DE102004047953A1 - Selektion von Partikeln im laminaren Fluss - Google Patents

Selektion von Partikeln im laminaren Fluss Download PDF

Info

Publication number
DE102004047953A1
DE102004047953A1 DE102004047953A DE102004047953A DE102004047953A1 DE 102004047953 A1 DE102004047953 A1 DE 102004047953A1 DE 102004047953 A DE102004047953 A DE 102004047953A DE 102004047953 A DE102004047953 A DE 102004047953A DE 102004047953 A1 DE102004047953 A1 DE 102004047953A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
particles
fluid stream
fluid
channel
particle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102004047953A
Other languages
English (en)
Inventor
Rudolf Rigler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE102004047953A priority Critical patent/DE102004047953A1/de
Priority to PCT/EP2005/010548 priority patent/WO2006037561A1/en
Priority to EP05795236A priority patent/EP1802958A1/de
Priority to US11/664,423 priority patent/US8252604B2/en
Publication of DE102004047953A1 publication Critical patent/DE102004047953A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502776—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for focusing or laminating flows
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1484—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/0005—Field flow fractionation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0636—Focussing flows, e.g. to laminate flows
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/117497—Automated chemical analysis with a continuously flowing sample or carrier stream
    • Y10T436/118339—Automated chemical analysis with a continuously flowing sample or carrier stream with formation of a segmented stream

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von geladenen Partikeln mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population einer Vielzahl unterschiedlicher Partikel sowie eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von geladenen Partikeln mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population einer Vielzahl unterschiedlicher Partikel sowie eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.
  • Zur Identifizierung neuer Liganden für diagnostische, biomedizinische und pharmazeutische Anwendungen können kombinatorische Bibliotheken, bestehend aus einer Population einer Vielzahl von Partikeln, z.B. Phagen, Zellen, Ribosomen etc., eingesetzt werden, wobei die einzelnen Partikel jeweils unterschiedliche Liganden präsentieren (siehe z.B. WO90/02809; WO92/15677; WO92/15679; WO92/06204; WO92/06176; WO98/19162; WO98/35232; WO99/06839 und WO99/5428). Zur Identifizierung von Liganden mit einer vorbestimmten Eigenschaft wird üblicherweise eine Musterung der zu untersuchenden Bibliothek durchgeführt, wobei ein markiertes Zielmolekül mit den einzelnen Partikeln der Bibliothek in Kontakt gebracht wird und das Auftreten einer Bindung zwischen dem Zielmolekül und einem bestimmten Partikel der Bibliothek bzw. dem von dem Partikel präsentierten Liganden bestimmt wird. Anschließend muss das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft identifiziert werden. Bisherige Selektions- und Identifizierungsmethoden, z.B. die so genannten "Panning"- oder "Selex"-Verfahren haben jedoch eine relativ geringe Effizienz, so dass ein bestimmtes Partikel mit gewünschten Eigenschaften oftmals nicht in der Bibliothek gefunden werden kann, obwohl es dort vorhanden ist.
  • Ein direkter Nachweis von einzelnen Analytmolekülen ist mit dem im europäischen Patent 0 679 251 beschriebenen Verfahren zur Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) beschrieben. Mittels FCS kann in einem kleinen Messvolumen von beispielsweise < 10–14 I ein einziges oder nur wenige mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Moleküle nachgewiesen werden. Das Messprinzip der FCS beruht darauf, dass ein kleines Volumenelement der Probeflüssigkeit einem starken Anregungslicht, z.B. eines Lasers ausgesetzt wird, so dass nur diejenigen Fluoreszenzmoleküle, die sich in diesem Messvolumen aufhalten, angeregt werden. Das emittierte Fluoreszenzlicht aus diesem Volumenelement wird dann auf einen Detektor, z.B. einen Fotomultiplier, abgebildet. Ein Molekül, das sich im Volumenelement befindet, wird sich gemäß seiner charakteristischen Diffusionsgeschwindigkeit mit einer durchschnittlichen, aber für das betreffende Molekül charakteristischen Zeit wieder aus dem Volumenelement entfernen und dann nicht mehr zu beobachten sein.
  • Wird nun die Lumineszenz ein- und desselben Moleküls während seiner durchschnittlichen Aufenthaltsdauer in dem Messvolumen mehrmals angeregt, so lassen sich von diesem Molekül viele Signale erfassen.
  • Die Anwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Sortierung und Identifizierung einzelner Moleküle ist bei Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740–5747) und Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177–186) beschrieben. Es wird die Verwendung einer Quadrupol-Falle und elektrischer Feldgradienten in Verbindung mit Einzelphotonendetektoren zur Identifizierung von Einzelmolekülen vorgeschlagen.
  • WO 02/01189 offenbart ein Verfahren zur Selektion von Partikeln in mehreren Zyklen, wobei die Partikel in jedem Zyklus in einem Mikrokanal durch ein Detektionselement geleitet werden, das zwischen markierten und nicht markierten Partikeln unterscheiden kann, und die Konzentration der Partikel in einem nachfolgenden Zyklus gegenüber dem vorhergehenden Zyklus verringert wird.
    •
  • Da bekannte Verfahren zeitaufwändig und umständlich sind, besteht ein Bedarf, die Sensitivität und Effizienz bei der Selektion von Partikeln weiter zu verbessern.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Selektion von geladenen Partikeln mit einer vorbestimmten Eigenschaft darauf basierend, dass geladene Partikel, die eine nachweisbare Markierung tragen, in einem ersten laminaren Fluidstrom durch einen Kanal geleitet werden und mittels eines elektrischen Feldpulses von vorbestimmter Größe (Spannung und Dauer) aus dem ersten laminaren Fluidstrom in einen gleichgerichteten benachbarten laminaren Fluidstrom überführt werden, ohne das substanzielle Fluidvolumina zwischen den Fluidströmen ausgetauscht werden. Auf diese Weise können markierte Partikel gezielt aus dem ersten Fluidstrom entfernt und somit von unmarkierten Partikeln separiert werden.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen einer Population von unterschiedlichen Partikeln,
    • (b) Markieren von Partikeln, die eine vorbestimmte Eigenschaft aufweisen,
    • (c) Leiten eines ersten Fluidstrom, der die Partikel enthält, unter Bedingungen, bei denen die Partikel eine elektrische Ladung tragen, durch einen Kanal, wobei der erste Fluidstrom in Kontakt mit zumindest einem zweiten Fluidstrom steht, der gleichgerichtet mit dem ersten Fluidstrom im wesentlichen ohne Vermischung strömt,
    • (d) Leiten der Fluidströme über ein Detektionselement, das zwischen markierten und nicht markierten Partikeln unterscheiden kann,
    • (e) Abtrennen eines detektierten markierten Partikels durch Anlegen eines elektrischen Feldes, um das Partikel aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom zu überführen, und
    • (f) gegebenenfalls Identifizieren oder/und Charakterisieren des markierten und abgetrennten Partikels.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, umfassend:
    • (a) einen Kanal, in dem ein erster und zumindest ein zweiter Fluidstrom gleichgerichtet in Kontakt miteinander und im wesentlichen ohne Vermischung strömen können,
    • (b) Mittel zum Einbringen eines ersten Fluidstroms in den Kanal, wobei der erste Fluidstrom die Partikel enthält und die Partikel eine elektrische Ladung tragen,
    • (c) Mittel zum Einbringen zumindest eines zweiten Fluidstroms in den Kanal,
    • (d) Mittel zur Detektion einer Markierung auf einem geladenen Partikel, das im ersten Fluidstrom durch den Kanal geleitetet wird, und
