DE10149714A1

DE10149714A1 - Esterase EstA aus Rhodococcus sp.

Info

Publication number: DE10149714A1
Application number: DE10149714A
Authority: DE
Inventors: Helmut Schwab; Marinka Gudelj-Wyletal; Anton Glieder; Harald Trauthwein
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2003-04-30
Also published as: WO2003031609A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase aus Rhodococcus sp., zu dieser homologe Proteine, Nukleinsäuren, kodierend für diese Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie die Herstellung und Verwendung dieser Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase aus Rhodococcus sp., zu dieser homologe Proteine, Nukleinsäuren kodierend für diese Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie die Herstellung und Verwendung dieser Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.
Hydrolasen sind eine große und vielfältige Gruppe von Enzymen, die neben Ester auch Peptide, Amide und Halide hydrolysieren können. Eine besondere Klasse stellen hierbei die lipolytischen und esterolytischen Enzyme dar, wobei die Abgrenzung der Esterasen (EC 3.1.1) gegenüber den Lipasen schwierig ist, da die Definition dieser Enzyme nicht auf der Struktur ihrer Substrate basiert, sondern eher auf ihrem physikalischen Zustand. Die Klassifikation der Esterasen in Abgrenzung zu den Lipasen erfolgt gewöhnlich aufgrund der Länge der Acylkette ihrer Ester- Substrate. Esterasen zeigen vorzugsweise Aktivität in Bezug auf wasserlösliche, kurzkettige Fettsäureester, während Lipasen höhere Aktivität zeigen in Bezug auf wasserunlösliche, emulsifizierte langkettige Fettsäuresubstrate [1, 2].
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen und Strukturen von Serinhydrolasen macht deutlich, dass ihr aktives Zentrum aus einer katalytischen Triade besteht, die aus einem Serin-, einem Aspartat- oder Glutamat- und einem Histidin-Rest zusammengesetzt ist [3-10]. Für die meisten Esterasen und Lipasen kann ein konserviertes Muster in der Umgebung des Serin des aktiven Zentrums gefunden werden. In der Prosite-Datenbank sind folgende Motive definiert und zwar für die Carboxylesterase-Familien vom Typ-B, "G-D-X-G" und "G-D-S-L" jeweils das Konsensus-Muster F-[GR]-G-x(4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G, [LIVM]-x- [LIVMF]-[SA]-G-D-S-[CA]-G-[GA]-x-L-[CA] bzw. [LIVMFYAG](4)-G-D-S-[LIVM]- x(1,2)-[TAG]-G[11]. Desweiteren kann noch das Klasse A β-Laktamase-Motiv ([F,Y]- X-[L,I,V,M,F,Y]-X-S-[T,V]-X-K-X-X-X-X-[A,G,L]-X-X-[L,C]) in einer spezifischen Klasse von Esterasen gefunden werden (Petersen, E. I., Valinger, G., Sölkner, B. Stubenrauch, G., Schwab H. (2001): A novel esterase from Burkholderia gladioli which shows high deacetylation activity on cephalosporins is related to β-lactamases and DD-peptidases. J. Biotechnol. 89: 11-25).
Darüberhinaus umfasst die Familie der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme eine Gruppe von Proteinen, die eine dreidimensionale Kernstruktur gemeinsam haben, obwohl keine signifikante Ähnlichkeit in der Primärstruktur festgestellt werden konnte. Während die katalytischen Spezifitäten der Mitglieder der alpha/beta- Hydrolase-gefalteten Enzyme völlig unterschiedlich voneinander sind, scheint ihr enzymatischer Mechanismus ähnlich zu sein [12]. Alle besitzen eine katalytische Triade mit der in der Aminosäuresequenz aufeinanderfolgenden Konfiguration Nukleophil-Säure-Histidin. Diese drei Aminosäuren, befinden sich an ähnlichen topologischen Orten im korrekt gefalteten Protein, obwohl sie durch eine variable Anzahl von Aminosäuren in der Primärstruktur jedes Enzyms voneinander getrennt sind. Bei allen bekannten Familienmitgliedern dieser Hydrolasen ist das Nukleophil, meistens ein Serin-Rest, in einer konservierten Sequenz lokalisiert, dem "nukleophilen Ellbogen", mit einer vorgeschlagenen Konsensusregion Sm-X-Nu-X- Sm-Sm, wobei Sm für eine kleine Aminosäure, in der Regel Glycin, X für eine beliebige Aminosäure und Nu für das Nukleophil steht, welche eine strukturelle Gemeinsamkeit der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme darstellt [12].
Esterasen haben zunehmend an Bedeutung in der Biotechnologie [13] und in der organischen Chemie [14, 15] gewonnen. Ihre charakteristischen Eigenschaften, wie Substratspezifität, Regioselektiviät und Enantioselektivität, erlauben eine breite Anwendungsmöglichkeit dieser Enzyme. Sie sind in der Natur sehr weit verbreitet und in Tieren, Pflanzen wie auch in Mikroorganismen vorzufinden. Aufgrund ihrer industrieller Anwendungsmöglichkeiten hat sich vor kurzem intensives Forschungsinteresse auf die mikrobiellen Esterasen gerichtet. Hierbei handelt es sich beispielsweise um die Enzyme von Bacillus stearothermophilus [16], Bacillus subtilis [17], Burkholderia gladioli [18] Arthrobacter Globiformis [19], Aspergillus niger [20, 21], Aspergillus awamori [22, 23], Pseudomonas cepacia [24], Pseudomonas fluorescens [25, 26] and Ochrobactrum anthropi [27].
Ein schwerwiegender Nachteil der bisher verwendeten Enzyme ist jedoch, dass sie nicht dazu in der Lage sind hochsubstituierte Substrate zu spalten. Ein Beispiel eines solchen sperrigen Substrates ist Linalylacetat, ein Ester eines allylischen Tertiäralkohols. Der veresterte Alkohol, Linalool, stellt einer der wichtigsten Terpen- Alkohole der Geschmacks- und Geruchsindustrie dar und liegt in unterschiedlichen enantiomeren Formen vor. Das (R)-(-)-Enantiomer, Licareol, ist der Hauptbestandteil von Extrakten aus Cinnamonium camphora und Cayenne linaloe, während das (S)- (+)-Enantiomer, Coriandrol, in erster Linie im Corianderöl anzutreffen ist. Da sich die beiden Enantiomere in ihrem Geruch unterscheiden [28], ist es wünschenswert die optisch reinen Enantiomere zur Herstellung von Geschmacks- und Geruchskompositionen zu erhalten.
Außerdem wurde in Bezug auf Linalool bereits für etliche mikrobielle Lipasen berichtet, dass es von diesen nicht als Substrat in einer Esterifikations-Reaktion verwendet werden kann [29, 30]. Das korrespondierende Acetat hingegen konnte mit unterschiedlichem Erfolg hydrolysiert werden, wenn ganze mikrobielle Zellen verwendet wurden [31].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues hydrolytisches Enzym, insbesondere eine neue Esterase und/oder Lipase, zur Verfügung zu stellen, wozu angesichts der Anwendungsmöglichkeiten solcher Enzyme, insbesondere in der Biotechnologie und organischen Chemie, ein dringender Bedarf besteht, und/oder ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, womit neue hydrolytische Enzyme, insbesondere Esterasen und/oder Lipasen, erhalten werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es insbesondere ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, zur Verfügung zu stellen, die eine gegenüber den bisher beschriebenen Enzymen verschiedene Substratspezifität und/oder einen unterscheidbaren Grad an Selektivität und/oder eine unterscheidbare Reaktionsgeschwindigkeit und/oder eine unterscheidbare Struktur und/oder einen unterscheidbaren Reaktionsmechanismus besitzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ferner, Esterasen und/oder Lipasen zur Verfügung zu stellen, die dazu in der Lage sind, sperrige Ester und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-Verknüpfungen, insbesondere die sterisch schwer zugängliche Esterbindung im Linaloylacetat zu spalten.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, insbesondere durch ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1, ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und einen gegen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 gerichteten Antikörper.
