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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von biologischen Substanzen,
insbesondere von Mikroorganismen oder deren Bestandteilen, und Biosensoren
zur Umsetzung der Verfahren.
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Sensoren
sind Einrichtungen zum Fühlen oder
Detektieren von physikalischen oder chemischen Größen oder
von Substanzen. Zu den Sensoren zur Detektion von Substanzen gehören insbesondere
Biosensoren, mit denen biologische Substanzen erfassbar sind. Unter
biologischen Substanzen (oder: Biokomponenten) werden hier allgemein
Stoffe, Verbindungen, Makromoleküle
oder Aggregate biologischen Ursprungs oder entsprechende komplexere
Materialien, wie z. B. lebende oder tote biologische Zellen, Zellgruppen
oder Zellbestandteile verstanden. Biosensoren funktionieren auf
der Grundlage von Affinitätsbeziehungen,
wie sie beispielsweise zwischen Antigenen und Antikörpern oder
einem Enzym oder einem Substrat bestehen. Zwischen einer biologischen
Substanz, die in einer Probe erfasst werden soll, und einer Substanz
(signalgebendes Material) im Biosensor läuft eine biochemische Reaktion
ab, deren Produkt beispielsweise mit physikalischen Methoden erfasst
wird.
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Besondere
Anforderungen bestehen an Biosensoren, die zur Detektion von Mikroorganismen, insbesondere
von biologischen Krankheitserregern, eingerichtet sind. Zu diesen
Anforderungen zählen insbesondere
eine hohe Selektivität
und Funktionssicherheit unter praktischen Einsatzbedingungen außerhalb
des Labors, z. B. im mobilen Einsatz wie insbesondere im öffentlichen
Raum (Flughäfen,
Bahnhöfe
usw.).
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Das
Funktionsprinzip eines herkömmlichen Biosensors
für Mikroorganismen
ist in 10 illustriert.
Der herkömmliche
Biosensor 10' (siehe 10a) umfasst eine Suspensionskammer 20' mit einer Einführeinrichtung 30', einer Detektoreinrichtung 40' und einem Detektorbereich 50'. Der Detektorbereich 50' wird durch
ein Substrat gebildet, auf dem als signalgebende Materialien 21' B-Lymphozyten 22' immobilisiert
angeordnet sind. In der Suspensionskammer 20' ist eine Nährlösung zur Versorgung der lebenden
B-Lymphozyten 22' angeordnet. Über die
Einführeinrichtung 30' wird eine Probe
mit den zu detektierenden Mikroorganismen 1' in die Suspensionskammer 20' eingeführt. Die
B-Lymphozyten 22' tragen
spezifische Antikörper 23', die für eine Bindung
mit dem zu detektierenden Mikroorganismus eingerichtet sind. Die
B-Lymphozyten 22' sind ferner durch
genetische Manipulation so gebildet, dass bei Ankopplung von einem
oder mehreren Mikroorganismen 1' an den Antikörpern 23' grün fluoreszierende Proteine 25' (sogenannte
GFP's) erzeugt werden.
In der Detektoreinrichtung sind eine Anregungs-Lichtquelle und ein
optischer Detektor vorgesehen, die auf die Anregung und Detektion
der GFP-Fluoreszenz abgestimmt
sind.
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Bei
Einführung
von Mikroorganismen 1' in die
Suspensionskammer 20' kommt
es zur Anbindung an den Antikörpern 23' der B-Lymphozyten 22' (siehe 10b). Es kommt zur GFP-Produktion und zur
Anregung der GFP-spezifischen Fluoreszenz (Pfeil F), die ein Signal
für das
Auftreten der Mikroorganismen ist. Der herkömmliche Biosensor mit immobilisierten
Lymphozyten besitzt zwar den Vorteil einer hochempfindlichen Zellreaktion,
die technisch relativ einfach in ein optisches und elektrisches
Signal umsetzbar ist. Es treten jedoch die folgenden Nachteile auf,
die die Anwendbarkeit dieser Biosensoren erheblich einschränken.
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Nachteilig
ist in erster Linie die Handhabung und Stabilität der zellbasierten Biosensoren.
B-Lymphozyten oder auch andere Zellen höherer Organismen (Säuger) müssen unter
sterilen Bedingungen gehalten werden. Die Zellen sind empfindlich
gegenüber
Erschütterungen
und Temperaturschwankungen. Es sind technische Maßnah men
zur Erhaltung der Vitalität
der Zellen zu treffen. Außerdem
muss die Zellvitalität
laufend geprüft
werden. Dadurch wird der Aufbau des Biosensors kompliziert. Die
geforderte Sterilität
steht in inhärentem
Widerspruch zur Detektion von Mikroorganismen aus einem Umgebungsmilieu.
Mit der Probe, z. B. aus der Luft werden laufend die verschiedensten
Arten biologischer Erreger in den Biosensor aufgenommen, die die
Zellen 22' angreifen
können
oder wie im Fall von Bakterien um die gemeinsame Nahrungsquelle
im Sensor konkurrieren.
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Ein
weiterer Nachteil der herkömmlichen
Biosensoren besteht in der geringen Reaktionszeit. Der Prozess zur
Genexpression und Signalkettenverknüpfung, in dessen Ergebnis die
grüne GFP-Fluoreszenz
messbar ist, dauert mindestens 10 Minuten bis zu einer Stunde. Derart
lange Ansprechzeiten sind jedoch insbesondere bei der Detektion
gefährlicher
Mikroorganismen unannehmbar.
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Weitere
Nachteile der herkömmlichen
Biosensoren bestehen in der geringen Funktionsfähigkeit, in der eingeschränkten Lagerfähigkeit
und Einsatzdauer, in der beschränkten
Simultandetektion verschiedener Erreger und in der Gefahr eines
Fehlalarms.
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In
US 5 104 791 A wird
ein Verfahren zur Detektion von Viren beschrieben, wobei eine Konglomeratbildung
mit Hilfe biologischer Substanzen mit substanzspezifischen Bindungsstellen
stattfindet. In
US 6
187 546 B1 wird ein Verfahren zur Isolation von Säugetierzellen
beschrieben, bei dem die Zellen mit Hilfe von „Beads", an denen Antikörper angeheftet wurden, gefangen
werden. Unter Verwendung eines magnetischen Feldes können die „Beads" mitsamt den an ihnen
haftenden Zellen aus einer Suspension isoliert werden.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Detektion
biologischer Substanzen bereitzustellen, mit dem die Nachteile herkömmlicher
Detektionsverfahren überwunden
werden. Das neue Detektionsverfahren soll sich insbesondere durch
eine hohe Zuverlässigkeit,
kurze Ansprechzeit und dauerhafte und erweiterte Einsetzbarkeit
auszeichnen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, einen verbesserten
Biosensor zur Umsetzung des Verfahrens bereitzustellen. Der erfindungsgemäße Biosensor
soll sich insbesondere durch einen vereinfachten Aufbau, eine erhöhte Funktionssicherheit und
eine Regenerationsfähigkeit
auszeichnen.
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Diese
Aufgaben werden durch ein Verfahren und einen Biosensor mit den
Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 und
7 gelöst.
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Vorteilhafte
Ausführungsformen
der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Die
Grundidee der Erfindung ist es, bei der Detektion biologischer Substanzen
als signalgebende Materialien Partikel mit substanzspezifischen
Bindungsstellen zu verwenden, die in einer Suspension frei beweglich
sind und bei Anwesenheit mindestens einer gesuchten Targetsubstanz
zu Partikelaggregaten verknüpft
werden können,
die mit physikalischen Methoden detektierbar sind. Die Verwendung
der frei suspendierten Partikel einerseits und die Detektion von
Partikelaggregaten andererseits liefern eine Reihe von Vorteilen,
die das erfindungsgemäße Verfahren
den herkömmlichen
Techniken weit überlegen machen.
Die Partikelaggregation besitzt den Vorteil einer geringen Ansprechzeit
und effektiven Detektierbarkeit. Es werden vorzugsweise Partikel
aus nicht-lebenden, insbesondere synthetischen Materialien verwendet.
In diesem Fall stellen die Vitalitätserhaltung und die Sterilität des Sensors
keine Probleme dar. Die Partikel mit substanzspezifischen Bindungsstellen
repräsentieren
zwar tote Materie, die dennoch durch die Targetsubstanz-induzierte
Partikelaggregation auf die Anwesenheit biologisch wirksamer Targetsubstanzen
anspricht.
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Gemäß einer
wichtigen Ausführungsform
der Erfindung wird die Partikelaggregation als Änderung der Transparenz, Fluoreszenz
oder Streuung der Suspension, die die Probe, die spezifisch bindenden Partikel
und gegebenenfalls Partikelaggregate enthält, optisch detektiert oder
visuell beobachtet. Vorteilhafterweise werden durch die Aggregation
in der Suspension größere Teilchen
gebildet, die sich auf die optischen Eigenschaften der Suspension
auswirken.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung werden die Partikelaggregate in einem Detektorbereich
gesammelt und detektiert. Im Detektorbereich der Sensorkammer werden
Kräfte
er zeugt, unter deren Wirkung Partikelaggregate im Detektorbereich
gesammelt werden, einzelne Partikel jedoch den Detektorbereich verlassen
können.
Der Detektorbereich zeichnet sich durch die lokale Ausbildung von
Kräften
aus, die selektiv ausschließlich auf
die Aggregate wirken. Die Sammlung oder Anreicherung der Partikelaggregate
besitzt den Vorteil einer erhöhten
Sensitivität
der Detektion. Wenn die Partikelaggregate im suspendierten Zustand
angereichert werden, ergibt sich als zusätzlicher Vorteil einer schnellen
Anreicherung im Volumen und damit einer Verkürzung der Ansprechzeit. Wenn
die Partikelaggregate im Festphasen-adsorbierten Zustand angereichert
werden, so kann vorteilhafterweise auf Maßnahmen zur Aggregatsammlung
beispielsweise unter Verwendung äußerer Felder
verzichtet werden.
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Die
erfindungsgemäße Detektion
der Partikelaggregate erfolgt beispielsweise mit optischen oder
elektrischen Messungen. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Messsignal zur Erfassung der Partikelaggregate als
Differenzsignal zwischen einem Detektorsignal und einem Referenzsignal
ermittelt. Das Detektorsignal repräsentiert das Vorhandensein
und/oder die Menge der Partikelaggregate im Detektorbereich. Das
Referenzsignal repräsentiert
ein Untergrundsignal, das außerhalb
des Detektorbereiches ermittelt wird.
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Ein
weiteres vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der
Erzeugung einer Strömung
der Suspension mit der Probe, den Partikeln mit substanzspezifischen
Bindungsstellen und den gegebenenfalls gebildeten Partikelaggregaten.
Die Suspensionsströmung
(vorzugsweise Ringströmung)
durchströmt
wiederholt den Detektorbereich, in dem die Partikelaggregate aus
der Suspension festgehalten werden. Durch diese Maßnahme wird
die Sensitivität
der Detektion erhöht
und die Ansprechzeit der Detektion verkürzt.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt die Detektion in einer Suspension, die verschiedene
Partikelarten mit verschiedenen substanzspezifischen Bindungsstellen enthält. Für zwei oder
mehr gesuchte Targetsubstanzen sind entsprechend zwei oder mehr
Partikelarten mit zugehörigen
Bindungsstellen oder Partikel mit zwei oder mehr substanzspezifischen
Bindungsstellen vorgesehen. Die Partikel werden vorzugsweise je nach
den gesuchten Targetsubstanzen in getrennten Detektorbereichen angereichert
und detektiert. Vorteilhafterweise können gleichzeitig verschiedene
Mikroorganismen mit hoher Spezifität und Zuverlässigkeit
erfasst werden.
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Biosensor zur Umsetzung des
genannten Verfahrens. Der erfindungsgemäße Biosensor umfasst insbesondere
eine Suspensionskammer zur Aufnahme einer Suspension mit Partikeln
mit substanzspezifischen Bindungsstellen, eine Einführeinrichtung
zur Einführung
einer Probe in die Suspension und eine Detektoreinrichtung zur Erfassung
von Partikelaggregaten. Der erfindungsgemäße Biosensor besitzt den Vorteil
eines erheblich vereinfachten Aufbaus. Der Biosensor kann als sogenannter
Sensorchip miniaturisiert und mobil verwendet werden. Die Funktionsfähigkeit
des Biosensors ist von den Umgebungsbedingungen, wie z. B. Erschütterungen,
Temperatur und dgl. relativ unabhängig. Er ermöglicht eine
Lagerung über
beliebige Zeiträume,
eine einfache Reinigung und Regeneration.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung weist die Suspensionskammer mindestens einen Detektorbereich
auf, der zur Aggregatanreicherung ausgebildet und auf den die Detektoreinrichtung
gerichtet ist. Der Detektorbereich wird beispielsweise durch eine
Festphase an einer Wand der Suspensionskammer oder durch einen Teilbereich
der Suspensionskammer mit einer Felderzeugungseinrichtung zur Erzeugung
von Rückhaltefeldern
für die
Partikelaggregate gebildet. Die Felderzeugungseinrichtung um fasst
vorzugsweise Elektroden, die zur dielektrophoretischen Sammlung
von Partikelaggregaten ausgebildet sind.
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Weitere
besonders bevorzugte Merkmale des erfindungsgemäßen Biosensors sind die Bereitstellung
eines Strömungsgenerators
zur Erzeugung einer Strömung
in der Suspensionskammer, die Ausbildung der Einführeinrichtung
als permeable Membran, durch die die Probe aus der Umgebungsluft
direkt in die Suspensionskammer überführt werden kann
und die Bereitstellung eines schnell ansprechenden Alarmsystems,
das die Erzeugung der Partikelaggregate aus den Partikeln mit substanzspezifischen
Bindungsstellen und den zu detektierenden Substanzen signalisiert,
z. B. anzeigt, hörbar
macht oder anderweitig dem Nutzer des Biosensors mitteilt.
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Die
Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Der Biosensor
besitzt eine kleine und lageunabhängige Bauform. Er ist über längere Zeiträume, z.
B. über
einen oder mehrere Tage, einsatzfähig. Vorteilhafterweise ist
eine schnelle Aktivierbarkeit gegeben. Er kann ohne weiteres auf
verschiedene Typen von Mikroorganismen angepasst werden. Ein Fehlalarm
ist praktisch ausgeschlossen. Das Verfahren ist unter den verschiedensten
Bedingungen, insbesondere mobil oder stationär, an technischen Einrichtungen
oder am Menschen einsetzbar.
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Ein
besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Biosensors besteht in der
Möglichkeit
einer vollständigen
Reinigung und Regenerierbarkeit durch Waschen und Neubefüllung. Der
Biosensor ist wartungsfrei. Dies ist besonders bei einem massenhaften,
routinemäßigen Einsatz
von Bedeutung. Lebende Zellen sind als Sensormaterial nicht zwingend
erforderlich, so dass Sterilitätsanforderungen
nicht eingehalten werden müssen
und der Sensor durch Staub und unkritische Substanzen (ungefährliche
Mikroorganismen) kontaminiert werden kann, ohne dass ein Alarm ausgelöst wird.
Je nach Suspensionsbefüllung
und Partikelausstattung lassen sich in einem System parallel oder
in Serie nacheinander mehrere Biokomponenten selektiv überwachen
und detektieren.
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Weitere
Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im folgenden unter
Bezug auf die beigefügten
Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
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1 ein
Schema eines erfindungsgemäßen Biosensors,
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2 einen
erfindungsgemäß verwendeten Partikel
mit substanzspezifischen Bindungsstellen,
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3 eine
Illustration einer erfindungsgemäßen Partikelaggregation,
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4, 5 schematische
Teilansichten von Biosensoren gemäß weiteren Ausführungsformen
der Erfindung,
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6 weitere
Einzelheiten eines erfindungsgemäßen Biosensors,
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7 eine
schematische Teilansicht eines Biosensors gemäß einer weiteren Ausführungsform der
Erfindung,
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8, 9 Illustrationen
einer Ausführungsform
der erfindungsgemäß verwendeten
Einführeinrichtung,
und
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10:
Illustrationen eines herkömmlichen Biosensors
(Stand der Technik).
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1 zeigt
in schematischer Übersichtsdarstellung
Komponenten eines erfindungsgemäßen Biosensors 10.
Je nach Anwendungsfall sind alle Komponenten in Kombination oder
nur Teilkomponenten vorgesehen oder bestimmte Merkmale modifiziert ausgebildet.
Das Schema dient lediglich Illustrationszwecken, ohne auf bestimmte Größen, Größenverhältnisse,
Formen oder Anordnungen der Teile erfindungsgemäßer Biosensoren beschränkt zu sein.
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Allgemein
umfasst ein erfindungsgemäßer Biosensor 10 mindestens
eine Suspensionskammer 20, mindestens eine Einführeinrichtung 30 und
mindestens eine Detektoreinrichtung 40. Die Suspensionskammer 20 ist
zur Aufnahme einer Suspension mit Partikeln 21 (vergrößert eingezeichnet,
siehe 2) eingerichtet. Mindestens Teilbereiche der Kammerwand
bestehen aus einem transparenten Material, z. B. Kunststoff. Der
Biosensor kann in Form eines Sensorchips als mobiles System gebildet sein.
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Die
Einführeinrichtung 30 ist
in eine Wand der Suspensionskammer 20 integriert oder als
gesonderte Komponente an der Suspensionskammer 20 angebracht.
Die Einführeinrichtung 30 stellt
die Schnittstelle zwischen dem gasförmigen oder flüssigen Außenmedium
und der Suspension im Sensor dar und dient der Einführung einer
Probe oder von Teilen einer Probe in die Suspensionskammer 20.
Es ist beispielsweise eine Austauschermembran (siehe 6, 8, 9)
zur Übernahme
von Bestandteilen aus einer gasförmigen
Probe (z. B. Umgebungsluft) in die Suspension oder eine Dosiereinrichtung
zur Zuführung
einer flüssigen
Probe (z. B. aus Grundwasser) in die Suspension vorgesehen. Die Dosiereinrichtung
umfasst beispielsweise eine Leitung mit einem Ventil, ggf. mit einer
Saugpumpe.
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Die
Detektoreinrichtung 40 ist je nach Art des physikalischen
Messverfahrens zur Detektion von Partikelaggregaten in der Suspensionskammer 20 ausgebildet.
Sie ist in eine Kammerwand integriert oder außerhalb der Suspensionskammer 20 angeordnet.
Es ist beispielsweise eine Kombination aus Anregungs-Lichtquelle
und optischem Sensor (z. B. CCD-Sensor) oder eine anderweitige Messeinrichtung
zur Erfassung physikalischer Eigenschaften der Suspension, insbesondere
im Detektorbereich 50 vorgesehen. Als Detektoreinrichtung
kann beispielsweise auch eine Massendichte messeinrichtung zur lokal
sensitiven Ermittlung der Massendichte in der Suspension unter Verwendung
von Ultraschall vorgesehen sein. Die Detektoreinrichtung 40 ist
mit einer Mess- und Steuereinrichtung 45 verbunden, die
mit einer Signaleinrichtung 60 gekoppelt ist. Die Signaleinrichtung 60 umfasst
beispielsweise optische (61), akustische (62)
und/oder mechanische (63) Signalisierungsmittel. Als optische
Signalisierungsmittel werden beispielweise LED's verwendet. Eine grüne LED zeigt die Betriebsbereitschaft
des Sensors an. Eine rote LED signalisiert ein Ansprechen des Sensors.
Anstelle der Signaleinrichtung 60 kann auch ein (nicht
dargestellter) Sender vorgesehen sein, der Systemzustände und
insbesondere die Detektion der zu untersuchenden Substanz drahtlos
an eine Zentraleinheit (nicht dargestellt) übermittelt. Die genannten Komponenten
sind in einem Gehäuse 70 angeordnet.
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Der
Detektorbereich 50, in dem gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung eine Anreicherung von Partikelaggregaten vorgesehen ist,
umfasst eine Felderzeugungseinrichtung zur Sammlung oder Zurückhaltung
der Aggregate in einem suspendierten Zustand im Detektorbereich 50 oder
eine Adsorptionsschicht zur Immobilisierung von Aggregaten. Die
Felderzeugungseinrichtung kann je nach Anwendungsfall mit der Mess-
und Steuereinrichtung 45 verbunden sein (siehe gestrichelter
Pfeil), um die Parameter der Aggregatanreicherung in Abhängigkeit
von Detektorsignalen zu steuern.
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Das
Bezugszeichen 80 illustriert schematisch ein weiteres vorteilhaftes
Merkmal der Erfindung, wonach im Biosensor 10 mit einem
Strömungsgenerator
eine Ringströmung
erzeugt wird. Die Suspension in der Suspensionskammer 20 wird über einen
Strömungskreislauf 81,
der auch durch eine entsprechend geformte Suspensionskammer 20 gebildet
sein kann, mehrfach am Detektorbereich 50 vorbeigeführt (siehe 7).
Im Detektorbereich werden lokal Kräfte ausgeübt, die selektiv ausschließlich auf die
Aggregate wirken. Aggregate, die bei einem ersten Durchtritt durch
den Detektorbereich noch zu klein für ein Festhalten sind, wachsen
im Umlauf und werden beim nächsten
oder einem folgenden Durchtritt gesammelt.
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Das
Volumen der Suspensionskammer 20 ggf. mit dem Umlauf wird
anwendungsabhängig
gewählt
und beträgt
bei mobilen Geräten
z. B. 10 μl
bis 10 ml. Es können
aber auch größere Volumina
bis in den 100 ml-Bereich vorgesehen sein.
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Das
Wirkprinzip der erfindungsgemäßen Stoffdetektion
basiert auf der Verwendung von Partikeln, die substanzspezifische
Bindungsstellen tragen und in einer Trägerflüssigkeit (im folgenden: Sensorsuspension)
frei suspendiert sind, als signalgebendes Material oder Sensorelement.
Ein Partikel 21 ist schematisch vergrößert in 2 illustriert.
Er besteht aus einem Partikelkörper 22,
der auf seiner Oberfläche
eine Vielzahl von Bindungsstellen 23, 24 trägt. Des
weiteren können,
wenn eine Fluoreszenzdetektion (siehe unten) vorgesehen ist und
der Partikel oder die nachzuweisende Substanz keine genügende Eigenfluoreszenz
besitzen, auf der Oberfläche oder
im Inneren fluoreszierende Moleküle 25 zur
Fluoreszenzmarkierung angeordnet sein. Die Fluoreszenzmarkierung 25 umfasst
vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder fluoreszierende Proteine
mit einer möglichst
hohen Fluoreszenzquantenausbeute, wie z. B. Fluoreszindiazetat.
Es kann auch eine Beladung der Partikel 21 mit einer ferromagnetischen Substanz
vorgesehen sein, wenn die Partikel 21 in einem Detektorbereich
mit einem magnetischen Sammelfeld konzentriert werden sollen.
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Der
Partikelkörper 22 ist
ein synthetisches inertes Teilchen aus einem Kunststoff- und insbesondere
Polymermaterial. Als Partikelkörper
werden beispielsweise kommerziell verfügbare "Beads", Liposomen, Latexkörper oder Gelpartikel verwendet.
Der Durchmesser der Partikelkörper 22 beträgt einige
Mikrometer (z. B. 3 bis 5 μm)
oder weniger bis in den Sub-Mikrometer-Bereich (z. B. bis hinab
zu 10 nm).
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Die
Bindungsstellen 23, 24 sind allgemein chemische
Substanzen, die spezifisch mit vorbestimmten Targetsubstanzen, die
detektiert werden sollen, Bindungen eingehen, gegenüber anderen,
in der Probe enthaltenen Stoffen jedoch inert sind. Für die Detektion
von Biokomponenten werden als Bindungsstellen vorzugsweise spezifische
Antikörper verwendet.
Die Antikörper
werden nach an sich bekannten Verfahren der Antikörperproduktion
gewonnen und nach ebenfalls bekannten molekularbiologischen Techniken
an die Partikelkörper
angekoppelt. Die Antikörper
werden beispielsweise aus B-Lymphozyten (z. B. der Maus) gewonnen.
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Auf
der Oberfläche
der Partikelkörper 22 befinden
sich mehrere Bindungsstellen. Zur Partikelaggregation müssen pro
Partikel mindestens zwei Bindungsstellen, vorzugsweise jedoch drei
oder mehr Bindungsstellen vorgesehen sein. Je nach Anwendungsfall
können
die Partikel 21 ausschließlich Bindungsstellen (z. B. 23)
tragen, die für
genau eine zu detektierende Targetsubstanz spezifisch bindend sind,
oder zwei oder mehr verschiedene Antikörper (z. B. 23, 24)
tragen, an denen verschiedene Targetsubstanzen ankoppeln. Im letzteren
Fall ist die Selektivität
des Detektionsverfahrens entsprechend auf eine Gruppe von Targetsubstanzen
beschränkt.
In der Sensorsuspension können
auch Gruppen mit verschiedenen Partikelarten enthalten sein, die
jeweils spezifische Bindungsstellen tragen. In diesem Fall ist die
Spezifität
des Biosensors ebenfalls eingeschränkt, falls nicht zusätzliche
Maßnahmen
zur selektiven Detektion der verschiedenen Partikelgruppen in verschiedenen
Detektorbereichen, z. B. durch verschiedene dielektrophoretische
Rückhaltebedingungen,
bereitgestellt werden.
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Die
Sensorsuspension besteht beispielsweise aus einer Elektrolytlösung oder
einer physiologischen Kochsalzlösung.
Die Zahl der Partikel mit substanzspezifischen Bindungsstellen in
der Sensorsuspension ist anwendungsabhängig gewählt. Sie beträgt beispielsweise
100 bis 106 je μl. Ein besonderer Vorteil des
erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, dass die Partikel 21 aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer
Aggregationsfreiheit im unbeladenen Zustand frei in der Sensorsuspension
verteilt sind. Die Sensorsuspension liefert somit ein isotropes
Grundsignal (z. B. Fluoreszenzsignal), das die Einsatzbereitschaft
des Biosensors anzeigt. Wenn die Partikel genügend klein sind, ist die Sensorsuspension
transparent und klar, was vorteilhafterweise visuell geprüft werden
kann.
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Wenn
sich in der Sensorsuspension die gesuchte Targetsubstanz befindet,
kommt es zu der in 3 illustrierten Partikelaggregation.
Die Targetsubstanz wird über
die Einführeinrichtung
(siehe unten) in die Sensorsuspension eingeführt und dort gelöst oder
frei suspendiert. Die Targetsubstanz enthält beispielsweise mindestens
eine gesuchte Biokomponente (z. B. Mikroorganismen, Viren oder Sporen) oder
Teile von diesen oder andere biologische Substanzen. Biokomponenten
sind beispielsweise auch Moleküle,
Verbindungen, Makromoleküle,
wie z. B. Proteine oder Lipide, oder Aggregate, die in biologischen
Systemen enthalten sind, oder lebende oder tote biologische Zellen,
Zellgruppen oder Zellbestandteile. Mikroorganismen umfassen beispielsweise
Bakterien oder andere Krankheitserreger.
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Die
Biokomponenten 1 treffen aufgrund der thermischen Bewegung
oder ggf. einer zusätzlichen gerichteten
oder ungerichteten Strömungsbewegung in
der Sensorsuspension nach kurzer Zeit auf freie Bindungsstellen 23,
an die sie spezifisch anbinden. Ferner treffen frei suspendierte
Partikel (z. B. 21) auf einen mit mindestens einer Biokomponente 1 beladenen
Partikel oder Partikelverbund. Es entsteht ein Partikelaggregat 26,
das gemäß der Schemadarstellung
in 3 ein irregulär
faden- oder netzartig gewachsener Verbund aus Partikeln 21 und Biokomponenten 1 darstellt.
Dieser Verbund kann je nach den quantitativen Verhältnissen
Dimensionen im Bereich von z. B. 0.2 bis 10 μm erhalten, wobei er weiter
in der Suspension frei suspendiert ist.
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Durch
Aggregatbildung werden allgemein die physikalischen Eigenschaften
der Sensorsuspension (z. B. optische Eigenschaften, Massendichteverteilung,
Viskosität
oder dgl.) verändert.
Im einfachsten Fall verursacht die Partikelaggregation beispielsweise
eine visuell beobachtbare Eintrübung,
wenn aus Partikeln 21 mit charakteristischen Größen kleiner
als die sichtbaren Lichtwellenlängen
zu streuenden Aggregaten wachsen. Für eine sensitive und automatisierbare
Detektion wird jedoch anstelle der visuellen Beobachtung die Messung
einer veränderten physikalischen
Größe der Sensorsuspension
bevorzugt. Dies wird im folgenden am Beispiel von Fluoreszenzmessungen
beschrieben.
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Zur
Fluoreszenzdetektion werden Partikel mit Eigenfluoreszenz oder einer
Fluoreszenzmarkierung 25 verwendet. Durch die Aggregatbildung ändert sich
die örtliche
Verteilung der fluoreszierenden Emitter in der Sensorsuspension.
Vor der Aggregatbildung ist ein isotrop verteiltes Fluoreszenz-Grundsignal
detektierbar, das sich in allen Volumenteilen der Sensorsuspension
gleichförmig
durch die Zahl der im Volumenteil enthaltenen einzelnen Partikel 21 bestimmt.
Während
und nach der Aggregatbildung kommt es entsprechend in manchen Volumenteilen zu
einer Verringerung und in anderen Volumenteilen zu einer Verstärkung der
Fluoreszenz. Diese Änderung
lässt sich
durch eine ortsselektive Fluoreszenzmessung erfassen.
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Unter
ortsselektiven Fluoreszenzmessung wird allgemein die lokal begrenzte
Anregung (Beleuchtung) und/oder Detektion der Fluoreszenz in einem
genügend
kleinen Volumenelement verstanden. Bei Messung mit einem ausreichend
schnell ansprechenden Detektor ergeben sich im Zeitverlauf des Fluoreszenzsignals
mit zunehmender Aggregatbildung Fluktuationen, die charakteristisch
für das
zeitweilige Auftreten von Partikelaggregaten im lokal angeregten
und/oder detektierten Bereich sind. Das Auftreten der Fluktuationen
kann als Maß für die Aggregatbildung
und damit für
die Detektion der gesuchten Targetsubstanz verwendet und in ein
Alarmsignal umgesetzt werden.
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Vorzugsweise
ist die Detektion der Partikelaggregate jedoch lokal auf mindestens
einen Detektorbereich 50 (siehe 1, 4, 5)
gerichtet, in dem eine Konzentration oder Anreicherung der Partikelaggregate 26 erfolgt.
Durch die Anreicherung wird die aggregat-induzierte Änderung
der örtlichen Fluoreszenzverteilung
vorteilhafterweise noch verstärkt,
so dass sich die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Detektion
weiter erhöht.
In einem Detektorbereich 50 werden die Partikel zusätzlichen Kräften ausgesetzt,
die selektiv bevorzugt auf die Partikelaggregate und weniger oder
gar nicht auf die einzelnen Partikel wirken. Die Kräfte umfassen
beispielsweise Kräfte
in elektromagnetischen Feldern (siehe z. B. 4) oder
chemische Bindungskräfte (siehe
z. B. 5). In elektromagnetischen Feldern werden beispielsweise
dielektrophoretische, magnetische oder optische Kräfte ausgeübt, unter
deren Wirkung die Partikelaggregate im Detektorbereich gesammelt
werden. Die Aggregatanreicherung erfolgt vorzugsweise unter Wirkung
elektromagnetischer Felder, da mit diesen Volumenkräfte erzeugt werden.
Mit Volumenkräften
lassen sich große
Aggregate stärker
beeinflussen als einzelne Partikel, was sich positiv auf die Ansprechzeit
eines erfindungsgemäßen Biosensors
auswirkt.
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In 4 ist
die Anreicherung von Partikelaggregaten 26 unter der Wirkung
elektromagnetischer Felder illustriert. Es ist ein Teil einer Suspensionskammer 20 mit
dem Detektorbereich 50 dargestellt, der von der Sensorsuspension
beispielsweise in Pfeilrichtung A durchströmt wird. Im Detektorbereich 50 sind
an den oberen und unteren Seitenwänden der Suspensionskammer
Elektroden 51 angeordnet, die mit einem Hochfrequenzgenerator 52 verbunden sind.
Im Detektorbereich 50 ist ferner die Detektoreinrichtung 40 mit
einer Anregungs-Lichtquelle 41 und einem Detektor 42 (jeweils
schematisch illustriert) angeordnet, die mit der Mess- und Steuereinrichtung 45 verbunden
sind. Die Fluoreszenzmessung erfolgt mit um 90° versetzten Strahlengängen der
Beleuchtung und Detektion. Alternativ zur Fluoreszenzmessung kann
die Detektoreinrichtung 40 auch zu einer Streulichtmessung
eingerichtet sein.
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Die
Elektroden 51 werden mit Hochfrequenzfeldern derart beaufschlagt,
dass sich in Strömungsrichtung
eine dielektrophoretische Feldbarriere bildet, die sich über die
Suspension erstreckt und teilchengrößenselektiv wirkt. Es wird
eine dielektrophoretische Kraft erzeugt, die so mit den Strömungskräften zusammenwirkt,
dass große
Teilchen im Detektorbereich 50 gehalten werden und kleine
Teilchen weiter strömen.
Die Manipulation dielektrischer Teilchen in hochfrequenten elektrischen
Feldern ist an sich bekannt, so dass es dem Fachmann möglich ist, die
Elektrodenformen und Feldparameter in Abhängigkeit vom Anwendungsfall
geeignet zu wählen.
Unter der dielektrophoretischen Kraftwirkung werden die Aggregate 26 im
Sensorbereich 50 zurückgehalten,
während
die einzelnen Partikel (nicht dargestellt) unter der Wirkung der
Suspensionsströmung
durch den Detektorbereich hindurchtreten. Durch die Konzentration
der Aggregate ergibt sich eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität im Detektorbereich 50.
Die Fluoreszenzmessung beispielsweise einer einzelnen Linie liefert
ein Detektorsignal, das bei Anstieg charakteristisch für das Auftreten
der Partikelaggregate ist. Wird ein bestimmter Schwellwert überschritten, spricht
der Biosensor 10 an. Von der Mess- und Steuereinrichtung 45 wird
ein Signal an die Signaleinrichtung 60 (siehe 1)
gegeben. Die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung kann
noch erhöht
werden, indem die Anregungs-Lichtquelle 41 auch einen Volumenbereich
der Suspensionskammer 20 außerhalb des Detektorbereiches 50 be strahlt
oder entsprechend eine weitere Anregungs-Lichtquelle vorgesehen
ist. Mit dem Detektor 42 oder einem zusätzlichen Detektor kann ein Referenzsignal
erhalten werden. Ein Alarmsignal wird beispielsweise erzeugt, wenn
ein Differenzsignal zwischen dem Detektorsignal aus dem Detektorbereich 50 und
dem Referenzsignal einen vorbestimmten Schwellwert überschreitet.
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Die
Anregungs-Lichtquelle 41 ist beispielsweise eine LED. Als
Detektor 42 wird beispielsweise ein CCD-Sensor oder ein
anderes photosensitives Element verwendet. Zusätzlich können am Detektor 42 Filter
zur Abtrennung des Anregungslichts vorgesehen sein.
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Die
Sammlung der Partikelaggregate 26 an einer im Detektorbereich 50 vorgesehenen
Festphase 53 ist in 5 illustriert.
Die Festphase 53 besteht aus einer Vielzahl von substanzspezifischen
Bindungsstellen (z. B. Antikörpern),
die auf einem Substrat an einer Wand der Suspensionskammer 20,
direkt auf der Wand oder auf dem Detektor angebracht sind. Entsprechend
dem oben erläuterten
Aggregationsprinzip erfolgt an der Festphase 53 eine Bildung, ein
Wachstum und eine Sammlung von Aggregaten 26. Die Konzentration
der Aggregate 26 kann analog zu den oben beschriebenen
Prinzipien durch eine Fluoreszenzmessung (Absolutmessung oder Referenzmessung)
detektiert und alarmiert werden. Die Festphasen-Sammlung gemäß 5 besitzt
zwar eine geringere Ansprechzeit als die Sammlung in der freien
Suspension gemäß 4,
ermöglicht
jedoch vorteilhafterweise einen erheblich vereinfachten Aufbau des
Biosensors 10. Es ergibt sich ferner als Vorteil gegenüber dem
herkömmlichen
Prinzip gemäß 10,
dass sich das signalgebende Material bei Ansprechen des Biosensors
im Detektorbereich 50 durch Aufbau der fluoreszierenden
Aggregate vorteilhafterweise schnell sammelt. Bei den in 4 und 5 gezeigten
Prinzipien der Aggregatanreicherung sind Ansprechzeiten des Biosensors 10 im
Sekundenbereich möglich.
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Alternative
Sammelprinzipien basieren auf optischen Kräften, die beispielsweise wie
bei Laserpinzetten mit Lasern ausgeübt werden, oder magnetischen
Kräften.
Am Detektorbereich können
beispielsweise Permanentmagneten angeordnet sein, die auf Aggregate
eine stärkere
Rückhaltekraft
ausüben
als auf die einzelnen Partikel.
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Weitere
Einzelheiten eines Biosensors 10, der beispielsweise auf
den in den 4 und 5 illustrierten
Prinzipien beruht, sind in 6 illustriert. Im
Gehäuse 70 sind
die Suspensionskammer 20 (teilweise dargestellt) mit der
Einführeinrichtung 30, der
Detektoreinrichtung 40, der Mess- und Steuereinrichtung
(nicht dargestellt) und der Signaleinrichtung 60 untergebracht.
Das Gehäuse 70 umfasst
Ein- und Austrittsfenster 71, 72 zur Aufnahme
und Abgabe eines Mediums (z. B. Umgebungsluft), aus dem eine Probe
untersucht werden soll. Im Gehäuse
kann auch ein Ventilator (nicht dargestellt) zum Ansaugen von Umgebungsluft
in das Gehäuse 70 vorgesehen sein.
Des weiteren kann im Gehäuse 70 eine
Befeuchtungseinrichtung (nicht dargestellt) vorgesehen sein, mit
der das aufgenommene Medium angefeuchtet wird, um ein Austrocknen
des Sensors zu behindern. Alternativ kann auch die Einführeinrichtung 30 an
einem Gehäusefenster
nach außen
hin frei liegen, so dass eine Probe direkt aus der Umgebung in die
Suspensionskammer 20 aufgenommen werden kann.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist die Strömungskammer 20 mit
einem Strömungsgeneratur 80 ausgestattet.
Mit dem Strömungsgenerator 80 wird
in der Sensorsuspension eine Flüssigkeitsbewegung
erzeugt, um die Aggregatbildung bei Auftreten der Targetsubstanz
zu fördern
und die Aggregate am Detektorbereich 50 vorbeizuführen. Die
Suspensionskammer 20 ist vorzugsweise als endloser, umlaufender
Kanal (z. B. als Ringkammer oder Zylinderkammer) aufgebaut, in dem
mit dem Strömungsgenerator 80 eine
umlaufende Strömung
erzeugt wird, wie dies in 7 illustriert ist.
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7 zeigt
eine Suspensionskammer 20 in Form eines flachen Kreiszylinders,
in dem eine Ringströmung
der Sensorsuspension gebildet ist. An die Suspensionskammer 20 sind
ein Zulauf 82 und ein Ablauf 83 angeschlossen,
die einen geschlossenen Strömungskreislauf 81 bilden
können
oder der Systembefüllung
und -entleerung dienen. Die Einführeinrichtung 30 (nicht
dargestellt) ist direkt mit der Suspensionskammer 20 oder
alternativ mit einem Teil des Strömungskreislaufs 81 verbunden.
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Des
weiteren ist an der Suspensionskammer 20 ein Detektorbereich 50 zur
Anreicherung der sich im Biosensor 10 gegebenenfalls bildenden
Partikelaggregate vorgesehen. Es ist beispielhaft ein Detektorbereich 50 mit
einer Vielzahl von Elektroden 51 zur dielektrophoretischen
Sammlung der Partikelaggregate (siehe 4) vorgesehen.
Des weiteren ist die Anregungs-Lichtquelle 41 der Detektoreinrichtung
an der Suspensionskammer 20 angebracht. Der Darstellung
gemäß 7 ist
zu entnehmen, dass bei der Realisierung eines Detektorbereiches 50 zur
Anreicherung der Aggregate die Anregungs-Lichtquelle 41 nicht
notwendigerweise lokal auf den Detektorbereich 50 gerichtet
sein muss. Vielmehr ist es möglich, mit
einer geeigneten Optik die gesamte Suspensionskammer 20 zu
beleuchten und eine lokal selektive Detektion am Detektorbereich 50 und
gegebenenfalls eine Referenzmessung außerhalb des Detektorbereichs 50 vorzunehmen.
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Während des
Sensorbetriebs wird mit dem Strömungsgenerator
eine Ringströmung
erzeugt, die gegebenenfalls auch für den Medienumlauf durch die Zu-
und Abläufe 82, 83 sorgt.
Der Strömungsgenerator
ist beispielsweise durch ein magnetisches (Magnetrührer), dielektrophoretisches,
thermisches oder elektrohydrodynamisches Rührwerk gebildet. Die über die
Einführeinrichtung 30 in
die Sensorsuspension eingebrachten Probenbestandteile gelangen über den
Zulauf 82 in die Suspensionskammer 20. Beim Auftreten
der Targetsubstanz erfolgt die Aggregatbildung. Die wachsenden Ag gregate
werden im Detektorbereich 50 aus der Ringströmung zurückgehalten
und konzentriert. Bei Überschreiten
eines vorbestimmten Differenzwertes der Fluoreszenz relativ zur
Umgebungsfluoreszenz in der Suspensionskammer 20 außerhalb
des Detektorbereichs 50 wird ein Alarm signalisiert. Die
Ringströmung
wird während des
Betriebes ununterbrochen aufrechterhalten.
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Der
in den 6 und 7 illustrierte Biosensor ist
ferner mit den folgenden Komponenten ausgestattet, die im einzelnen
nicht gezeigt sind. Es ist eine Mess- und Steuereinrichtung zum
Betrieb der optischen Detektion, zur Signalauswertung und zur Alarmerzeugung
vorgesehen. Des weiteren ist eine Felderzeugungseinrichtung (z.
B. Hochfrequenzgenerator) für
die dielektrophoretische, magnetische und/optische Krafterzeugung
vorgesehen. Vorteilhafterweise zeigen die Erfahrungen aus der fluidischen Mikrosystemtechnik,
dass diese Schaltungen klein und mit geringem Energieverbrauch bereitgestellt werden
können,
so dass der Biosensor 10 ohne weiteres als mobiles Gerät realisiert
werden kann. Des weiteren kann der Biosensor mit einem Spül- und Suspensionskühlsystem,
gegebenenfalls mit einem Hilfstank, verbunden sein.
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In
den 8 und 9 sind Einzelheiten der erfindungsgemäß verwendeten
Einführeinrichtung 30 illustriert.
Die Einführeinrichtung 30 umfasst
beispielsweise eine Austauschmembran oder ein Diffusionsfenster 31,
das die Schnittstelle zwischen dem Inneren der Suspensionskammer 20 und
der Umgebung darstellt. Das Diffusionsfenster 31 ist beispielsweise
eine dünne
Membran mit Durchbrüchen
oder Poren. Die Membrandicke beträgt beispielsweise 3 μm. Die Poren
besitzen charakteristische Durchmesser im Bereich von z. B. 0.5
bis 40 μm.
Sie sind derart gewählt,
dass die jeweilige Targetsubstanz durch die Poren hindurchtreten
kann. Das Diffusionsfenster wird beispielsweise durch eine Oxid-
oder Siliziummembran mit entsprechenden Poren 32 gebildet.
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Die
Probeneinführung
erfolgt derart, dass das Außenmedium
(z. B. Außenluft),
das auf Mikroorganismen getestet werden soll, an der Außenseite des
Diffusionsfensters 31 (siehe 8a)
vorbeigeführt
wird. Dies erfolgt aktiv mit einem Ventilator oder passiv durch
in der Umgebung vorhandene Medienströmungen. Vorzugsweise ist die
Luftfeuchte im Außenraum
erhöht.
Dies besitzt den Vorteil, dass ein Austrocknen der Sensorsuspension
durch die Poren 32 vermindert wird.
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Die
in den meisten Fällen
hydrophilen Mikroorganismen gelangen auf den Suspensionsmeniskus 33 (siehe 8b), der an den Poren 32 gebildet
ist, oder auf die feuchte Oberfläche
des Diffusionsfensters 31 und von dort passiv in die Sensorsuspension. Die
Bildung des Suspensionsmeniskus 33 kann vorteilhafterweise
durch hydrophobe Materialien 34 am Rand der Poren gefördert werden.
Mit dem Strömungsgenerator
wird auf der Innenseite der Einführeinrichtung
laufend die Sensorsuspension vorbeigeführt. Es wird beispielsweise
eine laminare Strömung induziert.
Die Targetsubstanz kann in der oben beschriebenen Weise mit den
Partikeln in der Suspension wechselwirken, so dass Aggregate gebildet
werden. Die Strömungsgeschwindigkeit
in der Suspensionskammer 20 kann so eingestellt werden,
dass die einzelnen Partikel durch die dielektrophoretische Feldwirkung
im Detektorbereich 50 nicht zurückgehalten werden, während sich
die größeren Aggregate sammeln
und über
dem Detektor 42 aggregieren. Vorteilhafterweise kommt es
bei der Aggregation zu einem Lawineneffekt. Über die Partikel-Partikel-Polarisationswechselwirkungen
sammeln sich weitere einzelne Partikel und wachsende Aggregate an
den im Detektorbereich 50 festgehaltenen Partikelaggregaten.
Durch diesen Lawineneffekt wird die Empfindlichkeit des Biosensors
weiter erhöht.
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9 zeigt
die direkte Ankopplung der Einführeinrichtung 30 an
die Suspensionskammer 20. Es ist auch ein besonderer Vorteil
der Erfindung erkennbar, der sich auf die Herstellung des Biosensors bezieht.
Die Suspensionskammer 20 mit der Einführeinrichtung 30 können einstückig aus
einem Material hergestellt sein. Es wird beispielsweise Halbleitermaterial
oder Kunststoff mit an sich bekannten dreidimensionalen Strukturierungstechniken
geformt und den weiteren Komponenten (z. B. Elektroden) ausgestattet.
Der Verdunstungsschutz 73 ist eine Einrichtung zur Anfeuchtung
der Luft und besteht z. B. aus wassergetränktem Material.
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Die
Erfindung kann wie folgt modifiziert werden. Anstelle der synthetischen
Partikelkörper
des signalgebenden Materials können
auch Partikelkörper aus
biologischen Substanzen (z. B. lebende oder tote Zellen, wie lebende
oder tote B-Lymphozyten, oder Zellfragmente, wie Membranvesikeln)
verwendet werden. Es kann vorteilhafterweise eine besonders gute
Anpassung an die Betriebsbedingungen erzielt werden, was möglicherweise
auftretende Einschränkungen
bei der Handhabung der Partikel kompensiert. Die Bindungsstellen
können
anstelle von Biokomponenten auch für andere Targetsubstanzen,
wie z. B. synthetische Toxine, spezifisch bindend sein. Es können an
einem Biosensor mehrere Suspensionskammern und an jeder Suspensionskammer
mehrere Detektorbereiche vorgesehen sein.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung
sein.