    • (e) Mittel zum Abtrennen eines detektierten markierten Partikels von nicht markierten Partikeln, umfassend Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes, um das Partikel aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom zu überführen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Selektion von einzelnen Partikeln aus sehr großen Partikelpopulationen, die beispielsweise mehr als 108 oder sogar 1012 oder mehr unterschiedliche Partikel umfassen. Die Partikel weisen eine elektrische Ladung, d.h. eine positive oder negative elektrische Gesamtladung auf, so dass sie durch Anlegen eines elektrischen Feldes im wesentlichen senkrecht zur Flussrichtung entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld wandern und somit aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom überführt werden können. Beispiele für Partikel sind Zellen, Teile von Zelloberflächen, Zellorganellen, z.B. Ribosomen, Viren wie etwa Bakteriophagen, z.B. filamentöse Phagen oder in Phagenhüllen verpackte Plasmide (Phagemide), Nukleinsäuren wie Gene oder cDNA-Moleküle, Proteine wie etwa Enzyme oder Rezeptoren, oder niedermolekulare Substanzen. Vorzugsweise sind die Partikel Elemente einer kombinatorischen Bibliothek, z.B. einer Bibliothek von genetischen Packungen wie Phagen, Zellen, Sporen oder Ribosomen, die auf ihrer Oberfläche Peptidstrukturen, z.B. lineare oder zirkuläre Peptide, oder Proteine wie Antikörper, vorzugsweise fusioniert mit Oberflächenproteinen, z.B. Oberflächenproteinen von filamentösen Phagen, präsentieren. Ebenso können die Partikel Elemente einer chemischen Bibliothek sein.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine effiziente Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Vielzahl unterschiedlicher Partikel. Unter "vorbestimmte Eigenschaft" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise die Fähigkeit zur Bindung an eine Zielsubstanz zu verstehen. Die Bindung des Partikels an die Zielsubstanz kann eine Liganden-Rezeptor-Bindung, eine Enzym-Substrat-Bindung, eine Antikörper-Antigen-Bindung, eine Nukleinsäurehybridisierung, eine Zucker-Lectin-Bindung oder eine andere hochaffine biologische oder chemische Wechselwirkung umfassen. Andererseits kann die vorbestimmte Eigenschaft des Partikels auch darin bestehen, eine biologische oder chemische Wechselwirkung, z.B. die Bindung an eine Zielsubstanz, zu verhindern.
  • Zur Selektion des Partikels mit der vorbestimmten Eigenschaft wird die Partikelpopulation vorzugsweise mit einer eine nachweisbare Markierung tragenden Zielsubstanz inkubiert, wobei die Inkubationsbedingungen derart gewählt werden, dass das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft an eine Markierungsgruppe bindet und so von anderen Partikeln abgetrennt werden kann. Als Markierungsgruppen kommen insbesondere nicht radioaktive Markierungsgruppen und besonders bevorzugt durch optische Methoden nachweisbare Markierungsgruppen, wie etwa Farbstoffe, und insbesondere Quantenmarkierungsgruppen oder Fluoreszenzmarkierungsgruppen in Betracht. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungsgruppen sind Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Fluorescein und andere in diagnostischen Verfahren oder Selektionsverfahren übliche Fluoreszenzfarbstoffe.
  • Die markierte Zielsubstanz ist für das zu identifizierende Partikel spezifisch, d.h. die Zielsubstanz bindet unter den Testbedingungen mit ausreichend hoher Affinität und Selektivität an das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft, um eine Selektion zu ermöglichen.
  • Gegebenenfalls kann die vorbestimmte Eigenschaft des zu selektionierenden Partikels auch eine biologische Aktivität, z.B. eine enzymatische Aktivität sein. In diesem Fall können die Partikel mit einem chromogenen oder fluoreszenten Enzymsubstrat inkubiert und in Vesikeln, z.B. Lipidvesikeln wie Liposomen oder Vesikeln aus amphiphilen Block-Copolymeren, verkapselt werden. Sofern ein Partikel, z.B. ein Phage oder ein Ribosom, an seiner Oberfläche ein aktives Enzymmolekül präsentiert, erfolgt innerhalb des Vesikels eine Umsetzung des Substrats, wobei ein farbiges oder fluoreszentes Produkt gebildet wird, welches nachgewiesen werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach dem Markieren der Partikel, aber vor dem Einbringen der Partikel in die Detektionsvorrichtung eine Affinitäts-Vorselektionsprozedur vorgenommen. Hierzu erfolgt nach der Markierung, z.B. einer Behandlung der Partikelpopulation mit einem markierten Bindemolekül, ein weiterer Behandlungsschritt mit unmarkierten Bindemolekülen, so dass bei Partikeln, die das markierte Bindemolekül nur schwach gebunden haben, durch Dissoziation ein Austausch des markierten Bindemoleküls gegen das unmarkierte Bindemolekül stattfinden kann. Diese schwach bindefähigen und somit unerwünschten Partikel werden in diesem Fall bei der Selektionsprozedur von vornherein nicht als positiv erkannt und scheiden daher aus. Durch Einstellung der Bedingungen bei der Behandlung von markierten Partikeln mit unmarkierten Bindemolekülen kann die "Stringenz" der Affinitäts-Vorselektion eingestellt werden. Durch Erhöhung der Zeitdauer der Inkubation, der Temperatur und der Konzentration unmarkierter Bindemoleküle wird eine Erhöhung der Stringenz erreicht.
  • Falls die vorbestimmte Eigenschaft des Partikels darin besteht, selektiv an eine Zielsubstanz, aber möglichst nicht an eine mit der Zielsubstanz nahe verwandte Substanz, d.h. ein Analogon der Zielsubstanz, zu binden, kann vor oder/und nach der Markierung der Zielsubstanz eine Inkubation mit der nahe verwandten Substanz erfolgen, so dass Partikel mit einer Affinität für die nahe verwandte Substanz bei der Selektionsprozedur von vornherein nicht erfasst werden.
  • Ein bevorzugtes Beispiel für eine Population geladener Partikel ist eine kombinatorische Bibliothek genetischer Elemente, wie etwa eine Ribosomen-Bibliothek, wobei einzelnen Elemente dieser Bibliothek eine Population unterschiedlicher Proteine, z.B. Antikörper, Enzyme oder Nukleinsäure-Bindeproteine, wie etwa Transkriptionsfaktoren, eine für das jeweilige Protein kodierende Nukleinsäure, z.B. eine mRNA, und ein Ribosom enthalten (vgl. z.B. Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 14130–14135). Die Ribosomen-Bibliothek wird mit einem Liganden für das Protein, der eine Markierung trägt, als Zielsubstanz vorinkubiert, wobei – entsprechend den Inkubationsbedingungen – nur Proteine mit einer vorbestimmten Selektivität bzw. Affinität an den markierten Liganden binden. Gegebenenfalls kann anschließend eine Inkubation mit einem Überschuss von unmarkiertem Liganden oder/und einem Ligandenanalogon erfolgen, so dass – bei gering affiner bzw. selektiver Bindung – markierte Liganden von den Proteinen verdrängt werden. Auf diese Weise können je nach Dauer der Inkubation mit dem unmarkierten Liganden bzw. Ligandenanalogon Komplexe mit höherer oder niederer Affinität oder Selektivität erhalten werden. Ein weiteres bevorzugtes Beispiel sind Vesikel mit Enzymen oder anderen katalytischen Molekülen, z.B. katalytischen Antikörpern, in denen bei Vorhandensein der selektionierten katalytischen Aktivität, z.B. durch Verwendung fluorogener Substrate der katalytischen Reaktion, markierte Produkte gebildet werden. Die Vesikel enthalten positive oder negative Ladungsträger auf ihrer Oberfläche, z.B. durch Einbau von positiv oder negativ geladenen Lipiden in die Vesikelmembran.
  • Zur Unterscheidung von markierten Partikeln, d.h. Partikeln mit der vorbestimmten Eigenschaft, und nicht markierten Partikeln, d.h. Partikeln ohne die vorbestimmte Eigenschaft, wird der Fluidstrom mit den Partikeln über ein Detektionselement geleitet. In Kontakt mit dem ersten Fluidstrom wird zumindest ein zweiter Fluidstrom in gleicher Strömungsrichtung durch den Kanal geleitet, wobei die Fluidströme im wesentlichen ohne Vermischung, vorzugsweise jeweils in laminarem Fluss durch den Kanal strömen.
  • Das Leiten der Flüsse durch den Kanal erfolgt vorzugsweise durch hydrodynamische Mittel, beispielsweise durch Saug- oder Pumpwirkung. Die Flüsse können jedoch auch durch elektroosmotische Mittel erzeugt werden, z.B. durch elektrischen Feldgradienten. Weiterhin ist eine Kombination von hydrodynamischem Fluss und Feldgradienten möglich. Die Flüsse durch den Kanal weisen vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d.h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im Zentrum des jeweiligen Fluidstroms und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeit ab. Die Flussgeschwindigkeit durch den Kanal liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mm/s, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/s. Der Durchmesser des Kanals liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 500 μm, besonders bevorzugt von 10 bis 100 μm. Vorzugsweise werden die Fluidströme durch einen linearen Kanal mit im Wesentlichen einem konstanten Durchmesser geleitet.
  • Der erste Fluidstrom und der zumindest eine zweite Fluidstrom werden vorzugsweise jeweils durch separate Zugänge in den Kanal eingeleitet. Weiterhin ist bevorzugt, dass der erste und der zumindest eine zweite Fluidstrom jeweils durch separate Ausgänge aus dem Kanal abgeleitet werden. Neben dem ersten Fluidstrom werden vorzugsweise mehrere zweite Fluidströme, z.B. 2 zweite Fluidströme, durch den Kanal geleitet. Der erste Fluidstrom, der die geladenen Partikel enthält, befindet sich vorzugsweise in Kontakt mit mindestens 2 anderen Fluidströmen. Die Flussgeschwindigkeit im ersten Fluidstrom ist dabei günstigerweise geringer als die Flussgeschwindigkeit in dem zumindest einem zweiten Fluidstrom, wobei vorzugsweise eine 2–10fach unterschiedliche Geschwindigkeit in den Fluidströmen vorliegt.
  • Der erste Fluidstrom mit den Partikeln und die anderen Fluidströme werden über ein Detektionselement geleitet. Die Identifizierung eines markierten Partikels kann mittels einer beliebigen Messmethode, z.B. mit einer orts- und/oder zeitaufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanal vorliegt, sehr geringe Signale von Markierungsgruppen, insbesondere Fluoreszenzsignale, bis hinunter zur Einzelphotonenzählung zu erfassen. Wichtig ist dabei, dass die von markierten Partikeln stammenden Signale deutlich erfasst werden, so dass eine zuverlässige Unterscheidung von den nicht markierten Partikeln möglich ist.
  • Beispielsweise kann die Detektion mittels Einzelmolekül- und Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie erfolgen, bei der ein sehr kleines konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 bis 20 × 10–15 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, so dass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen.
  • Alternativ kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein so genanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomenes", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend – vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≥ 100 ps – das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
  • Besonders bevorzugt umfasst die Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszenzmarkierten Partikeln in der den Kanal durchströmenden Probeflüssigkeit einen Laser als Fluoreszenzanregungslichtquelle für die Moleküle, eine optische Anordnung zur Leitung und Fokussierung von Laserlicht des Lasers auf einen Fokalbereich des Kanals und zur konfokalen Abbildung des Fokalbereichs auf eine Fotodetektoranordnung zur Erfassung von Fluoreszenzlicht, welches im Fokalbereich von einem oder gegebenenfalls mehreren optisch angeregten Molekülen emittiert wurde, wobei die optische Anordnung ein Beugungselement oder ein phasenmodulierendes Element im Strahlengang des Lasers aufweist, welches gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren optischen Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl des Lasers ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich konfokal für die Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung abzubilden. Alternativ kann die Detektionsvorrichtung zwei den Kanal an einander gegenüberliegenden Seiten begrenzende Wände aufweisen, von denen eine ein Array von vorzugsweise integrierten, in den Kanal emittierenden Laserelementen als Fluoreszenzanregungslichtquellen aufweist, und von denen die andere ein Array von vorzugsweise integrierten, den Laserelementen jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweist, wobei die Laserelemente vorzugsweise Potenzialtopflaserelemente und die Fotodetektorelemente Avalanche-Dioden sind. Derartige Vorrichtungen sind beispielsweise in WO 01/86285 beschrieben.
  • Die durch das Detektionselement identifizierten Partikel, die eine Markierung tragen, werden von nicht markierten Partikeln abgetrennt. Hierzu wird – wenn das Detektionselement ein markiertes Partikel erkennt – in Flussrichtung stromabwärts ein elektrisches Feld über den Kanal gelegt, um die markierten geladenen Partikel aus dem ersten Fluidstrom in einen anderen Fluidstrom zu überführen. Das elektrische Feld wird vorzugsweise durch Elektroden erzeugt, die an oder/und in den Wänden des Kanals angeordnet sind. Die Elektroden können sich dabei innerhalb des Kanals befinden oder in den Kanalwänden integriert sein. Als geeignet hat sich beispielsweise eine Elektrodenanordnung umfassend zwei Drahtelektroden, z.B. aus Pt, angeordnet an gegenüberliegenden Wänden des Kanals im Kanalinneren, erwiesen. Da die Partikel während des Anlegens des elektrischen Feldes im Fluidstrom durch den Kanal transportiert werden, besitzen die Elektroden vorzugsweise eine laterale Ausdehnung von 1 bis 10 mm, um das elektrische Feld für eine ausreichende Zeitdauer aufrecht zu erhalten, die eine Überführung des markierten geladenen Partikels vom ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom erlaubt.
  • Die Zeitdauer für das Anlegen des elektrischen Feldes ergibt sich aus der Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel und der quer zur Strömungsrichtung zurückzulegenden Wegstrecke. Die Wanderungsgeschwindigkeit der geladenen Partikel im elektrischen Feld wird durch die Feldstärke und die Gesamtladung und Größe der Partikel bestimmt. Die Wegstrecke ergibt sich aus den Durchmessern der Fluidströme. Gute Ergebnisse können beispielsweise erzielt werden, wenn das elektrische Feld für eine Dauer von 20–200 m/s und mit einer Spannung von 10–50 V angelegt wird. Vorzugsweise werden die Parameter beim Anlegen des elektrischen Feldes so eingestellt, dass das markierte Partikel möglichst in einen mittleren Bereich des zweiten Fluidstroms transportiert wird. Nähere Angaben zur Wanderung von Partikeln im elektrischen Feld finden sich bei Rigler, Electrophoresis 23 (2002), 605–608.
  • Die Überführung des markierten Partikels vom ersten Fluidstrom in den zweiten Fluidstrom bewirkt eine räumliche Abtrennung der markierten Partikel von nicht markierten Partikeln, ohne dass ein signifikanter Fluidaustausch zwischen den Fluidströmen erfolgt. Der zweite Fluidstrom, der die markierten Partikel nunmehr enthält, wird anschließend vorzugsweise vom ersten Fluidstrom abgetrennt, beispielsweise indem der erste und zweite Fluidstrom jeweils durch separate Austrittsöffnungen aus dem Kanal abgeleitet werden. Die im zweiten Fluidstrom vorliegenden Partikel können anschließend einer Analyse unterzogen werden.
  • Diese Analyse umfasst vorzugsweise das Identifizieren oder/und Charakterisieren der gefundenen Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft. Dieser Schritt kann beispielsweise eine Amplifizierung, z.B. im Falle von Zellen und Viren, eine Vermehrung oder im Falle von Nukleinsäuren eine Amplifikationsreaktion wie PCR oder eine Sequenzierung umfassen. Das identifizierte bzw. charakterisierte Partikel bzw. dessen charakteristische Determinante, z.B. ein auf der Oberfläche präsentiertes Protein, kann anschließend dem jeweils dafür vorgesehenen Verwendungszweck zugeführt oder als Grundlage zur Herstellung einer weiteren kombinatorischen Bibliothek, z.B. durch Mutagenese, eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäße Selektionsprozedur kann in einem Zyklus oder in mehreren aufeinander folgenden Zyklen durchgeführt werden, wobei die Anzahl von falsch positiv identifizierten Partikeln verringert werden kann. Eine derartige Prozedur ist beispielsweise in WO 02/01189 beschrieben.
  • Eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält:
    • (i) einen ersten Zugang zum Einbringen des ersten Fluidstroms, der die zu selektionierenden Partikel enthält, die eine elektrische Ladung tragen,
    • (ii) einen oder mehrere zweite Zugänge zum Einbringen von zumindest einem zweiten Fluidstrom,
    • (iii) einen Kanal, in den die Zugänge (i) und (ii) einmünden, der so ausgestaltet ist, dass darin die ersten und zweiten Fluidströme gleichgerichtet in Kontakt miteinander und im wesentlich ohne Vermischung strömen,
    • (iv) mehrere Ausgänge zum separaten Ableiten der Fluidströme aus dem Kanal,
    • (v) ein Detektionselement zur Erkennung markierter Partikel und
    • (vi) Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes, beispielsweise Elektroden, um geladene Partikel vom ersten Fluidstrom in einen der zweiten Fluidströme zu überführen.
  • Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens zwei separate Zuleitungen zum Einbringen von 2 zweiten Fluidströmen. Die Zuleitungen sind dabei so angeordnet, dass der erste Fluidstrom in Kontakt mit den beiden anderen Fluidströmen durch den Kanal geleitet wird.
  • Die Vorrichtung enthält vorzugsweise weiterhin automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz- oder Kühleinrichtungen wie Peltier-Elemente, Reservoirs oder/und elektronische Auswertungsgeräte.
  • Die Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet.
    •
  • Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen:
  • 1 ist die schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Durch einen ersten Zugang (2) wird eine Population von markierten (leere Kreise) und unmarkierten (ausgefüllte Kreise) Partikeln (4) in einem ersten Fluidstrom (2a) in die Vorrichtung eingebracht. Ein zweiter Zugang (6) dient zum Einbringen eines zweiten Fluidstroms (6a). Die ersten und zweiten Zugänge (2, 6) münden in einen Kanal (8), in dem der aus dem ersten Zugang (2) stammende erste Fluidstrom (2a) gleichgerichtet mit dem aus dem zweiten Zugang (6) stammenden zweiten Fluidstrom (6a) ohne Vermischung, vorzugsweise jeweils in einem laminaren Fluss strömt. Der Durchmesser der Zugänge (2, 6) ist vorzugsweise im Bereich von ca. 1–5 mm. Der Kanal (8) hat vorzugsweise eine Breite von 50 μm und eine Tiefe von 20 μm. Die Formen und Abmessungen der Zugänge bzw. des Kanals können jedoch erheblich variiert werden, sofern ein vermischungsfreier Fluss mehrerer separater Fluidströme gewährleistet ist. Gegebenenfalls können die Zugänge auch als Reservoirvolumina dienen.
  • Im Bereich des Kanals (8) ist ein Detektionselement (10), vorzugsweise ein konfokales Detektionselement, angeordnet, welches die im ersten Fluidstrom (2a) durch den Kanal (8) transportierten markierten Partikel erkennt, beispielsweise dadurch dass ein von der Markierung stammendes Signal, z.B. ein optisches Signal, wie etwa Fluoreszenzemissionssignal, aufgefangen wird. Das Signal kann durch entsprechende Anregung mit einer Lichtquelle, z.B. einem Laser (nicht gezeigt), erzeugt werden. Stromabwärts des Detektionselements befindet sich eine Elektrodenanordnung mit einer positiven Elektrode (12a) und einer negativen Elektrode (12b). Durch Anlegen eines elektrischen Feldes im Bereich der Elektroden (12a, 12b) werden positiv geladene Partikel aus dem ersten Fluidstrom (2a) in den zweiten Fluidstrom (6a) überführt. (Bei Umkehrung der Polarität der Elektroden (12a, 12b) können auf entsprechende Weise negativ geladene Partikel aus dem ersten Fluidstrom (2a) in den zweiten Fluidstrom (6a) überführt werden. Durch eine Steuerung des Zeitpunkts und der Zeitdauer für das Anlegen des elektrischen Feldes im Bereich der Elektroden (12a, 12b) wird erreicht, dass markierte Partikel selektiv in den zweiten Fluidstrom (6a) überführt werden, während unmarkierte Partikel im ersten Fluidstrom (2a) verbleiben.
  • Stromabwärts der Elektrodenanordnung (12a, 12b) unterteilt sich der Kanal (8) in einen ersten Ausgang (14) und einen zweiten Ausgang (16). Während die unmarkierten Partikel, die im ersten Fluidstrom (2a) verblieben sind, durch den ersten Ausgang (14) aus der Vorrichtung abgeleitet werden, erfolgt eine separate Ableitung der markierten Partikel im zweiten Fluidstrom (6a) durch den zweiten Ausgang (16). Die Durchmesser der Ausgänge entsprechen vorzugsweise den Durchmessern der Zugänge.
  • 2 ist die schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese Vorrichtung enthält einen ersten Zugang (20) zum Einbringen eines ersten Fluidstroms (20a), der die zu selektionierenden Partikel (22) enthält, wobei markierte Partikel (leere Kreise) und unmarkierte Partikel (geschlossene Kreise) vorhanden sind. Weiterhin enthält die Vorrichtung zwei Zugänge (24, 26) zum Einbringen von zwei weiteren „zweiten" Fluidströmen (24a, 26a). Die Zugänge (22, 24, 26) münden in einen Kanal (28), in dem die Fluidströme (20a, 24a, 26a) gleichgerichtet und ohne Vermischung nebeneinander, vorzugsweise im laminaren Fluss strömen, ohne dass eine Vermischung der Fluidströme stattfindet. Ein im Bereich des Kanals (28) angeordnetes Detektionselement (30), vorzugsweise ein konfokales Detektionselement, erkennt ein markiertes Partikel aufgrund der von der Markierung stammenden Signale. Stromabwärts des Detektionselements ist eine Elektrodenanordnung (32a, 32b) mit einer positiven und einer negativen Elektrode lokalisiert. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes im Bereich der Elektrodenanordnung werden markierte Partikel – entsprechend ihrer Ladung – aus dem ersten Fluidstrom (20a) in einen der beiden zweiten Fluidströme (24a, 26a) überführt. In der dargestellten Vorrichtung werden die Partikel mit negativer Ladung in den Fluidstrom 24a und mit positiver Ladung in den Fluidstrom 26a überführt. Am Ende des Kanals (28) befinden sich drei Ausgänge (34, 36, 38). Der Ausgang (34) dient zum Ableiten des ersten Fluidstroms (20a), der noch die unmarkierten Partikel enthält. Die Ableitungen (36, 38) dienen zum Ableiten der Fluidströme 24a bzw. 26a, in denen – entsprechend ihrer Ladung – die markierten Partikel vorliegen.

