DE102004035347A1

DE102004035347A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Info

Publication number: DE102004035347A1
Application number: DE102004035347A
Authority: DE
Inventors: Sören Dr. Petersen; Marc Dr. Blair Gerigk; Thomas Dr. Hermann; Brigitte Dr. Bathe
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-07-21
Publication date: 2005-03-24

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien.

L-Lysin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass L-Lysin durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden kann. Wegen der großen Bedeutung dieser Aminosäure wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z.B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z.B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen, d.h. die genetisch bedingten Leistungseigenschaften des Bakteriums selbst betreffen.

In engem Zusammenhang mit der Leistungsfähigkeit eines Bakteriums in einem gegebenen Prozess stehen die Raten, mit denen Stoffwechselprozesse ablaufen. Vorteilhaft für die fermentative Herstellung von Aminosäuren wie L-Lysin sind beispielsweise eine möglichst hohe Lysinproduktionsrate bei gleichzeitig möglichst hohem Verhältnis von Lysinproduktions- zu Zuckeraufnahmerate (Ausbeute) sowie möglichst geringen Raten (idealerweise null) der Bildung von Nebenprodukten.

Die Messung von Raten wie den vorgenannten, die entweder die Aufnahme von Nährstoffen aus der Kulturflüssigkeit oder die Abgabe von Produkten in die Kulturflüssigkeit durch die Zellen (im folgenden extrazelluläre Raten genannt) bezeichnen, ist Stand der Technik. Es ist ebenfalls Stand der Technik, extrazelluläre Raten innerhalb der durch die intrinsischen Eigenschaften des fermentierten Organismus gesetzten Grenzen durch Prozesssteuerungs- bzw. -regelungsmaßnahmen günstig zu beeinflussen, so lassen sich beispielsweise die Zuckeraufnahme- und die Lysinproduktionsrate durch eine Zufütterungsstrategie beeinflussen wie es von Ensari und Lim (Applied Microbiology and Biotechnology 62: 35–40 (2003)) beschrieben ist. Shimizu et al. (Metabolic Engineering 1: 299–308 (1999)) beschreiben eine verfahrenstechnische Methode, die Lysinproduktivität im Rahmen der Grenzen eines gegebenenen Corynebacterium glutamicum-Stammes mittels Kontrolle der Wachstumsrate zu maximieren.

Im Gegensatz zu den extrazellulären Raten stehen die Raten der Umsetzungen von Stoffwechsel-Intermediaten innerhalb der Zelle ineinander, die sogenannten intrazellulären Raten oder Flüsse. Intrazelluläre Flüsse lassen sich beispielsweise mit Hilfe isotopischer Markierungstechniken wie der 13C-Markierungstechnik in Verbindung mit Kernresonanzspektroskopie (NMR) oder Massenspektrometrie bestimmen (Wiechert, Metabolic Engineering 3: 195–206 (2001)). Da intrazelluläre Umsetzungen bis auf wenige Ausnahmen enzymkatalysierte Reaktionen sind, lassen sich intrazelluläre Flüsse über Veränderung der Mengen der beteiligten Enzyme oder auch über Veränderungen der Enzymmengen konkurrierender Stoffwechselwege beeinflussen (z.B. WO 01/07626; US 6,586,214 ; Koffas et al. (Metabolic Engineering 5: 32–41 (2003)). Als Maß für die Menge eines bestimmten Enzyms wird in der Regel dessen sogenannte spezifische Aktivität verwandt, die sich z.B. in Zellextrakten messen lässt. Weder die Menge noch die spezifische Aktivität eines Enzyms sind dabei ein Maß für den in einem Fermentationsverfahren tatsächlich katalysierten Fluss.

Während die Bestimmung der intrazellulären Flüsse in verschiedenen aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften nicht optimal lysinproduzierenden Bakterienstämmen, insbesondere Stämmen von Corynebacterium glutamicum, zahlreich in der Literatur beschrieben ist (z.B. Marx et al., Biotechnology and Bioengineering 49: 111–129 (1996); Wittmann und Heinzle, European Journal of Biochemistry 268: 2441–2455 (2001); Drysch et al., Biotechnology and Bioengineering 5: 497–505 (2004)), ist eine Spezifizierung der für optimale Produktionsverhältnisse notwendigen Flüsse bislang nur anhand nicht realer, weil stark vereinfachter, Stoffwechselmodelle erfolgt. Stephanopoulos und Vallino (Science 252: 1675–1681 (1991)) beispielsweise berechneten die für eine theoretisch maximale Lysinausbeute notwendigen intrazellulären Flüsse anhand eines Modells, welches ausschließlich den Zentralstoffwechsel und die Lysinbiosynthese umfasst, d.h. weder das Restwachstum noch den Erhaltungsstoffwechsel eines realen Organismus berücksichtigt.

Von Varma et al. (Biotechnology and Bioengineering 42: 59–73 (1993)) wurde am Beispiel des Bakteriums Escherichia coli gezeigt, wie die theoretisch maximalen Ausbeuten verschiedener Aminosäuren, darunter auch Lysin, sowie die diesen Ausbeuten zugrundeliegenden Flüsse anhand der vorhandenen biochemischen Reaktionen berechnet werden können. Burgard und Maranas (Biotechnology and Bioengineering 74: 364-375 (2001)) erweiterten diese Arbeit zu einem universellen, spezies-unabhängigen Modell. Jedoch bleiben in beiden Fällen Restwachstum und Erhaltungsstoffwechsel ebenfalls unberücksichtigt. Petersen et al. (in: Metabolic Engineering in the Post Genomic Era, Kholodenko und Westerhoff (Hrsg.), Horizon Bioscience, Wymondham, UK (2004), pp. 237–275) beschreiben in einem Beispiel einen Ansatz, die bei einer Änderung spezifischer Enzymaktivitäten zu erwartenden Änderungen der Flüsse und damit auch zum Teil Verbesserungen der Lysinproduktivität zu berechnen, ohne allerdings auf die für eine optimale Lysinproduktivität notwendigen Flüsse selbst einzugehen.

Es war Aufgabe dieser Erfindung, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) ein L-Lysin produzierendes coryneformes Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert, wobei
b) die Konzentration der Kohlenstoffquelle(n) während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 10 g/l eingestellt wird, und
c) coryneforme Bakterien einsetzt werden, die mindestens einen oder mehrere Kohlenstoffflüsse aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe von i) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken; ii) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens jedoch 20% lenken; iii) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens jedoch 60% lenken; iv) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98% lenken; v) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19% lenken; vi) coryneformen Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6 einzustellen; und vii) coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/ Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7 einzustellen.

Der Kohlenstofffluss ist dabei definiert als das Verhältnis der auf Kohlenstoff bezogenen molaren Raten einer im Stoffwechsel stattfindenden Einzelreaktion oder Reaktionsfolge zu der Kohlenstoffaufnahmerate.

In einem Aspekt dieser Erfindung, ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass man im Schritt (c) coryneforme Bakterien einsetzt, die mindestens den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken. Es ist weiterhin möglich, dass man im Schritt (c) coryneforme Bakterien einsetzt, die zusätzlich zu dem Stofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg, einen weiteren Stofffluss ausgewählt aus der Gruppe (ii) bis (vii) lenken.

In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung, ist der Verfahrenschritt (c) dadurch gekennzeichnet, dass man coryneforme Bakterien einsetzt, die mindestens zwei der Stoffflüsse ausgewählt aus der Gruppe (i) bis (vii), lenkt.

Beschreibung der Erfindung

Neben der genauen Kenntnis des zellulären Stoffwechsels ist für eine modellbasierte Verbesserung des Stammes und des Produktionsprozesses eine Stoffflussanalyse notwendig, bei der durch Einsatz von zum Beispiel ¹³C markiertem Substrat der Kohlenstofffluss durch den Stoffwechsel nachvollzogen werden kann und die Flussverhältnisse an Verzweigungen in Form von relativen Flüssen bestimmt werden können (Bioreaktionstechnik: Bioprozesse mit Mikroorganismen und Zellen: Prozessüberwachung; K. Schügerl; Birkhäuser Verlag Basel – Bosten – Berlin; 1997). Der Kohlenstofffluss ist definiert als das Verhältnis der auf Kohlenstoff bezogenen molaren Raten einer im Stoffwechsel stattfindenden Einzelreaktion oder Reaktionsfolge zu der Kohlenstoffaufnahme. Wird für die Markierung eine 13C-Verbindung verwendet, ist die Bestimmung der Verteilung der markierten Atome in den verschiedenen Metaboliten beispielsweise mittels Kern-Resonanz-Spektroskopie (NMR) möglich.

Erfindungsgemäß besitzen die coryneformen Bakterien die Fähigkeit, den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75%, mehr als 85%, mehr als 95%, mehr als 105%, mehr als 115%, mehr als 125%, mehr als 135%, mehr als 145%, zu lenken.

Weiterhin besitzen die L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien die Fähigkeit, den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens jedoch 20%, mindestens 2% höchstens jedoch 18%, mindestens 3% höchstens jedoch 16% zu lenken.

Der Tricarbonsäurezyklus dient neben der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten auch zur Synthese von Verbindungen, die wesentliche Vorstufen der Aminosäuresynthesewege sind. Oxalacetat dient beispielsweise als eine Vorstufe der Lysinsynthese. Die Entnahme dieser Vorstufen aus dem Tricarbonsäurezyklus wird durch Auffüllreaktionen, so genannte anaplerotische Reaktionen kompensiert. Je nach Art der Kohlenstoffquelle, Wachstumsrate und Produktbildung der coryneformen Bakterien können diese Reaktionen vorwärts oder rückwärts ablaufen. vorwärts bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Kohlenstofffluss von der Glykolyse in Richtung Tricarbonsäurezyklus erfolgt (z.B. vom Pyruvat zum Oxalacetat und/oder vom Phosphoenolpyruvat zum Oxalacetat). Rückwärts bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Kohlenstofffluss vom Tricarbonsäurezyklus in Richtung Glykolyse verläuft (z.B. vom Oxalacetat zum Pyruvat). Die Flüsse können dabei gleichzeitig in beide Richtungen verlaufen. Die Summe aller vorwärts gerichteten abzüglich der Summe aller rückwärts gerichteten Flüsse bezeichnet man als Nettofluss. Ist der Nettofluss vorwärts gerichtet (also von der Glykolyse zum Tricarbonsäurezyklus), erhält er ein positives Vorzeichen, ist er rückwärts gerichtet, erhält er ein negatives Vorzeichen. Lysin produzierende coryneforme Bakterien besitzen im Allgemeinen die Fähigkeit, den Kohlenstoff durch die anaplerotischen Reaktionen von der Glykolyse in Richtung Tricarbonsäurezyklus zu lenken.

Besonders geeignet sind erfindungsgemäß L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19%, mehr als 23%, mehr als 26%, mehr als 28%, mehr als 30%, mehr als 33%, mehr als 35%, mehr als 37% zu lenken. Dies entspricht definitionsgemäß einem Nettofluss durch die anaplerotischen Reaktionen von mehr als 19%, mehr als 23%, mehr als 26%, mehr als 28%, mehr als 30%, mehr als 33%, mehr als 35%, mehr als 37%.

Erfindungsgemäß besonders geeignet sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens jedoch 60%, mindestens 30% höchstens jedoch 57%, mindestens 32% höchstens jedoch 53%, mindestens 33% höchstens jedoch 50% zu lenken.

Weiterhin sind erfindungsgemäß L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die die Fähigkeit besitzen, den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98%, mindestens 53% höchstens jedoch 95%, mindestens 56% höchstens jedoch 91%, mindestens 58% höchstens jedoch 87% zu lenken.

Erfindungsgemäß besitzen die L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6, mindestens 3,5 höchstens jedoch 4,5, mindestens 3,6 höchstens jedoch 4,4, mindestens 3,7 höchstens jedoch 4,3 einzustellen.

Weiterhin sind L-Lysin erfindungsgemäß produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7, mindestens 7 höchstens jedoch 150, mindestens 10 höchstens jedoch 125, mindestens 13 höchstens jedoch 100, oder mindestens 16 höchstens jedoch 75 einzustellen.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715
oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.

Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein wie oben beschriebenes Verfahren, in dem die in (c) beschrieben coryneforme Bakterien mindestens drei Kohlenstoffflüsse, ausgewählt aus (i) bis (vii) lenken.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein wie oben beschriebenes verfahren, in dem die in (c) beschrieben coryneforme Bakterien mindestens vier oder mehr Kohlenstoffflüsse, ausgewählt aus (i) bis (vii) lenken.

Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein wie oben beschriebenes Verfahren, in dem die in (c) beschrieben coryneforme Bakterien alle Kohlenstoffflüsse (i) bis (vii) lenken.

Erfindungsgemäß kann die Anlagenleistung einer L-Lysin produzierenden Fermentationseinheit dadurch gesteigert werden, dass man in dem oben beschriebenen ersten Kultivierungsschritt (a) nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert, wobei bei Verwendung des Zulaufverfahrens mindestens ein Zusatz-Nährmedium eingesetzt wird. I

Während des Kultivierungsschrittes (a) wird das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert. Bei Verwendung des Zulaufverfahrens wird nach mehr als 0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis 10 Stunden, bevorzugt nach 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt nach 3 bis 7 Stunden ein Zusatz-Nährmedium zugeführt.

Das erste Nährmedium enthält als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 1 bis 50 g/kg, bevorzugt von 5 bis 40 g/kg, besonders bevorzugt von 10 bis 30 g/kg. Unter Stärkehydrolysat versteht man erfindungsgemäß das Hydrolysat von Stärke aus Mais, Getreide, Kartoffeln oder Tapioka.

Als Stickstoffquelle im ersten Nährmedium können organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat Kaliumnitrat, Kaliumnatriumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 1 bis 50 g/kg, bevorzugt von 3 bis 40 g/kg, besonders bevorzugt von 5 bis 30 g/kg verwendet werden.

Als Phosphorquelle im ersten Nährmedium können Phosphorsäure, Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natriumhaltigen Salze, Polymere der Phosphorsäure oder das Hexaphosphorsäureester des Inosits auch Phytinsäure genannt in den Konzentrationen von 0,1 bis 5 g/kg, bevorzugt von 0,3 bis 3 g/kg, besonders bevorzugt von 0,5 bis 2,0 g/kg verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Diese Substanzen liegen in den Konzentrationen von 0,0003 bis 15 g/kg vor. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden.

Das Zusatz-Nährmedium, welches in einem Zulaufverfahren (fed batch) angewandt wird, enthält im allgemeinen lediglich als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 300 bis 700 g/kg, bevorzugt von 400 bis 650 g/kg, und gegebenenfalls eine anorganische Stickstoffquelle wie z.B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat. Alternativ können diese und andere Komponenten auch separat zugefüttert werden.

Starkes Wachstum zu Beginn der Kultivierung ist normalerweise eine logarithmische Wachstumsphase. Der logarithmischen Wachstumsphase folgt im Allgemeinen eine Phase von geringerem Zellwachstum als in der logarithmischen Phase.

Erfindungsgemäß wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 10 g/l, maximal 5 g/l, bevorzugt von maximal 3 g/l, besonders bevorzugt maximal 1 g/l eingestellt. Dabei wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle anhand von Methoden bestimmt, die Stand der Technik sind. β-D-Glukose wird z.B. in einem Glukoseanalysator YSI 02700 Select der Firma Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt. Der Begriff Zufütterungsphase bezeichnet dabei die Phase der Fermentation bei der wenigstens eine Kohlenstoffquelle kontinuierlich oder diskontinuierlich dem Medium zugeführt wird. Bei Fermentationen im Zufütterungsverfahren erfolgt dies in der Regel nach vollständigem oder beinahe vollständigem Verbrauch der initial vorgelegten Kohlenstoffquelle.

Nach der Zufütterung der Nährmedien, wird die erfindungsgemäße Fermentation so lange durchgeführt bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle maximal 2 g/l, maximal 1 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.

Erfindungsgemäß beträgt die Ausbeute (Y_P/S) mindestens 43 Gew.-%; mindestens 45 Gew.-%; mindestens 48 Gew.-%; mindestens 50 Gew.-%; mindestens 52 Gew.-% betragen. Dabei ist die Ausbeute Y_P/S definiert als das Verhältnis von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Menge an L-Lysin zu der Gesamtmenge der eingesetzten oder verbrauchten Kohlenstoffquelle.

Erfindungsgemäß wird L-Lysin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) von mindestens 2,5 bis 3,0 g/l pro Std., von mindestens 3,0 bis mehr als 4,0 g/l pro Std., von mindestens 4,0 bis 5,0 g/l pro Std., oder von mindestens 5,0 bis 8,0, g/l oder mehr pro Std. gebildet. Dabei ist die Raum-Zeit-Ausbeute definiert als das Verhältnis von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten L-Lysinmenge zu dem aktiv produzierenden Volumen der Kultur über den gesamten Zeitraum der Kultivierung gesehen. Die Raum-Zeit-Ausbeute wird auch volumetrische Produktivität genannt.

Erfindungsgemäß beträgt die L-Lysin Konzentration (c), bezogen auf Lysin-HCL, in der abgeführten Fermentationsbrühe mindestens 100 g/l, mindestens 110 g/l, mindestens 120 g/l, bevorzugt mehr als 130 g/l, besonders bevorzugt mehr als 140 g/l.

Bei der fermentativen Herstellung von L-Lysin wird versucht, ein Optimum in Abhängigkeit von den drei Leistungsmerkmalen Ausbeute, Produktivität und Produktkonzentration zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Ein solches Optimum kann durch einen Leistungs-Index (LI), der sich aus dem Produkt von Raum-Zeit-Ausbeute (RZA), Ausbeute (Y_P/S) und L-Lysin Konzentration (c) zusammensetzt (LI [g²/(1²·h)J = RZA[g/l·h]·Y_P/S[w/w]·c[g/l]) beschrieben werden. Erfindungsgemäß erreicht der Leistungs-Index, bezogen auf das erfindungsgemäße Verfahren, wenigstens 110 g²/(1²·h), wenigstens 120 g²/(1²·h), wenigstens 130 g²/(1²·h), wenigstens 150 g²/(1²·h), wenigstens 170 g²/(1²·h), wenigstens 190 g²/(1²·h), wenigstens 210 g²/(1²·h), wenigstens 230 g²/(1²·h), wenigstens 250 g²/(1²·h).

Während der Kultivierung wird die Temperatur in einem Bereich von 28°C bis 40°C, vorzugsweise von 30°C bis 35°C, eingestellt. Die Fermentation kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls bei Überdruck, vorzugsweise bei 0 bis 2,5 bar Überdruck, besonders bevorzugt bei 0 bis 1,5 bar durchgeführt werden. Der Sauerstoffpartialdruck wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca. 20%, Luftsättigung geregelt. Die Regelung des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 kann mit Ammoniakgas oder 25%igem Ammoniakwasser erfolgen. Die Bedingungen der Kultivierung können während der Kultivierung konstant bleiben oder verändert werden.

Um dem Anspruch des Leistungs-Index gerecht zu werden, ist während der Fermentation nicht nur ein ausreichender Sauerstoffpartialdruck zu gewährleisten, sondern zudem eine ausreichende biologische Aktivität der Zellen. Zur Gewährleistung der biologischen Aktivität, ist das Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt b) eingestellte Sauerstoff-Aufnahme-Rate (Oxygen Uptake Rate, OUR) maximal 350 mmol/(1·h), maximal 325 mmol/(1·h), maximal 300 mmol/(1·h), maximal 275 mmol/(1·h), maximal 250 mmol/(1·h), maximal 225 mmol/(1·h), maximal 200 mmol/(1·h), maximal 175 mmol/(1·h), maximal 150 mmol/(1·h) beträgt. Die Sauerstoff-Aufnahme-Rate OUR bezeichnet dabei die spezifische Sauerstoffabsorptionsgeschwindigkeit durch die Mikroorganismen in mmol O₂ je Liter Fermentationsbrühe und Stunde (Biotechnologie; D. Schlee und H.-P. Kleber, Gustav Fischer Verlag Jena; 1991).

Die beschriebenen Ströme an ersten Nährmedien und weiteren Nährmedien oder die Summe der Ströme an ersten Nährmedien und weiteren Nährmedien enthalten komplexe Bestandteile. Als komplexe Bestandteile werden Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bezeichnet, die in der eingesetzten Form eine Reinheit von weniger als 95% aufweisen. Bei einem solchen komplexen Bestandteil handelt es sich um eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl. Erfindungsgemäß beträgt der Anteil an komplexen Bestandteilen in den eingesetzten Nährmedien weniger als 10 Gew.-%, weniger als 5 Gew.-%, weniger als 2,5 Gew.-%, weniger als 1,0 Gew.-%, weniger als 0,5 Gew.-%.

Erfindungsgemäß beträgt die Osmolarität der abgeführten L-Lysin haltigen Fermentationsbrühe weniger als 2100 mosm/l, besser weniger 1800 mosm/l, insbesondere weniger 1500 mosm/l, bevorzugt weniger 1200 mosm/l. Als Osmolarität wird die Konzentration osmotisch wirksamer Teilchen in 1 Liter Flüssigvolumen bezeichnet. Zum Beispiel entspricht eine 1 molare Glucoselösung 1000 mosm/l (Biotechnologie; H. Weide, J. Páca und W. A. Knorre; Gustav Fischer Verlag Jena; 1991).

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium geeignet. Bei den coryneformen Bakterien handelt es sich insbesondere um die Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung Corynebacterium sind insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum und weiterhin die Arten Brevibacterium flavum und Corynebacterium thermoaminogenes zu nennen. Diese sind in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Lysin zu produzieren. Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)) und in der US-A-5,250,434.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium efficiens DSM44547
Corynebacterium efficiens DSM44548
Corynebacterium efficiens DSM44549
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, L-Lysin produzierende Stämme.

Die coryneformen Bakterien enthalten mindestens eine Kopie eines lysC-Gens oder Allels, das für eine Aspartatkinase kodiert, die gegenüber der Hemmung von Lysin oder Mischungen von Lysin und Threonin insensitiv sind (lysC^fbr). Derartige Bakterien sind typischerweise resistent gegen das Lysinanalogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein (AEC).

Des weiteren sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die ein oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe lysC-Allel (lysC^fbr), hom-Allel (hom^leaky), zwf-Allel, kodierend für eine NADPH-insensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, und das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Allel. Das pyc Allel ist in EP 1 108 790 beschrieben.

Ebenfalls sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die eine oder mehrere Resistenzen ausgewählt aus der Gruppe Azauracil^r (Aza^r), Rifamycin^r (Rif^r), Streptomycin^r (Strep^r), besitzen.

Weiterhin sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die mindestens folgende Eigenschaften umfassen: zwei (2) Kopien eines lysC-Allels, das für eine Lysin resistente Aspartatkinase kodiert (lysC^fbr), ein hom-Allel, das für eine abgeschwächte Homoserin-Dehydrogenase kodiert (hom^leaky) und zwei (2) Kopien eines zwf-Allels, das für eine NADPH-insensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert.

Des weiteren sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die eine oder mehrere der Eigenschaften ausgewählt aus der Gruppe drei (3), vier (4), oder fünf (5) Kopien eines lysC-Allels (lysC^fbr), zwei (2) Kopien eines lysE-Gens, zwei (2) Kopien eines zwal-Gens, enthalten.

Darüber hinaus sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die sensitiv gegenüber Diaminopimelinsäure-Analoga sind. Unter dem Begriff Diaminopimelinsäure-Analoga werden nach der vorliegenden Erfindung Verbindungen wie 4-Fluoro-Diaminopimelinsäure, 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, 4-Oxo-Diaminopimelinsäure oder 2,4,6-Triaminopimelinsäure zusammengefasst.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitiven coryneformen Bakterien, werden Mutagenesemethoden verwendet. Für die Mutagenese können klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) verwendet werden.

Die coryneformen Bakterien, die sensitiv gegenüber 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sind, können durch Ausplattieren auf 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure haltigen Nährmediumsplatten identifiziert werden. Hierzu eignen sich in besonderem Maße Endkonzentrationen von ca. 5 bis 15 g/l. beispielsweise ca. 10 g/l 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure im Nährmedium. Bei dieser Konzentration können 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive Mutanten von den unveränderten Elternstämmen durch ein verlangsamtes Wachstum unterschieden werden. Nach erfolgter Selektion zeigen die 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive Mutanten eine verbesserte L-Lysinproduktion.

Für das beschriebene Verfahren sind entsprechend stabile Stämme, die ihre Produktionseigenschaften im Laufe des Verfahrens nicht verlieren, besonders geeignet.

Die gezielte Veränderung von Stammeigenschaften coryneformer Bakterien, der Zusammensetzung der Nährmedien und die Art der Prozessführung haben alle zum Ziel, die eingesetzte Kohlenstoffquelle möglichst effektiv in L-Lysin umzuwandeln. Dafür ist es notwendig, dass der Kohlenstoff möglichst ohne verbrauchende Nebenreaktionen und weitestgehend ungehindert durch den Zellstoffwechsel in Richtung L-Lysin Synthese fließt.

Die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe aus dem erfindungsgemäßen Verfahren besitzt einen Feststoffgehalt von mindestens 10 Gew.-%, mindestens 12,5 Gew.-%, mindestens 15 Gew.-%, mindestens 17,5 Gew.-%.

Das produzierte L-Lysin kann anschließend aus der Fermentationsbrühe gereinigt werden. Zur Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung oder eine Kombination hieraus eingesetzt. Die L-Lysin haltige Brühe wird anschließend mit bekannten Methoden wie beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, Ionenausschlusschromatographie, Extraktion, Kristallisation, Fällung oder einer Kombination hieraus auf gereinigt.

Alternativ hierzu kann die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe auch entwässert werden. Hierzu wird Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert. Das Wasser wird hierbei zu 10% bis 90% entfernt.

Zur verbesserten Konservierung des L-Lysin haltigen Flüssigprodukts kann durch Zugabe von Säure oder Lauge der pH-Wert in den sauren (pH 2 bis 5) oder alkalischen (pH 9 bis 12) Bereich verändert werden.

Es ist ebenfalls möglich, aus der Fermentationsbrühe ein Produkt herzustellen, indem man die in der Kulturbrühe enthaltene Biomasse des Bakteriums vollständig (1000 oder nahezu vollständig d.h. mehr als oder größer als (>) 90%, > 95%, > 97%, > 99% entfernt und die übrigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend d.h. zu 30%–100%, 40%–100%, 50%–100%, 60%–100%, 70%–100%, 80%–100%, oder 90% – 100, bevorzugt größer gleich (≥) 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% oder ≥ 95% oder auch vollständig (100%) im Produkt belässt.

Zur Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung oder eine Kombination hieraus eingesetzt.

Die erhaltene Brühe wird anschließend mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert. Das Wasser wird hierbei zu 10% bis 90% entfernt.

Weiterhin kann aufkonzentrierte Brühe anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen Pulver aufgearbeitet werden. Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Das Wasser wird hierbei dann zu insgesamt mehr als 90% entfernt, sodass der Wassergehalt im Produkt kleiner als 10%, kleiner als 5% beträgt.

Die angegebenen Verfahrensschritte müssen nicht notwendigerweise in der hier aufgeführten Reihenfolge durchgeführt sondern können gegebenenfalls in technisch sinnvoller Weise kombiniert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber dem üblichen fed batch-Verfahren, vor allem durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute aus.

Vorzugsweise wird aus der Fermentationsbrühe durch Entfernen von Wasser ein L-Lysin enthaltenes Produkt folgender Zusammensetzung gewonnen:

Lysin	35–80 Gew.-%
Protein	max. 7 Gew.-%
Karbonsäuren	max. 7 Gew.-%
Gesamtzucker	max. 9 Gew.-%
Fette und Öle	max. 5 Gew.-%
Mineralstoffe	3–30 Gew.-%

Erfindungsgemäß hat dieses L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung einen Wassergehalt von mindestens 0,5 Gew.-%, jedoch höchstens 5,0 Gew.-%.

Weiterhin sollte zur Herstellung des Lysin enthaltenden Produkts die Fermentationsbrühe folgende Nebenproduktkonzentrationen einhalten. Eine Trehalose Konzentration von kleiner gleich (≤) 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine L-Alanin Konzentration von ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,5 g/l, ≤ 1,0 g/l, ≤ 0,25 g/l. Eine L-Valin Konzentration von ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,5 g/l, ≤ 1,0 g/l, ≤ 0,25 g/l. Eine L-Glutamat Konzentration von ≤ 7,5 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Ethanol Konzentration von ≤ 8,0 g/l, ≤ 4,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Laktat Konzentration von ≤ 8,0 g/l, ≤ 4,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Ketoglutarat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Succinat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Malat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Oxalacetat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Acetat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Pyruvat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l.

Erfindungsgemäß wird für die Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Produkts bevorzugt, dass die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von maximal 5,0%, bevorzugt maximal 4,0%, 3,0%, 2,5%, 2,0%, besonders bevorzugt maximal 1,5%, 1,0% oder 0,5% besitzt. Es ist besonders wünschenswert, dass die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von kleiner als 0,5% besitzt.

Erfindungsgemäß besitzt das L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung und anschließender Granulation eine mittlere Partikelgröße von > 0,1 bis 1,0 mm, bevorzugt in einer Menge von mehr als 97%, insbesondere mehr als 98%.

Weiterhin besitzt das L-Lysin enthaltende Produkt nach Entwässerung und Granulation eine Schüttgutdichte von mindestens 600 kg/m³, bevorzugt 650 kg/m³, insbesondere 700 kg/m³, bevorzugt jedoch größer als 750 kg/m³.

Wie in US Patent Application Serial No. 10/319,843 beschrieben, kann dem L-Lysin enthaltenden Produkt nach Entwässerung und Granulation ein Additiv zugesetzt werden, um die Eigenschaften des Produktes zu verbessern. Der Anteil an zugesetztem Additiv, insbesondere Öl, sollte dabei 0,02 – 2,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des L-Lysin enthaltenen Produktes, an der Oberfläche betragen.

Erfindungsgemäß enthält das L-Lysin enthaltende Produkt als Additiv eines oder mehrere der Öle, ausgewählt aus der Gruppe Mineralöl, pflanzliche Öle, Sojaöl, Olivenöl, Soja/Lecithin-Gemische, Speiseöle, Mischungen pflanzlicher Öle an der Oberfläche.

Empfehlenswert ist in jedem Fall, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung und Granulation einen Laktatanteil von ≤ 3 Gew.-%, ≤ 2 Gew.-%, ≤ 1 Gew.-%, ≤ 0,5 Gew.-%, ≤ 0,1 Gew.-% besitzt.

Die Analyse von L-Lysin und anderen Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben.

Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Lysin haltigen Produktes unter Verwendung von L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert, wobei b) eine Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 10 g/l eingestellt wird, und c) coryneforme Bakterien einsetzt werden, die mindestens einen oder mehrere Kohlenstoffflüsse aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe von (i) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken; (ii) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase-Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens jedoch 20% lenken; (iii) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens jedoch 60% lenken; (iv) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98% lenken; (v) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19% lenken; (vi) coryneformen Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6 einzustellen; und (vii) coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7 einzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt (c) coryneforme Bakterien einsetzt, die mindestens den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt (c) coryneforme Bakterien einsetzt, die zusätzlich mindestens einen Stofffluss ausgewählt aus der Gruppe (ii) bis (vii) lenkt.
Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Lysin haltigen Produktes unter Verwendung von L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert, wobei b) eine Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 10 g/l eingestellt wird, und c) coryneforme Bakterien einsetzt werden, die mindestens zwei Kohlenstoffflüsse, ausgewählt aus der Gruppe von (i) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken; (ii) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase-Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens jedoch 20% lenken; (iii) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens jedoch 60% lenken; (iv) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98% lenken; (v) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19% lenken; (vi) coryneformen Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6 einzustellen; und (vii) coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose- Phosphat-Weg [%]/Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7.
Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Lysin haltigen Produktes unter Verwendung von L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium inokuliert und kultiviert, wobei b) eine Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der zufütterungsphase von maximal 10 g/l eingestellt wird, und c) coryneforme Bakterien einsetzt werden, die mindestens drei oder mehr Kohlenstoffflüsse, ausgewählt aus der Gruppe von (i) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 75% lenken; (ii) coryneformen Bakterien die den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase-Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens jedoch 20% lenken; (iii) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens jedoch 60% lenken; (iv) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98% lenken; (v) coryneforme Bakterien die den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19% lenken; (vi) coryneformen Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6 einzustellen; und (vii) coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7.
verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten coryneformen Bakterien alle Kohlenstoffflüsse (i) bis (vii) lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierungsschritt (a) nach dem Satzverfahren (batch) durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierungsschritt (a) nach dem Zulaufverfahren (fed batch) durchgeführt wird, wobei mindestens ein Zusatz-Nährmedium eingesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 105% zu lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit einem prozentualen Anteil von mehr als 125% zu lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 4, oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase, kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit einem prozentualen Anteil von mehr als 19%, mehr als 23%, mehr als 26%, mehr als 28%, mehr als 30%, mehr als 33%, mehr als 35%, oder mehr als 37% zu lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 2% höchstens jedoch 18% lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus, bezogen auf die Acetyl-Reste, die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase Reaktion übertragen werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 3% höchstens jedoch 16% lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 30% höchstens jedoch 57% lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 32% höchstens jedoch 53% lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase, kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 49% höchstens jedoch 98%, mindestens 53% höchstens jedoch 95%, mindestens 56% höchstens jedoch 91%, oder mindestens 58% höchstens jedoch 87% zu lenken.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose- Phosphat-Weg [%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens 3,4 höchstens jedoch 4,6, mindestens 3,5 höchstens jedoch 4,5, mindestens 3,6 höchstens jedoch 4,4, oder mindestens 3,7 höchstens jedoch 4,3 einzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneforme Bakterien die die Fähigkeit besitzen, ein Verhältnis des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg [%]/Tricarbonsäurezyklus [%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7 höchstens jedoch 150, mindestens 10 höchstens jedoch 125, mindestens 13 höchstens jedoch 100, oder mindestens 16 höchstens jedoch 75 einzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kohlenstoffquelle um eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose, Glukose, Stärkehydrolysat, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Stickstoffquelle um eine oder mehrere organische, Stickstoff-haltige Stoffe oder Stoffgemische ausgewählt aus der Gruppe Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff und/oder um eine oder mehrere der anorganischen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe Ammoniak, Ammonium-haltige Salze und Salze der Salpetersäure handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei Ammonium-haltigen Salzen und Salzen der Salpetersäure um Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat und Kaliumnatriumnitrat handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Phosphorquelle um Phosphorsäure oder deren Polymere oder der Phytinsäure oder Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure handelt.
verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Alkalisalzen der Phosphorsäure um Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 10 g/l, 5 g/l oder 3 g/l eingestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung in der Zufütterungsphase von maximal 3 g/l eingestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass, nach der Zufütterung der Nährmedien, die Fermentation so lange durchgeführt wird bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle maximal 2 g/l, maximal 1 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute mindestens 43 Gew.-%, bezogen auf den eingesetzten Zucker beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute mindestens 52 Gew.-%, bezogen auf den eingesetzten Zucker beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Raum-Zeit-Ausbeute mindestens 2,5 g/(l·h) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Raum-Zeit-Ausbeute mindestens 4,0 g/(l·h) bis 5,0 g/(l·h) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Lysin-HCl in der abgeführten Fermentationsbrühe ≥ 100 g/l, ≥ 110 g/l, ≥ 120 g/l, ≥ 130 g/l, oder ≥ 140 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung des L-Lysin, bezogen auf Lysin-HCl, mit einem Leistungs-Index (LI) von wenigstens 110 g²/(1²·h) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung des L-Lysin, bezogen auf Lysin-HCl, mit einem Leistungs-Index (LI) von wenigstens 130 g²/(1²·h) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) eingesetzten Nährmedien komplexe Bestandteile aus der Gruppe Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl beinhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an komplexen Bestandteilen in den eingesetzten Nährmedien weniger als 5 Gew.-% beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeführte L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Osmolarität von maximal 2100 mosm/l, maximal 1800 mosm/l, maximal 1500 mosm/l, oder maximal 1200 mosm/l besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den coryneformen Bakterien um die Gattung Corynebacterium handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe mit 0%–100% der in der Fermentation gebildeten Biomasse nach einer 10%–90% Entwässerung als Flüssigprodukt hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das coryneforme Bakterium mindestens ein lysC-Gen oder Allel enthält, das für eine Aspartatkinase kodiert, die gegenüber der Hemmung durch Lysin oder Mischungen von Lysin und Threonin insensitiv ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin produzierende coryneforme Bakterium eines oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe lysC-Allel (lysC^fbr), hom-Allel (hom^leaky), zwf-Allel, kodierend für eine NADPHinsensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, und pyc-Allel, kodierend für eine Pyruvat-Carboxylase besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin produzierende coryneforme Bakterium eine oder mehrere Resistenzen ausgewählt aus der Gruppe Azauracil^r (Aza^r), Rifamycin^r (Rif^r), Streptomycin^r (Strep^r), besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin produzierende coryneforme Bakterium mindestens folgende Eigenschaften umfasst: zwei (2) Kopien eines lysC- Allels (lysC^fbr), ein hom-Allel (hom^leaky) und zwei (2) Kopien eines zwf-Allels, das für eine NADPHinsensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin produzierende coryneforme Bakterium eine oder mehrere der Eigenschaften ausgewählt aus der Gruppe drei (3), vier (4), oder fünf (5) Kopien eines lysC-Allels (lysC^fbr), zwei (2) Kopien eines lysE-Gens, zwei (2) Kopien eines zwal-Gens, besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin produzierende coryneforme Bakterium sensitiv gegenüber Diaminopimelinsäure-Analoga ausgewählt aus der Gruppe 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, 4-Fluoro-Diaminopimelinsäure, 4-Oxo-Diaminopimelinsäure und 2,4,6-Triaminopimelinsäure, bevorzugt 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Fermentationsbrühe enthaltene L-Lysin aufgereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe einen Feststoffgehalt von mindestens 10 Gew.-%, mindestens 12,5 Gew.-%, mindestens 15 Gew.-%, oder mindestens 17,5 Gew.-% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe durch das Entfernen von Wasser aufkonzentriert wird und ein L-Lysin haltiges Produkt, bestehend aus Lysin 35–80 Gew.-% Protein max. 7 Gew.-% Karbonsäuren max. 7 Gew.-%

Gesamtzucker max. 9 Gew.-% Fette und Öle max. 5 Gew.-% Mineralstoffe 3–30 Gew.-%

gewonnen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung einen Wassergehalt von mindestens 0,5, jedoch höchstens 5,0 Gew.-% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Trehalose in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Laktat in der Fermentationsbrühe maximal 8,0 g/l, maximal 4,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Ethanol in der Fermentationsbrühe maximal 8,0 g/l, maximal 4,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes L-Alanin in der Fermentationsbrühe maximal 5,0 g/l, maximal 2,5 g/l, maximal 1,0 g/l, oder maximal 0,25 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes L-Valin in der Fermentationsbrühe maximal 5,0 g/l, maximal 2,5 g/l, maximal 1,0 g/l, oder maximal 0,25 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes L-Glutamat in der Fermentationsbrühe maximal 7,5 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Ketoglutarat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Succinat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Malat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Oxalacetat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Acetat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Nebenproduktes Pyruvat in der Fermentationsbrühe maximal 10 g/l, maximal 5,0 g/l, maximal 2,0 g/l, oder maximal 0,5 g/l beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 32 oder 41, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeführte L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von maximal 2,5% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 32 oder 41, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeführte L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von maximal 1,0% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 32 oder 41, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeführte L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von maximal 0,5% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach Entwässerung und Granulation eine mittlere Partikelgröße von mindestens 0,1 bis 1,0 mm, mindestens 97%, oder mindestens 98% aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt einen Laktatanteil von maximal 3 Gew.-%, maximal 2 Gew.-%, maximal 1 Gew.-%, maximal 0,5 Gew.-%, oder maximal 0,1 Gew.-% besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach Entwässerung und Granulation eine Schüttgutdichte von mindestens 600 kg/m³, mindestens 650 kg/m³, mindestens 700 kg/m³, oder mindestens 750 kg/m³ besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach Entwässerung und Granulation einen Anteil an zugesetztem Additiv, insbesondere Öl in Höhe von 0,02–2 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des L-Lysin enthaltenen Produktes an der Oberfläche enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin enthaltende Produkt als Additiv eines oder mehrere der Öle, ausgewählt aus der Gruppe: Mineralöl, pflanzliche Öle, Sojaöl, Olivenöl, Soja/Lecithin-Gemische, Speiseöle, Mischungen pflanzlicher Öle an der Oberfläche enthält.