DE10155843A1 - Procedure for the prognosis and diagnosis of heart failure - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose von Herzversagen oder Herzinsuffizienz und gegebenenfalls des Bedarfs einer vorbeugenden Behandlung, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Menge an Relaxinpeptiden oder Fragmenten oder Isoformen hiervon in einer Probe der Körperflüssigkeit bestimmt wird. Es wird ein Verfahren bereitgestellt unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die Peptide oder Fragmente oder Isoformen von Relaxin binden.The invention relates to a method for the diagnosis or prognosis of heart failure or heart failure and possibly the need for preventive treatment, which is characterized in that the amount of relaxin peptides or fragments or isoforms thereof is determined in a sample of the body fluid. A method is provided using polyclonal or monoclonal antibodies that bind peptides or fragments or isoforms of relaxin.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose von Herzversagen oder Herzinsuffizienz und der Notwendigkeit einer prophylaktischen Behandlung. The invention relates to a method for diagnosis or prognosis of heart failure or heart failure and the need prophylactic treatment.

Bei einer Herzinsuffizienz (oder Herzversagen) kann das Herz nicht mehr genügend Blut durchpumpen, um den Bedarf der anderen Körperorgane zu befriedigen. Ursachen können sein eine Verengung der Arterien, die den Herzmuskel mit Blut versorgen, Erkrankungen der Herzarterien, frühere Herzattacken oder ein Myokardinfarkt mit vernarbtem Gewebe, das die normale Arbeit des Herzmuskels beeinträchtigt, hoher Blutdruck, Herzventilerkrankung aufgrund eines früheren rheumatischen Fiebers oder anderer Ursachen, primäre Erkrankungen des Herzmuskels selbst, auch Kardiomyopathie genannt, Herzdefekten aufgrund eines Geburtsfehlers-Herzinsuffizienz (Congenital Heart Disease), eine Infektion der Herzventile und/oder des Herzmuskels, Endokarditis und/oder Myokarditis. Personen mit einem Herzfehler können sich nicht mehr bewegen, da sie sonst kurzatmig werden und ermüden. Der Blutfluss aus dem Herzen wird langsamer und der Blutrückfluss zum Herzen durch die Venen staut sich zurück, was zu einem Stau in den Geweben führt. Dies führt oft zu Schwellungen oder Ödemen, gewöhnlich in den Füßen oder Knöcheln, aber auch in anderen Teilen des Körpers. Manchmal sammelt sich in den Lungen Flüssigkeit, was die Atmung beeinträchtigt und eine Kurzatmigkeit bedingt, insbesondere, wenn die Personen liegen. Das Versagen des Herzens beeinträchtigt auch die Funktion der Nieren und deren Ausscheidung von Natrium und Wasser. Das zurückgehaltene Wasser vergrößert die Ödeme. With heart failure (or heart failure) the heart can not pumping enough blood to meet the needs of others To satisfy body organs. Causes can be one Narrowing of the arteries that supply blood to the heart muscle, Cardiac artery disorders, previous heart attacks or a Myocardial infarction with scarred tissue, which is normal work of the heart muscle, high blood pressure, Heart valve disease due to a previous rheumatic fever or other causes, primary diseases of the heart muscle itself, also called cardiomyopathy, due to heart defects a congenital heart failure Disease), an infection of the heart valves and / or the Heart muscle, endocarditis and / or myocarditis. People with a Heart defects can no longer move because they would otherwise become short of breath and tire. The blood flow from the heart slows down and the blood return to the heart through the Veins back up, causing a jam in the tissues leads. This often leads to swelling or edema, usually in the feet or ankles, but also in other parts of the Body. Sometimes fluid collects in the lungs, which affects breathing and causes shortness of breath, especially when the people are lying down. The failure of the Heart also affects the functioning of the kidneys and their Excretion of sodium and water. The retained water increases the edema.

Die bekanntesten Zeichen für eine Herzinsuffizienz sind geschwollene Füße oder Knöchel oder Probleme mit der Atmung. Weitere Symptome sind eine Zunahme des Gewichts wegen der Ansammlung von Flüssigkeit. Herzinsuffizienz verlangt in der Regel ein Behandlungsprogramm aus Ruhe, passender Diät, angepassten täglichen Aktivitäten, Medikamenten wie ACE oder Inhibitoren für Angiotensin umwandelnde Enzyme, manche Beta- Blocker wie bspw. Carvedilol, Digitalis, Diuretika, Vasodilatoren. Die zur Behandlung von Herzinsuffizienz verwendeten Medikamente erfüllen verschiedene Funktionen. Die ACE-Inhibitoren und Vasodilatoren erweitern die Blutgefäße und vermindern den Widerstand, so dass das Blut leichter fließen und das Herz leichter und effizienter arbeiten kann. Beta-Blocker verbessern die Funktion der linken Herzkammer. Digitalis erhöht die Pumpleistung des Herzens, wohingegen Diuretika mithelfen, überschüssiges Salz und Wasser aus dem Körper zu eliminieren. Wird eine bestimmte Ursache für die Herzinsuffizienz entdeckt, so sollte sie behandelt oder, falls möglich, korrigiert werden. In manchen Fällen kann die Herzinsuffizienz beispielsweise durch eine Behebung des Bluthochdrucks behandelt werden. Einige Fälle können auch chirurgisch behandelt werden durch Ersatz der fehlerhaften Herzventile. Die meisten Fälle einer leichten oder moderaten Herzinsuffizienz sind behandelbar. Es besteht aber das Problem, dass leichte oder moderate Herzinsuffizienz undiagnostiziert bleibt, sofern sich die Patienten nicht einer körperlichen Untersuchung unterziehen. The most common signs of heart failure are swollen feet or ankles or breathing problems. Other symptoms include an increase in weight because of that Accumulation of fluid. Heart failure requires in the Usually a treatment program from rest, appropriate diet, adapted daily activities, medications like ACE or Inhibitors of angiotensin converting enzymes, some beta Blockers such as carvedilol, digitalis, diuretics, Vasodilators. The used to treat heart failure Medicines perform different functions. The ACE inhibitors and vasodilators dilate and diminish blood vessels the resistance so that the blood flow more easily and that Heart can work more easily and efficiently. Beta blockers improve the function of the left ventricle. Digitalis increased the pumping power of the heart, whereas diuretics help to eliminate excess salt and water from the body. If a specific cause of heart failure is discovered, this is how it should be treated or, if possible, corrected. In some cases, for example, heart failure by treating high blood pressure. Some Cases can also be treated surgically with replacement defective heart valves. Most cases are easy or moderate heart failure are treatable. It exists but the problem is that mild or moderate heart failure remains undiagnosed unless the patient is one undergo physical examination.

Herzinsuffizienz ist gekennzeichnet durch eine komplexe neurohumorale Aktivierung, verbunden mit einem Hochfahren von gefäßverengenden und salzzurückhaltenden Mediatoren und einer kompensatorischen Erhöhung von gegenregulierenden Hormonen. Es ist daher Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur frühen Diagnose und Prognose von Herzinsuffizienz bereitzustellen, das nicht auf einer körperlichen Untersuchung oder auf allgemeinen Risikofaktoren beruht. Heart failure is characterized by a complex neurohumoral activation associated with booting up vasoconstricting and salt-retaining mediators and one compensatory increase in counter-regulating hormones. It is therefore the aim of the invention, a method for early diagnosis and to provide prognosis of heart failure that is not on a physical exam or on general Risk factors based.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine neue medizinische Indikation für Relaxinpeptide und Fragmente hiervon. This object is achieved by the method according to claim 1. Preferred embodiments of the invention are in the dependent claims described. Another aspect of Invention is a new medical indication for Relaxin peptides and fragments thereof.

Wir zeigen hier, dass Relaxin (RLX) - auch bekannt als das Schwangerschaftshormon - ein wirksamer gegenwirkender Mediator beim menschlichen Herzversagen ist. Die Konzentrationen von RLX im Plasma und die Myokardexpression der zwei RLX-Gene (H1 und H2) gehen einher mit der Schwere der Erkrankung. Das versagende menschliche Herz ist eine wichtige Quelle für RLX- Peptide im Blutkreislauf und Myozyten sowie interstitielle Zellen produzieren RLX. Die Erhöhung des ventrikulären Fülldrucks fährt die Expression von RLX hoch. Das Hormon ist dann ein potenter Inhibitor für das Endothelin-1, welches der wichtigste und stärkste Vasokonstriktor bei Herzversagen ist. Weiterhin moduliert das RLX die Wirkung von Angiotensin-II, einem weiteren wichtigen Mediator. Unsere Daten zeigen, dass RLX beim menschlichen Herzversagen involviert ist und potentielle diagnostische sowie therapeutische Relevanz hat. We show here that Relaxin (RLX) - also known as that Pregnancy hormone - an effective counteracting mediator in human heart failure. The concentrations of RLX in plasma and myocardial expression of the two RLX genes (H1 and H2) are associated with the severity of the disease. The failing human heart is a major source of RLX Peptides in the bloodstream and myocytes as well as interstitial Cells produce RLX. The increase in ventricular Filling presses up the expression of RLX. The hormone is then a potent inhibitor of endothelin-1, which the most important and strongest vasoconstrictor in heart failure is. Furthermore, the RLX modulates the action of angiotensin-II, another important mediator. Our data show that RLX is involved in human heart failure and has potential diagnostic and therapeutic relevance.

Relaxin (RLX) ist ein Peptidhormon aus der Insulinfamilie. Wie Insulin besteht es aus einer α- und einer β-Kette, die über zwei Disulfidbrücken¹ miteinander verbunden sind. Die zwei menschlichen Gene für H1- und H2-Relaxin wurden in den 80er Jahren identifiziert^{2, 3}. Bei der Frau wird das H2-Gen im Corpus luteum, im Endometrium, in der Plazenta und in der Brust exprimiert; H1 mRNA wird nur in der Plazenta gefunden. Bei Männern wurde bislang eine H1- und H2-Expression nur in der Prostata¹ gefunden. Im Human-Plasma wird nur H2-RLX gefunden⁴; höchste Spiegel liegen vor während der Schwangerschaft und der zweiten Phase des Menstruationszyklus⁵. Wenngleich man die Bedeutung des RLX in der Physiologie der menschlichen Reproduktion seit langem kennt^{6, 7}, weiß man nur aus einigen Rattenversuchen mit exogener RLX, dass dieses Peptide auch eine Funktion im Herz-Kreislaufsystem hat und zwar wegen seiner gefäßerweiterten, diuretischen und zentralen hämodynamischen Wirkungen^{4, 8}. Darüber hinaus spielt das RLX als Hormon eine Rolle. Es wird zurzeit diskutiert⁹, ob es für das niedrige ischämische Risiko bei schwangeren Frauen verantwortlich ist. Relaxin (RLX) is a peptide hormone from the insulin family. Like insulin, it consists of an α and a β chain, which are connected to one another via two disulfide bridges ¹ . The two human genes for H1 and H2 relaxin were identified in the 1980s ^{2, 3} . In women, the H2 gene is expressed in the corpus luteum, in the endometrium, in the placenta and in the breast; H1 mRNA is only found in the placenta. H1 and H2 expression has so far only been found in prostate ^{1 in} men. Only H2-RLX is found in human plasma ⁴ ; highest levels are present during pregnancy and the second phase of the menstrual cycle ⁵ . Although the importance of the RLX in the physiology of human reproduction has long been known ^{6, 7} , it is only known from a few rat experiments with exogenous RLX that this peptide also has a function in the cardiovascular system because of its vasodilated, diuretic and central hemodynamic Effects ^{4, 8} . The RLX also plays a role as a hormone. It is currently under discussion ⁹ whether it is responsible for the low ischemic risk in pregnant women.

Herzinsuffizienz zeichnet sich aus durch eine komplexe neurohumorale Aktivierung und eine Hochregulierung gefäßverengender und salzrückhaltender Mediatoren, bspw. der Catecholamine, von Angiotensin-II, von Endothelin-1 und von Vasopressin. Die neurohumorale Aktivierung bedingt auch einen kompensatorischen Anstieg gefäßerweiternder und natriuretischer Mediatoren: bspw. der atrial und brain-natriuretic peptides wie auch von Adrenomedullin¹⁰ Bislang wurde weder die Beteiligung von RLX bei diesen neuroendokrinen Veränderungen noch dessen Expression im menschlichen Herz-Kreislaufsystem untersucht. Das Hormon ist aber ein neuer Kandidat für die oben genannten kardiovaskulären Wirkungen, wie sie in Tierversuchen beobachtet werden. Die Untersuchung hierin stellt klinische und experimentelle Daten vor, welche die Rolle von RLX als ein neuer Beteiligter bei menschlichen Herzversagen aufdecken. Heart failure is characterized by complex neurohumoral activation and upregulation of vasoconstricting and salt-retaining mediators, e.g. catecholamines, angiotensin-II, endothelin-1 and vasopressin. The neurohumoral activation also requires a compensatory increase in vasodilator and natriuretic mediators: e.g. the atrial and brain-natriuretic peptides as well as adrenomedullin ^10. So far, neither the involvement of RLX in these neuroendocrine changes nor its expression in the human cardiovascular system has been investigated. However, the hormone is a new candidate for the above-mentioned cardiovascular effects, as are observed in animal experiments. The study herein presents clinical and experimental data that reveal the role of RLX as a new participant in human heart failure.

Anstieg von RLX im Plasma bei menschlichem Herzversagen und die Reaktion auf akute hämodynamische VerbesserungenRLX increase in plasma in human heart failure and the response to acute hemodynamic improvements

Wir haben zunächst die RLX-Peptidspiegel in der Zirkulation als Funktion hämodynamisch definierter Krankheitsgrade untersucht (siehe Methodenteil). Patienten mit moderater Herzinsuffizienz besaßen signifikant höhere systemische und pulmonare Gefäßwiderstände als gesunde Personen (Tabelle 1). Je nach Messstelle (linkes Ventrikel, Lungenarterie, Sinus coronarius oder Vena antecubital) waren die RLX-Plasmaspiegel bei moderater Herzinsuffizienz (Fig. 1a) 4 bis 6mal gegenüber den Kontrollpatienten erhöht. Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz zeichneten sich aus durch drastisch höhere Lungendrucke und Lungengefäßwiderstände sowie durch einen deutlich niedrigeren Herzindex als Patienten mit einer moderaten Herzinsuffizienz (Tabelle 1). Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz besaßen 2,2 bis 2,6mal höhere RLX-Spiegel als Patienten mit moderater Herzinsuffizienz. Gegenüber den Kontrollen waren die Spiegel ca. 12 bis 16mal erhöht. Zur Identifizierung der hämodynamischer Determinanten der RLX- Spiegel erfolgten Regressionsanalysen. Diese zeigen eine enge Korrelation zwischen RLX und dem linken Ventrikelfülldruck (r = 0,69, P < 0,001) sowie dem Herzindex (r = -0,62, P < 0,001). We first examined the RLX peptide levels in the circulation as a function of hemodynamically defined degrees of disease (see method part). Patients with moderate heart failure had significantly higher systemic and pulmonary vascular resistance than healthy individuals (Table 1). Depending on the measuring point (left ventricle, pulmonary artery, coronary sinus or antecubital vein), the RLX plasma levels were increased 4 to 6 times compared to the control patients with moderate heart failure ( Fig. 1a). Patients with severe heart failure were characterized by drastically higher lung pressures and pulmonary vascular resistance, and by a significantly lower heart index than patients with moderate heart failure (Table 1). Patients with severe heart failure had 2.2 to 2.6 times higher RLX levels than patients with moderate heart failure. The levels were increased about 12 to 16 times compared to the controls. Regression analyzes were carried out to identify the hemodynamic determinants of the RLX levels. These show a close correlation between RLX and the left ventricular filling pressure (r = 0.69, P <0.001) and the heart index (r = -0.62, P <0.001).

Elf von 14 Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz (d. h. 79%) besaßen höhere RLX-Plasmaspiegel im Koronarsinus als in der linken Herzkammer (Fig. 1b). Dieser Befund zeigt, dass bei der Mehrzahl der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz RLX im Koronarsystem netto abgegeben wird. Eleven out of 14 patients with severe heart failure (ie 79%) had higher RLX plasma levels in the coronary sinus than in the left ventricle ( Fig. 1b). This finding shows that in the majority of patients with severe heart failure, RLX is released net in the coronary system.

Wir behandelten dann beide Herzinsuffizienz-Patientengruppen 12 Stunden mit gefäßerweiterndem Natriumnitroprussid. Bei den Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz führte diese Behandlung zu einer signifikanten Änderung des mittleren arteriellen Drucks (nach 2 Stunden: -23 ± 2% der Grundwerte), des mittleren Pulmonalarteriendrucks (-39 ± 3%), des Pulmonal- Kapillarabschlussdrucks PCWP (pulmonary capillary wedge pressure) (-46 ± 2%) und des systemischen (-65 ± 5%) sowie Lungengefäßwiderstands (-52 ± 3%). Die Ergebnisse für den Herzindex zeigten eine erhebliche Erhöhung (+70 ± 3%). Maximale hämodynamische Wirkungen wurden bereits erreicht innerhalb der ersten zwei Stunden der Behandlung. Diese akute gefäßerweiternde Therapie bewirkte einen verzögerten Anstieg des Plasma-RLX. Dieser war 48 Stunden nach Beginn der Therapie erfassbar (Fig. 1b). Bei Patienten mit moderater Herzinsuffizienz war nur die Abnahme des mittleren arteriellen Drucks (2 Stunden: -30 ± 1%) und des systemischen Gefäßwiderstands (3 Stunden: -53 ± 3%) signifikant. Bei diesen Patienten änderte sich über 48 Stunden die RLX-Plasmakonzentration nicht, im Gegensatz zu Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz. We then treated both groups of heart failure patients with vasodilator sodium nitroprusside for 12 hours. In patients with severe heart failure, this treatment resulted in a significant change in mean arterial pressure (after 2 hours: -23 ± 2% of baseline), mean pulmonary artery pressure (-39 ± 3%), and pulmonary capillary pressure PCWP (pulmonary capillary wedge pressure) (-46 ± 2%) and systemic (-65 ± 5%) and pulmonary vascular resistance (-52 ± 3%). The heart index results showed a significant increase (+70 ± 3%). Maximum hemodynamic effects were achieved within the first two hours of treatment. This acute vasodilator therapy delayed the increase in plasma RLX. This was detectable 48 hours after the start of therapy ( Fig. 1b). In patients with moderate heart failure, only the decrease in mean arterial pressure (2 hours: -30 ± 1%) and systemic vascular resistance (3 hours: -53 ± 3%) was significant. In these patients, the RLX plasma concentration did not change over 48 hours, in contrast to patients with severe heart failure.

Erhöhte H1- und H2-Genexpression im Vorhof- und Ventrikelgewebe des versagenden HerzensIncreased H1 and H2 gene expression in the atrial and ventricular tissues of the failing heart

Da bislang eine RLX-Genexpression in Humangeweben des Herz- Kreislaufsystems nicht beschrieben wurde, suchten wir nach möglichen RLX-Quellen im Herz-Kreislaufsystem. Mithilfe der RT-PCR konnten wir bei Patienten mit normalen Herzfunktionen sowohl H1- und H2-mRNA in der linken Herzkammer, im rechten Vorhof, in den Brustarterien sowie in der Vena saphena nachweisen (Fig. 2). Diese Untersuchungen legen eine konstitutive H1- und H2-Genexpression in diesen Geweben nahe. Insbesondere in den Gefäßen fanden wir ein 101-bp großes spezifisches PCR- Produkt, welches eine Splicingform der H1- und H2-mRNA darstellt, wie beschrieben von Gunnersen et al. für menschliche Plazenta und Prostata¹¹. Die Sequenzierung der verschiedenen PCR-Produkte (H1, H2 und der Splicingform) bestätigten deren Spezifität. Since an RLX gene expression in human tissues of the cardiovascular system has not yet been described, we looked for possible RLX sources in the cardiovascular system. Using RT-PCR, we were able to detect H1 and H2 mRNA in the left ventricle, in the right atrium, in the thoracic arteries and in the saphenous vein in patients with normal cardiac function ( Fig. 2). These studies suggest constitutive H1 and H2 gene expression in these tissues. In particular, we found a 101-bp specific PCR product in the tubes, which is a splicing form of the H1 and H2 mRNA, as described by Gunnersen et al. for human placenta and prostate ¹¹ . The sequencing of the different PCR products (H1, H2 and the splicing form) confirmed their specificity.

Wir untersuchten dann, ob das Auftreten von Herzinsuffizienz begleitet ist von einer erhöhten RLX-Genexpression in den Myokard- und den Gefäßgeweben, d. h., im Vergleich zu den oben genannten Kontrollgeweben (Fig. 2). Hierzu wurde die mRNA- Expression durch Southern-Blotting der PCR-Produkte quantifiziert. Wir fanden, dass in Proben aus dem linken Ventrikel des versagenden Herzens die GAPDH-normalisierte H1-mRNA signifikant erhöht war (bei Herzversagen mit 14,4 ± 2,4 zu gesunden Herzen mit 1,0 ± 0,5 gewillkürte Einheiten; P < 0,05). Die H2-mRNA war moderat erhöht (2,6 ± 0,4 zu 1,0 ± 0,1 Einheiten; P < 0,05). Die H1-Expression war moderat erhöht im rechten Vorhof bei Herzversagen, verglichen zu Proben aus gesunden Herzen (2,1 ± 0,4 gegenüber 1,0 ± 0,2 Einheiten; P < 0,05). Die Ergebnisse für H2-mRNA aus rechtem Vorhof waren zudem deutlich erhöht bei insuffizienten Herzen (3,8 ± 1,0 gegenüber 1,0 ± 0,1 Einheiten, P < 0,05). Im Gegensatz dazu unterschied sich bei Patienten mit normalen Herzfunktionen und Patienten mit Herzinsuffizienz die Expression der RLX-mPNA- Typen nicht signifikant in den Brustarterien und der Vena saphena. We then examined whether the occurrence of heart failure was accompanied by an increased RLX gene expression in the myocardial and vascular tissues, ie in comparison to the control tissues mentioned above ( FIG. 2). For this, the mRNA expression was quantified by Southern blotting of the PCR products. We found that in samples from the left ventricle of the failing heart, the GAPDH-normalized H1 mRNA was significantly increased (in heart failure with 14.4 ± 2.4 to healthy hearts with 1.0 ± 0.5 randomized units; P < 0.05). The H2 mRNA was moderately increased (2.6 ± 0.4 to 1.0 ± 0.1 units; P <0.05). H1 expression was moderately increased in the right atrium in heart failure compared to healthy heart samples (2.1 ± 0.4 versus 1.0 ± 0.2 units; P <0.05). The results for H2 mRNA from the right atrium were also significantly increased in inadequate hearts (3.8 ± 1.0 versus 1.0 ± 0.1 units, P <0.05). In contrast, the expression of the RLX-mPNA types did not differ significantly in the chest arteries and the saphenous vein in patients with normal cardiac function and patients with heart failure.

Erfassung von proRLX-Protein und die Genexpression des prozessierten EnzymsDetection of proRLX protein and gene expression of the processed enzyme

Zwei unabhängige methodische Ansätze wurden verwendet, um die Expression des RLX-Proteins in verschiedenen Humangeweben zu verifizieren. Zunächst wurden für eine Western-Blot-Analyse Proben aus dem rechten Vorhofund dem linken Ventrikel von sowohl gesunden als auch insuffizienten Herzen genommen (Fig. 3). Die Analyse deckte ein Band mit der Größe für Prorelaxin (~18 kDa)¹² in allen Proben. Wir konnten ferner nachweisen, dass exogenes reifes H1 und H2 in unserer Versuchsanlage auch erkannt wurden, aber dass die Gewebespiegel offensichtlich unterhalb der Erfassungsgrenze lagen. Die Konzentration von Prorelaxin im Gewebe (normalisiert zu α-Actin) war etwa zweifach bei einem insuffizienten rechten Vorhof (2,3 ± 0,2 gegenüber 1,0 ± 0,2 willkürliche Einheiten). Two independent methodological approaches were used to verify the expression of the RLX protein in different human tissues. First, samples from the right atrium and left ventricle were taken from both healthy and insufficient hearts for Western blot analysis ( Fig. 3). The analysis covered a band with the size for prorelaxin (~ 18 kDa) ¹² in all samples. We were also able to demonstrate that exogenous mature H1 and H2 were also detected in our test facility, but that the tissue levels were obviously below the detection limit. The concentration of prorelaxin in the tissue (normalized to α-actin) was approximately twice in an insufficient right atrium (2.3 ± 0.2 versus 1.0 ± 0.2 arbitrary units).

Da die Prohormon-Convertase-1 (PC-1, auch bezeichnet als PC- 1/3) das proRLX¹² prozessiert, untersuchten wir deren mRNA- Expression im Gewebe des rechten Vorhofs und der linken Herzhammer. Wenngleich eine Expression der PC nur für neuroendokrine Humangewebe (Hirn, Hirnanhangdrüse und Nebennierendrüsen, Pankreas)^{12, 13} beschrieben ist, konnten wir klar PC-1-mRYA in gesunden und insuffizienten Vorhof- und Ventrikelgeweben sowie in den Gefäßen (Fig. 3) nachweisen. Ferner konnten wir zeigen, dass die mRNA-Expression des RLX-prozessierenden Enzyms bei Herzinsuffizienz geregelt ist: Die Transkriptspiegel waren gleichförmig niedriger bei einem insuffizienten rechten Vorhof verglichen zu nichtinsuffizienten Geweben. Bei einem insuffizienten linksventikulären Myokard konnten wir aber eine breitere Spanne an PC1-mRNA-Expression beobachten, wohingegen nicht-insuffiziente linke Ventrikel PC1-mRNA gleichförmig exprimierten. Since prohormone convertase-1 (PC-1, also known as PC-1/3) processes the proRLX ¹² , we examined its mRNA expression in the tissue of the right atrium and the left heart hammer. Although expression of PC is only described for neuroendocrine human tissue (brain, pituitary gland and adrenal glands, pancreas) ^{12, 13} , we were able to clearly detect PC-1-mRYA in healthy and insufficient atrial and ventricular tissues as well as in the vessels ( Fig. 3) , We were also able to show that the mRNA expression of the RLX-processing enzyme is regulated in heart failure: the transcript levels were uniformly lower in an insufficient right atrium compared to non-insufficient tissues. In an insufficient left ventricular myocardium, however, we observed a wider range of PC1 mRNA expression, whereas non-insufficient left ventricles expressed PC1 mRNA uniformly.

Immunolokalisierung von RLX in MyokardgewebeImmunolocation of RLX in myocardial tissue

Die Immunofärbung verbunden mit einer Hematoxylin- und Eosin- Gegenfärbung des insuffizienten linksventrikulären Gewebes zeigte RLX-Immunoreaktivität in Myozyten und interstitiellen Zellen (Fig. 4). Die Myozyten zeigten ein diskretes granuläres Färbungsmuster entsprechend für das Corpus luteum und Endometrium¹⁴. Interstitielle Zellen waren jedoch homogener gefärbt. Ferner konnte die RLX-Immunoreaktivität durch Immunofluoreszenz in Myokard- und Gefäß-Gefrierschnitten verifiziert werden (Fig. 4b). The immunostaining combined with hematoxylin and eosin counterstaining of the insufficient left ventricular tissue showed RLX immunoreactivity in myocytes and interstitial cells ( FIG. 4). The myocytes showed a discrete granular staining pattern corresponding to the corpus luteum and endometrium ¹⁴ . However, interstitial cells were stained more homogeneously. Furthermore, the RLX immunoreactivity could be verified by immunofluorescence in myocardial and vascular frozen sections ( FIG. 4b).

Hochregulierung der RLX-Expression durch erhöhten FülldruckUp-regulation of RLX expression through increased filling pressure

Zur Überprüfung der Hypothese, dass die Myokarderweiterung den höheren Fülldrucken entspricht und der Schlüssel für die RLX-Regulierung ist, perforierten wir isolierte Rattenherzen zwei Stunden unter Bedingungen für normale und erhöhte enddiastolische linksventrikuläre Drucke (normaler LVEDP = 5 mm Hg; erhöhter LVEDP = 25 mm Hg). Entsprechend stellten wir in einer weiteren Versuchsgruppe normale (5 mm Hg) oder erhöhte mittlere rechte bzw. linke Vorhofdrucke ein (Fig. 5). Wir fanden, dass erhöhte LVEDP gegenüber Normalwerten eine merkliche Hochregulierung der RLX-Genexpression bewirkten. Im Gegensatz dazu führten sowohl höhere rechte als auch linke Vorhofdrucke zu keiner Änderung der Expression von RLX-mRNA (keine Daten für das linke Ventrikel gezeigt). In order to test the hypothesis that the myocardial dilation corresponds to the higher filling pressures and is the key to the RLX regulation, we perforated isolated rat hearts for two hours under conditions for normal and increased end-diastolic left ventricular pressures (normal LVEDP = 5 mm Hg; increased LVEDP = 25 mm Hg). Accordingly, we set normal (5 mm Hg) or increased middle right or left atrial pressure in a further test group ( Fig. 5). We found that increased LVEDP compared to normal values caused a marked upregulation of RLX gene expression. In contrast, both higher right and left atrial pressures did not change the expression of RLX mRNA (no data for the left ventricle shown).

Relaxin inhibiert die stimulierte Endothelin-1-SekretionRelaxin inhibits stimulated endothelin-1 secretion

Wir zeigten kürzlich, dass der Lungenkreislauf eine Hauptquelle für eine Endothelin-1(ET-1)-Nettoabgabe in Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz¹⁵ ist. ET-1 wiederum ist eines der stärksten Mediatoren bei der Herzinsuffizienz-Progression¹⁶. Wir untersuchten daher, ob RLX die endothele Pulmonal-Mechanotransduktion beeinflusst, welche die höhere ET-1-Expression bewirkt. Ein solcher Effekt würde nämlich eine relevante neurohumorale Rolle für das RLX im Verlauf der Herzinsuffizienz nahelegen. Wir unterwarfen Endothelzellen der Lungenarterie in einer Flusskammer hämodynamischen Bedingungen, welche die in vivo Sitation simuliert bei einem insuffizienten linken Ventrikel mit einem nachfolgenden Lungenstau (niederer Arterien-Scherdruck θ = 18 dyn/cm², hoher Auslaufdruck am Kammerausgang ["Pulmonalverschlussdruck"], p = 30 mm Hg). Wir fanden eine verdoppelte ET-1-Sekretion über 16 Stunden verglichen zu normalen hämodynamischen Bedingungen (θ = 30 oder 50 dyn/cm², p = 10 mm Hg) (Fig. 6a). Diese Erhöhung in der Peptidsekretion entspricht den erhöhten preproET-1-, Endothelin-Converting-Enzyme-1- (ECE-1) und ECE-2-mRNA-Spiegeln (Daten nicht gezeigt). Exogenes RLX-2 von 5 nM hingegen unterdrückte vollständig die hämodynamisch induzierte Erhöhung der ET-1-Sekretion (Fig. 6a). Dies kann einer Unterdrückung der ET-1-Genexpression (Daten nicht gezeigt) zugeschrieben werden. We recently showed that pulmonary circulation is a major source of net endothelin-1 (ET-1) delivery in patients with severe heart failure ¹⁵ . ET-1, in turn, is one of the strongest mediators in the progression of heart failure ¹⁶ . We therefore investigated whether RLX influences the endothelial pulmonary mechanotransduction which causes the higher ET-1 expression. Such an effect would suggest a relevant neurohumoral role for RLX in the course of heart failure. We subjected endothelial cells of the pulmonary artery to hemodynamic conditions in a flow chamber, which simulates the in vivo situation in an insufficient left ventricle with a subsequent lung congestion (low arterial shear pressure θ = 18 dynes / cm ² , high outlet pressure at the chamber outlet ["pulmonary occlusion pressure"], p = 30 mm Hg). We found a doubled ET-1 secretion over 16 hours compared to normal hemodynamic conditions (θ = 30 or 50 dynes / cm ² , p = 10 mm Hg) ( Fig. 6a). This increase in peptide secretion corresponds to the increased preproET-1, endothelin converting enzyme 1 (ECE-1) and ECE-2 mRNA levels (data not shown). Exogenous RLX-2 of 5 nM, on the other hand, completely suppressed the hemodynamically induced increase in ET-1 secretion ( FIG. 6a). This can be attributed to suppression of ET-1 gene expression (data not shown).

In weiteren Versuchen untersuchten wir die Wirkung von exogenem RLX-2 auf die Angiotensin-II(AT II)-stimulierte ET-1-Sekretion in Endothelzellen aus Lungenarterien. Die AT-II-induzierte ET-1-Sekretion ist ein gut beschriebener neurohumoraler Vorgang, der zur Progression der Herzinsuffizienz¹⁷ beiträgt. In Gegenwart von 100 nM AT II (entsprechend einem erhöhten Spiegel der mRNA-kodierten preproET-1 und ET-konvertierenden Enzyme-1 und -2) war die ET-1-Abgabe bei 8 Stunden über 4 Stunden verdoppelt. 10 nM RLX-2 hingegen inhibierte tiefgreifend die Erhöhung der ET-1-Sekretion (Fig. 6b). Auf funktioneller Ebene unterbindet eine selektive Blockierung der ET_B-Rezeptoren - die Clearance-Site für Endothelin-1¹⁸ - durch A-192621 gänzlich eine Inhibitorwirkung von RLX-2 gegenüber ET-1. Dieser Vorgang legt einen E_B-Rezeptor- vermittelten Mechanismus für die RLX-Wirkung nahe. Dies bestätigt die Messung einer massiven Erhöhung der ET_B-Rezeptor- Genexpression in Gegenwart von AT-II plus RLX (Fig. 6c). In further trials, we examined the effect of exogenous RLX-2 on angiotensin II (AT II) -stimulated ET-1 secretion in endothelial cells from pulmonary arteries. AT-II-induced ET-1 secretion is a well-described neurohumoral process that contributes to the progression of heart failure ¹⁷ . In the presence of 100 nM AT II (corresponding to an increased level of the mRNA-encoded preproET-1 and ET-converting enzymes 1 and -2), the ET-1 release was doubled at 8 hours over 4 hours. In contrast, 10 nM RLX-2 profoundly inhibited the increase in ET-1 secretion ( FIG. 6b). On a functional level, selective blocking of the ET _B receptors - the clearance site for endothelin-1 ¹⁸ - by A-192621 completely inhibits RLX-2's inhibitory activity against ET-1. This process suggests an E _B receptor-mediated mechanism for the RLX effect. This confirms the measurement of a massive increase in ET _B receptor gene expression in the presence of AT-II plus RLX ( Fig. 6c).

Insgesamt hat RLX ein hohes Potenzial für eine in vitro- Suppression der Stimulierung im ET-1-System. Dieser Befund veranlasste uns, die in vivo-Korrelation zwischen Plasma-ET-1 und RLX von unseren Patienten zu untersuchen. Overall, RLX has great potential for in vitro Suppression of stimulation in the ET-1 system. This finding prompted us to determine the in vivo correlation between plasma ET-1 and to examine RLX from our patients.

Zwischen Plasma-ET-1 und -RLX besteht bei schwerem Herzversagen eine inverse KorrelationThere is severe heart failure between plasma ET-1 and -RLX an inverse correlation

Fig. 6d zeigt die signifikante inverse Korrelation zwischen zirkulierendem ET-1 und RLX bei den untersuchten Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz (quadrat. Regression r = 0,81, P = 0,008; lineare Regression R = 0,71, P = 0,013). Patienten mit höchsten Plasma-RLX-Spiegeln besaßen in der Patientengruppe die niedrigste ET-1-Konzentrationen in der Zirkulation. Bei Patienten mit moderater Herzinsuffizienz und bei Kontrollpatienten ließ sich eine derartige Korrelation nicht feststellen (Daten nicht gezeigt). FIG. 6d shows the significant inverse correlation between circulating ET-1 and RLX in the examined patients with severe heart failure (square regression r = 0.81, P = 0.008;. Linear regression R = 0.71, P = 0.013). Patients with the highest plasma RLX levels had the lowest ET-1 concentrations in the circulation in the patient group. Such a correlation was not found in patients with moderate heart failure and in control patients (data not shown).

Das Polypeptid RLX ist seit vielen Jahren als Hormon für die menschliche Reproduktion^{6, 7} bekannt. Es zog daher seit den frühen 90er Jahren eine hohe Aufmerksamkeit auf sich. Diese Untersuchungen zeigten eine bemerkenswerte Vielfalt dieses Mediators in Ratten^{4, 8}. Wir zeigen hier erstmals i) dass RLX in menschlichen Herz-Kreislaufgewebe konstitutiv exprimiert wird und ii) dass es eine wichtige funktionelle Rolle während des menschlichen Herzversagens hat. Diese Befunde beruhen auf folgenden Beobachtungen: Die RLX-Plasmaspiegel steigen erheblich mit der Schwere der Herzinsuffizienz an und sie reagieren auf akute hämodynamische Verbesserungen während einer intensiven Behandlung. Bei schwerem Herzinsuffizienz konnten wir eine Nettokoronarabgabe für RLX in mehr als 75% der Patienten zeigen. Diese Tatsache legt nahe, dass das Herz eine relevante Quelle für ein erhöhtes zirkulierendes RLX bei menschlicher Herzinsuffizienz ist. Darüber hinaus zeigen wir erstmals eine H1- und H2-Genexpression im Herz und in den Gefäßen von Patienten mit guter Herzfunktion und Patienten mit einer Herzinsuffizienz. Das Auftreten von Herzinsuffizienz jedoch ist begleitet von einer signifikanten Erhöhung der H1- und H2-mRNA-Spiegel im Myokard. Die Western-Blot-Analyse und die Immunofärbung zeigen eine Translation der RLX-mRNA in RLX-Polypeptide im Herz und in den Gefäßen. Ferner zeigen wir hier erstmals eine Expression des proRLX-Prozessierungsenzyms PC = 1 im Herzen und in den Gefäßen. Die beobachtete differenzierte PC-1-mRNA-Expression bei insuffizienten Vorhof oder Ventrikeln erklärt das charakteristische Muster für die proRLX-Proteinspiegel. Die H1- und H2-Transkripte sind an beiden Stellen erhöht. Die verminderte Vorhofexpression von PC-1 hingegen erleichtert eine proRLX-Erhöhung, wohingegen die nicht gleichförmige Ventrikelregulation des PC-1 zu veränderlichen proRLX-Spiegeln führt. In der Immunfärbung erscheinen Myozyten und interstitielle Zellen als myokarde Quellen des RLX. Auf funktioneller Ebene ist die Myokarderweiterung wegen des erhöhten Fülldrucks in der linken Herzkammer das regulatorische Event für eine RLX-Genexpression. Daneben kann exogenes RLX wirksam in der Lunge die endothele ET-1-Antwort auf hämodynamische und humorale (AT II) Stimuli unterdrücken. RLX moduliert die Wirkungen von AT-II, gezeigt durch die Erhöhung der Endothel-ET_B-Rezeptorexpression in Gegenwart von AT-II plus RLX. Die potentielle Wirkung dieser in vitro-Befunde wird durch Daten bestärkt von unseren Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz: Zirkulierende RLX besitzt eine enge inverse Korrelation mit Plasma-ET-1, dem am stärksten wirkenden gefäßverengenden Mittel bei Herzversagen, und es ist ein starker Mediator für die Salz-Retention und das Myokard-Remodelling¹⁶. The polypeptide RLX has been known for many years as a hormone for human reproduction ^{6, 7} . It has therefore attracted a great deal of attention since the early 1990s. These studies showed a remarkable variety of this mediator in rats ^{4, 8} . We show here for the first time i) that RLX is constitutively expressed in human cardiovascular tissue and ii) that it has an important functional role during human heart failure. These findings are based on the following observations: RLX plasma levels rise significantly with the severity of heart failure and they respond to acute hemodynamic improvements during intensive treatment. In severe heart failure, we were able to show a net coronary delivery for RLX in more than 75% of patients. This fact suggests that the heart is a relevant source of increased circulating RLX in human heart failure. In addition, we are showing for the first time H1 and H2 gene expression in the heart and in the vessels of patients with good cardiac function and patients with heart failure. However, the occurrence of heart failure is accompanied by a significant increase in the H1 and H2 mRNA levels in the myocardium. Western blot analysis and immunostaining show translation of the RLX mRNA into RLX polypeptides in the heart and in the vessels. Furthermore, for the first time we show an expression of the proRLX processing enzyme PC = 1 in the heart and in the vessels. The observed differentiated PC-1 mRNA expression in insufficient atria or ventricles explains the characteristic pattern for the proRLX protein levels. The H1 and H2 transcripts are elevated in both places. The reduced atrial expression of PC-1, on the other hand, facilitates a proRLX increase, whereas the non-uniform ventricular regulation of PC-1 leads to variable proRLX levels. In immunostaining, myocytes and interstitial cells appear as myocardial sources of the RLX. On a functional level, myocardial dilation is the regulatory event for RLX gene expression due to the increased filling pressure in the left ventricle. In addition, exogenous RLX can effectively suppress the endothelial ET-1 response to hemodynamic and humoral (AT II) stimuli in the lungs. RLX modulates the effects of AT-II, shown by increasing endothelial ET _B receptor expression in the presence of AT-II plus RLX. The potential effect of these in vitro findings is confirmed by data from our patients with severe heart failure: Circulating RLX has a close inverse correlation with plasma ET-1, the most potent vasoconstrictor in heart failure, and it is a powerful mediator for those Salt retention and myocardial remodeling ¹⁶ .

Unsere Befunde und das Ergebnisbild, durch die Untersuchungen der Wirkung von exogenem RLX in Nagern lässt vorhersagen, dass das Peptid hauptsächlich kompensatorische Wirkungen im Verlauf der Herzinsuffizienz besitzt, d. h., Vasodilation⁸, Diuresis aufgrund einer Verstärkung der renalen AT-II- Gefäßreaktion¹⁹, Stimulierung der ANP (Atrial Natriuretic Peptide)²⁰, Kollagenmatrix-Degradation²¹, Modulation der AT-II- Wirkungen und Suppression des Endothelin-1-Systems. Our findings and the result picture, by examining the effects of exogenous RLX in rodents, predict that the peptide has mainly compensatory effects in the course of heart failure, ie vasodilation ⁸ , diuresis due to an increase in the renal AT-II vascular response ¹⁹ , stimulation the ANP (Atrial Natriuretic Peptide) ²⁰ , collagen matrix degradation ²¹ , modulation of the AT-II effects and suppression of the endothelin-1 system.

Im Ergebnis konnten wir einen wichtigen Beteiligten am menschlichen Herzversagen identifizieren: Relaxin ist daher ein wichtiger Wert für die Prognose eines Herzversagens und ist auch ein wichtiges Target für weitere therapeutische Ansätze. As a result, we were able to get an important participant in Identify human heart failure: Relaxin is therefore a important value for the prognosis of a heart failure and is also an important target for further therapeutic approaches.

VERFAHRENMETHOD Patienten und ProtokollPatient and protocol

Um einen möglichen Fehler in den RLX-Daten durch die verschiedenen Phasen des Menstruationszykluses auszuschalten, wurden in der Untersuchung nur postmenopausale Frauen aufgenommen, bei denen die Menstruation mindestens 12 Monate ausgesetzt hatte. Die Aufnahme der Patienten erfolgte nach folgenden Untersuchungspunkten: To a possible error in the RLX data by the different phases of the menstrual cycle only postmenopausal women were included in the study, where menstruation is suspended for at least 12 months would have. The patients were admitted as follows Investigation points:

Gruppe 1Group 1 Schwere HerzinsuffizienzSevere heart failure

14 Herzinsuffizienz- Patienten in der funktionellen Klasse NYHA IV wurden aufgenommen (5 Frauen, 9 Männer; mittleres Alter ± SD, 58 ± 7 Jahre, mittlere linksventrikulärer Ausstoßbruch [LVEF] ± SD, 19 ± 3%). Sieben Patienten litten an Herzinsuffizienz im Verlauf einer ischämischen Herzerkrankung (IHD) und sieben zeigten eine erweiterte Kardiomyopathie (DCM). 14 heart failure Patients in the NYHA IV functional class were recorded (5 women, 9 men; middle age ± SD, 58 ± 7 years, middle left ventricular output fracture [LVEF] ± SD, 19 ± 3%). Seven patients suffered from heart failure in the course of an ischemic heart disease (IHD) and seven showed advanced cardiomyopathy (DCM).

Die Einschlusskriterien waren wie folgt:

• a) Bedarf einer Intensivbehandlung der akuten linken Herzdekompensation (Orthopnea, Zeichen für einen schweren Lungenstau). Akute Ischämien wurden ausgeschlossen durch Elektrokardiogramm und durch Enzymkinetiken (Troponin, Kreatinkinase und Myoglobin).
• b) PCWP > 25 mm Hg, Cl < 2,5 L/min/m².

The inclusion criteria were as follows:

• a) Need for intensive treatment of acute left heart decompensation (orthopnea, sign of severe lung congestion). Acute ischemia was excluded by electrocardiogram and by enzyme kinetics (troponin, creatine kinase and myoglobin).
• b) PCWP> 25 mm Hg, Cl <2.5 L / min / m ² .

Wir behandelten die Patienten zwölf Stunden mit Natriumnitroprussid (SNP) und einer Dosis, die den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) auf 800 bis 1000 dyn/s/cm^-5 senkte, ohne den mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) unter 60 mm Hg zu drücken. Die mittlere Dosis ± SD für SNP war 3,1 ± 0,3 µg/kg/min. Intravenöses Furosemid wurde verabreicht entsprechend den klinischen Erfordernissen; i. v. Nitrate, Katecholamine und Phosphodiesteraseinhibitoren wurden nicht verabreicht. Alle Patienten waren auf einer stabilen oralen Therapie: Alle auf ACE-Inhibitoren und Diuretika; neun auf Nitrate; auf β-Blockern und sechs auf Digitalis. Die orale Medikation wurde in den Gruppen 1 und 2 durchgehend aufrechterhalten. We treated patients for 12 hours with sodium nitroprusside (SNP) and a dose that lowered systemic vascular resistance (SVR) to 800 to 1000 dyn / s / cm ^-5 without lowering mean arterial blood pressure (MAP) below 60 mm Hg. The mean dose ± SD for SNP was 3.1 ± 0.3 µg / kg / min. Intravenous furosemide was administered according to clinical needs; iv Nitrates, catecholamines and phosphodiesterase inhibitors were not administered. All patients were on stable oral therapy: all on ACE inhibitors and diuretics; nine on nitrates; on β-blockers and six on digitalis. Oral medication was maintained throughout in Groups 1 and 2.

Gruppe 2Group 2 Moderate HerzinsuffizienzModerate heart failure

Folgende Patienten wurden der Gruppe mit moderater Herzinsuffizienz zugeordnet: n = 13, 4 Frauen, 9 Männer, Alter 54 ± 7 Jahre, LVEF 27 ± 4%; wenn gegeben: i) in NYHA-Klasse II und wenn sie zeigten ii) einen PCWP < 20 mm Hg und ein Cl > 2,5 L/min/m². Die Patienten wurden aus Patienten rekrutiert, die vor einer koronaren Bypass-Operation einer hämodynamischen Evaluierung unterworfen wurden und/oder einer partiellen Ventrikulectomie. Sechs Patienten litten an einer Herzinsuffizienz in Folge einer IHD und sieben zeigten DCM. Wie in Gruppe 1 wurden die Patienten mit SNP-Dosen behandelt, durch die die oben genannten hämodynamischen Zielkriterien erreicht wurden. Die mittlere Dosis ± SD an SNP betrug 2,2 ± 0,6 µg/kg/min. Alle Patienten waren auf oralen ACE-Inhibitoren und oralen Diuretika; neun auf oralen Nitraten; acht auf β-Blockern und vier auf Digitalis. The following patients were assigned to the group with moderate heart failure: n = 13, 4 women, 9 men, age 54 ± 7 years, LVEF 27 ± 4%; if given: i) in NYHA class II and if they showed ii) a PCWP <20 mm Hg and a Cl> 2.5 L / min / m ² . Patients were recruited from patients undergoing hemodynamic evaluation prior to coronary bypass surgery and / or partial ventriculectomy. Six patients had heart failure as a result of IHD and seven had DCM. As in Group 1, patients were treated with doses of SNP that met the above-mentioned hemodynamic target criteria. The mean dose ± SD of SNP was 2.2 ± 0.6 µg / kg / min. All patients were on oral ACE inhibitors and oral diuretics; nine on oral nitrates; eight on β-blockers and four on digitalis.

Gruppe 3Group 3 Kontrollecontrol

13 Kontrollen (4 Frauen, 9 Männer, Alter 55 ± 4 Jahre; LVEF 65 ± 5%) wurden aus Patienten rekrutiert, die bei Verdacht auf einer koronaren Arterienerkrankung einer Herzkathederisierung unterworfen worden waren und bei denen keine strukturelle Herz-Kreislauferkrankung festgestellt werden konnte. 13 controls (4 women, 9 men, age 55 ± 4 years; LVEF 65 ± 5%) were recruited from patients those suspected of having coronary artery disease Cardiac catheterization had been subjected to and in which no structural cardiovascular disease was found could.

Gerätschaften und Sammlung der BlutprobenEquipment and collection of blood samples

In allen Gruppen wurden die Katheter in der Pulmonalarterie (PA) (Swan-Ganz) im Sinus coronarius (CS) und in der linken Herzkammer (LV) unter Fluoroskopkontrolle eingeführt. Die Blutproben und die hämodynamischen Messungen erfolgten mit einer Basislinie in allen Gruppen 2, 4, 6 und 12 Stunden nach Beginn der Therapie in den Gruppen 1 und 2. In allen Gruppen wurde weiterhin venöses Blut 48 Stunden nach Beginn der Therapie und der Katheterisierung genommen. Der Arteriendruck (A) wurde gleichzeitig von der linken Herzkammer und von der Radialarterie genommen um eine Vergleichbarkeit dieser Stellen zu erreichen (schwere Herzinsuffizienz: LV 18,9 ± 3,4; Radialarterie 18,5 ± 3,9 pg/mL [NS]; moderate Herzinsuffizienz: LV 7,9 ± 1,2; Radialarterie 7,6 ± 1,3 pg/mL [NS]). Während der Behandlung wurde arterielles Blut aus der Radialarterie genommen. Daneben wurde Blut aus PA, CS und der Antikubitalvene (V) genommen. In den Gruppen 1 und 2 wurde der linke Wert (n = 6) von Patienten erhalten, die sich einer Bypass-Operation unterworfen hatten. Diese zeigten eine normale Herzfunktion, bestimmt durch präoperative Katheterisierung. In all groups the catheters in the pulmonary artery (PA) (Swan-Ganz) in the coronary sinus (CS) and in the left ventricle (LV) introduced under fluoroscope control. The blood tests and the Hemodynamic measurements were made with a baseline in all groups 2, 4, 6 and 12 hours after the start of therapy in groups 1 and 2. In all groups continued venous blood 48 hours after starting therapy and Catheterization taken. The arterial pressure (A) was from the left ventricle and from the Radial artery taken to make these locations comparable reach (severe heart failure: LV 18.9 ± 3.4; Radial artery 18.5 ± 3.9 pg / mL [NS]; moderate heart failure: LV 7.9 ± 1.2; Radial artery 7.6 ± 1.3 pg / mL [NS]). While Treatment was arterial blood from the radial artery taken. In addition, blood from PA, CS and the anti-cubital vein was created (V) taken. In groups 1 and 2 the left value was (n = 6) received from patients undergoing bypass surgery had subjected. These showed normal heart function, determined by preoperative catheterization.

Schwere HerzinsuffizienzSevere heart failure

Die Gewebeproben aus der linken Herzkammer (n = 8) stammten von Patienten mit DCM (n = 2) und IHD (n = 3), die sich einer partiellen Ventrikuloectomie unterzogen hatten, sowie auch von explantierten DCM-Herzen (n = 3). Wir untersuchten weiterhin Proben aus einem erweiterten rechten Vorhof, wobei die entsprechenden Patienten an der Brustarterie oder der Vena saphena (n = 4 jeweils) litten, genommen von Patienten, die sich einer Bypass-Operation unterwerfen mussten. Alle Patienten hatten schwere Herzinsuffizienz, bestimmt durch präoperative Katheterisierung. The tissue samples from the left Ventricles (n = 8) were from patients with DCM (n = 2) and IHD (n = 3) who underwent a partial ventriculoectomy had undergone, as well as from explanted DCM hearts (n = 3). We continued to examine samples from one enlarged right atrium, taking the appropriate patient on the thoracic artery or saphenous vein (n = 4 each) suffered from patients undergoing bypass surgery had to submit. All patients had severe Heart failure determined by preoperative catheterization.

Die Proben wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und bei -70°C für die anschließende RNA-Isolierung aufbewahrt. Für die Gesamt-RNA-Isolierung nach Chomoczynski und Sacchi²², wurden die Gewebe homogenisiert, nach 20 Minuten Inkubation bei 30°C in 1,7 mL TRIZOL-Reagenz (Life Technologies) pro 50 mg Gewebe. Die RNA-Extraktion erfolgte durch Zugabe von 0,3 mL Chloroform pro 1 mL TRIZOL, 3 Minuten Inkubation bei 30°C und anschließender Zentrifugation (12 000 UpM, 30 Minuten, 4°C). Die RNA in der wässrigen Phase wurde durch Zusatz von 0,8 mL Isopropylalkohol pro 1 mL TRIZOL präzipitiert. Nach der Zentrifugation (12 000 UpM, 30 Minuten, 4°C) wurde das erhaltene Pellet in Diethylpyrocarbonat-behandelten Wasser aufgelöst. The samples were placed in liquid nitrogen and stored at -70 ° C for subsequent RNA isolation. For the total RNA isolation according to Chomoczynski and Sacchi ²² , the tissues were homogenized after 20 minutes incubation at 30 ° C in 1.7 mL TRIZOL reagent (Life Technologies) per 50 mg tissue. The RNA extraction was carried out by adding 0.3 mL chloroform per 1 mL TRIZOL, 3 minutes incubation at 30 ° C and subsequent centrifugation (12,000 rpm, 30 minutes, 4 ° C). The RNA in the aqueous phase was precipitated by adding 0.8 mL isopropyl alcohol per 1 mL TRIZOL. After centrifugation (12,000 rpm, 30 minutes, 4 ° C.), the pellet obtained was dissolved in water treated with diethyl pyrocarbonate.

Die Gesamt-RNA (2 µg) wurde revers transkripiert mithilfe von AMV-reverser Transkriptase und dT₁₅-Primer entsprechend den Angaben der Hersteller (First Strand cDNA Synthesis Kit, Boehringer Mannheim). Die PCR-Amplifikation von einsträngiger cDNA erfolgte mithilfe einem Primer-Paar, das spezifisch war für H1- und H2-prepro-RLX (H1- und H2-5'-Primer: 5' TCT GTT TAC TAC TGA ACC AAT TT 3'; H1-3'-Primer: 5' CTC AAA CAG TGC CAC GTA GGG TCG 3'; H2-3'-Primer: 5' ATT AGC CAA TGC ACT GTA GAG TTG 3') (TIB MOLBIOL), PC-1 (5'-Primer: 5' GTG AAC TGG AAG CTG ATT TTG CAC G 3'; 3'-Primer: 5' CAT AAG AAT TCA TGA CAA AAC AAC C 3') und für menschliche Glycerolaldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (5'-Primer: 5' TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT 3'; 3'-Primer: 5' CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC 3') (Clontech). Die Primer-Sequenzen für H1- und H2-prepro-RLX wurden ausgewählt nach der Arbeit von Gunnerson et al¹¹. The total RNA (2 µg) was reverse transcribed using AMV reverse transcriptase and dT ₁₅ primer according to the manufacturer's instructions (First Strand cDNA Synthesis Kit, Boehringer Mannheim). The PCR amplification of single-stranded cDNA was carried out using a primer pair which was specific for H1 and H2 prepro-RLX (H1 and H2-5 'primers: 5' TCT GTT TAC TAC TGA ACC AAT TT 3 '; H1-3 'primer: 5' CTC AAA CAG TGC CAC GTA GGG TCG 3 ';H2-3' primer: 5 'ATT AGC CAA TGC ACT GTA GAG TTG 3') (TIB MOLBIOL), PC-1 (5th 'Primer: 5' GTG AAC TGG AAG CTG ATT TTG CAC G 3 ';3' primer: 5 'CAT AAG AAT TCA TGA CAA AAC AAC C 3') and for human glycerol aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (5 'primer: 5' TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT 3 ';3' primer: 5 'CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC 3') (Clontech). The primer sequences for H1 and H2 prepro RLX were selected based on the work of Gunnerson et al ¹¹ .

Die Southern-Blot-Hybridisierung erfolgte durch Quantifizierung der amplifizierten Sequenzen. Hierzu wurden die PCR-Produkte auf 2% Agarose-Gelen separiert, auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) geblottet und mit radioaktiven markierten Oligos hybridisiert, die spezifisch waren für H1 oder H2 (H1: 5' AAT GAA TTC CAA CAT GAT AAT TAT A 3'; H2: 5' AAC AAA TTC TGA CAT CAT ATT TAT G 3', Sequenzen nach Gunnersen) (Easy Hyb, Boehringer Mannheim). Schließlich folgte eine Autoradiographie und die Autoradiogramme wurden mithilfe der ImageMaster 1D Prime Software (Pharmacia Biotechn) quantifiziert. Alle Daten wurden auf die GAPDH-mRNA-Expression normalisiert. Southern blot hybridization was performed by quantification of the amplified sequences. For this the PCR products separated on 2% agarose gels, on nylon membranes (Hybond N, Amersham) blotted and with radioactive labeled oligos hybridized that were specific for H1 or H2 (H1: 5 ' AAT GAA TTC CAA CAT GAT AAT TAT A 3 '; H2: 5 'AAC AAA TTC TGA CAT CAT ATT TAT G 3 ', sequences according to Gunnersen) (Easy Hyb, Boehringer Mannheim). Finally, an autoradiography followed and the autoradiograms were made using the ImageMaster 1D Prime Software (Pharmacia Biotechn) quantified. All data were normalized for GAPDH mRNA expression.

Klonierung und Sequenzierung der verschiedenen RLX-mRNA-FormenCloning and sequencing of the different RLX mRNA forms

Wir verwendeten den Eukaryotic TA Cloning Kit (pCR 3,1 Vektor, Invitrogen) und den Standard Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) nach Angaben der Hersteller. We used the Eukaryotic TA Cloning Kit (pCR 3.1 vector, Invitrogen) and the Standard Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the manufacturer.

Immunostaining und ImmunofluorescenceImmunostaining and immunofluorescence

Paraffin-Schnitte (5 µm dick) vom Gewebe der linken Herzkammer wurden auf Gelatinebeschichtete Glasträger aufgebracht. Als Primärantikörper verwendeten wir einen für einen RLX-ELISA beschriebenen polyklonalen Antikörper. Die Gewebe wurden 24 Stunden (40°C) mit Primärantikörper inkubiert (Verdünnung 1 : 300). Der zweite Ziege-Antikaninchen-Antikörper und das dritte Reagenz wurden eine Stunde bei Raumtemperatur auf die Gewebe aufgebracht. Wir verwendeten 3,3'-Diaminobenzidintetrachlorid als Chromagen. Daneben erfolgte eine Hematoxylin- und Eosin-Gegenfärbung, so dass die RLX-Immunoreaktivität bestimmten Zelltypen zugeordnet werden konnte. Paraffin sections (5 µm thick) from the tissue of the left ventricle Gelatin-coated glass slides applied. As a primary antibody we used one described for an RLX ELISA polyclonal antibody. The tissues were 24 hours (40 ° C) incubated with primary antibody (dilution 1: 300). The second Goat anti-rabbit antibody and the third reagent were added applied to the tissues for one hour at room temperature. We used 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride as chromagen. In addition, hematoxylin and eosin counterstaining took place, so that the RLX immunoreactivity certain cell types could be assigned.

Ferner verwendeten wir Gefrierschnitte (5 µm) für die Erfassung der RLX-Immunoreaktivität in der linken Herzkammer, im rechten Vorhofund in den Gefäßen. In diesem Fall wurde der zweite Ziege-Antikaninchen-Antikörper mit dem Fluorochromcyarkin-3 markiert. Die Verfahrensspezifität wurde durch Substitution des Primärantikörpers mit Serum aus nicht immunisierten Kaninchen (Verdünnung 1 : 300) getestet. We also used frozen sections (5 µm) for the Detection of RLX immunoreactivity in the left ventricle, in the right atrium and in the vessels. In this case the second goat anti-rabbit antibody with the Fluorochrome carkarkin-3 labeled. The procedural specificity was through Substitution of the primary antibody with no serum immunized rabbits (dilution 1: 300) tested.

Western-Blot-AnalyseWestern blot analysis

Gewebeproben (50 mg) wurden bei 90°C 30 Minuten in 100 µL Diethylpyrocarbonat-behandelten Wasser plus 100 µL SDS-Puffer (125 mM Tris-Cl, 20% Glycerin, 6% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 0,02% Bromphenol-Blau) lysiert. Die Homogenate wurden 15 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert. 10 µl Überstand wurde auf einem 17,5%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Danach wurden die separierten Proteine auf Polyvinylidendifluorid-Membranen von Millepore (300 mAm, 1 h) geblottet. Diese Membranen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert mit 5% Trockenmilch, 0,05% Gelatine, 1% BSA, 0,02 Tween-20, 1 mal TBS [50 mM Tris, 150 mM NaCl]). Die Membranen wurden anschließend über Nacht bei 4°C mit Primärantikörper (Verdünnung 1 : 200 für RLX und 1 : 500 für α-Actin) inkubiert. Als Primärantikörper verwendeten wir polyklonalen RLX-spezifischen Antikörper, wie für den RLX-ELISA beschrieben, sowie monoklonale Maus-Anti-Actin-Antikörper. Nach zweimal 5 Minuten Waschen und zweimal 15 Minuten Waschen mit 1×TBS plus 0,02% Tween-20 wurden die Membranen 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase-konjugierter Maus-Antikaninchen- oder Ziege-Antimaus-IgG) inkubiert. Schließlich wurden die immunoreaktiven Banden mit BM Chemolumineszenz- System (Boehringer Mannheim) sichtbar gemacht. Tissue samples (50 mg) were taken at 90 ° C 30 minutes in 100 µL of diethyl pyrocarbonate-treated water plus 100 µL SDS buffer (125 mM Tris-Cl, 20% glycerin, 6% SDS, 10% β-mercaptoethanol, 0.02% bromophenol blue) lysed. The homogenates were centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. 10 ul supernatant was on a 17.5% SDS-PAGE gel separated. After that, the separated proteins were on Millepore polyvinylidene difluoride membranes (300 mAm, 1 h) blotted. These membranes were kept at room temperature for 2 hours blocked with 5% dry milk, 0.05% gelatin, 1% BSA, 0.02 Tween-20, 1 time TBS [50mM Tris, 150mM NaCl]). The Membranes were then at 4 ° C overnight Primary antibodies (dilution 1: 200 for RLX and 1: 500 for α-actin) incubated. We used polyclonal as the primary antibody RLX-specific antibodies as described for the RLX ELISA and mouse anti-actin monoclonal antibodies. After twice Wash for 5 minutes and wash twice for 15 minutes with 1 × TBS plus 0.02% Tween-20, the membranes were at 2 hours Room temperature with the second antibody (peroxidase-conjugated Mouse anti-rabbit or goat anti-mouse IgG) incubated. Finally, the immunoreactive bands with BM chemiluminescent System (Boehringer Mannheim) made visible.

Versuche an isolierten RattenherzenExperiments on isolated rat hearts

Isolierte Langendorff- Herzen aus Wistar-Rattenmännchen (180-250 g Körpergewicht) wurden 2 Stunden bei konstanten Druck perforiert mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (37°C; pH 7,35-7,45; Zusammensetzung in mmol/L: NaCl 116, KCl 4,0, MgSO₄ 1,2, KH₂PO₄ 1,2, NaHCO₃, 25, CaCl₂ 2,5, Glukose 10, HEPES 6; Äquilibrierung mit 95% O₂ und 5% CO₂). Der enddiastolische Druck der linken Herzkammer (LVEDP) von entweder 5 mm Hg (Kontrolle) oder 25 mm Hg (n = 3 für jede Gruppe) wurde mithilfe eines flüssiggefüllten Latex-Ballons eingestellt. In einer Untergruppe dieser Versuche (n = 3 für jede Gruppe) stellten wir den mittleren rechten oder linken Vorhofdruck mithilfe eines Ballons ein auf entweder normal (5 mm Hg) oder erhöhtem Wert (25 mm Hg). Die Baseline-Werte und der Zeitverlauf der Herzrate sowie des Koronarflusses unterschieden sich bei diesen Gruppen nicht (Daten nicht gezeigt). Schließlich wurden die entsprechenden Gewebe - freie linke Herzkammer und rechte/linke Vorhofwand - in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C für die Bestimmung der RLX = mRNA aufbewahrt. Es erfolgte eine Gesamt-RNA-Isolierung und eine reverse Transkription, wie oben beschrieben. Die PCR erfolgte mit entweder Primern für H1/2-prepro-RLX (5'-Primer: 5' GAA TTA FTT CGC GCG CAG ATT GC 3'; 3'-Primer: 5' GCA AGA CGA TCT TTT GGT ACA ACC 3'; Sequenzen nach Hansell et al.²³) (TIB MOLBIOL). Isolated Langendorff hearts from Wistar rat males (180-250 g body weight) were perforated for 2 hours at constant pressure with modified Krebs-Henseleit buffer (37 ° C; pH 7.35-7.45; composition in mmol / L: NaCl 116, KCl 4.0, MgSO ₄ 1.2, KH ₂ PO ₄ 1.2, NaHCO ₃ , 25, CaCl ₂ 2.5, glucose 10, HEPES 6; equilibration with 95% O ₂ and 5% CO ₂ ) , The left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) of either 5 mm Hg (control) or 25 mm Hg (n = 3 for each group) was adjusted using a liquid-filled latex balloon. In a subset of these trials (n = 3 for each group), we adjusted the mean right or left atrial pressure to either normal (5 mm Hg) or increased (25 mm Hg) using a balloon. The baseline values and the time course of the heart rate and the coronary flow did not differ in these groups (data not shown). Finally, the corresponding tissues - free left ventricle and right / left atrial wall - were snap frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C for the determination of the RLX = mRNA. Total RNA isolation and reverse transcription were performed as described above. The PCR was carried out with either primers for H1 / 2 prepro-RLX (5 'primer: 5' GAA TTA FTT CGC GCG CAG ATT GC 3 ';3' primer: 5 'GCA AGA CGA TCT TTT GGT ACA ACC 3'; Sequences according to Hansell et al. ²³ ) (TIB MOLBIOL).

ZELLKULTURCELL CULTURE

Endothel-Zellen aus einer Lungenarterie vom Rind (CPAE, Nr. CCL-209, American Type Culture Collection), Passage 6, wurde in Minimum Essential Medium (GIBCO), supplementiert mit 1,5 g/L Natriumbicarbonat, 0,11 g/L Natriumpyruvat, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 5% FCS unter humider 5%igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden bis auf Unterkonfluenz für eine Untersuchung der AT II- induzierten ET-1-Sekretion gezogen. Für die Flusskammerversuche wurde eine vollständige Konfluenz hergestellt. Bovine pulmonary artery endothelial cells (CPAE, No. CCL-209, American Type Culture Collection), Passage 6, was supplemented in Minimum Essential Medium (GIBCO) with 1.5 g / L sodium bicarbonate, 0.11 g / L Sodium pyruvate, 100 U / mL penicillin, 100 µg / mL streptomycin and 5% FCS cultivated under a humid 5% CO ₂ atmosphere. The cells were drawn to underconfluence for an investigation of the AT II-induced ET-1 secretion. Complete confluence was established for the flow chamber experiments.

FLUSSKAMMERFLOW CHAMBER

Die rechteckige Laminarflusskammer (5,0 cm Länge, 3,5 cm Breite) wurde mit einem zirkulierenden Volumen mit 300 mL Zellkulturmedium, begast mit 95% Luft und 5% Kohlendioxid, 16 Stunden perforiert. Der Scherdruck θ (in dyn/cm²) wurde so eingestellt, dass er folgenden Formeln für eine Newtonsche Flüssigkeit²⁴ entsprach:

θ = 6 η Q/B h²

= Δp = 12 η L Q/B h³

(η Viskosität in dyn s/cm²; Q Laminarfluss in cm³/s; B Kammerbreite in cm; h, Kammerhöhe in cm; Δp Druckgradient über die Kammer in dyn/cm²; L Kammerlänge in cm). Der flussinduzierte Druckgradient über die Kammer wurde als Differenz zwischen dem Ein- und dem Auslassdruck gemessen und konstant gehalten für veränderliche θ-Werte durch folgendes Verfahren: Um eine Veränderung von θ₁ zu θ₂ zu erreichen, stellten wir die Kammerhöhe h um θ₂/θ₁ und der Fluss Q durch (θ₂/θ₁)³, wodurch ein konstantes Δp sowie eine lineare Erhöhung für θ mit h erzielt wurde. The rectangular laminar flow chamber (5.0 cm long, 3.5 cm wide) was perforated with a circulating volume with 300 mL cell culture medium, gassed with 95% air and 5% carbon dioxide, for 16 hours. The shear pressure θ (in dynes / cm ² ) was set so that it corresponded to the following formulas for a Newtonian liquid ²⁴ :

θ = 6 η Q / B h ²

= Δp = 12 η LQ / B h ³

(η viscosity in dyn s / cm ² ; Q laminar flow in cm ³ / s; B chamber width in cm; h, chamber height in cm; Δp pressure gradient across the chamber in dyn / cm ² ; L chamber length in cm). The flow-induced pressure gradient across the chamber was measured as the difference between the inlet and outlet pressure and kept constant for variable θ values by the following procedure: In order to achieve a change from θ ₁ to θ ₂ , we adjusted the chamber height h by θ ₂ / θ ₁ and the flow Q through (θ ₂ / θ ₁ ) ³ , whereby a constant Δp and a linear increase for θ with h was achieved.

DATENANALYSEDATA ANALYSIS

Die Daten sind angegeben als Mittelwerte ± SEM, sofern nicht anders angegeben. Eine Fehlerwahrscheinlichkeit P < 0, 05 Wurde als ausreichend angesehen. Die Werte für ungepaarte Daten (hämodynamische Parameter, Zellkulturversuche) wurden mit dem Kruskal-Wallis-ANOVA-Rank oder der Mann-Whitney- Ranksumme geprüft. Unterschiede zwischen den Gruppen über die Zeit (hämodynamisch und Peptid-Spiegel) wurden mit einem nicht-parametrischen ANOVA für wiederholte Messungen²⁵ analysiert. In jedem Fall erfolgte ein mehrfaches Vergleichsverfahren mit Bonferroni-Holm-Anpassung des P nach einer Gesamttestung²⁶. Data are given as mean ± SEM unless otherwise stated. An error probability P <0.05 was considered sufficient. The values for unpaired data (hemodynamic parameters, cell culture experiments) were checked with the Kruskal-Wallis-ANOVA-Rank or the Mann-Whitney rank sum. Differences between groups over time (hemodynamic and peptide levels) were analyzed using a non-parametric ANOVA for repeated measurements ²⁵ . In any case, a multiple comparison procedure with Bonferroni-Holm adjustment of the P was carried out after an overall test ²⁶ .

Die Regressionsanalysen erfolgten mit einer kommerziellen Software für lineare und nicht lineare Regression (SigmaStat, Jandel Scientific). The regression analyzes were carried out with a commercial one Software for linear and non-linear regression (SigmaStat, Jandel Scientific).

Legendenlegends

Fig. 1: Die RLX-Plasmaspiegel erhöhen sich mit der Schwere der Herzinsuffizienz und reagieren auf akute hämodynamische Verbesserungen. Die RLX-Spiegel wurden erfasst in der linken Herzkammer (LV), in der Pulmonararterie (PA), im Sinus coronarius (CS) und in der Vena antekubital (V): Daten (Mittelwerte ± SEM) sind gegeben in pg/mL. Erfassungsgrenze des RLX-ELISA betrug 0,40 pg/mL. a Grundwerte. P < 0,05; # Schwere Herzinsuffizienz gegenüber moderater Herzinsuffizienz; * Schwere Herzinsuffizienz gegenüber Kontrollen: § moderates Herzinsuffizienz gegenüber Kontrollen. b 11 von 14 Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz (d. h. 79%) zeigten eine Nettoabgabe von RLX im Herzen, d. h., die Plasmaspiegel waren in der CS höher als in der LV. c Verlauf des zirkulierenden venösen RLX während und nach 12 Stunden gefäßerweiternder Therapie mit Natriumnitroprussid. P < 0,05; #, gegenüber Basislinie. Fig. 1: RLX plasma levels increase with the severity of heart failure and respond to acute hemodynamic improvements. The RLX levels were recorded in the left ventricle (LV), in the pulmonary artery (PA), in the coronary sinus (CS) and in the antecubital vein (V): data (mean values ± SEM) are given in pg / mL. The detection limit of the RLX-ELISA was 0.40 pg / mL. a basic values. P <0.05;# Severe heart failure versus moderate heart failure; * Severe heart failure versus controls: § moderate heart failure versus controls. b 11 out of 14 patients with severe heart failure (ie 79%) showed a net delivery of RLX in the heart, ie the plasma levels were higher in the CS than in the LV. c Course of circulating venous RLX during and after 12 hours of vasodilator therapy with sodium nitroprusside. P <0.05;#, versus baseline.

Fig. 2: H1- und H2-mRNA wird im Herz-Kreislaufgewebe konstitutiv exprimiert und ist signifikant erhöht im rechten Vorhofund in der linken Herzkammer von Patienten mit Herzinsuffizienz. a RT-PCR; und b Southern-Blot der PCR-Produkte der linken Herzkammer. Die Spuren sind (in a und b): 1-5 Kontrollen; 6-10 erweiterte Kardiomyopathie (DCM); 11 bis 13 Herzinsuffizienz sekundär zu einer ischämischen Herzerkrankung (IHD). c RT-PCR des rechten Vorhofs. Spuren: 1-8 Kontrollen; 9 bis 12 erweiterte Kardiomyopathie. d - e RT-PCR der Vena saphena (d) und Brustarterien (e). Spuren 1-6 sind Kontrollen, Spuren 7-10 stehen für Herzinsuffizienz im Anschluss an eine ischämische Herzerkrankung. Erwartete Größe der Banden für H1 und H2 ist 470 bp; Splicingform von H1 und H2, 571 bp; GAPDH 900 bp. Fig. 2: H1 and H2 mRNA is constitutively expressed in cardiovascular tissue and is significantly increased in the right atrium and in the left ventricle of patients with heart failure. a RT-PCR; and b Southern blot of the left ventricular PCR products. The traces are (in a and b): 1-5 controls; 6-10 advanced cardiomyopathy (DCM); 11 to 13 heart failure secondary to ischemic heart disease (IHD). c RT-PCR of the right atrium. Lanes: 1-8 controls; 9 to 12 advanced cardiomyopathy. d - e RT-PCR of the saphenous vein (d) and thoracic arteries (e). Lanes 1-6 are controls, lanes 7-10 represent heart failure following ischemic heart disease. Expected band size for H1 and H2 is 470 bp; Splicing form of H1 and H2, 571 bp; GAPDH 900 bp.

Fig. 3a: Western-Blot-Analyse zeigt eine Myokard-Expression von proRLX (~18 kDa). ProRLX-Spiegel sind höher in der insuffizienten (F) als in der nichtinsuffizienten (NF) rechten Vorkammer und unverändert in insuffizienten Ventrikeln. Die exogenen H1- und H2-RLX (positive Kontrolle; H1, 100 ng; H2, 500 ng) sind auch erfasst, aber Gewebespiegel der reifen RLX lagen unter der Empfindlichkeitsgrenze dieser Analyse. Die Expressionsspiegel waren normalisiert auf α-Actin (38 kDa). b Expression der Prohormonconvertase-1(PC-1)-mRNA im rechten Vorhof, linke Herzkammer, Vena saphena und Brustarterie mit krankem Myokard, zeigt Abnahmen im Vorhof in einem breiten Bereich von Ventrikelspiegeln dieses Enzyms. Figure 3a: Western blot analysis shows myocardial expression of proRLX (~ 18 kDa). ProRLX levels are higher in the insufficient (F) than in the non-insufficient (NF) right antechamber and unchanged in insufficient ventricles. The exogenous H1 and H2 RLX (positive control; H1, 100 ng; H2, 500 ng) were also recorded, but tissue levels of the mature RLX were below the sensitivity limit of this analysis. Expression levels were normalized to α-actin (38 kDa). b Expression of prohormone convertase-1 (PC-1) mRNA in the right atrium, left ventricle, saphenous vein and thoracic artery with diseased myocardium shows decreases in the atrium in a wide range of ventricular levels of this enzyme.

Fig. 4 a-d Immunfärbung mit Hematoxylin- und Eosin-Gegenfärbung zeigt eine RLX-Immunreaktivität in Myozyten (→) und in interstitiellen Zellen (*) im Gewebe der linken Herzkämmer von Patienten mit einer erweiterten Kardiomyopathie. e-f Spezifität wurde überprüft durch Ersatz des Primärantikörpers durch ein Serum von einem nicht-immunisierten Kaninchen. g Gefrierschnitte RLX-Immunofluoreszenz in Myokard- und Lungengewebeproben von Patienten mit Herzinsuffizienz infolge einer ischämischen Herzerkrankung. Fig. 4 ad immunostaining with hematoxylin and eosin counterstaining shows an RLX immunoreactivity in myocytes (→) and in interstitial cells (*) in the tissue of the left ventricle of patients with advanced cardiomyopathy. ef Specificity was checked by replacing the primary antibody with serum from a non-immunized rabbit. g Frozen sections of RLX immunofluorescence in myocardial and lung tissue samples from patients with heart failure due to ischemic heart disease.

Fig. 5 Erhöhung des enddiastolischen Drucks in der linken Herzkammer von 5 auf 25 mm Hg erhöht das preproRLX- mRNA in isolierten Rattenzellen, erfasst durch RT- PCR, wohingegen eine ähnliche Erhöhung des mittleren Wertes des rechten Vorhofes keine Wirkung hat (n = 2 für jede Gruppe). Die Drucke wurden eingestellt mithilfe eines flüssigkeitsgefüllten Ballons. Die Herzen wurden perfuriert mit Salzpuffer in konstantem Druckmodus (Perfusionsdruck 60 mm Hg) über zwei Stunden. Erwartete Größen der Banden sind: preproRLX = 434 bp; GAPDH = 900 bp. Fig. 5 Increasing the end diastolic pressure in the left ventricle from 5 to 25 mm Hg increases the preproRLX mRNA in isolated rat cells, as determined by RT-PCR, whereas a similar increase in the mean value of the right atrium has no effect (n = 2 for every group). The prints were set using a liquid-filled balloon. The hearts were perfused with salt buffer in constant pressure mode (perfusion pressure 60 mm Hg) over two hours. Expected sizes of the bands are: preproRLX = 434 bp; GAPDH = 900 bp.

Fig. 6 Unterdrückung von Endothelin-1 durch RLX in vitro und in vivo. a exogene RLX-2 (5 nM) supprimiert die Erhöhung der hämodynamisch stimulierten Endothelin-1-Sekretion der Lungen-Endothelzellen über 16 Stunden, induziert durch Anwenden eines niederen Arterien-Scherdrucks (18 dyn/cm²) und eines hohen Abschlussdrucks (30 mm Hg), verglichen zu normalen Werten (30 oder 50 dyn/cm², 10 mm Hg) (n = 3 in jedem Fall). P < 0,05;.30 mm Hg gegenüber 10 mm Hg. b exogene RLX-2 (10 nM) inhibiert 4 und 8 Stunden (n = 3 für jede Gruppe) den angiotensin-IIstimulierten Anstieg der Endothelin-I-Sekretion aus Lungenendothelzellen. Die Blockierung des ET_b- Rezeptors durch A-192621 (500 nM) unterbindet diesen RLX-Effekt vollständig. P < 0,05; * Angiotensin II gegenüber Kontrolle; # Angiotensin II gegenüber Angiotensin + RLX. Die Erhöhung von Endothelin-1 in Gegenwart von A-192621 verglichen mit unbehandelten Kontrollen ist ein gut bekanntes Phänomen und wird der Blockierung der ET_B-ermittelten Clearance des Peptids¹⁸ zugeschrieben. c Angiotension II (100 nM) erhöht die Preproendothelin-1(PPET-1)- und den Endothelin-Converting-Enzym (ECE)-mRNA-Spiegel (RT- PCR); der Haupteffekt von RLX-2 in Verbindung mit Angiotensin-II ist eine massive Hochregulierung der ET_B-Rezeptor-mRNA (Southern-Blot der RT-PCR- Produkte). Darstellungsbeispiel aus drei unabhängigen Versuchen. Markierungen des Southern-Blots gelten auch für die RT-PCR-Spuren. d Inverse Korrelation zwischen linksventrikulärem Plasma-RLX und dem linksventrikulärem Plasma-Endothelin-1 in Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz (n = 14). Tabelle 1 Hämodynamische Werte an der Grundlinie

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26. Holm, S. A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Stat. 6, 65-70 (1979).

Claims (11)

1. Verfahren zur Diagnose oder Prognose von Herzversagen oder Herzinsuffizienz und gegebenenfalls des Bedarfs einer vorbeugenden Behandlung, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Relaxinpeptiden oder Fragmenten oder Isoformen hiervon in einer Probe der Körperflüssigkeit bestimmt wird. 1. A method for the diagnosis or prognosis of heart failure or heart failure and possibly the need for preventive treatment, characterized in that the amount of relaxin peptides or fragments or isoforms thereof is determined in a sample of the body fluid. 2. Verfahren nach Anspruch 1 unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die Peptide oder Fragmente oder Isoformen von Relaxin binden. 2. The method according to claim 1 using polyclonal or monoclonal antibodies, the peptides or Bind fragments or isoforms of Relaxin. 3. Verfahren nach Anspruch 2 unter Verwendung eines Immunoassays, der ein kompetitiver oder Sandwich- Immunoassay ist. 3. The method according to claim 2 using a Immunoassays that are a competitive or sandwich Is immunoassay. 4. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 3, wobei die Körperflüssigkeit Blutplasma oder Blutserum ist. 4. The method according to any preceding claim 1 to 3, the body fluid being blood plasma or Is blood serum. 5. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 4, wobei die Menge an H1- und H2-Relaxinpeptid bestimmt wird. 5. The method according to any preceding claim 1 to 4, the amount of H1 and H2 relaxin peptide is determined. 6. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 5, wobei die Menge an H2-Relaxinpeptid oder Fragmenten hiervon bestimmt wird. 6. The method according to any preceding claim 1 to 5, the amount of H2 relaxin peptide or fragments is determined by this. 7. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 6, wobei das Herzversagen leichte oder moderate Herzinsuffizienz (Congestive Heart Failure) ist. 7. The method according to any preceding claim 1 to 6, with heart failure mild or moderate Heart failure (congestive heart failure) is. 8. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 7 zur Überwachung der Wirkung einer prophylaktischen medizinischen Behandlung. 8. The method according to any preceding claim 1 to 7 to monitor the effect of a prophylactic medical treatment. 9. Verwendung von Relaxinpeptiden oder Fragmenten oder Isoformen hiervon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder prophylaktischen Behandlung von Herzinsuffizienz (Congestive Heart Failure). 9. Use of relaxin peptides or fragments or Isoforms thereof for the manufacture of a medicament for Treatment or prophylactic treatment of Heart failure (congestive heart failure). 10. Verwendung von Relaxinpeptiden oder Fragmenten oder Isoformen hiervon zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung oder Modulierung des Effekts von Endothelin-1 und Angiotensin-II. 10. Use of relaxin peptides or fragments or Isoforms thereof for the manufacture of a medicament for Inhibiting or modulating the effect of endothelin-1 and angiotensin-II. 11. Verwendung von H2-Relaxinpeptid zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Behandlung von Herzversagen. 11. Use of H2 relaxin peptide for the production of a Medicament for the prophylactic treatment of Heart failure.