Claims (23)

  1. Verfahren zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population von unterschiedlichen Partikeln, (b) Markieren von Partikeln, die eine vorbestimmte Eigenschaft aufweisen, (c) Leiten eines ersten Fluidstrom, der die Partikel enthält, unter Bedingungen, bei denen die Partikel eine elektrische Ladung tragen, durch einen Kanal, wobei der erste Fluidstrom in Kontakt mit zumindest einem zweiten Fluidstrom steht, der gleichgerichtet mit dem ersten Fluidstrom im wesentlichen ohne Vermischung strömt, (d) Leiten der Fluidströme über ein Detektionselement, das zwischen markierten und nicht markierten Partikeln unterscheiden kann, (e) Abtrennen eines detektierten markierten Partikels durch Anlegen eines elektrischen Feldes, um das Partikel aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom zu überführen, und (f) gegebenenfalls Identifizieren oder/und Charakterisieren des markierten und abgetrennten Partikels.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel aus Zellen, Teilen von Zelloberflächen, Zellorganellen, Viren, Nukleinsäuren, Proteinen und niedermolekularen Substanzen ausgewählt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Population eine kombinatorische Bibliothek umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die kombinatorische Bibliothek aus genetischen Packungen wie Phagen, Zellen, Sporen oder Ribosomen oder Vesikeln mit katalytisch aktiven Proteinen ausgewählt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Population mehr als 108 unterschiedliche Partikel umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Population mehr als 102 unterschiedliche Partikel umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Markieren eine Inkubation der Partikel mit einer eine nachweisbare Markierung tragenden Zielsubstanz umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Markierung eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe verwendet wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel durch einen Kanal mit einem Durchmesser von 1 bis 500 μm geleitet werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluidstrom und der zumindest eine zweite Fluidstrom jeweils durch separate Zugänge in den Kanal geleitet werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluidstrom und der zumindest eine zweite Fluidstrom jeweils durch separate Ausgänge aus dem Kanal geleitet werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluidstrom in Kontakt mit mehreren, insbesondere mit 2 zweiten Fluidströmen durch den Kanal geleitet wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluidströme einen laminaren Fluss aufweisen.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussgeschwindigkeit in den Fluidströmen im Bereich von 1–50 mm/s liegt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussgeschwindigkeit im ersten Fluidstrom geringer als die Flussgeschwindigkeit in dem zumindest einen zweiten Fluidstrom ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der markierten Partikel durch Einzelmolekül- oder/und Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie oder/und durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenz-Abklingmessung erfolgt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld durch Elektroden erzeugt wird, die an den Wänden des Kanals angeordnet sind.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden eine laterale Ausdehnung von 1 bis 10 mm aufweisen.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld für eine Dauer von 20–200 ms angelegt wird.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld durch Anlegen einer Spannung von 10–50 V erzeugt wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere aufeinander folgende Selektionszyklen durchgeführt werden.
  22. Vorrichtung zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, umfassend: (a) einen Kanal, in dem ein erster und zumindest ein zweiter Fluidstrom gleichgerichtet in Kontakt miteinander und im wesentlichen ohne Vermischung strömen können, (b) Mittel zum Einbringen eines ersten Fluidstroms in den Kanal, wobei der erste Fluidstrom die Partikel enthält und die Partikel eine elektrische Ladung tragen, (c) Mittel zum Einbringen zumindest eines zweiten Fluidstroms in den Kanal, (d) Mittel zur Detektion einer Markierung auf einem geladenen Partikel, das im ersten Fluidstrom durch den Kanal geleitetet wird, und (e) Mittel zum Abtrennen eines detektierten markierten Partikels von nicht markierten Partikeln, umfassend Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes, um das Partikel aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom zu überführen.
  23. Vorrichtung zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, umfassend: (i) einen ersten Zugang zum Einbringen des ersten Fluidstroms, der die zu selektionierenden Partikel enthält, die eine elektrische Ladung tragen, (ii) einen oder mehrere zweite Zugänge zum Einbringen von zumindest einem zweiten Fluidstrom, (iii) einen Kanal, in den die Zugänge (i) und (ii) einmünden, der so ausgestaltet ist, dass darin die ersten und zweiten Fluidströme gleichgerichtet in Kontakt miteinander und im wesentlich ohne Vermischung strömen, (iv) mehrere Ausgänge zum separaten Ableiten der Fluidströme aus dem Kanal, (v) ein Detektionselement zur Erkennung markierter Partikel und (vi) Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes, um geladene Partikel vom ersten Fluidstrom in einen der zweiten Fluidströme zu überführen.
DE102004047953A 2004-10-01 2004-10-01 Selektion von Partikeln im laminaren Fluss Withdrawn DE102004047953A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004047953A DE102004047953A1 (de) 2004-10-01 2004-10-01 Selektion von Partikeln im laminaren Fluss
PCT/EP2005/010548 WO2006037561A1 (en) 2004-10-01 2005-09-29 Selection of particles in laminar flow
EP05795236A EP1802958A1 (de) 2004-10-01 2005-09-29 Selektion von partikeln in laminarströmung
US11/664,423 US8252604B2 (en) 2004-10-01 2005-09-29 Selection of particles in laminar flow

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004047953A DE102004047953A1 (de) 2004-10-01 2004-10-01 Selektion von Partikeln im laminaren Fluss

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102004047953A1 true DE102004047953A1 (de) 2006-04-20

Family

ID=36120325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102004047953A Withdrawn DE102004047953A1 (de) 2004-10-01 2004-10-01 Selektion von Partikeln im laminaren Fluss

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8252604B2 (de)
EP (1) EP1802958A1 (de)
DE (1) DE102004047953A1 (de)
WO (1) WO2006037561A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012211626A1 (de) * 2012-07-04 2014-01-09 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2793295A (en) * 1994-06-17 1996-01-15 Evotec Biosystems Gmbh Process and device for selectively extracting components from complex mixtures
US9943847B2 (en) 2002-04-17 2018-04-17 Cytonome/St, Llc Microfluidic system including a bubble valve for regulating fluid flow through a microchannel
US6976590B2 (en) 2002-06-24 2005-12-20 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US6808075B2 (en) 2002-04-17 2004-10-26 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US20070065808A1 (en) * 2002-04-17 2007-03-22 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US8895298B2 (en) 2002-09-27 2014-11-25 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
US8685711B2 (en) 2004-09-28 2014-04-01 Singulex, Inc. Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules
US9040305B2 (en) 2004-09-28 2015-05-26 Singulex, Inc. Method of analysis for determining a specific protein in blood samples using fluorescence spectrometry
US9260693B2 (en) 2004-12-03 2016-02-16 Cytonome/St, Llc Actuation of parallel microfluidic arrays
EP2594631A1 (de) * 2005-04-05 2013-05-22 Cellpoint Diagnostics Vorrichtungen und Verfahren zur Nachweisen von zirkulierenden Tumorzellen und anderen Partikeln
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
US10001496B2 (en) 2007-01-29 2018-06-19 Gearbox, Llc Systems for allergen detection
US20080245740A1 (en) * 2007-01-29 2008-10-09 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Fluidic methods
JP2011508219A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
WO2012067985A2 (en) * 2010-11-18 2012-05-24 The Regents Of The University Of California Method and device for high-throughput solution exchange for cell and particle suspensions
US9815060B2 (en) 2010-11-18 2017-11-14 The Regents Of The University Of California Method and device for high-throughput solution exchange for cell and particle suspensions
ES2865108T3 (es) * 2011-12-20 2021-10-15 Becton Dickinson Co Método, sistema, medio de almacenamiento legible por ordenador y clasificador de células para mejorar el rendimiento de partículas clasificadas
CN105264127B (zh) 2013-03-15 2019-04-09 Gpb科学有限责任公司 颗粒的片上微流体处理
CN113512522A (zh) 2013-03-15 2021-10-19 普林斯顿大学理事会 用于高通量纯化的方法和设备
US20150064153A1 (en) 2013-03-15 2015-03-05 The Trustees Of Princeton University High efficiency microfluidic purification of stem cells to improve transplants
EP3011305B1 (de) * 2013-06-19 2022-08-10 Universiteit Leiden Zweiphasige elektrogewinnung aus beweglichen phasen
GB2528632A (en) 2014-04-30 2016-02-03 Cambridge Entpr Ltd Fluidic analysis and separation
US10976232B2 (en) 2015-08-24 2021-04-13 Gpb Scientific, Inc. Methods and devices for multi-step cell purification and concentration
US11839876B2 (en) 2016-05-24 2023-12-12 Cellix Limited Apparatus for microfluidic flow cytometry analysis of a particulate containing fluid

