DE102004060742A1

DE102004060742A1 - Mikrosensor

Info

Publication number: DE102004060742A1
Application number: DE200410060742
Authority: DE
Inventors: Uwe Thomas; Klaus Dr. Bauer; Jürgen Prof. Dr. Heinze
Original assignee: THOMAS RECORDING GmbH; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: THOMAS RECORDING GmbH; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2004-12-15
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2006-07-06

Abstract

Ein Mikrosensor (1) hat eine zumindest teilweise sich verjügende Form. Er besteht wenigstens aus einem 20 mum bis 200 mum dicken Träger (11), in den zwei oder mehr Elektroden-Fasern (14) formschlüssig eingebettet sind. Sie sind aus einem Metall oder eine Metallegierung aufgebaut, haben Durchmesser von 4 mum bis 18 mum und durchspannen den Träger (11) in seiner Längsausdehnung vollständig. Meßseitig ragen sie aus ihm heraus und bilden punktförmige Bereiche. Einige von ihnen sind mit einer Schicht (70) und/oder mit einer spezifischen Schicht (80) versehen, die aus einem elektroaktiven Polymer besteht, beispielsweise Polycarbazol, Polythiophen oder Polypyrrol. Punktförmige Bereiche und das meßseitige Ende des Trägers (11) bilden den Sensorkopf (12), der flächig plan oder kegelförmig spitz ausgebildet ist. Gegen Zerstörung läßt sich der Mikrosensor (1) durch eine Kanüle (16) bzw. eine Kapillare (18) schützen. Die Schicht(en) (70) und die spezifische(n) Schicht(en) (80) des aus mindestens einer Multifaser-Mikroelektrode (10) bestehenden Mikrosensors (1) werden elektrochemisch u. a. mittels der Zyklovoltammetrie aus elektrisch leitenden Lösungen von Monomeren bzw. Salzen hergestellt und verleihen dem Mikrosensor (1) teilchenselektive Eigenschaften. Diese nutzt man, um gezielt Stoffe, beispielsweise Neurotransmitter, und deren Konzentrationen in Lösungen oder in Gewebekompartimenten zu bestimmen.

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikrosensor gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 31. Außerdem umfaßt sie ein Verfahren zur Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes mit dem erfindungsgemäßen Mikrosensor gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 35 und gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 38 sowie eine Verwendung desselben gemäß Anspruch 39 und Anspruch 40.
Man verwendet Mikroelektroden in vielfältiger Weise zur Bestimmung von Inhaltsstoffen in Lösungen und Körperflüssigkeiten. So offenbart GB A 2 284 267 eine Mikrodraht-Elektrode, um den Sauerstoff-Partialdruck im Blut zu bestimmen. Diese besteht aus mehreren Elektroden-Fasern, die jeweils mit einem Borosilikatglas-Mantel umgeben werden. Die so erhaltenen metallfasergefüllten Glaskörper werden in einen Träger eingebettet, der aus einem fluorierten Ethylen/Propylen-Copolymer besteht. Hierzu zieht man sie gebündelt durch ein Extrusionsbad mit geschmolzenem Polymer und wickelt sie nach dem Erstarren auf eine Spule. Jede Elektroden-Faser zuerst mit einem Glasmantel und alle zusammen dann mit einem Polymerträger zu umgeben ist jedoch arbeitsaufwendig und kostenintensiv.
Dies umgeht die US PS 5,002,651 dadurch, daß sie einen Träger aus einem elektrochemisch widerstandsfähigen Polymer beschreibt, in dem wenigstens eine Elektroden-Faser eingebracht ist. Jedoch handelt es sich bei ihr um einen Metallfaden, der auf seiner ganzen Länge mit einer Mischung aus Polymeren und Aktivmolekülen variabler Prozentanteile beschichtet ist. Auch eine derart konzipierte Mikroelektrode ist aufwendig und teuer in der Herstellung.
Die DE A1 101 12 384 vermeidet diese Nachteile und beschreibt eine Ultramikro-Elektrode mit einer zentrisch in einen zylindrischen Körper eingebetteten Elektroden-Faser und wenigstens drei diese Faser isoliert umgebenden weiteren Elektroden-Fasern. Alle Fasern bestehen aus einem einheitlichen Material wie etwa Metall und sind unmittelbar in einen beispielsweise aus Quarzglas bestehenden zylindrischen Körper integriert. Weil die beschriebene Ultramikro-Elektrode jedoch einen flächig plan oder konkav ausgeführten Sensorkopf besitzt, lassen sich kleine Öffnungen an Zellen oder Membranen nicht in jedem Fall durchdringen. Es ist also nicht jede beliebige Meßumgebung uneingeschränkt erreichbar. Außerdem läßt sich nicht vollkommen ausschließen, daß die offenbarte Mikroelektrode infolge ihrer Geometrie bzw. ihrer polymeren Beschichtung die chemische und physikalische Situation einer Meßprobe in einer über die Messung hinausgehenden Weise verändert.
Ziel der Erfindung ist es, diese und weitere Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und einen Mikrosensor zu schaffen, der kostengünstig und einfach herzustellen ist. Dabei soll er verschiedenste Arten von Signalen selektiv und präzise auch nebeneinander empfangen und eine Sonde zur quantitativen Bestimmung der verschiedensten Substanzen sein. Zudem wird eine lange Betriebsbereitschaft auch in wechselnden Meßumgebungen bei gleichbleibend hoher Meßgenauigkeit angestrebt.
Hauptmerkmale der Erfindung sind im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1, 31, 35 und 38, sowie in den Ansprüchen 39 und 40 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 30, 32 bis 34, 36 und 37.
Bei einem Mikrosensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium bestehend aus einer Multifaser-Mikroelektrode mit wenigstens zwei Elektroden-Fasern, von denen wenigstens eine als Gegenelektrode und/oder als Referenzelektrode ausgeführt ist und mit einem Träger, der ein alle Elektroden-Fasern gleichzeitig umschließender einstückiger, gegenüber dem flüssigen Medium indifferenter elektrischer Isolator ist, in dem die Elektroden-Fasern voneinander isoliert eingebettet sind, wobei jede von ihnen mit dem Träger stoffschlüssig direkt verbunden ist, sieht die Erfindung vor, daß der Mikrosensor eine zumindest teilweise konische Form besitzt und wenigstens eine der Fasern eine Arbeitselektrode ist, die meßseitig mit einer spezifischen Schicht aus einem biologisch verträglichen, elektroaktiven Polymer versehen ist. Durch diese Konzeption erreicht man, daß mit dem gleichen Mikrosensor eine elektrochemische Aktivität an Zellverbünden als Ganzes, beispielsweise an neuronalen Netzwerken, aber auch an Einzelzellen eines Zellverbundes lokalisiert und vermessen werden kann. Außerdem lassen sich Feststoff- oder Flüssigkeitsoberflächen unterschiedlicher Größe in einem Schritt gezielt auf das Vorhandensein bestimmter u.U. unterschiedlicher Teilchen hin untersuchen. Obwohl bei diesen Messungen elektrochemische Signale sehr variabel und verschieden stark ausgeprägt sind, gelingt es, jedes von ihnen präzise zu erfassen und weiterzuleiten. Auch im Dauerbetrieb kommt es nicht zu Ausfällen. Die zumindest teilweise konisch zulaufende und damit enge Mikrosensor läßt sich in schmalporige oder membranumschlossene Umgebungen einführen, wobei das elektroaktive Polymer infolge seiner biologischen Verträglichkeit keine die Messung beeinträchtigenden Veränderungen in einem Untersuchungsmedium hervorruft.
Nach Anspruch 2 ist die Multifaser-Mikroelektrode mit einer Mikroplatine verbunden, an die Kontaktdrähte aus einem Edelmetall angelötet sind. Diese Verbindung bildet die Schnittstelle zwischen Bauteilen mit Mikrometer-Abmessungen und einer viel größer bemessenen externen elektrischen Versorgung. Weil die Mikroplatine in unmittelbarer Nachbarschaft zur Multifaser-Mikroelektrode als starres Glied angebracht ist, wird eine starke mechanische Verformung der Elektroden-Fasern zwischen Platine und Träger vermieden und dadurch die Gebrauchsdauer des Mikrosensors erhöht.
Anspruch 3 offenbart als wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Mikrosensors, daß sein Träger ein runder oder ovaler Quarzglasmantel ist. Durch seine gerundete Form ist er leicht in die verschiedensten Kavitäten einführbar. Quarz als harter und sehr temperaturbeständiger Werkstoff macht den Mikrosensor überdies universell einsatzfähig ohne daß zu befürchten bleibt, Teile des Trägers könnten unter bestimmten Meßbedingungen in Lösung gehen und somit Analysenergebnisse verfälschen.
Ebenso wesentlich ist es für den Mikrosensor, daß seine Elektroden-Fasern nach Anspruch 4 aus einem edlen Metall, beispielsweise aus Platin und/oder einer Platin/Wolfram-Legierung gefertigt sind und einen Durchmesser von 4 bis 18 μm, in einer bevorzugten Ausgestaltung von 10 bis 12 μm besitzen. Durch die beanspruchten Edelmetalle oder Edelmetalllegierungen ist sichergestellt, daß die Elektroden-Fasern langlebig und nicht oxidationsanfällig sind. Die gewählten Durchmesser garantieren einerseits problemlose Leitffähigkeit, sind andererseits jedoch so gering, daß Flächenbereiche mit Mikrometer-Abmessungen problemlos überstrichen und vermessen werden können.
Von besonderer Bedeutung für die Erfindung ist auch Anspruch 5, nach dem wenigstens eine Elektroden-Faser mit einer Schicht belegt ist und unterschiedliche Elektroden-Fasern mit unterschiedlichen Schichten und/oder mit unterschiedlichen spezifischen Schichten versehen sind. Nur durch diese Merkmalsausbildung ist es möglich, Elektroden für bestimmte Teilchen, Ionen oder Moleküle selektiv zu machen. Um besonders stabile Meßergebnisse zu erhalten, befindet sich die Schicht und/oder die spezifische Schicht gemäß Anspruch 6 nur auf einem Teil der Elektroden-Faser, der nicht an den Träger angrenzt.
Für die Erfindung ist es nach Anspruch 7 unerläßlich, daß die Elektroden-Fasern an einer Seite, die in Richtung eines Kontaktierungsendes zeigt, von dem sie umgebenden Träger freigelegt und an die Mikroplatine angelötet sind. Ohne dieses Freilegen könnte die Tetrode nicht mit der Mikroplatine verbunden werden und der Mikrosensor den Strom nicht an ein Meßgerät weiterleiten. Anspruch 8 bestimmt, daß die freigelegte Seite der Elektroden-Fasern, die Mikroplatine und Enden der Kontaktdrähte in einer Klebstoffmatrix eingebettet sind und zusammen das Kontaktierungsende bilden. Es ist sinnvoll, diese Bestandteile des Mikrosensors in einem Klebstoffblock zu fixieren, um sie vor Beschädigungen oder Abriß zu schützen und im Mikrosensor Wackelkontakte und Kurzschlüsse zu verhindern.
In einer Ausgestaltung der Erfindung nach Anspruch 9 weist der Mikrosensor n Elektodenfasern auf, wobei n einen ganzzahligen Wert von 2 bis 50, vorzugsweise von 3 bis 13 und am bevorzugtesten von 4 bis 6 annimmt und die einzelnen Fasern beispielsweise äquidistant zueinander angeordnet sind. Sie sind nach Anspruch 10 außerdem so zueinander gruppiert, daß eine zentrisch angeordnete Elektroden-Faser von n Elektroden-Fasern vorzugsweise konzentrisch umgeben ist, wobei n einen ganzzahligen Wert von 1 bis 49, vorzugsweise von 2 bis 12 und am bevorzugtesten von 3 bis 6 annimmt. Nur mit derart aufgebauten Sensoren lassen sich mehrere Teilchen simultan nebeneinander in einem definierten Meßvolumen nachweisen. Dies gelingt außerdem besonders gut, wenn die einzelnen Fasern nach Anspruch 11 so geschaltet sind, daß sie voneinander unabhängig elektrisch ansprechbare Mikro-Scheibenelektroden mit elektrischer Abschirmung bilden.
Um in mikroporöse Strukturen und Zellzwischenräume eindringen zu können, hat die Multifaser-Mikroelektrode laut Anspruch 12 einen Durchmesser von kleiner oder gleich 250 μm. Zudem besitzt sie nach Anspruch 13 an einem Ende, das dem Kontaktierungsende gegenüberliegt einen Sensorkopf, der eine kreisrunde oder ovale bzw. zumindest teilweise konisch verjüngte, glatt polierte Oberfläche aufweist. Mit einer solchen Topographie erhält man gut reproduzierbare und homogene Meßsignale.
Eine kompakt gebaute und vielseitig einsetzbare Form der Multifaser-Mikroelektrode ist eine Tetrode nach Anspruch 14, bei der drei Elektroden-Fasern eine vierte, zentral im Träger angeordnete Elektroden-Faser konzentrisch umgeben. Es handelt sich bei ihr gemäß Anspruch 15 um eine kreisrunde oder ovale Faser mit einem Durchmesser von 50 bis 110 μm und in bevorzugter Ausführung von 70 bis 90 μm. Zudem besitzt sie eine Länge von 5 bis 15 cm und vorzugsweise von 10 bis 12 cm.
Diese einem Haar vergleichbare Form verleiht der Tetrode Elastizität und erlaubt es, sie nicht nur in Lösung sondern auch an und in verschiedenen zellulären Geweben für Messungen zu verwenden. Dabei kann durch ihre schlanke Geometrie eine Verschiebung oder Traumatisierung einzelner Zellen im untersuchten Zielgebiet weitestgehend vermieden werden. Weil die vier gegeneinander isolierten Fasern sich auf engstem Raum befinden, lassen sich auch nahe beieinander liegende Flächenbereiche überstreichen und vermessen.
Die beanspruchte Tetrode ist überdies als Ringscheiben-Elektrode verwendbar, wenn man die konzentrisch angeordneten Elektroden-Fasern zu einer Ringelektrode zusammenschaltet und die zentrische Elektroden-Faser als zweite Elektrode einer Meßkette verwendet. Diese Ansteuerung der vier Elektroden-Fasern sorgt infolge des sogenannten „Tetrodeneffekts" auch dafür, daß Einzelsignale aus einem neuronalen Summensignal herausgefiltert werden können.
Die Stabilität des Mikrosensors erhöht sich, wenn die Multifaser-Mikroelektrode gemäß der Weiterführung in Anspruch 16 beispielsweise mittels eines Klebers auf Epoxid- oder Acrylharz-Basis in eine Kanüle eingeklebt ist. Letztere besteht gemäß Anspruch 17 aus einem Glasmaterial oder aus Edelstahl und besitzt einen Außendurchmesser von 250 μm bis 350 μm, vorzugsweise von 280 μm bis 305 μm. Derart dimensionierte Kanülen verursachen an einem zu untersuchenden Zielgewebe so gut wie keine Verletzungen und sind biologisch gut verträglich. Außerdem schirmen sie das Innere des Mikrosensors gegen äußere elektrische oder elektrochemische Einflüsse ab.
In einer vorteilhaften Erweiterung nach Anspruch 18 sind die Tetrode und die Kanüle am Kontaktierungsende beispielsweise durch eine Klebeverbindung fixiert. Dies gewährleistet eine schnelle Weiterleitung von Signalen an die Mikroplatine und macht Kurzschlüsse, die beim Verrutschen von Tetrode gegen Mikroplatine entstehen könnten, unmöglich.
Will man den Mikrosensor noch robuster gestalten, befestigt man ihn in einer praktischen Ausgestaltung der Erfindung nach Anspruch 19 in einer Kapillare, beispielsweise indem man ihn mit Acryl- oder Epoxidharz in ihr einklebt. Diese besteht nach Anspruch 20 zweckmäßigerweise aus Glas und/oder aus einem biegeelastischen Kunststoff. Beide Materialien sind mechanisch beanspruchbar und biologisch kompatibel.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung nach Anspruch 21 ist es besonders günstig, zwei der Elektroden-Fasern über einen Kontaktdraht als Gegenelektrode zusammen zu schalten, denn dadurch erhöht man innerhalb einer Meßumgebung eine durch die Gegenelektrode erfaßte Bezugsmeßfläche. Soll diese Fläche in unmittelbarer Nachbarschaft zu allen anderen Elektroden-Fasern angeordnet sein, ist es günstig, wenn im Sinne von Anspruch 22 eine zentrisch und eine konzentrisch angeordnete Elektroden-Faser zusammengeschaltet die Gegenelektrode bilden. Eine solche Anordnung ist immer dann besonders erstrebenswert, wenn eine zu bestimmende Konzentration eines Inhaltsstoffs sich selbst in kleinen Flächenbereichen einer Probe schnell ändert.
Soll eine miniaturisierte Zweistabmeßkette konzipiert werden, die ohne externe Elektroden auszukommen hat, ist die erweiternde Ausführung nach Anspruch 23 unerläßlich. Diese verlangt, daß die Schicht auf der Referenzelektrode vorhanden ist und aus abgeschiedenem Silber besteht, welches an seiner Oberfläche chemisch zu Silberchlorid umgesetzt ist.
Von dort gelangt man durch eine vielversprechende Erweiterung zu einer speziellen Dreistabmeßkette, wenn im Mikrosensor im Sinne von Anspruch 24 die spezifische Schicht für wenigstens einen Inhaltsstoff selektiv ist und aus einem elektrisch leitfähigen Polymer besteht. Durch diese erfindungsgemäße Weiterbildung gelingt es, auf engstem Raum eine klassische Dreielektroden-Anordnung von Arbeits-, Gegen- und Referenzelektrode zu realisieren. Mit ihr können gezielt Inhaltsstoffe, beispielsweise radikalisches Stickstoffmonoxid (NO) oder oxidierbare Lebensmittelbestandteile in einem flüssigen Medium bestimmt werden.
Besteht das leitfähige Polymer nach Anspruch 25 aus miteinander konjugiert verbundenen heterozyklischen Aromaten, so verhindert die daraus gebildete elektrochemisch aktive, gut auf der Edelmetalloberfläche haftende Polymerschicht wirkungsvoll ein Elektrodenfouling, also die Adsorption von Analyt-Teilchen an der Metalloberfläche der Arbeitselektrode. Diese bleibt somit lange einsetzbar und zeigt reproduzierbare Meßströme an.
Eine für die Erfindung ganz wesentliche Weiterbildung besteht darin, daß das leitfähige Polymer nach Anspruch 26 ein Polycarbazol und/oder ein Polythiophen ist. Beide heterozyklischen Verbindungsklassen eignen sich sowohl jeweils einzeln, als auch in Wechselwirkung miteinander sehr gut als elektroaktive Elektrodenbeschichtungen. An ihnen lassen sich Neurotransmitter bzw. Vitamin C quasi reversibel umsetzen. Dabei zeigen sich für Dopamin, Serotonin und Ascorbat markante Stromausbeuten. Polythiophen bildet zudem eine sehr gut strukturierte und homogene Schicht auf der Arbeitselektrode aus.
In einer weiterführenden Bauform des Mikrosensors nach Anspruch 27 ist das leitfähige Polymer ein Polypyrrol. Neurotransmitter lassen sich an einer aus diesem Polymer gebildeten Beschichtung ebenfalls selektiv umsetzen. Polypyrrol zeigt auf einer Platin-Elektroden-Faser eine besonders ausgeprägte Oberflächenhaftung und eine regelmäßige Oberflächenstruktur. Außerdem eignet sich eine Schicht aus Polypyrrol für die wärmeinduzierte Anreicherung von Kohlenstoff auf der Elektrodenfaser.
Die Erfindung erfährt nach Anspruch 28 eine wesentliche Erweiterung, weil die für einen Inhaltsstoff spezifische Schicht dotierbar oder dotiert ist, beispielsweise mit Verbindungen, die auf sie einen sterischen und/oder ladungsverändernden Einfluß haben. Durch dieses Merkmal erhöht man die Langlebigkeit einer auf einer Arbeitselektrode abgeschiedenen Polymerschicht. Außerdem werden ihre teilchenselektiven Eigenschaften nochmals verbessert. Besonders ergiebig ist es, wenn die spezifische Schicht nach Anspruch 29 mit speziellen Ionen dotiert ist, beispielsweise mit Metall- oder Halogenid-Ionen oder mit Ionen aus quartären Ammoniumsalzen, Borhalogeniden, Phosphorhalogeniden oder Perchloraten.
Für manche Anwendungen ist es auch erforderlich, die Erfindung gemäß Anspruch 30 weiterzuführen. Hierzu ist die unbeschichtete Arbeitselektrode aufgerauht, beispielsweise mittels Schwefelsäure. Schlecht haftende Polymerschichten verlangen eine solche Vorbehandlung oder Grundierung, um dann auf der Arbeitselektrode permanent fixierbar zu sein, was eine Voraussetzung für reproduzierbar stabile Meßergebnisse ist.
Für die Erfindung ist der unabhängige Anspruch 31 sehr bedeutend. Er offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Mikrosensors für die Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium, bei dem erfindungsgemäß wenigstens zwei Edelmetalldrähte in eine Quarzröhre gegeben und diese in der Hitze unter Zugspannung nach Taylor verformt wird; die verformte Quarzröhre an einer Seite entfernt wird, so daß die Metalldrähte als Elektroden-Fasern freigelegt werden; ein den freigelegten Elektroden-Fasern gegenüberliegender meßseitiger Bereich der Multifaser-Mikroelektrode zu einem Sensorkopf flächig glatt poliert wird, und zumindest eine der Elektroden-Fasern am Sensorkopf mit einer elektroaktiven Schicht und/oder mit einer elektroaktiven spezifischen Schicht versehen wird.
Bei einer derartigen Verfahrensweise werden in Serie herstellbare Mikrosensoren gleichbleibender Qualität erhalten, die mechanisch stabil sind und am Sensorkopf auch nach vielen Messungen keine Erosionserscheinungen zeigen. Auch die Schwierigkeit, ein Metall an oder in einem Quarzkörper ohne Verwendung zusätzlicher Haftvermittler dauerhaft zu befestigen, wird mit diesem Verfahren elegant überwunden. Schließlich eignet sich eine derart beschichtete Elektrode zum selektiven Nachweis ausgewählter Teilchen.
Nach Anspruch 32 wird der Sensorkopf so poliert, daß er eine konische Form aufweist oder einen Teilkegel ohne Kegelspitze bildet. Diese Formgebung erleichtert das Einführen des Mikrosensors in engwandige Höhlungen und poröse Kavitäten beträchtlich. Im Einklang mit Anspruch 33 ist es möglich, als elektroaktive Schicht ein leitfähiges Polymer elektrochemisch oder chemisch abzuscheiden. Diese Verfahrensweise erweitert das Spektrum möglicher einzusetzender chemischer Verbindungen. Um einen Übergang von der Multifaser-Elektrode zu einem Meßgerät zu schaffen, wird diese in der Ausgestaltung von Anspruch 34 an den freigelegten Elektroden-Fasern mit einer Mikroplatine verbunden. Hierdurch stellt man sicher, daß aufgenommene Signale unverfälscht an eine Meßvorrichtung weitergegeben werden Will man den Erfindungsgegenstand für Messungen einsetzen, definiert der unabhängige Verfahrensanspruch 35 die hierzu erforderliche Verfahrensschritte. Zur Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium mit einem Mikrosensor mit Sensorkopf wird besagter Sensor an einen hochempfindlichen Potentiostaten angeschlossen; mit dem Sensorkopf voran in das flüssige Medium, beispielsweise innerhalb eines Gewebekompartiments eingeführt und mittels zyklischer Voltammetrie Strom- Spannungskurven aufgenommen. Diese Vorgehensweise gestattet es, Inhaltsstoffe bis hinab zu wenigen μmol/l in einer Untersuchungsumgebung nachzuweisen. Außerdem kann man so eine sogenannte Multi-Unit-Aktivität, beispielsweise die neuronale Aktivität vieler Neurone, elektrochemisch untersuchen und gleichzeitig Einzelzellaktivitäten aus diesem sogenannten Summensignal isoliert vermessen. Ebenso kann bei Abrasterung einer Zellkultur mit einem rasterelektrochemischen Mikroskop (= SECM) bei einem konstanten Potential nur ein Wirkstoff selektiv umgesetzt und seine lokale Ausbreitung durch das resultierende dreidimensionale Stromprofil räumlich verfolgt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert schnelle Informationen über Bestandteile des flüssigen Mediums, wenn man nach Anspruch 36 aus der Strom- Spannungskurve für einen Meßpeak einen zugehörigen Spannungswert abliest und diesen anhand von Vergleichswerten einem Inhaltsstoff zuordnet. Außerdem erfährt man in der Ausgestaltung nach Anspruch 37 auf unkomplizierte Weise, wie konzentriert ein Inhaltsstoff im flüssigen Medium vorliegt. Hierzu muß man aus der Strom-Spannungskurve für einen Meßpeak einen zugehörigen Stromwert ablesen und diesem anhand einer für einen Inhaltsstoff charakteristischen Strom/Mengen-Eichgeraden eine entsprechende Menge zuordnen.
Anspruch 38 beschreibt eine besondere Ausgestaltung der Erfindung und soll deshalb individuellen Schutz genießen. Es handelt sich um ein Verfahren zur analytischen Bestimmung wenigstens eines in einem Organismus, beispielsweise innerhalb des Gehirns vorhandenen Inhaltsstoffes mit einem Mikrosensor;

– bei dem in einen Schädel ein kreisrundes Loch gebohrt wird, durch das ein aus Futter und Dorn bestehender Mandrin bis in eine Zielregion des Gehirns eingeführt wird;
– der Dorn herausgezogen und der erfindungsgemäße Mikrosensor eingeschoben und bis an die Zielregion herangeführt wird;
– mittels zyklischer Voltammetrie Strom- Spannungskurven aufgenommen werden;
– auf einem Bildschirm oder an einem Meßgerät die erhaltenen Kurven übereinanderlegt sowie Spannungswerte abgelesen werden und durch Zuordnung zu Eichwerten ein Inhaltsstoff identifiziert wird;
– und Stromwerte abgelesen werden, die man auf eine für den Inhaltsstoff spezifische Eichgerade abträgt und dadurch den Inhaltsstoff mengenmäßig bestimmt.

Dieses Verfahren gestattet es nicht nur, pathophysiologische Mechanismen insbesondere neurodegenerative Fehlbildungen und Erkrankungen postoperativ zu erforschen. Es erlaubt auch, aus intraoperativ aufgezeichneten Daten Störungen eines Populationssignals von Basalganglienkernen und nachgeschalteten motorischen Zentren in systemphysiologischen Ansätzen genauer zu analysieren. Dabei kann durch Verfahren des Mikrosensors ein Gewebe sozusagen elektrophysiologisch „gescannt" werden.
Die Bauform des Mikrosensors prädestiniert ihn für eine in Anspruch 39 formulierte Verwendung zur qualitativen und quantitativen Detektion von Neurotransmitern und/oder Antioxidantien in Lösungen und an oder in biologischem Material. Hierzu tragen in gleicher Weise seine Geometrie und seine kleine Bauform bei. Auch seine teilchenselektive Polymerbeschichtung ist wichtig. Dies gilt auch für die in Anspruch 40 formulierte Verwendung des Mikrosensors zur Verschiebung von Gleichgewichten zwischen oxidierten und reduzierten Formen eines Neurotransmitters oder eines Hormons innerhalb von Zellgewebeverbänden und interzellulären Zwischenräumen.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen:
1a eine abschnittweise schematische Ansicht eines Mikrosensors mit einer Tetrode als Multifaser-Mikroelektrode,
1b eine schematische Schrägansicht auf den vorderen Teil eines anderen Mikrosensors mit einer Tetrode als Multifaser-Mikroelektrode,
2 eine fotographische Draufsicht auf einen Sensorkopf des Mikrosensors aus 1,
3 eine schematische Draufsicht auf eine andere Bauform des Sensorkopfes,
4 mit einem polythiophen-beschichteten Mikrosensor in phosphatgepufferter Lösung erhaltene Strom/Spannungs – Kurven für verschiedene Dopamin-Konzentrationen,
5 eine Ausschnittvergrößerung von 4,
6 eine mit einem polythiophen-beschichteten Mikrosensor erhaltene Strom/Konzentrations – Kurve für Dopamin,
7 mit einem polythiophen-beschichteten Mikrosensor in phosphatgepufferter Lösung erhaltene Strom/Spannungs – Kurven für a) gelöstes Dopamin, b) gelöstes Serotonin und c) eine Mischung von gleichen Anteilen gelösten Dopamins und Serotonins,
8 Strukturformeln von a) Dopamin, b) Serotonin und c) Noradrenalin,
Unter Multifaser-Mikroelektrode 10 ist jede Mikroelektrode mit einem Träger 11 und wenigstens zwei Elektroden-Fasern 14, also auch eine dreifasrige Triode, eine fünffasrige Pentode oder allgemein eine n-fasrige Mikroelektrode zu verstehen, wobei n jeden ganzzahligen Wert größer gleich 2 annehmen kann. Der nachfolgend beschriebene Mikrosensor 1 enthält als Multifaser-Mikroelektrode 10 eine vierfasrige Elektrode. Alle hierzu gemachten Ausführungen gelten, sofern möglich, auch für Mikrosensoren 1 mit n Elektroden-Fasern 14.
Ein in 1 abgebildeter Mikrosensor 1 besteht aus eine Tetrode 15, die an einer Seite einen Sensorkopf 12 besitzt und an der anderen Seite in ein Kontaktierungsende 20 übergeht. Unter Tetrode 15 versteht man einen Träger 11, in den vier Elektroden-Fasern 14 eingebettet sind ohne einander zu berühren. Sie enden am Sensorkopf 12 und bilden dort punktförmige Bereiche, die bei einer Messung in unmittelbarem Kontakt mit einem zu untersuchenden Medium stehen. Findet in diesem Medium ein elektrochemisches Ereignis statt, so führt dies zu einer lokalen Verschiebung von Ladungen. Diese Ladungsverschiebung überträgt sich am Sensorkopf 12 auf die Elektroden-Fasern 14 der Tetrode 15 und es kommt zu einem elektrischen Signal, das am Kontaktierungsende 20 an eine Mikroplatine 30 und von dort an ein Steuer- und/oder Meßinstrument, beispielsweise an einen hochempfindlichen Potentiostaten, weitergegeben wird.
Die Tetrode 15 besitzt Abmessungen, die mit denen eines Haares vergleichbar sind. Sie ist zwischen 5 cm und 15 cm, idealerweise 10 cm lang und hat einen Durchmesser von 50 μm bis 110 μm, nach Möglichkeit jedoch zwischen 70 μm und 90 μm. Ihr Sensorkopf 12 nimmt in einer Ausführungsform einen Winkel von 90° zur Tetroden-Längsachse ein und bildet eine in das flüssige Medium eintauchende Tetrodenstirnfläche. Diese ist rund oder oval und glatt poliert. Ihr Durchmesser entspricht bei einer zylindrischen Tetrodenform dem der Tetrode 15. Bei einer konischen Ausgestaltung ist ihr Sensorkopfdurchmesser jedoch kleiner und sogar nahezu null, sofern die Tetrode 15 meßseitig, wie in 1b gezeigt, eine Spitze ausbildet. Bei einer solchen Spitzform sind die punktförmigen Bereiche auf einem Kegelmantel angeordnet.
Ein Großteil der Tetrode 15 besteht aus einem elektrisch isolierenden Träger 11 oder Mantel. Neben verschiedenen hochschmelzenden Glaswerkstoffen wie beispielsweise Borosilikat-Glas ist reines Siliziumdioxid in Form von Quarzglas hierfür besonders geeignet. Auch duroplastische, mechanisch auf Zug beanspruchbare Polymere können die Elektroden-Fasern 14 isolierend ummanteln.
Diese Fasern 14 durchspannen die Tetrode 15 in voller Länge und sind stoffschlüssig mit dem Träger 11 verbunden. Sie sind aus einem Draht oder Faden eines wieder erstarrten noblen Metalls gebildet. Besonders gut eignen sich Gold, Silber, Palladium, Kupfer und Platin. Auch Legierungen dieser Edelmetalle mit Vertretern von Übergangsmetallen aus den Gruppen drei bis zwölf des Periodensystems (erste bis achte Nebengruppe) finden Anwendung, so beispielsweise mit Platin vergesellschaftetes Wolfram. Die Elektroden-Fasern 14 haben jeweils einen Durchmesser von 4 bis 18 μm, wobei jedoch Querschnitte von 10 bis 12 μm besonders günstig sind.
Man kann jede der Fasern 14 einzeln elektronisch ansteuern, so daß in einer Tetrode 15 vier voneinander unabhängige Mikro-Scheibenelektroden plaziert sind. Günstigerweise sind, wie in 2 zu sehen, jeweils drei von ihnen koaxial um die im Träger 11 mittig angeordnete vierte Faser 14 gruppiert. Dadurch ist es möglich, die Tetrode 15 auch als Ringscheiben-Elektrode zu betreiben, indem einerseits die mittig angeordnete Faser 14 und andererseits die konzentrisch angeordneten, nun als Ring zusammen geschalteten Elektroden 14 jeweils ein einziges elektrisches Signal erzeugen.
Von den vier Elektroden-Fasern 14 lassen sich auch nur zwei gemeinsam ansteuern oder verbinden. Hierdurch wird am Sensorkopf 12 ein Flächenbereich über dem zu untersuchenden Medium abgedeckt, der entweder nur auf einer den konzentrischen Ring bildenden Kreisfläche liegt oder aber sowohl einen Teil dieser Kreisfläche als auch eine im Zentrum des Sensorkopfes 12 angeordnete Teilfläche erfaßt. Sind die Elektroden-Fasern 14, wie in 3 in Form eines Rechtecks im Träger 11 lokalisiert, kann ein größerer Flächenbereich des Sensorkopfes 12 homogen erfaßt werden.
Die am Sensorkopf 12 endenden punktförmigen Bereiche der Elektroden-Fasern 14 haben keinen stoffschlüssigen Kontakt zum Träger 11, sondern weisen nur in das zu untersuchende Medium. Sie besitzen in einer bevorzugten Ausführungsform in der Art einer miniaturisierten Dreistab-Meßkette eine unterschiedliche, elektrochemische Aktivität. Hierzu werden sie auf verschiedene Weise modifiziert oder belegt und bilden dann eine Gegenelektrode 40, eine Referenzelektrode 50 und eine Arbeitselektrode 60. Wenigstens eine dieser Elektroden 40, 50, 60 besitzt eine durch Glanzbildner hervorgerufene homogen glatte Struktur und/oder Oberfläche.
Die Gegenelektrode 40 besteht aus wenigstens einer unveränderten Elektroden-Faser 14. Um innerhalb einer Meßumgebung von etwa 300 μm² bis 9000 μm² eine möglichst große Bezugsmeßfläche zu erhalten, werden zwei Elektroden-Fasern 14 zu einer Gegenelektrode 40 zusammengeschaltet. Diese überdeckt innerhalb der Meßumgebung eine Bezugsmeßfläche von ungefähr 15 μm² bis 520 μm², wohingegen ein einzelner Elektroden-Faden 14 nur etwa 7 μm² bis 260 μm² erfaßt.
Die Referenzelektrode 50 registriert zusammen mit der Gegenelektrode 40 alle in der Meßumgebung des zu untersuchenden Mediums auftretenden elektrochemischen Änderungen, ist also nicht spezifisch für nur durch bestimmte Ionen oder Moleküle hervorgerufene Zustandswechsel. Sie besteht beispielsweise aus einer mit einer Silberschicht 70 überzogenen Elektroden-Faser 14, wobei die Silberschicht 70 einen Silberchloridüberzug besitzt. Die Metallchlorid-Schicht 70 weist eine Dicke von etwa 1 bis 2 μm auf, wohingegen das darunter befindliche amorphe Metall ungefähr 2 bis 5 μm dick ist.
Um gezielt elektrochemische Signale bestimmter Ionen oder Moleküle sowie gewisser Teilchenfamilien im zu untersuchenden Medium heraus zu filtern, besitzt jede Arbeitselektrode 60 eine spezifische Schicht 80, die elektrisch leitend ist und besonders gut haftet, wenn man den jeweils unbeschichteten Elektroden-Faden 14, insbesondere dessen punktförmigen Bereich zuvor beispielsweise mittels Schwefelsäure aufrauht.
Ein an dieser Schicht 80 pro Analyt-Teilchen gemessener Umsatzstrom ist um so höher, je dicker diese ist. Zur Bestimmung der Konzentration hormonaler Neurotransmitter, wie etwa Dopamin und Serotonin und zum Nachweis von Antioxidantien wie Ascorbinsäure ist die aus einem Polymer bestehende Schicht 80 zwischen 30 nm und 3 μm dick. Sie ist luft- und feuchtigkeitsunempfindlich und wird auch nicht anodisch oxidiert, sofern ein gegen eine Kalomel-Elektrode gemessenes, angelegtes Potential einen maximalen Wert von 0,6 V nicht überschreitet.
Die Schicht 80 besteht aus einem Polycarbazol oder einem Polythiophen bzw. aus einem speziellen Polypyrrol. Unter Polycarbazol bzw. Polythiophen und Polypyrrol versteht man auch Polymere die aus Derivaten von Carbazol, Thiophen oder Pyrrol durch Elektropolymerisation erhalten werden. So fallen unter die Gruppe der Polythiophene auch Polythiophen-3-carbonsäure oder Poly-3-methyl-thiophen sowie Di- oder Trimere dieser Verbindungen, wie Poly-terthiophene und Poly-bithiophene. Diese Polythiophene werden aus Thiophen-3-carbonsäure oder 3-Methyl-thiophen sowie aus di- oder trimeren Verbindungen, wie Terthiophenen oder Bithiophenen erhalten.
Elektropolymerisation bedeutet, die spezifische Polymerschicht 80 galvanostatisch, potentiostatisch oder potentiodynamisch aus einer wenigstens ein Monomer enthaltenden Lösung auf der Arbeitselektrode 60 abzuscheiden. Bei einer galvanostatischen Beschichtung wird während der Elektropolymerisation der angelegte Strom konstant gehalten und eine sich zeitlich ändernde Spannung gemessen, während bei einer potentiostatischen Beschichtung die Spannung konstant gehalten und der sich zeitlich ändernde Strom gemessen wird. Bei einer potentiodynamischen Arbeitsweise wird eine angelegte Spannung variiert und der sich ändernde Strom gemessen. In allen Fällen verbinden sich die eingesetzten Monomere und scheiden sich als spezifische Schicht 80 auf jeder elektrisch kontaktierten Arbeitselektrode 60 ab.
Um die Qualität der Arbeitselektrode 60 zu verbessern, ist deren teilchenspezifische Schicht 80 außerdem chemisch oder elektrochemisch dotiert oder dotierbar. Dies erhöht ihre Stabilität und dient dazu, noch gezielter ausgewählte Moleküle elektrochemisch umzusetzen. Dabei läßt sich durch Wahl eines geeigneten Dotierungsmittels das Leitfähigkeits-Verhalten von Polycarbazol um mehr als das Doppelte steigern.
Man unterscheidet zwischen einer n-Dotierung und einer p-Dotierung. Letztere entsteht, wenn eine vollständig abgeschiedene Polymerschicht 80 in einer Salzlösung durch ein positives Potential teilweise oxidiert wird. Hierdurch entstehen als p-Löcher bezeichnete, positiv geladene Bereiche, die sich entlang der Schicht 80 durch Delokalisation verschieben. In diese Löcher dringen Anionen aus der Salzlösung ein und stabilisieren die Polymerschicht 80. N-dotiert ist eine teilchenselektive Polymerschicht 80, wenn man sie in einer Salzlösung kathodisch reduziert. Nun bilden sich als n-Löcher bezeichnete, negativ geladene Bereiche aus und delokalisieren sich entlang der leitenden Schicht 80. Aus Ladungsneutralitätsgründen diffundieren Kationen der Salzlösung in die gebildeten Löcher und erzeugen so die n-Dotierung.
Bevorzugt führt man Dotierungen in polar aprotischen Lösemitteln, wie beispielsweise Acetonitril (ACN), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimetyhlformamid (DMF), Dioxan, Tetrahydrofuran (THF) sowie anderen alizyklischen oder aliphatischen Aethern und in sehr oxidationsträgen, zyklischen Ketonen durch. Als Dotierungsmittel eignen sich alle gängigen Salze; man nennt sie Leitsalze. Für die Erfindung lassen sich solche der Camphersulfonsäure (CSA) und der Polyvinylsulfonsäure (PVS) sowie Jodide, Bromide, Chloride, Fluoride, Sulfate und Hydrogensulfate einsetzen. Auch verschiedenste Metallionen sind verwendbar. Außerdem eignen sich Nitrate, Phosphorhalogenide, Borhalogenide, Perchlorate und quartäre Ammoniumsalze. Auch Salze mit großen Kationen, wie Tetra-n-butylammoniumhexafluorophosphat (TBAPF₆), Tetra-n-butylammoniumperchlorat (TBACIO₄) und Tetrabutylammoniumtetrafluoroborat (TBABF₄) sind besonders gut verwendbar.
Neben der Dotierung beeinflussen bei der Herstellung des leitenden Polymers auch die elektrochemische Abscheidemethode, ein gewählter Potentialbereich, eine angelegte Potentialänderungsgeschwindigkeit, eine eingestellte Temperatur, die Konzentration an Monomer- oder Oligomer, das verwendete Lösemittel und eingesetzte katalytisch wirkende Basen die Qualität der polymerbeschichteten Arbeitselektrode 60.
Beim Umsatz von neuronalen Botenstoffen oder anderen zyklischen Analyten an einer polycarbazolbeschichteten Arbeitselektrode 60 erhält man nur dann ausgeprägte Strommaxima, wenn die spezifische Polymerbeschichtung 80 vorab unter bestimmten Bedingungen erzeugt wurde. So muß das leitende Polymer durch potentiodynamische, potentiostatische oder galvanostatische Elektropolymerisation aus einem gelösten monemeren Carbazol unter Zusatz einer sterisch gehinderten schwer oxidierbaren Stickstoffbase gewonnen und während des Entstehungsprozesses sofort dotiert werden.
Als sterisch gehinderte Basen gebraucht man Fünf- oder Sechsring-Heterozyklen, die mehrfach alkyliert sind. Hierzu zählen mit mehreren tert-Butyl- sowie Isopropyl- oder Methylresten versehene Pyrrole, Pyrazole und Imidazole, Pyridine, Pyrimidine und Indole. Beispiele hierfür sind 3,5-Methyl-pyrazol, 2,4-Lutidin und 2,4 Di-tert-butylpyridin, 2,4,6-Collidin, 2,4,6 Tri-tert-butyl-pyridin, 2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-pyridin und 1,2,2,6,6-Pentamethyl-4-hydroxypiperidin. Auch 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) läßt sich verwenden.
Beschichtet man den punktförmigen Endbereich einer Elektroden-Faser 14 potentiodynamisch in einem schmalen Potentialbereich von 0,8 V bis 1,4 mit Polycarbazol, erhält man dünne Polymerschichten 80. Diese eignen sich gut zur Detektion geringer Analyt-Konzentrationen. Andererseits bildet sich bei einem potentiostatisch abgeschiedenen Polycarbazol eine dicke Polymerschicht 80, mit der sich gut hohe Neurotransmitter- oder Ascorbinsäure-Konzentrationen bestimmen lassen.
Das aus einem Mono-, Bi- oder Terthiophen gewonnene Polythiophen zeigt beim Umsatz der genannten Analyte ebenfalls ausgeprägte Strommaxima. Jedoch muß auch hier die potentiodynamische, potentiostatische oder galvanostatische Elektropolymerisation und die Dotierung des sich bildenden Polymers simultan stattfinden. Ein Basenzusatz ist nicht erforderlich.
Auch auf einer Elektroden-Faser 14 abgeschiedenes Polypyrrol eignet sich für den Nachweis der genannten hormonalen und antioxidativ wirkenden Analyte. Jedoch gelingt dies nur mit einem galvanostatisch gewonnenen und anschließend bei einem konstanten Potential gezielt überoxidierten Polypyrrol. Bei der galvanostatischen Erzeugung ist zudem der Zusatz einer der genannten sterisch gehinderten Basen erforderlich.
Sowohl Polycarbazole und Polythiophene als auch Polypyrrole haben konjugierte n-Elektronenpaare und leiten den elektrischen Strom. Alle Verbindungen bestehen aus polymeren, aromatischen Ringsystemen und können mit zyklischen Verbindungen im allgemeinen und besonders mit denen der genannten neuronalen Botenstoffe sowie mit Ascorbinsäure Wechselwirken. Das bedeutet, sie halten diese solange im Flächenbereich der Arbeitselektrode 60, bis ein elektrochemisches Ereignis eintritt. Meist handelt es sich hierbei um eine Oxidation der Neurotransmitter, die an der Arbeitselektrode 60 zu einem elektrischen Signal führt. Es kann aber auch eine Reduktion der bereits oxidierten hormonalen Botenstoffe stattfinden, sofern die Arbeitselektrode 60 kathodisch angesteuert wird. Oft finden Oxidation und Reduktion jedoch im schnellen Wechsel statt, denn man verwendet als Meßmethode die Zyklovoltammetrie (ZV) oder die schnelle Zyklovoltammetrie (SZV), um eine Verarmung der zu bestimmenden Moleküle oder Teilchenfamilien im Medium zu vermeiden.
Bei einer zyklovoltammetrischen Messung legt man an die Arbeitselektrode 60 eine negative Spannung an und erhöht sie schrittweise bis zu einem maximalen positiven Wert. Von dort kehrt man genauso schrittweise wieder zum negativen Ausgangswert zurück und detektiert für jeden angelegten Spannungswert einen an der Arbeitselektrode 60 fließenden Strom. Immer dann, wenn ein Oxidations- oder Reduktionsereignis auftritt, ändert sich dieser Strom gegenüber einer Meßkurve ohne ein solches Ereignis.
Diese Tatsache nutzt man, um in einem separaten Experiment denjenigen Konzentrationsbereich eines Analyten zu bestimmen, in dem die gemessenen Stromänderungen linear verlaufen. Hierzu trägt man ermittelte Peakstrom-Werte (y-Achse) von Meßproben bekannter Konzentration gegen eingesetzte Mengen an Neurotransmitter auf und erhält für einen ausgezeichneten Bereich eine Kalibratinsgerade. Innerhalb dieses linearen Konzentrationsbereichs lassen sich in einer Probenlösung unbekannte Mengen an entsprechendem Analyt mit dem Mikrosensor 1 durch Messung der Peakströme verläßlich ermitteln. Somit sind innerhalb dieses Detektionsbereichs auch Konzentrationsänderungen von Neurotransmittern in vivo zuverlässig detektierbar.
Die Elektroden-Fasern 14 der verschiedenen Elektroden 40, 50, 60 und der sie umhüllende als Träger 11 dienende Quarzglasmantel verleihen dem Mikrosensor 1 Stabilität. Diese wird noch erhöht, weil die Tetrode 15 erfindungsgemäß in eine beidseits geöffnete Kanüle 16 eingeklebt ist, wozu in der Regel Haftvermittler auf Epoxid- oder Acrylharzbasis verwendet werden. Besagte Kanüle 16 besitzt die gleiche Länge, wie der Träger 11 und hat einen Außendurchmesser von 250 μm bis 350 μm; nach Möglichkeit liegt er bei 305 μm. Ihre Wandung ist zwischen 1 μm und 3 μm, bevorzugt 1,5 μm dick und besteht aus einem elektrisch abschirmend wirkenden Glasmantel, wobei nicht unbedingt auf hochschmelzende Silikatgläser oder Quarz zurückgegriffen werden muß. Soll die Kanüle 16 als Faraday-Käfig wirken oder als Mantel-Elektrode elektrisch angesteuert werden, ist sie aus Edelstahl oder aus einem anderen, oxidativ schwer angreifbaren Metallwerkstoff gleicher Dimensionierung gefertigt. Beide Kanülen-Typen 16 umhüllen die Tetrode 15 in ihrer Längsausdehnung vollständig. Lediglich am Kontaktierungsende 20 ragen freiliegende Elektroden-Fasern 14 heraus. Hierzu wird die Tetrode 15 vor dem Einführen in die Kanüle 16 in einem definierbaren Bereich mit Flußsäure behandelt und auf diese Weise ihr Isolationsmantel 11 entfernt.
Die freigelegten Elektroden-Fasern 14 sind an der Mikroplatine 30 befestigt, vorzugsweise festgelötet. Auch Kontaktdrähte 32 sind an ihr über Lötstellen gehaltert und verbinden den Mikrosensor 1 mit einer elektrischen Quelle und/oder einem elektronischen Meßinstrument. Freigelegte Enden der Elektroden-Fasern 14, Mikroplatine 30 und Enden der Kontaktdrähte 32 sind in eine Klebstoffschicht eingebettet und bilden so das Kontaktierungsende 20, welches auf der angrenzenden Kanüle 16 aufliegt und mit ihr eine festhaftende Klebeverbindung eingeht. In einer anderen Ausführungsform wird das Kontaktierungsende 20 nicht haftend auf die Kanüle 16 aufgesetzt, sondern so in ihr versenkt und verklebt, daß nur noch die Kontaktdrähte 32 herausragen. Zur punktgenauen und stabilen Fixierung bedient man sich ebenfalls der bereits genannten Kunstharzkleber oder verwendet ein anderes, schnell aushärtendes Polymerisat, das auch aus zwei Komponenten bestehen kann.
Der Mikrosensor 1 läßt sich noch robuster gestalten, indem die Kanüle 16 samt Tetrode 15 und Kontaktierungsende 20 in eine an beiden Enden offene Kapillare 18 eingeschoben und dort mit genannten Klebern verschiebungsfest fixiert wird. Bei kompakter Bauform ragen nur noch die Kontaktdrähte 32 aus der Kapillare 18 heraus. Ist diese 18 für die Mikroplatine 30 jedoch zu engwandig oder soll die Platine 30 mit zusätzlichen Leitungen verbunden werden, kann das noch nicht in Klebeharz eingeschlossene Kontaktierungsende 20 auch auf der Kapillare 18 aufliegen. Es wird erst nach vorgenommener Verschaltung und Verlötung vollflächig mit Klebstoff überzogen und hierdurch endseitig auf der Kanüle 16 und auf der Kapillare 18 festgelegt. Letztere besteht aus Glas, wobei hier nicht unbedingt auf hochschmelzende Verbindungen zurückgegriffen werden muß. Auch biegeelastische, inerte Kunststoffe wie Polytetrafluoroethylen (PTFE) eignen sich gut als schützender Kapillarmantel.
Die Mikroplatine 30 empfängt am Sensorkopf 12 entstehende Signale und übermittelt sie verlustneutral an ein Meßgerät. Außerdem registriert sie von einer Quelle ausgehende elektrische Ereignisse und leitet sie ebenfalls ohne Verlust bis an den Sensorkopf 12. Sie besteht aus einem kupferbeschichteten Kunststoff-Flachmaterial, das eine konisch zulaufende Form besitzt. Beispielsweise hat sie eine Oberfläche von 10 bis 40 mm², nach Möglichkeit um die 25 mm², wobei Kantenlängen von 2 bis 15 mm gängig sind und solche von 4 bis 8 mm bevorzugt werden. Soll die Mikroplatine 30 innerhalb der Kanüle 16 oder der Kapillare 18 versenkt werden, ist ihre Oberfläche wesentlich kleiner und liegt nur noch bei 0,5 mm² oder darunter. Die an der Platine 30 befestigten, streifenförmigen Kontaktdrähte 32 haben einen Durchmesser von 5 μm bis 25 μm, Idealerweise 15 μm und bestehen aus einem Edelmetall, wobei bevorzugt Silber verwendet wird. Sie sind gegeneinander durch einen sie umgebenden Silikonschlauch isoliert. Dieser ist unterbrochen, wenn zwei oder mehrere der gewöhnlich vier vorhandenen Kontaktdrähte 32 miteinander durch Verbindung elektrisch zusammengeführt werden, wie es beispielsweise geschieht, um die von der Gegenelektrode 40 zu überstreichende Bezugsmeßfläche zu vergrößern.
Zur Schaffung des erfindungsgemäßen Mikrosensors 1 werden wenigstens zwei Metalldrähte aus Platin oder einer Platin-Metalllegierung in ein Quarzrohr verbracht und dieses nach der Taylor Methode bei erhöhter Temperatur unter Zugspannung verformt. Die dadurch erhaltene Multifaser-Mikroelektrode 10 ist ein unlösbarer Verbund aus Quarzträger 11 und entstandenen Elektroden-Fasern 14. Er wird an seinem spitzen Ende glatt poliert, so daß der Sensorkopf 12 entsteht. Dieser ist für die Tetrode 15 in 2 und 3 abgebildet. Seine runde oder ovale Oberfläche verläuft senkrecht zur Mikrosensor-Längsachse und besitzt den gleichen Durchmesser wie die Multifaser-Mikroelektrode 10. Die zumindest teilweise konische Form des Mikrosensors 1 kommt bei dieser Ausführungsform entweder durch eine entsprechend deminsionierte Kanüle 16 bzw. Kapillare 18 zustande oder sie ergibt sich aus der Verbindung von Multifaser-Mikroelektrode 10 und Mikroplatine 30.
In einer nicht gezeichneten Ausführungsform poliert man das spitze Ende des Quarzträgers 11 so, daß der Durchmesser des entstehenden Sensorkopfes 12 kleiner als der Durchmesser der Multifaser-Mikroelektrode 10 ist. Diese verjüngt sich demnach meßseitig konisch zu einer stumpfen Kegelspitze. Die punktförmigen Bereiche der Elektroden-Fasern 14 ragen am Sensorkopf 12 aus der Multifaser-Mikroelektrode 10 heraus. Man kann das spitze Ende jedoch auch nur so weit polierend bearbeiten, daß einige Elektroden-Fasern 14 auf der runden Oberfläche des Sensorkopfes 12 und weitere auf einer durch die vom verbleibenden Stumpfkegel gebildete Mantelfläche aus der Multifaser-Elektrode 10 hervortreten. So befindet sich der punktförmige Bereich der zentrischen Elektroden-Faser 14 einer derart polierten Tetrode 15 auf der planen Oberfläche des Sensorkopfes 12 und jene Bereiche der konzentrischen Elektroden-Fasern 14 auf der Mantelfläche der Tetrode 15.
In einer noch anderen in 1b gezeichneten Bauform poliert man die Multifaser-Mikroelektrode 10 an ihrem meßseitigen Ende zu einem gleichmäßigen Kegel. Mithin entsteht eine kegelförmige Spitze, die den Sensorkopf 12 bildet und alle punktförmigen Bereiche auf der Kegelfläche vereint.
Das dem Sensorkopf 12 gegenüber liegende Ende behandelt man auf einer Länge von 2 mm bis 5 cm, in den meisten Fällen jedoch auf einem 1 cm langen Stück mit Flußsäure, um die vier Elektroden-Fasern 14 von ihrem Träger 11 zu befreien. Die freigelegten Fasern 14 werden auf einer Mikroplatine 30 an ausgezeichneten Stellen mit einem Klebstoff auf Kunstharz-Basis oder einem Zweikomponenten-Kleber ortsfixiert. Dann befestigt man die Kontaktdrähte 32 mit genannten Klebstoffen an anderen vorgesehenen Punkten auf der Mikroplatine 30 und überzieht alle Klebepunkte mit einer Lötschicht aus Zinn. Dadurch entsteht eine dauerhaft leitende und feste Verbindung zwischen Elektroden-Fasern 14 Mikroplatine 30 und Kontaktdrähten 32. Um letztere gegeneinander zu isolieren, wird jedem Kontaktdraht 32 ein Silikonschlauch übergestülpt, so daß jeweils nur noch ein endständiges Stück Kontaktdraht 32 unisoliert bleibt. Sollen mehrere Elektroden-Fasern 14 die gleiche elektrische oder elektrochemische Funktion übernehmen, verbindet man die entsprechenden, als Streifen ausgeformten Kontaktdrähte 32 mit einem Lötpunkt oder verdrillt sie mittels einer Zange miteinander.
Die Verbindung aus Multifaser-Mikroelektrode 10, Mikroplatine 30 und verschiedenen Kontaktdrähten 32 stellt eine einfache Form eines Mikrosensors 1 dar. Man umgibt die Mikroplatine 30 vollflächig mit einem der genannten Klebstoffe, der sich auch auf angrenzende Teile der Kontaktdrähte 32 und die freigelegten Elektroden-Fasern 14 verteilt. Das so gebildete Kontaktierungsende 20 läßt man vollständig aushärten, beschichtet die angrenzende Multifaser-Elektrode 10 mit Klebstoff und klebt alles zusammen an bzw. in der Kanüle 16 fest. Die Multifaser-Mikroelektrode 10 füllt das Kanüleninnere vollständig aus, während das Kontaktierungsende 20 entweder endseitig auf der Kanüle 16 klebt oder in ihrem Inneren festliegt. Manchmal ist es auch zweckmäßig, das noch nicht ausgehärtete Kontaktierungsende 20 samt mit Kleber versehener Multifaser-Mikroelektrode 10 sofort auf oder in der Kanüle 16 zu plazieren, wo es nach erfolgter Trocknung ortsfest fixiert ist.
Um den Aufbau des Mikrosensors 1 noch solider zu gestalten, bestreicht man die mit eingeklebtem Mikrosensor 1 versehene Kanüle 16 mit einem der benannten Klebstoffe und befestigt sie in der Kapillare 18. Diese ist oder wird an einem Ende invers konisch ausgezogen. In den so aufgespannten ausreichend großen trichterförmigen Hohlraum läßt sich die Mikroplatine 30 samt Kontaktdrähten 32 einsetzen und beispielsweise durch Eingießen von Epoxidharz fixieren.
In einer nicht gezeichneten Ausführungsform des Mikrosensors 1 wird die Multifaser-Elektrode 10 samt Kontaktierungsende 20 nur in der Kanüle 16 verschiebefest fixiert und ist in der als Führung dienenden Kapillare 18 längsverschieblich gelagert. Bei einer noch anderen ebenfalls nicht gezeichneten, jedoch sehr platzsparenden Variante ist die Multifaser-Mikroelektrode 10 sogar innerhalb der Kanüle 16 frei beweglich und wird auf der einen Kanülenseite durch das Kontaktierungsende 20 und auf der anderen Seite durch eine ringförmige Verdickung am Herausfallen aus der Kanüle 16 gehindert.
Eine der Elektroden-Fasern 14 muß als Referenzelektrode 50 ausgeführt werden, damit bei einem Meßvorgang stabile Potentiale erhalten werden. Deshalb wird zumindest eine der Fasern 14 zunächst elektrochemisch mit Silber beschichtet und die Oberfläche der Silberschicht 70 danach chemisch in Silberchlorid umgewandelt.
Zur Silberbeschichtung taucht man die Multifaser-Mikroelektrode 10 in eine wässrige Lösung von 1 mmol/l bis 100 mmol/l Silbernitrat (AgNO₃), die einen dreifachen molaren Überschuß an Ammoniak (NH₃) enthält. Am punktförmigen Bereich der Faser 14 scheidet man nun bei einer Stromdichte zwischen 0,2 und 10 mA/cm² galvanostatisch reduktiv Silber ab. Hierfür wird die Faser 14 mit einem Arbeitselektroden-Anschluß des Potentiostaten verbunden. Weiterhin besteht die Beschichtungsanordnung aus einer externen Referenzelektrode, nämlich einem reinen Silberdraht und aus einer externen Gegenelektrode in Gestalt eines Platinblechs. Der galvanostatische Beschichtungsvorgang dauert zwischen 100 und 500 Sekunden, je nach Stärke der aufzubringenden Silberschicht, die im Mittel 3 μm dick ist.
Der Mikrosensor 1 wird dann vom Arbeitselektroden-Anschluß entfernt und in eine 1 bis 5 molare salpetersaure Lösung gestellt. Diese enthält zwischen 0,1 und 4 mol/l Kaliumchlorid (KCl). Je nach gewählter Konzentration und Anzahl der zu beschichtenden punktförmigen Bereiche muß 1 bis 10 min abgewartet werden, bis sich durch die oxidierend wirkende Salpetersäure (HNO₃) eine etwa 1,5 μm starke Silberchlorid-Schicht 70 auf jedem versilberten punktförmigen Bereich gebildet hat.
Die so erhaltene Ag/AgCl – Elektrode weist gegenüber einer gesättigten Kalomel-Elektrode (SCE) ein zeitlich stabiles Potential von –38 mV bis –42 mV auf. Damit hat man eine Ag/AgCl-Referenzelektrode 50 geschaffen, die in die Multifaser-Mikroelektrode 10 integriert ist. Bei Messungen unter konstanter Chloridkonzentration, beispielsweise im menschlichen Organismus oder in Zellkulturen, erhält man mit dieser Elektrode 50 eine stabile Referenzelektrode zweiter Art.
Um eine Arbeitselektrode 60 auszubilden, muß wenigstens einer der punktförmigen Bereiche der Elektroden-Faser(n) 14 am Sensorkopf 12 teilchenselektiv beschichtet sein. Für eine elektrisch leitfähige Polycarbazolschicht 80 wird die Multifaser-Mikroelektrode 10 mit ihrer Referenzelektrode 50 unter Argon in eine eletrochemische Zelle überführt. Diese enthält als Lösemittel destilliertes und getrocknetes Acetonitril. Darin ist eines der oben angegebenen-Leitsalze mit einer Konzentration von 0,1 mol/l gelöst. Weiterhin enthält die Lösung als Monomer Carbazol in einer Konzentration von 1 mmol/l bis 10 mmol/l und einen äquimolaren Zusatz einer der oben genannten stickstoffhaltigen Basen. Alle zu beschichtenden Fasern 14 werden über den Arbeitselektroden-Anschluß mit dem hochempfindlichen Potentiostaten verbunden. Als Referenzelektrode verwendet man die in der Multifaser-Mikroelektrode 10 integrierte Ag/AgCl-Referenzelektrode 50 und als Gegenelektrode kontaktiert man einen Platindraht mit dem Potentiostaten. Mit dieser Dreielektroden-Anordnung wird nun am punktförmigen Bereich jeder elektrisch verbundenen Arbeitselektrode 60 zyklovoltammetrisch eine fest haftende Polycarbazolschicht 80 erzeugt. Man durchfährt hierzu in 4 bis 20 Zyklen und vorzugsweise 6 bis 10 Zyklen einen gegenüber der Referenzelektrode 50 gemessenen Potentialbereich zwischen 0 V und 1,5 V mit einer konstanten Potentialänderungsgeschwindigkeit. Diese liegt in einem Bereich von 2 mV/s bis 100 mV/s und bevorzugt bei 20 bis 60 mV/s.
Zur Qualitätskontrolle wird das entstandene Polymer zumindest zyklovoltammetrisch in einer monomerfreien Zelle – die nur Lösemittel und Leitsalz enthält – anhand seiner Be- und Entladungskurve mit drei Zyklen charakterisiert. Bei anodischen Potentialen kommt es zu einer p-Dotierung und Anionen des Leitsalzes wandern in die Polymerschicht 80. Bei kathodischen Potentialen wandern Leitsalz-Kationen in die n-dotierte spezifische Schicht 80. Durch Anlegen dieser unterschiedlichen Potentiale ermittelt man ein maximal mögliches Potentialfenster, in dem die elektroaktive spezifische Schicht 80 reversibel be- und entladbar ist ohne zerstört zu werden. Der fertige Mikrosensor 1 wird dann der Zelle entnommen, mit Lösemittel gespült und an der Luft getrocknet. Dabei nimmt die spezifische Schicht 80 ihren beladenen Zustand an.
Soll eine Arbeitselektrode 60 mit einer Polythiophen-Schicht 80 überzogen werden, wird eine sterisch gehinderte Base nicht benötigt. Ansonsten ist wie bei der Beschichtung mit Polycarbazol zu verfahren, wobei als Monomer ein Thiophen oder eines seiner höheren Homologen mit zwei bis fünf Thiopheneinheiten verwendet wird. Auch mit funktionellen Gruppen oder Substituenten versehene monomere Derivate sowie deren Di- oder Trimere lassen sich einsetzen. Die Dotierung erfolgt nach der für Polycarbazol beschriebenen Vorgehensweise.
Zum Nachweis aromatischer neuronaler Botenstoffe wie Dopamin und Serotonin kann an einem Mikrosensor 1 auf wenigstens einer Elektroden-Faser 14 anstelle oder zusammen mit wenigstens einer der genannten Polymerschichten 80 eine Polypyrrol-Schicht 80 abgeschieden werden. Hierzu löst man Pyrrol anstelle von oder zusammen mit Carbazol und/oder einem anderen Monomer in einer Acetonitril-Lösung, die eines der oben genannten Leitsalze und eine der genannten sterisch gehinderten Stickstoffbasen enthält. Die einzuhaltenden Konzentrationen sind mit denen der oben beschriebenen Carbazol-Lösung identisch. Mikrosensor 1 und Potentiostat werden in der bereits beschriebenen Weise an Elektroden angeschlossen. Jedoch erfolgt eine Beschichtung mit Polypyrrol galvanostatisch, wobei an wenigstens eine anodisch kontaktierte Elektroden-Faser 14 für eine Zeit von 30 s bis 2 min ein konstanter Strom zwischen 50 nA und 200 nA angelegt wird. Die so erhaltene Polymerschicht 80 muß anschließend bei einem konstanten Potential nochmals anodisch überoxidiert werden.
Neben diesen elektrochemischen Abscheideverfahren läßt sich eine spezifische Schicht 80 eines elektroaktiven Polymers auf einem punktförmigen Bereich einer Elektroden-Faser 14 auch chemisch oder physikochemisch abscheiden. Geeignete Methoden hierzu sind das Verdampfen und die Kondensation oder die Sublimation unter reduziertem Druck oder die gepulste Laserablation.
Mit einem Mikrosensor 1, der zur besseren Abschirmung von Störsignalen oder zum Schutz bei mechanischer Beanspruchung nach Möglichkeit kanülen- oder kapillarummantelt ist, lassen sich Neurotransmitter in Lösung und in vivo qualitativ und quantitativ bestimmen.
Für einen normalen Tetroden-Meßbetrieb besteht seine Gegenelektrode 40 aus zwei verbundenen, unbelegten Elektroden-Fasern 14, seine Referenzelektrode 50 aus einer einzigen in beschriebener Weise modifizierten Faser 14 und seine polymeraromatisch belegte Arbeitselektrode 60 ist ebenfalls einzelfasrig.
Zunächst zeichnet man für jeden zu bestimmenden Neurotransmitter eine Eichgerade auf. Hierzu taucht man den an einen Potentiostaten angeschlossenen Mikrosensor 1 in eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die einen pH-Wert von 7,4 besitzt und 0,9 % w/v Natriumchlorid (NaCl) enthält. Außerdem befindet sich in dieser physiologischen Lösung eine vorgebbar kleine Menge des zu untersuchenden neuronalen Botenstoffes, beispielsweise Dopamin oder Serotonin. Man durchfährt einen ZV-Zyklus von etwa –300 mV bis +700 mV mit einer konstanten Scanrate, die zwischen 0,2 V/s und 10 V/s liegt und erhöht dann die Dopamin-Konzentration in definierbaren Schritten. Nach jeder Konzentrationsänderung wird ein Zyklovoltammogramm aufgenommen und die auf diese Weise erhaltenen Meßkurven graphisch übereinandergelegt. 4 und 5 zeigen mit einem Polythiophen-Mikrosensor 1 erhaltene Ergebnisse für Dopamin bei einer Scanrate von 1 V/s.
Dopamin und Serotonin werden bei bestimmten für den jeweiligen Neurotransmitter spezifischen Potentialwerten oder Potentiallagen oxidiert oder reduziert. So entnimmt man 5, daß Signale für die Reduktion von Dopamin bei –20 mV besonders ausgeprägt ist. Trägt man die an dieser Stelle gemessenen Ströme gegen die eingesetzte Menge an Dopamin auf, erhält man die in 6 gezeigte Eichgerade. Diese läßt sich in einem Konzentrantionsbereich von 20 μmol/l bis 700 μmol/l zur quantitativen Bestimmung einer unbekannten Neurotransmitter-Menge in einem flüssigen Medium verwenden.
Wie sich aus 7 ergibt, wird der größte Teil von Serotonin bei +450 mV oxidiert, wobei jedoch für diese Verbindung bei Anwesenheit von Dopamin ein kathodisches Reduktionssignal nicht zu beobachten ist. Mit dem erfindungsgemäßen Mikrosensor 1 lassen sich demnach mindestens die beiden Neurotransmitter Dopamin und Serotonin quantitativ nebeneinander nachweisen, denn deren spezifische Signale elektrochemischer Aktivität, sprich deren Potentiallagen sind voneinander beabstandet und können deshalb unabhänig voneinander ausgewertet werden. Liegen Dopamin und Serotonin in einer zu untersuchenden Probe nebeneinander vor, so läßt sich erstgenannter Neurotransmitter bis hinab zu einer Konzentration von 20 μmol/l nachweisen und für die zweitgenannte Verbindung liegt die Detektionsgrenze bei 10 μmol/l.
Befinden sich Dopamin, Serotonin und Noradrenalin (deren Strukturformeln in 8 dargestellt sind) in äquimolaren Mengen von 71 μmol/l in einer Meßlösung, so lassen sich nur die für Dopamin und Serotonin typischen zyklovoltammetrischen Kurven erhalten. Noradrenalin beeinflußt also bei diesen Konzentrations- und Meßbedingungen das Redoxverhalten der beiden anderen Neurotransmitter nicht.
Mit dem Mikrosensor 1 bestimmt man auch Kinetiken von Neurotrasmittern. Hierzu verfolgt man bei einem konstanten Potential, bei dem selektiv nur ein bestimmter Wirkstoff an der Sensoroberfläche umgesetzt wird, den sich zeitlich ändernden Strom. Somit erhält man ein Bild von der zeitlichen Konzentrantionsänderung eines Neurotransmitters.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikrosensor 1 ist eine in vivo Bestimmung neuronaler Botenstoffe in extrakorporalen Zell- und Gewebekulturen aber auch im Gehirn möglich. Insbesondere lassen sich u.a. Serotonin und Dopamin in Echtzeit qualitativ und quantitativ erfassen. Ebenso ist es möglich, deren durch neurophysiologische Prozesse oder durch zugeführte Medikamente ausgelöste Mengenänderungen in einem bestimmten interzellulären Raumbereich zu detektieren, was für das tiefere Verständnis neuropathologischer Erkrankungen, wie etwa der Altersdemenz und der parkinsonschen Krankheit sehr wichtig ist.
Mit dem Mikrosensor 1 kann man überdies neurochemische Vorgänge im Zellinneren und in Zellzwischenräumen, beispielsweise an synaptisch oder elektrosynaptisch verbundenden Nervenfasern außerhalb und innerhalb des Organismus studieren und neuronale Ereignisse elektrisch beeinflussen.
Bei Untersuchungen am Gehirn bohrt man in einen leblosen oder lokal betäubten Schädel ein Loch von etwa 1 cm Durchmesser und positioniert ihn ortsfest in einem Stereotaxierahmen. Dieser Rahmen besitzt einen Ring mit Halbbogenaufbau, an dem Instrumente für Eingriffe in das Gehirninnere, beispielsweise ein 64-Kanal-Multielelktroden-Ableitsystem fixiert sind. Durch die geöffnete Schädeldecke und die Hirnhaut (Dura) wird ein Mandrin (= als Führung dienendes Futter mit innengeführtem Dorn) ins Gehirninnere eingeschoben, indem man Zellgewebe und Blutgefäße vorsichtig verdrängt, bis eine Zielregion, beispielsweise der Thalamus erreicht ist. Nun wird der Dorn aus der Führung des Mandrin herausgezogen und der erfindungsgemäße Mikrosensor 1 eingeführt.
Um Art und Menge wenigstens eines neuronalen Botenstoffes in kultivierten Zellkulturen sowie am lebenden oder leblosen Organismus zu bestimmen, bewegt man den an einen hochempfindlichen Potentiostaten angeschlossenen Mikrosensor 1 bis auf etwa zwei Mikrometer oder weniger an ein zu untersuchendes Zellgewebe heran. Er überdeckt dort einen Flächenbereich von etwa 7 μm² bis 520 μm². Es werden zwischen einem und fünf der bereits beschriebenen Strom/Spannungs-Zyklen (ZV-Zyklen) durchlaufen und der Mikrosensor 1 dann schrittweise verschoben. Für jeden Flächenbereich entnimmt man dem zugehörigen Zyklovoltammogramm (ZV) Strom- und Spannungswerte in der bereits beschriebenen Weise und vergleicht sie mit den aufgenommenen Eichgeraden, um wenigstens einen Neurotransmitter qualitativ und quantitativ zu bestimmen.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar.
Elektrochemische Beschichtungen der Elektroden-Fasern 14 mit leitfähigen Polymeren können neben Acetonitril auch in anderen oxidationsunempfindlichen, aprotischen Lösemitteln, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimetyhlformamid (DMF), Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), sowie alizyklischen oder aliphatischen Aethern und in sehr oxidationsträgen, zyklischen Ketonen durchgeführt werden. Dabei lassen sich polymeraromatische Leiter nicht nur durch anodische Oxidation aromatischer Ausgangsverbindungen sondern auch durch deren kathodische Reduktion herstellen. Unter Ausgangsverbindung sind alle heterozyklischen, aromatischen Monomere zu verstehen.
Neben aromatischen, der Oxidation zugänglichen Neurotransmittern und Ascorbinsäure (Vitamin C) läßt sich auch Stickstoffoxid (NO) mit dem Mikrosensor 1 bestimmen.
Man erkennt, daß ein Mikrosensor (1) eine zumindest teilweise sich verjüngende Form besitzt. Er besteht wenigstens aus einem 20 μm bis 200 μm dicken Träger (11), in den zwei oder mehr Elektroden-Fasern (14) formschlüssig eingebettet sind. Sie sind aus einem Metall oder einer Metallegierung aufgebaut, haben Durchmesser von 4 μm bis 18 μm und durchspannen den Träger (11) in seiner Längsausdehnung vollständig. Meßseitig ragen sie aus ihm heraus und bilden punktförmige Bereiche. Einige von ihnen sind mit einer Schicht (70) und/oder mit einer spezifischen Schicht (80) versehen, die aus einem elektroaktiven Polymer besteht, beispielsweise Polycarbazol, Polythiophen oder Polypyrrol. Punktförmige Bereiche und das meßseitige Ende des Trägers (11) bilden den Sensorkopf (12), der flächig plan oder kegelförmig spitz ausgebildet ist. Gegen Zerstörung läßt sich der Mikrosensor (1) durch eine Kanüle (16) bzw. eine Kapillare (18) schützen. Die Schichten) (70) und die spezifische(n) Schichten) (80) des aus mindestens einer Multifaser-Mikroelektrode (10) bestehenden Mikrosensors (1) werden elektrochemisch, u.a. mittels der Zyklovoltammetrie aus elektrisch leitenden Lösungen von Monomeren bzw. Salzen hergestellt und verleihen dem Mikrosensor (1) teilchenselektive Eigenschaften. Diese nutzt man, um gezielt Stoffe, beispielsweise Neurotransmitter und deren Konzentrationen in Lösung oder in Gewebekompartimenten zu bestimmen.
Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.

1: Mikrosensor
10: Multifaser-Mikroelektrode
11: Träger
12: Sensorkopf
14: Elektroden-Faser(n)
15: Tetrode
16: Kanüle
18: Kapillare
20: Kontaktierungsende
30: Mikroplatine
32: Kontaktdrähte
40: Gegenelektrode
50: Referenzelektrode
60: Arbeitselektrode
70: Schicht
80: spezifische Schicht

Claims

Mikrosensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium bestehend aus einer Multifaser-Mikroelektrode (10) mit wenigstens zwei Elektroden-Fasern (14), von denen wenigstens eine als Gegenelektrode (40) und/oder als Referenzelektrode (50) ausgeführt ist und mit einem Träger (11), der ein alle Elektroden-Fasern (14) gleichzeitig umschließender einstückiger, gegenüber dem flüssigen Medium indifferenter elektrischer Isolator ist, in dem die Elektroden-Fasern (14) voneinander isoliert eingebettet sind, wobei jede von ihnen mit dem Träger (11) stoffschlüssig direkt verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikrosensor (1) eine zumindest teilweise konische Form besitzt und wenigstens eine der Fasern (14) eine Arbeitselektrode (60) ist, die meßseitig mit einer spezifischen Schicht (80) aus einem biologisch verträglichen, elektroaktiven Polymer versehen ist.
Mikrosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) mit einer Mikroplatine (30) verbunden ist, an die Kontaktdrähte (32) aus einem Edelmetall angelötet sind.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (11) ein runder oder ovaler Quarzglasmantel ist.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden-Fasern (14) aus einem edlen Metall, beispielsweise aus Platin und/oder einer Platin/Wolfram-Legierung gefertigt sind und einen Durchmesser von 4 bis 18 μm und in einer bevorzugten Ausgestaltung von 10 bis 12 μm besitzen.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektroden-Faser (14) mit einer Schicht (70) belegt ist und daß unterschiedliche Elektroden-Fasern (14) mit unterschiedlichen Schichten (70) und/oder mit unterschiedlichen spezifischen Schichten (80) versehen sind.
Mikrosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Schicht (70) und/oder die spezifische Schicht (80) nur auf einem Teil der Elektroden-Faser (14) befindet, der nicht an den Träger (11) angrenzt.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden-Fasern (14) an einer Seite, die in Richtung eines Kontaktierungsendes (20) zeigt, von dem sie umgebenden Träger (11) freigelegt und an die Mikroplatine (30) angelötet sind.
Mikrosensor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die freigelegte Seite der Elektroden-Fasern (14), die Mikroplatine (30) und Enden der Kontaktdrähte (32) in einer Klebstoffmatrix eingebettet sind und zusammen das Kontaktierungsende (20) bilden.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er n Elektodenfasern (14) aufweist, wobei n einen ganzzahligen Wert von 2 bis 50, vorzugsweise von 3 bis 13 und am bevorzugtesten von 4 bis 6 annimmt und die einzelnen Fasern (14) beispielsweise äquidistant zueinander angeordnet sind.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine zentrisch angeordnete Elektroden-Faser (14) von n Elektroden-Fasern (14) vorzugsweise konzentrisch umgeben ist, wobei n einen ganzzahligen Wert von 1 bis 49, vorzugsweise von 2 bis 12 und am bevorzugtesten von 3 bis 6 annimmt.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden-Fasern (14) so geschaltet sind, daß sie voneinander unabhängig elektrisch ansprechbare Mikro-Scheibenelektroden mit elektrischer Abschirmung bilden.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser--Mikroelektrode (10) einen Durchmesser von kleiner oder gleich 250 μm besitzt.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) an einem Ende, das dem Kontaktierungsende (20) gegenüberliegt, einen Sensorkopf (12) besitzt, der eine kreisrunde oder ovale, bzw. zumindest teilweise konisch verjüngte, glatt polierte Oberfläche aufweist.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) eine Tetrode (15) ist, bei der drei Elektroden-Fasern (14) eine vierte, zentral im Träger (11) angeordnete Elektroden-Faser (14) konzentrisch umgeben.
Mikrosensor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Tetrode (15) eine kreisrunde oder ovale Faser mit einem Durchmesser von 50 bis 110 μm, in bevorzugter Ausführung von 70 bis 90 μm ist und dabei eine Länge von 5 bis 15 cm und vorzugsweise von 10 bis 12 cm aufweist.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) in eine Kanüle (16) eingeklebt ist, beispielsweise mittels eines Klebers auf Epoxid- oder Acrylharz-Basis.
Mikrosensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle (16) aus einem Glasmaterial oder aus Edelstahl besteht und einen Außendurchmesser von 250 μm bis 350 μm und vorzugsweise von 280 μm bis 305 μm besitzt.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) und die Kanüle (16) am Kontaktierungsende (20) fixiert sind, beispielsweise durch eine Klebeverbindung.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle (16) in einer Kapillare (18) befestigt, beispielsweise mit Acryl- oder Epoxidharz in ihr eingeklebt ist.
Mikrosensor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (18) aus Glas und/oder aus einem biegeelastischen Kunststoff besteht.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 2 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Elektroden-Fasern (14) über einen Kontaktdraht (32) als Gegenelektrode (40) zusammengeschaltet sind.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine zentrisch und eine konzentrisch angeordnete Elektroden-Faser (14) zusammengeschaltet die Gegenelektrode (40) bilden.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 5 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht (70) auf der Referenzelektrode (50) vorhanden ist und aus abgeschiedenem Silber besteht, welches an seiner Oberfläche chemisch zu Silberchlorid umgesetzt ist.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Schicht (80) für wenigstens einen Inhaltsstoff selektiv ist und aus einem elektrisch leitfähigen Polymer besteht.
Mikrosensor nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das leitfähige Polymer aus miteinander konjugiert verbundenen, heterozyklischen Aromaten besteht.
Mikrosensor nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß das leitfähige Polymer ein Polycarbazol und/oder ein Polythiophen ist.
Mikrosensor nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß das leitfähige Polymer ein Polypyrrol ist.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht (80) dotierbar oder dotiert ist, beispielsweise mit Verbindungen, die auf sie einen sterischen und/oder ladungsverändernden Einfluß haben.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht (80) mit speziellen Ionen dotiert ist, beispielsweise mit Metall- oder Halogenid-Ionen oder mit Ionen aus quartären Ammoniumsalzen, Borhalogeniden, Phosphorhalogeniden oder Perchloraten.
Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode (60) in unbeschichteter Form eine aufgerauhte, beispielsweise mittels Schwefelsäure geätzte Oberfläche besitzt.
Verfahren zur Herstellung eines Mikrosensors (1) für die Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, a. daß wenigstens zwei Edelmetalldrähte in eine Quarzröhre gegeben und diese in der Hitze unter Zugspannung nach Taylor verformt wird, b. daß die verformte Quarzröhre an einer Seite entfernt wird, so daß die Metalldrähte als Elektroden-Fasern (14) freigelegt werden, c. daß ein den freigelegten Elektroden-Fasern (14) gegenüberliegender meßseitiger Bereich der Multifaser-Mikroelektrode (10) zu einem Sensorkopf (12) flächig glatt poliert wird, d. und daß zumindest eine der Elektroden-Fasern (14) am Sensorkopf (12) mit einer elektroaktiven Schicht (70) und/oder mit einer elektroaktiven spezifischen Schicht (80) versehen wird.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Sensorkopf (12) so poliert wird, daß er eine konische Form aufweist oder einen Teilkegel ohne Kegelspitze bildet.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß als elektroaktive Schicht (80) ein leitfähiges Polymer elektrochemisch oder chemisch abgeschieden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Multifaser-Mikroelektrode (10) an den freigelegten Elektroden-Fasern (14) mit einer Mikroplatine (30) verbunden wird.
Verfahren zur Bestimmung wenigstens eines Inhaltsstoffes in einem flüssigen Medium mit einem Mikrosensor (1) mit Sensorkopf (12), insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, a. daß der Mikrosensor (1) an einen hochempfindlichen Potentiostaten angeschlossen wird, b. daß er mit dem Sensorkopf (12) voran in das flüssige Medium, beispielsweise innerhalb eines Gewebekompartiments eingeführt wird und c. daß mittels zyklischer Voltammetrie Strom- Spannungskurven aufgenommen werden.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß man aus wenigstens einer der Strom- Spannungskurven für wenigstens einen Meßpeak einen zugehörigen Spannungswert abliest und diesen anhand von Vergleichswerten einem Inhaltsstoff zuordnet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß man aus wenigstens einer der Strom-Spannungskurven für einen Meßpeak einen zugehörigen Stromwert abliest und diesem anhand einer für einen Inhaltsstoff charakteristischen Strom/Mengen-Eichgeraden eine entsprechende Menge zuordnet.
Verfahren zur analytischen Bestimmung wenigstens eines in einem Organismus, beispielsweise innerhalb des Gehirns vorhandenen Inhaltsstoffes mit einem Mikrosensor (1), insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 37, dadurch gekennzeichnet, a. daß in einen Schädel ein kreisrundes Loch gebohrt wird, durch das ein aus Futter und Dorn bestehender Mandrin bis in eine Zielregion des Gehirns eingeführt wird, b. daß der Dorn herausgezogen und der erfindungsgemäße Mikrosensor (1) eingeschoben und bis an die Zielregion herangeführt wird, c. daß mittels zyklischer Voltammetrie Strom- Spannungskurven aufgenommen werden, d. daß man auf einem Bildschirm oder an einem Meßgerät die erhaltenen Kurven übereinanderlegt, Spannungswerte abliest und durch Zuordnung zu Eichwerten einen Inhaltsstoff identifiziert e. und daß Stromwerte abgelesen werden, die man auf eine für den Inhaltsstoff spezifische Eichgerade abträgt und dadurch den Inhaltsstoff mengenmäßig bestimmt.
Verwendung des Mikrosensors (1) insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur qualitativen und quantitativen Detektion von Neurotransmittern und/oder Antioxidantien in Lösungen und an oder in biologischem Material.
Verwendung des Mikrosensors (1) insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 39 zur Verschiebung von Gleichgewichten zwischen oxidierten und reduzierten Formen eines Neurotransmitters oder eines Hormons innerhalb von Zellgewebeverbänden und interzellulären Zwischenräumen.