DE102004059473A1

DE102004059473A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten und Gewebeproben

Info

Publication number: DE102004059473A1
Application number: DE200410059473
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Petrich; Arnulf Dr. Staib
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2004-12-10
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2006-06-22
Also published as: WO2006061080A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, und Gewebeproben, umfassend die folgenden Schritte: Einstrahlen eines von einer Lichtquelle (11) ausgehenden Primärlichtstrahls (14) des sichtbaren oder infraroten Spektralbereichs in ein Fourier-Spektrometer (10), Durchführen einer Messung mittels des Fourier-Spektrometers (10) an aus einer Wechselwirkung mit einer zu untersuchenden Probe (20) resultierendem Sekundärlicht (22) zum Ermitteln eines Probeninterferogramms, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse, Zuordnung des Probeninterferogramms zu jener Klasse, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramm weniger abweicht. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung (1) zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, und Gewebeproben auf Basis von mittels eines Fourier-Spektrometers ermittelten Probeninterferogrammen.
Die spektroskopische Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere von Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, interstitielle Flüssigkeit, Kammerwasser, liquor oder Gewebebiopsien und Mikrotomschnitte von Gewebeproben, kann einem Arzt bei der Diagnose einer Krankheit eine wichtige Hilfestellung bieten. Beispielsweise kann die Konzentration chemischer Substanzen, die für eine Diagnose von Bedeutung sind, in einer Probe durch Untersuchung charakteristischer Spektrallinien bestimmt werden.
Häufig führen Krankheiten zu Änderungen der Konzentrationen verschiedenster chemischer Substanzen im Blut, an de ren Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Patienten. Demzufolge können bei der spektroskopischen Untersuchung einer Probe vielfältige Änderungen im Spektrum festgestellt werden.
Seit einiger Zeit sind auch Verfahren vorgeschlagen worden, bei denen auf der Grundlage spektroskopischer Untersuchungen von Körperflüssigkeiten und Gewebeproben der Versuch gemacht wird, nicht (nur) Daten über in der Flüssigkeit enthaltene Substanzen (Analyten) zu gewinnen, sondern unmittelbar Informationen darüber zu erhalten, ob bei dem betreffenden Patienten ein bestimmtes Krankheitsbild vorliegt. Anwendungen derartiger Verfahren werden als "Disease Pattern Recognition (DPR)" bezeichnet.
In der EP 0644412 A2 wird beispielsweise vorgeschlagen, Infrarotspektren von Proben durch ein multivariates Auswerteverfahren einer bestimmten Klasse, beispielsweise von Patienten mit einer Leber- oder Nierenkrankheit, zuzuordnen. Zu diesem Zweck werden Infrarotspektren verschiedener Proben bekannter Klassifikation aufgenommen, die als Vergleichsspektren für multivariate Auswerteverfahren dienen, beispielsweise zum Training eines neuronalen Netzes.
In der EP 1329716 A1 wird beschrieben, wie mit Infrarotspektroskopie Blutproben auf das Vorliegen des metabolischen Syndroms untersucht werden können. Dazu wird ein Infrarotspektrum einer zu untersuchenden Probe mit Infrarotspektren von Proben zweier Klassen, nämlich Proben von an dem metabolischen Syndrom erkrankten Patienten und Proben einer gesunden Kontrollgruppe, verglichen. Durch ein multivariates Auswerteverfahren, beispielsweise Diskriminanz- oder Clusteranalyse, werden die Infrarotspek tren der zu untersuchenden Proben einer dieser beiden Klassen zugeordnet.
Trotz gewisser Fortschritte ist mit den bekannten Verfahren die Zuordnung eines Spektrums zu einem bestimmten Krankheitsbild nicht mit der für praktische Anwendungen erwünschten Zuverlässigkeit möglich.
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, einen Weg aufzuzeigen, wie Proben von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, mit größerer Zuverlässigkeit einer Klasse, die ein bestimmtes Krankheitsbild repräsentiert, zugeordnet werden können.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, und Gewebeproben umfassend die folgenden Schritte: Einstrahlen eines von einer Lichtquelle ausgehendem Primärlichtstrahls des sichtbaren oder infraroten Spektralbereichs in ein Fourier-Spektrometer, Durchführen einer Messung mittels des Fourier-Spektrometers an aus einer Wechselwirkung mit der Probe resultierendem Sekundärlicht zum Ermitteln eines Probeninterferogramms, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse, Zuordnung des Probeninterferogramms zu jener Klasse, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramms weniger abweicht.
Diese Aufgabe wird ferner gelöst durch eine Vorrichtung zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, und Gewebeproben umfassend eine Lichtquelle zum Aussenden von Licht des sichtbaren und/oder infraroten Spektralbereich, ein Fourier-Spektro meter zum Messen eines Probeninterferogramms einer zu untersuchenden Probe, eine Auswerteeinheit, die im Betrieb das Probeninterferogramm mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse vergleicht, das Probeninterferogramm mit einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse vergleicht, und das Probeninterferogramm jener Klasse zuordnet, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramm weniger abweicht.
Bei der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Zuordnung zu vorgegebenen Klassen unmittelbar anhand von Interferogrammen, während nach dem Stand der Technik aus gemessenen Interferogrammen zunächst durch Fourier-Transformation Spektren gewonnen werden und eine Zuordnung erst anhand der Spektren, also der Intensitätsverteilung in Abhängigkeit von Frequenz, Wellenzahl oder Wellenlänge erfolgt. Die Zuordnung der Interferogramme zu verschiedenen Klassen kann grundsätzlich mit den gleichen Mitteln wie die Zuordnung von Fourier-transformierten Spektren bei Verfahren nach dem Stand der Technik erfolgen. Geeignet sind insbesondere multivariate Auswerteverfahren (z.B. Diskriminanz- oder Clusteranalyse). Beispiele für verschiedene multivariate Auswerteverfahren, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, finden sich in dem Artikel "Classification of signatures of Bovine Spongiform Encephalopaty in serum using infrared spectroscopy" von T. Martin et al. in Analyst 129, 2004, Seiten 897 bis 901, der diesbezüglich durch Bezugnahme zum Gegenstand der Anmeldung gemacht wird.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß eine Zuordnung zu vorgegebenen Klassen anhand von Interferogrammen wesentlich zuverlässiger möglich ist, als anhand von Fourier-transformierten Spektren. Obwohl sich erst in einem Spektrum einzelne Spektrallinien identifizieren und bestimmten chemischen Substanzen zuordnen lassen, sind Interferogramme in dieser Hinsicht aussagekräftiger als Spektren.
In Kenntnis der Erfindung läßt sich diese Beobachtung möglicherweise dadurch erklären, daß bei einer Fourier-Transformation Informationen verloren gehen oder Daten verfälscht werden, die in einem Interferogramm enthalten sind. Dies scheint darauf zu beruhen, daß die Fourier-Transformation idealerweise ein Interferogramm voraussetzt, das über einen unendlich langen Zeitraum (d.h. mit einem unendlich langen Verfahrweg des Spektrometers) gemessen wurde. Da Interferogramme selbstverständlich nur über endliche Zeiträume gemessen werden können, wird für eine Fouriertransformation eine Apodisationsfunktion verwendet, durch die das Interferogramm außerhalb des gemessenen Zeitraums ergänzt (beispielsweise durch einen konstanten Wert) und das gemessene Interferogramm in einem Übergangsbereich stetig an die Ergänzung angepaßt wird. Unabhängig davon, wie diese Apodisationsfunktion gewählt wird, scheint ein unerwünschter Einfluß auf die Meßdaten und damit eine Beeinträchtigung der Zuordnung unvermeidbar.
Durch die vorliegende Erfindung kann eine weitere Fehlerquelle vermieden werden, die im Stand der Technik die Zuverlässigkeit von Zuordnungen beeinträchtigen kann. Üblicherweise wird nämlich vor einer Fourier-Transformation eine Interpolation zwischen den einzelnen Meßpunkten des Interferogramms durch ein sogenanntes Zerofilling durchgeführt. Dies kann ebenfalls zu Zuordnungsfehlern beitragen.
Die Tatsache, daß gemäß der vorliegenden Erfindung die Zuordnung zu den vorgegebenen Klassen anhand eines Ver gleichs von Interferogrammen anstelle eines Vergleichs von Spektren erfolgt, bedeutet nicht, daß auf jede Aufbereitung der Meßdaten, auf denen das auszuwertende Interferogramm beruht, verzichtet werden muß. Bevorzugt wird vielmehr das Probeninterferogramm durch Aufbereitung eines Rohdateninterferogramms unter Verwendung eines an einer Referenzsubstanz gemessenen Referenzinterferogramms erzeugt. Als Referenzsubstanz kann beispielsweise ein leerer Probenträger aus Silizium dienen oder eine Standardlösung einer geeigneten Chemikalie.
Zur Aufbereitung kann eine Differenz zwischen dem Referenzinterferogramm und dem Rohdateninterferogramm gebildet werden. Auch eine Quotientenbildung, bei der das Rohdateninterferogramm durch das Referenzinterferogramm dividiert wird, kann zur Datenaufbereitung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist es, eine Aufbereitung des Rohdateninterferogramms sowohl durch Subtraktion als auch durch Division vorzunehmen, da auf diese Weise sowohl absolute als auch relative Fehler weitgehend kompensiert werden können.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß es in vielen Fällen ausreicht, die Abweichung des Probeninterferogramms von dem Vergleichsinterferogramm nur anhand von ausgewählten Teilabschnitten der Interferogramme zu bestimmen. Auf diese Weise läßt sich der Aufwand einer Auswertung erheblich reduzieren, da nur Teile von Interferogrammen untersucht werden müssen.
Dies ist überraschend, weil das Vorhandensein einer für ein bestimmtes Krankheitsbild charakteristischen chemischen Substanz zwar in einem Spektrum zu charakteristischen Spektrallinien führen kann, jedoch in einem Interferogramm einer Spektrallinie ein sich über das gesamte Interferogramm erstreckender Wellenzug entspricht. Anders ausgedrückt lassen sich für chemische Substanzen charakteristische Energiezustände zwar in einem Spektrum lokalisieren, die entsprechende Information ist in einem Interferogramm jedoch über die gesamte Meßzeit verteilt.
Daß in einem Interferogramm trotzdem charakteristische Bereiche auftreten können, läßt sich in Kenntnis der Erfindung wohl damit erklären, daß im infraroten Spektralbereich Spektren oft nicht durch einzelne Spektrallinien charakterisierbar sind, sondern durch Vibrations- und/oder Rotationsbanden, also Serien von Spektrallinien. Wichtige Informationen über die untersuchte Probe sind deshalb über einen Frequenzbereich verteilt.
Wie bereits erwähnt, können für den Vergleich der Interferogramme Verfahren verwendet werden, die im Rahmen der DPR bisher zum Vergleich von Spektren verwendet wurden. Generell sind eine Vielzahl mathematischer Verfahren geeignet, mit denen ein Unterschied zweier zu vergleichender funktionaler Abhängigkeiten quantifiziert werden kann. Gebräuchlich ist beispielsweise die Bestimmung einer Summe der Abweichungsquadrate der einzelnen Datenpunkte, hier also der Datenpunkte des Probeninterferogramms von den Datenpunkten des Vergleichsinterferogramms für jeweils den gleichen Punkt auf der Zeitachse.
Bevorzugt sind jedoch Verfahren, bei denen durch Vergleich der Probeninterferogramme mit dem Vergleichsinterferogramm der ersten Klasse ein erster Zuordnungsparameter bestimmt wird, der die Abweichung des Probeninter ferogramms von dem Vergleichsinterferogramm der ersten Klasse charakterisiert und durch Vergleich des Probeninterferogramms mit dem Vergleichsinterferogramm der zweiten Klasse ein zweiter Zuordnungsparameter bestimmt wird, der die Abweichung des Probeninterferogramms von dem Vergleichsinterferogramm der zweiten Klasse charakterisiert und bei dem dann die Zuordnung des Probeninterferogramms zu der ersten oder zweiten Klasse in Abhängigkeit von einer Relation der beiden Zuordnungsparameter erfolgt.