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994016313A2 (de) * 1993-01-18 1994-07-21 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren und vorrichtung zur bewertung der fitness von biopolymeren
DK0925494T3 (da) * 1996-09-04 2002-07-01 Scandinavian Micro Biodevices Mikrostrømningssystem til partikelseparation og analyse
DE10031028B4 (de) * 2000-06-26 2008-09-04 Gnothis Holding Sa Verfahren zur Selektion von Partikeln
US7318902B2 (en) * 2002-02-04 2008-01-15 Colorado School Of Mines Laminar flow-based separations of colloidal and cellular particles
US7223371B2 (en) * 2002-03-14 2007-05-29 Micronics, Inc. Microfluidic channel network device
EP1507591A1 (de) * 2002-05-24 2005-02-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zum überführen von molekülen aus einem chemisch reagierenden ersten strom in einen benachbarten chemisch reagierenden zweiten strom
US20070163883A1 (en) * 2004-02-04 2007-07-19 Evotec Technologies Gmbh Microfluidic system comprising an electrode arrangement and associated control method
US20070151855A1 (en) * 2004-02-04 2007-07-05 Evotec Technologies Gmbh Microfluidic system and associated operational method
US7964078B2 (en) * 2005-11-07 2011-06-21 The Regents Of The University Of California Microfluidic device for cell and particle separation
WO2007092713A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Trustees Of The University Of Pennsylvania Microfluidic system and method for analysis of gene expression in cell-containing samples and detection of disease
TWI305732B (en) * 2006-09-18 2009-02-01 Raydium Semiconductor Corp Fluid particle separating device
US7807454B2 (en) * 2006-10-18 2010-10-05 The Regents Of The University Of California Microfluidic magnetophoretic device and methods for using the same
US8790916B2 (en) * 2009-05-14 2014-07-29 Genestream, Inc. Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012211626A1 (de) * 2012-07-04 2014-01-09 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellsuspension

Also Published As

Publication number Publication date
US20080108143A1 (en) 2008-05-08
EP1802958A1 (de) 2007-07-04
WO2006037561A1 (en) 2006-04-13
US8252604B2 (en) 2012-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10031028B4 (de) Verfahren zur Selektion von Partikeln
DE102004047953A1 (de) Selektion von Partikeln im laminaren Fluss
EP2152913B1 (de) Detektionsvorrichtung zur detektion von biologischen mikropartikeln wie bakterien, viren, sporen, pollen oder biologische toxine, sowie detektionsverfahren
EP0177718B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Sortierung von mikroskopischen Partikeln
US8613890B2 (en) Microparticle sorting apparatus, flow cytometer using the same and microparticle sorting method
CN102998259B (zh) 光学测量设备、流式细胞仪及光学测量方法
WO2004070361A1 (de) Mehrparametrige detektion in einem fluidischen mikrosystem
JP2009115672A (ja) 微小粒子の光学的測定方法及び分取方法、並びに前記光学的測定方法及び分取方法に用いる流路、光学的測定装置及びフローサイトメータ
JP2005521425A (ja) 微小流体粒子分析システム
US11733152B2 (en) Microfluidic system with combined electrical and optical detection for high accuracy particle sorting and methods thereof
WO2003056330A2 (de) Zellsortiersystem zur grössenabhängigen sortierung oder separation von in einer strömenden flüssigkeit suspendierten zellen
DE10023423B4 (de) Direkter Nachweis von Einzelmolekülen
US8351034B2 (en) Laminar flow width detecting method, laminar flow width control method, laminar flow control system, and flow cytometer
US20070163883A1 (en) Microfluidic system comprising an electrode arrangement and associated control method
DE4301005A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bewertung der Fitness von Biopolymeren
Zhang Imaging single synaptic vesicles in mammalian central synapses with quantum dots
RU2756306C1 (ru) Система и способ для анализа фенотипа и полинуклеотидного секвенирования биологических частиц с использованием детерминированного штрихкодирования
ES2255349B1 (es) Procedimiento y dispositivo para la identificacion y caracterizacion secuencial de unidades discretas en suspension en un chorro capilar en regimen de flujo laminar, mediante un sensor optico o electromagnetico.
WO2023220536A2 (en) Systems and methods for sorting using laser particles or cells
EP4088099A1 (de) Anordnung zur optischen vorkonditionierung einer optisch aktivierbaren biologischen probe
DE10314579A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren
WO2003035259A2 (de) Arrays mit hairpin-strukturen
Hiebert et al. the different cultures were observed, the most each class of chromosomes identified by a distinct
Dittrich et al. Cytometry on Microfluidic Chips

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee