DE10157721A1

DE10157721A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Info

Publication number: DE10157721A1
Application number: DE10157721A
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-11-24
Filing date: 2001-11-24
Publication date: 2003-06-05
Also published as: AU2002342763A1; WO2003046184A1; EP1448778B1; ATE536411T1; EP1448778A1; DK1448778T3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, in dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das csrA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, DOLLAR A b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das csrA-Gen verstärkt wird.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.

Das csrA-Gen wurde von Romeo et al. (Journal of Bacteriology 175(15), 4744-4755 (1993)) beschrieben. Es ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. In der US-A- 6,268,471 wird die Aminosäuresequenz des CsrA-Polypeptides gezeigt und die Wirkung auf die Bildung von Enzymen der Glykogenbiosynthese, der Gluconeogenese und der Glykolyse beschrieben. In der WO99/02721 wird die csrB-RNA und seine Wirkung auf die Expression des CsrA-Proteins beschrieben. In der WO00/73484 wird dargelegt, daß durch Senkung der verfügbaren Menge an funktionellem CSrA-Protein die Produktion der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan verbessert werden kann.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, und in denen die für das csrA-Gen kodierende insbesondere endogene Nukleotidsequenz verstärkt wird.

Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Histidin, L-Lysin und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin ist, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia, in denen man das csrA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert.

Das crsA-Gen und gegebenenfalls Allele des csrA-Gens werden unter Bedingungen überexprimiert, die geeignet sind, das CsrA-Protein zu bilden.

Weitere Schritte sind:

a) die Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
b) die Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100) davon im Produkt verbleiben.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.

Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression des csrA-Gens in verbesserter Weise nicht aromatische L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.

Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.

Das csrA-Gen wird unter anderem durch folgende Angaben beschrieben:
Bezeichnung: Regulator CsrA (carbon storage regulator A), RNA-bindendes Protein, globale regulatorische Funktion, kontrolliert Glycogen-Synthese, Gluconeogenese, Zellgröße und Oberflächeneigenschaften
Referenz: Romeo et al.; Journal of Bacteriology 175(15), 4744-4755 (1993)
Accession No.: AE000353

Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.

Das in der angegebenen Textstelle beschriebene Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression des Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Proteins erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens das csrA-Gen, oder dafür codierende Nucleotidsequenzen trägt.

Es ist ebenfalls möglich, gleichzeitig oder gegebenenfalls getrennt eine Überexpression des CsrA-Regulators durch Abschwächung des csrB-Gens zu erreichen.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) oder Ribonukleinsäuren (RNA's) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym oder eine entsprechende Ribonukleinsäure mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein), Gen oder Ribonukleinsäure inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder der entsprechenden Ribonukleinsäure im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins oder der Wildtyp-RNA, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins oder der RNA im Ausgangs- Mikroorganismus, herabgesenkt.

Es ist schließlich ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression oder Aktivität der jeweiligen Gene betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des csrA-Gens, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat oder Enzyme der Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609),
das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158 : 647-653 (1986)),
das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 10 03 4833.5),
das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8),
das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)), das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba- Gen (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose- Phosphotransferase, das PTS Enzym I und die Glucosespezifische IIA Komponente kodierende ptsHlcrr-Operon (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry 261 : 12414-12419 (1986)), das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
das für die Alkyl Hydroperoxid Reduktase Untereinheiten kodierende ahpCF-Operon (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995))
das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988))
das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB- Gen (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)), und
das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase, das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase und die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysJIH-Operon (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989))
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des csrA-Gens, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)),
das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research 14 (13), 5449-5460 (1986)),
das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Matsuoko und McFadden, Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988)),
das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase- Systems kodierende dgsA-Gen (Hosono et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256-251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Jahreis et al., Molecular and General Genetics 226, 332-336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist, und
das für den Sigma³⁸-Faktor kodierende rpoS-Gen (WO 01/05939), das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist,
abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.

Dies geschieht unter Bedingungen, die für die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der entsprechenden Enzyme geeignet sind.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des csrA-Gens, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie beispielsweise L- Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, dass die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das csrA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, fermentiert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man gleichzeitig oder gegebenenfalls getrennt das CsrA-Protein durch Abschwächung des csrB-Gens überexprimiert.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man gegebenenfalls gleichzeitig das csrA-Gen oder seine Allele unter Bedingungen exprimiert, die geeignet sind, das CSrA-Protein zu bilden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das crsB-Gen oder seine Allele unter Bedingungen abschwächt, die geeignet sind, das CsrA-Protein zu bilden.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende weitere Schritte durchführt:

a) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und

b) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100) davon im Produkt verbleiben.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des Polynukleotides, das für das csrA-Gen kodiert, erhöht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften des Polypeptides (Proteins) verbessert oder erhöht, für die das Polynukleotid csrA kodiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L- Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 10.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,

2. 10.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen,

3. 10.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen,

4. 10.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen,

5. 10.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB,

6. 10.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,

7. 10.7 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,

8. 10.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC,

9. 10.9 das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen,

10. 10.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen,

11. 10.11 das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen,

12. 10.12 das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm- Gen,

13. 10.13 das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba-Gen,

14. 10.14 das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose- Phosphotransferase, das PTS Enzym I und die Glucose-spezifische IIA Komponente kodierende ptsHIcrr-Operon,

15. 10.15 das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen,

16. 10.16 das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen,

17. 10.17 das für die Alkyl Hydroperoxid Reduktase Untereinheiten kodierenden ahpCF-Operon,

18. 10.18 das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK- Gen,

19. 10.19 das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen, und

20. 10.20 das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit- Reduktase, das Hämoprotein der NADPH-Sulfit- Reduktase und die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysJIH-Operon

verstärkt, insbesondere überexprimiert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 11.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen,

2. 11.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen,

3. 11.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA,

4. 11.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP,

5. 11.5 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen,

6. 11.6 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen,

7. 11.7 das für die Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen,

8. 11.8 das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen,

9. 11.9 das für den Fructose-Repressor kodierende fruR- Gen, und

10. 11.10 das für den Sigma³⁸-Faktor kodierende rpoS-Gen

abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.

12. Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia, in denen das csrA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert.