-
GEGENSTAND DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft ein Apheresematerial bzw. Adsorbent sowie ein
Verfahren für
die Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender
Faktor, macrophage migration inhibitory factor) aus Blut, Blutplasma,
Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten,
insbesondere aus solchen Körperflüssigkeiten
eines Patienten mit Sepsis oder septischem Schock. Die Erfindung
betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen Apheresematerials
bzw. Adsorbents zur Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung
von MIF aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Zytokine
-
Zytokine
sind von verschiedenen Zellen gebildete Proteine, die das Verhalten
anderer Zellen beeinflussen. Viele Zytokine üben ihre Wirkung meist über spezifische
Rezeptoren auf ihre Zielzellen aus, wodurch häufig Wachstum, Differenzierung
oder der Tod der Zelle ausgelöst
wird.
-
Zytokine
spielen vor allem bei der Entzündungsreaktion
und deren Regulation eine wichtige Rolle, wobei sie zusammen mit
anderen Entzündungsmediatoren
Auswirkungen auf die Blutgefäße haben.
Durch sie findet eine Erweiterung und eine erhöhte Durchlässigkeit der Blutgefäße statt,
was zu einem erhöhten
Blutfluss und zu einem Austreten von Flüssigkeit im Bereich des Infektionsherdes
führt.
-
Eine
weitere Funktion der Zytokine bei einer Entzündungsreaktion ist die Erhöhung der
Expression von Adhäsionsmolekülen des
Gefäßwandendothels,
wodurch Immunzellen rekrutiert werden und zum Infektionsherd wandern
können.
Gleichzeitig bewirken Zytokine die Aktivierung der Immunzellen.
Somit sind Zytokine vor allem Mediatoren des Immunsystems, die verschiedene
Funktionen erfüllen
und dadurch Entzündungsreaktionen
regulieren.
-
Ein
Zytokin kann von verschiedenen Zelltypen gebildet werden und auch
auf verschiedene Zelltypen einwirken. Meist werden Zytokine als
Antwort auf inflammatorische oder antigene Stimuli synthetisiert
und wirken in den häufigsten
Fällen
lokal (autokrin oder parakrin). Manche Zytokine wirken auch endokrin, ähnlich wie Hormone.
Im Unterschied zu den Hormonen werden sie jedoch von verschiedenen
Zelltypen produziert.
-
Zytokine
sind Polypeptide oder Glykoproteine mit einem Molekulargewicht ≤ 30 kDa und
können
anhand ihrer Struktur in verschiedene Unterfamilien klassifiziert
werden, wie zum Beispiel die Hämatopoetine,
die Interferone und die TNF-Familie.
-
Da
Zytokine für
die Regulation von Immunreaktionen eine wichtige Rolle spielen,
sind sie auch häufig an
Krankheiten beteiligt, wie zum Beispiel septischem Schock und Sepsis,
Autoimmunerkrankungen und rheumatoider Arthritis. Sie sind die Mediatoren
bei Entzündungsreaktionen
und auch bei einer Sepsis. Sie werden z.B. als Reaktion auf einen
eingedrungenen Mikroorganismus gebildet und lösen die Entzündungsreaktion durch
Bildung von weiteren Mediatoren, freien Radikalen, Eikosanoiden
usw. aus. Durch diese Reaktionskaskade wird das Immunsystem aktiviert.
Vor allem TNF, IL-1 und MIF spielen als Zytokine eine wichtige Rolle
bei der Sepsis. Es wird vermutet, dass MIF einen Hauptmediator der
Sepsis darstellt, da Therapieansätze,
wie die Gabe von Anti-TNF-Antikörpern
oder Antagonisten des IL-1-Rezeptors, keine positiven Ergebnisse
bei Sepsiserkrankten lieferten.
-
Makrophagen-migrationsinhibierender
Faktor (MIF)
-
Das
Zytokin Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor (Macrophage migration
inhibitory factor, MIF) wurde 1966 von Bloom & Bennett und David unabhängig voneinander
entdeckt und als T-Zellprodukt beschrieben, das die Migration von
Makrophagen inhibiert. Später
konnten weitere Eigenschaften und Wirkungen für MIF festgestellt werden,
wie z.B. die Stimulation der Aktivität von Makrophagen und die Steuerung
der Immunantwort, welche weit über
die Funktion eines T-Zell-Zytokins hinausreicht.
-
Die
Klonierung von humanem MIF (huMIF) gelang erstmals 1989 und öffnete damit
neue Möglichkeiten
zur Charakterisierung dieses Zytokins. Aber erst nach der Herstellung
des rekombinanten humanen MIF (rhuMIF) konnte auch die migrationshemmende
Wirkung auf Makrophagen und die Induktion der TNF-Sekretion eindeutig
nachgewiesen werden.
-
MIF
ist ein ubiquitäres
Protein, welches in fast allen Zellen gefunden wird. Es ist ein
Regulator des angeborenen Immunsystems und der Immunantwort und
wird unter verschiedensten Bedingungen freigesetzt. Bei der Regulation
anderer Zytokine spielt es ebenso eine Rolle, wie bei der Expression
von Rezeptoren (z. B. TLR-4), welche in das angeborene Immunsystem
involviert sind. Weitere Funktionen sind die Inhibition von p53
und die Aktivierung von Bestandteilen der mitogen-aktivierten Protein-Kinase
(MAP-Kinase) und von Jun-activation domain-binding protein-1 (JAB-1)
Stoffwechselwegen.
-
MIF
besitzt eine zentrale Funktion in der inflammatorischen Kaskade,
wird aber auch von Zellen außerhalb
des Immunsystems gebildet, wie z.B. von Zellen des Endokrinen und
des Nervensystems. Außerdem wird
es von Zellen gebildet, welche mit geringen Dosen an Glucocorticoiden
stimuliert wurden. Üblicherweise inhibieren
Glucocorticoide die Expression von Zytokinen. Offenbar wirken MIF
und Glucocorticoide gegenseitig als Antagonisten und regulieren
so die Immunantwort. MIF ist dabei für die Aktivierung der Immunsysteme
verantwortlich und erhöht
unter anderem die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen
wie TNF, IL-1, IL-6 und IL-8 ebenso wie die Proliferation von T-Zellen.
-
In
den letzten Jahren wurde MIF mit vielen inflammatorischen Erkrankungen
in Verbindung gebracht, wie z.B. Arthritis, Sepsis, Anämie, Encephalomyelitis,
Tumorwachstum usw.. Deshalb wurde MIF immer häufiger als ein interessanter
Therapieansatz bei inflammatorischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen angesehen.
Seine katalytische Aktivität
bietet dabei einen wichtigen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer MIF-Inhibitoren.
Es wird vermutet, dass die biologische Aktivität von MIF auf seinen enzymatischen
Reaktionen beruht, jedoch ist der Zusammenhang zwischen den enzymatischen
und den biologischen Aktivitäten
von MIF noch nicht aufgeklärt.
-
Struktur von MIF
-
Das
huMIF-Gen, ein relativ kleines Gen (<1000 bp), besteht aus drei Exons, die
durch zwei kleine Introns (100-200 bp) voneinander getrennt sind.
Bisher konnte ein mRNA-Transkript von 600 bp aus verschiedenen Geweben
isoliert werden. Zu den Konsensussequenzen, die möglicherweise
an der Transkriptionsregulation des MIF-Gens beteiligt sind, gehören unter
anderem eine Cytokin-1 (CK-1) Stelle und eine Nuklear Faktor-κB (NF-κB) Stelle,
möglicherweise
auch ein negative glucocorticoid responsive element (nGRE), welches
im Mausgen gefunden, bisher aber im humanen MIF (huMIF) noch nicht
nachgewiesen wurde. Diese Elemente spiegeln sowohl die Zytokinaktivität, als auch
Hormon- und Glucocorticoid-antagonistische Funktionen wieder.
-
Das
huMIF-Monomer umfasst 114 Aminosäuren
und hat ein Molekulargewicht von 12,5 kDa. Obwohl potentielle N-Glykosilierungsstellen
vorhanden sind, findet keine N-Glykosilierung statt. MIF wird außerdem spezifisch
sezerniert, obwohl eine hydrophobe N-terminale Signalsequenz nicht
vorhanden ist.
-
Das
huMIF-Monomer besteht aus zwei α-Helices
und sechs oder sieben β-Strängen. Dabei
bilden vier β-Stränge ein
zentrales Faltblatt, in dem zwei parallele β-Faltblätter antiparallel miteinander
verknüpft
sind.
-
Aminosäuresequenz
von humanem MIF mit Sekundärstrukturelementen. (Pfeile
stehen für β-Faltblattbereiche,
Zylinder für α-helikale
Bereiche)
-
Röntgenstrukturanalysen
zeigen, dass es sich bei huMIF um ein Homotrimer mit einer Größe von ca. 35×50×50 Å handelt,
wobei drei β-Faltblattbereiche
eine Kanalstruktur ausbilden, welche von sechs α-Helices flankiert wird. Diese
Struktur ist unter allen Mitgliedern der Zytokinfamilie einzigartig.
Allerdings gibt es auch Hinweise auf eine Dimerstruktur von huMIF.
Einige Studien weisen darauf hin, dass unter physiologischen Bedingungen
ein Gemisch aus Monomeren, Dimeren und Trimeren vorliegt. Welche
dabei die biologische aktive Struktur ist, konnte noch nicht geklärt werden.
-
Wirkung und Funktion von
MIF
-
Die
Inhibition der Makrophagenmigration durch MIF wurde bereits sehr
früh beschrieben.
In den vergangenen Jahren wurden weitere durch MIF verursachte Effekte
nachgewiesen. MIF wird nicht nur von Makrophagen, sondern auch von
T-Zellen und Hypophysenzellen ausgeschüttet und ist somit ein Zytokin
der Makrophagen und T-Zellen, ebenso wie ein Hypophysenhormon. Dabei
unterscheiden sich die beiden MIF-Quellen vor allem im Zeitpunkt
der MIF-Sekretion und in ihren Dosis-Wirkungskurven.
-
Eine
weitere wichtige Rolle spielt MIF bei der Regulation der Immunantwort
im Zusammenspiel mit Glucocorticoiden. Diese sind potente anti-inflammatorische
und immunsupressiv wirkende Hormone und unterdrücken normalerweise die Zytokinproduktion.
Die MIF-Produktion wird dagegen durch geringe Dosen an Glucocorticoiden
stimuliert, und MIF besitzt sogar Glucocorticoid-überschreibende
Wirkung und verringert deren Inhibitionswirkung (glucocorticoid
overriding activity). Eine effektive Immunantwort nach einer Infektion
basiert offensichtlich auf einer genau geregelten Balance zwischen
anti-inflammatorischen Glucocorticoiden und proinflammatorischen
Zytokinen (MIF).
-
MIF
ist bei verschiedenen Entzündungsreaktionen
ein wichtiger Mediator, zum Beispiel beim septischen Schock bzw.
der Sepsis, ebenso wie bei Rheumatoider Arthritis, bei der Makrophagen
zur Pathogenese der Krankheit beitragen.
-
Neben
den Immunzellen und den Zellen der Hypophyse wird MIF auch von anderen
Gewebszellen produziert, wie zum Beispiel in den β-Zellen des
Pankreas. Offensichtlich spielt MIF eine Rolle als autokriner Regulator
der Insulinsekretion und könnte
am Kohlehydratmetabolismus beteiligt sein.
-
Die
Aufklärung
der molekularen Wirkungsmechanismen war bisher nicht möglich, vor
allem da bisher kein Membranrezeptor für MIF identifiziert werden
konnte. Mittels Röntgenstrukturanalyse
konnten Homologien zu zwei bakteriellen Isomerasen festgestellt
werden: CHMI (5-Carboxymethyl-2-Hydroxy-muconat-Isomerase)
und 4-OT (4-Oxalcrotonat-Tautomerase). Eine Tautomerase-Aktivität konnte
für die
nicht-physiologischen Substrate D-Dopachrom und p-Hydroxyphenylpyruvat
nachgewiesen werden. Diese enzymatischen Bindestellen sind vor allem
bei der Entwicklung von MIF-Inhibitoren ins Interesse der Forschung
gerückt.
Sie sind vor allem interessant bei der Entwicklung neuer Therapieansätze bei
inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Sepsis. MIF scheint auch
eine Rolle bei zellulären
Redoxprozessen zu spielen.
-
Sepsis und
septischer Schock
-
Sepsis,
septischer Schock und SIRS (systemic inflammatory response syndrome)
sind in der Intensivmedizin der westlichen Länder Hauptursache für Todesfälle mit
Todesraten zwischen 30 und 70%. In den USA erkranken >500 000 Patienten pro
Jahr an Sepsis mit einer ansteigenden Rate von 1,5% pro Jahr.
-
Problematisch
bei der Behandlung von Sepsispatienten ist die genaue Definition
der verschiedenen Sepsisstadien. Man unterscheidet dabei:
a)
SIRS | systemic
inflammatory response syndrome
Temperatur >38.3°C
oder <36°C
erhöhte Herzfrequenz
erhöhte Atmungsrate
erhöhte Anzahl
an weißen
Blutkörperchen
keine
Mikroorganismen im Blut |
b)
Sepsis | systemische
Reaktion auf eine Infektion, welche sich durch zwei oder mehr Merkmale
der SIRS zeigt (SIRS + mikrobielle Infektion) |
c)
schwere Sepsis | Sepsis,
welche zu Organstörungen,
Hypoperfusion oder zu Hypotonie führen kann |
d)
septischer Schock | Sepsis-induzierte
Hypotonie |
e)
MODS | multiple
organ dysfunction syndrome
stark veränderte Organfunktionen |
-
Das
Spektrum der Mikroorganismen, welche eine Sepsis auslösen können, hat
sich seit den 70er Jahren stark verändert. Zunächst waren vor allem Gram-negative
Bakterien für
eine Sepsis verantwortlich, jedoch heute treten immer mehr Sepsisfälle durch
Gram-positive Bakterien auf. Eine systemische Entzündungsreaktion,
eine Sepsis, kann aber auch durch nicht-infektiöse Störungen ausgelöst werden,
wie zum Beispiel durch ein Trauma, eine Pankreatitis oder durch
abdominale bzw. kardiovaskuläre
Chirurgie. Vermutlich wird eine Sepsis durch eine Überreaktion
des Immunsystems ausgelöst.
Bei einem Eindringen von Mirkoorganismen reagiert das angeborene
Immunsystem als erstes, wobei Neutrophile, Makrophagen und natürliche Killerzellen eingesetzt
werden. Dabei spielen vor allem Zytokine eine wichtige Rolle als
Mediatoren, die die Aktivierung und Differenzierung regulieren. Über sie
und andere stimulierende Moleküle
aktiviert das angeborene Immunsystem schließlich das adaptive Immunsystem,
welches die Fähigkeit
hat, ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen.
-
Beim
septischen Schock reagiert das angeborene Immunsystem unangemessen
stark, wodurch eine systemische Entzündungsreaktion auftreten kann,
die schließlich
zu Organschädigungen
führt.
-
MIF und Sepsis 1 septischer
Schock
-
Pro-inflammatorische
Zytokine, wie zum Beispiel TNF, IL-1 und MIF spielen eine wichtige
Rolle bei der Entwicklung einer Sepsis. Es sind Mediatoren, welche
die Entzündungsreaktion
aktivieren und die Expression weiterer Mediatoren bzw. die Proliferation
inflammatorischer Zellen anregen. Sie wirken gegenüber Glucocorticoiden,
welche die Entzündungsreaktion
hemmen, antagonistisch und verstärken
somit die Entzündungsreaktion.
Aus diesem Grund erscheint die Inhibition dieser pro-inflammatorischer
Zytokine als Therapieansatz bei inflammatorischen Erkrankungen und
Autoimmunerkrankungen interessant.
-
MIF
wird als ein Hauptmediator der Sepsis angesehen, da durch MIF die
Produktion von TNF, weiteren pro-inflammatorischen Zytokinen und
Eikosanoiden angeregt, die Expression von TLR-4, welcher LPS erkennt, induziert und
die angeborene Immunantwort aktiviert wird. MIF und Glucocorticoide
wirken als Antagonisten und sind für die Regulation der Entzündungsreaktion
verantwortlich. MIF hat eine hemmende Wirkung auf Glucocorticoide,
die entzündungshemmend
wirken.
-
Vermutete
Mechanismen durch MIF bei einer Sepsis. (Entnommen
aus Riedemann et al., 2003 (Nature Medicine. 9; 517-524))
-
Im
Falle einer Sepsis ist die MIF-Konzentration im Serum von Patienten
deutlich erhöht,
wodurch die pro-inflammatorische Reaktion verstärkt wird und sich die Prognose
deutlich verschlechtert. Mäuse,
denen das MIF-Gen fehlt, zeigten dagegen einen Schutz vor letaler
Endotoxämie
und bildeten eine Sepsis erst nach Verabreichung von MIF aus.
-
Therapiestrategien bei
Sepsis
-
Pro-inflammatorische
Zytokine sind eine interessante Zielstruktur für Therapiestrategien bei Sepsis, da
sie deren Entstehung und Fortlauf auslösen und beeinflussen. Bisherige
Therapieansätze
gegen TNF und IL-1 scheiterten beim Menschen, trotz Erfolgen im
Tierversuch. Dies lässt
sich darauf zurückführen, dass
Therapeutika (Antikörper
gegen das entsprechende Zytokin) im Tierversuch kurz nach der Injektion
von LPS, einem Auslöser
der bakteriellen Sepsis, verabreicht wurden. Ein Sepsispatient war
dagegen im Krankheitsverlauf schon weiter fortgeschritten, bevor
eine eindeutige Diagnose gestellt werden konnte und mit der Therapie begonnen
wurde. Weitere multifaktoriellen Gründe und Nebenwirkungen waren
zudem beteiligt am negativen Ausgang dieser Studien.
-
MIF
wird als ein Hauptmediator der Sepsis angesehen und hat in ersten
Tierversuchen vielversprechende Ergebnisse geliefert. Es konnte
nachgewiesen werden, dass Mäuse
mit defektem oder fehlendem MIF-Gen, eine deutlich höhere Überlebensrate
nach LPS-Injektionen aufweisen. Wurde zusätzlich MIF injiziert, erhöhte sich
die Sterberate dieser Mäuse.
Eine deutliche Verbesserung der Überlebensrate
von Mäusen nach
einer LPS-Injektion zeigten weitere Versuche mit Anti-MIF-Antikörper. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit monoklonalen MIF-Antikörpern erzielt, sowie auch in
Tierversuchen mit lebenden Bakterien (CLP-Modell).
-
Verschiedene
diskutierte Therapieansätze
gegen Sepsis umfassen die Inhibition oder Blockierung von MIF durch
Einsatz spezifischer Anti-MIF-Antikörper. Ein anderer Ansatz ist
der Einsatz von small molecular weight (SMW)-Inhibitoren, welche
z.B. so entwickelt werden, dass sie MIF über die enzymatische Bindestelle inhibieren.
Die Blockade der MIF-Sekretion wäre
ebenfalls ein Therapieansatz. Denkbar wären auch Strategien, die an
der Wechselwirkung von MIF mit seinen derzeit bekannten Bindungsproteinen
JAB1/CSN5, CD74/li, MHC II und BNPL ansetzen. Hier könnten Domänen oder
Bindungsmotive dieser Bindungspartner als MIF-neutralisierende Agenzien
Einsatz finden.
-
AUFGABE DER
ERFINDUNG
-
Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Mittel
und ein neues Verfahren bereitzustellen, die geeignet sind, die
Aktivität
oder Menge des Mediators für
Sepsis und septischen Schock, MIF, in einer Körperflüssigkeit eines Patienten auf
eine für
einen Patienten schonendere und verträglichere Weise zu verringern
als dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.
-
BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
erfindungsgemäße Aufgabe
wird gelöst
durch ein Apheresematerial bzw. Adsorbent für die Entfernung, Abreicherung
oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender
Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten,
welches ein festes Trägermaterial
umfasst und wobei auf der Oberfläche
des festen Trägermaterials
MIF-bindende Moleküle
oder funktionale Gruppen immobilisiert sind.
-
Das
erfindungsgemäße Apheresematerial
bzw. Adsorbent ist besonders geeignet für die extrakorporale Dialyse
von Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, um eine überhöhte MIF-Konzentration
oder -Aktivität
darin zu erniedrigen und sie wieder in physiologische Bereiche zu
bringen. Hierbei nimmt man an, das Verringerungsfaktoren von etwa
5 bis max. 100-fach erzielt werden müssen. Bei der Apherese wird
Blut eines Patienten, z. B. eines Patienten mit Sepsis oder septischem
Schock, außerhalb
des Körpers
entweder als Vollblut oder z. B. nach einer Abtrennung der Blutzellen
als Blutplasma über
das erfindungsgemäße Apheresematerial
bzw. Adsorbent geleitet. Da das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent
MIF-bindende Moleküle
oder funktionale Gruppen auf der Oberfläche immobilisiert aufweist,
bindet MIF an diese Moleküle
oder funktionalen Gruppen und wird dem Blut- oder Plasmastrom entzogen
oder in eine inaktive Form überführt. Anschließend kann
das bezüglich
MIF abgereicherte oder inaktivierte Blut oder Plasma, gegebenenfalls
nach weiterer Behandlung, dem Patienten wieder zugeführt werden.
Aufgrund der verminderten MIF-Konzentration bzw. -Aktivität wird dessen
inflammatorische Wirkung im Körper
des Patienten abnehmen und sich das Krankheitsbild bessern.
-
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Apheresematerials
bzw. Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder
funktionalen Gruppen über
einen Abstandshalterrest (Spacer) oder auf das Trägermaterial
gepfropfte Polymerketten, mit dem Trägermaterial verbunden.
-
Es
hat sich gezeigt, dass die Bindungsstärke MIF-bindender Moleküle oder
funktionaler Gruppen dadurch erheblich verbessert werden konnte,
dass diese nicht unmittelbar auf der Oberfläche des Trägermaterials gebunden bzw.
immobilisiert sind, sondern über
einen Abstandshalterrest (Spacer) oder über auf das Trägermaterial
gepfropfte Polymerketten. Es wird angenommen, dass die verbesserte
Bindung auf eine geringere sterische Hinderung der MIF-Bindung an
die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen
aufgrund des Abstandes zur Oberfläche des Trägermaterials zurückzuführen ist.
Ein weiterer Vorteil des Abstands halters kann eine Vervielfältigung
der MIF-Bindungsstellen sein, wenn jeweils mehrere MIF-bindende Moleküle oder
funktionale Gruppen pro Abstandshalter oder Polymerkette gebunden
werden können.
Dies lässt
sich mit Vorteil verwirklichen, wenn die zur Bindung der immobilisierten
MIF-bindenden Moleküle
oder funktionalen Gruppen auf das Trägermaterial gepfropfte Polymerketten
sind. Die Herstellung des Materials basiert auf einer radikalischen
Pfropfpolymerisation von Monomeren mit ungesättigten C=C-Doppelbindungen (z.B.
Acrylsäurederivaten)
und reaktiven Seitengruppen (z. B. Oxirangruppen). Verbindungen,
die sowohl ungesättigte
C=C-Doppelbindungen als auch Oxiranseitengruppen enthalten, sind
dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind insbesondere Glycidylmethacrylat,
Glycidylacrylat und Vinylglycidylether. Bevorzugt wird Glycidylmethacrylat
verwendet. Für
die erfindungsgemäße Anwendung
geeignete Pfropfgrade liegen im Bereich zwischen 101 und 200 %.
Bevorzugt sind Werte zwischen 105 und 120 %.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder
funktionalen Gruppen unter Inhibitoren der katalytischen und/oder
enzymatischen Aktivität
von MIF ausgewählt.
So ist bekannt, dass S-Hexyl-Glutathion und Hexanthiol eine starke
inhibitorische Wirkung auf die Dopachrom-Tautomerase-Aktivität von MIF
ausüben
(Swope et al., The Journal of Biological Chemistry, 273:14877-14884,
1998). Besonders bevorzugt sind die immobilisierten MIF-bindenden
Moleküle
oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Mercaptogruppen oder
Thiolgruppen enthaltenden Molekülen
ausgewählt.
Als erfindungsgemäß ganz besonders
geeignet haben sich Mercaptopyridin-Reste als immobilisierte MIF-bindende
Moleküle
oder funktionale Gruppen erwiesen.
-
Das
Apheresematerial bzw. Adsorbent der vorliegenden Erfindung ist zweckmäßigerweise
ein poröses Material,
vorzugsweise eine Membran, ein Teilchenbett, eine Fasermatte oder
Perlen (Beads). Da das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent
mit menschlichem oder tierischen Blut, Blutplasma oder anderen Körperflüssigkeiten
in Kontakt kommt, welche anschließend in den Patienten zurückgeführt werden
sollen, ist das Trägermaterial
besonders zweckmäßig ein
biokompatibles Polymermaterial. Geeignete biokompatible Trägermaterialien
sind Polyethersulfon (PES), Polypropylen (PP), Polysulfon (PSU),
Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyacrylnitril
(PAN), Polyamid (PA), Polytetrafluorethylen (PTFE), quervernetztes
Polystyrol-Polyethylenglycol (PS-PEG), Cyclo-olefincopolymere (COC),
Celluloseacetat (CA) oder Gemische oder Copolymere davon oder Gemische
oder Copolymere mit hydrophilisierenden Polymeren, wie Polyvinylpyrrolidon
(PVP) oder Polyethylenoxid (PEO).
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw.
Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder
MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Anti-MIF-Antikörpern oder
Fragmenten oder Derivaten davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle
ausgewählt.
Solche Antikörper,
die spezifisch gegen MIF gerichtet sind, wurden bereits hergestellt
oder lassen sich vom Fachmann auf dem Gebiet nach bekannten Verfahren
und unter Auswahl geeigneter MIF-Epitope herstellen. Geeignet sind
monoklonale und polyklonale Anti-MIF-Antikörper, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt
sind.
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw.
Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder
MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter zellulären MIF-Bindungsproteinen ausgewählt. Hier
sind dem Fachmann das intrazelluläre Protein JAB1/CSN5, ein transkriptioneller
Coaktivator und Zellzyklusregulator, sowie ggf. weitere Untereinheiten
des CSN-Signalosomkomplexes bekannt, das Membran- und MHC-assoziierte
Protein CD74/Invariant chain (Ii chain) und das Apoptoseregulierende
Protein BNPL. Aus diesen MIF-bindenden Proteinen lassen sich lösliche,
handhabbare, MIF-bindende Domänen
oder Sequenzen ableiten, die bei der Immobilisierung auf dem erfindungsgemäßen Adsorbent
mit Vorteil Einsatz finden können.
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw.
Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder
MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter weiteren Inhibitoren und
Substraten der katalytischen und/oder enzymatischen Aktivitäten von
MIF ausgewählt.
So eignen sich Substrate der Tautomerase/Isomeraseaktivität von MIF
wie Dopachrom, Phenylpyruvat oder die Vielzahl der bis dato beschriebenen
Inhibitoren dieser katalytischen Aktivität und Derivate dieser Verbindungen.
Auch eignen sich Substrate/Co-Substrate der Thiolproteinoxidoreduktaseaktivität von MIF
wie Glutathion, Liponsäure,
Hydroxyethyldisulfid, Cystein und andere Cystein-haltige Peptide,
sowie Insulinpeptidsequenzen.
-
Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Entfernung, Abreicherung
oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender
Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten,
bei dem man das oben hierin beschriebene Apheresematerial bzw. Adsorbent
mit dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder den anderen Körperflüssigkeiten
eines Patienten extrakorporal in Kontakt bringt. Liegt das erfindungsgemäße Apheresematerial
bzw. Adsorbent in der Form von Teilchen oder Perlen (Beads) vor,
so wird es geeigneterweise in eine Durchflußkammer bzw. Säule gepackt,
die dann von dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten
eines Patienten extrakorporal durchströmt wird. Vor oder nach der Behandlung,
bei der MIF abgereichert wird, kann eine oder können mehrere weitere Behandlungsstufen
des Blutes oder der anderen Flüssigkeiten
erfolgen. Es können
auch mehrere Behandlungen des Blutes oder der anderen Flüssigkeiten
in hintereinander angeordneten Einheiten, in denen MIF durch Adsorption
abgereichert wird, vorgenommen werden, um eine gewünschte Endkonzentration
an MIF zu erreichen, bevor das Blut oder die anderen Körperflüssigkeiten
in einen Patienten reinfundiert werden.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Herstellung
erfindungsgemäßer Apheresematerialien
zur Adsorption von MIF aus Blutplasma
-
1.1. Herstellung von Mercaptopyridin-
bzw. Hexanthiol-Acrylatbeads (ohne Spacer)
-
2
g Oxiran-Polyacrylatbeads (ToyopearlTM HW70EC
Tosoh Biosep, Stuttgart) mit einem mittleren Partikeldurchmesser
von 140 μm,
einer mittleren Porenausschlussgrenze von 800.000 Da und einem mittleren Oxirangehalt
von 4,0 mmol/g werden für
24 h bei 40 °C
mit 20 ml 0,1 M Mercaptopyridin bzw. 0,1 M Hexanthiol in DMF umgesetzt.
Nach Abschluß der
Umsetzung und mehrmaligem Waschen mit destilliertem Wasser werden
die Beads bei 40 °C
im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
-
1.2. Herstellung von thiophilen
Acrylatbeads (ohne Spacer)
-
3
g Toyopearl HW70EC Beads werden in 20 ml 4 M Natriumhydrogensulfidlösung (pH
11) gegeben und 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach sorgfältigem Waschen
mit destilliertem Wasser reagieren die Beads 1 h mit Divinylsulfon
(0,4 M) in 20 ml 0,1 M Carbonat-Puffer (pH 11) bei Raumtemperatur.
Die Beads werden anschließend
mit destilliertem Wasser gewaschen und dann 45 min in 20 ml einer
2,3 M Mercaptoethanol-Lösung
in 0,5 M Natriumcarbonat (pH 11) bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich werden
die Beads pH-neutral gewaschen und im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
-
1.3. Herstellung von mit
Mercaptopyridin bzw. Hexanthiol modifizierten Acrylatbeads mit Polyacrylat-Spacer
-
5
g Toyopearl HW70EC Beads werden in 20 ml 32%-iger Ammoniaklösung für 24 h bei
Raumtemperatur aminiert und anschließend ammoniakfrei gewaschen.
Anschließend
werden die Beads in 45 ml 0,1 M NaOH und 0,6 g 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure) resuspendiert.
Nach Zugabe von 0,85 g N-Hydroxysuccinimid und 0,85 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
wird der Ansatz 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließendem Spülen mit
Wasser und 2-Propanol erfolgt die Pfropfpolymerisation des Acrylat-Spacers
durch Umsetzung der Beads mit 2,5 g Glycidylmethacrylat in 100 ml
2-Propanol. Die Reaktion erfolgt unter Stickstoffatmosphäre bei 75°C für 6 h bei
leichtem Rühren.
Nach Waschen mit Propanol und Wasser erfolgt die Anbindung von Mercaptopyridin über die
Oxiran Gruppen der gepfropften Polymerseitenketten. Hierzu werden
die Beads in 40 ml 2-Propanol vorgelegt und nach Zugabe von Mercaptopyridin
(0,1 M) für
24 h bei 40 °C
umgesetzt. Anschließend
wird mit Propanol und Wasser gewaschen.
-
Beispiel 2: Adsorption
von MIF aus PBS-Puffer
-
Es
wurden die in Beispiel 1 gefertigten Materialien sowie S-Hexyl-Glutathion-Agarose
Beads (Fa. Sigma-Aldrich, München)
bezüglich
ihrer Fähigkeit
getestet, rhuMIF aus PBS-Puffer (pH 7,2) zu binden. Als Kontrolle
wurden die Basismaterialien ohne Ligandenmodifizierung eingesetzt.
Zur Durchführung
der Tests wurden jeweils ca. 1,2 ml Beads in Säulen, die mit einer Fritte
ausgestattet waren, vorgelegt. Anschließend wurde mit PBS-Puffer gespült und mit
einer rhuMIF-Lösung
für 15
min inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Lösung über die
Fritte von den Beads getrennt und die rhuMIF-Konzentration mittels
Bradford-Test (Fa. Bio-Rad) bestimmt. Die Auswertung erfolgte mithilfe
eines BSA-Standards. Die aus den Differenzen der rhuMIF-Konzentrationen
vor und nach der Inkubation ermittelten Bindungskapazitäten wurden
jeweils auf die eingesetzte Bead-Masse normiert. Die Ergebnisse
sind in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.
-
Beispiel 3: Adsorption
von MIF aus Humanplasma
-
Die
in Beispiel 1 gefertigten Materialien wurden in einem Batchverfahren
auf ihre Bindungseigenschaft bezüglich
rhuMIF aus Humanplasma getestet. Dazu wurden jeweils 1,2 ml Beads
mit 500 μl
frischem ACD-antikoaguliertem Humanplasma für 15 min bei Raumtempaeratur
inkubiert. Das Humanplasma wurde vor der Inkubation mit 10 μl/ml rhuMIF
versetzt. Im Überstand wurde
vor und nach der Inkubation die MIF-Konzentration mittels eines
huMIF-Sandwich-ELISA (Fa. R&D
Systems, MAB289 und BAF289) gemessen. Die Bindungskapazitäten, die
sich aus den MIF-Konzentrationen vor und nach der Inkubation ergeben,
sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle
1: MIF-Bindungskapazität
aus PBS-Puffer in μg
rhuMIF/ml Beads (MIF
Eingangskonzentration: 20 μg/ml)
Tabelle
2: MIF-Bindungskapazität
aus PBS-Puffer in μg
rhuMIF/ml Beads (MIF
Eingangskonzentration: 50 μg/ml)
Tabelle
3: MIF-Bindungskapazität
aus Humanplasma in μg
rhuMIF/ml Beads (MIF
Eingangskonzentration: 10 μg/ml)
-
Beispiel 4: Untersuchungen
zur Spezifität
der MIF-Bindung
-
Zur
Untersuchung der Spezifität
der MIF-Bindung wurden die Materialien aus den Bindungstests nach der
Inkubation zunächst
in unterschiedlichen Medien sorgfältig mit PBS-Puffer gewaschen.
Zur Desorption der adsorbierten Proteine wurden die Adsorbentien
anschließend
7 min bei 100 °C
in SDS-haltigem Beladungspuffer für die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese)
gekocht. Der Beladungspuffer hatte die folgende Zusammensetzung:
2,5 ml 0,5 M Tris (pH 6,8), 4 ml 10% SDS, 2 ml Glycerol, 1 ml β-Mercaptoethanol
und 1 ml Bromphenolblau. Anschließend wurde der Überstand
mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Zur Darstellung der rhuMIF-Banden
wurden die Proteine durch Western-Blot auf eine Nitrozellulosemembran übertragen,
die Membran mit einem Anti-huMIF-Antikörper aus Maus (MAB298 anti-huMIF,
R&D Systems)
inkubiert. Nach Waschen der Membran wurde diese mit einem mit Meerrettichperoxidase
(POD) gekoppelten Anti-Maus-Antikörper inkubiert und der Western-Blot
in bekannter Weise gefärbt.
Der Western-Blot ist in 1 dargestellt. Die Analyse der
adsorbierten Proteine erfolgte durch SDS-PAGE-Trennung des Desorptionsüberstandes
und anschließende
Silberfärbung.
Das Ergebnis ist in 2 dargestellt.