DE102004002259B4 - Process for the enzymatic production of baccatin III - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Baccatin III aus 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB), insbesondere in einem Enzymreaktor, wobei das 10-DAB in einem Flüssigphasensystem, mit einer wässrigen Phase (A) und einer organischen Phase (B), mittels eines eine Acetyltransferase aus Taxus spec. enthaltenden Zellrohsafts zu Baccatin III umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Phase (A) zur Regenerierung des durch die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III verbrauchten Acetyl-Coenzyms A Glucose und/oder Pyruvat zugesetzt wird.method for the enzymatic preparation of baccatin III from 10-deacetylbaccatin III (10-DAB), especially in an enzyme reactor, wherein the 10-DAB in a liquid phase system, with an aqueous Phase (A) and an organic phase (B) by means of an acetyltransferase from Taxus spec. containing Zellrohsafts converted to Baccatin III is characterized in that the aqueous phase (A) for regeneration of that consumed by the conversion of 10-DAB to baccatin III Acetyl-coenzyme A glucose and / or pyruvate is added.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Baccatin III gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The The invention relates to a process for the enzymatic preparation of Baccatin III according to the generic term of claim 1.
Taxane, insbesondere Paclitaxel (Taxol) sind zytotoxische Diterpene aus der Eibe, von denen einige die Zellreplikation hemmen. Dies geschieht dadurch, dass die Taxane, speziell Paclitaxel, an die Tubulinpolymere binden und diese stabilisieren, so dass die dynamische Reorganisation des mikrotubulären Systems blockiert wird. Somit wird die Zellteilung in der G2/M-Phase des Zellzyklus inhibiert. Aufgrund dieses Mechanismus haben Taxane eine Antitumorwirkung und werden zunehmend gegen eine Reihe von Karzinomen, insbesondere Ovarial-, Mamma- und Bronchialkarzinome eingesetzt.taxanes in particular paclitaxel (taxol) are cytotoxic diterpenes yew, some of which inhibit cell replication. this happens in that the taxanes, especially paclitaxel, bind to the tubulin polymers tie and stabilize them, allowing the dynamic reorganization of the microtubule System is blocked. Thus, cell division becomes G2 / M phase of the cell cycle. Because of this mechanism, taxanes have an antitumor effect and are increasingly against a number of Carcinomas, especially ovarian, breast and bronchial carcinomas used.
Wegen der Antitumorwirkung von Paclitaxel besteht ein großer Bedarf an dieser Substanz. Viele Behandlungen können nicht oder nur unzureichend durchgeführt werden, da Paclitaxel lediglich in geringen Mengen und zu hohen Kosten zur Verfügung gestellt werden kann.Because of There is a great need for the anti-tumor effect of paclitaxel on this substance. Many treatments can not or only insufficiently be carried out because paclitaxel only in small quantities and at high cost to disposal can be made.
Zur Zeit wird die Herstellung von Paclitaxel insbesondere auf die Aufarbeitung der Rinde von Taxus brevifolia (Nutt.) gestützt. Da die Konzentration von Paclitaxel in der Rinde-jedoch sehr niedrig ist, könnte dieses Verfahren absehbar zur Zerstörung des Eibenbestandes führen. Daher müssen ökologisch und ökonomisch sinnvolle Alternativen in Form einer chemischen Synthese entwickelt werden. to Time will be the production of paclitaxel especially on the workup the bark of Taxus brevifolia (Nutt.) supported. Because the concentration of Paclitaxel is very low in the bark, however, this could be Process foreseeable for the destruction of the Eibenbestandes lead. Therefore, must be ecological and economically developed meaningful alternatives in the form of a chemical synthesis become.
Da eine Vollsynthese von Paclitaxel aufgrund ihrer geringen Ausbeuten nicht in Frage kommt, kann eine Semisynthese auf der Grundlage von 10-Deacetyl-baccatin III (10-DAB) erfolgen.There a full synthesis of paclitaxel due to their low yields is out of the question, can be a semisynthesis based on 10-deacetyl-baccatin III (10-DAB).
Außerdem kann 10-DAB in signifikanten Mengen aus den Nadeln und Zweigen von Eiben gewonnen werden. Da dieses Ausgangsmaterial in großen Mengen in der Park- und Forstwirtschaft anfällt und der Eibenverschnitt sowieso schwer zu entsorgen ist, stellt sich hierbei nicht das oben geschilderte Problem der Bestandsgefährdung der Eibe. Auch unter Kostenaspekten ist diese Quelle zu bevorzugen.In addition, can 10-DAB in significant quantities from the needles and branches of yew trees be won. Because this source material in large quantities in the park and forestry accumulates and the Eibenverschnitt anyway hard to dispose of, this is not the above described problem of endangerment of yew. Also under Cost aspects, this source is to be preferred.
Bei
der Semisynthese von Baccatin III muss 10-DAB an Position 10 stereospezifisch
acetyliert werden (siehe dazu
Die
Jedoch
sind eine Reihe von Aspekten des Verfahrens gemäß der
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Baccatin III als Vorstufe des Paclitaxels, ohne die oben genannten Nachteile herzustellen.It the object of the present invention is baccatin III as a precursor of paclitaxel without producing the above-mentioned disadvantages.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.These The object is achieved by a method according to claim 1.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Baccatin III aus 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB), insbesondere in einem Enzymreaktor, wird 10-DAB in einem Flüssigphasensystem, mit einer wässrigen Phase (A) und einer organischen Phase (B), mittels eines eine Acetyltransferase aus Taxus spec. enthaltenden Zellrohsafts zu Baccatin III umgesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Phase (A) zur Regenerierung des durch die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III verbrauchten Acetyl-Coenzyms A Glucose und/oder Pyruvat zugesetzt wird.At the inventive method for the enzymatic preparation of baccatin III from 10-deacetylbaccatin III (10-DAB), especially in an enzyme reactor, becomes 10-DAB in a liquid phase system, with an aqueous Phase (A) and an organic phase (B) by means of an acetyltransferase from Taxus spec. containing Zellrohsafts converted to Baccatin III. The inventive method is characterized in that the aqueous phase (A) for regeneration of that consumed by the conversion of 10-DAB to baccatin III Acetyl-coenzyme A glucose and / or pyruvate is added.
Der zum Einsatz kommende Enzymreaktor weist eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran auf, wobei im Innern des Enzymreaktors die Acetyltransferase aus Taxus spec. immobilisiert ist.Of the used Enzyme reactor has a hollow fiber ultrafiltration membrane on, wherein in the interior of the enzyme reactor, the acetyltransferase from Taxus spec. is immobilized.
Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembranen zeichnen sich durch eine Vielzahl von Kapillarmembranen aus, so dass das Verhältnis Oberfläche zu Volumen sehr hoch ist, wobei gleichzeitig eine kompakte Bauweise erreicht werden kann. Somit kann eine hohe Umsatzrate erzielt werden.Hollow fiber ultrafiltration membranes are characterized by a variety of capillary membranes, so that the ratio surface to volume is very high, while maintaining a compact design can be achieved. Thus, a high turnover rate can be achieved.
Unter Immobilisierung ist hier zu verstehen, dass die Acetyltransferase aus Taxus spec. sich in einem abgeschlossenen Kompartiment bzw. Kreislauf befindet. Die Acetyltransferase befindet sich, wie unten noch erläutert werden wird, in einer wässrigen Phase innerhalb dieses auch als Reaktionsraum die nenden geschlossenen Kompartiments bzw. Kreislaufs und wird in der wässrigen Phase laufend umgewälzt.Under Immobilization is understood here to mean acetyltransferase from Taxus spec. in a closed compartment or Circulation is located. The acetyltransferase is as below still explained will be in an aqueous phase within this also as reaction space the nenden closed Compartment or circulation and is continuously circulated in the aqueous phase.
Durch die Immobilisierung einer Acetyltransferase ergibt sich für die Synthese von Baccatin III eine verkürzte Reaktionszeit.By the immobilization of an acetyltransferase results for the synthesis from Baccatin III a shortened Reaction time.
Die Acetyltransferase aus Taxus spec. katalysiert die Übertragung einer Acetylgruppe auf die OH-Gruppe an Position 10 des 10-DAB, wodurch Baccatin III entsteht. Sie wird durch die Immobilisierung in konzentrierter Form bereitgestellt.The acetyltransferase from Taxus spec. catalyzes the transfer of an acetyl group to the OH group at position 10 of the 10-DAB, thereby Baccatine III is created. It is provided by the immobilization in concentrated form.
Von Vorteil beim erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass ein Zellrohsaft zum Einsatz kommen kann, und keine aufwendigen Aufreinigungsschritte vor dem Einsatz der Acetyltransferase in der Synthese durchgeführt werden müssen. Außerdem werden mit dem Zellrohsaft weitere Enzyme bereitgestellt.From Advantage of the method according to the invention is that a Zellrohsaft can be used, and no consuming Purification steps before the use of acetyltransferase in the Synthesis performed Need to become. Furthermore are provided with the Zellrohsaft other enzymes.
Der Zellrohsaft wird wie folgt gewonnen: Suspension von geeigneten Zellen in einem wässrigen Puffer, insbesondere Phosphatpuffer; Zellaufschluss, insbesondere mittels Ultraschall unter Zugabe einer DNase; Abzentrifugation; Fällung des Überstandes mit einer Polyethylenimin-Lösung; Abzentrifugation; Versetzen des Überstandes mit Glycerin.Of the Crude sap is obtained as follows: suspension of suitable cells in an aqueous Buffers, in particular phosphate buffers; Cell disruption, in particular by means of ultrasound with the addition of a DNase; centrifuging; precipitation of the supernatant with a polyethyleneimine solution; centrifuging; Move the supernatant with glycerin.
Durch die Verwendung der Acetyltransferase aus Taxus spec. erfolgt die Herstellung von Baccatin III, wobei dieses Baccatin III praktisch enantiomerenrein vorliegt, da die Acetyltransferase eine stereospezifische Acetylierung an Position 10 des 10-DAB katalysiert.By the use of acetyltransferase from Taxus spec. the Production of baccatin III, this baccatin III being practical enantiomerically pure, since the acetyltransferase is a stereospecific Acetylation catalyzed at position 10 of the 10-DAB.
Die
erfindungsgemäße Synthese
von Baccatin III erfolgt enzyma tisch, wobei ein Coenzym notwendig
ist, nämlich
Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) (siehe dazu auch
Erfindungsgemäß wird demzufolge während des Verfahrens der wässrigen Phase zur Regenerierung des durch die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III verbrauchten Acetyl-Coenzyms A Glucose und/oder Pyruvat zugesetzt.Accordingly, according to the invention during the Method of aqueous Phase for the regeneration of by the conversion of 10-DAB to baccatin III consumed acetyl coenzyme A glucose and / or pyruvate added.
Der eingesetzte Zellrohsaft verfügt über die benötigten Enzyme, um aus Glucose und/oder Pyruvat das bei der Umsetzung von Baccatin III anfallende Coenzym A zu acetylieren und somit zu regenerieren. Dadurch wird eine kontinuierliche Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III im Enzymreaktor ermöglicht.Of the used Zellrohsaft has the required enzymes, from glucose and / or pyruvate in the reaction of baccatin III to accumulate Coenzyme A to acetylate and thus to regenerate. This will produce a continuous conversion of 10-DAB to baccatin III in the enzyme reactor allows.
Somit ist die Zugabe von externem Acetyl-CoA und das damit verbundene kostenintensive Regenerationssystem nicht mehr notwendig und es wird ein kostengünstiges enzymatisches Verfahren zur Verfügung gestellt.Consequently is the addition of external acetyl-CoA and its associated costly regeneration system is no longer necessary and it will a cost-effective enzymatic process available posed.
Als flüssige wässrige Phase wird vorteilhafter Weise ein wässriger Puffer, insbesondere ein Phosphat- und/oder MOPS-puffer eingesetzt. Als organische Phase wird bevorzugt ein nichthalogenierter Ether, insbesondere Diisopropylether oder Dibutylether eingesetzt.When liquid aqueous Phase is advantageously an aqueous buffer, in particular a phosphate and / or MOPS buffer used. As an organic phase is preferably a non-halogenated ether, in particular diisopropyl ether or dibutyl ether used.
Diisopropylether und Dibutylether sind von Vorteil, da das synthetisierte Baccatin III in diesen organischen Lösungsmitteln selektiv löslich ist und somit direkt nach der Synthese aus der wässrigen Phase extrahiert wird, während das Substrat praktisch vollständig in der organischen Phase verbleibt.diisopropylether and dibutyl ethers are beneficial because the synthesized baccatin III in these organic solvents selectively soluble and thus is extracted from the aqueous phase immediately after the synthesis, while the substrate is virtually complete remains in the organic phase.
Weiterhin sind Diisopropylether und Dibutylether gegenüber halogenierten Lösungsmitteln in ökologischer Hinsicht vorteilhaft.Farther are diisopropyl ether and dibutyl ether over halogenated solvents in ecological Advantageous.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die in dem Zellrohsaft befindliche Acetyltransferase im Enzymreaktor in der wässrigen Phase (A) immobilisiert, und zwar insbesondere durch eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran, wobei diese Ultrafiltrationsmembran vorteilhafterweise hydrophob ist. Die Hydrophobizität wird insbesondere dadurch erreicht, dass die Ultrafiltrationsmembran Polysulfon und/oder Polyethersulfon aufweist bzw. aus Polysulfon und/oder Polyethersulfon besteht.In an advantageous embodiment the method according to the invention the acetyltransferase in the cell sap is in the enzyme reactor in the aqueous Phase (A) immobilized, in particular by a hollow fiber ultrafiltration membrane, this ultrafiltration membrane advantageously being hydrophobic is. The hydrophobicity is in particular achieved by the fact that the ultrafiltration membrane Polysulfone and / or polyethersulfone has or from polysulfone and / or polyethersulfone.
Durch die Immobilisierung wird die Acetyltransferase nicht durch den Fluss des Zellrohsaftes durch den Enzymreaktor ausgeschwemmt, sondern verbleibt in der wässrigen Phase. Dies gewährleistet hohe Umsatzraten des Enzyms.By immobilization does not drive the acetyltransferase through the flow the Zellrohsaftes flushed through the enzyme reactor, but remains in the aqueous Phase. This ensures high Conversion rates of the enzyme.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens weist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran eine Porengrößenverteilung von kleiner 10 nm oder eine Trenngrenze von kleiner 50 kD auf. Besonders bevorzugt ist eine Porengrößenverteilung von kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich 10 kD.In a particularly advantageous embodiment of the method has the hollow fiber ultrafiltration membrane has a pore size distribution of less than 10 nm or a cut-off of less than 50 kD. Especially preferred is a pore size distribution of less than or equal to 3 nm or a cut-off of less than or equal to 10 kD.
Die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran trennt vorteilhafter Weise die organische von der wässrigen Phase, liegt also zwischen diesen beiden Phasen.The Hollow fiber ultrafiltration membrane advantageously separates the organic from the aqueous phase, lies between these two phases.
Besonders vorteilhaft ist es in diesem Zusammenhang, wenn der Zellrohsaft aus Escherichia coli oder der Hefe Pichia pastoris oder aus Spalthefen gewonnen wird, da sich diese Organismen gut für die Expression heterologer Proteine in großen Ausbeuten eignen. Dafür können diese Organismen nach Einbringung geeigneter Plasmide zur Proteinexpression, die für die Acetyltransferase aus Taxus spec. kodieren, zur Herstellung des Zellrohsaftes hergestellt werden. Die Verfahren zur Überexpression von heterologen Proteinen sind dem Fachmann bekannt.Especially it is advantageous in this context when the Zellrohsaft from Escherichia coli or the yeast Pichia pastoris or from fission yeasts is obtained because these organisms are good for expression heterologous Proteins in large Yields are suitable. Therefore can these organisms after introduction of suitable plasmids for protein expression, the for the acetyltransferase from Taxus spec. encode, for production of the Zellrohsaftes are produced. The methods of overexpression of heterologous proteins are known in the art.
Zur Herstellung des Zellrohsaftes kann der durch Aufschluss der Zellen gewonnene Zellsaft durch Zugabe von mindestens einer Nuklease, insbesondere einer DNase, von Nukleinsäuren befreit werden.to Production of the Zellrohsaftes can by the digestion of the cells obtained cell juice by adding at least one nuclease, in particular a DNase, of nucleic acids be freed.
