergebnisse für das Clustering der Superspektren der Referenzstämme sind in 2 dargestellt. Beide Clustering-Verfahren erlauben eine sichere und identische Auftrennung der Referenzstämme.The similarity of the superspec spectra of the reference subspecies is represented by a Euclidean distance matrix. The distance matrix is analyzed using different clustering methods (Hierarchical Clustering and Qantum Clustering). The results for the clustering of the superspectrons of the reference strains are in 2 shown. Both clustering methods allow a secure and identical separation of the reference strains.

Von jeder Referenzsubspezies wurden zwei unabhängige Superspektren ermittelt: 1, 2: Ingbritt 3, 4: JB 1600 5, 6: NCTC 10449 7, 8: GS 5 9, 10: QP 50-1 11, 12: SE11 13, 14: OMZ 125 15, 16: LM 7 17, 18: OMZ 175 From each reference subspecies, two independent super spectra were determined: 1, 2: Ingbritt 3, 4: JB 1600 5, 6: NCTC 10449 7, 8: GS 5 9, 10: QP 50-1 11, 12: SE11 13, 14: OMZ 125 15, 16: LM 7 17, 18: OMZ 175

2a zeigt das Ergebnis nach hierarchischem Clustering.

• untere horizontale Linie: σ₁, maximale Distanz der Doppelbestimmung einer Subspezies
• obere horizontale Linie: σ₂, minimale Distanz zweier verschiedener Subspezies

2a shows the result after hierarchical clustering.

• lower horizontal line: σ ₁ , maximum distance of the double determination of a subspecies
• upper horizontal line: σ ₂ , minimum distance of two different subspecies

2b zeigt das Ergebnis nach Quantum clustering, wobei die Anzahl der Dimensionen 9 ist. 2 B shows the result after quantum clustering, where the number of dimensions is 9.

Die Subspezies der Spezies S. mutans zeigen unterschiedliche Ähnlichkeiten, die jedoch geringer sind (höhere Differenzen) als die größten Differenzen, die zwischen Doppelbestimmungen eines Stammes beobachtet wurden.The Subspecies of the species S. mutans show different similarities, however, they are lower (higher Differences) than the largest differences, observed between duplicate determinations of a strain.

7. Subspeziesdifferenzierung von Isolaten7. Subspecies differentiation of isolates

Die Analyse der Superspektren der S. mutans Isolate auf Subspezies-Ebene basiert auf der Reproduzierbarkeit der Messungen an den S. mutans Referenzstämmen. 2a zeigt die Ergebnisse des hierarchischen Clusterings der Superspektren der Referenzstämme, die jeweils doppelt bestimmt wurden. σ₁ ist ein Maß für die maximale Differenz der Doppelbestimmung einer Subspezies (hier die Doppelbestimmung des Stammes SE 11). σ₂ ist ein Maß für die minimale Distanz zwischen Superspektren verschiedener Subspezies (hier die Distanz der Stämme Ingbritt und JB 1600).The superspecific analysis of S. mutans isolates at subspecies level is based on the reproducibility of measurements on the S. mutans reference strains. 2a shows the results of the hierarchical clustering of the superspectrons of the reference strains, which were each determined twice. σ ₁ is a measure of the maximum difference of the double determination of a subspecies (here the double determination of the strain SE 11). σ ₂ is a measure of the minimum distance between superspectrics of different subspecies (here the distance of the strains Ingbritt and JB 1600).

In einem ersten Schritt. wurden zunächst alle S. mutans Isolate jedes Probanden separat analysiert. Unter Verwendung von σ₁ als Schranke konnte die maximale Zahl verschiedener Subspezies je Proband bestimmt werden. Mit σ₂ als Schranke konnten je Proband zwischen einer und vier sicher verschiedenen Subspezies ermittelt werden (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Ergebnis der Populationsanalyse der klinischen S. mutans Isolate aller 10 Probanden auf Subspezies-Ebene. Proband S. mutans Anzahl Isolate möglicherweise verschiedene Isolate (> σ₁) sicher verschiedene Isolate (> σ₂) P1 23 3 2 (a, b) P2 14 3 2 (a, b) P3 26 6 4 (a, b, c, d) P4 11 5 3 (a, b, c) P5 16 1 1 P6 16 2 2 (a, b) P7 9 4 3 (a, b, c) P8 12 4 3 (a, b, c) P9 10 2 2 (a. b) P10 22 4 1 In a first step. First, all S. mutans isolates of each subject were analyzed separately. Using σ ₁ as a barrier, the maximum number of different subspecies per subject could be determined. With σ ₂ as a barrier, between one and four certainly different subspecies could be determined per subject (see Table 1). Table 1: Result of the population analysis of clinical S. mutans isolates of all 10 subjects at subspecies level. Family S. mutans Number of isolates possibly different isolates (> σ ₁ ) certainly different isolates (> σ ₂ ) P1 23 3 2 (a, b) P2 14 3 2 (a, b) P3 26 6 4 (a, b, c, d) P4 11 5 3 (a, b, c) P5 16 1 1 P6 16 2 2 (a, b) P7 9 4 3 (a, b, c) P8 12 4 3 (a, b, c) P9 10 2 2 (a b) P10 22 4 1

3 zeigt die Ergebnisse des hierarchischen Clusterings der Superspektren bzw. Zentroide aller sicher verschiedenen S. mutans Subspezies von jedem der 10 Probanden, des doppelbestimmten Superspektrums des Referenzstammes SE 11 (maximale Differenz der Doppelbestimmung der Referenzstämme, σ₁) sowie der Superspektren der beiden ähnlichsten verschiedenen Referenzstämme (Inbritt und JB 1600, σ₂). 3 shows the results of the hierarchical clustering of the superspec- ces or centroids of all surely different S. mutans subspecies of each of the 10 subjects, the double determined superspec- ce of the reference strain SE 11 (maximum difference of the double determination of the reference strains, σ ₁ ) as well as the super spectra of the two most similar different reference strains (Inbritt and JB 1600, σ ₂ ).

Mit σ₁ als Schranke konnten Isolate verschiedener Probanden als phänotypisch ununterscheidbar, und damit im Rahmen der verwendeten Methode als „phänotypisch identisch", erkannt werden (hier sind Subspezies a aus Proband 3 (P 3-a) und Subspezies a aus Proband 6 (P 6-a) identisch sowie Subspezies a aus Proband 6 (P 6-a) und Subspezies a aus Proband 5 (P 5-a)).With σ ₁ as a barrier isolates of different subjects could be identified as phenotypically indistinguishable, and thus within the scope of the method used as "phenotypically identical" (here are subspecies a from subject 3 (P 3-a) and subspecies a from subject 6 (P 6-a) identical as well as subspecies a from subject 6 (P 6-a) and subspecies a from subject 5 (P 5-a)).

Mit σ₂ als Schranke konnten mindestens 14 sicher verschiedene Subspezies in den 10 Probanden unterschieden werden.With σ ₂ as a barrier it was possible to distinguish at least 14 distinct subspecies in the 10 subjects.

Distanzen zwischen σ₁ und σ₂ wurden für drei Gruppen von Isolaten gefunden (P 3-a/P 6-a, P1-a/P 5-a, P 9-a; P 4-a, P 6-b; P 1-b, P 8-a, P 7-a, P 2-a, P 3-c; siehe 3). Die jeweiligen Phänotypen sind unterscheidbar, die jeweiligen Superspektren sind einander jedoch ähnlicher als die der ähnlichsten der untersuchten Referenzstämme (Ingbritt und JB 1600).Distances between σ ₁ and σ ₂ were found for three groups of isolates (P 3-a / P 6-a, P 1-a / P 5-a, P 9-a, P 4-a, P 6-b, P 1-b, P 8-a, P 7-a, P 2-a, P 3-c; 3 ). The respective phenotypes are under However, the respective super spectra are more similar than those of the most similar of the investigated reference strains (Ingbritt and JB 1600).

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Claims (9)

Verfahren zur Differenzierung von Mikroorganismen in einer Probe auf Subspezies-Ebene mittels Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), wobei a) aus der Probe durch Kultivierung auf einem Medium, das für die auf ihre Subspezies zu untersuchende Spezies selektiv ist, Einzelkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden, die zur gleichen Spezies gehören, b) MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen aufgenommen werden, c) durch eine mathematische Ähnlichkeitsanalyse aus natürlichen MALDI-MS-Referenzspektren von verschiedenen Mikroorganismen-Subspezies, die zur gleichen Spezies wie die aus der Probe gewonnen Einzelkulturen gehören, die Werte s₁ (Homogenitätsgrenze) und s₂ (Heterogenitätsgrenze) ermittelt werden, wobei die Homogenitätsgrenze s₁ der maximalen Distanz verschiedener Spektren der gleichen Referenzsubspezies bei Mehrfachmessungen der Referenzsubspezies und die Heterogenitätsgrenze s₂ der kleinsten beobachteten Distanz zwischen Spektren von zwei verschiedenen Referenzsubspezies entspricht, d) die MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen paarweise miteinander und mit den Referenzspektren durch eine mathematische Ähnlichkeitsanalyse verglichen werden, wobei die Einzelkultur dann als identisch mit einer Referenzsubspezies bzw. einer anderen aus der Probe gewonnenen Einzelkultur eingestuft wird, wenn die Distanz der Spektren kleiner als s₁ ist, die Einzelkultur als neue Subspezies eingestuft wird, wenn ihre Distanz zu allen Referenzspektren und zu allen Spektren der anderen aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen größer als s₂ ist, die Einzelkultur nahe verwandt mit einer Referenzsubspezies bzw. einer anderen aus der Probe gewonnenen Einzelkultur eingestuft wird, wenn die Distanz der Spektren größer als s₁ und kleiner als s₂ ist.Method for differentiating microorganisms in a sample at sub-species level using matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), where a) from the sample by culturing on a medium suitable for subcellularization selective species is obtained from microorganisms belonging to the same species, b) MALDI-MS spectra of the individual cultures obtained from the sample are recorded, c) by a mathematical similarity analysis from natural MALDI-MS reference spectra of different microorganisms -Subspezies that belong to the same species as the individual cultures obtained from the sample, the values s ₁ (homogeneity limit) and s ₂ (heterogeneity limit) are determined, the Homo genitätsgrenze s ₁ corresponds to the maximum distance of various spectra of the same Referenzsubspezies for multiple measurements of Referenzsubspezies and heterogeneity boundary s ₂ of the smallest observed distance between spectra of two different Referenzsubspezies, d) the MALDI-MS-spectra of the individual cultures derived from the sample pairs with each other and with the reference spectra are compared by a mathematical similarity analysis, wherein the single culture is then considered to be identical to a Referenzspespezies or other obtained from the sample single culture, if the distance of the spectra is less than s ₁ , the single culture is classified as new subspecies, if their distance to all reference spectra and to all spectra of the other individual cultures obtained from the sample is greater than s ₂ , the individual culture is considered to be closely related to a reference subspecies or to another single culture obtained from the sample, if the Distance of the spectra is greater than s ₁ and less than s ₂ . Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-TOF-MS Spektren in einem Massenbereich von 2000 bis 20000 Dalton aufgenommen werden.Method according to claim 1, characterized in that that the MALDI-TOF-MS spectra in a mass range of 2000 to 20000 daltons are recorded. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-TOF-MS Spektren aus der Überlagerung von mindestens sechs vollständigen Einzelspektren konstruiert werden.Method according to claim 1, characterized in that that the MALDI-TOF-MS spectra from the superposition of at least six complete Single spectra are constructed. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für jede Referenz-Subspezies mindestens zwei unabhängige Spektren aufgenommen werden.Method according to claim 1, characterized in that that for every reference subspecies at least two independent Spectra are recorded. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Werte s₁ und s₂ aus einer Euklidischen Distanzmatrix der Referenzspektren gewonnen werden.A method according to claim 1, characterized in that the values s ₁ and s _{2 are obtained} from a Euclidean distance matrix of the reference spectra. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen mittels einer Euklidischen Distanzmatrix paarweise miteinander und mit den Referenzspektren verglichen werden.Method according to claim 1, characterized in that that the MALDI-MS spectra of the individual cultures obtained from the sample by means of a Euclidean distance matrix in pairs with each other and be compared with the reference spectra. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Clusteranalyse der MALDI-MS-Spektren der aus der Probe gewonnenen Einzelkulturen und/oder der Referenz-Spektren durchgeführt wird.Method according to claim 1, characterized in that that in addition a cluster analysis of the MALDI-MS spectra obtained from the sample Single cultures and / or the reference spectra is performed. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Clusteranalyse hierarchisches Clustering, K-means Clustering, Fuzzy Clustering und/oder Quantum Clustering eingesetzt wird.Method according to claim 7, characterized in that that for cluster analysis hierarchical clustering, K-means clustering, Fuzzy clustering and / or quantum clustering is used. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Subspezies-Differenzierung von Mutans-Streptokokken oder Candida albicans.Use of the method according to one of claims 1 to 8 for subspecies differentiation of mutans streptococci or Candida albicans.