DE102005002353A1 - Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications - Google Patents
Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications Download PDFInfo
- Publication number
- DE102005002353A1 DE102005002353A1 DE200510002353 DE102005002353A DE102005002353A1 DE 102005002353 A1 DE102005002353 A1 DE 102005002353A1 DE 200510002353 DE200510002353 DE 200510002353 DE 102005002353 A DE102005002353 A DE 102005002353A DE 102005002353 A1 DE102005002353 A1 DE 102005002353A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ager
- rme
- antibody
- antibodies
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung, Funktionalität und Verwendung von Domänen aus dem N-Terminus des Rezeptors für Advanced Glycation End Products (AGER). Diese Domänen, mit der Bezeichnung Rezeptor Multimerisierungs Epitop (RME) sind hochkonserviert in sämtlichen AGER Proteinsequenzen. Sie stellen die Mediatoren für die AGER Selbstassoziation und Heteromerisierung mit anderen Proteinen dar. Die erfindungsgemäßen AGER-RMEs eignen sich als Target zur Identifizierung von AGER-Liganden, welche die natürliche Ligandenwechselwirkung modulieren; als Immunogen für die aktive oder passive Immunisierung von Individuen, als diagnostische Mittel zur Identifizierung immunogener Reaktionen sowie als Peptidliganden zur Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Beteiligung von AGER.The The present invention relates to identification, functionality and use of domains from the N-terminus of the Advanced Glycation End Products receptor (AGER). These domains, labeled Receptor Multimerization Epitope (RME) highly preserved in all AGER protein sequences. They provide the mediators for the AGER Self-association and heteromerization with other proteins. The AGER RMEs according to the invention are suitable as a target for the identification of AGER ligands, which The natural Modulate ligand interaction; as an immunogen for the active or passive immunization of individuals as diagnostic agents for the identification of immunogenic reactions as well as peptide ligands for the modulation of protein-protein interactions with participation from AGER.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass zahlreiche menschliche Erkrankungen mit einem vermehrten Auftreten von AGER oder AGER-bindenden Liganden assoziiert sind (Jerums G et al.:Arch Biochem Biophys. 2003 Nov 1;419(1):55-62.; Bucciarelli LG et al.: Cell Mol Life Sci. 2002 Jul;59(7):1117-28; Hofmann HS et al.:Am J Respir Crit Care Med. 2004 Sep 1;170(5):516-9.; Lotze MT et al:Curr Opin Investig Drugs. 2003 Dec;4(12):1405-9).Out It is known in the art that many human diseases with an increased occurrence of AGER or AGER-binding ligands (Jerums G et al .: Arche Biochem Biophys 2003 Nov 1; 419 (1): 55-62 .; Bucciarelli LG et al .: Cell Mol Life Sci. 2002 July; 59 (7): 1117-28; Hofmann HS et al.: Am J Respir Crit Care Med. 2004 Sep 1; 170 (5): 516-9; Lotze MT et al: Curr Opin Investig Drugs. 2003 Dec; 4 (12): 1405-9).
Die WO-A-2004/016229 beschreibt N-terminale AGER-Fragmente, welche die Fähigkeit zur Ligandenbindung besitzen (RAGE-LBE) und schlägt deren Verwendung u.a. (als Fusionsprotein mit einem Immunglobulinelement) zur Behandlung von AGER-assoziierten Erkrankungen vor. Als Beispiele für solche Erkrankungen werden genannt, Amyloidosen, Krebs, Arthritis, Crohn'sche Erkrankung, chronische inflammatorische Erkrankungen, akute inflammatorische Erkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Diabetes, Diabeteskomplikationen, Prion-assoziierte Erkrankungen, Vaskularitis, Nephropathien, Retinopathien und Neuropathien. Insbesondere werden als AGER-assoziierte Erkrankungen genannt: Alzheimer, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Bowel Disease, multiple Sklerose, Psoriasis, Lupus, Autoimmunerkrankungen im allgemeinen, Sepsis, Arteriosklerose und Restenose. Insbesondere wird in der internationalen Patentanmeldung vorgeschlagen, AGER-Fragmente mit einer Länge von 118–344 Aminosäuren (jeweils beginnend am ersten N-terminalen Rest des Rezeptors) zu verwenden. Kürzere Fragmente werden nicht beschrieben. Weiterhin findet man in der WO-Schrift einen allgemeinen Hinweis auf die mögliche therapeutische Brauchbarkeit M/45213 isolierter Antikörper, welche mit einem Epitop der AGER-Aminosäuresequenz spezifisch immunoreaktiv sind. Es werden aber weder spezielle Epitope vorgeschlagen, noch werden spezifische Antikörper hergestellt.The WO-A-2004/016229 describes N-terminal AGER fragments containing the ability for ligand binding (RAGE-LBE) and proposes their use i.a. (when Fusion protein with an immunoglobulin element) for the treatment of AGER-associated Diseases. As examples of such diseases will be called, amyloidoses, cancer, arthritis, Crohn's disease, chronic inflammatory diseases, acute inflammatory diseases, cardiovascular diseases, Diabetes, diabetes complications, prion-associated diseases, Vascularular disease, nephropathies, retinopathies and neuropathies. Especially are called AGER-associated Diseases called: Alzheimer's disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, Bowel Disease, Multiple Sclerosis, Psoriasis, Lupus, Autoimmune Diseases in general, sepsis, arteriosclerosis and restenosis. Especially is proposed in the international patent application, AGER fragments with a length from 118-344 amino acids (each beginning at the first N-terminal residue of the receptor) too use. short Fragments are not described. Furthermore one finds in the WO-writing a general indication of the potential therapeutic utility M / 45213 isolated antibody, which is specifically immunoreactive with an epitope of the AGER amino acid sequence are. However, neither specific epitopes are proposed nor become specific antibodies produced.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Therapieansätze zur Behandlung AGER-assoziierter Erkrankungen bereitzustellen.It is therefore an object of the present invention, new therapeutic approaches to Treatment of AGER-associated diseases.
Kurze Beschreibung der ErfindungShort description the invention
Obige Aufgabe wurde überraschenderweise durch Isolierung und Charakterisierung spezieller Rezeptor Multimerisierungs Epitope (RME) von AGER gelöst.Above Task was surprisingly by isolation and characterization of special receptor multimerization Epitope (RME) solved by AGER.
Figurenbeschreibungfigure description
pIRES hNgR hp75 NgR (SEQ ID NO:18) (
pcDNA3
hRhoA wt (SEQ ID NO:23) (
pcDNA4
His Myc(mycHis)A hRhoA wt (SEQ ID NO:21) (
pcDNA3.1
(V5-His)hp75 Nr.16 (SEQ ID NO:16) (
pIRES hNgR hp75 NgR (SEQ ID NO: 18) (
pcDNA3 hRhoA wt (SEQ ID NO: 23) (
pcDNA4 His Myc (mycHis) A hRhoA wt (SEQ ID NO: 21) (
pcDNA3.1 (V5-His) hp75 # 16 (SEQ ID NO: 16) (
Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description the invention
1. Spezielle Gegenstände der Erfindung1. Special items of the invention
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des Rezeptor Multimerisierungs Epitops (RME) des Advanced-Glycation-End Products Rezeptors (AGER), umfassend ein zur Auto-Multimerisierung befähigtes Peptidfragment der N-terminalen AGER-Ektodomäne, oder eines funktionalen, immunogenen Äquivalents von AGER-RME, als Immunogen zur Herstellung eines polyklonaler Antiserums oder monoklonaler Antikörper gegen AGER-RME.One The first object of the invention relates to the use of the receptor Multimerization Epitops (RME) of the Advanced Glycation End Products Receptor (AGER) comprising a peptide fragment capable of auto-multimerization the N-terminal AGER ectodomain, or a functional, immunogenic equivalent of AGER-RME, as an immunogen for the preparation of a polyclonal antiserum or monoclonal antibody against AGER-RME.
Insbesondere wird dabei AGER-RME mit einer Länge von etwa 8 bis 50 Aminosäureresten eingesetzt, welches abgeleitet ist von der humanen AGER-Ektodomäne mit einer Aminosäuresequenz gemäß Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136 oder von einer funktional äquivalenten Ektodomäne.Especially is doing AGER-RME with a length from about 8 to 50 amino acid residues which is derived from the human AGER ectodomain with a amino acid sequence according to Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136 or of a functionally equivalent one Ectodomain.
Beispielsweise
umfasst das AGER-RME folgende Sequenz:
C(K/R)GAPKKP(P/T)Q(Q/R/K)LE
(SEQ ID NO: 1)For example, the AGER RME comprises the following sequence:
C (K / R) GAPKKP (P / T) Q (Q / R / K) LE (SEQ ID NO: 1)
Vorzugsweise
umfasst das AGER-RME eine Sequenz, die ausgewählt ist unter
CRGAPKKPPQQLE
(SEQ ID NO: 2)
CKGAPKKPPQRLE (SEQ ID NO: 3)
CKGAPKKPTQKLE
(SEQ ID NO: 4)Preferably, the AGER RME comprises a sequence selected from
CRGAPKKPPQQLE (SEQ ID NO: 2)
CKGAPKKPPQRLE (SEQ ID NO: 3)
CKGAPKKPTQKLE (SEQ ID NO: 4)
Ein
erfindungsgemäß brauchbares
AGER-RME kann aber auch eine Sequenz der folgenden allgemeinen Formel
umfassen:
X1 für
ein Wasserstoffatom, oder die Aminosäure Q oder das Dipeptid DQ
steht;
X2 für NITARIG(K/E)PL(V/M)L(N/S/K)
(SEQ ID NO: 5) steht;
X3 für eine Sequenz
nach SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 steht; und
X4 für die Peptidsequenz
WKLN steht.However, an AGER-RME useful in accordance with the invention may also comprise a sequence of the following general formula:
X 1 represents a hydrogen atom, or the amino acid Q or the dipeptide DQ;
X 2 is NITARIG (K / E) PL (V / M) L (N / S / K) (SEQ ID NO: 5);
X 3 represents a sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4; and
X 4 stands for the peptide sequence WKLN.
Alternativ kann das AGER-RME, insbesondere mit einer der oben angegebenen Sequenzen, als cyclisches Peptid vorliegen.alternative can be the AGER-RME, in particular with one of the above sequences, exist as a cyclic peptide.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer AGER-RME gemäß obiger Definition als diagnostischen Marker, wie z.B. als Capture-Antigen, zur Diagnose von Krankheiten oder Krankheitsstadien, bei denen Auto-Antikörper gegen das AGER-RME auftreten.One Another object of the invention relates to the use of a AGER-RME according to the above Definition as a diagnostic marker, e.g. as a capture antigen, for the diagnosis of diseases or stages of disease in which auto-antibodies against the AGER-RME occur.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer AGER-RME gemäß obiger Definition, der AGER-Ektodomäne mit einer Aminosäuresequenz gemäß Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136 und N-terminaler Subfragmente davon, sowie von Muteinen und Derivaten dieser AGER-Moleküle, oder von AGER-RME-bindenden Liganden zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Diagnose oder Therapie von AGER-mediierten Krankheiten oder Krankheitsstadien.One Another object of the invention relates to the use of a AGER-RME according to the above Definition, the AGER ectodomain with an amino acid sequence according to Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136 and N-terminal subfragments thereof, as well as muteins and derivatives of these AGER molecules, or of AGER-RME-binding Ligands for the preparation of a pharmaceutical agent for diagnosis or Therapy of AGER-mediated diseases or stages of disease.
Erfindungsgemäß therapierbare Krankheiten oder Krankheitsstadien sind solche, die mit einer AGER/AGER-, AGER/Ligand-, AGER/Rezeptor-, AGER/Rezeptor/Ligand-, AGER/Rezeptor/Co-Rezeptor- und/oder AGER/Rezeptor/Counter-Rezeptor-Wechselwirkung assoziiert sind.Therapeutic according to the invention Diseases or stages of disease are those associated with an AGER / AGER, AGER / ligand, AGER / receptor, AGER / receptor / ligand, AGER / receptor / co-receptor and / or AGER / receptor / counter-receptor interaction are associated.
Als Beispiele für Erkrankungen die mit einer AGER/AGER-Wechselwirkung assoziiert sind, können genannt werden: Alzheimer und Amyloidosen; als Beispiele für Erkrankungen die mit einer AGER/Ligand- Wechselwirkung assoziiert sind, können genannt werden: Alzheimer und HIV-assoziierte Demenz; als Beispiele für Erkrankungen die mit einer AGER/Rezeptor- Wechselwirkung assoziiert sind, können genannt werden: Rückenmarksverletzung und Schädeltrauma; als Beispiele für Erkrankungen die mit einer AGER/Rezeptor/Co-Rezeptor- und/oder AGER/Rezeptor/Counter-Rezeptor-Wechselwirkung assoziiert sind, können genannt werden: Multiple Sklerose, Sepsis, Arteriosklerose.When examples for Diseases associated with an AGER / AGER interaction, can be called are: Alzheimer's and amyloidoses; as examples of diseases which are associated with an AGER / ligand interaction may be mentioned are: Alzheimer's and HIV-associated dementia; as examples of diseases which are associated with an AGER / receptor interaction may be mentioned become: spinal cord injury and skull trauma; as examples of Diseases associated with AGER / receptor / co-receptor and / or AGER / receptor / counter-receptor interaction are, can called: multiple sclerosis, sepsis, arteriosclerosis.
Die erfindungsgemäß therapierbaren und/oder diagnostizierbaren Krankheiten oder Krankheitsstadien können weiterhin aus folgenden Gruppen ausgewählt sein:
- a) mechanischen Verletzungen von Schädel und Rückenmark;
- b) ischaemischen Schäden, wie Schlaganfall;
- c) chronischen Erkrankungen, ausgewählt unter neurodegenerative, inflammatorische und Autoimmun-Erkrankungen, wie insbesondere Multiple Sklerose, Parkinson, Alzheimer's, HIV-1 assoziierte Demenz;
- d) diabetischen Folgeerkrankungen, wie diabetische Nephropathie, diabetische Neuropathie, und diabetische Vaskulopathie;
- e) Tumorprogression und Metastasierung;
- f) veränderten Neurogeneseprozesse bei psychotischen Erkrankungen, wie Depression und Schizophrenie, und chronischen Schmerzzuständen die durch exzessive Neuritensprossung und/oder pathologische Synaptogenese hervorgerufen werden, wie Phantomschmerz nach Amputation;
- g) Störungen der neuronalen Regeneration, des axonalen Sproutings, der Neuritenextension und der neuronalen Plastizität
- h) zentralen/peripheren Amyloiderkrankungen; und
- i) Arteriosklerose.
- a) mechanical injury to the skull and spinal cord;
- b) ischemic damage, such as stroke;
- c) chronic diseases selected from neurodegenerative, inflammatory and autoimmune diseases such as, in particular, multiple sclerosis, Parkinson's, Alzheimer's, HIV-1 associated dementia;
- d) diabetic sequelae, such as diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, and diabetic vasculopathy;
- e) tumor progression and metastasis;
- f) altered neurogenesis processes in psychotic disorders such as depression and schizophrenia, and chronic pain conditions caused by excessive neurite sprouting and / or pathological synaptogenesis, such as phantom pain after amputation;
- g) disorders of neuronal regeneration, axonal sprout, neurite extension and neuronal plasticity
- h) central / peripheral amyloid diseases; and
- i) arteriosclerosis.
Nach einer besonderen Ausführungsform ist der AGER-RME-bindende Ligand ein anti-AGER-RME-Antikörper.To a particular embodiment For example, the AGER-RME binding ligand is an anti-AGER-RME antibody.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von AGER-RME nach obiger Definition als Target zum Nachweis oder zur Identifizierung von AGER-bindenden Liganden.One Another object of the invention relates to the use of AGER-RME as defined above as a target for detection or identification from AGER-binding Ligands.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von AGER-RME nach obiger Definition als Immunogen zur aktiven oder passiven Immunisierung.One Another object of the invention relates to the use of AGER-RME according to the above definition as an immunogen for active or passive immunization.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein polyklonales anti-AGER-RME Antiserum, erhältlich durch Immunisierung eines Säugers mit einer antigenen Menge eines AGER-RME Peptids gemäß obiger Definition.object The invention further provides a polyclonal anti-AGER-RME antiserum, available by immunizing a mammal with an antigenic amount of AGER-RME peptide as defined above.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin monoklonale anti-AGER-RME Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon, gegebenenfalls in humanisierter Form.object monoclonal anti-AGER-RME antibodies or Antigen-binding fragments thereof, optionally in humanized Shape.
Bevorzugte Antikörper oder Antiseren weisen wenigstens eine der folgenden Eigenschafen auf:
- a) verbesserte Spezifität für ein AGER-RME gemäß obiger Definition,
- b) verbesserte Spezifität für ein unter Beteiligung des AGER-RME nach obiger Definition ausgebildetes Neoepitop,
- c) Inhibition der AGER-RME- vermittelten Multimerisierung mit sRAGE oder anti-AGER-RME Antikörper (insbesondere zu beobachten in einem AlphaScreen- oder Assay);
- d) spezifische Erkennung eines AGER-Ligand-induzierten, z.B. durch Aβ1-42 induzierten, Rezeptorstatus von sRAGE;
- e) Induzierung einer Rezeptorkonfiguration von sRAGE, welche die Bindung eines AGER-Liganden, wie z.B. ausgewählt unter Aβ1-42, Aβ 20-42, Aβ 12-42 und deren Globulomere, Amyloid, AGE, an sRAGE moduliert, wie z.B. fördert.
- a) improved specificity for an AGER RME as defined above,
- b) improved specificity for a neoepitope formed using the AGER-RME as defined above,
- c) inhibition of AGER-RME-mediated multimerization with sRAGE or anti-AGER-RME antibody (especially seen in an alpha-screen or assay);
- d) specific recognition of an AGER-ligand-induced, eg Aβ1-42-induced, receptor status of sRAGE;
- e) inducing a receptor configuration of sRAGE which promotes binding of an AGER ligand, such as selected from Aβ1-42, Aβ20-42, Aβ12-42 and their globulomers, amyloid, AGE, to sRAGE, such as, for example.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin monoklonale, bispezifische Antikörper, umfassend
- a) eine erste Antigen-bindende Domäne, abgeleitet von einem monoklonalen Antikörper nach obiger Definition, und
- b) eine zweite Antigen-bindende Domäne mit Spezifität für wenigstens einen Zelloberflächen-Rezeptor, der zu einer Wechselwirkung mit AGER-RME befähigt sind, wie z.B. AGER, NgR, oder mit Spezifität für einen Liganden, Co- oder Counter-Rezeptor für einen dieser Rezeptoren,
- a) a first antigen-binding domain derived from a monoclonal antibody as defined above, and
- b) a second antigen-binding domain having specificity for at least one cell surface receptor capable of interacting with AGER-RME, such as AGER, NgR, or having specificity for a ligand, co- or counter-receptor for any of these receptors
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Hybridprotein, umfassend ein AGER-RME nach obiger Definition. Derartige Hybridproteine umfassend außerdem einen funktionalen Teil eines Proteins, ausgewählt unter Immunglobulinen und Fragmenten davon, wie z.B. ein Ig-Fc Fragment funktional verknüpft mit, beispielsweise dem C-Terminus von AGER-RME.Another The subject of the invention is a hybrid protein comprising an AGER-RME as defined above. Such hybrid proteins also include a functional part of a protein selected from immunoglobulins and Fragments thereof, e.g. an Ig-Fc fragment is functionally linked to, for example, the C-terminus of AGER-RME.
Gegenstand der Erfindung sind auch AGER-RME-Derivate, umfassend AGER-RME nach obiger Definition in PEGylierter Form oder gekoppelt mit einem, beispielsweise optischen, enzymatischen oder radioaktiven, Marker.object The invention also includes AGER-RME derivatives comprising AGER-RME according to above definition in PEGylated form or coupled with one, for example, optical, enzymatic or radioactive, markers.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft pharmazeutische Mittel, umfassend in einem pharmazeutisch verträglichen Träger wenigsten einen aktiven Bestandteil ausgewählt unter:
- a) AGER-RME nach obiger Definition;
- b) für AGER-RME nach obiger Definition kodierenden Nukleinsäuresequenzen;
- c) monoklonale oder polyklonale anti-AGER-RME Antikörpern nach obiger Definition;
- d) bispezifischen Antikörpern nach obiger Definition, und
- e) Hybridproteinen und Derivaten nach obiger Definition.
- a) AGER-RME as defined above;
- b) nucleic acid sequences encoding AGER-RME as defined above;
- c) monoclonal or polyclonal anti-AGER-RME antibodies as defined above;
- d) bispecific antibodies as defined above, and
- e) hybrid proteins and derivatives as defined above.
Erfindungsgemäße pharmazeutisches Mittel können zusätzlich als weiteren aktiven Bestandteil einen Wirkstoff enthalten, der ausgewählt ist unter:
- a) Neurotrophen Faktoren, wie Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF, NT-3, BNDF; Inosin; Neuroimmunophilinen, wie FK506, GP11046; Chondroitinsulfat-Proteoglycan-abbauenden Enzymen, wie Chondroitinase ABC;
- b) Antikörper gegen Neuritenwachstumsinhibitoren; Nogo-A, wie die Antikörper IN-1, 7B12; MAG; Omgp; und/oder deren Rezeptoren; wie anti-NgR- und anti-p75-Antikörper;
- c) löslichem NgR-Fragment; Nogo-A-Peptidfragmenten, wie NEP1-40 und Nogo66,
- d) Inhibitoren der p75-vermittelten Signalkaskade, wie RHO A-Inhibitoren, ROCK-Inhibitoren, wie Y-27632,
- e) cAMP und funktionalen Analoga, Proteinkinase A, Arginase I, Polyamine, ciliary neurotrophis factor.
- a) Neurotrophic factors such as nerve growth factors such as NGF, NT-3, BNDF; inosine; Neuroimmunophilins such as FK506, GP11046; Chondroitin sulfate proteoglycan degrading enzymes, such as chondroitinase ABC;
- b) antibodies to neurite outgrowth inhibitors; Nogo-A, like the antibodies IN-1, 7B12; LIKE; OMgp; and / or their receptors; such as anti-NgR and anti-p75 antibodies;
- c) soluble NgR fragment; Nogo A peptide fragments, such as NEP1-40 and Nogo66,
- d) inhibitors of the p75-mediated signaling cascade, such as RHO A inhibitors, ROCK inhibitors, such as Y-27632,
- e) cAMP and functional analogs, protein kinase A, arginase I, polyamines, ciliary neurotrophis factor.
Solche pharmazeutischen Mittel eignen sich beispielsweise zur intrathecalen, intravenösen, subkutanen, oralen oder parenteralen, nasalen und Inhalations-Verabreichung.Such For example, pharmaceutical agents are useful for intrathecal, intravenous, subcutaneous, oral or parenteral, nasal and inhalation administration.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Immunogen, umfassend AGER-RME nach obiger Definition in einen pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls mit eine Adjuvans zur aktiven Immunisierung.object The invention further relates to an immunogen comprising AGER-RME according to above definition in a pharmaceutically acceptable carrier and optionally with an adjuvant for active immunization.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von Effektoren des AGER-Rezeptors, wobei man eine Probe, in der man einen Effektor vermutet, mit einem AGER-RME-Polypeptid nach obiger Definition inkubiert und den Ansatz auf die Bildung eines Effektor-AGER-RME-Komplexes untersucht.object The invention also provides a method for detecting effectors of the AGER receptor, taking a sample in which one has an effector suspected to be incubated with an AGER-RME polypeptide as defined above and the approach to the formation of an effector-AGER-RME complex examined.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Expressionsvektoren, umfassend wenigstens eine kodierende Nukleinsäuresequenz für ein lineares AGER-RME gemäß obiger Definition, operativ verknüpft mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz.object The invention furthermore relates to expression vectors comprising at least a coding nucleic acid sequence for a linear AGER-RME according to the above Definition, operatively linked with at least one regulatory nucleic acid sequence.
Die Erfindung betrifft zudem rekombinante Mikroorganismen, welche wenigstes einen solchen Vektor trägt.The Invention also relates to recombinant microorganisms, which least carries such a vector.
Gegenstand der Erfindung sind auch Hybridomzelllinien, welche einen monoklonalen Antikörper nach obiger Definition produzieren.object The invention also includes hybridoma cell lines which are monoclonal antibody produce according to the above definition.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung von AGER-RME nach obiger Definition oder eines dieses enthaltenden Hybridproteins, wobei man einen rekombinanten Miroorganismus nach obiger Definition kultiviert und das produzierte Proteinprodukt aus der Kultur isoliert.The The invention further relates to processes for the production of AGER-RME as defined above or a hybrid protein containing the same, where one has a recombinant Miroorganismus as defined above cultured and isolated the protein product produced from the culture.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers nach obiger Definition, wobei man eine Hybridomzelllinie nach obiger Definition kultiviert und das produzierte Proteinprodukt aus der Kultur isoliert.The The invention further relates to methods for producing a monoclonal antibody according to the above definition, wherein a hybridoma cell line according to the above Definition cultured and the protein product produced from the Culture isolated.
Die Erfindung umfasst weiterhin funktionale, insbesondere immunogene Äquivalente von AGER-RME gemäß obiger Definition, welche einen Homologiegrad von weniger als 100% zu SEQ ID NO: 6 aufweisen.The The invention further includes functional, in particular immunogenic, equivalents from AGER-RME according to above Definition which has a degree of homology of less than 100% to SEQ ID NO: 6.
Erfindungsgemäße funktionalen Äquivalente von AGER-RME weisen wenigstens eine der folgenden Eigenschaften auf:
- a. Inhibition der Signaltransduktion im Aktin-Cytoskelett-Rearrangement (ACR)-Assay;
- b. Kompetition mit sRAGE um die Bindung mit einem AGER-Liganden, wie z.B. Aβ Globulomere, Aβ1-42, Aβ 20-42, Aβ 12-42, Amyloid, AGE;
- c. Auto-Multimerisierung oder Multimerisierung mit AGER-RME oder s-RAGE.
- a. Inhibition of signal transduction in the actin-cytoskeletal rearrangement (ACR) assay;
- b. Competing with sRAGE for binding with an AGER ligand, such as Aβ globulomers, Aβ1-42, Aβ 20-42, Aβ 12-42, amyloid, AGE;
- c. Auto-multimerization or multimerization with AGER-RME or s-RAGE.
Erfindungsgemäße funktionale Äquivalente
von AGER-RME können
weiterhin eine Kernsequenz mit hoher positiver Ladungsdichte der
folgende allgemeinen Formel aufweisen:
die
Reste Z unabhängig
voneinander für
einen Aminosäurerest
mit positiv geladener Seitenkette stehen, wie insbesondere Lysin
und Arginin; und
die Reste X1 und X2 unabhängig
voneinander für
beliebige 1 bis 5 gleiche oder verschiedene Aminosäure stehen,
welche keine positiv geladenen Seitenketten tragen.Functional equivalents of AGER-RME according to the invention may furthermore have a core sequence with a high positive charge density of the following general formula:
the radicals Z independently of one another represent an amino acid residue with a positively charged side chain, in particular lysine and arginine; and
the radicals X 1 and X 2 are independently any 1 to 5 identical or different amino acid, which carry no positively charged side chains.
II. Erläuterungen allgemeiner BegriffeII. Explanatory notes general terms
Als „Rezeptoren" bezeichnet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere an einer Zellmembran gebundene Oberflächenmoleküle, welche mit einem, beispielsweise löslichen, Liganden in Wechselwirkung treten können und als Folge dieser Wechselwirkung ein beispielsweise in das Zellinnere gerichtetes Signal oder eine Signalkaskade (auch als Signalling bezeichnet) auslösen können.As "receptors" one calls in Framework of the present invention, in particular on a cell membrane bound surface molecules, which with one, for example, soluble, Ligands can interact and as a result of this interaction an example directed into the cell interior signal or a Signal cascade (also referred to as signaling) can trigger.
Als „Co-Rezeptoren" bezeichnet man Membranstrukturelemente, die sich in derselben Zelle befindet wie der Rezeptor. Der Co-Rezeptor ist nötig, um die Funktionalität des Rezeptors zu definieren und/oder zu modulieren."Co-receptors" are membrane structure elements, which is in the same cell as the receptor. The co-receptor is necessary, about the functionality of the receptor to define and / or modulate.
Als „Counter-Rezeptoren" bezeichnet man membrangebundene Oberflächenmoleküle, die sich auf zwei verschiedenen (benachbarten) Zellen befinden und die miteinander in Kontakt treten und dadurch ein Signalling auslösen können."Counter-receptors" are called membrane-bound ones Surface molecules that are on two different (neighboring) cells and the contact each other and thereby trigger a signaling.
Als „Ligand" bezeichnet man einen natürlichen, d.h. in vivo gebildeten oder künstlich erzeugten, nieder- oder hochmolekularen Bindungspartner für eine „Rezeptor". Der Ligand ist vorzugsweise in der extrazellulären Umgebung frei beweglich.As a "ligand" one calls one natural, i.e. formed in vivo or artificially produced, low- or high-molecular binding partner for a "receptor." The ligand is preferably in the extracellular Environment freely movable.
Als „Rezeptor Multimerisierungs Epitop" (RME) versteht man ein Peptidfragment das insbesondere zur Auto-Multimerisierung befähigt ist und somit dimere, trimerer, tetramere etc. Komplexe mit Oligo- oder Polypeptiden von im wesentlichen gleicher Aminosäuresequenz ausbilden kann. Zusätzlich kann das RME auch zur Heteromultimerisierung befähigt sein und Komplexe mit wenigstens einem davon verschiedenen Oligo- oder Polypeptid bilden. Die Komplexbildung kann beispielsweise durch Gelchromatographie, native Gelelektrophorese ggf. nach Stabilisierung der Komplexe durch Vernetzung, z.B. mit üblichen Methoden der Proteinbiochemie, nachweisbar sein.As a "receptor Multimerization Epitope "(RME) One understands a peptide fragment, especially for auto-multimerization capable and thus dimeric, trimeric, tetrameric, etc. complexes with oligo- or polypeptides of substantially the same amino acid sequence can train. additionally The RME may also be capable of heteromultimerization and complexes with form at least one of them different oligo- or polypeptide. The complex formation For example, by gel chromatography, native gel electrophoresis optionally after stabilization of the complexes by cross-linking, e.g. with usual Methods of protein biochemistry, be detectable.
Als „Immunogen" bezeichnet man ein erfindungsgemäßes Peptidfragment in glycosylierter oder nicht-glycosylierter Form, welches zur Induktion der Bildung von Antikörpern gegen das Immunogen geeignet ist. Gegebenenfalls kann eine Bindung des Immunogens (als Hapten) an einen makromolekularen Träger von Vorteil sein.As "immunogen" one calls one Inventive peptide fragment in glycosylated or non-glycosylated form, which is used for induction the formation of antibodies is suitable against the immunogen. Optionally, a bond of the immunogen (as a hapten) to a macromolecular carrier of advantage be.
Als „Epitop" oder antigene Determinante bezeichnet man den die Spezifität eines Antikörpers bestimmenden Bereich eines Antigens, wie z.B. eine Proteins. Wird dieses Epitop, beispielsweise durch äußere Einflüsse, wie z.B. eine Wechselwirkung eines Proteins mit einem Liganden, in einem Abschnitt des Proteins neu gebildet oder auf der zugänglichen Moleküloberfläche exprimiert, so spricht man von einem „Neoepitop".As "epitope" or antigenic determinant one calls the specificity an antibody determining region of an antigen, e.g. a protein. Becomes this epitope, for example by external influences, e.g. an interaction a protein with a ligand, in a section of the protein newly formed or accessible Molecule surface expressed, this is called a "neoepitope".
Als „Domäne" eine Proteins oder Antikörpers bezeichnet man eine durch alpha-Helix- und/oder beta-Faltblattelemente gebildete komlpexe, innerhalb des Proteins abgegrenzte Struktur.As a "domain" a protein or antibody one refers to one formed by alpha-helical and / or beta-sheet elements komlpexe, within the protein delimited structure.
III. Weitere Angaben zur Ausführung der ErfindungIII. Further information on execution the invention
1. Polypeptide1. Polypeptides
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Rezeptor Multimerisierungs Epitops (RME) des Advanced-Glycation-End Products Rezeptors (AGER), umfassend ein zur Auto-Multimerisierung befähigtes Peptidfragment der N-terminalen AGER- Ektodomäne, oder eines funktionalen, immunogenen Äquivalents von AGER-RME. Erfindungsgemäß bevorzugte AGER-RME sind lineare oder cyclische Peptide mit einer Länge von etwa 8 bis 50 Aminosäureresten, abgeleitet von der humanen AGER-Ektodomäne mit einer Aminosäuresequenz gemäß Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136 oder einer funktional äquivalenten Ektodomäne.object In particular, receptor of the invention are multimerization epitopes (RME) of the Advanced Glycation End Products Receptor (AGER) a peptide fragment capable of auto-multimerizing the N-terminal AGER ectodomain, or a functional, immunogenic equivalent from AGER-RME. According to the invention preferred AGER-RME are linear or cyclic peptides of length about 8 to 50 amino acid residues, derived from the human AGER ectodomain with a amino acid sequence according to Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136 or a functionally equivalent Ectodomain.
Bevorzugte
AGER-RME können
folgende Sequenz
C(K/R)GAPKKP(P/T)Q(Q/R/K)LE (SEQ ID NO: 1)
und
insbesondere eine der Sequenzen
CRGAPKKPPQQLE (SEQ ID NO: 2)
CKGAPKKPPQRLE
(SEQ ID NO: 3)
CKGAPKKPTQKLE (SEQ ID NO: 4)
umfassen.Preferred AGER RMEs can be the following sequence
C (K / R) GAPKKP (P / T) Q (Q / R / K) LE (SEQ ID NO: 1)
and in particular one of the sequences
CRGAPKKPPQQLE (SEQ ID NO: 2)
CKGAPKKPPQRLE (SEQ ID NO: 3)
CKGAPKKPTQKLE (SEQ ID NO: 4)
include.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten neuen Polypeptide.Includes according to the invention are also "functional equivalents" of the specifically disclosed new polypeptides.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, wie z. B. solche mit einem Homologiegrad von weniger als 100% zu SEQ ID NO: 6 (Nterm 31) oder SEQ ID NO: 3 (Nterm 13), welche aber weiterhin die gewünschte biologische Aktivität besitzen, wie z.B. Inhibition der Signaltransduktion im Aktin-Cytoskelett-Rearrangement (ACR)-Assay; Kompetition mit sRAGE um die Bindung mit einem AGER-Liganden; Auto-Multimerisierung oder Multimerisierung mit AGER-RME oder s-RAGE."Functional equivalents" or analogues of Specifically disclosed polypeptides are within the scope of the present invention Invention thereof different polypeptides, such as. B. those with a Degree of homology of less than 100% to SEQ ID NO: 6 (Nterm 31) or SEQ ID NO: 3 (Nterm 13), but which continue to produce the desired biological activity own, such as Inhibition of signal transduction in the actin-cytoskeletal rearrangement (ACR) assay; Competition with sRAGE for binding with an AGER ligand; Car multimerization or multimerization with AGER-RME or s-RAGE.
Funktionale Äquivalente
von AGER-RME können
aber auch eine charakteristische Kernsequenz oder Leitstruktur mit
hoher positiver Ladungsdichte der folgende allgemeinen Formel aufweisen
die Reste X1 und X2 unabhängig voneinander
für beliebige
1 bis 5 gleiche oder verschiedene Aminosäure stehen, welche keine positiv
geladenen Seitenketten tragen.However, functional equivalents of AGER-RME may also have a characteristic core sequence or high positive charge density conducting structure of the following general formula
the radicals X 1 and X 2 are independently any 1 to 5 identical or different amino acid, which carry no positively charged side chains.
Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere
Mutanten, welche in wenigstens einer der Sequenzpositionen der oben
genannten konkreten Sequenzen eine andere als die konkret genannte
Aminosäure
aufweisen aber trotzdem eine der hierin genannten biologischen Aktivitäten besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die
durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen,
-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen
Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition
auftreten können,
solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil
führen.
Funktionale Äquivalenz
ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster
zwischen Mutante und unverändertem
Polypeptid qualitativ übereinstimmen,
d.h. beispielsweise gleiche biologische Effekte nur unterschiedlich
stark ausgeprägt
zu beobachten sind. Beispiele für
geeignete Substitutionen von Aminosäureresten sind folgende:
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Aus druck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung."Functional equivalents" in the above sense are also precursors the described polypeptides as well as functional derivatives and salts the polypeptides. By the term "salts" is meant both salts of carboxyl groups as well as acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention. salts of carboxyl groups are prepared in a conventional manner and include inorganic Salts such as sodium, calcium, ammonium, iron and Zinc salts, and salts with organic bases, such as amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like. Acid addition salts, such as salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids, like acetic acid and oxalic acid are also the subject of the invention.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen."Functional Derivatives of polypeptides according to the invention can on functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques also be prepared. Such derivatives include, for example aliphatic esters of carboxylic acid groups, Amides of carboxylic acid groups, available by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives free amino groups, prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.Of course, "functional equivalents" also include Polypeptides which are accessible from other organisms, as well as naturally occurring Variants. For example, areas can be identified by sequence comparison homologous sequence regions and based on the concrete Specifications of the invention equivalent Determine enzymes.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Enzyme und Immunoglobuline."Functional equivalents" are also fusion proteins, which is one of the above polypeptide sequences or derived therefrom functional equivalents and at least one other, functionally distinct, heterologous Sequence in functional N- or C-terminal linkage (i.e. without mutual essential functional impairment the fusion protein parts). Nonlimiting examples for such heterologous sequences are e.g. Enzymes and immunoglobulins.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.According to the invention, "functional equivalents" encompassed are homologs to the specifically disclosed proteins. These have at least 60 %, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as e.g. 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed Sequences, calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448. A percentage homology a homologous invention Polypeptide means in particular percentage identity of the amino acid residues based on the total length one of the amino acid sequences specifically described herein.
Unter einer „abgeleiteten" Aminosäuresequenz wird erfindungsgemäß, wenn keine anderen Angaben gemacht werden, eine Sequenz verstanden, die mit der Ausgangssequenz eine Identität von mindestens 80% oder mindestens 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% und 99% aufweist.Under a "derived" amino acid sequence is according to the invention, if no other information is given, a sequence understood that with the starting sequence an identity of at least 80% or at least 90%, in particular 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% having.
Unter „Identität" zwischen zwei Sequenzen
wird Identität
der Aminosäurereste über die
jeweils gesamte Sequenzlänge
verstanden, wie z.B. die Identität,
die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software
der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins
DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on
a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter
Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Multiple
alignment parameter:
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße Äquivalente Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.in the Trap of a possible Protein glycosylation includes equivalent proteins of the invention above designated type in deglycosylated or glycosylated form and through change of the glycosylation pattern available modified forms.
Homologe des erfindungsgemäßen Peptide können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispiels weise kann eine variegierte Bank von Peptid-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).homologous of the peptides according to the invention can by screening combinatorial libraries of mutants, e.g. Truncation mutants, be identified. For example, a variegated bank of peptide variants by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level be generated, such. by enzymatic ligation of a mixture synthetic oligonucleotides. There are a variety of procedures that for making banks of potential homologs from a degenerate Oligonucleotide sequence can be used. The chemical synthesis a degenerate gene sequence can be in a DNA synthesizer carried out and the synthetic gene can then be transformed into a suitable expression vector be ligated. The use of a degenerate set of sentences allows the Provision of all sequences in a mixture that the desired Encoding a set of potential protein sequences. Process for synthesis degenerate oligonucleotides are known in the art (e.g., Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
2. Nukleinsäuren2. Nucleic acids
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die kodierenden Nukleinsäuresequenzen für die oben beschriebenen AGER-RME Peptide, sowie davon abgeleitete Nukleinsäuresequenzen.object The invention furthermore relates to the coding nucleic acid sequences for the AGER-RME peptides described above, as well as nucleic acid sequences derived therefrom.
Alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.All Nucleic acid sequences of the invention (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as. cDNA and mRNA) are in a conventional manner by chemical Synthesis from the nucleotide building blocks, such as by fragment condensation single overlapping, complementary nucleic acid building blocks the double helix can be produced. The chemical synthesis of oligonucleotides can, for example, in a known manner, by the Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2nd Ed., Wiley Press New York, pp. 896-897). The addition of synthetic oligonucleotides and filling of Gaps with the help of the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions and general cloning procedures are described in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, described.
Unter einer „abgeleiteten" Nukleinsäuresequenz wird erfindungsgemäß, wenn keine anderen Angaben gemacht werden, eine Sequenz verstanden, die mit der Ausgangssequenz eine Identität von mindestens 80% oder mindestens 90%, insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% und 99% aufweist.Under a "derived" nucleic acid sequence is according to the invention, if no other information is given, a sequence understood that with the starting sequence an identity of at least 80% or at least 90%, in particular 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% having.
Unter „Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (siehe oben).Under "identity" between two nucleic acids becomes the identity the nucleotides over each understood the entire nucleic acid length, especially the identity, by comparison using the Vector NTI Suite 7.1 software the company Informax (USA) using the Clustal method (see above).
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, kodierend für eines der obigen Peptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.object The invention also includes nucleic acid sequences, coding for one of the above peptides and their functional equivalents, e.g. under Use artificial Nucleotide analogs are accessible.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Peptide oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die z.B. als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.The The invention relates both to isolated nucleic acid molecules which are suitable for peptides according to the invention or encode biologically active portions thereof, as well as nucleic acid fragments, the e.g. as hybridization probes or primers for identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention can be.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthaltenThe Nucleic acid molecules according to the invention can additionally untranslated sequences from the 3 'and / or 5 'end of the coding Gene range included
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.An "isolated" nucleic acid molecule is used by separated from other nucleic acid molecules, in the natural Source of nucleic acid are present and can also essentially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or be free from chemical precursors or other chemicals, though it is chemically synthesized.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der erfindungsgemäßen Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.One Nucleic acid molecule according to the invention can by means of Standard molecular biology techniques and the invention provided Sequence information to be isolated. For example, cDNA from a suitable cDNA library can be isolated by one of the specifically disclosed complete Sequences or a portion thereof as a hybridization probe and Standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). moreover let yourself a nucleic acid molecule comprising one of the sequences of the invention or a portion thereof, by polymerase chain reaction isolate, wherein the oligonucleotide primer created on the basis of this sequence were used. The nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis become. The oligonucleotides according to the invention can further by standard synthetic methods, e.g. with an automatic DNA synthesizer become.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.The The invention further encompasses the nucleotide sequences specifically described complementary Nucleic acid molecules or a section of it.
Die erfindungsgemäß Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.The according to the invention nucleotide sequences enable the generation of probes and primers used for identification and / or Cloning of homologous sequences in other cell types and organisms are usable. Such probes or primers usually include one Nucleotide sequence region which under stringent conditions binds to at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or hybridized to a corresponding antisense strand.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von kodierenden Sequenzen zu den erfindungsgemäßen AGER-RMEs und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Peptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil.Further Nucleic acid sequences according to the invention are derived from coding sequences to the AGER-RMEs of the invention and differ from it by addition, substitution, insertion or Deletion of single or multiple nucleotides, but continue to encode for peptides with the desired property profile.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.According to the invention are also such nucleic acid sequences, include the so-called silent mutations or according to the Codon usage of a particular source or host organism, in comparison are changed to a specific sequence, as well as naturally occurring Variants, such as splice variants or allelic variants, of which. The subject matter is also conservative Nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question by an amino acid same charge, size, polarity and / or solubility replaced) available Sequences.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.object of the invention are also those by sequence polymorphisms of the specifically disclosed nucleic acids derived molecules. These genetic polymorphisms can occur between individuals of a population due to natural variation exist. This natural Variations usually work a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.Farther The invention also encompasses nucleic acid sequences which have been described above hybridize or complementary to said coding sequences. These polynucleotides can be screened by genomic or find cDNA libraries, and optionally with appropriate Multiply primers by PCR and then, for example, with appropriate Isolate probes. One more way offers the transformation of suitable microorganisms with polynucleotides according to the invention or Vectors, the multiplication of microorganisms and thus polynucleotides and their subsequent isolation. About that can out Polynucleotides according to the invention also be synthesized by chemical means.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70–100%, vorzugsweise zu 90–100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50–70 °C, vorzugsweise 60–65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 × SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20 × SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.Under the property of being able to "hybridize" to polynucleotides understands one's ability a poly or oligonucleotide under stringent conditions an almost complementary one To bind sequence while under these conditions non-specific bonds between non-complementary partners remain under. For this, the sequences should be 70-100%, preferably 90-100%, complementary. The property complementary For example, sequences can be linked to one another specifically Northern or Southern Blot technique or primer binding use in PCR or RT-PCR. Usually For this purpose, oligonucleotides from a length of 30 base pairs are used. Under stringent conditions one understands for example in the Northern blotting technique, the use of a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm Wash solution, for example 0.1 × SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0.3M Na citrate, pH 7.0) to elute nonspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides. It remains, as mentioned above, only to a great extent complementary nucleic acids tied together. The setting of stringent conditions is known to those skilled in the art and is e.g. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft "Antisense-"Nukleinsäuren. Diese umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die Antisense-Nukleinsäure kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft die als 5'- und 3'-untranslatierte Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.One Another aspect of the invention relates to "antisense" nucleic acids. This includes a nucleotide sequence which is complementary to a coding "sense" nucleic acid. The Antisense nucleic acid may be to the entire coding strand or just to a section of it complementary be. In a further embodiment the antisense nucleic acid molecule is antisense to a non-coding region of the coding strand of a Nucleotide sequence. The term "non-coding Range " as 5'- and 3'-untranslated Regions designated sequence segments.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann bspw. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabilität des Duplexes erhöhen, der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5- (Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann auch biologisch hergestellt werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist.One Antisense oligonucleotide may be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, Be 35, 40, 45 or 50 nucleotides long. An antisense nucleic acid according to the invention can by chemical synthesis and enzymatic ligation reactions by means of constructed in the art. An antisense nucleic acid can be chemically synthesized, with naturally occurring nucleotides or different modified nucleotides are used so are designed to increase the biological stability of the molecules, or the physical stability of the duplex, which has arisen between the antisense and sense nucleic acid. For example can Phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides can be used. Examples of modified nucleotides used to generate the antisense nucleic acid can be are u.a. 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, Xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, Beta-D-galactosyl-queosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosyl-queosine, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, Uracil-5-oxyacetic (v), wybutoxosin, pseudouracil, quinosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, Uracil-5-oxyacetic (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w and 2,6-diaminopurine. The antisense nucleic acid can also be produced biologically be used by an expression vector, in the one nucleic acid has been subcloned in the antisense direction.
3. Expressionskonstrukte und Vektoren3. expression constructs and vectors
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder funktionales Äquivalent oder Immunglobulin kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.object of the invention are also Expression constructs containing under genetic control regulatory nucleic acid sequences one for an inventive AGER RME or functional equivalent or immunoglobulin-encoding nucleic acid sequence; as well as vectors, comprising at least one of these expression constructs.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence. Under "Operational linkage" is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements is able to fulfill its function in the expression of the coding sequence.Actually operable linkable sequences are targeting sequences Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, etc. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.In addition to the artificial regulatory sequences may be the natural regulatory sequence be present before the actual structural gene. By genetic change can this natural Regulation optionally switched off and the expression of genes elevated or be humiliated. The gene construct can also be simpler be built, that is there will be no extra Regulation signals inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural Regulatory sequence mutated so that no regulation takes place and gene expression is increased or decreased. The nucleic acid sequences can contained in one or more copies in the gene construct.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp- lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die grampositiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPl-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc , ara, SP6, lambda PR or lambda PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; and the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, not or the ubiquitin or phaseolin promoter. Particularly preferred is the use of inducible promoters, such as light and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P l promoter. In principle, all natural promoters can be used with their regulatory sequences. In addition, synthetic promoters can also be used to advantage.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.The The regulatory sequences mentioned are intended for targeted expression the nucleic acid sequences and enable protein expression. For example, depending on the host organism, this may mean that Gene is expressed or overexpressed only after induction, or that it expresses immediately and / or overexpressed becomes.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.The Regulatory sequences or factors can preferably the Positively influence expression and thereby increase or decrease it. So can a reinforcement the regulatory elements advantageously at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers. But there is also a reinforcement Translation possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.The Production of an expression cassette takes place by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence as well as a terminator or Polyadenylation signal. For this purpose, conventional recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.The recombinant nucleic acid construct or gene construct becomes expression in a suitable host organism advantageously inserted into a host-specific vector, which allows optimal expression of the genes in the host. Vectors are well known to those skilled in the art and may be obtained, for example, from "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) become. Among vectors are out of the box Plasmids also all other vectors known in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, Transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA too understand. These vectors can autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally become.
Als
Beispiele für
geeignete Expressionsvektoren können
genannt werden:
Übliche
Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith,
D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England
Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei
denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein
bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.As examples of suitable expression vectors may be mentioned:
Common fusion expression vectors such as pGEX (Pharmacia Biotech, Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) glutathione S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89).Non-fusion protein expression vectors such as pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89).
Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae, wie pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.Yeast expression vector for expression in the yeast S. cerevisiae, such as pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFA (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectors and Method of constructing vectors that are suitable for use in other mushrooms, such as filamentous Mushrooms, include those that are described in detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P. J. (1991) Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Eds. Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).Baculovirus vectors, for the expression of proteins in cultured insect cells (eg. Sf9 cells) available The pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.Plant expression vectors such as those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plans binary vectors with selectable Biol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation ", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).Mammalian expression vectors such as pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.Further suitable expression systems for prokaryotic and eukaryotic cells are described in Chapters 16 and 16 17, by Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 described.
4. Rekombinante Wirtsorganismen4. Recombinant host organisms
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.With Help the vectors of the invention are recombinant organisms produced, which, for example are transformed with at least one vector according to the invention and used to produce the polypeptides of the invention can be. Advantageously, the recombinant invention described above Constructs are introduced and expressed in a suitable host system. In this case, preference is given to familiar cloning methods known to the person skilled in the art. and transfection methods, such as co-precipitation, Protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, used to bind said nucleic acids in respective expression system for expression. suitable Systems are used, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.When Host organisms are in principle suitable for all organisms that have a Expression of the nucleic acids according to the invention, their Allelic variants, their functional equivalents or derivatives allow. Host organisms include, for example, bacteria, fungi, yeasts, to understand plant or animal cells. Preferred organisms are bacteria, such as those of the genera Escherichia, such. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic Microorganisms, such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic Cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells.
Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.The Selection of successfully transformed organisms can be achieved by marker genes carried out also in the vector or in the expression cassette are included. examples for such marker genes are genes for Antibiotic resistance and for Enzymes that catalyze a coloring reaction that causes staining of the transformed cell causes. These can then by means of automatic Cell sorting can be selected. Successfully transformed with a vector Microorganisms that have a corresponding antibiotic resistance gene (e.g., G418 or hygromycin) can be replaced by appropriate Select antibiotic-containing media or nutrient media. Marker proteins, the on the cell surface presents can, can for selection by affinity chromatography be used.
Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen, wie transgenen Tieren, insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression, gebracht werden.If desired, The gene product can also be used in transgenic organisms, such as transgenic Animals, especially mice, Sheep or transgenic plants for expression.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer AGER-RME-Peptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Peptide-produzierenden rekombinanten Wirtsorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Peptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.object The invention furthermore relates to processes for recombinant production AGER-RME peptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, wherein cultivating a peptide-producing recombinant host organism, optionally induces the expression of the polypeptides and these isolated from the culture. The peptides can be so also in large-scale scale produced if desired.
Der rekombinante Wirt kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.Of the Recombinant host can be cultured and fermented by known methods become. Bacteria can For example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9 are increased. In detail will be suitable cultivation conditions for example in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.The Cells then become, if the polypeptides are not in the culture medium be secreted, open-minded and the product according to known Protein isolation method recovered from the lysate. The cells can optionally by high frequency ultrasound, by high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or digested by combining several of the listed methods become.
Eine Aufreinigung der Peptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.A Purification of the peptides can be carried out with known, chromatographic Be achieved, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, Ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well with other usual ones Methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are, for example in Cooper, F.G., Biochemical Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Besonders geeignet ist es, zur Isolierung des rekombinanten Peptids Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Peptide an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.Especially it is suitable to isolate the recombinant peptide vector systems or oligonucleotides that encode the cDNA for particular nucleotide sequences extend and for that changed Encode polypeptides or fusion proteins, e.g. a simpler one Serve cleaning. Such suitable modifications are, for example anchors acting as anchors, such as. as a hexa-histidine anchor known modification or epitopes recognized as antigens of antibodies can be (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). These anchors can for attaching the peptides to a solid support, e.g. a polymer matrix, serve, for example, be filled in a chromatography column can be used, or on a microtiter plate or on another carrier can be.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Peptide verwendet werden. Zur Erkennung der Peptidekönnen außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Peptide verwendet werden.simultaneously can these anchors can also be used to detect the peptides. to Detection of the peptides also usual markers, like fluorescent dyes, enzyme markers after reaction with a Substrate form a detectable reaction product, or radioactive Marker, alone or in combination with the anchors for derivatization the peptides are used.
5. Immunglobuline5. Immunoglobulins
5.1 Definition5.1 Definition
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind monoklonale oder polyklonale Antikörper, die an ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon spezifisch binden, d.h. Antikörper mit Spezifität für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Teile dieser Antikörper, insbesondere antigenbindende Teile davon, d.h. Antikörperfragmente, die ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon binden.object The present invention relates to monoclonal or polyclonal antibodies which to an inventive AGER RME or derivative / equivalent specifically bind, i. Antibody with specificity for an AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent from that. The present invention also relates to parts of these Antibody, in particular, antigen-binding portions thereof, i. Antibody fragments that an inventive AGER RME or a derivative / equivalent bind it.
Unter einem „Derivat/Äquivalent" von AGER-RME versteht man in diesem Zusammenhang auch Vorstufen wie AGER oder sRAGE oder andere AGER Splice-Varianten in unterschiedlichen konformativen Zuständen, die beispielsweise durch Wechselwirkung dieser Moleküle mit einen korrespondierenden Bindungspartner transient oder permanent induziert werden.Under understands a "derivative / equivalent" of AGER-RME In this context, precursors such as AGER or sRAGE or other AGER splice variants in different conformational ones states for example, by interaction of these molecules with a corresponding binding partner transiently or permanently induced become.
Vorzugsweise wählt man den erfindungsgemäßen Antikörper so, dass er eine bestimmte Bindungskinetik aufweist (z. B. hohe Affinität, geringe Dissoziation, niedrige off-Geschwindigkeit, starke neutralisierende Aktivität) für die spezifische Bindung an erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon.Preferably you choose the antibody according to the invention that it has a certain binding kinetics (eg high affinity, low Dissociation, low off-rate, strong neutralizing activity) for the specific Binding to AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent from that.
So können Antikörper mit einer Affinität für das erfindungsgemäße AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon im Bereich von KD = 10–6 – 10–12 M bereitgestellt werden.Thus, antibodies with an affinity for the AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent thereof in the range of K D = 10 -6-10 -12 M can be provided.
Einem weiteren Aspekt zufolge kann man die erfindungsgemäßen Antikörper so wählen, dass sie das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon mit einer koff-Geschwindigkeitskonstanten von 0,1 s–1 oder weniger binden.In another aspect, the antibodies of the invention may be selected to bind the AGER-RME or derivative / equivalent thereof at a k off rate constant of 0.1 s -1 or less.
Bei den Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um isolierte Antikörper. Einem weiteren Aspekt zufolge sind die Antikörper neutralisierende Antikörper. Zu den erfindungsgemäßen Antikörpern gehören insbesondere monoklonale und rekombinante Antikörper. Der erfindungsgemäße Antikörper kann eine Aminosäuresequenz umfassen, die vollständig von einer einzigen Spezies abstammt, kann also z.B. ein humaner Antikörper oder ein Mausantikörper sein. Weiteren Ausführungsformen zufolge kann der Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein CDR-Graft-Antikörper oder eine andere Form eines humanisierten Antikörpers sein.at the antibodies they are preferably isolated antibodies. Another aspect According to the antibodies neutralizing antibodies. The antibodies according to the invention include in particular monoclonal and recombinant antibodies. The antibody according to the invention can an amino acid sequence include that completely derived from a single species, so e.g. a humane one antibody or a mouse antibody be. Further embodiments According to the antibody a chimeric antibody or a CDR graft antibody or another form of humanized antibody.
Der Begriff „Antikörper" soll sich auf Immunglobulinmoleküle beziehen, die aus 4 Polypeptidketten, zwei schweren (H) Ketten und zwei leichten (L) Ketten, gebildet sind. Die Ketten sind in der Regel durch Disulfid-Bindungen miteinander verknüpft. Jede schwere Kette setzt sich aus einer variablen Region der schweren Kette (hier als HCVR oder VH abgekürzt) und einer konstanten Region der schweren Kette zusammen. Die konstante Region der schweren Kette wird aus drei Domänen CH1, CH2 und CH3 gebildet. Jede leichte Kette setzt sich aus einer variablen Region der leichten Kette (hier als LCVR oder VL abgekürzt) und einer konstanten Region der leichten Kette zusammen. Die konstante Region der leichten Kette wird aus einer Domäne CL gebildet. Die VH- und VL-Regionen können weiter unterteilt werden in hypervariable Regionen, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR für Complementarity Determining Region) bezeichnet werden und mit konservierteren Regionen, die als Gerüstregionen (FR für Frame Work Region) bezeichnet werden, durchsetzt sind. Jede VH- und VL-Region wird aus drei CDRs und vier FRs gebildet, die vom N-Terminus zum C- Terminus in folgender Reihenfolge angeordnet sind: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.Of the Term "antibody" is intended to refer to immunoglobulin molecules consisting of 4 polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light ones (L) chains are formed. The chains are usually due to disulfide bonds linked together. Each heavy chain is made up of a variable region of the heavy chain (abbreviated here as HCVR or VH) and a constant heavy chain region together. The constant Heavy chain region is made up of three domains CH1, CH2 and CH3. Each light chain is made up of a variable region of light weight Chain (here abbreviated as LCVR or VL) and a constant region the light chain together. The constant region of the light chain becomes from a domain CL formed. The VH and VL regions can are further subdivided into hypervariable regions which are considered to be complementary Regions (CDR for Complementarity Determining Region) and more conserved Regions as scaffolding regions (FR for Frame Work Region) are interspersed. Each VH and VL region becomes consists of three CDRs and four FRs, which form the N-terminus to the C-terminus in the following Ordered are: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Der Begriff „antigenbindender Teil" eines Antikörpers (oder einfach „Antikörperteil") bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers mit Spezifität für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon, wobei das oder die Fragmente nach wie vor die Fähigkeit besitzen, das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon spezifisch zu binden. Es ist gezeigt worden, dass die antigenbindende Funktion eines Antikörpers von Fragmenten eines vollständigen Antikörpers wahrgenommen werden können. Zu Beispielen bindender Fragmente gehören im Sinne des Begriffs „antigenbindender Teil" eines Antikörpers (i) ein Fab-Fragment, d.h. ein aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen zusammengesetztes monovalentes Fragment; (ii) ein F(ab')2-Fragment, d.h. ein bivalentes Fragment, welches zwei in der Hinge-Region über eine Disulfid-Brücke miteinander verknüpfte Fab-Fragmente beinhaltet; (iii) ein Fd-Fragment, das sich aus den VH- und CH1-Domänen zusammengesetzt; (iv) ein Fv-Fragment, das sich aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers zusammengesetzt; (v) ein dAb-Fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546 ), das aus einer VH-Domäne oder VH, CH1, CH2, DH3, oder VH, CH2, CH3 besteht; und (vi) eine isolierte komplementaritätsbestimmente Region (CDR). Wenngleich die beiden Domänen des Fv-Fragments, nämlich VL und VH, von getrennten Genen kodiert sind, können sie des weiteren mit einem synthetischen Linker unter Verwendung rekombinanter Verfahren miteinander verbunden werden, wodurch sie als eine einzige Proteinkette hergestellt werden können, worin die VL- und VH-Regionen sich zusammenfinden, um monovalente Moleküle zu bilden (als Einzelkette-Fv (ScFv) gekannt; siehe z.B. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; und Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Derartige Einzelketten-Antikörper sollen auch von dem Begriff „antigenbindender Teil" eines Antikörpers erfasst werden. Andere Formen von Einzelketten-Antikörpern wie „Diabodies" gehören ebenfalls dazu. Diabodies sind bivalente, bispezifische Antikörper, in denen VH- und VL-Domänen auf einer einzelnen Polypeptidkette exprimiert sind, wobei allerdings ein Linker verwendet wird, der zu kurz ist, als dass sich die beiden Domänen auf derselben Kette zusammenfinden können, wodurch man die Domänen zwingt, mit komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei antigenbindende Stellen zu bilden (siehe z.B. Holliger, P., of al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).The term "antigen-binding portion" of an antibody (or simply "antibody portion") refers to one or more fragments of an antibody having specificity for an AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent thereof, wherein the fragment or fragments still have the ability to to specifically bind the AGER-RME or derivative / equivalent thereof. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be detected by fragments of a complete antibody. Examples of binding fragments within the meaning of the term "antigen-binding portion" of an antibody include (i) a Fab fragment, ie a monovalent fragment composed of the VL, VH, CL and CH1 domains, (ii) an F (ab ') 2 fragment, ie a bivalent fragment which contains two Fab fragments linked together in the hinge region via a disulfide bridge; (iii) an Fd fragment composed of the VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment composed of the VL and VH domains of a single arm of an antibody; (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); consists of a VH domain or VH, CH1, CH2, DH3, or VH, CH2, CH3; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR). Although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are of separate Genes are encoded, they can also miteinande with a synthetic linker using recombinant methods r, whereby they can be produced as a single protein chain, wherein the VL and VH regions come together to form monovalent molecules (known as single chain Fv (ScFv); see, eg, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Such single-chain antibodies are also to be encompassed by the term "antigen-binding portion" of an antibody Other forms of single-chain antibodies such as "diabodies" are also included. Diabodies are bivalent bispecific antibodies in which VH and VL domains are expressed on a single polypeptide chain, however, using a linker that is too short for the two domains to co-assemble on the same chain, thereby forming the domains forces to pair with complementary domains of another chain and form two antigen-binding sites (see, eg, Holliger, P., et al., (1993) Proc Natl Acad Sci., USA 90: 6444-6448, Poljak, RJ, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
Des weiteren kann ein Antikörper oder antigenbindender Teil davon Teil eines größeren Immunadhäsionsmoleküls sein, das durch kovalente oder nicht kovalente Assoziierung des Antikörpers oder Antikörperteils mit einem oder mehreren weiteren Proteinen oder Peptiden gebildet wird. Zu solchen Immunadhäsionsmolekülen gehört die Verwendung der Streptavidin-Kernregion, um ein tetrameres scFv-Molekül herzustellen (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies und Hybridomas 6:93-101) und die Verwendung eines Cysteinrestes, eines Markerpeptids und eines C-terminalen Polyhistidin-Tags, um bivalente und biotinylierte scFv-Moleküle zu machen (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058).Of another may be an antibody or antigen-binding portion thereof may be part of a larger immunoadhesion molecule, by covalent or non-covalent association of the antibody or Anti body part formed with one or more other proteins or peptides becomes. Such immunoadhesion molecules include use the streptavidin core region to make a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) and the use of a cysteine residue, a marker peptide and a C-terminal polyhistidine tags to make bivalent and biotinylated scFv molecules (Kipriyanov, S.M., et al., (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058).
Antikörperteile, wie Fab und F(ab')2-Fragmente, können aus ganzen Antikörpern hergestellt werden, indem man konventionelle Techniken verwendet, wie die Verdauung mit Papain bzw. Pepsin. Darüber hinaus können Antikörper, Antikörperteile und Immunadhäsionsmoleküle erhalten werden, indem man standardisierte rekombinante DNA-Techniken verwendet. Ein „isolierter Antikörper mit Spezifität für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon" umschreibt einen Antikörper mit Spezifität für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon, der im wesentlichen frei von anderen Antikörpern mit unterschiedlichen Antigenspezifitäten ist.Antibody parts, such as Fab and F (ab ') 2 fragments, can be made from whole antibodies using conventional techniques, such as digestion with papain or pepsin. In addition, antibodies, antibody parts and immunoadhesion molecules can be obtained using standard recombinant DNA techniques. An "isolated antibody having specificity for an AGER-RME or derivative / equivalent thereof" of the present invention describes an antibody having specificity for an AGER-RME or derivative / equivalent thereof of the present invention that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities.
Der Begriff „neutralisierender Antikörper" beschreibt einen Antikörper, dessen Bindung an ein bestimmtes Antigen zur Inhibierung der biologischen Aktivität des Antigens führt. Diese Inhibierung der biologischen Aktivität des Antigens kann beurteilt werden, indem man einen oder mehrere Indikatoren für die biologische Aktivität des Antigens misst, wobei man einen geeigneten in vitro- oder in vivo-Assay verwendet.Of the Term "neutralizing Antibody "describes one Antibody, its binding to a particular antigen to inhibit the biological activity of the antigen leads. This inhibition of the biological activity of the antigen can be assessed be by adding one or more biological indicators activity of the antigen, using a suitable in vitro or in vitro used in vivo assay.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper" beschreibt einen Antikörper, der von einem Hybridom abstammt (z. B. ein Antikörper, der von einem mittels Hybridomtechnologie, wie der standardisierten Hybridommethodik nach Köhler und Milstein, hergestellten Hybridom sekretiert wird). Ein von einem Hybridom abstammender Antikörper mit Spezifität für ein erfindungsgemäßes AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon wird daher als monoklonaler Antikörper bezeichnet.Of the Term "monoclonal Antibody "describes one Antibody, which is derived from a hybridoma (eg an antibody derived from a Hybridoma technology, such as the standardized hybrid methodology Charcoal burner and Milstein, prepared hybridoma is secreted). One of one Hybridoma-derived antibodies with specificity for a AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent therefore, it is called a monoclonal antibody.
Der Begriff „rekombinanter Antikörper" beschreibt Antikörper, die mit rekombinanten Mitteln hergestellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden, wie Antikörper, die unter Verwendung eines in eine Wirtszelle transfizierten, rekombinanten Expressionsvektors exprimiert werden; Antikörper, die aus einer rekombinanten kombinatorischen Antikörperbank isoliert sind; Antikörper, die aus einem Tier (z. B. einer Maus), das durch humane Immunglobulingene transgen ist, isoliert sind (siehe z. B. Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); oder Antikörper, die auf irgend eine andere Weise, bei der bestimmte Immunoglobulin-Gensequenzen (wie humane Immunglobulin-Gensequenzen) mit anderen DNA-Sequenzen zusammengesetzt werden, herge stellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden. Zu rekombinanten Antikörpern gehören beispielsweise chimäre, CDR-Graft- und humanisierte Antikörper.Of the Term "recombinant Antibody "describes antibodies that produced, expressed, produced or recombinantly produced be isolated, such as antibodies, those using a transfected into a host cell, recombinant Expression vector are expressed; Antibodies derived from a recombinant combinatorial Antibody library isolated; Antibody, from an animal (e.g., a mouse) raised by human immunoglobulin genes is transgenic, isolated (see, e.g., Taylor, L.D., et al. Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295); or antibodies to any other The manner in which certain immunoglobulin gene sequences (such as human Immunoglobulin gene sequences) with other DNA sequences be made, expressed, expressed, produced or isolated. To recombinant antibodies belong for example, chimera, CDR graft and humanized antibodies.
Der Begriff „humaner Antikörper" beschreibt Antikörper, deren variable und konstante Regionen Immunglobulinsequenzen der Humankeimbahn, wie beispielsweise von Kabat et al. (siehe Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health und Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242) beschrieben, entsprechen oder davon abstammen. Die erfindungsgemäßen humanen Antikörper können allerdings Aminosäurereste beinhalten, die nicht von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen kodiert sind (z. B. Mutationen, die durch zufällige oder ortsspezifische Mutagenese in vitro oder durch somatische Mutation in vivo eingeführt sind), beispielsweise in den CDRs, und insbesondere in CDR3. Erfindungsgemäße rekombinante humane Antikörper haben variable Regionen und können auch konstante Regionen beinhalten, die von Immunglobulinsequenzen der Humankeimbahn abstammen (siehe Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health und Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242). Bestimmten Ausführungsformen zufolge werden derartige rekombinante humane Antikörper allerdings einer in vitro-Mutagenese (oder falls ein durch humane Ig-Sequenzen transgenes Tier verwendet wird, einer somatischen in vivo-Mutagenese) unterzogen, so dass die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Regionen der rekombinanten Antikörper Sequenzen sind, die, wenngleich sie mit VH- und VL-Sequenzen der Humankeimbahn verwandt sind oder davon abstammen, innerhalb des humanen Antikörper-Keimbahnrepertoirs in vivo natürlicherweise nicht existieren. Bestimmten Ausführungsformen zufolge sind derartige rekombinante Antikörper das Resultat einer selektiven Mutagenese oder Rückmutation, oder beides.Of the Term "human Antibody "describes antibodies whose variable and constant regions of human germline immunoglobulin sequences, as exemplified by Kabat et al. (see Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Pat. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), correspond or derive from it. The human of the invention antibody can however, amino acid residues which do not include human germ-line immunoglobulin sequences are encoded (eg, mutations caused by random or site-specific Mutagenesis are introduced in vitro or by somatic mutation in vivo), for example in the CDRs, and especially in CDR3. Recombinant according to the invention human antibodies have variable regions and can also contain constant regions that are immunoglobulin sequences from the human germline (see Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Pat. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). certain embodiments however, such recombinant human antibodies become in vitro mutagenesis (or if any by human Ig sequences transgenic animal used, in vivo somatic mutagenesis), so that the amino acid sequences the VH and VL regions the recombinant antibody Sequences are, although with VH and VL sequences of the human germline are related or derived from within the human antibody germline repertoire in vivo naturally does not exist. Certain embodiments contemplate such recombinant antibodies the result of selective mutagenesis or reverse mutation, or both.
Der Begriff "Rückmutation" bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem einige oder sämtliche der somatisch mutierten Aminosäuren eines humanen Antikörpers mit den entsprechenden Keimbahnresten einer homologen Keimbahnantikörpersequenz ersetzt werden. Die Sequenzen für die schwere und leichte Kette eines erfindungsgemäßen humanen Antikörpers werden getrennt mit den Keimbahnsequenzen in der VBASE-Datenbank verglichen, um die Sequenzen mit der größten Homologie zu identifizieren. Abweichungen im erfindungsgemäßen humanen Antikörper werden auf die Keimbahnsequenz zurückgeführt, indem man an definierten Nukleotidpositionen, die solche abweichenden Aminosäuren kodieren, mutiert. Die direkte oder indirekte Bedeutung jeder auf diese Weise als Kandidat für eine Rückmutation identifizierten Aminosäure für die Antigenbindung sollte untersucht werden, und eine Aminosäure, die nach Mutation eine wünschenswerte Eigenschaft des humanen Antikörpers beeinträchtigt, sollte in den endgültigen humanen Antikörper nicht miteinbezogen werden. Um die Anzahl der Aminosäuren für eine Rückmutation so gering wie möglich zu halten, können diejenigen Aminosäurepositionen unverändert bleiben, die zwar von der am nächsten kommenden Keimbahnsequenz abweichen aber mit der entsprechenden Aminosäuresequenz einer zweiten Keimbahnsequenz identisch sind, vorausgesetzt, daß die zweite Keimbahnsequenz mit der Sequenz des erfindungsgemäßen humanen Antikörpers zumindest in 10 und vorzugsweise in 12 Aminosäuren auf beiden Seiten der fraglichen Aminosäure identisch und co-linear ist. Rückmutationen können auf beliebiger Stufe der Antikörperoptimierung vorgenommen werden.The term "reverse mutation" refers to a method in which some or all of the somatic mutant amino acids of a human antibody are replaced with the corresponding germline residues of a homologous germline antibody sequence. The heavy and light chain sequences of a human antibody of the invention are separately compared to the germline sequences in the VBASE database to identify the most homologous sequences. Deviations in the human antibody of the invention are attributed to the germline sequence by mutating at defined nucleotide positions encoding such aberrant amino acids. The direct or indirect significance of each amino acid for antigen binding thus identified as a candidate for reverse mutation should be examined, and an amino acid which, upon mutation, interferes with a desirable property of the human antibody should not be included in the final human antibody. To keep the number of amino acids as low as possible for a reverse mutation, those amino acid positions may remain unchanged, although from the closest germ line but identical to the corresponding amino acid sequence of a second germline sequence, provided that the second germline sequence is identical and co-linear with the sequence of the human antibody of the invention at least in 10 and preferably 12 amino acids on both sides of the amino acid in question. Reverse mutations can be made at any stage of antibody optimization.
Der Begriff „chimärer Antikörper" umfasst Antikörper, in denen einzelne Teile des Moleküls aus verschiedenen Spezies abgeleitet sind. So sind chimäre Antikörper, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Antikörper, die Sequenzen für die variable Region der schweren und leichten Kette aus einer Spezies beinhalten, in denen aber die Sequenzen einer oder mehrerer der CDR-Regionen aus VH und/oder VL mit CDR-Sequenzen einer anderen Spezies ersetzt sind. In solchen Antikörpern können die variablen Regionen der schweren und leichten Kette aus Maus aufweisen, in denen eine oder mehrere der Maus-CDRs (z. B. CDR3) durch humane CDR-Sequenzen ersetzt sind.Of the Term "chimeric antibody" includes antibodies, in which individual parts of the molecule derived from different species. So are chimeric antibodies, without limited to this to be, e.g. Antibody, the sequences for the variable region of the heavy and light chain from one species but in which the sequences of one or more of the CDR regions from VH and / or VL with CDR sequences from another Species are replaced. In such antibodies, the variable regions the heavy and light chain of mouse exhibit, in which one or more of the mouse CDRs (eg, CDR3) by human CDR sequences are replaced.
Der Begriff „humanisierter Antikörper" beschreibt Antikörper, die Sequenzen der variablen Region schwerer und leichter Kette aus einer nichthumanen Spezies (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Kamelid, Ziege) beinhalten, in denen jedoch wenigstens ein Teil der VH- und/oder VL-Sequenz verändert worden ist, um „humanähnlicher" zu sein, d. h. variablen Sequenzen der humanen Keimbahn ähnlicher zu sein. Eine Art eines humanisierten Antikörpers ist ein CDR-Graft-Antikörper, bei dem humane CDR-Sequenzen in nichthumane VH- und VL-Sequenzen eingesetzt sind, um die entsprechenden nichthumanen CDR-Sequenzen zu ersetzen.Of the Term "humanized Antibody "describes antibodies that Sequences of the heavy and light chain variable region from one non-human species (eg mouse, rat, rabbit, chicken, camelid, goat) in which, however, at least part of the VH and / or Changed VL sequence to be more "human like", i.e. variable Sequences of the human germline more similar to be. One type of humanized antibody is a CDR graft antibody the human CDR sequences in non-human VH and VL sequences are used to generate the corresponding replace nonhuman CDR sequences.
Eine Methode, die Bindungskinetik eines Antikörpers zu messen, basiert auf der sogenannten Oberflächenplasmonräsonanz. Der Begriff „Oberflächenplasmonresonanz" bezieht sich auf ein optisches Phänomen, mit dem sich biospezifische Wechselwirkungen analysieren lassen, indem man Veränderungen von Proteinkonzentrationen mit einer Biosensormatrix nachweist, wobei man beispielsweise das BIAcore-System verwendet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden und Piscataway, NJ). Für weitere Beschreibungen siehe Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; und Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.A Method to measure the binding kinetics of an antibody is based on the so-called surface plasmonresonance. The term "surface plasmon resonance" refers to an optical phenomenon, with which biospecific interactions can be analyzed, by making changes of protein concentrations with a biosensor matrix, using, for example, the BIAcore system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). For further Descriptions see Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Der Begriff "Koff" beschreibt die off-Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation eines Antikörpers aus dem Antikörper/Antigen-Komplex.The term "K off " describes the off-rate constant for the dissociation of an antibody from the antibody / antigen complex.
Der Begriff „Kd" beschreibt die Dissoziationskonstante einer bestimmten Antikörper-Antigen-Wechselwirkung.The term "K d " describes the dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction.
Die Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Antikörper kann beurteilt werden, indem man standardisierte in vitro-Immunoassays, wie ELISA- oder BIAcore-Analysen, verwendet.The binding affinity the antibody according to the invention can be assessed by using standardized in vitro immunoassays, as ELISA or BIAcore analyzes used.
5.2 Herstellung von Immunglobulinen5.2 Preparation of immunoglobulins
5.2.1 Herstellung von polyklonalen Antikörpern5.2.1 Production of polyclonal antibodies
Die vorliegende Erfindung betrifft polylkonale anti-AGER-RME Antikörper und deren HerstellungThe The present invention relates to polylonal anti-AGER-RME antibodies and their production
Dazu wird ein Wirt mit wenigstens einem erfindungsgemäßen AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon immunisiert; und ein als Antwort auf die Immunisierung gebildetes Antikörper-haltiges Serum des Wirts gewinnt.To becomes a host with at least one AGER-RME according to the invention or derivative / equivalent immunized thereof; and one formed in response to the immunization Antibody-containing Serum of the host wins.
Sind die zu verwendenden AGER-RMEs nicht oder nur schwach immunogen, so kann man ihre Immunogenität dadurch erhöhen, daß man sie an Träger, vorzugsweise ein Trägerprotein, wie Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Limulus Polyphenus Hemocyanin ((LPH), Rinderserumalbumin (BSA) oder Ovalbumin (OVA), koppelt. Dazu stehen dem Fachmann eine Reihe von Kopplungsmöglichkeiten zur Verfügung, die allgemein bekannt sind. Zweckmäßig kann beispielsweise die Umsetzung mit Glutardialdehyd sein, beispielsweise durch Inkubation von AGER-RMEs mit einem geeigneten Peptid oder Peptid-Gemisch in Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel. Diese Umsetzung kann bequemerweise bei Umgebungstemperatur, also in der Regel Raumtemperatur, durchgeführt werden. Es kann allerdings auch zweckmäßig sein, zu kühlen oder leicht zu erwärmen. In der Regel führt die Umsetzung innerhalb weniger Stunden zum erwünschten Ergebnis, eine Reaktionsdauer von beispielsweise 2 h liegt im üblichen Bereich. Die Glutardialdehyd-Konzentration liegt in der Regel im ppm- bis %-Bereich, zweckmäßigerweise von 10 ppm bis zu 1 %, vorzugsweise von 100 ppm bis 0,5 %. Die Optimierung der Reaktionsparameter liegt im Bereich des fachmännischen Könnens.If the AGER-RMEs to be used are not or only weakly immunogenic, their immunogenicity can be increased by adding them to carriers, preferably a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), Limulus polyphenus hemocyanin ((LPH), bovine serum albumin (BSA For this purpose, a number of coupling possibilities are known to those skilled in the art, which are generally known, for example, the reaction with glutaraldehyde, for example by incubation of AGER-RMEs with a suitable peptide or peptide mixture in This reaction may conveniently be carried out at ambient temperature, usually room temperature, but it may also be convenient to cool or slightly heat it, usually resulting in the desired result within a few hours Reaction time of, for example, 2 h is within the usual range ehyd concentration is usually in the ppm to% range, suitably from 10 ppm to 1%, preferably from 100 ppm to 0.5%. Optimization of the reaction parameters is within the skill of the art.
Zusätzlich zum Antigen enthalten die Zusammensetzungen in der Regel weitere Hilfsstoffe, insbesondere üblicherweise zur Immunisierung eingesetzte Adjuvantien, z.B. Freund-Adjuvanz. Insbesondere verwendet man komplettes Freund-Adjuvanz für die erste Immunisierung wohingegen alle weiteren Immunisierungen mit inkomplettem Freund-Adjuvanz durchgeführt werden. Zur Herstellung der Immunisierungscocktails wird das Antigen (Immunogen), vorzugsweise als oben beschriebenes Komponenten-Gemisch, zu dem oder den Hilfsstoffen gegeben. In der Regel wird dabei das Antigen emulgiert.In addition to Antigen, the compositions usually contain other auxiliaries, especially usually adjuvants used for immunization, e.g. Freund's adjuvant. In particular, one uses complete friend adjuvant for the first Immunization whereas all other immunizations are with incomplete Freund's adjuvant carried out become. The antigen is used to prepare the immunization cocktails (Immunogen), preferably as a component mixture described above, to which or given to the excipients. As a rule, the antigen is emulsified.
Als Wirt eignen sich insbesondere Nager oder auch Kaninchen. Diesen oder anderen geeigneten Wirten werden die Immunisierungscocktails, vorzugsweise subkutan, injiziert. Die Antikörpertiter können mit einem Immunoassay, beispielsweise kompetitiv mit einem gegen Wirt-IgG gerichteten Schaf-Antiserum und markiertem AGER-RME, bestimmt werden. So kann gegen Ende der Immunisierung entschieden werden, ob ein bestimmter Wirt zur Antikörpergewinnung geeignet ist. Werden beispielsweise vier Immunisierungen durchgeführt, so kann man nach der dritten Immunisierung den Antikörpertiter bestimmen und dann aus Tieren, die einen ausreichenden Antikörpertiter aufweisen, Antikörper gewinnen.When In particular, rodents or even rabbits are suitable. this or other suitable hosts, the immunization cocktails, preferably subcutaneously, injected. Antibody titers can be measured with an immunoassay, for example competitively with a sheep antiserum directed against host IgG and labeled AGER-RME. So can the end of the Immunization can be decided if a particular host for antibody production suitable is. For example, if four immunizations are performed, so you can after the third immunization the antibody titer and then from animals that have a sufficient antibody titer have, antibodies win.
Zur Gewinnung gebildeter Antikörper ist es bevorzugt, den Wirten über mehrere Wochen oder Monate Blut abzunehmen. Abschließend kann man den Wirt ausbluten lassen. Aus dem so gewonnenen Blut kann in an sich bekannter Weise Serum gewonnen werden, das die erwünschten Antikörper enthält. Das so erhaltene Vollserum kann erforderlichenfalls in fachmännischer Weise weiter aufgereinigt werden, um die darin enthaltene Antikörperfraktion und insbesondere die AGER-RME-erkennenden Antikörper anzureichern.to Obtaining formed antibodies it is preferable to the hosts over to lose blood for several weeks or months. In conclusion, can let the host bleed to death. From the blood thus obtained can in at It is known to obtain serum containing the desired antibody contains. If necessary, the whole serum thus obtained can be obtained in a professional manner Be further purified to the contained antibody fraction and in particular to enrich the AGER-RME-recognizing antibodies.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens selektiert man wenigstens einen Antikörper des Serums, der das als Immunogen verwendete AGER-RME, ein Derivat/Äquivalent davon spezifisch erkennt. Spezifität meint in diesem Zusammenhang eine höhere Bindungsaffinität des Antikörpers für das Immunogen als für andere, insbesondere immunogen verwandte Proteine, wie APP (Amyloid Precursor Protein).According to one particular embodiment This method is selected at least one antibody of Serum containing the AGER-RME used as immunogen, a derivative / equivalent specifically recognizes it. Specificity means in this context a higher one binding affinity of the antibody for the Immunogen as for other, especially immunogenically related, proteins, such as APP (amyloid Precursor protein).
5.2.2 Herstellung von monoklonalen Antikörpern5.2.2 Production of monoclonal antibodies
Erfindungsgemäß brauchbare Immunglobuline sind inter Anwendung an sich bekannter Methoden zugänglich. So gestattet die Hybridomtechnologie die Herstellung von monospezifischen Antikörpern für ein interessierendes Antigen. Weiterhin sind rekombinante Antikörpertechniken, wie das in-vitro-Screenen von Antikörperbanken entwickelt worden mit deren Hilfe sich ebenfalls derartige spezifische Antikörper herstellen lassen.Usable according to the invention Immunoglobulins are accessible by application of known methods. Thus, hybridoma technology allows the production of monospecific antibodies for a antigen of interest. Furthermore, recombinant antibody techniques, how the in vitro screening of antibody libraries has been developed with the help of which also produce such specific antibodies to let.
So kann man beispielsweise ein Tier mit dem interessierenden Antigen immunisieren. Dieser in-vivo-Ansatz kann des weiteren beinhalten, dass man aus den Lymphozyten oder Milzzellen eines Tieres eine Reihe von Hybridomen etabliert und ein Hybridom selektiert, das einen das Antigen spezifisch bindenden Antikörper sekretiert. Bei dem zu immunisierenden Tier kann es sich beispielsweise um eine Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Kamelid oder Schaf handeln, oder um eine transgene Version eines der zuvor genannten Tiere, beispielsweise eine transgene Maus mit humanen Immunglobulingenen, die nach einem antigenen Stimulus humane Antikörper macht. Zu weiteren Typen von Tieren, die immunisiert werden können, zählen Mäuse mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID), die mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen (chimäre hu-PBMC-SCID-Mäuse) oder mit lymphoiden Zellen oder Vorläufern davon rekonstituiert worden sind, genauso wie Mäuse, die mit einer letalen Gesamtkörperbestrahlung behandelt, anschließend mit Knochenmarkszellen aus einer Maus mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) gegen Strahlung geschützt und anschließend mit funktionalen humanen Lymphozyten transplantiert worden sind (das sogenannte Trimera-System). Eine weiterer Typus eines zu immunisierenden Tieres ist ein Tier (z.B. eine Maus), in dessen Genom ein endogenes Gen, welches das interessierende Antigen kodiert, ausgeschaltet wurde („knocked out"), z.B. durch homologe Rekombination, so dass dieses Tier nach Immunisierung mit dem Antigen das Antigen als fremd erkennt. Für den Fachmann ist klar, dass die mit diesen Verfahren hergestellten polyklonalen oder monoklonalen Antikörper charakterisiert und selektiert werden, indem man bekannte Screening-Verfahren verwendet, zu denen ELISA-Techniken gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.So you can, for example, an animal with the antigen of interest immunize. This in vivo approach may further include that one from the lymphocytes or spleen cells of an animal a number established hybridomas and selected a hybridoma, the one secretes the antigen specifically binding antibody. At the zu immunizing animal may be, for example, a mouse, rat, Rabbit, chicken, camelid or sheep, or transgenic Version of one of the aforementioned animals, for example a transgenic Human immunoglobulin gene mouse human after an antigenic stimulus antibody power. Other types of animals that can be immunized include mice with severe combined immunodeficiency (SCID) with human peripheral blood mononuclear cells (chimera hu-PBMC SCID mice) or reconstituted with lymphoid cells or precursors thereof as well as mice, those with a lethal total body irradiation treated, then with bone marrow cells from a mouse with severe combined Immunodeficiency (SCID) protected against radiation and subsequently with functional human lymphocytes have been transplanted (the so-called Trimera system). Another type of one to be immunized Animal is an animal (e.g., a mouse) whose genome is endogenous Gene encoding the antigen of interest was ("knocked out "), for example by homologous Recombination, leaving this animal after immunization with the antigen recognizes the antigen as foreign. For It will be apparent to those skilled in the art that those made by these methods polyclonal or monoclonal antibody characterized and selected be used by using known screening methods, which Include ELISA techniques, but not limited thereto to be.
Einer weiteren Ausführungsform zufolge, screent man eine rekombinante Antikörperbank mit dem Antigen. Die rekombinante Antikörperbank kann beispielsweise auf der Oberfläche von Bakteriophagen oder auf der Oberfläche von Hefezellen oder auf der Oberfläche von bakteriellen Zellen exprimiert sein. Die rekombinante Antikörperbank kann beispielsweise eine scFv-Bank oder eine Fab-Bank sein. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind Antikörperbänke als RNA-Protein-Fusionen exprimierbar.one another embodiment According to that, a recombinant antibody library is screened with the antigen. The recombinant antibody library For example, on the surface of bacteriophages or on the surface of yeast cells or on the surface of bacterial cells be expressed. For example, the recombinant antibody library an scFv bank or a fab bank. According to another embodiment are antibody banks as RNA-protein fusions expressible.
Ein weiterer Ansatz zur Herstellung erfindungsgemäßer Antikörper beinhaltet eine Kombination aus in vivo- und in vitro-Ansätzen. Beispielsweise kann man das Antigen auf das Antikörper-Repertoire einwirken lassen, indem man ein Tier mit dem Antigen in vivo immunisiert und anschließend eine aus lymphoiden Zellen des Tieres hergestellte rekombinante Antikörperbank oder Einzeldomänen-Antikörperbank (z.B. mit schwerer und/oder leichter Kette) mit dem Antigen in vitro screent. Einem weiteren Ansatz zufolge lässt man das Antigen auf das Antikörper-Repertoire einwirken, indem man ein Tier mit dem Antigen in vivo immunisiert und anschließend eine aus lymphoiden Zellen des Tieres hergestellte rekombinante Antikörperbank oder Einzeldomänen-Bank einer Affinitätsreifung unterzieht. Einem weiteren Ansatz zufolge lässt man das Antigen auf das Antikörper-Repertoire einwirken, indem man ein Tier mit dem Antigen in vivo immunisiert, anschließend einzelne Antikörper-produzierende Zellen, die einen interessierenden Antikörper sekretieren, selektiert und aus diesen selektierten Zellen cDNAs für die variable Region der schweren und leichten Kette gewinnt (z.B. mittels PCR) und die variablen Regionen der schweren und leichten Kette in vitro in Säugerwirtszellen exprimiert (was als das Lymphozyten-Antikörper-Selektionsverfahren, oder SLAM für „Selected Lymphocyte Antibody Method", bezeichnet wird), wodurch sich die selektierten Antikörper-Gensequenzen weiter selektieren und manipulieren lassen. Außerdem können monoklonale Antikörper durch Expressionsklonierung selektiert werden, indem man die Antikörpergene für die schwere und leichte Kette in Säugerzellen exprimiert und diejenigen Säugerzellen selektiert, die einen Antikörper mit der gewünschten Bindungsaffinität sekretieren.One Another approach for the production of antibodies according to the invention involves a combination from in vivo and in vitro approaches. For example, one can apply the antigen to the antibody repertoire act by immunizing an animal with the antigen in vivo and subsequently a recombinant derived from lymphoid cells of the animal Antibody library or single domain antibody library (e.g., heavy and / or light chain) with the antigen in vitro screened. Another approach is to leave the antigen on the Antibody repertoire act by immunizing an animal with the antigen in vivo and subsequently a recombinant derived from lymphoid cells of the animal Antibody library or single domain bank an affinity maturation subjects. Another approach is to leave the antigen on the Antibody repertoire act by immunizing an animal with the antigen in vivo, subsequently single antibody-producing Selecting cells which secrete an antibody of interest and from these selected cells, cDNAs for the heavy region variable region and light chain (e.g., by PCR) and the variable Heavy and light chain regions in vitro in mammalian host cells expressed (which is called the lymphocyte antibody selection method, or SLAM for "Selected Lymphocyte Antibody Method ", denoted ), whereby the selected antibody gene sequences continue to select and get manipulated. Furthermore can monoclonal antibodies be selected by expression cloning by the antibody genes for the heavy and light chain in mammalian cells expresses and selects those mammalian cells, the one antibody with the desired binding affinity secrete.
Mit vorliegender Erfindung werden definierte Antigene in Form von AGER-RMEs zum Screenen und Gegenscreenen zur Verfügung gestellt. So können erfindungsgemäß diejenigen polyklonalen und monoklonalen Antikörper selektiert werden, die ein erfindungsgemäß gewünschtes Eigenschaftsprofil gemäß obiger Definition aufweisen, wie z.B. einen AGER-induzierten Rezeptorstatus spezifisch erkennen.With In the present invention defined antigens in the form of AGER-RMEs provided for screening and counter screening. Thus, according to the invention those polyclonal and monoclonal antibodies are selected, the a desired according to the invention Property profile according to above Have definition, e.g. an AGER-induced receptor status recognize specifically.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern lassen sich verschiedene Antikörpertypen herstellen. Hierzu gehören im Wesentlichen humane Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper und CDR-Graft-Antikörper sowie Antigen-bindende Teile davon.With the inventive method for the production of antibodies can be different types of antibodies produce. These include essentially human antibodies, chimera Antibody, humanized antibodies and CDR graft antibodies and antigen-binding portions thereof.
Im Folgenden werden Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Antikörper beschrieben. Dabei wird zwischen In-vivo-Ansätzen, In-vitro-Ansätzen, oder einer Kombination aus beiden, unterschieden.in the Methods for producing antibodies according to the invention are described below. Here, between in vivo approaches, In vitro approaches, or a combination of both.
In-vivo-Ansätze:In vivo approaches:
Ausgehend von den in-vivo erzeugten Antikörper produzierenden Zellen können monoklonale Antikörper mittels standardisierter Techniken, wie der ursprünglich von Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) (siehe auch Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75) beschriebenen Hybridomtechnik, hergestellt werden. Die Technologie zur Produktion monoklonaler Antikörperhybridome ist hinlänglich bekannt (siehe allgemein R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Eine immortalisierte Zelllinie (typischerweise ein Myelom) wird dazu mit Lymphozyten (typischerweise Splenozyten oder Lymphknotenzellen oder periphere Blutlymphozyten) eines mit dem erfindungsgemäßen AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon immunisierten Säugers fusioniert, und die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomzellen werden gescreent, um ein Hybridom zu identifizieren, das einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für erfindungsgemäßes AGER-RME oder für ein Derivat/Äquivalent davon produziert. Dazu kann man ein beliebiges, von vielen hinlänglich bekannten Protokollen für die Fusion von Lymphozyten und immortalisierten Zelllinien anwenden (siehe auch G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra). Darüber hinaus sind dem Fachmann mannigfaltige Variationen solcher Verfahren, die ebenfalls brauchbar sind, bekannt. Typischerweise stammten die immortalisierten Zelllinien (z.B. eine Myelomzelllinie) von der gleichen Säugerspezies ab wie die Lymphozyten. Beispielsweise kann man murine Hybridome etablieren, indem man Lymphozyten aus einer mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Zubereitung immunisierten Maus mit einer immortalisierten Mauszelllinie fusioniert. Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomzelllinien, welche für Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltendes Kulturmedium (HAT-Medium) sensitiv sind. Man kann eine beliebige von vielen Myelomzelllinien als Fusionspartner standardmäßig verwenden, z.B. die P3-NS1/1-Ag4-1-, P3-x63-Ag8.653- or Sp2/O-Ag14-Myelomlinie. Diese Myelomzelllinien sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, erhältlich. Typischerweise werden HAT-sensitive Maus-Myelomzellen mit Maus-Splenozyten unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) fusioniert. Die aus der Fusion resultierenden Hybridomzellen werden dann unter Verwendung von HAT-Medium selektiert, wodurch nicht fusionierte und nicht produktiv fusionierte Myelomzellen abgetötet werden (nicht fusionierte Splenozyten sterben nach mehreren Tagen ab, da sie nicht transformiert sind). Monoklonale Antikörper-produzierende Hybridomzellen, die ein erfindungsgemäßes AFER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon spezifisch erkennen, werden identifiziert, indem man die Hybridomkulturüberstände auf solche Antikörper screent, z.B. indem man einen Standard-ELISA-Assay verwendet, um diejenigen Antikörper zu selektieren, die erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon spezifisch binden können.Starting from the antibody producing cells produced in vivo, monoclonal antibodies can be isolated by standard techniques such as those originally described by Köhler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497) (see also Brown et al., (1981) J. Immunol 127: 539 Brown et al (1980) J. Biol Chem 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31; and Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269- 75) described hybridoma technique can be produced. The technology for producing monoclonal antibody hybridomas is well known (see generally RH Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyzes, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); EA Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402; ML Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3: 231-36). An immortalized cell line (typically a myeloma) is fused thereto with lymphocytes (typically splenocytes or lymph node cells or peripheral blood lymphocytes) of a mammal immunized with the inventive AGER-RME or derivative / equivalent thereof and the culture supernatants of the resulting hybridoma cells are screened to generate a hybridoma which produces a monoclonal antibody with specificity for AGER-RME according to the invention or for a derivative / equivalent thereof. Any of the well-known protocols for the fusion of lymphocytes and immortalized cell lines can be used for this purpose (see also G. Galfre et al., (1977) Nature 266: 550-52; Gefter et al., Somatic Cell Genet., Cited supra Lerner, Yale J. Biol. Med., Cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra). In addition, various variations of such methods which are also useful are known to those skilled in the art. Typically, the immortalized cell lines (eg, a myeloma cell line) derived from the same mammalian species as the lymphocytes. For example, murine hybridomas can be established by fusing lymphocytes from a mouse immunized with an immunogenic preparation of the invention to an immortalized mouse cell line. Preferred immortalized cell lines are mouse myeloma cell lines which are sensitive to hypoxanthine, aminopterin and thymidine-containing culture medium (HAT medium). One of many myeloma cell lines can be used as standard by fusion, eg the P3-NS1 / 1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 or Sp2 / O-Ag14 myeloma line. These myeloma cell lines are available from the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Typically, HAT-sensitive mouse myeloma cells are fused to mouse splenocytes using polyethylene glycol (PEG). The hybridoma cells resulting from the fusion are then selected using HAT medium, killing unfused and non-productively fused myeloma cells (unfused splenocytes die off) several days since they are not transformed). Monoclonal antibody-producing hybridoma cells which specifically recognize an AFER-RME according to the invention or a derivative / equivalent thereof are identified by screening the hybridoma culture supernatants for such antibodies, eg by using a standard ELISA assay to select those antibodies, can specifically bind the AGER-RME according to the invention or a derivative / equivalent thereof.
Je nach Art des gewünschten Antikörpers, können verschiedene Wirtstiere für die in-vivo-Immunisierung verwendet werden. Ein Wirt, der eine endogene Version des interessierenden Antigens selbst exprimiert, kann verwendet werden. Alternativ kann ein Wirt verwendet werden, der für eine endogene Version des interessierenden Antigens defizient gemacht wurde. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass Mäuse, die über homologe Rekombination am entsprechenden endogenen Gen für ein bestimmtes endogenes Protein defizient gemacht wurden (d.h. Knockout-Mäuse) eine humorale Antwort gegen das Protein, mit dem sie immunisiert wurden, erzeugen und daher zur Herstellung hochaffiner monoklonaler Antikörper gegen das Protein verwendet werden können (siehe z.B. Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, M.P. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).ever according to the type of desired Antibody, can different host animals for the in vivo immunization be used. A host that has an endogenous version of the Antigen itself expresses can be used. Alternatively, you can a host used for made an endogenous version of the antigen of interest deficient has been. For example, it has been shown that mice receiving homologous recombination at the appropriate endogenous gene for a particular endogenous Protein were deficient (i.e., knockout mice) humoral response to the protein with which they were immunized produce and therefore for the production of high affinity monoclonal antibodies against the protein can be used (See, e.g., Roes, J. et al., (1995) J. Immunol., Methods 183: 231-237; Lunn, M.P. et al. (2000) J. Neurochem. 75: 404-412).
Für die Herstellung nicht humaner Antikörper gegen erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon sind viele nicht-menschliche Säuger als Wirte für die Antikörperherstellung geeignet. Hierzu gehören Mäuse, Ratten, Hühner, Kamelide, Kaninchen und Ziegen (und Knockout-Versionen davon), wenngleich Mäuse zur Hybridomherstellung bevorzugt sind. Desweiteren kann man zur Herstellung im Wesentlichen humaner Antikörper gegen ein humanes Antigen mit dualer Spezifität ein nicht-humanes Wirtstier verwenden, das ein humanes Antikörper-Repertoire exprimiert. Zu solchen nicht-humanen Tieren gehören transgene Tiere (z.B. Mäuse), die humane Immunglobulin-Transgene tragen (chimäre hu-PBMC-SCID-Mäuse) und Mensch/Maus-Bestrahlungschimären, die nachstehend eingehender beschrieben sind.For the production non-human antibody against inventive AGER-RME or a derivative / equivalent many of these are non-human mammalian hosts for antibody production suitable. These include mice Rats, chickens, Camelid, rabbit and goat (and knockout versions of it), though Mice for Hybridoma production are preferred. Furthermore, one can for the production essentially human antibody use a nonhuman host animal against a human dual specificity antigen human antibody repertoire expressed. Such non-human animals include transgenic animals (e.g., mice) which human immunoglobulin transgenes (chimeric hu-PBMC-SCID mice) and Human / mouse radiation chimeras, the will be described in more detail below.
Einer Ausführungsform zufolge ist das Tier, das mit einem erfindungsgemäßen AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon immunisiert wird, ein nicht-humaner Säuger, vorzugsweise eine Maus, der durch humane Immunglobulingene transgen ist, so dass der nicht-humane Säuger nach einem antigenen Stimulus humane Antigkörper macht. Typischerweise werden in solche Tiere Immunglobulin-Transgene für schwere und leichte Kette mit humaner Keimbahnkonfiguration eingeführt, wobei die Tiere so verändert wurden, dass ihre endogenen Loci für schwere und leichte Kette inaktiv sind. Stimuliert man solche Tiere mit Antigen (z.B. mit einem humanen Antigen), werden Antikörper, die von den humanen Immunglobulinsequenzen abstammen (d.h. humane Antikörper), produziert. Aus den Lymphozyten solcher Tiere können mittels standardisierter Hypridomtechnologie humane monoklonale Antikörper gemacht werden. Zur weiteren Beschreibung transgener Mäuse mit humanen Immunglobulinen und ihre Verwendung bei der Herstellung humaner Antikörper siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,939,598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 und WO 99/53049 (Abgenix Inc.), und US-Patent Nr. 5,545,806, Nr. 5,569,825, Nr. 5,625, 126, Nr. 5,633, 425, Nr. 5,661,016, Nr. 5,770,429, Nr. 5,814,318, Nr. 5,877,397 und WO 99/45962 (Genpharm Inc.); siehe ebenfalls MacQuitty, J.J. und Kay, R.M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. und Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F.A. und Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L.L. und Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; Gallo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540.one embodiment according to the animal is that with an inventive AGER-RME or derivative / equivalent of which a non-human mammal, preferably a mouse, is immunized which is transgenic by human immunoglobulin genes, so that the non-human mammal after an antigenic stimulus makes human antigens. typically, In such animals are immunoglobulin transgenes for heavy and light chain introduced with human germline configuration, whereby the animals were so altered that their endogenous loci are for heavy and light chain are inactive. Stimulates such animals with antigen (e.g., with a human antigen), antibodies which derived from the human immunoglobulin sequences (i.e., human antibodies). From the lymphocytes of such animals can be analyzed by means of standardized Hypridom technology human monoclonal antibodies are made. To further Description of transgenic mice with human immunoglobulins and their use in the preparation human antibody See, for example, U.S. Patent No. 5,939,598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 and WO 99/53049 (Abgenix Inc.), and U.S. Patent No. 5,545,806, No. 5,569,825, No. 5,625,126, No. 5,633,425, No. 5,661,016, No. 5,770,429, No. 5,814,318, No. 5,877,397 and WO 99/45962 (Genpharm Inc.); see also MacQuitty, J.J. and Kay, R.M. (1992) Science 257: 1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368: 856-859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding, F.A. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild, D.M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; Mendez, M.J. et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Green, L.L. and Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66: 401-410; Gallo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30: 534-540.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Tier, das mit erfindungsgemäßem AGER-RME oder einem Derivat/Äquivalent davon immunisiert wird, eine Maus mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) sein, die mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen oder lymphoiden Zellen oder Vorläufern davon rekonstituiert wurde. Solche Mäuse, die als chimäre hu-PBMC-SCID-Mäuse bezeichnet werden, produzieren nachgewiesenermaßen humane Immunglobulinantworten nach einem antigenen Stimulus. Zur weiteren Beschreibung dieser Mäuse und ihrer Verwendung für die Erzeugung von Antikörpern siehe beispielsweise Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, W.J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol. 159:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. und Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murphy, W.J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S.L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36:113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; und Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45.According to one another embodiment the animal can be treated with AGER-RME according to the invention or a derivative / equivalent of which is immunized a mouse with severe combined immunodeficiency (SCID) be human peripheral blood mononuclear or lymphoid Cells or precursors thereof was reconstituted. Such mice, the as a chimera hu-PBMC-SCID mice have been shown to produce human immunoglobulin responses after an antigenic stimulus. For further description of this Mice and their use for the generation of antibodies See, for example, Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195: 360-375; Murphy, W.J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8: 233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol. 159: from 1393 to 1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217: 79-85; Yoshinari, K. and Arai, K. (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins, W. A. et al. (1999) Hybridoma 18: 121-129; Murphy, W.J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90: 22-27; Smithson, S.L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36: 113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180: 268-277; and Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5: 35-45.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Tier, das mit erfindungsgemäßem AGER-RME oder einem Derivat/Äquivalent davon immunisiert wird, eine Maus, die mit einer letalen Ganzkörperbestrahlung behandelt, anschließend mit Knochenmarkszellen aus Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) gegen Strahlung geschützt, und anschließend mit funktionalen humanen Lymphozyten transplantiert worden ist. Dieser als das Trimera-System bezeichnete Chimärentyp wird verwendet, um humane monoklonale Antikörper herzustellen, indem man die Mäuse mit dem interessierenden Antigen immunisiert und anschließend monoklonale Antikörper unter Verwendung von standardisierter Hybridomtechnologie herstellt. Zur weiteren Beschreibung dieser Mäuse und ihrer Verwendung für die Erzeugung von Antikörpern siehe beispielsweise Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y und Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242-246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; und Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634-641.According to a further embodiment, the animal is the AGER-RME according to the invention or a derivative / equivalent thereof, a mouse treated with lethal whole body irradiation, then protected against radiation with bone marrow cells from mice with severe combined immunodeficiency (SCID) and subsequently transplanted with functional human lymphocytes. This type of chimera, called the Trimera system, is used to make human monoclonal antibodies by immunizing the mice with the antigen of interest and then producing monoclonal antibodies using standard hybridoma technology. For further description of these mice and their use for the generation of antibodies, see, for example, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93: 154-161; Reisner, Y and Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16: 242-246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29: 553-562; and Bocher, WO et al. (1999) Immunology 96: 634-641.
In-vitro-Ansätze:In vitro approaches:
Alternativ
zur Herstellung erfindungsgemäßer Antikörper durch
Immunisierung und Selektion können erfindungsgemäße Antikörper identifiziert
und isoliert werden, indem man rekombinante kombinatorische Immunglobulin-Bankmit
einem erfindungsgemäßen AGER-RME
oder Derivat/Äquivatent
davon screent, um so Mitglieder der Immunoglobulin-Bank, die spezifisch
an das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent
davon binden, zu isolieren. Kits zur Erzeugung und zum Screenen
von Display-Banken sind kommerziell erhältlich (z.B. das Recombinant
Phage Antibody System von Pharmacia, Katalog-Nr. 27-9400-01; und
der SurfZAP® Phage
Display Kit von Stratagene, Katalog-Nr. 240612). In vielen Ausführungsformen
ist die Display-Bank eine scFv-Bank oder eine Fab-Bank. Die Phagendisplay-Technik
zum Screenen rekombinanter Antikörperbänke ist hinlänglich beschrieben
worden. Beispiele für
Verfahren und Verbindungen, die bei der Erzeugung und dem Screenen
von Antikörper-Display-Banken
besonders vorteilhaft verwendet werden können, sind beispielsweise in
McCafferty et al. WO 92/01047, US-Patent Nr. 5,969,108 und
Weitere Beschreibungen von Screenings rekombinanter Antikörperbänke sind in wissenschaftlichen Publikationen zu finden, wie Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; und Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86.Further Descriptions of screenings of recombinant antibody libraries are in scientific publications, as Fuchs et al. (1991) Bio / Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio / Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554; and Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296: 57-86.
Alternativ zur Verwendung von Bakteriophagen-Display-Systemen können rekombinante Antikörper-Banken auf der Oberfläche von Hefezellen oder bakteriellen Zellen exprimiert werden. Verfahren zur Herstellung und zum Screenen von Banken, die auf der Oberfläche von Hefezellen exprimiert sind, sind in WO 99/36569 beschrieben. Verfahren zur Herstellung und zum Screenen von Banken, die auf der Oberfläche von bakteriellen Zellen exprimiert sind, sind in WO 98/49286 genauer beschrieben.alternative For the use of bacteriophage display systems may be recombinant Antibody banks on the surface of yeast cells or bacterial cells. method for the manufacture and screening of banks on the surface of Yeast cells are expressed, are described in WO 99/36569. method for the preparation and screening of banks on the surface of bacterial Cells are more specifically described in WO 98/49286.
Sobald ein interessierender Antikörper aus einer kombinatorischen Bank identifiziert ist, werden die DNAs, welche die leichten und schweren Ketten des Antikörpers kodieren, mittels standardisierter molekularbiologischer Techniken isoliert, beispielsweise mittels PCR-Amplifikation von DNA aus der Display-Packung (z.B. dem Phagen), die man während des Screenens der Bank isoliert hat. Nukleotidsequenzen von Genen für leichte und schwere Antikörperketten, mit denen PCR-Primer hergestellt werden können, sind dem Fachmann bekannt. Viele solcher Sequenzen sind beispielsweise in Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health und Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242 und der Datenbank für Sequenzen der Humankeimbahn VBASE beschrieben.As soon as an antibody of interest identified from a combinatorial library, the DNAs, which code the light and heavy chains of the antibody, isolated by standardized molecular biology techniques, for example by PCR amplification of DNA from the display package (e.g. the phage), which one during of the screening of the bank. Nucleotide sequences of genes for easy and heavy antibody chains, with which PCR primers can be prepared are known in the art. Many such sequences are described, for example, in Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 and the database for Sequences of human germline VBASE described.
Ein erfindungsgemäßer Antikörper oder Antikörperteil kann hergestellt werden, indem man die Gene für leichte und schwere Immunglobulinketten in einer Wirtszelle rekombinant exprimiert. Um einen Antikörper rekombinant zu exprimieren, wird eine Wirtszelle mit einem oder mehreren rekombinanten Expressionsvektoren, die DNA-Fragmente tragen, welche die leichten und schweren Immunglobulinketten des Antikörpers kodieren, transfiziert, so dass die leichten und schweren Ketten in der Wirtszelle exprimiert und vorzugsweise in das Medium, in dem die Wirtszellen kultiviert werden, sekretiert werden. Aus diesem Medium können die Antikörper gewonnen werden. Man verwendet standardisierte rekombinante DNA-Methodik, um Gene für schwere und leichte Antikörperketten zu erhalten, diese Gene in rekombinante Expressionsvektoren einzusetzen und die Vektoren in Wirtszellen einzuführen. Eine derartige Methodik ist beispielsweise in Sambrook, Fritsch und Maniatis (Hrsg.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (Hrsg.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) und im US-Patent Nr. 4,816,397 von Boss et al. beschrieben.One inventive antibody or Antibody portion can be made by using the genes for light and heavy immunoglobulin chains expressed recombinantly in a host cell. To recombinant an antibody expressing a host cell with one or more recombinant Expression vectors carrying DNA fragments encoding the light ones and heavy immunoglobulin chains of the antibody, transfected, so that the light and heavy chains are expressed in the host cell and preferably into the medium in which the host cells cultured be secreted. From this medium, the antibodies can be obtained become. Standardized recombinant DNA methodology is used around genes for heavy and light antibody chains to obtain these genes in recombinant expression vectors and introduce the vectors into host cells. Such a methodology is for example in Sambrook, Fritsch and Maniatis (ed.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (Ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) and U.S. Patent No. 4,816,397 to Boss et al. described.
Sobald DNA-Fragmente, die VH- und VL-Segmente des interessierenden Antikörpers kodieren, erhalten werden, können diese DNA-Fragmente mit standardisierten rekom binanten DNA-Techniken weiter manipuliert werden, beispielsweise um die Gene für variable Regionen in Gene für Antikörperketten voller Länge, in Gene für Fab-Fragmente oder in ein scFv-Gen zu überführen. Bei diesen Manipulationen wird ein VL- oder VH-kodierendes DNA-Fragment operativ mit einem weiteren ein weiteres Protein, z.B. eine konstante Antikörperregion oder einen flexiblen Linker, kodierenden DNA-Fragment verknüpft. Der Begriff „operativ verknüpft" soll hier meinen, dass die beiden DNA-Fragmente so miteinander verbunden sind, dass die von den beiden DNA-Fragmenten kodierten Aminosäuresequenzen im Leseraster (in-frame) bleiben.As soon as DNA fragments encoding VH and VL segments of the antibody of interest, can be obtained these DNA fragments with standardized recombinant DNA techniques be further manipulated, for example, the genes for variable Regions in Gene for Antibody chains full length, in Genes for Fab fragments or into a scFv gene. at these manipulations become a VL or VH-encoding DNA fragment operatively with another another protein, e.g. a constant Antibody region or a flexible linker, encoding DNA fragment linked. Of the Term "operative linked "should mean here that the two DNA fragments are linked together so that those of the two DNA fragments encoded amino acid sequences stay in-frame.
Die isolierte, die VH-Region kodierende DNA kann in ein Gen für eine schwere Kette voller Länge überführt werden, indem man die VH-Region kodierende DNA mit einem weiteren, konstante Regionen der schweren Kette (CH1, CH2 und CH3) kodierenden DNA-Molekül operativ verknüpft. Die Sequenzen von Genen für konstante Regionen humaner schwerer Ketten sind hinlänglich bekannt (siehe z.B. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health und Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242), und DNA-Fragmente, die diese Regionen überspannen, können mittels standardisierter PCR-Amplifikation erhalten werden. Die konstante Region der schweren Kette kann eine konstante Region aus IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD sein, wobei eine konstante Region aus IgG1 oder IgG4 bevorzugt ist. Um ein Gen für ein Fab-Fragment der schweren Kette zu erhalten, kann die VH-kodierende DNA mit einem weiteren, lediglich die konstante Region CH1 der schweren Kette kodierenden DNA-Molekül operativ verknüpft werden.The isolated, the VH region encoding DNA can be into a gene for a heavy Full length chain to be transferred by coding the VH region-encoding DNA with another, constant Regions of the heavy chain (CH1, CH2 and CH3) encoding DNA molecule operatively connected. The sequences of genes for Constant regions of human heavy chains are well known (See, e.g., Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Pat. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), and DNA fragments, that span these regions, can obtained by standard PCR amplification. The Constant heavy chain region can be a constant region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD, with a constant Region of IgG1 or IgG4 is preferred. To a gene for a Fab fragment To obtain the heavy chain, the VH-encoding DNA with a further, only the constant region CH1 of the heavy chain coding DNA molecule operatively linked become.
Die isolierte, die VL-Region kodierende DNA kann in ein Gen für eine leichte Kette voller Länge (sowie ein Gen für eine Fab-leichte Kette) überführt werden, indem man die VL-kodierende DNA mit einem weiteren, die konstante Region CL der leichten Kette kodierenden DNA-Molekül operativ verknüpft. Die Sequenzen von Genen der konstanten Region humaner leichter Kette sind hinlänglich bekannt (siehe Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health und Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242), und DNA-Fragmente, die diese Regionen überspannen, können mittels standardisierter PCR-Amplifikation erhalten werden. Die konstante Region der leichten Kette kann eine konstante kappa- oder lambda-Region sein, wobei eine konstante kappa-Region bevorzugt ist.The isolated, the VL region encoding DNA can be into a gene for a slight Chain full length (as well as a gene for a Fab light chain), by mixing the VL-encoding DNA with another, the constant Region CL of the light chain encoding DNA molecule operatively connected. The sequences of human light chain constant region genes are sufficient (see Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Pat. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), and DNA fragments, that span these regions, can obtained by standard PCR amplification. The constant region of the light chain can be a constant kappa or lambda region, with a constant kappa region being preferred is.
Um ein scFv-Gen zu erzeugen, können die VH- und VL-kodierenden DNA-Fragmente mit einem weiteren, einen flexiblen Linker, z.B. die Aminosäuresequenz (Gly4-Ser)3 kodierenden Fragment operativ verknüpft werden, so dass die VH- und VL-Sequenzen als fortlaufendes einzelkettiges Protein exprimiert werden, wobei die VL- und VH-Regionen über den flexiblen Linker miteinander verbunden sind (siehe Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).To generate an scFv gene, the VH and VL-encoding DNA fragments can be operatively linked to another fragment that encodes a flexible linker, eg, the amino acid sequence (Gly 4 -Ser) 3 , such that the VH and VL Sequences are expressed as a continuous single-chain protein with the VL and VH regions linked together via the flexible linker (see Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554).
VH- und VL-Einzeldomänen mit Spezifität für erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon können mit den oben beschriebenen Verfahren aus Einzeldomänen-Banken isoliert werden. Zwei VH-Einzeldomänen-Ketten (mit oder ohne CH1) oder zwei VL-Ketten oder ein Paar aus einer VH- und einer VL-Kette mit der gewünschten Spezifität können verwendet werden, um erfindungsgemäße AGER-RMEs oder Derivate/Äquivalente davon zu binden.VH and VL single domains with specificity for inventive AGER RME or a derivative / equivalent of it can with the single domain banks methods described above be isolated. Two VH single domain chains (with or without CH1) or two VL chains or a pair of VH and VL chains with the desired specificity can are used to AGER-RMEs invention or derivatives / equivalents to bind it.
Um die erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper oder Antikörperteile zu exprimieren, können die DNAs, welche die leichten und schweren Ketten von partieller oder voller Länge kodieren, in Expressionsvektoren insertiert werden, so das die Gene mit transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen operativ verknüpft sind. In diesem Zusammenhang soll der Begriff „operativ verknüpft" meinen, dass ein Antikörpergen in einem Vektor so ligiert ist, dass transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen innerhalb des Vektors ihre beabsichtigte Funktion zur Regulation der Transkription und Translation des Antikörpergens erfüllen.In order to express the recombinant antibodies or antibody portions of the invention, the DNAs encoding the partial and full length light and heavy chains can be inserted into expression vectors such that the genes are operably linked to transcriptional and translational control sequences. In this context, the term "operatively linked" means that an antibody gene is ligated in a vector so that transcriptional and translational control sequences within the vector fulfill their intended function of regulating the transcription and translation of the antibody gene.
Der Expressionsvektor und die Expressionskontrollsequenzen werden so gewählt, dass sie mit der zur Expression verwendeten Wirtszelle kompatibel sind. Das Gen für die leichte Antikörperkette und das Gen für die schwere Antikörperkette können in getrennte Vektoren insertiert werden, oder beide Gene werden in denselben Expressionsvektor insertiert, was der Regelfall ist. Die Antikörpergene werden in den Expressionsvektor mittels standardisierter Verfahren insertiert (z.B. Ligation komplementärer Restriktionsschnittstellen am Antikörpergenfragment und Vektor, oder Ligation stumpfer Enden, falls keine Restriktionsschnittstellen vorhanden sind). Vor der Insertion der Sequenzen für die leichte und schwere Kette kann der Expressionsvektor bereits Sequenzen für konstante Antikörperregionen tragen. Beispielsweise ist es ein Ansatz, die VH- und VL-Sequenzen in Antikörpergene voller Länge zu überführen, indem man sie in Expressionsvektoren insertiert, die bereits die konstanten Regionen für schwere bzw. leichte Kette kodieren, so dass das VH-Segment mit dem oder den CH-Segment(en) innerhalb des Vektors operativ verknüpft ist, und auch das VL-Segment mit dem CL-Segment innerhalb des Vektors operativ verknüpft ist. Zusätzlich oder alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor ein Signalpeptid kodieren, welches die Sekretion der Antikörperkette aus der Wirtszelle erleichtert. Das Gen für die Antikörperkette kann in den Vektor kloniert werden, so dass das Signalpeptid in Leseraster mit dem N-Terminus des Gens für die Antikörperkette verknüpft ist. Das Signalpeptid kann ein Immunglobulin-Signalpeptid oder ein heterologes Signalpeptid sein (d.h. ein Signalpeptid aus einem Nicht-Immunoglobulin-Protein). Zusätzlich zu den Genen für die Antikörperkette können die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren regulatorische Sequenzen aufweisen, welche die Expression der Gene für die Antikörperkette in einer Wirtszelle kontrollieren. Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und weitere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) einschließen, welche die Transkription oder Translation der Gene für die Antikörperkette kontrollieren. Solche regulatorischen Sequenzen sind beispielsweise in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. Dem Fachmann ist bekannt, dass das Design des Expressionsvektors, wozu die Selektion regulatorischer Sequenzen gehört, von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der gewünschten Expressionsstärke des Proteins, etc. Zu bevorzugten regulatorischen Sequenzen für eine Expression in Säugerwirtszellen gehören virale Elemente, die zu einer starken Proteinexpression in Säugerzellen führen, wie Promotoren und/oder Enhancer, die vom Cytomegalovirus (CMV) (wie der CMV-Promoter/Enhancer), Simian-Virus 40 (SV40) (wie der SV40-Promotor/Enhancer), Adenovirus (z.B. der Späte Adenovirus-Hauptpromotor (AdMLP für Adenovirus Major Late Promoter) und Polyoma abstammen. Zur weiteren Beschreibung viraler regulatorischer Elemente und Sequenzen davon, siehe z.B. US-Patent Nr. 5,168,062 von Stinski, US-Patent Nr. 4,510,245 von Bell et al. und US-Patent Nr. 4,968,615 von Schaffner et al.Of the Expression vector and the expression control sequences are so selected that it is compatible with the host cell used for expression are. The gene for the light antibody chain and the gene for the heavy antibody chain can be inserted into separate vectors, or both genes inserted into the same expression vector, which is the rule. The antibody genes be in the expression vector by means of standardized methods inserted (e.g., ligation of complementary restriction sites on the antibody gene fragment and vector, or blunt ended ligation, if no restriction sites available). Before insertion of the sequences for the light and heavy chain, the expression vector may already have sequences for constant Antibody regions wear. For example, it is one approach, the VH and VL sequences in antibody genes full length to convict by they are inserted into expression vectors that are already constant Regions for encode heavy or light chain, so that the VH segment with the CH segment (s) within the vector, and also the VL segment is operatively linked to the CL segment within the vector. additionally or alternatively, the recombinant expression vector may be a signal peptide encode the secretion of the antibody chain from the host cell facilitated. The gene for the antibody chain can be cloned into the vector so that the signal peptide in Reading frame is linked to the N-terminus of the antibody chain gene. The signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous Signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein). additionally to the genes for the antibody chain can the expression vectors of the invention have regulatory sequences which express the genes for the Antibody chain in a host cell. The term "regulatory sequence" is intended to include promoters, Enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) lock in, which is the transcription or translation of the genes for the antibody chain check. Such regulatory sequences are for example in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). The skilled person is It is known that the design of an expression vector, why selection belongs to regulatory sequences, depend on factors can, as the choice of the host cell to be transformed, the desired expression level of the protein, etc. Preferred regulatory sequences for expression in mammalian host cells belong viral elements leading to strong protein expression in mammalian cells to lead, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) (like the CMV promoter / enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (like the SV40 promoter / enhancer), adenovirus (e.g., the major adenovirus late promoter (AdMLP for adenovirus Major Late Promoter) and Polyoma. For further description viral regulatory elements and sequences thereof, see e.g. U.S. Patent No. 5,168,062 to Stinski, U.S. Patent No. 4,510,245 to Bell et al. and U.S. Patent No. 4,968,615 to Schaffner et al.
Zusätzlich zu den Genen für die Antikörperkette und die regulatorischen Sequenzen können die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren zusätzliche Sequenzen aufweisen, wie Sequenzen, welche die Replikation des Vektors in Wirtszellen regulieren (z.B. Replikationsstartpunkte) und selektierbare Markergene. Die selektierbaren Markergene erleichtern die Selektion von Wirtszellen, in die der Vektor eingeführt wurde (siehe z.B. US-Patents Nr. 4,399,216, 4,634,665 und 5,179,017, alle von Axel et al.). Zum Beispiel ist es üblich, dass das selektierbare Markergen eine Wirtszelle, in die der Vektor eingesetzt wurde, gegen Wirkstoffe wie G418, Hygromycin oder Methotrexat resistent macht. Zu bevorzugten selektierbaren Markergenen gehören das Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) (zur Verwendung in dhfr–-Wirtzellen mit Methotrexat-Selektion/Amplifikation) und das neo-Gen (zur G418-Selektion).In addition to the genes for the antibody chain and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the invention may have additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (eg, origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker genes facilitate the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, eg, US Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017, all to Axel et al.). For example, it is common for the selectable marker gene to render a host cell into which the vector has been used resistant to drugs such as G418, hygromycin or methotrexate. Preferred selectable marker genes include the gene for dihydrofolate reductase (DHFR) (for use in dhfr - host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection).
Für die Expression der leichten und schweren Ketten wird der oder werden die schwere und leichte Ketten kodierende(n) Expressionsvektor(en) mittels standardisierter Techniken in eine Wirtszelle transfiziert. Die verschiedenen Formen des Begriffs „Transfektion" sollen eine Vielzahl von Techniken erfassen, die gewöhnlicherweise zur Einführung exogener DNA in eine prokaryotische oder eukarotische Wirtszelle verwendet werden, z.B. Elektroporation, Calcium-Phosphat-Fällung, DEAE-Dextran- Transfektion und ähnliches. Wenngleich es theoretisch möglich ist, die erfindungsgemäßen Antikörper entweder in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen zu exprimieren, ist die Expression der Antikörper in eukaryotischen Zellen und insbesondere in Säugerwirtszellen bevorzugt, da die Wahrscheinlichkeit, dass ein korrekt gefalteter und immunologisch aktiver Antikörper zusammengesetzt und sekretiert wird, in solchen eukaryotischen Zellen und insbesondere Säugerzellen höher ist als in prokaryotischen Zellen. Über die prokaryotische Expression von Antikörpergenen ist berichtet worden, dass sie für die Produktion großer Ausbeuten aktiven Antikörpers ineffektiv sei (Boss, M.A. und Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).For the expression Light and heavy chains will become or become heavy and light chain coding expression vector (s) by means of standardized Techniques transfected into a host cell. The different forms The term "transfection" should be a variety of techniques, usually for the introduction exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell can be used, e.g. Electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is theoretically possible is, the antibodies of the invention either in prokaryotic or eukaryotic host cells, is the expression of the antibodies in eukaryotic cells and especially in mammalian host cells, because the probability of being a correctly folded and immunological active antibody is assembled and secreted in such eukaryotic cells and especially mammalian cells is higher as in prokaryotic cells. about the prokaryotic expression of antibody genes has been reported that they are for the production big Yields of active antibody is ineffective (Boss, M.A. and Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).
Zu Säugerwirtszellen, die für die Expression erfindungsgemäßer rekombinanter Antikörper bevorzugt sind, gehören CHO-Zellen (einschließlich dhfr–-CHO-Zellen, die in Urlaub und Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 beschrieben sind und mit einem DHFR-selektierbaren Marker verwendet werden, wie z.B. in R.J. Kaufman und P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 beschrieben ist), NS0-Myelomzellen, COS-Zellen und SP2-Zellen. Werden rekombinante Expressionsvektoren, welche die Antikörpegene kodieren, in Säugerwirtszellen eingeführt, so werden die Antikörper hergestellt, indem man die Wirtszellen so lange kultiviert, bis der Antikörper in den Wirtszellen exprimiert oder vorzugsweise der Antikörper in das Kulturmedium, in dem die Wirtszellen wachsen, sekretiert wird. Die Antikörper können aus dem Kulturmedium gewonnen werden, indem man standardisierte Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen verwendet.Mammalian host cells which are preferred for the expression of recombinant antibodies of the invention include CHO cells (including dhfr - CHO cells described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 159: 601-621), NS0 myeloma cells, COS cells and SP2 cells. When recombinant expression vectors encoding the antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are prepared by culturing the host cells until the antibody is expressed in the host cells or, preferably, the antibody is secreted into the culture medium in which the host cells grow , The antibodies can be recovered from the culture medium using standardized methods for the purification of proteins.
Es können ebenfalls Wirtszellen verwendet werden, um Teile intakter Antikörper, wie Fab-Fragmente oder scFv-Moleküle, herzustellen. Variationen der zuvor beschriebenen Vorgehensweise gehören selbstverständlich zur Erfindung. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, eine Wirtszelle mit DNA zu transfizieren, die entweder die leichte Kette oder die schwere Kette (aber nicht beide) eines erfindungsgemäßen Antikörpers kodiert. Sind leichte oder schwere Ketten vorhanden, die für die Bindung des interessierenden Antigens nicht erforderlich sind, so kann die DNA, die entweder eine solche leichte oder eine solche schwere Kette oder beide kodiert, mittels rekombinanter DNA-Technologie zum Teil oder vollständig entfernt werden. Moleküle, die von solchen verkürzten DNA-Molekülen exprimiert werden, gehören ebenfalls zu den erfindungsgemäßen Antikörpern. Darüber hinaus können bifunktionale Antikörper hergestellt werden, in denen eine schwere und eine leichte Kette ein erfindungsgemäßer Antikörper sind und die andere schwere und leichte Kette Spezifität für ein anderes als das interessierende Antigen besitzen, indem man einen erfindungsgemäßen Antikörper mit einem zweiten Antikörper mittels standardisierter chemischer Verfahren quervernetzt.It can Also, host cells can be used to protect intact antibodies, such as Fab fragments or scFv molecules, manufacture. Variations of the procedure described above belong Of course to the invention. For example, it may be desirable to have a host cell to transfect with DNA containing either the light chain or the heavy chain (but not both) of an antibody of the invention encoded. Are light or heavy chains available for bonding of the antigen of interest are not required, the DNA that is either such a light or heavy chain or both encoded, partially or completely removed by recombinant DNA technology become. molecules those shortened by such DNA molecules are expressed also to the antibodies of the invention. Furthermore can bifunctional antibodies are made in which a heavy and a light chain an antibody according to the invention and the other heavy and light chain specificity for another as having the antigen of interest by having an antibody according to the invention a second antibody Cross-linked by standardized chemical methods.
In einem bevorzugten System zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Antigen-bindenden Teils davon wird ein rekombinanter Expressionsvektor, der sowohl die schwere Antikörperkette als auch die leichte Antikörperkette kodiert, mittels Calcium-Phosphat-vermittelter Transfektion in dhfr–-CHO-Zellen eingeführt. Innerhalb des rekombinanten Expressionsvektors sind die Gene für die schwere und leichte Antikörperkette jeweils mit regulatorischen CMV-Enhancer/AdMLP-Promotor-Elementen operativ verknüpft, um eine starke Transkription der Gene zu bewirken. Der rekombinante Expressionsvektor trägt auch ein DHFR-Gen, mit dem sich CHO-Zellen, die mit dem Vektor transfiziert sind, selektieren lassen, indem man die Methotrexat-Selektion/Amplification verwendet. Die selektierten transformierten Wirtszellen werden kultiviert, so dass die schweren und leichten Antikörperketten exprimiert werden, und intakter Antikörper wird aus dem Kulturmedium gewonnen. Man verwendet standardisierte molekularbiologische Techniken, um den rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, die Wirtszellen zu transfizieren, die Transformanten zu selektieren, die Wirtszellen zu kultivieren und den Antikörper aus dem Kulturmedium zu gewinnen. So betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörpers, indem man eine erfindungsgemäße Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, bis ein erfindungsgemäßer rekombinanter Antikörper synthetisiert ist. Das Verfahren kann des weiteren beinhalten, dass man den rekombinanten Antikörper aus dem Kulturmedium isoliert.In a preferred system for recombinant expression of an antibody or antigen-binding portion thereof of the invention, a recombinant expression vector encoding both the heavy antibody chain and the light antibody chain is introduced into dhfr - CHO cells by calcium phosphate-mediated transfection. Within the recombinant expression vector, the heavy and light antibody chain genes are each operably linked to CMV enhancer / AdMLP promoter regulatory elements to effect strong transcription of the genes. The recombinant expression vector also carries a DHFR gene with which CHO cells transfected with the vector can be selected by using methotrexate selection / amplification. The selected transformed host cells are cultured so that the heavy and light antibody chains are expressed, and intact antibody is recovered from the culture medium. Standardized molecular biology techniques are used to prepare the recombinant expression vector, to transfect the host cells, to select the transformants, to cultivate the host cells and to recover the antibody from the culture medium. Thus, the invention relates to a process for the synthesis of a recombinant antibody according to the invention by culturing a host cell according to the invention in a suitable culture medium until a recombinant antibody according to the invention is synthesized. The method may further include isolating the recombinant antibody from the culture medium.
Alternativ zum Screenen rekombinanter Antikörperbänke durch Phage-Display können weitere, dem Fachmann bekannte Methoden zum Screenen großer kombinatorischer Bänke eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Antikörper zu identifizieren. Bei einer Art eines alternativen Expressionssytems ist die rekombinante Antikörperbank in Form von RNA-Protein-Fusionen exprimiert, wie in WO 98/31700 von Szostak und Roberts, und in Roberts, R.W. und Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302 beschrieben. In diesem System erzeugt man durch in-vitro-Translation synthetischer mRNAs, die an ihrem 3'-Ende Puromycin, ein Peptidylakzeptor-Antibiotikum, tragen, zwischen einer mRNA und dem Peptid oder Protein, das sie kodiert, eine kovalente Fusion. So kann eine spezifische mRNA aus einem komplexen Gemisch von mRNAs (z.B. einer kombinatorischen Bank) anhand der Eigenschaften des kodierten Peptids oder Proteins (z.B. des Antikörpers oder eines Teils davon) wie dem Binden des Antikörpers oder Teils davon an erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon angereichert werden. Antikörper oder Teile davon kodierende Nukleinsäuresequenzen, die aus dem Screenen solcher Bänke gewonnen werden, können mit rekombinanten Mitteln in der oben beschriebenen Weise exprimiert werden (z.B. in Säugerwirtszellen) und darüber hinaus einer weiteren Affinitätsreifung unterzogen werden, indem man entweder in weiteren Durchgängen mRNA- Peptid-Fusionen screent, wobei man in die ursprünglich selektierte(n) Sequenz(en) Mutationen einführt, oder indem man andere Verfahren zur in-vitro-Affinitätsreifung rekombinanter Antikörper in der oben beschriebenen Weise verwendet.alternative for screening recombinant antibody libraries Phage display can other methods known to those skilled in the art for screening large combinatorial Banks used be to the antibodies of the invention identify. In one type of alternative expression system is the recombinant antibody library in the form of RNA-protein fusions, as in WO 98/31700 by Szostak and Roberts, and in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302. In This system is produced by in vitro translation of synthetic mRNAs, the at her 3'-end Puromycin, a peptidyl acceptor antibiotic, carries between one mRNA and the peptide or protein that encodes it, a covalent Fusion. So can a specific mRNA from a complex mixture of mRNAs (e.g., a combinatorial library) by properties the encoded peptide or protein (e.g., the antibody or protein) part thereof) such as the binding of the antibody or part thereof to AGER-RME according to the invention or a derivative / equivalent enriched by it. antibody or parts thereof encoding nucleic acid sequences resulting from screening such benches can be won expressed with recombinant agents in the manner described above (e.g., in mammalian host cells) and above also a further affinity maturation either by screening mRNA-peptide fusions in further rounds, being in the original one selected sequence (s) introduce mutations, or by adding others Method for in vitro affinity maturation recombinant antibody used in the manner described above.
Kombinationen aus in vivo- und in vitro-Ansätzen:Combinations of in vivo and in vitro approaches:
Die erfindungsgemäßen Antikörper können ebenfalls hergestellt werden, indem man eine Kombination aus in-vivo- und in-vitro-Ansätzen anwendet, wie Verfahren, in denen man zunächst erfindungsgemäßes AGER-RME oder ein Derivat/Äquivalent davon auf ein Antikörper-Repertoire in vivo in einem Wirtstier einwirken lässt, um die Produktion von AGER-RME- oder Derivat/Äquivalent-bindenden Antikörpern zu stimulieren, und anschließend die weitere Antikörperselektion und/oder Antikörperreifung (d.h. Optimierung) mit Hilfe einer oder mehrerer in-vitro-Techniken bewerkstelligt wird. Einer Ausführungsform zufolge kann ein solches kombiniertes Verfahren beinhalten, dass man zunächst ein nicht-humanes Tier (z.B. eine Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Kamelide, Ziege oder eine transgene Version davon oder eine chimäre Maus) mit dem erfindungsgemäßen AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon immunisiert, um eine Antikörper-Antwort gegen das Antigen zu stimulieren, und anschließend unter Verwendung von Immunglobulinsequenzen aus Lymphozyten, die durch die Einwirkung des AGER-RMEs oder Derivats/Äquivalents in vivo stimuliert worden sind, eine Phage-Display-Antikörperbank herstellt und screent. Der erste Schritt dieser kombinierten Vorgehensweise kann in der oben im Zusammenhang mit den in-vivo-Ansätzen beschriebenen Weise durchgeführt werden, während der zweite Schritt dieser Vorgehensweise in der oben in Zusammenhang mit den in-Vitro-Ansätzen beschriebenen Weise durchgeführt werden kann. Zu bevorzugten Methoden für die Hyperimmunisierung von nicht-humanen Tieren mit anschließendem in-vitro-Screening von Phage-Display-Bänken, die aus den stimulierten Lymphozyten hergestellt wurden, gehören diejenigen, die von BioSite Inc., siehe z.B. WO 98/47343, WO 91/17271, US-Patent Nr. 5,427,908 und US-Patent Nr. 5,580,717 beschrieben sind.The antibodies according to the invention can also be prepared by using a combination of in vivo and in vitro approaches, such as methods in which first inventive AGER-RME, or a derivative / equivalent thereof, is capable of acting on an antibody repertoire in vivo in a host animal to stimulate the production of AGER-RME or derivative / equivalent binding antibodies followed by further antibody selection and / or antibody maturation ( ie optimization) is accomplished by one or more in vitro techniques. According to one embodiment, such a combined method may involve first obtaining a non-human animal (eg a mouse, rat, rabbit, chicken, camelid, goat or a transgenic version thereof or a chimeric mouse) with the AGER-RME or derivative of the invention / Equivalent thereof immunized to stimulate an antibody response to the antigen, and subsequently to produce a phage display antibody library using immunoglobulin sequences from lymphocytes stimulated in vivo by the action of the AGER-RME or derivative / equivalent and screent. The first step of this combined approach may be performed in the manner described above in the context of the in vivo approaches, while the second step of this approach may be performed in the manner described above in connection with the in vitro approaches. Preferred methods for hyperimmunization of non-human animals followed by in vitro screening of phage display banks prepared from the stimulated lymphocytes include those described by BioSite Inc., see, for example, WO 98/47343, WO 91/17271, U.S. Patent No. 5,427,908 and U.S. Patent No. 5,580,717.
Einer weiteren Ausführungsform zufolge beinhaltet ein kombiniertes Verfahren, dass man zunächst ein nicht-humanes Tier (z.B. eine Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Kamelide, Ziege oder eine Knockout- und/oder transgene Version davon, oder eine chimäre Maus) mit einem erfindungsgemäßen AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon immunisiert, um eine Antikörperantwort gegen das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon zu stimulieren, und die Lymphozyten, welche die Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren, selektiert, indem man (z.B. aus den immunisierten Tieren hergestellte) Hybridome screent. Die Gene für die Antikörper oder Einzeldomän-Antikörper werden aus den selektierten Klonen isoliert (mittels standardisierter Klonie rungsverfahren, wie der Reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion) und einer in-vitro-Affinitätsreifung unterzogen, um dadurch die Bindungseigenschaften des selektierten Antikörpers oder der selektierten Antikörper zu verbessern. Der erste Schritt dieser Vorgehensweise kann in der oben in Zusammenhang mit den in-vivo-Ansätzen beschriebenen Weise vollzogen werden, während der zweite Schritt dieser Vorgehensweise in der oben in Zusammenhang mit den in-vitro-Ansätzen beschriebenen Weise vollzogen werden kann, insbesondere indem man Verfahren zur in-vitro-Affinitätsreifung verwendet, wie diejenigen, die in WO 97/29131 und WO 00/56772 beschrieben sind.one another embodiment According to a combined procedure involves first being a non-human Animal (e.g., a mouse, rat, rabbit, chicken, camelid, goat or a knockout and / or transgenic version thereof, or a chimeric mouse) with an AGER RME according to the invention or derivative / equivalent immunized to an antibody response against the AGER RME or derivative / equivalent thereof and the lymphocytes carrying the antibodies the desired specificity , selected by (e.g., from the immunized animals prepared) hybridomas screent. The genes for the antibodies or single domain antibodies are isolated from the selected clones (by means of standardized cloning methods, like the reverse transcriptase polymerase chain reaction) and a in vitro affinity maturation subjected to thereby the binding properties of the selected antibody or the selected antibody to improve. The first step of this procedure can be found in the completed above in connection with the in vivo approaches described be while The second step of this approach is related in the above with the in vitro approaches described manner can be accomplished, in particular by Method for in vitro affinity maturation such as those described in WO 97/29131 and WO 00/56772 are.
In einem weiteren kombinierten Verfahren werden die rekombinanten Antikörper aus einzelnen isolierten Lymphozyten erzeugt, indem man eine Vorgehensweise verwendet, die dem Fachmann als Lymphozyten-Antikörper-Selektionsverfahren (SLAM) bekannt und in US-Patent Nr. 5,627,052, WO 92/02551 und Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 beschrieben ist. In diesem Verfahren wird ein nicht-humanes Tier (z.B. eine Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Kamelide, Ziege, oder eine transgene Version davon, oder eine chimäre Maus) zunächst in vivo mit erfindungsgemäßem AGER-RME oder einem Derivat/Äquivalent davon immunisiert, um eine Immunantwort gegen das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent zu stimulieren, und dann werden einzelne, interessierende Antikörper sekretierende Zellen selektiert, indem man einen antigenspezifischen hämolytischen Plaque-Assay verwendet. Hierzu können das AGER-RME oder Derivat/Äquivalent davon, oder interessierende strukturell verwandte Moleküle an Schaf-Erythrozyten gekoppelt werden, wobei man einen Linker wie Biotin verwendet, wodurch sich einzelne Zellen, die Antikörper mit geeigneter Spezifität sekretieren, unter Verwendung des hämolytischen Plaque-Assays identifizieren lassen. In Anschluss an die Identifizierung von Zellen, die interessierende Antikörper sekretieren, werden cDNAs für die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten aus den Zellen durch Reverse Transkriptase-PCR gewonnen und diese variablen Regionen können dann in Zusammenhang mit geeigneten konstanten Immunglobulinregionen (z.B. humanen konstanten Regionen) in Säugerwirtszellen wie COS- oder CHO-Zellen exprimiert werden. Die mit den aus in vivo selektierten Lymphozyten abstammenden, amplifizierten Immungrobulinsequenzen transfizierten Wirtszellen können dann einer weiteren in-vitro-Analyse und -Selektion unterzogen werden, indem man beispielsweise die transfizierten Zellen ausbreitet, um Zellen zu isolieren, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität exprimieren. Die amplifizierten Immunglobulinsequenzen können des weiteren in vitro manipuliert werden.In In another combined method, the recombinant antibodies individual isolated lymphocytes generated by taking a course of action used by those skilled in the art as a lymphocyte antibody selection method (SLAM) and in US Pat. No. 5,627,052, WO 92/02551 and Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 is. In this method, a non-human animal (e.g. Mouse, rat, rabbit, chicken, camelid, goat, or a transgenic Version of it, or a chimera Mouse) first in vivo with AGER-RME according to the invention or a derivative / equivalent immunized to an immune response against the AGER-RME or Derivative / equivalent and then individual antibodies of interest secrete Cells selected by giving an antigen-specific hemolytic Used plaque assay. You can do this the AGER-RME or derivative / equivalent thereof, or structurally related molecules of interest to sheep erythrocytes coupled, using a linker such as biotin, thereby single cells, the antibodies with appropriate specificity secrete using the hemolytic plaque assay to let. Following the identification of cells, the ones of interest antibody to secrete cDNAs for the variable regions of the light and heavy chains from the Cells recovered by reverse transcriptase PCR and these variables Regions can then in conjunction with appropriate immunoglobulin constant regions (e.g., human constant regions) in mammalian host cells such as COS or CHO cells are expressed. Those selected with those from in vivo Lymphocyte-derived, amplified immunoglobulin sequences transfected host cells can then undergo further in vitro analysis and selection, for example by spreading the transfected cells to Isolate cells that are antibodies with the desired specificity express. The amplified immunoglobulin sequences can be of be further manipulated in vitro.
6. Pharmazeutische Mittel6. Pharmaceutical agents
6.1 Allgemein6.1 General
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch pharmazeutische Mittel (Zusammensetzungen), die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes Protein (AGER-RME; AGER-RME-bindende Liganden, wie anti-AGER-RME Antikörper, bispezifische Antikörper, Hybridproteine gemäß obiger Definition; AGER-Ektodomäne und N-terminale Subfragmente) oder eine kodierende AGER-RME-Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger beinhalten. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können des weiteren wenigstens ein zusätzliches therapeutisches Agens, z. B. ein oder mehrere zusätzliche therapeutische Agenzien zur Behandlung einer der hierin beschriebenen Erkrankungen beinhalten.The present invention also relates to pharmaceutical compositions (compositions) containing as active ingredient a protein according to the invention (AGER-RME; AGER-RME-binding ligands, such as ti-AGER-RME antibodies, bispecific antibodies, hybrid proteins as defined above; AGER ectodomain and N-terminal subfragments) or an encoding AGER-RME nucleic acid sequence and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical compositions according to the invention may further comprise at least one additional therapeutic agent, e.g. B. one or more additional therapeutic agents for the treatment of any of the diseases described herein.
Zu pharmazeutisch verträglichen Trägern gehören sämtliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antimikrobielle Agenzien, isotonisierende und die Absorption verzögernde Agenzien, und dergleichen, sofern sie physiologisch kompatibel sind.To pharmaceutically acceptable carriers belong all Solvent, Dispersion media, coatings, antimicrobial Agents, isotonizing and absorption delaying agents, and the like, as long as they are physiologically compatible.
Zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern gehören beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Lactose, Dextrose, Succrose, Sorbitol, Manitol, Stärken, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen pharmazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleitmittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservierende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidantien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emulsionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungsmittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuniger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon-Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppositoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist. Vgl. auch Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, Heidelberg.To pharmaceutically acceptable carriers belong for example, water, saline, Phosphate-buffered saline, Lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, starches, gum acacia, Calcium phosphate, alginates, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, Syrup and methylcellulose. Furthermore, the formulations may be pharmaceutical acceptable carriers or usual Auxiliaries, such as lubricants, for example tallow, magnesium stearate and mineral oil; Wetting agents; emulsifying and suspending agents; conservation Agents such as methyl and propyl hydroxybenzoates; antioxidants; Antiirritatives; chelating agents; coating aids; Emulsion stabilizers film former; gelling agents; Odor masking agents; masking flavors; resins; Hydrocolloids; Solvents; Solubilizing agents; Neutralizing agents; permeation; pigments; quaternary ammonium compounds; refatting and superfatting agents; Ointment, cream or oil bases; Silicone derivatives; spreading aids; stabilizers; Sterilanzien; suppository bases; Tablet excipients, such as binders, fillers, Lubricants, disintegrants or coatings; Propellant; Desiccant; Opacifiers; Thickener; waxes; plasticizers; Include white oils. A related embodiment based on expert Knowledge, such as in Fiedler, H.P., Lexicon of excipients for pharmacy, Cosmetics and adjacent areas, 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, is shown. See also Hager's Handbook of Pharmaceutical Practice, Springer Verlag, Heidelberg.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise zur parenteralen Verabreichung geeignet sein. Hierzu wird der Wirkstoff, wie z.B. der Antikörper, vor zugsweise als injizierbare Lösungen mit einem Wirkstoffgehalt von 0,1–250 mg/ml zubereitet. Die injizierbaren Lösungen können in flüssiger oder lyophilisierter Form in einem Flintglas oder Vial, einer Ampulle oder einer gefüllten Spritze als Dosierungsform zubereitet sein.The For example, pharmaceutical compositions may be for parenteral Administration be suitable. For this purpose, the active ingredient, such as the antibody, preferably before as injectable solutions prepared with an active ingredient content of 0.1-250 mg / ml. The injectable solutions can in liquid or lyophilized form in a flint glass or vial, an ampoule or a filled one Syringe can be prepared as a dosage form.
Der Puffer kann L-Histidin (1–50 mM, vorzugsweise 5–10 mM) enthalten und einen pH-Wert von 5,0–7,0, vorzugsweise von 6,0, aufweisen. Zu weiteren geeigneten Puffern gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Natriumsuccinat-, Natriumcitrat-, Natriumphosphat- oder Kaliumphosphat-Puffer.Of the Buffer can be L-histidine (1-50 mM, preferably 5-10 mM) and a pH of 5.0-7.0, preferably 6.0, exhibit. Other suitable buffers include, but are not limited to, Sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate or potassium phosphate buffer.
Man kann Natriumchlorid verwenden, um die Tonizität der Lösung auf eine Konzentration von 0–300 mM (vorzugsweise 150 mM für eine flüssige Dosierungsform) einzustellen. Cryoschutzmittel können für eine lyophilisierte Dosierungsform mit einbezogen werden, wie z. B. Sucrose (z. B. 0–10 %, vorzugsweise 0,5–1,0 % (w/w)). Zu weiteren geeigneten Cryoschutzmitteln gehören Trehalose und Laktose. Füllstoffe können für eine lyophilisierte Dosierungsform mit einbezogen werden, z.B. Mannitol (z.B. 1–10 %, vorzugsweise 2–4 %(w/w)). Stabilisatoren können sowohl in flüssigen als auch lyophilisierten Dosierungsformen verwendet werden, z.B. L-Methionin (z.B. 51–50 mM, vorzugsweise 5–10 mM). Zu weiteren geeigneten Füllstoffen gehören Glycin und Arginin. Ebenso können Tenside verwendet werden, beispielsweise Polysorbat-80 (z.B. 0–0,05 %, vorzugsweise 0,005–0,01 %(w/w)). Zu weiteren Tensiden gehören Polysorbat-20 und BRIJ-Tenside.you Can use sodium chloride to increase the tonicity of the solution to a concentration from 0-300 mM (preferably 150 mM for a liquid Dosage form). Cryoprotectants can be used for a lyophilized dosage form be included, such. Sucrose (e.g., 0-10%, preferably 0.5-1.0% (W / w)). Other suitable cryoprotectants include trehalose and lactose. fillers can for one lyophilized dosage form, e.g. mannitol (e.g., 1-10 %, preferably 2-4% (w / w)). Stabilizers can both in liquid as well as lyophilized dosage forms, e.g. L-methionine (e.g., 51-50 mM, preferably 5-10 mM). Other suitable fillers include glycine and arginine. Likewise Surfactants, for example polysorbate-80 (e.g., 0-0.05%, preferably 0.005-0.01 % (W / w)). Other surfactants include polysorbate-20 and BRIJ surfactants.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können eine Vielzahl von Formen annehmen. Zu diesen gehören flüssige, halbfeste und feste Dosierungsformen, wie flüssige Lösungen (z. B. injizierbare und infundierbare Lösungen, Lotionen, Augen- und Ohrentropfen), Liposome, Dispersionen oder Suspensionen und feste Formen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatinekapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Wirkstoffe verwendet werden. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Verabreichungsart und der therapeutischen Anwendung ab. Typischerweise werden Zusammensetzungen in Form von injizierbaren oder infundierbaren Lösungen bevorzugt. Ein geeigneter Verabreichungsweg ist z.B. parenteral (z. B. intravenös, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Wirkstoff durch intravenöse Infusion oder Injektion verabreicht. Einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zufolge wird der Wirkstoff durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht.The Compositions of the invention can take on a variety of forms. These include liquid, semi-solid and solid Dosage forms, such as liquid solutions (eg, injectable and infusible solutions, lotions, ophthalmic and Ear drops), liposomes, dispersions or suspensions and solid Forms such as powders, powders, granules, tablets, lozenges, sachets, Cachets, dragees, capsules such as hard and soft gelatin capsules, suppositories or vaginal drug forms, semi-solid dosage forms, such as ointments, Creams, hydrogels, pastes or patches. Also implanted dispensers can for the administration of active compounds according to the invention be used. The preferred form depends on the intended mode of administration and therapeutic application. Typically, compositions in the form of injectable or infusible solutions. A suitable one Route of administration is e.g. parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular). According to one preferred embodiment The active ingredient is by intravenous infusion or injection administered. According to another preferred embodiment, the Active ingredient by intramuscular or subcutaneous injection.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen typischerweise steril und unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein. Die Zusammensetzungen können als Lösung, Mikroemulsion, Dispersion, liposomal oder einer weiteren für hohe Wirkstoffkonzentrationen geeigneten, geordneten Struktur formuliert werden. Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem man die aktive Verbindung (wie z.B. den Antikörper) in der benötigten Menge in ein geeignetes Lösungsmittel gegebenenfalls mit einem oder einer Kombination der vorstehend genannten Inhaltsstoffe, je nach Bedarf, einbringt und anschließend steril filtriert. Dispersionen werden in der Regel zubereitet, indem man die aktive Verbindung in ein steriles Vehikel einbringt, welches ein Grunddispersionsmedium und gegebenenfalls weitere benötigte Inhaltsstoffe enthält. Im Falle eines sterilen lyophilisierten Pulvers zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen stellen die Vakuumtrocknung und Sprühtrocknung bevorzugte Herstellungsverfahren dar, mit denen ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffes und gegebenenfalls weiterer erwünschter Inhaltsstoffe aus einer zuvor steril filtrierten Lösung erhalten wird. Die richtige Fliessfähigkeit einer Lösung kann beibehalten werden, indem man beispielsweise einen Überzug wie Lecithin verwendet, im Fall von Dispersionen die benötigte Partikelgröße beibehält oder Tenside verwendet. Eine verlängerte Absorption injizierbarer Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem man ein Agens, das die Absorption verzögert, beispielsweise Monostearatsalze und Gelatine, in die Zusammensetzung mit einbringt.therapeutic Compositions need typically sterile and under the conditions of manufacture and storage be stable. The compositions may be as a solution, microemulsion, dispersion, liposomal or another for high drug concentrations of appropriate, ordered structure can be formulated. Sterile injectable solutions can by preparing the active compound (such as the Antibody) in the needed Amount in a suitable solvent optionally with one or a combination of the above Ingredients, as needed, and then sterile filtered. Dispersions are usually prepared by adding introducing the active compound into a sterile vehicle, which a basic dispersion medium and optionally further ingredients required contains. In the case of a sterile lyophilized powder for preparation sterile injectable solutions Vacuum drying and spray drying are preferred manufacturing processes with which a powder of the active ingredient and optionally further desired Ingredients obtained from a previously sterile filtered solution becomes. The right flowability a solution can be maintained by, for example, coating Lecithin, in the case of dispersions, the required particle size or maintains Surfactants used. An extended one Absorption of injectable compositions can be achieved by adding an agent which retards the absorption, for example monostearate salts and gelatin, in the composition.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können mit einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden, wenngleich für viele therapeutische Anwendungen die subkutane Injektion, intravenöse Injektion oder Infusion die bevorzugte Verabreichungsart darstellt. Der Fachmann weiß, dass Weg und/oder Art der Verabreichung vom gewünschten Resultat abhängen. Bestimmten Ausführungsformen zufolge kann die aktive Verbindung mit einem Träger zubereitet werden, der die Verbindung gegen rasche Freisetzung schützt, so zum Beispiel eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung, wozu Implantate, transdermale Pflaster und mikroverkapselte Abgabesysteme gehören. Es können biologisch abbaubare biokompatible Polymere verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Die Verfahren zur Zubereitung solcher Formulierungen sind dem Fachmann allgemein bekannt, siehe zum Beispiel Sustained und Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.The active ingredients according to the invention can by a variety of methods known to those skilled in the art, administered, although for many therapeutic applications subcutaneous injection, intravenous injection or infusion is the preferred route of administration. The expert White, that route and / or mode of administration depend on the desired result. certain embodiments according to the active compound can be prepared with a carrier, the the compound protects against rapid release, such as a formulation with controlled release, including implants, transdermal patches and microencapsulated delivery systems. It can be biodegradable biocompatible Polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, Collagen, polyorthoester and polylactic acid. The methods of preparation such formulations are well known to those skilled in the art, see for example, sustained and controlled release drug delivery systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Bestimmten Ausführungsformen zufolge kann ein erfindungsgemäßer Wirkstoff oral verabreicht werden, beispielsweise in einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren essbaren Träger. Der Wirkstoff (und gewünschtenfalls weitere Inhaltsstoffe) können auch in einer Hart- oder Weichgelatinekapsel eingeschlossen, zu Tabletten verpresst oder direkt der Nahrung zugesetzt werden. Für die orale therapeutische Verabreichung können die Wirkstoffe mit Exzipienten vermischt und in Form von schluckbaren Tabletten, Buccaltabletten, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups und dergleichen verwendet werden. Soll ein erfindungsgemäßer Wirkstoffe über einen anderen als den parenteralen Weg verabreicht werden, kann es erforderlich sein, eine Beschichtung aus einem Material zu wählen, das seine Inaktivierung verhindert.certain embodiments According to an inventive drug be administered orally, for example in an inert diluent or an assimilable edible carrier. The active substance (and, if desired other ingredients) also enclosed in a hard or soft gelatin capsule, too Tablets are compressed or added directly to the food. For the oral therapeutic administration the active ingredients are mixed with excipients and in the form of swallowable Tablets, buccal tablets, capsules, elixirs, suspensions, syrups and the like can be used. If an inventive active ingredients on a It may be necessary to administer it other than the parenteral route be to choose a coating of a material that its inactivation prevented.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Agenzien verabreicht werden, die bei der Behandlung der zuvor beschriebenen Erkrankungen brauchbar sind.The active ingredients according to the invention can together with one or more additional therapeutic agents administered in the treatment of those previously described Diseases are useful.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten in der Regel eine therapeutisch wirksame Menge oder eine prophylaktisch wirksame Menge wenigstens eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs. In Abhängigkeit von der gewünschten Behandlung, ob beispielsweise eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung gewünscht ist, können Dosierungspläne gewählt und angepasst werden. Beispielsweise kann man eine Einzeldosis, mehrere getrennte Dosen über die Zeit verteilt oder eine ansteigende bzw. sinkende Dosierung je nach den Anforderungen der therapeutischen Situation verabreichen. Es ist insbesondere von Vorteil, parentale Zusammensetzungen in Einheitsdosierungsform zu formulieren, um die Verabreichung zu erleichtern und eine Gleichförmigkeit der Dosierung zu gewährleisten.The pharmaceutical compositions of the present invention usually a therapeutically effective amount or a prophylactic effective amount of at least one active ingredient according to the invention. Dependent on from the desired Treatment, whether for example a therapeutic or prophylactic Treatment desired is, can dosing schedules chosen and adapted. For example, you can take a single dose, several separate doses over the time spread or an increasing or decreasing dosage administer according to the requirements of the therapeutic situation. It is particularly advantageous to use parenteral compositions in Formulate unit dosage form to facilitate administration and a uniformity to ensure the dosage.
Der behandelnde Arzt kann die für die jeweilige Therapie und den jeweiligen Wirkstoff am meisten geeignete Darreichungsform, Art der Verabreichung und Dosierung ohne weiteres bestimmen.Of the the attending physician may be the one for the most appropriate therapy and drug Dosage form, route of administration and dosage readily determine.
Eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs kann beispielsweise im Bereich von 0,1–20 mg/kg und vorzugsweise 1–10 mg/kg liegen, ohne darauf beschränkt zu sein. Natürlich können diese Mengen je nach Art und Schwere des zu lindernden Zustandes variieren.A therapeutically or prophylactically effective amount of an active ingredient according to the invention may, for example, in the range of 0.1-20 mg / kg and preferably 1-10 mg / kg lie without limitation to be. Naturally can these quantities depending on the nature and severity of the condition to be alleviated vary.
6.2 Vakzine6.2 vaccine
Die erfindungsgemäßen AGER-RME und Derivate/Äquivalente davon sind als Immunogen zur Vakzinierung eines zu behandelnden Patienten brauchbar.The AGER-RME according to the invention and derivatives / equivalents thereof are as immunogen for vaccination of a to be treated Patient useful.
Zu diesem Zweck brauchbare Vakzine stellen in der Regel eine pharmazeutische Zusammensetzung dar, die wenigstens ein erfindungsgemäßes AGER-RME und/oder wenigstens ein erfindungsgemäßes Derivat/Äquivalent davon enthält. Ferner kann die Zusammensetzung einen physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe, beispielsweise Immunstimulantien, enthalten.To Vaccines that are useful for this purpose are usually pharmaceutical Composition which is at least one inventive AGER RME and / or at least one derivative / equivalent according to the invention of which contains. Furthermore, the composition may be physiologically acceptable Carrier and optionally further excipients, for example immunostimulants, contain.
Während geeignete Träger im Prinzip beliebig gewählt werden können, richtet sich die Art des Trägers in der Regel nach dem Verabreichungsweg. So können die erfindungsgemäßen Vakzine insbesondere in einer zur parenteralen, beispielsweise intravenösen, intramuskulären und subkutanen Verabreichung geeigneten Form formuliert werden. In diesen Fällen beinhaltet der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs und/oder einen Puffer.While appropriate carrier basically chosen arbitrarily can be depends on the type of carrier in usually after the route of administration. Thus, the vaccines according to the invention especially in a parenteral, for example, intravenous, intramuscular and subcutaneous administration form suitable form. In these make includes the carrier preferably water, saline, Alcohol, a fat, a wax and / or a buffer.
Es können beliebige einer Vielzahl von Immunstimulantien in den erfindungsgemäßen Vakzinen verwendet werden. Beispielsweise kann ein Adjuvans mit einbezogen werden. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die das Antigen vor einem raschen Abbau schützen sollen, wie Aluminiumhydroxid oder ein Mineralöl, sowie ein von Lipid A, aus Bortadella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis abgeleitetes Protein. Geeignete Adjuvantien sind in der Regel kommerziell erhältlich, beispielsweise komplettes oder inkomplettes Freund-Adjuvans; AS-2; Aluminiumsalze, wie Aluminiumhydroxid (gegebenenfalls alas Gel) oder Aluminiumphosphat; Calcium-, Eisen- oder Zinksalze; eine unlösliche Suspension acylierten Tyrosins; acylierte Zucker; kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide; Polyphosphazene; biologisch abbaubare Mikrosphären; Monophosphoryl-Lipid A. Cytokine, wie GM-CSF oder Interleukin-2, -7 oder -12 können ebenfalls als Adjuvantien verwendet werden.It can any of a variety of immunostimulants in the vaccines of the invention be used. For example, an adjuvant may be included become. Most adjuvants contain a substance that the Protect antigen from rapid degradation, such as aluminum hydroxide or a mineral oil, as well as one of lipid A, from Bortadella pertussis or Mycobacterium tuberculosis-derived protein. Suitable adjuvants are in usually available commercially, for example, complete or incomplete Freund's adjuvant; AS-2; Aluminum salts, such as aluminum hydroxide (optionally gel) or aluminum phosphate; Calcium, iron or zinc salts; an insoluble suspension acylated tyrosine; acylated sugars; cationic or anionic derivatized polysaccharides; polyphosphazenes; biodegradable Microspheres; Monophosphoryl lipid A. cytokines, such as GM-CSF or interleukin-2, -7 or -12 can also be used as adjuvants.
7. Therapieverfahren7. Therapy procedure
7.1 AGER assoziierte Erkrankungen7.1 AGER Associated Diseases
Erfindungsgemäß werden die Voraussetzungen für Diagnose und oder Therapie „AGER-assoziierter" Erkrankungen verbessert bzw. erstmals geschaffen. „Ager assioziierte" Erkrankungen sind insbesondere solche, die mit einer AGER/AGER-, AGER/Ligand-, AGER/Rezeptor-, AGER/Rezeptor/Ligand-, AGER/Rezeptor/Co-Rezeptor- und/oder AGER/Rezeptor/Counter-Rezeptor-Wechselwirkung assoziiert sind. „Ager-assoziierte" Erkrankungen können zudem durch eine vermehrte Expression oder sonstige Bildung von AGER oder AGER-Liganden charakterisiert sein.According to the invention the requirements for Diagnosis and / or treatment of "AGER-associated" diseases improved or first created. "Ager Associated "diseases are in particular those associated with an AGER / AGER, AGER / ligand, AGER / receptor, AGER / receptor / ligand, AGER / receptor / co-receptor and / or AGER / receptor / counter-receptor interaction are associated. "Ager-associated" diseases can also be by increased expression or other formation of AGER or AGER ligands be characterized.
Als
AGER-assoziierte Erkrankungen sind insbesondere die folgenden in
der WO 2004/016229 genannten und/oder in der Literatur beschriebenen
Krankheiten zu nennen:
Amyloidosen, Krebs, Arthritis, Crohn'sche Erkrankung,
chronische inflammatorische Erkrankungen, akute inflammatorische
Erkrankungen (Schmidt AM et al: J Clin Invest. 2001 Oct;108(7):949-55.),
kardiovaskuläre
Erkrankungen, Diabetes, Diabeteskomplikationen (Yan SD et al: Eur
J Clin Invest. 1997 Mar;27(3):179-81), Prion-assoziierte Erkrankungen
(Sasaki N et al:Neurosci Lett. 2002 Jun 28;326(2):117-20), Vaskularitis,
Nephropathien, Retinopathien und Neuropathien (Thornalley PJ.:Int
Rev Neurobiol. 2002;50:37-57.). Alzheimer (Weldon DT et al: Geriatrics.
1997 Sep;52 Suppl 2:S13-6; Yan SD et al: Biochim Biophys Acta. 2000
Jul 26;1502(1):145-57), rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis (Drinda
S et al:.Rheumatol Int. 2004 Mar 26), Bowel Disease (Foell D et
al:Gut. 2003 Jun;52(6):847-53), multiple Sklerose (Yan SS et al:Nat
Med. 2003 Mar;9(3):287-93.), Psoriasis (Foell D et al: Rheumatology
(Oxford). 2003 Nov;42(11):1383-9.), Lupus (Tanji N et al:J Am Soc
Nephrol. 2000 Sep;11(9):1656-66.),
Autoimmunerkrankungen im allgemeinen, Sepsis (Liliensiek B et al:J
Clin Invest. 2004 Jun;113(11):1641-50), Arteriosklerose und Restenose
(Schmidt AM et al: Circ Res. 1999 Mar 19;84(5):489-97.).AGER-associated diseases are in particular the following diseases mentioned in WO 2004/016229 and / or described in the literature:
Amyloidoses, cancer, arthritis, Crohn's disease, chronic inflammatory diseases, acute inflammatory diseases (Schmidt AM et al .: J Clin Invest 2001 Oct; 108 (7): 949-55), cardiovascular disease, diabetes, diabetic complications (Yan Eur et al: Eur J Clin Invest, 1997 Mar; 27 (3): 179-81), Prion-associated diseases (Sasaki N et al: Neurosci Lett., 2002 Jun 28; 326 (2): 117-20), vascular ulcer , Nephropathies, retinopathies and neuropathies (Thornalley PJ. Int Rev Neurobiol. 2002; 50: 37-57). Alzheimer's (Weldon DT et al: Geriatrics 1997 Sep; 52 Suppl 2: S13-6; Yan SD et al: Biochim Biophys Acta 2000 Jul 26; 1502 (1): 145-57), rheumatoid arthritis, osteoarthritis (Drinda S et al: Rheumatol Int 2004 Mar 26), Bowel Disease (Foell D et al: Good, 2003 Jun; 52 (6): 847-53), multiple sclerosis (Yan SS et al: Nat Med., 2003, Mar. 9 (3): 287-93), psoriasis (Foell D et al: Rheumatology (Oxford), 2003 Nov; 42 (11): 1383-9), Lupus (Tanji N et al: J Am Soc Nephrol 2000 Sep ; 11 (9): 1656-66.), Autoimmune diseases in general, sepsis (Liliensiek B et al .: J Clin Invest., 2004 Jun; 113 (11): 1641-50), arteriosclerosis and restenosis (Schmidt AM et al: Circ Res. 1999 Mar 19; 84 (5): 489-97.).
7.2 Therapieansätze7.2 Therapeutic approaches
Erfindungsgemäße Therapieansätze basieren auf der modulierenden Wirkung wenigstens eines der oben genannten therapeutischen Agenzien auf eine mit der zu behandelnden Erkrankung assoziierten Wechselwirkung des Typs: AGER/AGER, AGER/Ligand, AGER/Rezeptor, AGER/Rezeptor/Ligand, AGER/Rezeptor/Co-Rezeptor oder AGER/Rezeptor/Counter-Rezeptor.Therapeutic approaches according to the invention are based on the modulating effect of at least one of the above therapeutic agents on one with the disease to be treated associated interaction of the type: AGER / AGER, AGER / ligand, AGER / receptor, AGER / receptor / ligand, AGER / receptor / co-receptor or AGER / receptor / counter receptor.
Der bei der erfindungsgemäß durchgeführten Therapie zu beobachtende therapeutische Effekt kann dabei auf einer agonistischen, partiell agonistischen, antagonistischen oder invers agonistischen Wirkung auf wenigstens eine dieser Wechselwirkungen beruhen.Of the in the therapy carried out according to the invention therapeutic effect to be observed may be on an agonistic, partially agonistic, antagonistic or inverse agonistic Effect on at least one of these interactions based.
Insbesondere kann dabei die therapeutische Wirkung beruhen auf:
- a) der Induktion, teilweisen Hemmung oder vollständigen Unterbrechung eines Signalweges; und/oder
- b) der Bildung von durch den Körper besser eliminierbaren oder physiologisch/pathophysiologisch unwirksamen Kompexstrukturen.
- a) the induction, partial inhibition or complete disruption of a signaling pathway; and or
- b) the formation of more easily eliminable by the body or physiologically / pathophysiologically ineffective Kompexstrukturen.
B. DiagnostizierverfahrenB. Diagnostic procedure
Als diagnostische Agenzien sind erfindungsgemäß insbesondere AGER-RME und Derivate/Äquivalente gemäß obiger Definition sowie anti-AGER-RME-Antikörper zu nennen.When Diagnostic agents according to the invention are in particular AGER-RME and Derivatives / equivalents according to the above Definition as well as anti-AGER-RME antibodies.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher insbesondere die verbesserte qualitative oder quantitative Bestimmung oben definierter Krankheitszustände durch Nachweis krankheitstypischer Antigene oder Antikörper.The present invention enables hence, in particular, the improved qualitative or quantitative determination above defined disease states by detection of disease-typical antigens or antibodies.
Die Bestimmung erfolgt vorzugsweise mit immunologischen Methoden. Prinzipiell kann dies mit jedem analytischen bzw. diagnostischen Testverfahren erfolgen, bei dem Antikörper eingesetzt werden. Hierzu gehören Agglutinations- und Präzipitations-Techniken, Immunoassays, immunhistochemische Verfahren und Immunoblot-Techniken, z.B. Western-Blotting oder Dot Blot-Verfahren. Auch in vivo-Verfahren gehören dazu, beispielsweise bildgebende Verfahren.The Determination is preferably carried out by immunological methods. in principle This can be done with any analytical or diagnostic test procedure take place, in which antibody be used. These include Agglutination and precipitation techniques, immunoassays, immunohistochemical and immunoblot techniques, e.g. Western blotting or Dot blot method. Also in vivo methods include, for example, imaging Method.
Von Vorteil ist der Einsatz in Immunoassays. Geeignet sind sowohl kompetitive Immunoassays, d.h. Antigen und markiertes Antigen (Tracer) konkurrieren um die Antikörperbindung, als auch Sandwich-Immunoassays, d.h. die Bindung spezifischer Antikörper an das Antigen wird mit einem zweiten, meist markierten Antikörper nachgewiesen. Diese Assays können sowohl homogen, d.h. ohne eine Trennung in feste und flüssige Phase, als auch heterogen sein, d.h. gebundene Markierungen werden von ungebundenen getrennt, beispielsweise über Festphasen-gebundene Antikörper. Die verschiedenen heterogenen und homogenen Immunoassay-Formate können je nach Markierung und Meßmethode bestimmten Klassen zugeordnet werden, beispielsweise RIAs (Radioimmunoassays), ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), FIA (Fluoreszenz-Immunoassay), LIA (Lumineszenz-Immunoassay), TRFIA (zeitlich aufgelöster FIA), IMAC (Immunaktivierung), EMIT (Enzyme multiplied immune test), TIA (Turbodimetrischer Immunoassay), I-PCR (Immuno-PCR).From Advantage is the use in immunoassays. Suitable are both competitive Immunoassays, i. Antigen and labeled antigen (tracer) compete to antibody binding, as well as sandwich immunoassays, i. the binding of specific antibodies the antigen is detected with a second, mostly labeled antibody. These assays can both homogeneous, i. without a separation into solid and liquid phase, as well as being heterogeneous, i. bound marks are from unbound separately, for example via solid phase-bound antibodies. The Different heterogeneous and homogeneous immunoassay formats can ever according to marking and measuring method assigned to certain classes, for example RIAs (radioimmunoassays), ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), FIA (fluorescence immunoassay), LIA (luminescence immunoassay), TRFIA (time-resolved FIA), IMAC (immune activation), EMIT (enzymes multiplied immune test), TIA (Turbidimetric immunoassay), I-PCR (Immuno-PCR).
Zur erfindungsgemäßen Antigen-Bestimmung sind kompetitive Immunoassays bevorzugt. Dabei konkurriert markiertes Antigen (Tracer) mit dem zu quantifizierenden Antigen der Probe um die Bindung an den verwendeten Antikörper. Aus der Menge des verdrängten Tracers lässt sich mit Hilfe einer Standardkurve die Antigenmenge, sprich die Antigenmenge, in der Probe bestimmen.to antigen determination according to the invention competitive immunoassays are preferred. Marked competes Antigen (tracer) with the antigen of the sample to be quantified to bind to the antibody used. From the crowd of displaced tracers let yourself using a standard curve, the amount of antigen, that is, the amount of antigen, in the sample.
Von den für diese Zwecke zur Verfügung stehenden Markierungen haben sich Enzyme als vorteilhaft erwiesen. Beispielsweise können Systeme auf Basis von Peroxidasen, insbesondere der Meerrettich-Peroxidase, der alkalischen Phosphatase und der β-D-Galactosidase, verwendet werden. Für diese Enzyme stehen spezifische Substrate zur Verfügung, deren Umsetzung sich z.B. photometrisch verfolgen lässt. Geeignete Substratsysteme basieren auf p-Nitrophenylphosphat (p-NPP), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium (BCIP/NPT), Fast-Red/Naphthol-AS-TS-Phosphat für die alkalische Phosphatase; 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS), o-Phenylendiamin (OPT), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB) und 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon (MBTH) für Peroxidasen; o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (o-NPG), p-Nitrophenyl-β-D-Galactosid und 4-Methylumbelliphenyl-β-D-galactosid (MUG) für die β-D-Galactosidase. Diese Substratsysteme sind in vielen Fällen in gebrauchsfertiger Form kommerziell erhältlich, beispielsweise in Form von Tabletten, die auch weitere Reagenzien, wie zweckmäßige Puffer und ähnliches enthalten können.From the for these purposes available standing markers, enzymes have proven to be advantageous. For example, you can Systems based on peroxidases, in particular horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and β-D-galactosidase. For this Enzymes are specific substrates available, their implementation is e.g. can be followed photometrically. Suitable substrate systems are based on p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitro blue tetrazolium (BCIP / NPT) Fast-Red / Naphthol AS-TS Phosphate for Alkaline Phosphatase; 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), o-phenylenediamine (OPT), 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), o-dianisidine, 5-aminosalicylic acid, 3-dimethylaminobenzoic acid (DMAB) and 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH) for peroxidases; o-nitrophenyl-β-D-galactoside (o-NPG), p-nitrophenyl-β-D-galactoside and 4-Methylumbelliphenyl-β-D-galactoside (MUG) for the β-D-galactosidase. These substrate systems are in many cases ready to use commercially available, for example in the form of tablets which also contain other reagents, as appropriate buffers and similar can contain.
Die Kopplung von Markierungen an Peptide oder Antikörper zur Herstellung von Tracern kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Darüber hinaus stehen eine Reihe zur Konjugation an Proteine zweckmäßig modifizierte Markierungen zur Verfügung, beispielsweise Biotin-, Avidin-, Extravidin- oder Streptavidin-konjugierte Enzyme, Maleimid-aktivierte Enzyme und ähnliches. Diese Markierungen können direkt mit dem erfindungsgemäß zu verwendenden Molekül umgesetzt werden.The Coupling of labels to peptides or antibodies for the production of tracers can be done in a conventional manner. In addition, stand a number labels suitably modified for conjugation to proteins to disposal, For example, biotin, avidin, extravidin or streptavidin-conjugated Enzymes, maleimide-activated enzymes and the like. These marks can directly with the invention to be used molecule be implemented.
Wird ein heterogenes Immunoassay-Format gewählt, so kann der Antigen-Antikörper-Komplex zwecks Trennung beispielsweise über einen an den Träger gekoppelten antiidiotypischen Antikörper, z.B. einen gegen Kaninchen-IgG gerichteten Antikörper, an den Träger gebunden werden. Träger, insbesondere Mikrotiterplatten, die mit entsprechenden Antikörpern beschichtet sind, sind bekannt und kommerziell erhältlich.If a heterogeneous immunoassay format is chosen, then the antigen-antibody complex for the purpose of separation, for example, be bound to the carrier via an antiidiotypic antibody coupled to the carrier, eg an antibody directed against rabbit IgG. Carriers, in particular microtiter plates coated with appropriate antibodies, are known and commercially available.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Immunoassay-Sets mit wenigstens einem vorstehend beschriebenen Antikörper und weiteren Komponenten. Es handelt sich hierbei um eine Zusammenstellung, in der Regel als Verpackungseinheit, von Mitteln zur Durchführung einer erfindungsgemäßen AGER-Bestimmung. Zwecks möglichst einfacher Handhabung werden diese Mittel vorzugsweise im wesentlichen gebrauchsfertig bereitgestellt. Eine vorteilhafte Anordnung bietet den Immunoassay in Kit-Form an. Ein Kit umfasst in der Regel mehrere Behältnisse zur getrennten Anordnung von Komponenten. Alle Komponenten können in gebrauchsfertiger Verdünnung, als Konzentrat zum Verdünnen oder als Trockensubstanz oder Lyophilisat zum Lösen oder Suspendieren bereitgestellt werden; einzelne oder sämtliche Komponenten kön nen eingefroren sein oder bei Umgebungstemperatur bis zum Gebrauch aufbewahrt werden. Seren sind vorzugsweise schockgefroren, beispielsweise bei –20°C, so dass in diesen Fällen ein Immunoassay vor Gebrauch vorzugsweise bei Gefriertemperaturen zu hatten ist.One Another object of the present invention are immunoassay sets with at least one antibody described above and other components. This is a compilation, usually as a packaging unit, by means of carrying out a AGER determination according to the invention. For the most part possible easy handling, these agents are preferably substantially ready to use. An advantageous arrangement offers the immunoassay in kit form. A kit usually includes several containers for separate arrangement of components. All components can work in ready-to-use dilution, as a concentrate for dilution or as a dry substance or lyophilizate for dissolving or suspending become; single or all Components can be frozen be stored at ambient temperature until use. Sera are preferably snap frozen, for example at -20 ° C, so that in these cases an immunoassay before use preferably at freezing temperatures was to have.
Weitere, dem Immunoassay beigefügte Komponenten können sein: Standardprotein, Tracer; Kontrollserum, Mikrotiterplatten, vorzugsweise mit Antikörper beschichtet, Puffer, beispielsweise zum Testen, zum Waschen oder zur Umsetzung des Substrats, und das Enzymsubstrat selbst.Further, attached to the immunoassay Components can be: standard protein, tracer; Control serum, microtiter plates, preferably with antibody coated, buffer, for example for testing, for washing or for the reaction of the substrate, and the enzyme substrate itself.
Allgemeine Prinzipien von Immunoassays und die Erzeugung und Verwendung von Antikörpern als Hilfsmittel in Labor und Klinik finden sich beispielsweise in Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E., and Lane, D., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).General Principles of Immunoassays and the Generation and Use of antibodies as an aid in the laboratory and clinic can be found, for example, in Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E., and Lane, D., Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).
9. Screening-Verfahren9. Screening procedure
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zum Nachweis von Effektoren des AGER-Rezeptors, wobei man eine Probe, in der man einen Effektor vermutet, mit einem AGER-RME-Polypeptid inkubiert und den Ansatz auf die Bildung eines Effektor-AGER-RME-Komplexes untersucht.object The invention also provides methods for detecting effectors of the invention AGER receptor, taking a sample in which one has an effector suspected to be incubated with an AGER-RME polypeptide and the batch on the formation of an effector-AGER-RME complex examined.
Derartige Effektoren können eine agonistische, partiell agonistische, antagonistische oder invers agonistische Wirkung besitzen. Es können dies z.B. synthetische niedermolekulare Supstanzen, synthetische Peptide, natürliche oder synthetische Antikörpermoleküle oder Naturstoffe sein.such Effectors can an agonistic, partially agonistic, antagonistic or inverse possess agonistic effect. This may be e.g. synthetic Low molecular weight suppression, synthetic peptides, natural or synthetic antibody molecules or Be natural substances.
Solche erfindungsgemäßen Verfahren werden in der Regel als in vitro-Screening-Verfahren durchgeführt, mit denen man aus einer Vielzahl verschiedener Substanzen diejenigen auslesen kann, die im Hinblick auf eine künftige Anwendung am aussichtsreichsten zu sein scheinen.Such inventive method are usually performed as an in vitro screening method, with which one from a Variety of different substances can read those who with a view to a future Application seems to be the most promising.
Beispielsweise können mittels kombinatorischer Chemie umfangreiche Stoffbanken angelegt werden, die eine Vielzahl potentieller Wirkstoffe umfassen. Das Durchmustern kombinatorischer Substanzbibliotheken nach Stoffen mit gewünschter Aktivität ist automatisierbar. Screening-Roboter dienen der effizienten Auswertung der vorzugsweise auf Mikrotiterplatten angeordneten Einzelassays. So betrifft die vorliegende Erfindung auch Screening-Verfahren, d.h. sowohl Primär- als auch Sekundärscreening-Verfahren, bei denen vorzugsweise wenigstens eines der nachfolgend beschriebenen Verfahren zur Anwendung kommt. Kommen mehrere Verfahren zur Anwendung, so kann das zeitlich versetzt oder gleichzeitig an ein und derselben Probe oder an verschiedenen Proben einer zu untersuchenden Substanz geschehen.For example can Comprehensive material banks created by means of combinatorial chemistry which include a variety of potential agents. The Screening combinatorial substance libraries for substances with desired activity is automatable. Screening robots are used for efficient evaluation preferably arranged on microtiter plates single assays. Thus, the present invention also relates to screening methods, i.e. both primary as well as secondary screening methods in which preferably at least one of the methods described below is used. If several methods are used, then can do this at the same time or at one and the same time Sample or on different samples of a substance to be examined happen.
Eine effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist der im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte Scintillation Proximity Assay, kurz SPA genannt. Kits und Komponenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei Amersham Pharmacia Biotech. Im Prinzip werden solubilisierte oder membrangebundene Rezeptoren auf Szintillationssubstanz enthaltenden, kleinen Fluoromikrosphären immobilisert. Bindet beispielsweise ein Radioligand an die immobilisierten Rezeptoren, so wird die Szintillationssubstanz zur Lichtemission angeregt, da die räumliche Nähe zwischen Szintillationssubstanz und Radioligand gegeben ist.A effective technology to carry out Such method is in the field of drug screening known Scintillation Proximity Assay, called SPA for short. Kits and Components for implementation this assays can commercially available, for example, Amersham Pharmacia Biotech. In principle, solubilized or membrane bound Receptors on Szintillationssubstanz containing small Fluoromikrosphären immobilisert. For example, binds a radioligand to the immobilized receptors, Thus, the scintillation substance is excited to emit light, since the spatial Proximity between scintillant substance and radioligand is given.
Eine weitere effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist die im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte FlashPlateR-Technologie. Kits und Komponenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei NEN Life Science Products. Dieses Prinzip basiert ebenfalls auf Mikrotiterplatten (96er oder 384er), die mit Scintillationssubstanz beschichtet sind.A another effective technology for carrying out such processes is the popular FlashPlateR technology in drug screening. Kits and components to carry out this assays can commercially available, for example, at NEN Life Science Products. This principle is also based on microtiter plates (96er or 384) coated with scintillant.
Screeningverfahren unter Verwendung des hierin beschriebenen Actin Cytoskeletal Rearrangement (ACR) Assays sind ebenfalls anwendbar.screening process using the Actin Cytoskeletal Rearrangement (ACR) described herein Assays are also applicable.
Die nach diesen Verfahren identifizierbaren Substanzen oder Teile aus Substanzgemischen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.The identifiable substances or parts according to these methods Substance mixtures are also the subject of the present invention.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf folgende nichtlimitierende Herstellungs- und Anwendungsbeispiele näher erläutertThe Invention will now be described with reference to the following non-limiting Manufacturing and Application examples closer explained
Experimenteller TeilExperimental part
1. Allgemeine Angaben1. General information
II.HerstellungsbeispieleII.Herstellungsbeispiele
Herstellungsbeispiel 1: Herstellung von AP-Nogo66Production Example 1 Production of AP-Nogo66
a) Klonierung des Nogo66 Fragments von hNogoAa) Cloning of Nogo66 Fragments of hNogoA
Es
wurde ausgegangen von der publizierten hNogoA Sequenz (NCBI): AF148537.
Die beiden folgenden synthetischen Oligonukleotide wurden von der
publizierten Sequenz abgeleitet:
Mez 402: GCCACCATGAGGATATACAAGGGTGTGATCC (SEQ ID NO:9);
Oligo ab Aminosäure
R1055 (kursiv) mit Start ATG (unterstrichen) und Kozak Sequenz (fett)
Mez
404: CTTCAGAGAATCAACTAAATCATC (SEQ ID NO:10); Oligo bis Aminosäure K1120
(fett)It was assumed that the published hNogoA sequence (NCBI): AF148537. The following two synthetic oligonucleotides were derived from the published sequence:
Mez 402: GCCACC ATG AGGATATACAAGGGTGTGATCC (SEQ ID NO: 9); Oligo from amino acid R1055 (italics) with start ATG (underlined) and Kozak sequence (bold)
Mez 404: CTTCAGAGAATCAACTAAATCATC (SEQ ID NO: 10); Oligo to amino acid K1120 (bold)
Mit diesen beiden Oligos wurde in frontal cortex cDNA als Template (hergestellt mit Superscript first strand synthesis system for RT-PCR; Invitrogen, Carlsbad, CA) (Novak et al., Brain Res. Mol. Brain, 2002, 107(2): 183-189) eine PCR durchgeführt. Die Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit Herculase (Stratagene, La Jolla, USA), durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Grösse von 207 bp wurde mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das amplifizierte, gereinigte Fragment wurde in pcDNA3.1V5-His TOPO (pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit, #K4800-01) gesetzt. Mit dem so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1V5-His hNOGO66 wurden E.coli TOP10 Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)) beschrieben, transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Antibiotikum Ampicillin erreicht.With These two oligos were prepared in frontal cortex cDNA template (produced with Superscript first strand synthesis system for RT-PCR; Invitrogen, Carlsbad, CA) (Novak et al., Brain Res. Mol. Brain, 2002, 107 (2): 183-189) performed a PCR. The reaction was carried out by standard method, as described by Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) Herculase (Stratagene, La Jolla, USA). The obtained DNA fragment with one size of 207 bp was mixed with the QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. The amplified, purified Fragment was transformed into pcDNA3.1V5-His TOPO (pcDNA3.1 / V5-His TOPO TA expression Kit, # K4800-01). With the resulting construct pcDNA3.1V5-His hNOGO66 was detected by E. coli TOP10 cells (Invitrogen, Carlsbad, CA) Standard methods as in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Selection for plasmid-carrying cells was by the antibiotic Achieved ampicillin.
Die Identifikation von neun Klonen mittels PCR zeigte bei drei Klonen eine Bande in der richtigen Größe von 207 bp. Die Richtigkeit der Sequenz wurde durch Sequenzanalyse überprüft.The Identification of nine clones by PCR showed in three clones a gang in the right size of 207 bp. The correctness of the sequence was checked by sequence analysis.
Die
kodierende Nogo66-Sequenz wurde mit Xbal aus obigem Plasmid pcDNA3.1V5-His hNOGO66 herausgeschnitten
und in das Plasmid pAP-tag5 (GenHunter Cooperation, Nashville, TN,
USA) über
Xbal einkloniert. Man erhält
das Plasmid pAP-tag5/PPC/hNOGO66
Nr.5. (SEQ ID NO:11) dargestellt in
b) Herstellung der stabilen Zelllinie:b) Preparation of the stable Cell line:
HEK293 Zellen wurden in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum unter Zusatz von Penicillin/Streptomycin) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Für die Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 6 Kavitäten (1 × 106 pro Well) ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Cocktail, der 1 μg Plasmid DNA (pAP-tag5/PPC/hNOGO66 Nr.5) und 3μl Fugene6 (ROCHE Diagnostics, Mannheim) enthielt, nach Angaben der Herstellers transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin abgelöst, in eine Zellkulturflasche mit 175cm2 Grundfläche überführt und die Selektion durch Zugabe von 150μg/ml Zeocin in Wachstumsmedium gestartet. Heranwachsende Zeocin-resistente Zellkolonien wurden nach etwa 4 Wochen mit Trypsin abgelöst und mit einem Zellsorter in 96-well Platten vereinzelt. Nach etwa drei Wochen wurde ein Aliqout des Mediumüberstands der herangewachsenen Einzellzellkolonien, deren Konfluenz zu diesem Zeitpunkt zwischen 5 und 85% abgeschätzt wurde, auf Nitrozellulose pipettiert. Durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitroblau-Tetrazoliumsalz) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) wurde die Proteinexpression über die Aktivität der Alkalischen Phosphatase anhand der entstehenden Färbung nachgeweisen.HEK293 cells were cultured in growth medium (DMEM with 10% fetal bovine serum with the addition of penicillin / streptomycin) at 37 ° C and 5% CO 2 . For transfection, the cells were seeded in 6- well plates (1 x 10 6 per well) and incubated overnight. Cells were transfected with a cocktail containing 1 μg of plasmid DNA (pAP-tag5 / PPC / hNOGO66 # 5) and 3 μl of Fugene6 (ROCHE Diagnostics, Mannheim) according to the manufacturer's instructions. Two days later, cells were detached by treatment with trypsin, transferred to a 175 cm 2 cell culture flask, and selection started by adding 150 μg / ml Zeocin in growth medium. Adolescent zeocin-resistant cell colonies were detached after about 4 weeks with trypsin and separated with a cell sorter in 96-well plates. After about three weeks, an aliquot of the medium supernatant of the grown single cell colonies whose confluence was estimated to be between 5 and 85% at this time was pipetted onto nitrocellulose. By adding a solution of NBT (nitroblue tetrazolium salt) and BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), the protein expression was monitored by the activity of the alkaline phosphatase on the basis of the resulting color point.
c) Expression von AP-Nogo66:c) Expression of AP-Nogo66:
Ein HEK293 Klon (Klon Nr. 5), welcher AP-Nogo66 produziert, wurde in Kulturmedium (RPMI Glutamax +10% FCS, 150 μg/ml Zeocin, Antibiotic/Antimycotic) durch mehrmalige Passage (ca. 20) in Kulturflaschen vermehrt. Die AP-Nogo66 Expression wurde nach jeder zweiten oder dritten Passage im Dot Blot Test (mit NBT/BCIP Reagens) überprüft.One HEK293 clone (clone # 5), which produces AP-Nogo66, has been introduced into Culture medium (RPMI glutamax + 10% FCS, 150 μg / ml zeocin, antibiotic / antimycotic) multiplied by repeated passage (about 20) in culture bottles. The AP-Nogo66 expression was after every second or third passage checked in dot blot test (with NBT / BCIP reagent).
Um AP-Nogo66 in Serum-freiem Medium zu produzieren wurden die Zelle zunächst bis fast zur Konfluenz in Triple-Flasks kultiviert, dann erfolgte ein Mediumwechsel zu Expressionsmedium (Pro293a – CDM Medium (Biowhittaker; # 12-764Q), 2mM Glutamin, Antibiotic/Antimycotic). Daraufhin wurden die Zellen 3–4 Tage bei 37 °C kultiviert, die Überstände wurden abgenommen und abzentrifugiert (1500 Upm, 5 min). Die Überstände wurden bei –80°C gesammelt. Zur weiteren Verarbeitung wurden sie aufgetaut, mit Proteinaseinhibitoren (PMSF 0,1 mM, Pefabloc SC 1 mM) versetzt und in Amicon Tubes (Millipore) aufkonzentriert und die AP-Nogo66 Konzentration wurde bestimmt (ca. 3 μg/ml) (Mw von monomerer AP: 67 kDa und monomerem AP-Nogo66 etwa. 75 kDa in SDS Gelen).Around AP-Nogo66 in serum-free medium to produce were the cell first until almost confluence cultivated in triple flasks, then took place a medium change to expression medium (Pro293a - CDM medium (Biowhittaker; # 12-764Q), 2mM glutamine, antibiotic / antimycotic). Thereupon were the cells are 3-4 days at 37 ° C cultured, the supernatants were removed and centrifuged (1500 rpm, 5 min). The supernatants were collected at -80 ° C. For further processing, they were thawed with proteinase inhibitors (PMSF 0.1 mM, Pefabloc SC 1 mM) and in Amicon Tubes (Millipore). concentrated and the AP-Nogo66 concentration was determined (ca. 3 μg / ml) (Mw of monomeric AP: 67 kDa and monomeric AP-Nogo66 about 75 kDa in SDS gels).
Der AP-Nogo66-Pool wurde mit anti-AP-Agarose immunopräzipitiert. Das Präzipitat wurde durch 10-minütiges Erhitzen bei 95°C in Gegenwart von 5% Mercaptoethanol denaturiert und so von den Agarose Beads entfernt, schließlich durch Westen-Analyse mittels Antikörpern mit Spezifität für AP und Nogo66 verifiziert. Durch Gelchromatographie (Superose 12, Amersham Biosciences. Laufmittel: 20 mM Natriumphosphat, 140 mM Natriumchlorid, pH 7.4) wurde bestimmt, dass AP-Nogo66 als Dimer läuft und ein Mw von etwa 140 kDa aufweist. In Vorversuchen wurde festgestellt, dass AP-Nogo66, nicht aber GST-Nogo66 funktionell aktiv war. Es wird daher vermutet, dass NgR-Liganden womöglich als Dimer vorliegen müssen, um funtionell zu sein. Wie die Kristallstruktur der Alkalischen Phosphatase zeigt, wird die Dimerisierung vom AP-Tag induziert (Versuche nicht gezeigt).Of the AP-Nogo66 pool was immunoprecipitated with anti-AP agarose. The precipitate was through 10-minute Heating at 95 ° C denatured in the presence of 5% mercaptoethanol and so from the agarose beads removed, finally by West analysis using antibodies with specificity for AP and Nogo66 verified. By gel chromatography (Superose 12, Amersham Biosciences. Eluent: 20 mM sodium phosphate, 140 mM sodium chloride, pH 7.4) it was determined that AP-Nogo66 runs as a dimer and has a Mw of about 140 kDa. In preliminary tests it was determined that AP-Nogo66, but not GST-Nogo66 was functionally active. It is therefore assumed that NgR ligands might be must be present as dimer, to be funtional. Like the crystal structure of the alkaline Phosphatase shows, the dimerization of the AP-day is induced (experiments Not shown).
Herstellungsbeispiel 2: Herstellung von rekombinanten HEK-Zelllinien zur Durchführung des funktionellen Aktin Cytoskeletal Rearrangement (ACR) AssayProduction Example 2 Production of recombinant HEK cell lines for carrying out the functional actin cytoskeletal rearrangement (ACR) assay
1. Herstellung der erforderlichen Konstrukte1. Preparation of the required constructs
a) Klonierung von hp75;
Herstellung von pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr.16 (
Es
wurde von den publizierten Sequenzen für humanes p75 ausgegangen:
NM_002507; M14764 (die beide 100% identisch sind). Die folgenden
Oligonukleotide wurden von der publizierten Sequenz abgeleitet:
Mey
36: GCCACCATGGGGGCAGGTGCCACC (SEQ ID NO:13); Oligo mit Start-Codon (fett) mit
Kozak Sequenz (kursiv)
Mey 35: TCACACTGGGGATGTGGCAG (SEQ ID NO:12); Oligo mit
Stop Codon (fett) ein Basenaustausch T statt C (unterstrichen) da
das Oligo von der publizierten Ratten Sequenz abgeleitet ist
Mey
71: GCAGCCCCATCAGTCCGC (SEQ ID NO:14); Oligo beginnend 64 Basenpaare
vor Start ATGIt was assumed that the published sequences for human p75: NM_002507; M14764 (both 100% identical). The following oligonucleotides were derived from the published sequence:
Mey 36: GCCACCATGGGGGCAGGTGCCACC (SEQ ID NO: 13); Oligo with start codon (bold) with Kozak sequence (italics)
Mey 35: TCACAC T GGGGATGTGGCAG (SEQ ID NO: 12); Oligo with stop codon (bold) a base exchange T instead of C (underlined) since the oligo is derived from the published rat sequence
Mey 71: GCAGCCCCATCAGTCCGC (SEQ ID NO: 14); Oligo starting 64 base pairs before launch ATG
Anschließend wurde eine PCR (analog zu Nogo 66 Klonierung, Beispiel 1) mit dem Primerpaar Mey 35171 in cDNA aus der Zelllinie SH-SY5Y (humane Neuroblastomazellinie ATCC # CRL-2266) durchgeführt. Die PCR mit Mey35/71 lieferte ein 1348 bp Fragment. Dieses wurde gereinigt.Subsequently was a PCR (analogous to Nogo 66 cloning, Example 1) with the primer pair Mey 35171 in cDNA from the cell line SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line ATCC # CRL-2266). The PCR with Mey35 / 71 yielded a 1348 bp fragment. This was cleaned.
Eine anschließende PCR mit dem Primerpaar Mey 35/36 im Mey 35/71-Fragment ergab eine deutliche Bande (Fragmentgröße: 1284 bp). Diese wurde gereinigt. Dann wurde diese Bande in pcDNA3.1/V5-His TOPO Vector (SEQ ID NO:15) (pcDNA3.1(V5-His)TOPO TA Expression Kit Invitrogen #K4800-01) ungeschnitten eingesetzt (Prinzip Topoisomerase) Mit dem so erhaltenen Konstrukt (pcDNA3.1 hp75) wurden TOP10 Zellen nach Standardmethoden (analog zu Nogo 66 Klonierung, Beispiel 1) transformiert.A subsequent PCR with the primer pair Mey 35/36 in the Mey 35/71 fragment gave a distinct band (fragment size: 1284 bp). This was cleaned. Then this band was in pcDNA3.1 / V5-His TOPO Vector (SEQ ID NO: 15) (pcDNA3.1 (V5-His) TOPO TA Expression Kit Invitrogen # K4800-01) used uncut (principle topoisomerase) with The resulting construct (pcDNA3.1 hp75) became TOP10 cells by standard methods (analogous to Nogo 66 cloning, Example 1) transformed.
13
Klone dieser Transformation wurden überprüft und vier Klone mit der richtigen
Orientierung (Nr.13, 15, 16 und 18) konnten identifiziert werden.
Klon Nr16 wurde weiter verwendet. Die Sequenz des enthaltenen Konstruktes
(pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr.16; vgl. auch
b) Herstellung von pIRES hp75b) Preparation of pIRES hp75
Plasmid pIRES (Clontech, Palo Alto, USA) wurde mit Xba I und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl;1,5 h bei 37 °C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Xba I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × Puffer H (Roche) und 32 μl Wasser bidest. geschnitten: Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.plasmid pIRES (Clontech, Palo Alto, USA) was labeled Xba I and Not I (Roche Diagnostics) using a restriction assay (40 μl, 1.5 h at 37 ° C) 5 μg of DNA, 2 μl of Xba I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × buffer H (Roche) and 32 μl Water bidest. cut: The excised fragment was with Help the Qiagen gel extraction kit from a DNA gel in conventional Won way.
Plasmid pcDNA3.1 hp75, hergestellt wie oben beschrieben, wurde mit Spe I und und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl; 1,5 h bei 37 °C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Spe I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × Puffer H (Roche), 32 μl Wasser bidest geschnitten. Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.plasmid pcDNA3.1 hp75, prepared as described above, was mixed with Spe I and and Not I (Roche Diagnostics) using a restriction approach (40 μl; 1.5 h at 37 ° C) containing 5 μg DNA, 2 μl Spe I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × buffer H (Roche), 32 μl Cut reddish water. The excised fragment was with Help the Qiagen gel extraction kit from a DNA gel in conventional Won way.
Die auf diese Weise hergestellten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des folgenden Ansatzes über Nacht bei 16 °C ligiert: 5 μl hp75-Konstrukt, 2 μl geschnittener pIRES, 1,5 μl T4-DNA Ligase (Roche) 3 μl 10 × Puffer T4 (Roche), 20,5 μl Wasser bidest. Diese Ligation mit der Bezeichnung pIRES hp75 wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert.The Restriction fragments prepared in this way were Using the following approach, ligated overnight at 16 ° C: 5 μl hp75 construct, 2 μl cut pIRES, 1.5 μl T4 DNA ligase (Roche) 3 μl 10 × buffer T4 (Roche), 20.5 μl Water bidest. This ligation, called pIRES hp75, was then transformed into the bacterial strain SuperComp XL2 Blue (Stratagene).
c) Herstellung von pIRES
hNgR hp75 (
pcDNA hNgR CDS1, kommerziell enworben von RZPD (Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon.Nr.: IRAL-p962L1427Q2), enthaltend die kodierende Sequenz für humanen Nogo-Rezeptor (hNgR), wurde unter Verwendung eines Restriktionsansatzes 13 μl;1 h bei 37 °C) enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl Hind III (Roche), 1,5 μl 10 × Puffer B (Roche) und 10 μl Wasser bidest. verdaut (blunt end). Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.pcDNA hNgR CDS1, commercially sourced from RZPD (German Resource Center for genome research GmbH, clone no .: IRAL-p962L1427Q2), containing the coding sequence for human Nogo receptor (hNgR) was generated using a restriction approach 13 μl; 1 h at 37 ° C) containing 5 μg DNA, 1.5 μl Hind III (Roche), 1.5 μl 10 × buffer B (Roche) and 10 μl Water bidest. digested (blunt end). The cut fragment was using the Qiagen gel extraction kit from a DNA gel in conventional Won way.
Zum Auffüllen der Enden wurden 20 μl des geschnittenes pcDNA hNgR CDS1-Konstrukt in einem Ansatz (100μl; 30 min 11 °C), enthaltend 2 μl T4-DNA Polymerase (Roche), 10 μl 10 × Puffer T4 (Roche), 1 μl 100 mM DTT (Gibco), 10 μl 20 mM NTP Mix (Stratagene) und 77 μl Wasser bidest. inkubiert. Das T4-fill-in wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel gewonnen.To the Fill up the ends were 20 μl of the cut pcDNA hNgR CDS1 construct in one batch (100 μl, 30 min 11 ° C), containing 2 μl T4 DNA polymerase (Roche), 10 μl 10 × buffer T4 (Roche), 1 μl 100 mM DTT (Gibco), 10 μl 20 mM NTP mix (Stratagene) and 77 μl water redist. incubated. The T4-fill-in was made using the Qiagen Gel Extraction Kit won a DNA gel.
Zur Dephosphorylierung, um eine Re-Ligierung der blunt ends zu vermeiden, wurden 50 μl des T4 fill-ins des hNgR CDS1-Konstruktes mit 2 μl Alkalische Phosphatase (Roche), 10 μl 10 × Puffer (Roche) und 38 μl Wasser bidest. zunächst 30 min bei 37 °C und anschließend 15 min bei 65 °C inkubiert. Das so erhaltenen Dephosphorylierungskonstrukt wurde schließlich mit Qiagen Hit clean-up aufgereinigt.to Dephosphorylation to avoid re-ligation of the blunt ends were 50 μl of the T4 fill-in of the hNgR CDS1 construct with 2 μl alkaline phosphatase (Roche), 10 μl 10x buffer (Roche) and 38 μl Water bidest. first 30 min at 37 ° C and subsequently 15 min at 65 ° C incubated. The dephosphorylation construct thus obtained was after all cleaned with Qiagen Hit clean-up.
Das gereinigte pcDNA h NgR Hind II blunt Fragment wurde dann mit EcoRI unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (15 μl, 1 h bei 37 °C), enthaltend 10 μl Eluat (aus Qiagen Hit clean-up), 1,5 μl EcoR I (Roche), 1,5 μl 10 × Puffer H (Roche) und 2,0 μl Wasser bidest., verdaut und mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel nach Restriktion gewonnen.The purified pcDNA h NgR Hind II blunt fragment was then digested with EcoRI using a restriction assay (15 μl, 1 h at 37 ° C) containing 10 μl of eluate (from Qiagen hit clean-up), 1.5 μl EcoR I (Roche), 1.5 μl 10 × buffer H (Roche) and 2.0 μl Water redistilled, digested and with the help of the Qiagen Gel Extraction Kit a DNA gel obtained by restriction.
pIRES
hp75 (wie oben hergestellt) wurde mit EcoR I und Hind III unter
Verwendung eines Restriktionsansatzes (27 μl, 1,5 h bei 37 °C), enthaltend
5 μg DNA,
1,5 μl EcoR
I, 1,5 μl
Hind III, 4 μl
10 × Puffer
H (Roche) und 20 μl
Wasser bidest. geöffnet.
Das gewünschte
hP75 Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem
DNA-Gel nach Restriktion gewonnen und mit dem oben hergestellten
hNgR-Konstrukt unter Verwendung eines Ligationsansatzes, enthaltend
5 μNgR-Konstrukt,
2 μl geschnittener
pIRES hp75, 1,5 μl T4-DNA
Ligase (Roche), 3 μl
10 × Puffer
T4 (Roche) und 20,5 μl
Wasser bidest. über
Nacht 16 °C
ligiert. Das erhaltene Konstrukt pIRES hNgR hp75 (
Weitere
Sequenzinformationen zu pIRES hNgR hp75 sind in folgendem Abschnitt
zusammengefasst:
d) Herstellung von pcDNA4(mycHis)A
hRhoA wt (
Das Plasmid pOTB7 RhoA (kommerziell erworben von RZPD, Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon.Nr.: IRAL-p962A174), das die kodierende Sequenz für humane RhoA GTPase enthält, wurde unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1,5 h bei 37 °C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. verdaut.The Plasmid pOTB7 RhoA (commercially purchased from RZPD, Deutsches Resourcenzentrum for genome research GmbH, clone no .: IRAL-p962A174), which encodes the coding sequence for human Contains RhoA GTPase, was assayed using the following restriction approach (25 μl, 1.5 h at 37 ° C), containing 5 μg of DNA, 1.5 μl of EcoR I, 1.5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × buffer H (Roche) and 19 μl Water bidest. digested.
In einem zweiten Ansatz wurde pcDNA4(mycHis) (Invitrogen, Carlsbad, USA) unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1,5 h bei 37 °C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. ebenfalls verdaut.In In a second approach, pcDNA4 (mycHis) (Invitrogen, Carlsbad, USA) using the following restriction approach (25 μl, 1.5 h at 37 ° C), containing 5 μg DNA, 1.5 μl EcoR I, 1.5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × buffer H (Roche) and 19 μl Water bidest. also digested.
Anschließend wurden
die geschnittenen Fragmente, wie oben beschrieben gereinigt und
ligiert, wobei man das Plasmid pcDNA4(mycHis)A h RhoA wt (vgl.
Weitere
Sequenzinformationen zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt sind in folgendem
Abschnitt zusammengefasst:
d) Herstellung von pcDNA3
hRhoA wt (
Die Herstellung erfolgt in Analogie zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt, wobei man aber anstelle von pcDNA4(mycHis) das oben bereits beschriebenen Plasmid pcDNA3.1V5-His TOPO verwendet.The Production takes place in analogy to pcDNA4 (mycHis) A hRhoA wt, where but instead of pcDNA4 (mycHis) the one already described above Plasmid pcDNA3.1V5-His TOPO used.
Weitere
Sequenzinformationen zu pcDNA3 hRhoA wt (vgl.
2. Generierung stabiler rekombinanter HEK Zelllinien2nd generation more stable recombinant HEK cell lines
a) Herstellung der Doppel-Transfektante HEK293 NgR/p75a) Preparation of the double transfectant HEK293 NgR / p75
HEK293 Wildtyp- Zellen (kultiviert in RPMI -Glutamax + 10% dial. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic) wurden in einem ersten Transfektionsschritt mit dem Plasmid pIRES hNgR hp75 transfiziert. Dazu wurden in Kulturschalen mit 10 Vertiefungen je Ansatz 2 μg Plasmid-DNA in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium und 2 × 106 Zellen in 12 μl LIPOFECTAMINE in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium vermischt, und 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Man füllte dann mit serumfreien Me dium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml je Transfektionsansatz auf. Anschließend gab man zu jeder Schale 2 ml serumfreies RPMI-Gutamax Medium und man inkubierte 6 h bei 37 °C. Dann erfolgte ein Mediumwechsel auf RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS und inkubierte 1 Tag bei 37 °C. Anschließend wurden die Schaleninhalte gesplittet (in unterschiedlichen Verdünnungen: 1:10; 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000; 1 Ansatz/Schale pro Verdünnung) (in RPMI-Glutamax + 10% dialysiertes FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml)HEK293 wild-type cells (cultured in RPMI-glutamax + 10% dial FCS + 1% antibiotic-antimycotic) were transfected in a first transfection step with the plasmid pIRES hNgR hp75. To this end, 2 μg of plasmid DNA in 100 μl of serum-free RPMI-Gutamax medium and 2 × 10 6 cells in 12 μl of LIPOFECTAMINE were mixed in culture dishes with 10 wells per batch in 100 μl of serum-free RPMI-Gutamax medium and incubated for 15 to 20 minutes at room temperature , It was then filled with serum-free Me medium to a total volume of 1 ml per Transfektionsansatz. Subsequently, 2 ml of serum-free RPMI-Gutamax medium were added to each dish and the mixture was incubated at 37 ° C. for 6 h. Then the medium was changed to RPMI-glutamax + 5% dialysed FCS and incubated for 1 day at 37 ° C. Then the shell contents were split (in different dilutions: 1:10, 1:50, 1: 100, 1: 250, 1: 500, 1: 1000, 1 batch / dish per dilution) (dialyzed in RPMI-glutamax + 10% FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg / ml)
Klone wurden aus derjenigen Verdünnung isoliert, die die ersten separierten Klone ergab. Sterile Mini-Glaszylinder (BASF) wurden mit einer sterilen Pinzette mit einem Ende in sterile Vaseline (BASF) vorsichtig eingetaucht. Das mit der Vaseline benetzte Ende der Mini-Glaszylinder wurde auf die zuvor ausgewählten Einzelklone vorsichtig aufgesetzt. Der Einzelklon sollte vollständig vom Mini-Glaszylinder umschlossen sein. In die Mini-Glaszylinder wurden nun mit einer Eppendorf-Pipette mit steriler Spitze 40 μl Trypsin (Gibco, Trypsin-EDTA) zugegeben. Das Trypsin ließ man 1–2 Minuten auf die Zellen einwirken. Durch mehrmaliges (3–4 Mal) Anziehen und Abgeben des Trypsins mit einer Eppendorf-Pipette (sterile Spitze) wurden die Zellen resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden mit der Eppendorf-Pipette vollständig vom Mini-Glaszylinder in eine 24-well Platte (Tissue culture plate, Falcon, Becton Dickinson, jedes well enthielt 1 ml Medium RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS) überführt.Clones were made from those dilution isolated, which gave the first separated clones. Sterile mini glass cylinder (BASF) were sterile with a pair of sterile tweezers with one end Vaseline (BASF) carefully submerged. The wetted with petroleum jelly The end of the mini glass cylinder was added to the previously selected single clones carefully put on. The single clone should be completely from the Be enclosed in a mini glass cylinder. In the mini-glass cylinder were Now use an Eppendorf sterile-tip pipette to add 40 μl trypsin (Gibco, trypsin-EDTA). The trypsin was allowed to act on the cells for 1-2 minutes. By repeated (3-4 Times) Tighten and deliver the trypsin with an Eppendorf pipette (sterile tip) the cells were resuspended. The resuspended Cells were completely removed from the mini-glass cylinder with the Eppendorf pipette 24-well plate (tissue culture plate, Falcon, Becton Dickinson, each well contained 1 ml of medium RPMI-glutamax + 5% dialysed FCS) transferred.
Der Nachweis von positiven Klonen erfolgte mittels FACS wie oben beschrieben. Dabei wurde die Überexpression der Rezeptoren NgR und p75 an der Zelloberfläche bestimmt (Ergebnisse nicht gezeigt).Of the Detection of positive clones was done by FACS as described above. This was the overexpression of the receptors NgR and p75 at the cell surface (results not shown).
b) Herstellung der Triple-Transfektante HEK293 RhoA/NgR/p75b) Preparation of the triple transfectant HEK293 RhoA / NgR / p75
Ein gemäß a) hergestellter positiver Klon (Klon 5) der Zelllinie HEK293 NgR/p75 wird in analoger Weise mit dem Plasmid pcDNA4(mycHis)A hRhoA transfiziert. Im letzten Schritt erfolgte eine Splittung der Ansätze in RPMI-Glutamax (+ 10% dialysiertes. FCS + 1 % Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml, + Zeocin 125 μg/ml)One according to a) produced positive clone (clone 5) of cell line HEK293 NgR / p75 is in analogous Manner transfected with the plasmid pcDNA4 (mycHis) A hRhoA. In the last A step was followed by splitting the batches into RPMI glutamax (+ 10%). dialyzed. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg / ml, + Zeocin 125 μg / ml)
Zum Nachweis positiver Klone wurde diese durch Immunoblotting auf RhoA Expression und durch FACS Analyse auf Expression der Rezeptoren NgR und p75 getestet.To the Positive clones were detected by immunoblotting on RhoA Expression and by FACS analysis for expression of the receptors NgR and p75 tested.
Zum
RhoA-Nachweis wurde ein von dem jeweiligen Klon abgeleitetes Zellhomogenat
durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (NuPAGE Polyacrylamid Gel 4–12%, 1,5
mm stark (Invitrogen Carlsbad, USA); die Proteinproben wurden mit
5% Mercaptoethanol denaturiert) aufgetrennt und nach Immunoblotting
mit monoklonalem Maus-anti-RhoA Antikörper nach Standardmethode getestet.
Ein typisches Ergebnis ist in
Zum
Nachweis der Expression von NgR und p75 wurde eine FACS-Analyse
wie oben beschrieben durchgeführt.
Ein typisches Ergebnis ist in
Herstellungsbeispiel 3: Herstellung von rekombinantem humanem sRAGE ProteinProduction Example 3 Preparation of Recombinant Human sRAGE Protein
Grundlage für die Expression und Aufreinigung von rekombinanten sRAGE Protein war die stabil mit dem Vektor pcDNA3 (-) 6.1 C HIS A transfizierte HEK 293 Zelllinie „293/6.1 sRAGE His 6".basis for the Expression and purification of recombinant sRAGE protein was Stably transfected with the vector pcDNA3 (-) 6.1 C HIS A HEK 293 cell line "293 / 6.1 sRAGE His 6 ".
Im Folgenden wird zunächst die Herstellung dieser Zelllinie beschrieben: Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook, J. and Russell D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd.Edition, Cold Spring Harbor Press, NY durchgeführt.in the Following will be first described the production of this cell line: molecular biological Standard techniques were used according to Sambrook, J. and Russell D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd.Edition, Cold Spring Harbor Press, NY performed.
Gesamt-RNA
aus Lymphozyten (PBL) wurde mit dem Superscript RT-PCR System (Invitrogen,
Carlsbad, USA) revers transkribiert, um anschließend mit den Oligonukleotidprimern
RAGE-SE:
CCG AAT TCC GGA AGC AGG ATG GCA GCC G (SEQ ID NO:25) und
RAGE-AS:
CCC TCG AGC CCC TCA AGG CCC TCA GTA CTA CT (SEQ ID NO:26)
die
RAGE cDNA, wie sie in der Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136 beschrieben
ist, zu amplifizieren. Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction
Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen
EcoR1 und XhoI geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in den
ebenfalls XhoI/EcoR1 geschnittenen Vektor pcDNA 3 (Invitrogen, Carlsbad,
USA) ligiert zu werden. Nach Transformation in E.coli XL-1 blue
Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter
Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid
Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Ausgehend von diesem
Plasmid mit der Bezeichnung pcDNA3/RAGE 2.6 wurde mit den Primern
N-SE
A: AGT AAC GGC CGC CAG TGT GCT GGA A TT CGG A (SEQ ID NO:27) und
C-SE
B: CCG GTA CCA CCT GCA GTT GGC CCC TCC TCG CC (SEQ ID NO:28)
die
cDNA (Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136 ) des löslichen
RAGE (sRAGE) amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mit EcoR1 und Kpn1
Restriktionsendunukleasen geschnitten und nach oben beschriebener
Aufreinigung in den mit EcoR1/Kpn1 linearisierten Vektor „pcDNA3.1(-)
Myc HIS" (Invitrogen,
Carlsbad, USA) ligiert. Der so neu entstandene Plasmid-Vektor „pcDNA
3 (-) 6.1 C HIS A" wurde
mit dem Transfektionsreagenz „Superfect" (Qiagen, Hilden,
Deutschland) nach Angaben des Herstellers in HEK 293 transfiziert.
Nach Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418
in MEM Medium (#M4528, Sigma, München,
Deutschland) + 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Pennicillin/Streptavidin
(Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden serielle Verdünnungen der Zellsuspension
hergestellt, so dass ausgehend von einem Einzelklon die Zelllinie „293/6.1
sRAGE His 6" identifiziert
werden konnte.Total RNA from lymphocytes (PBL) was reverse transcribed with the Superscript RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, USA), followed by oligonucleotide primers
RAGE-SE: CCG AAT TCC GGA AGC AGG ATG GCA GCC G (SEQ ID NO: 25) and
RAGE-AS: CCC TCG AGC CCC TCA AGG CCC TCA GTA CTA CT (SEQ ID NO: 26)
the RAGE cDNA as described in Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136 is described. After gel purification with the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), the cDNA was cut with the restriction endonucleases EcoR1 and XhoI in order to be ligated into the XhoI / EcoR1 cut vector pcDNA 3 (Invitrogen, Carlsbad, USA) after renewed gel purification , After transformation into E. coli XL-1 blue cells (Invitrogen, Carlsbad, USA), a positive recombinant clone was amplified, the sequence verified and the plasmid DNA isolated with the Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Starting from this plasmid labeled pcDNA3 / RAGE 2.6 was mixed with the primers
N-SE A: AGT AAC GGC CGC CAG TGT GCT GGA A TT CGG A (SEQ ID NO: 27) and
C-SE B: CCG GTA CCA CCT GCA GTT GGC CCC TCC TCG CC (SEQ ID NO: 28)
amplified the cDNA (Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136) of the soluble RAGE (sRAGE). The PCR product was cut with EcoR1 and Kpn1 restriction endunucleases and ligated into EcoR1 / Kpn1 linearized vector "pcDNA3.1 (-) Myc HIS" (Invitrogen, Carlsbad, USA) as described above. "The newly created plasmid vector" pcDNA 3 (-) 6.1 C HIS A "was transfected with the transfection reagent" Superfect "(Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer in HEK 293. After selection of the" positive "cells with 800 μg / ml G418 in MEM medium ( # M4528, Sigma, Munich, Germany) + 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml pennicillin / streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) serial dilutions of the cell suspension were prepared such that starting from a single clone, the cell line " 293 / 6.1 sRAGE His 6 ".
Die Identität der sRAGE Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde im Western Blot mit RAGE-spezifischen Antikörpern (Santa Cruz; # sc5563) überprüft.The identity the sRAGE expression and secretion of the protein into the culture medium was in Western blot with RAGE-specific antibodies (Santa Cruz; # sc5563).
Zur Protein-Produktion wurde diese Zelllinie in 4 × 20 l Wannenstapel in serumhaltigen MEM (s.o.) angezogen. Die Zellen wurden dann in serumfreien Medium Pro293a-CDM (#12-764Q, BioWhittaker, Vervier, Belgien) bei 37 °C für 3 Tage kultiviert, bevor der Mediumüberstand abgenommen und über „Hemolflow F-Series High-Flux" Säulen (Fresenisus Medical Care AG, Bad Homburg, Deutschland) auf 1400 ml aufkonzentriert wurde.to Protein production, this cell line was in 4 × 20 l tub stack in serum-containing MEM (s.o.) tightened. The cells were then in serum-free medium Pro293a CDM (# 12-764Q, BioWhittaker, Vervier, Belgium) at 37 ° C for 3 days cultured before the medium supernatant taken off and on "Hemolflow F-Series High-Flux "columns (Fresenius Medical Care AG, Bad Homburg, Germany) to 1400 ml.
Die Proteinaufreinigung erfolgte über „Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) und wurde von der Firma Diarect AG (Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Als NiNTA Säulenmaterial wurde „chelating sepharose FF" (Amersham-Bioscience, Upsala, Schweden) eingesetzt. Äquilibrierung, Bindung an die Säulenmatrix und Aufreinigung erfolgten gemäß den Herstellerangaben. Die Elution des Proteins erfolgte stufenweise mit steigenden Imidazol-Konzentrationen. Die verschiedenen Fraktionen wurden im Western Blot mit anti-HIS Antikörpern auf den Gehalt an sRAGE Protein überprüft. Das gereinigte sRAGE Protein (Genbank Ref. Seq. Sequenz NM_001136) eluierte spezifisch bei 250–500 mM Imidazol. Die so gewonnenen Fraktionen wurden vereinigt, aufkonzentriert und dreimal gegen PBS dialysiert (2 × 4h, 1 × 16 h).The Protein purification was carried out via "Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) and was developed by the company Diarect AG (Freiburg, Germany). As NiNTA column material became "chelating sepharose FF "(Amersham-Bioscience, Upsala, Sweden). equilibration Binding to the column matrix and purification was done according to the manufacturer's instructions. The elution of the protein was gradual with increasing imidazole concentrations. The different fractions were detected in Western blot with anti-HIS antibodies checked the content of sRAGE protein. The purified sRAGE protein (Genbank Ref. Seq. Sequence NM_001136) eluted specifically at 250-500 mM imidazole. The fractions thus obtained were pooled, concentrated and dialysed three times against PBS (2 × 4 h, 1 × 16 h).
Herstellungsbeispiel 4: sRAGE PeptidfragmenteProduction Example 4 sRAGE peptide fragments
Die
folgenden Peptide wurden nach Standardmethoden der Peptidsynthese
hergestellt:
NtermR31: QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLN (SEQ
ID NO:6)
NtermR13: CKGAPKKPPRQRLE (SEQ ID NO:3)
ScraNtermR31:
APLACPRELIKGKWEVKPKRNPKNQLTIGQL (SEQ ID NO:7)
ScraNtermR13:
GKPRAPKCLKPEQ (SEQ ID NO:8)The following peptides were prepared by standard methods of peptide synthesis:
NtermR31: QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLN (SEQ ID NO: 6)
NtermR13: CKGAPKKPPRQRLE (SEQ ID NO: 3)
ScraNtermR31: APLACPRELIKGKWEVKPKRNPKNQLTIGQL (SEQ ID NO: 7)
ScraNtermR13: GKPRAPKCLKPEQ (SEQ ID NO: 8)
Herstellungsbeispiel 5: Herstellung von His-NogoR FusionsproteinProduction Example 5: Preparation of His-NogoR fusion protein
Grundlage für die Expression und Aufreinigung von rekombinanten His-NogoR Fusionsprotein (Genbank:NM_023004) war die stabil mit dem Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" transfizierte HEK 293 Zelllinie „CHO"basis for the Expression and purification of recombinant His-NogoR fusion protein (Genbank: NM_023004) was the stably transfected with the vector "pcDNA4 / hNogoR-TM6" HEK 293 cell line "CHO"
Im Folgenden wird zunächst die Herstellung dieser Zelllinie beschrieben: Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook and Russel (2001) durchgeführt.in the Following will be first described the production of this cell line: molecular biological Standard techniques were according to Sambrook and Russel (2001).
Ausgangspunkt
für die
Herstellung des NgR-HIS Expressionsplasmids war der bei der RZPD
GmbH (Berlin, Deutschland) käuflich
erworbene cDNA Klon pOTB7 I-RALp962L1427Q2.
Aus der Plasmid-DNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimern:
hNogoR
Hind III: CCAAGCTTATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO:29)
hNogoR
Eco RI – TM:
CCGAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO:30)
die gewünschte kodierende
Nukleotidsquenz amplifiziert.The starting point for the production of the NgR-HIS expression plasmid was the cDNA clone pOTB7 I-RALp962L1427Q2, which was purchased from RZPD GmbH (Berlin, Germany). From the plasmid DNA was amplified by PCR using the oligonucleotide primers:
hNogoR Hind III: CCAAGCTTATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 29)
hNogoR Eco RI - TM: CCGAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO: 30)
amplified the desired coding nucleotide sequence.
Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und EcoR1 geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in den ebenfalls HindIII/EcoR1 geschnittenen Vektor pcDNA4/MycHIS A (Invitrogen, Carlsbad, USA) ligiert zu werden. Nach Transformation in E.coli Top10 One Shot Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.To Gel purification with the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) was the cDNA with the restriction endonucleases HindIII and EcoR1 cut to re-purify in the likewise HindIII / EcoR1 cut vector pcDNA4 / MycHIS A (Invitrogen, Carlsbad, USA). After transformation in E. coli Top10 One Shot Cells (Invitrogen, Carlsbad, USA) amplified a positive recombinant clone, verified the sequence and the plasmid DNA with the plasmid mini-kit (Qiagen, Hilden, Germany) isolated.
Der so neu entstandene Plasmid-Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" wurde mit dem Transfektionsreagenz „Fugene 6" (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers in CHO-K1 transfiziert. Nach Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München, Deutschland) enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Pennicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden serielle Verdünnungen der Zellsuspension hergestellt, so dass ausgehend von einem Einzelklon die Zelllinie „CHO-K1/" identifiziert werden konnte.Of the so newly formed plasmid vector "pcDNA4 / hNogoR-TM6" was with the transfection reagent "Fugene 6 "(Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer in CHO-K1 transfected. After selection of the "positive" cells with 800 μg / ml G418 in MEM medium (# M4528, Sigma, Munich, Germany) containing 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml pennicillin / streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) were serial dilutions of the cell suspension so that starting from a single clone, the cell line "CHO-K1 /" are identified could.
Die Identität der Nogo-Rezeptor Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde im Dot Blot mit anti-HIS spezifischen Antikörpern (#1922416, Roche, Mannheim, Deutschland) überprüft.The identity the Nogo receptor expression and secretion of the protein in the culture medium was in dot blot with anti-HIS specific antibodies (# 1922416, Roche, Mannheim, Germany).
Der
Zellklon wurde unter normalen Zellkulturbedingungen vermehrt und
in einen Wannenstapel eingesät.
Nach 21 Tagen des Wachstums unter FCS wurde das Medium durch frisches
serumfreies Medium ersetzt. Nach 3 Tagen wurden 40 Liter serumfreier
Zellkulturüberstand
gewonnen. Dieser Überstand
wurde mit Hilfe einer Fresenius Hemoflow F60 auf 1 Liter konzentriert
(Faktor 40). Anschließend
wurden 50ml Ni-NTA-Superflow
Beads (Qiagen, Hilden), welche mit PBS voräquilibriert waren, zu dem Konzentrat
gegeben und bei 4°C für 3 Stunden
gerührt.
Die Beads wurden durch Abstellen des Rührers sedimentiert (über Nacht
bei 4°C),
der Überstand
wurde verworfen und die Ni-NTA Beads in eine Säule gefüllt. Die Beads wurden bei Raumtemperatur
mit drei Säulenvolumen
20mM Na-Phosphatpuffer, 300mM NaCl pH8.0 gewaschen. Anschließende erfolgten
Waschschritte mit 5 Säulenvolumen
20mM Na-Phosphatpuffer, 300mM NaCl, 10mM Imidazole pH8.0. Eluiert
wurde der gebundene Hexa-Hisgetaggte NgR mit 20mM Na-Phosphatpuffer,
300mM NaCl, 100mM Imidazole pH8.0. Das Eluat wurde über Nacht
gegen 25mM Tris/HCl pH7.0 dialysiert. Das Dialysat wurde bei Raumtemperatur
auf eine Q-Sepharose Säule
(Amersham Biosciences, 1.6 × 3cm;
Volumen 6ml) gegeben. Anschließend
wurde mit folgenden Puffern gearbeitet:
Puffer A: 50mM Tris/HCl;
pH7.0;
Puffer B: 50mM Tris/HCl; 1M NaCl; pH7.0The cell clone was propagated under normal cell culture conditions and seeded in a well stack. After 21 days of growth under FCS, the medium was replaced with fresh serum-free medium. After 3 days, 40 liters of serum-free cell culture supernatant were recovered. This supernatant was concentrated to 1 liter using a Fresenius Hemoflow F60 (factor 40). Subsequently, 50 ml of Ni-NTA Superflow Beads (Qiagen, Hilden) preequilibrated with PBS were added to the concentrate and stirred at 4 ° C for 3 hours. The beads were sedimented by switching off the stirrer (overnight at 4 ° C), the supernatant was discarded and the Ni-NTA beads filled into a column. The beads were washed at room temperature with three column volumes of 20 mM Na phosphate buffer, 300 mM NaCl pH 8.0. Subsequent washes with 5 column volumes of 20 mM Na phosphate buffer, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole pH 8.0. The bound Hexa-His tagged NgR was eluted with 20 mM Na phosphate buffer, 300 mM NaCl, 100 mM Imidazole pH8.0. The eluate was dialyzed overnight against 25 mM Tris / HCl pH 7.0. The dialysate was added to a Q-Sepharose column (Amersham Biosciences, 1.6 x 3 cm, 6 ml volume) at room temperature. Subsequently, the following buffers were used:
Buffer A: 50 mM Tris / HCl; pH 7.0;
Buffer B: 50 mM Tris / HCl; 1M NaCl; pH 7.0
Mit
einem Fluß von
2ml/min wurde mit folgendem Gradienten eluiert:
0% Puffer B
für 5 Säulenvolumen;
0–50%
Puffer B in 12 Säulenvolumen;
50–100%
Puffer B in 2 Säulenvolumen,
sowie 100% Puffer B in 5 Säulenvolumen.With a flow of 2 ml / min was eluted with the following gradient:
0% Buffer B for 5 column volumes; 0-50% buffer B in 12 column volumes; 50-100% Buffer B in 2 column volumes, and 100% Buffer B in 5 column volumes.
Pro Säulenvolumen wurden zwei Fraktionen gewonnen. Diese wurden durch Standard SDS-Gelelektrophorese analysiert. Fraktionen mit der höchsten NgR-Reinheit wurden für den Anteil des hochglykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 110.000–120.000), sowie für den Anteil des niedrigglykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 75.000–90.000) vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 20mM Na-Phosphatpuffer, 140mM NaCl pH 7.4 bei 4°C über Nacht dialysiert. Die Dialysate wurden anschließend durch einen 0.2μm Sterilfilter filtriert und bei 4°C aufbewahrt.Per column volume two factions were won. These were analyzed by standard SDS gel electrophoresis analyzed. Fractions with the highest NgR purity was used for the proportion of the highly glycosylated receptor (molecular weight approx. 110000 to 120000) also for the proportion of the low-glycosylated receptor (molecular weight about 75,000-90,000) united. The pooled fractions were challenged with 20 mM Na phosphate buffer, 140 mM NaCl pH 7.4 at 4 ° C overnight dialyzed. The dialysates were then passed through a 0.2μm sterile filter filtered and at 4 ° C kept.
Herstellungsbeispiel 6: Herstellung eines monoklonalen Anti-NtermR31 AntikörpersProduction Example 6: Preparation of a Monoclonal Anti-NtermR31 Antibody
Für die Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen NtermR31 wurde die folgende Strategie gewählt. Als Immunogen wurde das Peptid an bovines Thyroglobulin (BTG, Sigma, T-1001) konjugiert, welches Maleimidgruppen (abgeleitet von Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat) trägt. Für die Detektion von erzeugten Anti-Peptid-Antikörpern wurde dasselbe Peptid, konjugiert an Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, A-7906) welches ebenfalls Maleimidgruppen (abgeleitet von Succinimidyl-6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoat]) unterschiedlicher chemischer Struktur trägt. Die Konjugation des gleichen Peptids an zwei verschiedene hochmolekulare Träger über zwei verschiedene Vernetzer erlaubt die Selektion monoklonaler Antikörper mit Spezifität gegen das Peptid.For the generation monoclonal antibody against NtermR31, the following strategy was chosen. As immunogen was the Peptide conjugated to bovine thyroglobulin (BTG, Sigma, T-1001), which maleimide groups (derived from sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) wearing. For the detection of generated anti-peptide antibodies the same peptide conjugated to bovine serum albumin (BSA, Sigma, A-7906) which also contains maleimide groups (derived from succinimidyl-6 - [(β-maleimidopropionamido) hexanoate]) carries different chemical structure. The conjugation of the same Peptides to two different high molecular carrier over two different crosslinkers allows the selection of monoclonal antibodies with specificity against the peptide.
a) Herstellung des Immunisierungsantigensa) Preparation of the immunizing antigen
NtermR31 wurde an BTG unter Verwendung des Sulfhydrylgruppen-reaktiven heterobifunktionellen Vernetzers Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) konjugiert. Die Konjugation erfolgte unter Anwendung der folgenden zweistufigen Methode.NtermR31 was added to BTG using the sulfhydryl group-reactive heterobifunctional crosslinker Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) conjugated. The conjugation was carried out using the following two-stage method.
1. Maleylierung des Trägerproteins1. Maleylation of the carrier protein
4 mg Sulfo-SMCC in Wasser (10 mg/ml) wurden zu 2 ml der Trägerproteinlösung (10 mg/ml) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM HEPES-Na, 150 mM NaCl, pH 7.5) bei 4°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 4°C und anschließend weitere 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach Inkubation wurde das Reaktionsgemisch auf einer Säule mit Sephadex G-50 (1,5 × 14 cm), äquilibiert mit dem gleichen Puffer, entsalzt. Nach dem Entsalzen erhielt man 8 ml der maleylierten BTG-Lösung in einer Konzentration von 2,5 mg/ml.4 mg sulfo-SMCC in water (10 mg / ml) was added to 2 ml of the carrier protein solution (10 mg / ml) in HEPES-buffered saline (20 mM HEPES-Na, 150 mM NaCl, pH 7.5) at 4 ° C given. The reaction mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes and then further 30 minutes at 25 ° C incubated. After incubation, the reaction mixture was on a Pillar with Sephadex G-50 (1.5 × 14 cm), equilibrated with the same buffer, desalted. After desalting, one received 8 ml of the maleylated BTG solution at a concentration of 2.5 mg / ml.
2. Kupplung von maleyliertem BTG an das Peptid NtermR312. Coupling of maleylated BTG to the peptide NtermR31
1,2 ml einer Lösung des Peptids NtermR31 (10 mg/ml) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung wurden zu 5 ml der maleylierten BTG-Lösung (2,5 mg/ml) im gleicher Puffer gegeben und 2 Stunden bei 4°C und anschließend 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht umgesetzte Maleimidgruppen wurden mit 2-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 10 mM und Inkubation über Nacht blockiert. Anschließend wurde gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.2) bei 4°C und viermaligem Pufferwechsel dialysiert (MW Ausschluss 10.000).1.2 ml of a solution of the peptide NtermR31 (10 mg / ml) in HEPES-buffered saline became 5 ml of the maleylated BTG solution (2.5 mg / ml) in the same buffer and 2 hours at 4 ° C and then 4 hours incubated at room temperature. Unreacted maleimide groups were with 2-mercaptoethanol in a final concentration of 10 mM and incubation overnight blocked. Subsequently was added to phosphate buffered saline (PBS, 10 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.2) at 4 ° C and four changes of buffer dialysed (MW exclusion 10,000).
b) Herstellung des ELISA-Antigensb) Preparation of the ELISA antigen
Das Peptid NtermR31 wurde unter Verwendung des Sulfhydrylgruppen-reaktiven heterobifunktionellen Vernetzers Succinimidyl-6-[(β-maleimido-propionamido)hexanoat] (SMPH) an BSA konjugiert. Die Konjugation erfolgte nach folgender zweistufiger Methode.The Peptide NtermR31 was synthesized using the sulfhydryl group heterobifunctional cross-linker succinimidyl-6 - [(β-maleimido-propionamido) hexanoate] (SMPH) conjugated to BSA. The conjugation was carried out according to the following two-stage method.
1. Maleylierung des Trägerproteins1. Maleylation of the carrier protein
4 mg SMPH in Wasser (10 mg/ml) wurden zu 2 ml der Trägerproteinlösung (10 mg/ml) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM HEPES-Na, 150 mM NaCl, pH 7,5) bei 4°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 4°C und anschließend weitere 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach Inkubation wurde das Reaktionsgemisch auf einer Säule mit Sephadex G-50 (1,5 × 14 cm), äquilibiert mit dem gleichen Puffer, entsalzt. Nach dem Entsalzen erhielt man 8 ml der maleylierten BSA-Lösung in einer Konzentration von 2,5 mg/ml.4 mg of SMPH in water (10 mg / ml) was added to 2 ml of the carrier protein solution (10 mg / ml) in HEPES-buffered saline (20 mM HEPES-Na, 150 mM NaCl, pH 7.5) at 4 ° C given. The reaction mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes and then further 30 minutes at 25 ° C incubated. After incubation, the reaction mixture was on a Pillar with Sephadex G-50 (1.5 × 14 cm), equilibrated with the same buffer, desalted. After desalting, one received 8 ml of the maleylated BSA solution at a concentration of 2.5 mg / ml.
2. Kupplung von maleyliertem BSA an NtermR312. Coupling of maleylated BSA to NtermR31
1,2 ml einer Lösung des Peptids NtermR31 (10 mg/ml) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung wurden zu 5 ml der maleiylierten BSA-Lösung (2,5 mg/ml) im gleicher Puffer gegeben und 2 Stunden bei 4°C, und anschließend 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht umgesetzte Maleimidgruppen wurden mit 2-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 10 mM und Inkubation über Nacht blockiert. Anschließend wurde gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.2) bei 4°C und viermaligem Natriumchlorid, pH 7.2) bei 4°C und viermaligem Pufferwechsel dialysiert (MW Ausschluss 10.000).1.2 ml of a solution of the peptide NtermR31 (10 mg / ml) in HEPES-buffered saline became 5 ml of the maleiylated BSA solution (2.5 mg / ml) in the same buffer and 2 hours at 4 ° C, and then 4 hours incubated at room temperature. Unreacted maleimide groups were with 2-mercaptoethanol at a final concentration of 10 mM and incubated overnight blocked. Subsequently was added to phosphate buffered saline (PBS, 10 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.2) at 4 ° C and four times sodium chloride, pH 7.2) at 4 ° C and four times buffer change dialysis (MW exclusion 10,000).
c) Immunisierungc) immunization
5 Mäuse (8 Wochen alt) wurden durch Injektion mit 100 μg BTG-Peptidkonjugat, emulgiert in komplettem Freud'schen Adjuvans (Sigma, F-5881), behandelt. Die Injektion erfolgte in den Peritonealraum 90 Tage vor Fusion. Sämtliche anderen Injektionen wurden nach folgendem Schema in den Peritonealraum verabreicht. Inkomplettes Freud'sches Adjuvans von Sigma (Katalognummer F-5506) wurde verwendet.5 Mice (8 Weeks old) were emulsified by injection with 100 μg BTG-peptide conjugate in complete Freudian Adjuvant (Sigma, F-5881). The injection took place in the Peritoneal cavity 90 days before fusion. All other injections were administered to the peritoneal cavity according to the following schedule. Incomplete Freudian Adjuvant from Sigma (catalog number F-5506) was used.
d) Myelomzelllinied) myeloma cell line
Als Myelomzelllinie wurde SP2/0-Ag14 von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen verwendet. Die Zellen synthetisieren oder sezernieren keine Immunglobulinketten, sie sind resistent gegen Azaguanin (8-AZG, 20 μg/ml), wachsen nicht in HAT (Hypoxantin 10–4 M, Aminopterin 10–5 M und Thymidin 4 × 10–5 M)-Medium. Die SP2/0 Zellen wurden in Gewebekulturkolben in Standardkulturmedium (DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS) supplementiert mit 20 μg/ml 8-AZG, um NGPRT+ Revertanten abzutöten) kultiviert. Eine Woche vor der Fusion wurden die SP2/0 Zellen in Standardkulturmedium ohne 8-AZG gehalten.As a myeloma cell line, SP2 / 0-Ag14 was used by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. The cells do not synthesize or secrete immunoglobulin chains, are resistant to azaguanine (8-AZG, 20 μg / ml), do not grow in HAT (hypoxanthine 10 -4 M, aminopterin 10 -5 M and thymidine 4 × 10 -5 M). Medium. The SP2 / 0 cells were cultured in tissue culture flasks in standard culture medium (DMEM + 10% fetal calf serum (FCS) supplemented with 20 μg / ml 8-AZG to kill NGPRT + revertants). One week before fusion, SP2 / 0 cells were maintained in standard culture medium without 8-AZG.
e) Zellfusionierung und Plattierunge) cell fusion and plating
Drei Milzorgane von immunisierten Mäusen wurden aseptisch entfernt und zerkleinert. Einzelzellsuspensionen wurden daraus hergestellt. Die Milzlymphozyten wurden mit der SP2/0 Myelomzelllinie (Verhältnis: 5 Lymphozyten/1 SP2/0) in Gegenwart von Polyethylenglycol 3350 fusioniert. Die auf diese Weise produzierten Zellen wurden in DMEM, enthaltend HAT und 20% FCS resuspendiert. Die Zellen wurden in acht 96er Gewebekulturplatten (Corning Costar) ausplattiert, welche Zellen von Peritoneal-Exsudat als Feeder-Schicht enthielten. Die Platten wurden 10 Tage bei 37°C in feuchter Atmosphäre, enthaltend 5% Kohlendioxid, inkubiert. Während dieser Phase wurden die Zellen zweimal mit HAT Medium gefüttert.Three Splenic organs of immunized mice were removed aseptically and minced. Single cell suspensions were made from it. The spleen lymphocytes were treated with the SP2 / 0 Myeloma cell line (ratio: 5 Lymphocytes / 1 SP2 / 0) in the presence of polyethylene glycol 3350. The cells thus produced were incubated in DMEM HAT and 20% FCS resuspended. Cells were grown in eight 96-well tissue culture plates (Corning Costar) plated cells of peritoneal exudate as feeder layer contained. The plates were incubated for 10 days at 37 ° C in a humid atmosphere 5% carbon dioxide, incubated. While In this phase, the cells were fed twice with HAT medium.
Ein Teil der Milzzellsuspension wurde 10 Tage in einem T-Kolben kultiviert.One Part of the spleen cell suspension was cultured for 10 days in a T-flask.
f) Screening Assayf) Screening Assay
Ein indirekter ELISA, ausgelegt für die Detektion von IgG, wurde für das Screening der Zellkulturüberstände eingesetzt. Die Tests wurden in flachbödigen Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Greiner, Cat.# 756071) wie folgt durchgeführt: 100 μl Aliquots einer Lösung aus 0,5 M Carbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,6, enthaltend 4 μg/ml BSA – NtermR31 Konjugat (bezogen auf BSA) wurde jeder Vertiefung der Platte zugegeben. Nach Inkubation über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4°C wurden die Platten viermal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, 50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,8), enthaltend 0,01% Triton X-100 (Waschpuffer) gewaschen und mit 200 μl/Vertiefung 2%iger Gelatine (aus Kaltwasserfisch-Haut, Sigma G-7765) in TBS (Blockierungspuffer) 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Platten wurden mit Waschpuffer gewaschen und 100 μl Zellkulturüberstand wurde den jeweiligen Vertiefungen zugesetzt. Der Zellkulturüberstand von SP2/0 Myelomzellen wurde als negative Kontrolle verwendet. Der Splenozyten-Zellkulturüberstand wurde als positive Kontrolle verwendet.One indirect ELISA, designed for the detection of IgG, was for used the screening of cell culture supernatants. The tests were in flachbödigen Polystyrene microtiter plates with 96 wells (Greiner, Cat. # 756071) as follows: 100 μl aliquots a solution of 0.5 M carbonate / bicarbonate buffer, pH 9.6, containing 4 μg / ml BSA-NtermR31 Conjugate (based on BSA) was added to each well of the plate. After incubation over Night in a humid chamber at 4 ° C the plates were washed four times with Tris-buffered saline (TBS, 50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.8) containing 0.01% Triton X-100 (Wash Buffer) and washed with 200 μl / well of 2% gelatin (from coldwater fish skin, Sigma G-7765) in TBS (blocking buffer) Blocked for 1 hour at room temperature (RT). The plates were with Washing buffer washed and 100 .mu.l Cell culture supernatant was added to the respective wells. The cell culture supernatant of SP2 / 0 myeloma cells was used as a negative control. Of the Splenocytes cell culture supernatant was used as a positive control.
Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die ELISA-Platten mit Ziege-Anti-Maus IgG (Maus Fc-spezifisch), konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Sigma, A-2429) (50 μl/Vertiefung, verdünnt in Blockierungspuffer, 1:5000) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde den Platten 150 μl/Vertiefung Subtratpuffer (2 mM 4- Nitrophenylphosphat (SIGMA, N3254) in 5% Diethanolamin + 0,5 mM MgCl2, pH 9,8) zugesetzt. Die Substratumsetzung wurde in einem 12-Kanal Dynex Opsys MR Mikroplattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 405 nm detektiert.The plates were incubated for 1 hour at room temperature. After several washes, the ELISA plates were supplemented with goat anti-mouse IgG (mouse Fc-specific) conjugated with alkaline phosphatase (Sigma, A-2429) (50 μl / well, diluted in blocking buffer, 1: 5000) for 1 hour Room temperature incubated. After a further washing step, 150 μl / well of substrate buffer (2 mM 4-nitrophenyl phosphate (SIGMA, N3254) in 5% diethanolamine + 0.5 mM MgCl 2 , pH 9.8) was added to the plates. Substrate conversion was detected in a 12-channel Dynex Opsys MR microplate reader at a wavelength of 405 nm.
g) Selektion stabiler Antikörperproduzenteng) selection more stable Antibody producer
Das Erstscreening wurde 10 Tage nach der Fusion durchgeführt. Zellen aus positiven IgG-produzierenden Vertiefungen wurden in Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen überführt und 4 Tage kultiviert. Ein ELISA für BSA-NtermR31 zur Bestimmung von Kulturen, welche den interessierenden Antikörper produzieren, wurde durchgeführt. Dieses Vermehrungsverfahren wurde zweimal nach 3 und nach 5 Tagen wiederholt. So wurde unter anderem ein anti-NtermR31 Ab mit der internen Bezeichnung „Clone 37" isoliert.The First screening was performed 10 days after the merger. cell from positive IgG-producing wells were in wells transferred from plates with 24 wells and Cultivated for 4 days. An ELISA for BSA-NtermR31 for the determination of cultures containing the subject of interest antibody produce was carried out. This propagation procedure was repeated twice after 3 and after 5 days repeated. Thus, among other things, an anti-NtermR31 Ab with the internal name "Clone 37 "isolated.
h) Cryokonservierung der Hybridomzellenh) cryopreservation of hybridoma
Ein Aliqot der jeweiligen Hybridome wurde in 1,0 ml Gefriermedium (90% (v/v) FCS, 10% (v/v) Dimethylsulfoxid) resuspendiert und in Gefriertuben überführt. Dann wurden die Gefäße sofort in eine Kühlkammer (Kühlrate 1 °C pro Minute) überführt. Nach Erreichen einer Temperatur von unter –60°C wurden die Zellen in Flüssigstickstoff zur Lagerung überführt.One Aliqot of the respective hybridomas was in 1.0 ml of freezing medium (90% (v / v) FCS, 10% (v / v) dimethyl sulfoxide) resuspended and transferred to freezer tubes. Then the vessels were immediately in a cooling chamber (cooling rate 1 ° C per minute) transferred. To Reaching a temperature below -60 ° C, the cells were in liquid nitrogen transferred to storage.
III. AusführungsbeispieleIII. embodiments
Ausführungsbeispiel 1: ELISA-Messung von Autoantikörpern gegen das N-terminale Peptid NtermR 31 von sRAGE in humanem PlasmaEmbodiment 1: ELISA measurement of autoantibodies against the N-terminal Peptide NtermR 31 from sRAGE in human plasma
a) Materialien:a) Materials:
- – Mikrotiterplatten: SigmaScreen; Streptavidin Coated Plate (Sigma, M-4058; 96-well (black));- microtiter plates: Sigma screen; Streptavidin coated plate (Sigma, M-4058; 96-well (black));
- – Nterm 31 (SEQ ID NO:6) (umfassend 31 N-terminale Aminosäuren des reifen RAGE ohne Leader-Peptid), biotinyliert von Fa. Thermo Electron GmbH; Ulm; OR183539/2), gelöst, 3,9 mg/ml; weiterverdünnt zur Anwendung auf 1 μg/ml in TBS, 0,1 % Tween20; 0,1 % BSA- Nterm 31 (SEQ ID NO: 6) (comprising 31 N-terminal amino acids of the mature RAGE without leader peptide), biotinylated by Thermo Electron GmbH; Ulm; OR183539 / 2), solved, 3.9 mg / ml; further diluted for application to 1 μg / ml in TBS, 0.1% Tween20; 0.1% BSA
- – Waschpuffer: TBS 0,1 % Tween20- Wash buffer: TBS 0.1% Tween20
- – TBS, Tris buffered Saline,: 20 mM Tris pH 7,4; 0,9% NaCl- TBS, Tris buffered saline: 20 mM Tris pH 7.4; 0.9% NaCl
- – Substrat: 4-Nitrophenylphosphat: Fa. Roche; Nr. 726923; eine Tablette in 100 ml 100 mM Tris/HCl pH 9,8 gelöstSubstrate: 4-Nitrophenyl phosphate: Fa. Roche; No. 726923; one tablet in 100 100 mM Tris / HCl pH 9.8
- – Antikörper: – Ziege-Anti-Kaninchen IgG (whole molecule), konjugiert mit alkalischer Phosphatase (AP-Conjugate); Fa. Sigma A-3812; Verdünnung im ELISA 1: 5000 in TBS 0,1 % Tween20; 0,1 % BSA – Ziege-Anti-Human IgG (Fc specific); konjugiert mit alkalischer Phosphatase (AP-Conjugate); Fa. Sigma A-9544, Verdünnung im ELISA 1: 5000 in TBS 0,1 % Tween20; 0,1 % BSA – Polyklonales Antiserum von Kaninchen, welches mehrfach mit dem Peptid immunisiert worden war = Anti-31 mer-8508; (Tier 6304), 20 ml vom 8.6.2004; versetzt mit 0,02% Thimerosal (Rabbit polyclonal AB 1:500); Die Immunisierung und Gewinnung des Serums wurden von der Firma Bio-Trend (Köln, Deutschland) durchgeführt. – Plasmen von Alzheimer Demenz (AD) Patienten wurden von Prof. Henn (Zentralinstitut für die seelische Gesundheit, Mannheim) erhalten: Non AD control; weiblich: Kontrollplasma; Plasmen von Patienten: AP23 MCIF06.7 weiblich; LAP30 Alzheimer Dementia weiblich 00.0 early onset; LAP39 MCI F06.7 weiblich; LAP45 MCI F06.7 männlich; LAP53 MCI F06.7 weiblich; LAP60 Alzheimer Dementia late onset männlich.Antibodies: - goat anti-rabbit IgG (whole molecule) conjugated with alkaline phosphatase (AP-conjugates); Fa. Sigma A-3812; dilution in ELISA 1: 5000 in TBS 0.1% Tween20; 0.1% BSA - Goat anti-human IgG (Fc specific); conjugated with alkaline phosphatase (AP conjugates); Fa. Sigma A-9544, dilution in ELISA 1: 5000 in TBS 0.1% Tween20; 0.1% BSA - Polyclonal Rabbit antiserum immunized several times with the peptide had been = anti-mer-8508; (Animal 6304), 20 ml from 8.6.2004; spiked with 0.02% thimerosal (Rabbit polyclonal AB 1: 500); The Immunization and recovery of the serum were performed by Bio-Trend (Cologne, Germany) carried out. - plasmas Alzheimer's disease (AD) patients were studied by Prof. Henn (Zentralinstitut for the mental health, Mannheim) received: Non AD control; Female: Control plasma; Plasmas of patients: AP23 MCIF06.7 female; LAP30 Alzheimer dementia female 00.0 early onset; LAP39 MCI F06.7 Female; LAP45 MCI F06.7 male; LAP53 MCI F06.7 female; LAP60 Alzheimer dementia late onset male.
Die Proben wurden weiterverdünnt im ELISA in TBS 0,1 % Tween20; 0,1 % BSAThe Samples were diluted further in ELISA in TBS 0.1% Tween20; 0.1% BSA
b) Versuchsdurchführung:b) Experimental procedure:
Je 100 μl des verdünnten NtermR31 Peptids wurde in jeden Napf der Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde verworfen, die Platten wurden je dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Je 100 μl des Kaninchenserums (Positivkontrolle) oder der verschiedenen Plasmen wurden pro Napf in verschiedenen Verdünnungen für je 3 Stunden bei Raumtemperatur in den Platten inkubiert. Der Überstand wurde verworfen, die Platten wurden je dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden pro Napf je 100 μl der entsprechenden Enzym-markierten Antikörper (Anti-human für die humanen Plasmaproben; Anti-Kaninchen für das Kaninchen Antiserum) pipettiert und für 1 Stunde bei Raum temperatur inkubiert. Dann wurde erneut je dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Jeder Napf erhielt dann 100 μl der Substratlösung. Nach einer Entwicklungszeit von ca. 10 Minuten wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von 50μl 1 M NaOH pro Napf gestoppt. Die Flüssigkeit aus den Näpfen wurde in eine durchsichtige Mikrotiterplatte (flexible plate; Fa. Falcon Nr. 353912) überführt. Die Absorption in den Näpfen der Mikrotiterplatte wurde in einem entsprechenden Photometer bei 405 nm gemessen.Per 100 μl of the diluted NtermR31 peptide was pipetted into each well of the microtiter plate. It was then incubated for 2 hours at room temperature. The supernatant was discarded, the plates were washed three times with washing buffer. 100 μl each of the rabbit serum (positive control) or the various plasmas were incubated per well in different dilutions for 3 hours at room temperature in the plates. The supernatant was discarded, the plates were washed three times with washing buffer. 100 μl of the corresponding enzyme-labeled antibodies (anti-human for the human plasma samples, anti-rabbit for the rabbit antiserum) were then pipetted per well and incubated for 1 hour at room temperature. Then was washed again three times with washing buffer. Each well then received 100 μl of the substrate solution. After a development time of about 10 minutes, the enzyme reaction was stopped by adding 50 μl of 1 M NaOH per well. The liquid from the wells was in a through microtiter plate (flexible plate, Falcon No. 353912). The absorbance in the wells of the microtiter plate was measured in a corresponding photometer at 405 nm.
c) Ergebnisse:c) Results:
Im
Serum des immuniserten Kaninchens waren Antikörper gegen das N-terminale
Peptid mit Hilfe dieses ELISA nachweisbar (vgl.
Die
mit verschiedenen Patientenseren erhaltene Ergebnisse sind in
Ausführungsbeispiel 2: Charakterisierung des polyklonalen anti-NtermR31 Serums und eines monoklonalen anti-NtermR31 AntikörpersEmbodiment 2: Characterization polyclonal anti-NtermR31 serum and a monoclonal anti-NtermR31 antibody
a) Materialiena) materials
- – Nitrocellulose-Membranen (0,45 μm Porengröße, # LC2001, Firma: Invitrogen)- Nitrocellulose membranes (0.45 μm Pore size, # LC2001, Company: Invitrogen)
- – Blockierungsreagenz (Roche Applied Science; # 1921673)- Blocking reagent (Roche Applied Science; # 1921673)
- – NBT/BCIP Lösung (1 Tablette auf 10ml H2O; Roche Applied Science, # 1697 471)- NBT / BCIP solution (1 tablet on 10 ml H 2 O; Roche Applied Science, # 1697 471)
- – Protein/Peptidproben NtermR31 (s.o.) ScraNtermR31 (s.o.) ScraNtermR13 (s.o.)NtermR13 (s.o.)sRAGE-6xHIS (AA 23-352, NP_001127) human sRAGE/Fc (R&D Systems;#1145-RG; AA 1-344) human sRAGE/Fc (AA 1-130) mouse sRAGE (R&D Systems; # Custom03) rat sRAGE/Fc (R&D Systems; #1616-RG; AA 1-342) - Protein / peptide samples NtermR31 (so.) ScraNtermR31 (s.o.) ScraNtermR13 (see above) NtermR13 (see above) sRAGE-6xHIS (AA 23-352, NP_001127) human sRAGE / Fc (R & D Systems, # 1145-RG; AA 1-344) human sRAGE / Fc (AA 1-130) mouse sRAGE (R & D Systems; # Custom03) advice sRAGE / Fc (R & D system; # 1616-RG; AA 1-342)
- – Antikörper polyklonales anti-NtermR31 Serum und Präimmunserum bezogen über die Firma Biotrend (Köln, Deutschland) (vgl. Ausführungsbeispiel 1), sekundären Antikörper Shp × Rb IgG AlkPhos (Chemikon, # AP304A)- antibodies polyclonal anti-NtermR31 serum and preimmune serum related over the company Biotrend (Cologne, Germany) (see exemplary embodiment 1), secondary antibody Shp × Rb IgG AlkPhos (Chemikon, # AP304A)
b) Versuchsdurchführung für polyklonales Serum:b) Experimental procedure for polyclonal Serum:
Die Charakterisierung des polyklonalen anti-NtermR31 Serums wurde mit Hilfe eines Dot Blot Verfahrens durchgeführt. Auf Nitrozellulose-Membranen wurden 5 bzw. 50 ng der oben aufgelisteten Protein- bzw. Peptidproben in einem Volumen von 0,5 μl aufgetragen. Die Membran wurde über Nacht bei 4°C in 1 × Blockierungsreagenz blockiert. Die Membranen wurden dann mit Präimmunserum und Antiserum NtermR31 vom Kaninchen 6304 in einer Verdünnung von 1:1000 in 0,5% Blockierungsreagenz für eine Stunde inkubiert. Nach drei Waschschritten in 1 × PBS bei Raumtemperatur erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper Shp × Rb IgG AlkPhos für eine Stunde bei Raumtemperatur in 0,5% Blockierungsreagenz. Die Membran wurde erneut 3 × 5 Minuten in PBS gewaschen, bevor mit NBT/BCIP Lösung gefärbt wurde. Die Färbelösung wurde nach Erreichen des gewünschten Signal/Hintergrundverhältnisses abgezogen und die Membranen mit Wasser gespült.The Characterization of the polyclonal anti-NtermR31 serum was performed with Help a dot blot method performed. On nitrocellulose membranes were 5 and 50 ng of the above listed protein and peptide samples, respectively in a volume of 0.5 μl applied. The membrane was over Night at 4 ° C in 1 × blocking reagent blocked. The membranes were then treated with preimmune serum and antiserum NtermR31 from rabbit 6304 in a dilution of 1: 1000 in 0.5% blocking reagent for one hour. After three Washing steps in 1 × PBS incubation with the secondary antibody Shp × Rb IgG was carried out at room temperature AlkPhos for one hour at room temperature in 0.5% blocking reagent. The Membrane became 3x5 again Washed in PBS for minutes before staining with NBT / BCIP solution. The staining solution was after reaching the desired Signal / background ratio withdrawn and rinsed the membranes with water.
c) Ergebnisse für polyklonales Serum:c) Results for polyclonal Serum:
Das
Versuchsergebnis ist in
Ein überraschender Befund ist die schlechte bzw. fehlende Detektion des Peptids NtermR13, dass eine Teilsequenz (Kernsequenz) von NtermR31 ist und im homogenen Bindungsassay (AlphaScreen; vgl. unten) die wesentliche Bindungsaktivität aufweist. Eine wahrscheinliche Erklärung für dieses Ergebnis könnte in der bevorzugten Erkennung eines Konformations-Eptiops in NtermR31 durch den polyklonalen Antikörper sein. Nur wenn das Peptid durch intramolekulare Wechselwirkung diese Konforma tion einnimmt, wird es von dem Antiserum deutlich erkannt. Das kürzere NtermR13 Teilpeptid kann diese räumliche Struktur nicht einnehmen und wird daher nicht erkannt. Die vollständige 31 Aminosäuren umfassende Sequenz oder Peptide welche diese Sequenz enthalten sind daher als Immunogen besonders geeignet.A surprising finding is the poor or lack of detection of the peptide NtermR13 that is a partial sequence (core sequence) of NtermR31 and has the essential binding activity in the homogeneous binding assay (AlphaScreen, see below). A likely explanation for this result could be in the preferred recognition of a conformational eptiope in NtermR31 by the polyclonal antibody. Only when the peptide through intramolecular interaction occupies this Konforma tion, it is clearly recognized by the antiserum. The shorter NtermR13 partial peptide can not take this spatial structure and is therefore not recognized. The complete 31 amino acid sequence or peptides containing this sequence are therefore particularly suitable as an immunogen.
Eine weitere mögliche Erklärung könnte eine klar unterschiedliche Immunogenität des Peptids NtermR13 im Vergleich mit den nicht überlappenden Bereichen von NtermR31 (Bereich 1–14; Bereich 28–31) sein. Eine Analyse der Peptidsequenz mit dem Software Paket Abie Pro 3.0 (ChangBioscience.com), das für die Selektion von antigenen Peptidsequenzen zur Antikörperproduktion eingesetzt wird, widerspricht jedoch dieser Erklärung. Die Analyse von NtermR31 mit Abie Pro 3.0 zeigt, dass vier 13-mer Peptide mit guten antigenen Eigenschaften vorhergesagt werden, wobei ein Peptid exakt der Sequenz NtermR13 entspricht. Die drei anderen Peptide sind jeweils um eine Aminosäure N-termial versetzt, so dass auch hier jeweils eine große Überlappung mit NtermR13 gegeben ist. Eine deutlich schlechtere Immunogenität von NtermR13 ist daher eher unwahrscheinlich und die Hypothese der 3D Konformation ist als die wahrscheinliche anzusehen. Diese Konformation kann ebenfalls nicht von den „srambled" Peptiden eingenommen werden, was deren Nichterkennung im Western-dot-blot erklärt.A more possible statement could a clearly different immunogenicity of the peptide NtermR13 in comparison with the non-overlapping Areas of NtermR31 (area 1-14, area 28-31). An analysis of the peptide sequence with the software package Abie Pro 3.0 (ChangBioscience.com), for the Selection of antigenic peptide sequences for antibody production but contradicts this explanation. The analysis of NtermR31 with Abie Pro 3.0 shows that four 13-mer peptides with good antigenic Properties are predicted, with one peptide being exactly the sequence NtermR13 corresponds. The three other peptides are each one amino acid N-termial offset, so that here too each a large overlap given with NtermR13. A significantly poorer immunogenicity of NtermR13 is therefore rather unlikely and the hypothesis of 3D conformation is considered the likely one. This conformation can also not taken by the "srambled" peptides which explains their non-recognition in Western-dot-blot.
d) Versuchsdurchführung für monoklonalen anti-NtermR31 Antikörperd) experimental procedure for monoclonal anti-NtermR31 antibody
Die Charakterisierung des monoklonalen anti NtermR31 Antikörper aus dem Zellkulturüberstand „Clone 37" wurde mit Hilfe eines Dot Blot Verfahrens durchgeführt. Auf Nitrozellulose-Membranen (0,45 μm Porengröße, # LC2001, Firma: Invitrogen) wurden 5 bzw. 50 ng der oben aufgelisteten Protein- bzw. Peptidproben im Triplikat in einem Volumen von 0,5 μl aufgetragen. Die Membran wurde über Nacht bei 4°C in 1 × Blockierungsreagenz (Roche Applied Science; # 1921673) blockiert. Die Membranen wurden dann mit Zellkulturüberstand, bezogen über die Firma Biotrend (Köln, Deutschland), in einer Verdünnung von 1:10 in 0,5% Blockierungsreagenz (Roche Applied Science; # 1921673) eine Stunde inkubiert. Nach drei Waschschritten in 1 PBS bei Raumtemperatur erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper Shp × Ms IgG F(ab')2 AP (Chemikon, # AQ330A) für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer 1:5000 Verdünnung in 0,5% Blockierungsreagenz. Die Membran wurde erneut 3 × 5 Minuten in PBS gewaschen, bevor mit NBT/BCIP Lösung (1 Tablette auf 10ml H2O; Roche Applied Science, # 1697 471) gefärbt wurde. Die Färbelösung wurde nach Erreichen des gewünschten Signal/Hintergrundverhältnisses abgezogen und die Membranen mit Wasser gespült.The characterization of the monoclonal anti NtermR31 antibody from the cell culture supernatant "Clone 37" was carried out by means of a dot blot method On nitrocellulose membranes (0.45 μm pore size, # LC2001, company: Invitrogen) were 5 and 50 ng of the above listed Protein or peptide samples were triplicate plated in a volume of 0.5 μL The membrane was blocked overnight at 4 ° C in 1 × blocking reagent (Roche Applied Science, # 1921673) The membranes were then incubated with cell culture supernatant relative to the cell culture supernatant Biotrend (Cologne, Germany) was incubated for one hour at a dilution of 1:10 in 0.5% blocking reagent (Roche Applied Science, # 1921673) After three washes in 1 PBS at room temperature, incubation was carried out with the secondary antibody Shp × Ms IgG F (ab ') 2 AP (Chemikon, # AQ330A) for one hour at room temperature in a 1: 5000 dilution in 0.5% blocking reagent The membrane was again placed 3 x 5 minutes in PB S washed before using NBT / BCIP solution (1 tablet to 10 mL H 2 O; Roche Applied Science, # 1697 471). The staining solution was withdrawn after reaching the desired signal / background ratio and the membranes rinsed with water.
e) Ergebnisse für monoklonalem Antikörper:e) Results for monoclonal Antibody:
Die
Ergebnisse sind in
Ausführungsbeispiel 3: AlphaScreen-Messung der sRAGE Interaktion mit den Peptiden NtermR31 bzw. NtermR13Exemplary Embodiment 3 AlphaScreen Measurement the sRAGE interaction with the peptides NtermR31 and NtermR13, respectively
a) Materialiena) materials
Für die Messung
der NtermR31 bzw. NtermR13 Bindung an den RAGE Rezeptor wurde das
AlphaScreenTM System (Bestell Nummer:6760610M)
von der Firma Perkin Elmer (Shelton, CT, USA) eingesetzt.
NtermR13
biotinyliert (Thermo Electron, Ulm))
NtermR31 biotinyliert
(Thermo Electron, Ulm)For the measurement of NtermR31 or NtermR13 binding to the RAGE receptor, the AlphaScreen ™ system (order number: 6760610M) from Perkin Elmer (Shelton, CT) was used.
NtermR13 biotinylated (Thermo Electron, Ulm))
NtermR31 biotinylated (Thermo Electron, Ulm)
b) Versuchsdurchführungb) Experimental procedure
Der gesamte homogene Assay wurde in 25 mM HEPES, 100 mM NaCl pH 7,4 und 0,1 % BSA im 20 μl Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthielt 2,5 ng/μl des Fusionsproteins sRAGE-6xHIS (Aminosäuren 23-352, NP_001127), 20 ng/μl Anti-HIS Acceptor-Beads, 20 ng/μl Streptavidin Donor-Beads und NtermR13 bzw. NtermR31 Peptide in den Konzentrationen 0,1,5,10,25,50,100,150 und 300 nM.Of the Total homogeneous assay was performed in 25 mM HEPES, 100 mM NaCl pH 7.4 and 0.1% BSA in 20 μl Volume performed. The batch contained 2.5 ng / μl of the fusion protein sRAGE-6xHIS (amino acids 23-352, NP_001127), 20 ng / μl anti-HIS Acceptor beads, 20 ng / μl Streptavidin donor beads and NtermR13 or NtermR31 peptides in the Concentrations 0,1,5,10,25,50,100,150 and 300 nM.
Die Einzelkomponenten wurden in einer definierten zeitlichen Reihenfolge zusammengebracht: Zunächst wurde sRAGE 6xHIS für 30 Minuten mit den Acceptor-Beads inkubiert. Die verschiedenen Peptidmengen wurden dann zugesetzt, um nach weiteren 30 Minuten die Donor-Beads hinzuzugegeben. Nach weiteren 60 Minuten erfolgte die Fluoreszenzmessung im AlphaQuest Gerät der Firma Perkin-Elmer mit einer Zeitverzögerung von einer Sekunde. Jeder Messpunkt wurde als Triplikat bestimmt. Die Auswertung und grafische Aufarbeitung der Ergebnisse erfolgten mit dem Softwarepaket GraphPrism 4.0.The individual components were brought together in a defined chronological order: First, sRAGE 6 × HIS was incubated for 30 minutes with the acceptor beads. The different peptide men were then added to add the donor beads after a further 30 minutes. After a further 60 minutes, the fluorescence measurement was carried out in the AlphaQuest device from Perkin-Elmer with a time delay of one second. Each measuring point was determined as triplicate. The evaluation and graphical processing of the results was done with the software package GraphPrism 4.0.
c) Ergebnissec) Results
Die
Ergebnisse sind in
Ausführungsbeispiel 4: AlphaScreen-Messung der sRAGE Interaktion mit KontrollpeptidenExemplary Embodiment 4 AlphaScreen Measurement the sRAGE interaction with control peptides
a) Materialiena) materials
Für die Messung der Bindung an den RAGE Rezeptor wurde das AlphaScreenTM System (Bestell Nummer:6760610M) von der Firma Perkin Elmer (Shelton, CT, USA) eingesetzt.For the measurement of binding to the RAGE receptor, the AlphaScreen ™ system (order number: 6760610M) from Perkin Elmer (Shelton, CT) was used.
Folgende
Peptide wurden in biotinylierter Form eingesetzt: Amyloid
Aβ-1-42
Oligomer (hergestellt gemäß WO 2004
067561)
- Unterstrichen: positiv geladene Aminosäuren
- Kursiv: negativ geladene Aminosäure
- Underlined: positively charged amino acids
- Italic: negatively charged amino acid
b) Versuchsdurchführungb) Experimental procedure
Der Assay wurde nach Vorschrift des Herstellers und in 25 mM HEPES, 100 mM NaCl pH 7,4 und 0,1% BSA im 20 μl Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthielt 2,5 ng/μl des Fusionsproteins sRAGE-6xHIS (Aminosäuren 23-352, NP_001127), 20 ng/μl Anti-HIS Acceptor-Beads, 20 ng/μl Streptavidin Donor-Beads und die biotinylierten Peptide in den Konzentrationen 0,10, 30, 100, und 300 nM. Die Peptide, mit Außnahme von Aβ 1–42 Oligomeren, wurden bei 50°C für 10 Minuten unmittelbar vor dem Versuch erhitzt, um mögliche Aggregationen zu lösen.Of the Assay was performed according to the manufacturer's instructions and in 25 mM HEPES, 100 mM NaCl pH 7.4 and 0.1% BSA in 20 μl volume. Of the Batch contained 2.5 ng / μl of the fusion protein sRAGE-6xHIS (amino acids 23-352, NP_001127), 20 ng / μl anti-HIS acceptor beads, 20 ng / μl Streptavidin donor beads and the biotinylated peptides in the concentrations 0.10, 30, 100, and 300 nM. The peptides except Aβ 1-42 oligomers, were at 50 ° C for 10 Minutes immediately before the experiment heated to possible aggregations to solve.
Die Einzelkomponenten wurden in einer definierten zeitlichen Reihenfolge zusammengebracht: Zunächst wurde sRAGE 6xHIS für 30 Minuten mit den Acceptor-Beads inku biert. Die verschiedenen Peptidmengen wurden dann zugesetzt, um nach weiteren 30 Minuten die Donor-Beads hinzuzugeben. Nach weiteren 60 Minuten erfolgte die Fluoreszenzmessung im AlphaQuest Gerät der Firma Perkin-Elmer mit einer Zeitverzögerung von einer Sekunde. Jeder Messpunkt wurde als Triplikat bestimmt. Die Auswertung und grafische Aufarbeitung der Ergebnisse erfolgten mit dem Softwarepaket GraphPrims 4.0.The Individual components were in a defined chronological order brought together: first was sRAGE 6xHIS for Baked for 30 minutes with the Acceptor beads. The different amounts of peptide were then added to the donor beads after a further 30 minutes should admit. After another 60 minutes, the fluorescence measurement was performed in the AlphaQuest device the company Perkin-Elmer with a time delay of one second. Everyone Measuring point was determined as triplicate. The evaluation and graphical The results were processed with the software package GraphPrims 4.0.
c) Ergebnisse:c) Results:
Die
Versuchsergebnisse sind in
Sowohl das völlig unpolare und neutrale Peptid „Unpol13" als auch das negativ geladene Peptid „Minus7" binden in dem Experiment nicht an den Rezeptor, wie die niedrigen kaum sichtbaren Kurven für diese Peptide (Verlauf auf der X-Achse) belegen. Die Hypothese, dass positive Ladungen für die Bindung notwendig sind wird durch die Peptide „ScraNtermR13", „AlterCharge1" und „Plus7" eindrucksvoll bestätigt. Die größte Ladungsdichte besitzt das Heptamer Plus7, was zusammen mit ScraNtermR13 die höchste maximale Signalstärke in dem Versuch erreicht. ScraNtermR13 ist aus den gleichen Aminosäuren aufgebaut wie NtermR13, jedoch in willkürlicher Abfolge. Da diese Kontrolle mit gleicher bzw. leicht höherer Affinität an sRAGE bindet, ist die Aminosäuresequenz nach der derzeitigen Datenlage nur insofern von Relevanz, als dass positive Ladungen in einer bestimmten Dichte vorhanden sein müssen. Dass noch nicht einmal die spezifische Kombination der positiven Ladungsträger für die Bindung notwendig ist, wird durch das Peptid AlterCharge1 belegt, was als 13mer vier positive Ladungen trägt, die jedoch nicht wie beim NtermR13 von 3 Lysinen und einem Arginin stammen, sondern von drei Argininen und einem Histidin.Both the completely nonpolar and neutral peptide "Unpol13" and the negatively charged peptide "Minus7" do not bind to the receptor in the experiment, as evidenced by the low barely visible curves for these peptides (X-axis plot). The hypothesis that positive charges are necessary for binding is impressively confirmed by the peptides "ScraNtermR13", "AlterCharge1" and "Plus7." The highest charge density possesses the heptamer Plus7, which together with ScraNtermR13 has the highest maximum signal strength achieved in the attempt. ScraNtermR13 is composed of the same amino acids as NtermR13, but in an arbitrary sequence. Since this control binds with equal or slightly higher affinity to sRAGE, the current state of the amino acid sequence is only relevant insofar as positive charges must be present at a specific density. The fact that not even the specific combination of positive charge carriers for the binding is necessary, is occupied by the peptide AlterCharge1, which carries four positive charges as 13mer, but not as in the case of NtermR13 of 3 lysines and an arginine, but of three arginines and a histidine.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass offenbar für die Bindung an RAGE ionische Peptid/Rezeptorinteraktionen über positive Ladungen in dem Peptid NtermR13 ausreichend sind. Solche positiven Ladungsaggregationen gehen aber nur dann besonders in den Bindungsvorgang ein, wenn sie in einem grösseren Polypeptid mittels einer besonderen 3D-Faltung auf der Oberfläche eines Polypetids/Proteins z.B. sRA-GE, präsentiert werdenIn summary let yourself adhere to that apparently for binding to RAGE ionic peptide / receptor interactions via positive Charges in the peptide NtermR13 are sufficient. Such positive However, charge aggregations only go into the binding process especially if they are in a bigger one Polypeptide by means of a special 3D-folding on the surface of a Polypetids / proteins e.g. SRA GE, presents become
Ausführungsbeispiel 5: AP-Nogo66 Kompetitions-Assay:Embodiment 5: AP-Nogo66 Competition assay:
a) Materialien:a) Materials:
- Mikrotiterplatten (Maxisorb, Nunc)Microtiter plates (Maxisorb, Nunc)
- AttoPhos Substrat (Roche Nr.1681982, Germany)AttoPhos Substrate (Roche Nr.1681982, Germany)
- His-NogoR: exprimiert in CHO-K1 Zellen und nach Aufreinignung mit einer Reinheit > 90% des niedrig glycosylierten Nogo-Rezeptors mit einem Molekulargewicht von 80 kDa in SDS-PAGEHis-NogoR: expressed in CHO-K1 cells and after purification with a purity> 90% of the low glycosylated Nogo receptor of molecular weight of 80 kDa in SDS-PAGE
- AP-Nogo66 (s.o.)AP-Nogo66 (s.o.)
- sRAGE (s.o.)sRAGE (s.o.)
- Nterm 31 (s.o.)Nterm 31 (see above)
- NtermR13 (s.o.)NtermR13 (s.o.)
- scraNtermR13 (s.o.)scraNtermR13 (s.o.)
- scraNtermR31 (s.o.)scraNtermR31 (s.o.)
b) Versuchsdurchführung:b) Experimental procedure:
Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 0,1 ml einer Lösung von His-NogoR (5 μg/ml in Natriumcarbonatpuffer, pH 9) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Anschließend wurde ein 1-stündiger Blockierungsschritt mit 2-%-igem Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-HCl, pH 7,2, bei Zimmertemperatur durchgeführt. Für Lösungen von His-NogoR, sRAGE und NtermR31 wurden Ausgangskonzentrationen von 200 nM eingestellt. Diese Stammlösungen wurden dann dreifach verdünnt. AP-Nogo66 (3 μg/ml) wurde mit Puffer (Tris-HCl, pH 7,2 und 0,1 % BSA) auf 0,2 nM verdünnt. 0,05 ml AP-Nogo66 (0,2 nM) wurde zu den jeweiligen Verdünnungen der Proteine (0,05 ml) zugesetzt und 90 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die jeweiligen Endkonzentrationen betrugen: 0,1 nM für AP-Nogo66 und 100, 33,3, 11,1, 3,7, und 1,2 nM für His-NogoR, sRAGE und NtermR31.microtiter plates (Nunc Maxisorb) were mixed with 0.1 ml of a solution of His-NogoR (5 μg / ml in sodium carbonate buffer, pH 9) Night at 4 ° C coated. Subsequently became a 1-hour Blocking step with 2% bovine serum albumin (BSA) in Tris-HCl, pH 7.2, carried out at room temperature. For solutions of His-NogoR, sRAGE and NtermR31 were set to starting concentrations of 200 nM. These stock solutions were then thinned threefold. AP-Nogo66 (3 μg / ml) was diluted to 0.2 nM with buffer (Tris-HCl, pH 7.2 and 0.1% BSA). 0.05 ml AP-Nogo66 (0.2 nM) became the respective dilutions of the proteins (0.05 ml) and 90 minutes at ambient temperature incubated. The respective final concentrations were: 0.1 nM for AP-Nogo66 and 100, 33.3, 11.1, 3.7, and 1.2 nM for His-NogoR, sRAGE, and NtermR31.
Nach
jedem Inkubationsschritt wurden die Platten mit Waschpuffer (10
mM Tris-HCl, pH 7,2 und 0,05 % Tween20) gewaschen. Die Bindung von
AP-Nogo66 wurde mit dem Substrat AttoPhos (Roche) für die alkalische
Phosphatase detektiert und die Fluoreszenzeinheiten mit dem Instrument
Polarstar (BMG Labtech, Germany) gemessen. Die Ergebnisse sind für die Proteine
in
c) Ergebnisse:c) Results:
Die
Bindung von AP-Nogo66 an den NgR, der auf der Mikrotiterplatte gebunden
war, wurde durch den gleichen löslichen
Liganden mit einem IC50 von 2 nM blockiert. Überraschenderweise
verhindert das sRAGE Protein im ähnlichen
Konzentrationsbereich mit einem IC50 von
3,5 nM die AP-Nogo66 Bindung (
Ausführungsbeispiel 6: Funktioneller Zytoskelettrearrangement (ACR)-AssayEmbodiment 6: Functional Cytoskeletal tear assembly (ACR) assay
a) Materialien:a) Materials:
- Hek293 RhoA/NgR/p75 (s.o.)Hek293 RhoA / NgR / p75 (s.o.)
- NtermR13 (s.o.)NtermR13 (s.o.)
- NtermR31 (s.o.)NtermR31 (s.o.)
- sRAGE (s.o.)sRAGE (s.o.)
- AP-Nogo66 (s.o.)AP-Nogo66 (s.o.)
- Amphoterin scr; (Thermo Electron, Ulm, DE)Amphoterin scr; (Thermo Electron, Ulm, Germany)
- (NH2Cys(DY555)KSKKVEAVKKAKAGGKPKDRAAYAKEYIDKLEKK-COOH)(NH 2 Cys (DY555) KSKKVEAVKKAKAGGKPKDRAAYAKEYIDKLEKK-COOH)
- MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 VertiefungenMTP Biocoat 96-well microtiter plates
- RPMI-Glutamax (Invitrogen)RPMI glutamax (Invitrogen)
- Phalloidin Alexa 568 oder 488 (Molecular Probes, Eugene, USA)Phalloidin Alexa 568 or 488 (Molecular Probes, Eugene, USA)
- DAPI (Molecular Probes, Eugene, USA)DAPI (Molecular Probes, Eugene, USA)
b) Versuchsdurchführung:b) Experimental procedure:
1 × 104 Hek293 RhoA/NgR/p75 Zellen wurden in MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zwei Tage vor dem eigentlichen Versuchsbeginn überimpft. Die so erhaltenen Zelllinien wurden mit dem jeweiligen RAGE-Peptid (NtermR13, NtermR31, sRA-GE) bei verschiedenen Konzentrationen (0,2 μM, 1 μM, 5μM) oder einem Kontrollpeptid (Amphoterin scr; Konz. = 0.2,1, 5 μM) vorinkubiert. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit dem NgR-Liganden AP-Nogo-66 (9,6 μg/ml) in Kulturmedium enthaltend 5% FCS. Für jede Versuchsreihe wurde ein unstimulierter Kontrollansatz (ohne AP-Nogo66) hergestellt. Nach einer 5- bis 10-minütigen Stimulationsperiode wurde die Aktivierung mit kalter PBS unterbrochen. Die Zellen wurden mit 3–4 %-iger Paraformaldehydlösung fixiert, mit PBS, enthaltend 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und 30–45 Minuten mit Phalloidin Alexa 568 oder 488 inkubiert. Zusätzlich erfolgte eine 5 minütige Inkubation mit DAPI zur Kernfärbung. Die Zellen wurden mit hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (Axiovert 25) visualisiert. Fluoreszenzmikrogramme wurden mit einer gekühlten CCD Kamera von Zeiss aufgenommen und der prozentuale Anteil kontrahierter Zellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl ermittelt.1 x 10 4 Hek293 RhoA / NgR / p75 cells were inoculated into 96-well MTP Biocoat microtiter plates two days before the actual start of the experiment. The cell lines thus obtained were incubated with the respective RAGE peptide (NtermR13, NtermR31, sRA-GE) at various concentrations (0.2 μM, 1 μM, 5 μM) or a control peptide (Amphoterin scr; Conc. = 0.2.1, 5 μM ) preincubated. The cells were stimulated with the NgR ligand AP-Nogo-66 (9.6 μg / ml) in culture medium containing 5% FCS. For each series of experiments, an unstimulated control batch (without AP-Nogo66) was prepared. After a 5-10 minute pacing period, activation was disrupted with cold PBS. The cells were fixed with 3-4% paraformaldehyde solution, permeabilized with PBS containing 0.2% Triton X-100, and incubated with phalloidin Alexa 568 or 488 for 30-45 minutes. In addition, a 5 minute incubation with DAPI for nuclear staining was performed. The cells were visualized using an epifluorescence microscope (Axiovert 25). Fluorescence micrographs were recorded with a cooled CCD camera from Zeiss and the percentage of contracted cells, based on the total cell count, was determined.
c) Ergebnisse:c) Results:
Die
Versuchsergebnisse für
NtermR 31 und sRAGE sind in
Ausführungsbeispiel 7: FIHC-Analyse mit anti-RAGE in transgenem APP-MäusehirnEmbodiment 7: FIHC analysis with anti-RAGE in transgenic APP mouse brain
a) Materialiena) materials
TEST
Waschlösung
(Tris-gepufferte Kochsalzlösung
mit Tween 20, 10-fach Konzentrat; DakoCytomation; Glostrup, Dänemark S3306)
1:10 verdünnt
mit destilliertem Wasser.
Esel-Serum (Serotec GmbH, Düsseldorf,
DE) 5 % in TBSTTEST wash solution (Tris buffered saline with Tween 20, 10X concentrate, DakoCytomation, Glostrup, Denmark S3306) diluted 1:10 with distilled water.
Donkey Serum (Serotec GmbH, Dusseldorf, DE) 5% in TBST
Primärantikörper:primary:
- – Kaninchen-anti-RAGE (Abcam, Distributeur: Acris GmbH, Hiddenhaus, DE,; ab3611) 1:200 verdünnt in TBST- Rabbit anti-RAGE (Abcam, Distributor: Acris GmbH, Hiddenhaus, DE, from 3611) 1: 200 dilute in TBST
- – Kaninchen-anti-RAGE (Biotrend; Köln, DE; anti-31-mer-8508), 1:200 verdünnt in TBST; erfindungsgemäßes anti-NtermR31 Serum; Sekundärantikörper:- Rabbit anti-RAGE (Biotrend, Cologne, DE; anti-31-mer-8508) diluted 1: 200 in TBST; anti-NtermR31 according to the invention Serum; Secondary antibody:
- – Esel-anti-Kaninchen-Cy3 (Jackson Immuno, Distributeur Dianova GmbH, Hamburg, DE), 1:500 verdünnt mit TBST Vectashield hardset mounting medium (Vector Laboratories; Burligame, UK H-1400)- Donkey anti-rabbit Cy3 (Jackson Immuno, Distributor Dianova GmbH, Hamburg, DE), 1: 500 diluted with TBST Vectashield hardset mounting medium (Vector Laboratories; Burligame, UK H-1400)
- – Tg2576 Mäuse (Taconic M&B A/S, Ry, Dänemark), welche das Gen für huimanes Amyloid Präkursor Protein (APP) tragen- Tg2576 Mice (Taconic M & B A / S, Ry, Denmark), which is the gene for huimanes amyloid precursor Carry protein (APP)
b) Versuchsdurchführung:b) Experimental procedure:
Gefrierschnitte mit einer Dicke von 40 μm, angefertigt vom Gyrus dentatus von Tg2576 Mäusen mit einem Alter von 10 Wochen bzw. 11 Monaten wurden 20 Minuten mit Esel-Serum und über Nacht mit einem der Primärantikörper inkubiert. Nach 3 Waschschritten in TBST-Puffer wurden die Schnitte mit Esel-anti-Kaninchen-Cy3- Sekundärantikärper 60 Minuten inkubiert und abschließend dreimal mit TBST-Puffer gewaschen. Die Schnitte wurden dann auf Supertrost Plus Glasträgern aufgebracht, luftgetrocknet und mit einem Deckglas abgedeckt. Fluorezenzaufnahmen der Dünnschnitte wurden in einem Axioplan Imaging System analysiert. (Mikroskop Axioplan Imaging 2; Fa. Carl Zeiss, Jena, Deutschland).Frozen sections with a thickness of 40 μm prepared from the dentate gyrus of Tg2576. Mice 10 weeks and 11 months old, respectively, were incubated with donkey serum for 20 minutes and with one of the primary antibodies overnight. After 3 washes in TBST buffer, sections were cut with donkey anti-rabbit chen-Cy3 secondary antibody for 60 minutes and then washed three times with TBST buffer. The sections were then applied to Supertrost Plus glass slides, air dried and covered with a coverslip. Fluoroscopic images of the thin sections were analyzed in an Axioplan Imaging System. (Microscope Axioplan Imaging 2, Carl Zeiss, Jena, Germany).
c) Ergebnisse:c) Results:
Die
Versuchsergebnisse sind in der beiliegenden
APP transgene Mäuse zeigen eine enorme Stimulation von membrangebundenem RAGE zu einen Zeitpunkt, wo noch keine Amyloidplaques gebildet werden. Wenn Amyloid verstärkt gebildet wird und Paques entstehen (ab dem 9–12 Lebensmonat), verschwindet membrangebundenes RAGE zugunsten von löslichem RAGE, welches im Plasma gemessen werden kann. Alte Tiere haben daher besonders hohe sRAGE Plasmaspiegel.APP transgenic mice show tremendous stimulation of membrane-bound RAGE at a time where no amyloid plaques are formed. When amyloid is increasingly formed and Paques arise (from the 9-12 month) disappears Membrane-bound RAGE in favor of soluble RAGE, which in plasma can be measured. Old animals therefore have very high sRAGE Plasma levels.
Die
Immunhistochemie liefert einen weiteren Beleg dafür, dass
das anti-NtermR31-Antiserum (
Ausführungsbeispiel 8: Nachweis von sRAGE in Mausplasma mittels ELISAEmbodiment 8: Detection of sRAGE in mouse plasma by ELISA
a) Materiala) material
- Mikrotiterplatten (Flexible plate, 96 well, flat bottom, Falcon)Microtiter plates (Flexible plate, 96 well, flat bottom, Falcon)
- Ziege-Anti-mouse RAGE Antibody; R&D Systems; AF1179Goat anti-mouse RAGE Antibody; R & D Systems; AF1179
- Transgene Mäuse (Tg2576)Transgenic mice (Tg2576)
- Streptavidin-AP Conjugate (Roche, Mannheim, Nr. 1089161 Streptavidin-AP Conjugate (Roche, Mannheim, No. 1089161
- AttoPhos Substrate Set (Fa. Roche, Mannheim, Nr. 1681982)AttoPhos Substrate Set (Roche, Mannheim, No. 1681982)
- rekombinantes lösliches Maus-RAGE (Firma R&D Systems, Wiesbaden; Custom03)recombinant soluble Mouse RAGE (company R & D Systems, Wiesbaden; Custom03)
b) Versuchsdurchführung:b) Experimental procedure:
Mikrotiterplatten wurden mit je 100μl Antikörperlösung (Ziege-Anti-Maus RAGE; Stammlösung: 100 μg/ml; verdünnt eingesetzt in einer Konzentration von 1 μg/ml in 50 mM NaHCO3) gecoatet über Nacht bei 4°C. Anschließend wurden die Näpfe je dreimal mit TBS/0,1% Tween 20 gewaschen. Um Adsorptionseffekte zu minimieren wurde mit je 100ml einer 1 % BSA-Lösung in TBS/0,1 % Tween20 eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde wie oben beschrieben je dreimal mit TBS/0,1% Tween 20 gewaschen.Microtiter plates were coated with 100 μl of antibody solution (goat anti-mouse RAGE, stock solution: 100 μg / ml, diluted at a concentration of 1 μg / ml in 50 mM NaHCO 3 ) overnight at 4 ° C. The wells were then washed three times each with TBS / 0.1% Tween 20. In order to minimize adsorption effects, 100 ml of a 1% BSA solution in TBS / 0.1% Tween20 were incubated for one hour at room temperature. Subsequently, as described above, washed three times each with TBS / 0.1% Tween 20.
Als Proben für lösliches Maus RAGE wurde Plasma von 10 Wochen und 12 Monate alten transgenen Mäusen (Tg2576), sowie von Mäusen des nicht transgenen Stammes C57BI6 eingesetzt. Das Plasma wurde in einer Verdünnung 1:20 in TBS/01 % Tween 20 in einem Volumen on je 100 μl eingesetzt. Anschließend wurde je dreimal gewaschen wie oben beschrieben. Als Detektionsantikörper wurde je 100 μl eines biotinylierten Ziegen-Anti-Maus RAGE-Antikörpers (Stammlösung: 50 μg/ml in TBS/0,1%BSA; verdünnt eingesetzt in einer Verdünnung von 1:200 in TBS/0,1% Tween20/0,1% BSA) pro Napf gegeben. Nach Inkubation für 60 Minuten bei Raumtemperatur wurde erneut gewaschen (wie oben). Anschließend wurde mit je 100μl Streptavidin-AP Conjugate in einer Verdünnung von 1:2500 in TBS/0,1 % BSA/0,1 % Tween20 für 2 Stunden inkubiert. Wiederum wurde dreimal gewaschen. Die Enzymmenge wurde mit Hilfe von je 100 μl des AttoPhos Substrate Set nachgewiesen. Nach Inkubation für 90 Minuten wurde die Fluoreszenz in einem Polarstargerät mit Anregung von 440 nm und Emission von 540 nm gemessen.When Samples for soluble Mouse RAGE was plasma from 10 weeks and 12 month old transgenic mice (Tg2576), as well as of mice of the non-transgenic strain C57BI6. The plasma was in a dilution 1:20 in TBS / 01% Tween 20 in a volume of 100 μl each. Subsequently was washed three times as described above. As a detection antibody was 100 μl each of a biotinylated goat anti-mouse RAGE antibody (stock solution: 50 μg / ml in TBS / 0.1% BSA; dilute used in a dilution of 1: 200 in TBS / 0.1% Tween20 / 0.1% BSA) per well. After incubation for 60 At room temperature was washed again (as above). Subsequently was with 100μl each Streptavidin-AP Conjugate diluted 1: 2500 in TBS / 0.1 % BSA / 0.1% Tween20 for Incubated for 2 hours. Again, it was washed three times. The amount of enzyme was with the help of 100 ul of the AttoPhos Substrate Set. After incubation for 90 minutes was fluorescence in a Polarstar with excitation of 440 nm and Emission measured from 540 nm.
Als Kontrolle für den ELISA wurde ein rekombinantes lösliches Maus-RAGE (Firma R&D Systems, Wiesbaden; Custom03) eingesetzt.When Control for the ELISA was a recombinant soluble mouse RAGE (R & D Systems, Wiesbaden; Custom03) used.
c) Ergebnis:c) Result:
Ausführungsbeispiel 9: Kompetition der sRAGE/Aβ-Oligomer-Interaktion durch Anti-NtermR31 und Anti-sRAGE AntikörperEmbodiment 9: Competition the sRAGE / Aβ oligomer interaction by anti-NtermR31 and anti-sRAGE antibodies
a) Materialien und Versuchsdurchführunga) Materials and test procedure
Die Versuche zur Verdrängung der sRAGE – Amyloid Beta Globulomer Bindung durch Antikörper wurden mit der „homogeneous time-resolved fluorescence" (HTRF) Technologie der Firma CIS Bio International (Bagnols, Frankreich) durchgeführt. Die HTRF Donor- und Akzeptor-Komponenten, Anti6HIS-Europiumcryptat (CIS Bio Katalog Nummer:: 61HISKLA; 500 wells/13 μg) und Streptavidin XL – 665 (CIS Bio Katalog Nummer: 611SAXLA, 500 wells/250μg), wurden in jeweils 250 μl H2O bidest. gelöst. Ausgehend von diesen Stammlösungen wurden 1:50 Arbeitsverdünnungen mit einer Endkonzentration von 7.4 nM Anti6His-Cryptate bzw. 121.2 nM Streptavidin XL-665 in PBS, pH 7.4 hergestellt.Antibody sRAGE-amyloid beta globulomer binding displacement experiments were performed using the homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF) technology of CIS Bio International (Bagnols, France) .The HTRF donor and acceptor components, Anti6HIS- Europiumcryptate (CIS Bio catalog number: 61HISKLA; 500 wells / 13 μg) and streptavidin XL - 665 (CIS Bio catalog number: 611SAXLA, 500 wells / 250μg) were dissolved in 250 μl H 2 O redistilled broth starting from these Stock solutions were prepared 1:50 working dilutions with a final concentration of 7.4 nM Anti6His-Cryptate or 121.2 nM Streptavidin XL-665 in PBS, pH 7.4.
Als Negativkontrolle in diesem Versuch diente Kaninchen IgG (Best.Nr.: I5006; Sigma, Taufkirchen, Deutschland). Als positive Kontrolle wurde der polyklonale anti RAGE Antikörper AF1145 (R&D Systems; Wiesbaden, Deutschland) eingesetzt. Die verwendeten anti NtermR31 Immunglobuline wurden, wie an anderer Stelle bereits beschrieben, über die Firma Biotrend (Köln, Deutschland) erworben.When Negative control in this experiment was rabbit IgG (order no .: I5006; Sigma, Taufkirchen, Germany). As a positive control the polyclonal anti RAGE antibody AF1145 (R & D Systems; Wiesbaden, Germany) used. The used anti NtermR31 immunoglobulins were, as already described elsewhere, about the Company Biotrend (Cologne, Germany).
Zur Versuchsdurchführung wurden zunächst in separaten Ansätzen 4 μl des rekombinanten sRAGE Proteins (Herstellung und Reinigung wie beschrieben, Konzentration 1 μM) mit jeweils 4 μl der zu testenden Antikörperlösungen bzw. der IgG Kontrolle in den Konzentrationen 7,14 μM, 3,57 μM, 1,78 μM, 0,892μM, 0,446μM, 0,223μM, 0,112μM, 0,056μM und 0 μM für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.to Experimental Procedure were first in separate approaches 4 μl of the Recombinant sRAGE protein (preparation and purification as described, Concentration 1 μM) with 4 μl each the antibody solutions to be tested or the IgG control in the concentrations 7,14 μM, 3,57 μM, 1,78 μM, 0,892 μM, 0,446 μM, 0,223 μM, 0,112 μM, 0,056 μM and 0 μM for one hour at room temperature incubated.
Danach wurden dem Ansatz 4 μl einer 4 μM Stammlösung des Aβ 1/5 biotin Globulomers zugesetzt (finale Konzentration 800nM) und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die hier angegebene A beta 1/5 biotin Globulomer Konzentration bezieht sich auf die Aβ 1–42 Monomere, die zur Herstellung der Globulomere verwendet wurden. Jeweils 2 μl der oben beschriebenen 7,4 nM Anti6His-Cryptate Lösung und der 121,2 nM Streptavidin wurden zugesetzt, um dann diesen Ansatz weitere zwei Stunden bei nun 4°C zu inkubieren. Nach dem Zusatz von 4 μl einer 2M KF Stammlö sung wurde der Gesamtansatz im BMG Pherastar Fluoreszenzmeßgerät (BMG Labtech GmbH, Offenburg, Deutschland) im HTRF Modus gemessen. Die berechneten %DeltaF Werte wurden in GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA) übertragen und ausgewertet. Die im Graphen angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentration des 20 μl Gesamtansatztes.After that 4 μl were added to the batch a 4 μM stock solution of Aβ 1/5 biotin globulomers added (final concentration 800nM) and a incubated for another hour at room temperature. The specified here A beta 1/5 biotin globulomer concentration refers to the Aβ 1-42 monomers, used to make the globulomers. 2 μl each of the above described 7.4 nM Anti6His-Cryptate solution and the 121.2 nM streptavidin were added to this approach for an additional two hours now 4 ° C to incubate. After adding 4 μl of a 2M KF stock solution the overall approach in the BMG Pherastar fluorescence meter (BMG Labtech GmbH, Offenburg, Germany) Germany) measured in HTRF mode. The calculated% DeltaF values were transferred to GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA) and evaluated. Refer to the concentrations given in the graph on the final concentration of the 20 μl Gesamtansatztes.
b) Ergebnisb) Result
Das
Versuchsergebnis ist in
Claims (34)
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE200510002353 DE102005002353A1 (en) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications |
| EP06706286A EP1838339A2 (en) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | Ager-peptides and use thereof |
| JP2007550773A JP2008526243A (en) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | AGER peptides and uses thereof |
| US11/795,282 US9291621B2 (en) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | AGER-peptides and use thereof |
| PCT/EP2006/000420 WO2006077101A2 (en) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | Ager-peptides and use thereof |
| US14/993,308 US20170008959A1 (en) | 2005-01-18 | 2016-01-12 | Ager-peptides and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE200510002353 DE102005002353A1 (en) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE102005002353A1 true DE102005002353A1 (en) | 2006-07-27 |
Family
ID=36650411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE200510002353 Withdrawn DE102005002353A1 (en) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE102005002353A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111202843A (en) * | 2012-08-31 | 2020-05-29 | 拜尔健康护理有限责任公司 | Anti-prolactin receptor antibody formulations |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001092892A2 (en) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Transtech Pharma, Inc. | Methods to identify compounds that modulate rage |
| US20020177550A1 (en) * | 1998-04-17 | 2002-11-28 | The Trustees Of Columbia University | Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject |
| EP1380593A1 (en) * | 2001-03-19 | 2004-01-14 | Japan as represented by President of Kanazawa University | Soluble rage protein |
| WO2004016229A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Wyeth | Compositions and methods for treating rage-associated disorders |
-
2005
- 2005-01-18 DE DE200510002353 patent/DE102005002353A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020177550A1 (en) * | 1998-04-17 | 2002-11-28 | The Trustees Of Columbia University | Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject |
| WO2001092892A2 (en) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Transtech Pharma, Inc. | Methods to identify compounds that modulate rage |
| EP1380593A1 (en) * | 2001-03-19 | 2004-01-14 | Japan as represented by President of Kanazawa University | Soluble rage protein |
| WO2004016229A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Wyeth | Compositions and methods for treating rage-associated disorders |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MRUTHINTI,Shyamala,et.al.:Autoimmunity in Alzheimers disease * |
| MRUTHINTI,Shyamala,et.al.:Autoimmunity in Alzheimers disease;increased levels of circulating IgGs binding Aβ and RAGE peptides.In:Neurobiol. of Aging 25,(2004),ISSN 0197-4580,S.1023-1032; |
| ncreased levels of circulating IgGs binding Abeta and RAGE peptides.In:Neurobiol. of Aging 25,(2004),ISSN 0197-4580,S.1023-1032 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111202843A (en) * | 2012-08-31 | 2020-05-29 | 拜尔健康护理有限责任公司 | Anti-prolactin receptor antibody formulations |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1928905B1 (en) | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (rgm) protein family and functional fragments thereof, and their use | |
| EP1594891B1 (en) | Amyloid-beta(1-42) oligomers, derivatives thereof, antibodies for the same, method for production and use therof | |
| EP2033971A1 (en) | Bone Morphogenetic Protein (BMP) binding domains of proteins of the Repulsive Guidance Molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof and their application | |
| DE60226036T3 (en) | ANTIBODY THAT DETERMINES THE GM1-GANGLIOSID-BOUND AMYLOID-B PROTEIN AND DNA THAT CODES FOR THIS ANTIBODY | |
| DE60312639T2 (en) | ANTIBODIES TO IGF-IR AND ITS USES | |
| EP2598882B1 (en) | Safe and functional humanized antibodies for use in treating an amyloidosis | |
| DE69833014T2 (en) | HUMAN HUMOLOGICAL HUMOLOGICAL | |
| TW201809004A (en) | Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof | |
| SA515360253B1 (en) | Antibodies recognizing alpha-synuclei | |
| KR20080090408A (en) | Anti-abeta; globulomer antibodies, antigen-binding moieties thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods of producing said antibodies, compositions comprising said antibodies, uses of said antibodies and methods of using said antibodies | |
| EP2700410A1 (en) | Neutralizing monoclonal antibodies against the Nogo-66 receptor (NGR) and uses thereof | |
| KR20170036785A (en) | Human-derived anti-huntingtin (htt) antibodies and uses thereof | |
| WO2002040668A2 (en) | Proteins and dna sequences underlying these proteins used for treating inflammations | |
| RU2350623C2 (en) | ANTI-Nogo ANTIBODIES ("11C7") AND THEIR APPLICATION IN PHARMACEUTICS | |
| US20170008959A1 (en) | Ager-peptides and use thereof | |
| WO2006077101A2 (en) | Ager-peptides and use thereof | |
| DE102005002353A1 (en) | Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications | |
| DE102005015832A1 (en) | Use of receptor multimerization epitope (RME) of advanced glycation end product receptor (AGER) as immunogen, useful for preparing antibodies for diagnosis and treatment of e.g. spinal injuries or diabetic complications | |
| JP2004507210A (en) | Regulation of endothelial cell surface receptor activity in regulating angiogenesis | |
| CN110234344A (en) | There is the neuronal cell protective effect of the antibody of specificity to β-kind of starch peptide protofibril form |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OM8 | Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |