DE1018192B - Manufacture of the antibiotic novobiocin - Google Patents

Description

Herstellung des Antibiotikums Novobiocin Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuartigen, eine Säure darstellenden Mikrobenbekämpfungsmittels, dem die Bezeichnung Novobiocin gegeben wurde. Das Novobiocin kann ferner aus der Nährlösung gewonnen und in seine Salze übergeführt werden.Preparation of the antibiotic novobiocin The present invention relates to the manufacture of a novel anti-microbial agent that represents an acid, which was given the name Novobiocin. The Novobiocin can also from the Nutrient solution obtained and converted into its salts.

Novobiocin wird durch ein Gärverfahren hergestellt. Der verwendete Organismus ist in der Sammlung von Chas. Pfizer & Co., Inc., durch die Nummer 7243-3 gekennzeichnet. Man isoliert ihn aus Bodenprob°n. Eine Bodenprobe wurde mit Wasser verdünnt; 4/1o ccm dieser Suspension wurden auf die Oberfläche von in einer Petri-Schale befindlichem Emerson-Aga.r gesprüht. N ach 5tägigem Wachstum bei 28° wurde eine einheitliche Kolonie des einen Mikroorganismus isoliert und auf Schrägnährböden aus Emerson-Agar gezüchtet. Eine Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C., eingesandt und dort in die ständige Kulturen sammlung unter der Bezeichnung ATCC 12318 aufgenommen. Es wurde festgestellt, daß dieser Organismus zu einem Stamm der Spezies Streptomyces griseus gehört. Die in der vorliegenden Anmeldung verwendete Bezeichnung Streptomyces griseus ATCC 12318 bezieht sich auf alle zum selben Stamm gehörigen Organismen sowie dessen Mutanten.Novobiocin is made through a fermentation process. The one used Organism is in the collection of chas. Pfizer & Co., Inc., by number 7243-3. It is isolated from soil samples. A soil sample was taken with Water diluted; 4/10 ccm of this suspension were on the surface of in a Petri dish located Emerson-Aga.r sprayed. After 5 days of growth at 28 ° a uniform colony of the one microorganism was isolated and placed on slanted culture media grown from Emerson agar. A culture of this organism was made by the American Type Culture Collection in Washington, D. C., and there in the permanent Culture collection under the designation ATCC 12318 added. It was determined, that this organism belongs to a strain of the species Streptomyces griseus. the Designation Streptomyces griseus ATCC 12318 used in the present application refers to all organisms belonging to the same strain as well as its mutants.

Nach 7tägigem Wachstum bei 28° auf Emerson-Agar wurde der Streptomyces griseus ATCC 12318 untersucht. Aus dem Umstand, daß die Kolonie hart und zäh ist, geht hervor, daß es sich um eine Spezies der actinomycetischen Gattung Streptomyces handelt. Die sich verzweigenden Mycelfäden sind außerordentlich schmal, d. h. besitzen eine Breite von etwa 1,5 q.. und die Luftmycelfäden besitzen Sporenketten, die zumindest in manchen Fällen spiralförmig sind. Bei 7tägiger Züchtung auf Emersons-Agar bei 28° entwickelte sich der Organismus gut. Das weiße Luftmycel bildete keine flockige, sondern eine dichte, dünne Schicht auf der Oberfläche der Kolonie. Es wird im wesentlichen kein lösliches Pigment gebildet. Einzelne Kolonien sind erhaben und meist etwas kraterförmig.After 7 days of growth at 28 ° on Emerson agar, the Streptomyces griseus ATCC 12318 examined. From the fact that the colony is tough and tough, shows that it is a species of the actinomycetic genus Streptomyces acts. The branching mycelium threads are extremely narrow, i. H. own a width of about 1.5 q .. and the aerial mycelium threads have spore chains that at least are spiral in some cases. When cultivated on Emerson's agar for 7 days At 28 ° the organism developed well. The white aerial mycelium did not form a flaky one, but a dense, thin layer on the surface of the colony. It will essentially no soluble pigment formed. Individual colonies are raised and mostly something crater-shaped.

In sechs Wiederholungsversuchen wurde Streptomyces griseus ATCC 12318 auf Schrägnährböden oder in Petri-Schalen, die die normalerweise für den Nachweis von Streptomyces Stämmen verwendeten Medien enthielten, gezüchtet. Nach zweiwöchiger Inkubation bei geeigneten Temperaturen wurden die Endwerte für die verschiedenen Medien bestimmt und eingetragen.In six replicates, Streptomyces griseus was ATCC 12318 on inclined culture media or in Petri dishes, which are normally used for the detection media used by Streptomyces strains. After two weeks Incubation at appropriate temperatures were the final values for the various Media determined and registered.

Die Untersuchung der Kultur und der Vergleich ihrer Eigenschaften mit denen der von W a k s m a n und L e c h e v a 1 i e r in »Actinomycetes and their Antibiotics« beschriebenen Spezies führten zu dem Schluß, daß die Kultur einen Stamm des S. griseus darstellte. Die Unterschiede gegenüber dem beschriebenen. S. griseus waren nur unbedeutend.Studying the culture and comparing its properties with those of W a k s m a n and L e c h e v a 1 i e r in »Actinomycetes and their Antibiotics «led to the conclusion that culture unites one Tribe of S. griseus represented. The differences from the one described. S. griseus were insignificant.

Die folgende Tabelle enthält eine Aufstellung der charakteristischen Eigenschaften des speziellen Stammes S. griseus ATCC 12318. Eine weitere Tabelle enthält eine Aufstellung der Punkte, in denen sich der vorliegende Stamm von dem beschriebenen S. griseus unterscheidet.The following table lists the characteristic Properties of the special strain S. griseus ATCC 12318. Another table contains a list of the points in which the present tribe differs from the described S. griseus differs.

Farben nach »Ridgway, Color Standards and NTomenclature« wurden mit der Bezeichnung (R) versehen.Colors according to "Ridgway, Color Standards and NTomenclature" were included the designation (R) provided.

Das Antibiotikum Novobiocin wird durch Züchtung von Streptomyces griseus ATCC Nr. 12318 in ein°m Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen hergestellt. Die Zusammensetzung dieser Nährlösung kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Im wesentlichen benötigt man eine Kohlehydratquell.e, eine Stickstoffquelle und Spuren anorganischer Elemente. Temperaturen zwischen etwa 25 und 35° sind zweckmäßig. Im allgemeinen läßt man die Gärung in einem Zeitraum von einem bis mehreren Tagen erfolgen, worauf das Antibiotikum abgetrennt wird. Unter Verwendung von Micrococcus flavus zur qualitativen Untersuchung wurde nachgewiesen, daß das Anti- Medium Wachstumsstärke Luftmycel Lösliches Pigment Bemerkungen und Sporenbildung Glukose- mäßig gut, weiß bis blaß-oliv- keines erhabene Kolonien mit klar Asparagin- lederfarbig abgegrenztem Rand; vege- Agar tatives Mycel, an sicht- baren Stellen bräunlich- rosa (Buff-PINK (R)); Rückseite blaßgelb bis hell gelbbraun (beinah Clay Color (R)); Konid.ien in Form von losen bis mäßig losen Spiralen; Konidien- fäden in Form von End- büscheln; die Sporen be- saßen kurze Zylinderform, gelegentlich Kugelform 0,75 bis 1,00 V 1,00 bis 1,5 i Entrahmte Milch schwach bis gar nicht oder wenig, warm lederfarbig gleichzeitig erfolgende Ko- mäßig weißlich; Ring Light Buff (R)) bis agulierung und Peptisa- cremeweiß bis zwischen hell ocker- tion, jedoch langsam er- lachsfarben lederfarbig (Light folgende Peptisation; pA- (Apricot Buff (R)) Ochraceous-Buff Wert wechselte zwischen (R)) und ocker- 6,3 und 6,6 bis 6,7 lederfarbig (Ochra- ceous-Buff (R) ) Glukose-Agar gut spärlich, meist an den bräunlichgelb, heller vegetatives, an sichtbaren Rändern auftretend, als Roh-Siena Stellen farbloses Mycel; weiß (Raw Sienna (R)) Rückseite farblos bis hell Lederfarben Agar-Nähr- mäßig spärlich bis mäßig, im wesentlichen keines vegetatives, an sichtbaren Lösung -weiß Stellen farbloses My cel ; Rückseite Maßgelb Synthetisches gut gut, leicht pulvrig, im wesentlichen keines Wachstum unter der Ober- Agar blaßgelboliv (ähnlich fläche flach; Rückseite -wie Olive-Buff (R)) lederfarbig (Warm Buff (R)) Calcium. Malat- gut gut, creme-veiß bis im wesentlichen keines Malat wurde verbraucht; Agar blaßlohfa,rben kein vegetatives Mycel (zwischen Olive- sichtbar; Rückseite ocker- Buff (R) und farbig (Ochraceous-Buff Avellaneous (R)) (R)) Cellulose schwach bis weiß mäßig Kartoffel- gut spärlich, -weißlich bis blaßgräulichlohfarben vegetatives Mycel, farblos Schräg- weiß oder lohfarben bis Lederfarben oder Leder- nährböden farbengelb; Oberflächefein gerunzelt; Geruch erdig Stärke-Platten j schwach mäßig, -weißlich keines Zone der Stärkehydrolyse 2,0 bis 3,2 cm Durchmes- ser; meistflacheKolonien; ! Rückseite weiß bis ocker- lachsfarbig (Light Ochra- ceous-Buff (R) bis Ochra- ceous-Buff (R) und Apri- cot Buff (R) ) Gelatine-Platten mäßig gut, -weiß keines Zone der Verflüssigung 2,5 bis 3,2 cm Durchmesser; j kein vegetatives Mycel sichtbar Medium Wachstumsstärke Luftmycel Lösliches Pigment Bemerkungen und Sporenbildung Dextrose- mäßig mäßig, weiß im wesentlichen keines keine Nitratreduktion; vege- N itrat- tatives Mycel b.laßgelb bis N ährlösung hell lachsfarben Emersons-Agar gut spärlich, meist am hell gelbbraun (zwi- vegetatives :@lycel, farblos Rande und auf dem schen Ochraceous- bis rosalederfarben (zwi- Boden auftretend, Buff (R) und scheu Light Ochraceous- weiß Ochraceous- Salmon (R) und Salmon- Salmon (R)) Buff (R»; Oberfläche ge- wölbt ; am unteren Teil desSchrägnährbode-nsfeine Risse in der Nähe der Ränder und des Bodens; an Stellen, wo kein Luft- mycel, Oberfläche wachs- artig; Rückseite farblos bis lederfarbig (Ochra- ceous-Buff (R)) Aufstellung der Unterschiede zwischen der Kultur von S. griseus ATCC 12318 und der Beschreibung des S. griseus Medium S. griseus ATCC 12 318 S. griseus Glukose-Asparagin- Spiralen in Endbüscheln büschelförmige Sporenträger; spiralförmig Agar laut Originalbericht von K r a i n s k v und Krassilvikov Milch Koagulierung und Peptisation gleichzeitig, Koagulierung und rasche Peptisation aber Peptisation langsam erfolgend Dextrose-Nitrat- keine Reduktion zu Nitriten Reduktion Nährlösung Sporenfarbe hell wassergrün auf synthe- Luftmycel wassergrün tischem Agar und Calciummalat, aber durchweg beschrieben als Olive Buff (R) bis Avel.laneous (R) biotikum aus der Nährlösung bei einem pH-Wert von 2 durch Äther, Butylalkohol, Äthylacetat und Methylisobutylketon extrahiert wird. Durch Benzol und Chloroform wird es bei diesem pH-Wert teilweise, bei einem pH-Wert von 6,5 überhaupt nicht extrahiert. Auch erfolgt bei diesem pH-Wert geringe oder gar keine Extraktion mit Äther, jedoch mit Butylalkohol oder Methylisobutylketon und teilweise mit Äthylacetat. Bei einem PH-Wert von 9 extrahiert von den erwähnten Lösungsmitteln nur noch Butylalkohol die gewünschte Substanz.The antibiotic novobiocin is produced by culturing Streptomyces griseus ATCC No. 12318 in a nutrient medium under submerged aerobic conditions. The composition of this nutrient solution can vary within wide limits. Essentially, you need a source of carbohydrates, a source of nitrogen and traces of inorganic elements. Temperatures between about 25 and 35 ° are appropriate. In general, fermentation is allowed to take place over a period of one to several days, after which the antibiotic is separated. Using Micrococcus flavus for the qualitative investigation, it was shown that the anti- Medium Growth strength aerial mycelium Soluble pigment Remarks and sporulation Glucose moderate good, white to pale olive - none raised colonies with clear Asparagine leather-colored border delimited; vege- Agar tative mycelium, visible brownish spots pink (Buff-PINK (R)); Reverse pale yellow to light yellow-brown (almost clay Color (R)); Conidium in Shape from loose to moderate loose spirals; Conidial threads in the form of end tufts; the spores sat short cylinder shape, occasionally spherical 0.75 to 1.00 V 1.00 to 1.5 i Skimmed milk weak to no or little, warm leather-colored, simultaneous moderately whitish; Ring Light Buff (R)) until agulation and peptic creamy white to between light ocher- tion, but slowly salmon-colored leather-colored (light following peptization; pA- (Apricot Buff (R)) Ochraceous-Buff value alternated between (R)) and ocher- 6.3 and 6.6 to 6.7 leather-colored (ochra- ceous-Buff (R)) Glucose agar well sparse, mostly on the brownish-yellow, lighter vegetative, on the visible Margins appearing as raw sienna spots colorless mycelium; white (Raw Sienna (R)) reverse side colorless to light Leather colors Agar-nutritionally sparse to moderate, essentially none vegetative, in terms of visible Solution - white areas of colorless mycelium; Back side yellow Synthetic good good, slightly powdery, essentially no growth below the top Agar pale yellow olive (similar surface flat; reverse side -like Olive-Buff (R)) leather-colored (Warm Buff (R)) Calcium. Malate-good, cream-white until essentially no malate was consumed; Agar pale flohfa, do not turn vegetative mycelium (visible between olive; reverse ocher Buff (R) and colored (Ochraceous-Buff Avellaneous (R)) (R)) Cellulose weak to white moderate Potato good sparse, whitish to pale greyish tan vegetative mycelium, colorless Slanted white or tan to leather colors or leather culture media colored yellow; Surface fine wrinkled; Smell earthy Starch plates j weakly moderate, -white no zone of starch hydrolysis 2.0 to 3.2 cm diameter ser; mostly flat colonies; ! Back white to ocher salmon-colored (Light Ochra- ceous-Buff (R) to Ochra- ceous-Buff (R) and Apri- cot Buff (R)) Gelatine plates moderately good, no white zone of liquefaction 2.5 up to 3.2 cm in diameter; j no vegetative mycelium visible Medium Growth strength aerial mycelium Soluble pigment Remarks and sporulation Dextrose-moderately moderate, essentially none knows no nitrate reduction; vege- Nitrate mycelium blue-yellow to Nutrient solution light salmon-colored Emersons agar well sparse, mostly light yellow-brown (between vegetatives: @lycel, colorless Edge and on the ochraceous to rose leather colors (between Floor Treading, Buff (R) and Shy Light Ochraceous- white Ochraceous- Salmon (R) and Salmon- Salmon (R)) Buff (R »; surface bulges; on the lower part desSchrägnährbode-nsfeine Cracks near the Edges and bottom; in places where no air mycelium, surface waxy good; Colorless back to leather-colored (ochra- ceous-Buff (R)) List of the differences between the culture of S. griseus ATCC 12318 and the description of the S. griseus Medium S. griseus ATCC 12 318 S. griseus Glucose-asparagine spirals in end clusters, tufted spore carriers; spiral Agar according to the original report by K rainskv and Krassilvikov Milk coagulation and peptization at the same time, coagulation and rapid peptization but peptization is slow Dextrose nitrate - no reduction to nitrite reduction Nutrient solution Spore color light water green on synthetic aerial mycelium water green table agar and calcium malate, but consistently described as Olive Buff (R) to Avel.laneous (R) biotic is extracted from the nutrient solution at a pH of 2 by ether, butyl alcohol, ethyl acetate and methyl isobutyl ketone. At this pH value, it is partially extracted by benzene and chloroform, and not at all at a pH value of 6.5. Also at this pH value there is little or no extraction with ether, but with butyl alcohol or methyl isobutyl ketone and sometimes with ethyl acetate. At a pH value of 9, only butyl alcohol extracts the desired substance from the solvents mentioned.

In der Nährlösung besitzt Novobiocin bei Zimmertemperatur gute Beständigkeit. Bei einem PH-Wert von 2 ist es bei 15 Minuten dauernder Behandlung auf einem Dampfbad unbeständig. Bei einem pH-Wert von 6,5 und 9,0 ist es auf einem Dampfbad mindestens 15 Minuten lang beständig.Novobiocin has good stability in the nutrient solution at room temperature. If the pH value is 2, it will be treated on a steam bath for 15 minutes inconsistent. At a pH of 6.5 and 9.0 it is at least on a steam bath Persistent for 15 minutes.

Das Vorhandensein von L\Tovob.iocin in der Gärlösung wird durch Papierchromatographie nachgewiesen. Hierzu wird die Gärlösung zur Entfernung des Mycels zentrifugiert. Ein Tropfen der zentrifugierten Lösung wird dann auf ein Stück Whatman-Filterpapier Nr.4 gebracht und damit die Papierchromato.graphie durchgeführt. Das Chromatogramm wird getrocknet und auf eine bioautographischePlatte gebracht, die eine Kultur von Mycobakterium 607 enthält. Nach etwa 18stündiger Inkubationszeit wird das Vorhandensein von Novobiocin durch das Auftreten von Inhibitionszonen nachgewiesen. Durch Feststellung der Lage dieser Zonen kann die Lage von Novobiocin bestimmt werden. Durch Messen der Entfernung, die es von der Auftragstelle der Nährlösung zurückgelegt hat und Vergleich mit der von der Lösungsmittelfront zurückgelegten Entfernung werden die Rf-Wert.e bestimmt.The presence of L \ Tovob.iocin in the fermentation solution is determined by paper chromatography proven. For this purpose, the fermentation solution is centrifuged to remove the mycelium. A drop of the centrifuged solution is then placed on a piece of Whatman filter paper No. 4 and the paper chromatography was carried out with it. The chromatogram is dried and placed on a bioautographic plate containing a culture of Contains Mycobacterium 607. After about 18 hours of incubation, the presence becomes detected by Novobiocin by the appearance of zones of inhibition. By finding The position of Novobiocin can be determined from the position of these zones. By measuring the distance it has traveled from the application site of the nutrient solution and Comparison with the distance covered by the solvent front are the Rf-Wert.e determined.

Wird zur Entwicklung mit Wasser gesättigtes Bu.-tanol verwendet, dann erhält man einen Fleck, der in seinem Mittelpunkt einem Rf-Wert von etwa 0,70 entspricht. Wird als Lösungsmittel mit MTasser gesätti.gtes Butanol verwendet, das 2 Gewichtsprozent p-Toluolsulfonsäure und 2 Gewichtsprozent Pip.eridiii, bezogen auf das Volumen, enthält, dann wird ein Fleck erhalten, der in seinem Mittelpunkt einem Rf-Wert von etwa 0,65 entspricht. Diese Rf-Werte wurden in aufsteigenden Systemen erhalten.If buttanol saturated with water is used for development, then a spot is obtained which corresponds to an Rf value of about 0.70 at its center. If the solvent used is butanol saturated with MTasser, which is 2 percent by weight p-toluenesulfonic acid and 2 percent by weight Pip.eridiii, based on the volume, then a spot is obtained which has an Rf value of corresponds to about 0.65. These Rf values were obtained in ascending systems.

Es wurde nachgewiesen, daß das Antibiotikum nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff enthält und eine Säure darstellt, die mit Basen, wie. z. B. Natri.umhydroxyd und Ammoniumhydroxyd leicht Salze bildet. Diese Salze besitzen wie die Stammsäure ebenfalls antibiotische Wirkung. Säure und Salze eignen sich daher als Mikrobenbekämpfungsmittel. Sie sind wirksam gegenüber zahlreichen Organismen, zu denen M. flavus, K. pneumoniae, S. aureus, B. subtilis, S. fecalis, Brucella bTonchiseptica, Mycobacterium 607, Mycobacterium ranae und Aerobacter aerogenes gehören. Novobiocin und seine Salze eignen sich dort, wo eine Wachstumshemmung von Microorganismen erzielt werden soll, so bei der Sterilisierung von Einrichtungen und Gegenständen, z. B. von chirurgischen Instrumenten. Ferner eignen sie sich zur Klassifizierung von Organismen und zur Erzielung reiner Kulturen eines einzigen Organismus in. solchen Fällen, in denen ein empfindlicher Organismus von einem widerstandsfähigen zu trennen ist.It has been proven that the antibiotic only contains the elements carbon, Contains hydrogen, nitrogen and oxygen and represents an acid that is associated with Bases, like. z. B. sodium hydroxide and ammonium hydroxide easily forms salts. These Salts possess like the parent acid also has an antibiotic effect. Acids and salts are therefore suitable as microbe control agents. They are effective against numerous organisms, including M. flavus, K. pneumoniae, S. aureus, B. subtilis, S. fecalis, Brucella b Tonchiseptica, Mycobacterium 607, Mycobacterium ranae and Aerobacter aerogenes belong. Novobiocin and its salts are suitable there, where a growth inhibition of microorganisms is to be achieved, this is the case with sterilization of facilities and objects, e.g. B. of surgical instruments. Further they are suitable for classifying organisms and for achieving pure cultures of a single organism in those cases in which a sensitive organism is to be separated from a resilient one.

Novobiocin ist eine verhältnismäßig untoxische Substanz. 5 mg der Substanz können ohne schädliche Wirkung einem Eiembryo eingespritzt werden. 20 g wiegenden Mäusen können ohne nachteilige Wirkung parenteral 2 mg eingespritzt werden. Die hohe Aktivität von Novobiocin und dessen Salzen gegen Mikroben, verbunden mit der geringen Toxizität, legten die Amvendung dieser Verbindungen zur Behandlung von Mensch, Tier und Pflanze nahe. Daher wurde die Wirkung in Tierversuchen erprobt. Weißen Mäusen wurden pathogene Bakterien in einer Dosis eingespritzt, die bei unbehandelten Tieren innerhalb von 24 Stunden zum Tod führte. Andere Mäuse erhielten eine solche Einspritzung pathogener Bakterien unter gleichzeitiger teils oraler, teils subcutaner Verabreichung von \ovobiocin. Bei den beiden '#7erabreichungsarten schwankte die Dosis zwischen 6.2 mg je kg und 100 mg je kg. Das Antibiotikum lieferte bei beiden Verabreichungsarten guten Schutz gegen Staphylokokken, genügenden Schutz gegen Diplokokken und Streptokokken. und- leichten Schutz gegen Proteus. Besonders wichtig ist die Tatsache, daß eine oral verabreichte Dosis von nur 6,2 mg je kg ausgezeichneten Schutz gegen Staphylokokken, und zwar auch solchen Staphylokokkenstämmen bewirkte, die gegenüber den gewöhnlich verwendeten Antiobiotika resistent sind.Novobiocin is a relatively non-toxic substance. 5 mg of the substance can be injected into an egg embryo without harmful effects. Mice weighing 20 g can be injected parenterally with 2 mg with no adverse effect. The high activity of novobiocin and its salts against microbes, combined with the low toxicity, suggested the use of these compounds for the treatment of humans, animals and plants. The effect was therefore tested in animal experiments. White mice were injected with pathogenic bacteria at a dose that resulted in death within 24 hours in untreated animals. Other mice received such an injection of pathogenic bacteria with simultaneous partly oral and partly subcutaneous administration of ovobiocin. In the two types of administration, the dose varied between 6.2 mg per kg and 100 mg per kg. The antibiotic provided good protection against staphylococci and adequate protection against diplococci and streptococci in both modes of administration. and- light protection against Proteus. Of particular importance is the fact that an orally administered dose of only 6.2 mg per kg provided excellent protection against staphylococci, including those strains of staphylococci which are resistant to the antibiotics commonly used.

Novobiocin und dessen Salze können allein oder in Verbindung mit anderen Mitteln, die ähnliche oder ergänzende Wirkung besitzen, verwendet werden. Sie können auch zusammen mit einem sich für den jeweiligen Fall eignenden Träger verwendet werden. Geeignete Träger sind z. B. Stärke, Milchzucker und verschiedene Arten von Ton. Novobiocin selbst ist in Wasser verhältnismäßig unlöslich; einige seiner Salze, z. B. die Natrium- und Ammoniumsalze sind recht löslich und können in Lösung verwendet werden.Novobiocin and its salts can be used alone or in conjunction with others Agents that have a similar or complementary effect can be used. You can also used together with a carrier suitable for the respective case will. Suitable carriers are e.g. B. starch, lactose and various types of Volume. Novobiocin itself is relatively insoluble in water; some of its salts, z. B. the sodium and ammonium salts are quite soluble and can be used in solution will.

Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen keine Begrenzung der Erfindung darstellen, in deren Rahmen: viele Abwandlungen möglich sind. Beispiel 1 Sechzehn 300 ccm fassende Schüttelkolben, von denen jeder 100 ccm der folgenden Nährlösung enthielt, wurden mit einer Sporensuspension von Streptomyces griseus ATCC Nr. 12318, die auf einem Schräg nährboden aus EmersonrAgar erzeugt worden war, geimpft.The following examples are for illustrative purposes only and are not intended to be Represent the limitation of the invention, within the framework of which: many modifications are possible are. Example 1 Sixteen 300 cc shake flasks, each 100 cc the following nutrient solution contained, were with a spore suspension of Streptomyces griseus ATCC No. 12318, which is produced from Emersonr Agar on an inclined culture medium had been vaccinated.

Zusammensetzung der Nährlösung Stärke ................................. 10 g/1 N-Z-Amin B (Sheffields Warenzeichen für enzymatisches Stoffwechselprodukt von Kasein) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . 10 g/1 Curbay BG (Warenzeichen der US Industria.l Alcohols Division of National Distillers für Melasse-Gärungsrückstände) ..... 5 g/1 Ca. C 0s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 p11-Wert 7,0 Die Lösung wurde 2 Tage entwickelt, dann wurd jeweils 100 ccm dieses Impfstoffes in sechzehn 4-i-Krrlben gebracht, die mit mechanischer Rührvorrichtung versehen waren und je 21 der obigen Nährlösung enthielten. Nach 3tägigem Wachstum unter Belüftung bei 28° wurden die Lösungen zusammengebracht und: über ein Filterhilfsmittel filtriert. Die biologische Aktivität dieser Nährlösung wurde nach dem Standardtest mittels der Kreiszone auf Papier bestimmt. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Gegen M. flavus: 32,5 mm.; gegen B. subtilis: 17,5 mm; gegen Mycoba@cterium 607: 21,8 mm. Gegen Klebsiella pneumoniae zeigte die Nährlösung im Vergleich mit reinem Chloramphenicol in einem turbidimeitrischen Verfahren eine Wirksamkeit von 130 Chloromycetin-Einheiten je ccm. (Chloromycetirz ist das Warenzeichen der Firma Parke, Davis & Co. für Chloramphenicol).Composition of the nutrient solution Starch ................................. 10 g / 1 NZ-Amin B (Sheffields trademark for enzymatic Metabolite of casein). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 10 g / 1 Curbay BG (trademark of the US Industria.l Alcohols Division of National Distillers for molasses fermentation residues) ..... 5 g / 1 approx. C 0s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g / 1 p11 value 7.0 The solution was developed for 2 days, then 100 cc of this vaccine was placed in each of sixteen 4 liter baskets which were provided with mechanical stirrers and each contained 21 of the above nutrient solution. After 3 days of growth with aeration at 28 °, the solutions were brought together and: Filtered through a filter aid. The biological activity of this nutrient solution was determined according to the standard test using the circular zone on paper. The following results were obtained: Against M. flavus: 32.5 mm .; against B. subtilis: 17.5 mm; against Mycoba @ cterium 607: 21.8 mm. The nutrient solution showed an effectiveness of 130 chloromycetin units per ccm against Klebsiella pneumoniae in comparison with pure chloramphenicol in a turbidimetric process. (Chloromycetirz is the trademark of Parke, Davis & Co. for chloramphenicol).

Die filtrierte Lösung wurde durch Zugabe von Mineralsäure auf den pH-Wert 2 gebracht und zweimal mit 5 1 1INIethyl-isobutylketon extrahiert. Die extrahierte Nährlösung ergab gegenüber M. flavus nur eine Zone von 19 mm. Die Methyl-isobutylketon-Extrakte wurden zusammengegossen und im Vakuum auf ein Volumen von 275 ccm eingeengt. Das Konzentrat wurde dreimal mit je 7 5 ccm lo/oigerNatriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Natriumbicarbonatextrakte wurden zusammengegeben; diese Lösung zeigte gegen M. flavus eine Zone von 37 mm und besaß eine Wirksamkeit von 245 Chloromy cetin-Einheiten je ccm. Das Methyl - isobutylketon-Kanzentrat ewgab nach dieser Extraktion gegen M. flavus eine Zone von. 40,5 mm.The filtered solution was added to the Brought pH 2 and extracted twice with 5 1 1INIethyl-isobutylketon. The extracted Nutrient solution showed only a zone of 19 mm compared to M. flavus. The methyl isobutyl ketone extracts were poured together and concentrated in vacuo to a volume of 275 cc. That The concentrate was extracted three times with 75 ccm lo / o sodium bicarbonate solution each time. The sodium bicarbonate extracts were combined; this solution showed against M. flavus had a 37 mm zone and had a potency of 245 chloromycetin units per ccm. The methyl isobutyl ketone Kanzentrat ew gave against this extraction M. flavus a zone of. 40.5 mm.

Durch Extraktion. des Methyl-isobutylleton-(MIK)-Konzen,trats mit Natriumbicarbonat wird das Natriumsalz der freien Säure Novobiocin gebildet, das ursprünglich in der MIK-Lösung vorhanden war. Aus den obigen Angaben ist zu ersehen, daß sowohl die freie Säure wie das Natriumsalz eine starke Aktivität gegen Mikroben zeigten.By extraction. of the methyl isobutylletone (MIK) concentrate, entered with Sodium bicarbonate is made the sodium salt of the free acid novobiocin, which originally existed in the MIK solution. From the above information it can be seen that that both the free acid and the sodium salt have a strong activity against microbes showed.

Das MIK-Konzentrat wurde weiter dreimal mit je 75 ccm Wasser, das mit Ammoniak auf einen p$ Wert von 9,5 eingestellt worden war, extrahiert. Die ammoniakalische Lösung ergab gegen M. flavus eine Zone von 45 mm und zeigte, wie durch Versuche nachgewiesen wurde, 660 Chloromycetin-Einheiten je ccm. Nach dieser Extraktion ergab die MIK-Schicht gegen M. flavus eine Zone von 26,7 mm.The MIK concentrate was further mixed three times with 75 cc of water each time had been adjusted to a p $ value of 9.5 with ammonia, extracted. The ammoniacal Solution gave a zone of 45 mm against M. flavus and showed, as by experiments was detected, 660 chloromycetin units per ccm. After this extraction gave the MIK layer against M. flavus has a zone of 26.7 mm.

Die wäßrige Ammoniaklösung wurde mit Mineralsäure auf einen pH Wert von 2 eingestellt und mit Äther extrahiert. Nach der Ätherextraktion ergab die wäßrige Schicht gegenüber M. flavus eine Zone von 28,3 mm, während der Ätherextrakt eine Zone von 35,9 mm ergab. Die Ätherlösung wurde mit Ammoniakgas behandelt und lieferte 1,2 g eines weißen Niederschlags, der aus dem Ammoniumsalz von Novobiocin bestand. Dieses Ammoniumsalz zeigte eine Wirksamkeit von 895 Einheiten Chloromycetin j e mg. Beispiel 2 Streptomyces griseus ATCC Nr. 12318 wurde durch 3tägige Gärung bei 28° unter Belüftung und submersen Bedingungen in 75,61 Nährlösung der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung gezüchtet. Die Lösung wurde filtriert, mit Mineralsäure auf einen p$ Wert von 2 gebracht und zweimal mit je einem Viertel des Volumens an Methyl-isobutylketon extrahiert. Nach der zweiten Extraktion zeigte die Lösung geringe Aktivität gegenüber M. flavus. Die MIK-Extrakte wurden vereinigt und auf ein Volumen von 1500 ccm eingeengt. Die konzentrierte MIK-Lösung ergab gegen M. flavus eine Zone von 35 mm.The aqueous ammonia solution was adjusted to a pH of 2 with mineral acid and extracted with ether. After the ether extraction, the aqueous layer against M. flavus gave a zone of 28.3 mm, while the ether extract gave a zone of 35.9 mm. The ethereal solution was treated with ammonia gas and yielded 1.2 g of a white precipitate consisting of the ammonium salt of novobiocin. This ammonium salt showed an activity of 895 units of chloromycetin per mg. Example 2 Streptomyces griseus ATCC No. 12318 was grown by fermentation for 3 days at 28 ° with aeration and submerged conditions in 75.61 nutrient solution of the composition given in Example 1. The solution was filtered, brought to a p value of 2 with mineral acid and extracted twice with a quarter of the volume of methyl isobutyl ketone each time. After the second extraction, the solution showed little activity against M. flavus. The MIK extracts were combined and concentrated to a volume of 1500 cc. The concentrated MIK solution resulted in a 35 mm zone against M. flavus.

Das MIK-Konzentrat wurde dreimal mit je 400 ccm gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Natriumbicarbonatlösung zeigte gegenüber M. flavus eine Zone von 22,2 mm und besaß eine Wirksamkeit von 440 Choromycetin-Einheiten je ccm. Nach den Extraktionen mit Natriumbicarbonat ergab die MIK-Schicht eine Zone von 38,4 mm gegenüber M. flavus. Die MIK-Schicht wurde dreimal mit je 400 ccm Wasser, das mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt worden war, extrahiert. Die ammoniakalischen Extrakte wurden zusammengegossen und zeigten gegenüber M. flavus eine Zone von 40 mm sowie eine Wirksamkeit von 2190 Chloromycetin.-Einheiten je ccm. Der MIK-Rückstand ergab nach den Extraktionen mit Ammoniak gegenüber M. flavus eine Zone von 30,1 mm.The MIK concentrate was mixed three times with 400 ccm of saturated sodium bicarbonate solution each time extracted. The sodium bicarbonate solution showed a zone of against M. flavus 22.2 mm and had a potency of 440 choromycetin units per cc. After the Extractions with sodium bicarbonate gave the MIK layer a zone of 38.4 mm opposite M. flavus. The MIK layer was applied three times with 400 ccm of water each time, and that with ammonia adjusted to pH 9.5, extracted. The ammoniacal Extracts were poured together and showed a zone of 40 against M. flavus mm and an effectiveness of 2190 chloromycetin units per ccm. The MIK residue showed a zone of 30.1 against M. flavus after the extractions with ammonia mm.

Die ammoniakalische Lösung wurde mit Schwefelsäure auf einen p$-Wert von 2 eingestellt, wobei 6,5 g der rohen freien Säure in Form eines weißen Feststoffes ausfielen. Das Filtrat zeigte 10 Chloromycetin-Einheiten je ccm und ergab gegenüber M. flavus eine Zone von 25,7 mm.The ammoniacal solution was with sulfuric acid to a p $ value set of 2, with 6.5 g of the crude free acid in the form of a white solid failed. The filtrate showed 10 chloromycetin units per cc and gave opposite M. flavus a zone of 25.7 mm.

Der Niederschlag aus freier Säure wurde in Äther gelöst, dann wurde Ammonialcgas zugesetzt. Das Ammoniaksalz von Novobiocin fiel in Form eines Gummis aus, das in Wasser gelöst wurde. Die wäßrige Lösung wurde mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, worauf 3,5 g der freien Säure in Form eines weißen Feststoffes ausfielen, der 890 Chloromycetin-Einheiten je mg enthielt. Dieser weiße Feststoff zeigte Absorptionsmaxima im Ultraviolett bei 308 m g und 250 m #t" ein Minimum bei 270 m #t sowie einen Wendepunkt bei 289 m #t. Die Absorptionsmaxima im Infrarot lagen bei 3333, 2907, 1709, 1681, 1639, 1600, 1538, 1497, 1370, 1280, 1255, 1115, 1093, 992 und 971 cm-1. Im Eisenchloridtest zeigte Novobiocin eine grünlichbraune Farbe. Es erwies sich als eine Säure und bildete Salze mit einer großen Anzahl von sowohl anorganischen als auch organischen Basen, wie z. B. Trimethylamin, Benzylamin und Piperidin.The free acid precipitate was dissolved in ether, then was Ammonia gas added. Novobiocin's ammonia salt fell in the form of a gum that was dissolved in water. The aqueous solution was made up with sulfuric acid adjusted to a pH of 2, whereupon 3.5 g of the free acid in the form of a white Precipitated solid which contained 890 chloromycetin units per mg. This white one Solid showed absorption maxima in the ultraviolet at 308 m g and 250 m #t " Minimum at 270 m #t and a turning point at 289 m #t. The absorption maxima in the infrared were 3333, 2907, 1709, 1681, 1639, 1600, 1538, 1497, 1370, 1280, 1255, 1115, 1093, 992 and 971 cm-1. In the iron chloride test, novobiocin showed a greenish-brown color Colour. It turned out to be an acid and formed salts with a large number of both inorganic and organic bases, such as. B. trimethylamine, benzylamine and piperidine.

Novobiocin wurde chromatographisch in einer mit Tonerde gefüllten Säule gereinigt. Die Tonerde war zuvor mit Säure gewaschen worden. Das Antibiotikum wurde in einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat gelöst und auf die Tonerdesäule aufgegeben, aus der es mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat, das allmählich steigende Mengen Äthanol enthielt, eluiert wurde. Eine Probe des auf diese Weise gereinigten Stoffes wurde weiter durch Umkristallisieren aus wäßrigen Methanollösungen gereinigt. Das gereinigte Novobiocin hatte folgende physikalische Daten: Schmelzpunkt 153 bis 155°, optische Drehung [a]D = -53° (Methanol 0,10/0, Neutralisationsäquivalent = 642. Die Analyse ergab folgende Werte: Kohlenstoff . . . . . . . . . . . . 59,20 Gewichtsprozent Wasserstoff ............ 5,94 " Stickstoff .............. 4,33 " Sauerstoff (durch Diffe- renz) ................ 30,53 " In Methanol gelöst ergab das Antibiotikum das folgende UV-Spektrum: .ln,@,@ = 310 m @, (E,1 m 320) ; @wenaenunkt = 289 bis 290 m #t (El,' 2' 250) ; @ma@ = 246 m R, (El 285).Novobiocin was purified by chromatography in a column filled with clay. The clay had previously been washed with acid. The antibiotic was dissolved in a mixture of benzene and ethyl acetate and applied to the alumina column, from which it was eluted with a mixture of benzene and ethyl acetate containing gradually increasing amounts of ethanol. A sample of the fabric thus purified was further purified by recrystallization from aqueous methanol solutions. The purified Novobiocin had the following physical data: melting point 153 to 155 °, optical rotation [a] D = -53 ° (methanol 0.10 / 0, neutralization equivalent = 642. The analysis gave the following values: Carbon. . . . . . . . . . . . 59.20 percent by weight Hydrogen ............ 5.94 " Nitrogen .............. 4.33 " Oxygen (through diffe- renz) ................ 30.53 " The antibiotic, dissolved in methanol, gave the following UV spectrum: .ln, @, @ = 310 m @, (E, 1 m 320); @wenaenunkt = 289 to 290 m #t (El, ' 2 '250); @ ma @ = 246 m R, (El 285).

Es besaß außerdem ein Minimum bei 270m[,. Die Infrarot-Absorptionsmaxima (1% in KBr-Pellet) lagen bei: 3470, 3360, 2940, 2890, 1715, 1690, 1630, 1605, 1580, 1535, 1510, 1475, 1445, 1435, 1370, 1345, 1315, 1290, 1255, 1180, 1155, 1120, 1070, 1060, 1020, 1005, 995, 965, 930, 915, 835, 825, 815, 810, 790, 785, 765, 755 und 745 cm-1.It also had a minimum at 270m [. The infrared absorption maxima (1% in KBr pellet) were: 3470, 3360, 2940, 2890, 1715, 1690, 1630, 1605, 1580, 1535, 1510, 1475, 1445, 1435, 1370, 1345, 1315, 1290, 1255, 1180, 1155, 1120, 1070, 1060, 1020, 1005, 995, 965, 930, 915, 835, 825, 815, 810, 790, 785, 765, 755 and 745 cm-1.

Das Infrarotspektrum wird durch die Zeichnungen dargestellt, von denen Fig. 1 das Spektrum bei Frequenzen von 5000 bis 1100 cm-' und Fig. 2 bei Frequenzen von 1100 bis 625 cm-1 zeigt.The infrared spectrum is represented by the drawings of which Fig. 1 shows the spectrum at frequencies from 5000 to 1100 cm- 'and Fig. 2 at frequencies from 1100 to 625 cm-1.

Claims (1)

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Streptomyces griseus ATCC Nr. 12318 oder dessen Mutanten oder Varianten zur Herstellung des Antibiotikums Novobiocin auf biologischem Wege unter den üblichen Bedingungen, gegebenenfalls Gewinnung des Antibiotikums aus der Nährlösung und gegebenenfalls Überführung des Antibiotikums in seine Salze. In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschriften Nr. 2 449 866, 2 504 067, 2545554. PATENT CLAIM: The use of Streptomyces griseus ATCC No. 12318 or its mutants or variants for the production of the antibiotic novobiocin by biological means under the usual conditions, if necessary extraction of the antibiotic from the nutrient solution and if necessary conversion of the antibiotic into its salts. References considered: U.S. Patent Nos. 2,449,866, 2,504,067, 2545554.