Vor dem Einfüllen in den Enzymreaktor wird der Zellrohsaft vorteilhafterweise durch Fällung mit einer Polyethylenimin-Lösung hergestellt, wobei ggf. Glycerin zur Stabilisierung verwendet werden kann. Dadurch werden insbesondere für das Verfahren nicht benötigte Proteine abgetrennt.In front the filling in the enzyme reactor, the Zellrohsaft is advantageously by precipitation made with a polyethyleneimine solution, where appropriate, glycerol can be used for stabilization. Thereby be especially for the process was not needed Proteins separated.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens geht die Herstellung von der Substanz 10-Deacetyl-baccatin III (10-DAB) aus, das aus Eibennadeln gewonnen wird. Dies ist insbesondere unter ökologischen Gesichtspunk- ten vorteilhaft, da somit der Eibenbestand geschont werden kann.In a further advantageous embodiment of the method is the preparation of the substance 10-deacetyl-baccatin III (10-DAB) made out of yew needles. This is especially under ecological Aspects advantageous since thus spared the yew stock can be.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher beschrieben. Darin zeigt:The The present invention will be further described by the following figures. It shows:
In
In einem ersten Kreislauf K1 zirkuliert die organische Phase, also mindestens ein nicht-halogenierter Ether, insbesondere Diisopropylether und/oder Dibutylether. Die Stömungsrichtung ist durch einen Pfeil angegeben. Innerhalb des ersten Kreislaufs K1 sind ein Behälter B1 als Vorratsbehälter, sowie der Drucksensor D1 am Übergang vom Behälter B0 in die Rohrleitung und der Drucksensor D2 am Übergang von der Rohrleitung in den Behälter B0 angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durch eine motorbetriebene Pumpe P1 gewährleistet.In a first circuit K1 circulates the organic phase, ie at least one non-halogenated ether, in particular diisopropyl ether and / or Dibutyl ether. The direction of flow is indicated by an arrow. Within the first cycle K1 are a container B1 as a storage container, and the pressure sensor D1 at the transition from the container B0 into the pipeline and the pressure sensor D2 at the transition from the pipeline in the container B0 arranged. The circulation of the organic phase is through ensures a motor-driven pump P1.
In einem zweiten Kreislauf K2 zirkuliert die wässrige Phase, also der Zellrohsaft. Die Stömungsrichtung ist auch hier durch einen Pfeil angegeben. Zur Verbesserung des Extraktionsverhaltens kann die Strömungsrichtung jedoch auch umgekehrt werden, womit die Extraktion im Gegenstromverfahren verläuft. Innerhalb des zweiten Kreislaufs K2 sind ebenfalls ein Behälter B2 als Vorratsbehälter, sowie der Drucksensor D3 am Übergang vom Behälter B0 in die Rohrleitung und der Drucksensor D4 am Übergang von der Rohrleitung in den Behälter B0 angeordnet. Der Behälter B2 weist Mittel zur Temperatur- und pH-Messung auf. Zwischen dem Drucksensor D3 und dem Behälter B2 ist zudem ein Regulierventil v zur Regulation des Druckgradienten in der in dem zweiten Kreislauf K2 zirkulierenden wässrigen Phase angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durch eine motorbetriebene Pumpe P2 gewährleistet.In a second cycle K2 circulates the aqueous phase, so the Zellrohsaft. The direction of flow is also indicated here by an arrow. To improve the Extraction behavior, however, the direction of flow can also be reversed become, whereby the extraction runs countercurrently. Within of the second circuit K2 are also a container B2 as a reservoir, and the Pressure sensor D3 at the transition from the container B0 into the pipeline and the pressure sensor D4 at the transition from the pipeline in the container B0 arranged. The container B2 has means for temperature and pH measurement. Between the Pressure sensor D3 and the container B2 is also a regulating valve v for regulating the pressure gradient in the circulating in the second circuit K2 aqueous Phase arranged. The circulation of the organic phase is through a motorized pump P2 guaranteed.
Eine Auffangwanne A dient dem Auffangen von Flüssigkeit im Falle eines Lecks. Ein im Enzymreaktor R angeordnetes Heizmittel H dient der Einstellung einer geeigneten Temperatur.A Drip tray A is used to catch liquid in the event of a leak. A heating medium H arranged in the enzyme reactor R is used for adjustment a suitable temperature.
Mittels der Pumpen P1, P2 werden die organische und die wässrige Phase ständig im Kreis umgewälzt, so dass zum einen ständig neues Substrat in den Reaktionsraum im Behälter B0 geführt wird, andererseits das im Reaktionsraum gebildete Produkt ständig entfernt wird.through the pumps P1, P2 become the organic and the aqueous phase constantly circulated in a circle, so that, for one, constantly new substrate is guided into the reaction space in the container B0, on the other hand the product formed in the reaction space is constantly removed.
In der wässrigen Phase (A) findet die von der Acetyltransferase katalysierte Umsetzung von 10-DRB zu Baccatin III statt, wobei Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) unter Übertragung der Acetylgruppe an Position 10 des 10-DAB zu Coenzym A umgesetzt wird. Dabei ist die Acetyltransferase in der wässrigen Phase immobilisiert, so dass sie wiederholt zur Umsetzung des im Enzymreaktor befindlichen 10-DAB zur Verfügung steht. Das Coenzym A wird mittels eines im Zellrohsaft vorhandenen Enzyms, insbesondere einer Dehydrogenase, Ligase oder einer Transacetylase unter Verwendung eines Acetylgruppendonors wieder zu Acetyl-CoA umgesetzt. Damit steht das Acetyl-CoA für eine erneute Umsetzung von 10-DRB zu Baccatin III zur Verfügung, so dass Baccatin III kontinuierlich hergestellt werden kann.In the aqueous phase (A), acetyltransferase-catalyzed conversion of 10-DRB to baccatin III occurs, with acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) being converted to coenzyme A by transferring the acetyl group at position 10 of the 10-DAB. In this case, the acetyltransferase is immobilized in the aqueous phase, so that it is repeatedly available for the conversion of the 10-DAB present in the enzyme reactor. Coenzyme A is converted back into acetyl-CoA by means of an enzyme present in the cell sap, in particular a dehydrogenase, ligase or a transacetylase using an acetyl group donor. Thus, the acetyl-CoA stands for a new reaction of 10-DRB to Baccatin III available, so that Baccatin III can be produced continuously.
Die vorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel näher beschrieben.The The present invention will be further described by the following example.
Beispiel:Example:
Alle Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. 7,5 g Feuchtbiomasse von Escherichia coli des Stammes JM 109 rec des Klones pZP1, die zuvor bei –21°C gelagert wurden, wird in einem 50 mM Phosphatpuffer (KH2PO4: 0, 434 g/l, Na2HPO4·2H2O: 8,33 g/l, pH = 7,8) zu einem Gesamtvolumen von 20 ml resuspendiert. Die so erhaltene Suspension wird in einem Edelstahlaufschlussgefäß mittels Ultraschall (Ultraschallprozessor Dr. Hielcher, Typ UP 400 s) 2 min aufgeschlossen (Amplitide 70 %, Zyklus 0,3). Der erhaltene Zellsaft wird unter Zugabe von 30 μl DNase (90 Units, AppliChem) eine Stunde auf Eis gerührt. Anschließend wird der Zellsaft in ein 50 ml Falconröhrchen überführt und abzentrifugiert (Hettich Zentrifuge, Typ Rotanta 46R, 3500 U/min, Temperatur 4 °C). Der erhaltene Überstand wird mit einer Polyethylenimin-Lösung (Endkonzentration 0,5 %, Serva) gefällt und verbleibt 30 Minuten gerührt auf Eis. Dann wird der Zellsaft 30 min abzentrifugiert und der Überstand mit 20 Glycerin versetzt. Die so erhaltenen Flüssigkeit stellt den Zellrohsaft dar.All steps are carried out at 4 ° C. 7.5 g wet biomass of Escherichia coli of strain JM 109 rec of clone pZP1, which were previously stored at -21 ° C, in a 50 mM phosphate buffer (KH 2 PO 4 : 0, 434 g / l, Na 2 HPO 4 2H 2 O: 8.33 g / l, pH = 7.8) to a total volume of 20 ml. The suspension thus obtained is digested in a stainless steel digestion vessel by means of ultrasound (ultrasonic processor Dr. Hielcher, type UP 400 s) for 2 minutes (Amplitide 70%, cycle 0.3). The obtained cell juice is stirred for one hour on ice with addition of 30 μl of DNase (90 units, AppliChem). Subsequently, the cell sap is transferred to a 50 ml Falcon tube and centrifuged (Hettich centrifuge, type Rotanta 46R, 3500 rpm, temperature 4 ° C). The supernatant obtained is precipitated with a polyethyleneimine solution (final concentration 0.5%, Serva) and left stirring for 30 minutes on ice. The cell juice is then centrifuged off for 30 minutes and the supernatant is mixed with 20% glycerol. The liquid thus obtained represents the Zellrohsaft.
Die
enzymatische Reaktion erfolgt in einem Enzymmembranreaktor (Hohlfasermodul
MiniKros® Sampler
PS, Gehäusegröße 2, Trenngrenze
10 kD, Fläche
615 cm2, membraPure) unter folgenden Bedingungen:
Als
Lösungsmittel
kommt Diisopropylether (Riedel-deHaën) zum Einsatz. 750 ml werden
in eine 11-Schottflasche abgefüllt
und im Wasserbad auf 13 °C
temperiert. 150 ml Zellrohsaft werden in eine 250 ml-Schottflasche überführt und
mit 60 μg
10-DAB (Deacetylbaccatin-III, Coral Drugs), welches in 2 ml Ethanol
gelöst
wurde, sowie 60 mg Glucose-Monohydrat (Fluka) versetzt und im Wasserbad
bei 13 °C temperiert.
Die Diisopropylether-Phase
wird mit Hilfe einer Membranpumpe (Typ Dosierpumpe DME, Telab) mantelseitig
mit einem Fluss von 985 ml/h gepumpt. Eine Schlauchpumpe (Typ: BV-GES,
Ismatec) zirkuliert den Zellrohsaft mit einem Volumenstrom von 984
ml/h durch die Hohlfaser. Es wird kein Überdruck angelegt. Ein Durchbruch
einer der beiden Phasen über
den gesamten Versuchszeitraum wurde nicht beo bachtet.The enzymatic reaction is carried out in an enzyme membrane reactor (hollow fiber module MiniKros Sampler ® PS, housing size 2, cut-off 10 kD, area 615 cm 2, membraPure) under the following conditions:
The solvent used is diisopropyl ether (Riedel-deHaën). 750 ml are poured into an 11-Schott bottle and heated to 13 ° C in a water bath. Transfer 150 ml of crude Zellrohsaft into a 250 ml Schott flask and with 60 ug 10-DAB (Deacetylbaccatin III, Coral Drugs), which was dissolved in 2 ml of ethanol, and 60 mg of glucose monohydrate (Fluka) and in a water bath at 13 ° C tempered. The diisopropyl ether phase is pumped on the shell side with a flow of 985 ml / h with the aid of a membrane pump (type DME dosing pump, Telab). A peristaltic pump (type: BV-GES, Ismatec) circulates the cell stock juice through the hollow fiber at a flow rate of 984 ml / h. No overpressure is applied. A breakthrough of either phase over the entire trial period was not observed.
Das gebildete Baccatin III wird kontinuierlich extraktiv aus der wässrigen Phase abgezogen und reichert sich in der Diisopropylether-Phase an. Ein Auswaschen des Substrates 10-DAB durch die organische Phase wird durch die Selektivität des verwendeten Lösungsmittels verhindert. Das Produkt Baccatin III wird durch Einrotieren der Lösungsmittelphase in einem vakuumrotationsverdampfer nach Ablauf der enzymatischen Reaktion erhalten. Das so erhaltene Produkt Baccatin III besitzt eine Reinheit von 97 %. Unter den genannten Bedingungen ergibt sich ein Umsatz von bis zu 70 %. Als Versuchsdauer sind mindestens 24 Stunden anzusetzen.The Baccatin III formed is continuously extractive from the aqueous Phase removed and accumulates in the diisopropyl ether phase at. Washing out the substrate 10-DAB by the organic phase is through the selectivity of the solvent used prevented. The product Baccatin III is made by spinning the Solvent phase in a vacuum rotary evaporator after the end of the enzymatic Received reaction. The product thus obtained has baccatin III a purity of 97%. Under the conditions mentioned results a turnover of up to 70%. The test duration is at least 24 Hours to set.
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