Die Art der Relation hängt dabei von dem gewählten Zuordnungsparameter ab. Wenn der Zuordnungsparameter bei guter Übereinstimmung einen höheren Wert als bei geringer Übereinstimmung hat, wird das Probeninterferogramm der Klasse mit dem höheren Zuordnungsparameter zugeordnet. Wenn ein Zuordnungsparameter verwendet wird, bei dem sich ein hoher Grad von Übereinstimmung durch einen niedrigen Wert des Parameters ausdrückt, wird das Probeninterferogramm der Klasse mit dem niedrigeren Zuordnungsparameter zugeordnet.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung erläutert. Die dargestellten Besonderheiten können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung zu schaffen.
Es zeigen:
1 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend ein Fourier-Spektrometer und eine Auswerteeinheit;
2 ein mit der Vorrichtung gewonnenes Interferogramm und
3 ein aus dem in 2 gezeigten Interferogramm berechnetes Spektrum.
Das Fourier-Spektrometer 10 der in 1 gezeigten Vorrichtung 1 ist ein handelsübliches Spektrometer nach dem Stand der Technik. Von der Strahlungsquelle 11 ausgehendes Primärlicht wird über einen fokusierenden Spiegel 12 und eine Blende 13 in das Fourier-Spektrometer 10 eingestrahlt. Dort wird der Primärlichtstrahl 14 mittels eines Spiegels 15 kollimiert und trifft anschließend auf einen Strahlteiler 16, der im Idealfall 50 % der Strahlung reflektiert und 50 % durchläßt. Die resultierenden Teilstrahlen werden durch Reflexion an zwei Spiegeln 17, 18, von denen einer fest montiert, der andere in Richtung einer optischen Achse beweglich ist, am Strahlteiler 15 rekombiniert und zur Interferenz gebracht. Eine Hälfte dieser Strahlung ist zur Strahlungsquelle 11 hin gerichtet und geht für die Messung verloren. Die andere Hälfte wird über einen fokusierenden Spiegel 19 auf die Probe 20 gelenkt und trifft nach Durchstrahlen derselben auf einen fokusierenden Spiegel 21, der den Sekundärlichtstrahl 22 auf einen Detektor 23 lenkt.
Zum Messen eines Interferogramms wird der bewegliche Spiegel 17 um eine Wegstrecke ΔX aus seiner in 1 gezeigten Position verfahren. Zwischen den beiden Teilstrahlen entsteht dadurch ein Gangunterschied von δ = 2·ΔX. An dem Detektor 23 wird die Intensität der Strahlung in Abhängigkeit von dem Gangunterschied δ gemessen. Der Detektor 23 ist an eine Auswerteeinheit 24 angeschlossen.
2 zeigt ein schematisches Beispiel eines auf diese weise gemessenen Interferogramms, bei dem die Intensität über dem Gangunterschied δ aufgetragen ist. Zur Illustra tion zeigt 3 ein schematisches Spektrum, wie man es durch eine Fourier-Transformation aus einem Interferogramm gewinnen kann.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Berechnung des Spektrums aber nicht nötig. In der Auswerteeinheit 24 der in 1 gezeigten Vorrichtung 1 wird das Probeninterferogramm mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse und einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse verglichen. Das Probeninterferogramm wird jener Klasse zugeordnet, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramm weniger abweicht. Bei der ersten Klasse kann es sich beispielsweise um Patienten mit rheumatoider Arthritis und bei der zweiten Klasse um eine gesunde Kontrollgruppe handeln. Bevorzugt wird das Probeninterferogramm mit mehreren Vergleichsinterferogrammen einer Klasse, d.h. mit Vergleichsinterferogrammen, die an verschiedenen Patienten gemessen wurden, verglichen, um die Zuverlässigkeit der Zuordnung zu erhöhen.
Möglich ist es aber auch, aus mehreren Interferogrammen einer Klasse ein Durchschnittsinterferogramm zu bilden und dieses als Vergleichsinterferogramm zu verwenden. Bevorzugt werden dabei mindestens 100 Interferogramme von Referenzproben von mindestens 100 verschiedenen Probanden verwendet.
Als Lichtquelle 11 wird eine thermische Infrarotquelle verwendet. Möglich ist es aber auch, als Lichtquelle einen Laser zu verwenden und die Probeninterferogramme sowie die Vergleichsinterferogramme mittels Fourier-Ramanspektroskopie zu ermitteln.

Claims

Verfahren zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, und Gewebeproben umfassend die folgenden Schritte: Einstrahlen eines von einer Lichtquelle (11) ausgehenden Primärlichtstrahls (14) des sichtbaren oder infraroten Spektralbereichs in ein Fourier-Spektrometer (10), Durchführen einer Messung mittels des Fourier-Spektrometers (10) an aus einer Wechselwirkung mit einer zu untersuchenden Probe (20) resultierendem Sekundärlicht (22) zum Ermitteln eines Probeninterferogramms, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse, Vergleich des Probeninterferogramms mit einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse, Zuordnung des Probeninterferogramms zu jener Klasse, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramms weniger abweicht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Vergleich des Probeninterferogramms mit dem Vergleichsinterferogramm der ersten Klasse ein erster Zuordnungsparameter P1 bestimmt wird, der die Abweichung des Probeninterferogramms von dem Vergleichsinterferogramm der ersten Klasse charakterisiert, und durch Vergleich des Probeninterferogramms mit dem Vergleichsinterferogramm der zweiten Klasse ein zweiter Zuordnungsparameter P2 bestimmt wird, der die Abweichung des Probeninterferogramms von dem Vergleichsinterferogramm der zweiten Klasse charakterisiert, und das Probeninterferogramm in Abhängigkeit von einer Relation der beiden Zuordnungsparameter P1, P2 der ersten oder der zweiten Klasse zugeordnet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Berechnung der Vergleichsinterferogramme jeweils mehrere Interferogramme verwendet werden, die jeweils an Referenzproben gemessen wurden, die von Probanden mit einem übereinstimmenden Gesundheitszustand stammen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Berechnung der Vergleichsinterferogramme mindestens 100 Interferogramme von Referenzproben von mindestens 100 verschiedenen Probanden verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuordnungsparameter P1, P2 anhand eines Vergleichs von ausgewählten Teilabschnitten des Probeninterferogramms und des jeweiligen Vergleichsinterferogramms bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuordnungsparameter P1, P2 anhand von ein bis 100 Teilabschnitten bevorzugt 5 bis 20, bestimmt werden, die für die Klasse des jeweiligen Vergleichsinterferogramms charakteristisch sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (20) der zu untersuchenden Körperflüssigkeit vor der Messung getrocknet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für die Messung Infrarotlicht im Bereich von 400 bis 5000 Wellenzahlen verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle (11) ein Laser verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Proben- und Vergleichsinterferogramme mittels Fourier-Ramanspektroskopie ermittelt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Probeninterferogramm durch Aufbereitung eines Rohdateninterferogramms unter Verwendung eines an einer Referenzsubstanz gemessenen Referenzinterferogramms erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Aufbereitung das Referenzinterferogramm von dem Rohdateninterferogramm subtrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Aufbereitung das Rohdateninterferogramm durch das Referenzinterferogramm dividiert wird.
Vorrichtung zur Untersuchung von medizinisch relevanten Flüssigkeiten, insbesondere Blut, oder Gewebeproben umfassend: eine Lichtquelle (11) zum Aussenden von Licht des sichtbaren und/oder infraroten Spektralbereich, ein Fourier-Spektrometer (10) zum Messen eines Probeninterferogramms einer zu untersuchenden Probe, eine Auswerteeinheit (24), mit der – das Probeninterferogramm mit einem Vergleichsinterferogramm einer ersten Klasse verglichen wird, – das Probeninterferogramm mit einem Vergleichsinterferogramm einer zweiten Klasse verglichen wird, und – das Probeninterferogramm jener Klasse zugeordnet wird, von deren Vergleichsinterferogramm das Probeninterferogramm weniger abweicht.