Für den Fachmann ist naheliegend, wie er ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID No. 1 oder einem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 Nukleinsäuren und Polypeptide ähnlicher Struktur und gleicher oder ähnlicher Funktion erhalten kann. Insbesondere können, beispielsweise durch Evolutionsexperimente, auch Enzyme mit verbesserten Eigenschaften erhalten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 195 bis 1115 gemäß SEQ ID No. 1,
b) Polynukleotide kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2,
c) natürlicherweise vorkommende Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), insbesondere solche, die genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide,
e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, wobei unter stringenten Bedingungen vorzugsweise zu verstehen ist Inkubation bei 60°C in einer Lösung, enthaltend 0,1 × SSC und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), wobei 20 × SSC eine Lösung enthaltend 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat (pH 7,0) bedeutet,
f) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere mindestens 95% in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d),
g) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 10 oder 15, bevorzugt mindestens 20 oder 25, besonders bevorzugt mindestens 30 oder 40, ganz besonders bevorzugt 50 oder 80, insbesondere mindestens 100 oder 120 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Polynukleotids gemäß (a), '(b), (c), (d) oder (e),
h) Polynukleotide mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Nukleotiden gegenüber einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),
i) Polynukleotide, die mindestens eines der unter Punkt (a) bis (h) genannten Polynukleotide umfassen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen, wobei es sich bei den nicht-kodierenden Sequenzen beispielsweise um natürlicherweise vorkommende Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, insbesondere um solche zur Kontrolle der Expression von Esterasen oder Lipasen, handelt.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Ribonukleinsäure (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), wobei die Nukleinsäuren vorzugsweise als doppelsträngige Nukleinsäuren vorliegen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um Nukleinsäuren, die für ein Protein mit Hydrolase-Aktivität oder Teile davon kodieren. Bei dem Protein mit Hydrolase-Aktivität handelt es sich vorzugsweise um eine Lipase oder Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, Ester-, Thioester-, Amid-, Halid- oder Peptid-Bindungen zu spalten, besonders bevorzugt sperrige und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halidbindungen. Bei den Verbindungen kann es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide mit einer kurzen Acyl-Kette handeln, wobei mit kurzer Acyl-Kette vorzugsweise der Acylrest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt kann es sich um einen Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols, insbesondere um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, besonders bevorzugt um Linaloylacetat, handeln.
Mit Spaltung ist erfindungsgemäß vor allem hydrolytische Spaltung, also Spaltung unter Freisetzung der Carbonsäure und des entsprechenden Alkohols, Thiols, Amins oder Hydrogenhalogenids gemeint. Spaltung kann jedoch in besonderen Ausführungsformen auch unter Ausbildung einer neuen Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halogenidbindung erfolgen, insbesondere kann es sich hierbei beispielsweise, falls eine Ester-Bindung in eine neue Ester-Bindung umgewandelt wird, um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, regioselektiv oder enantioselektiv Bindungen zu spalten, wobei der Wert für den enantiomeren Überschuß (e. e.) vorzugsweise größer gleich 20%, besonders bevorzugt größer gleich 40%, vor allem größer gleich 60%, ist.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Hydrolase mit α/β-Hydrolase-Faltung und/oder um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxylesterase, insbesondere um eine solche, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder zu diesen Enzymen homolog ist.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Nukleinsäuren, die für eine Esterase, besonders bevorzugt für eine mikrobielle Esterase, besonders bevorzugt bakterielle Esterase, insbesondere für eine Esterase aus Rhodococcus, vor allem für eine Esterase aus Rhodococcus sp., hierbei insbesondere für die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 und/oder eines der weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum einen zur Herstellung oder Isolierung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum anderen zur Herstellung oder Isolierung neuer, zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ähnlichen strukturellen und gleichen, ähnlichen und/oder verbesserten funktionellen Eigenschaften, wobei unter funktionellen Eigenschaften insbesondere hydrolytische Aktivität, vor allem Lipase- und/oder Esterase-Aktivität, und unter verbesserten funktionellen Eigenschaften beispielsweise höhere Spezifität und/oder höherer Umsatz und/oder höherer Regio- oder Enantioselektivität zu verstehen ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können so beispielsweise als Sonden zur Identifzierung und/oder Isolierung von homologen Nukleinsäuren aus einer artifiziellen, einer cDNA- oder genomischen Genbank, hierbei vorzugsweise zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Esterasen, Lipasen und/oder für eines der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Teile davon kodieren, oder als Antisense- Nukleinsäuren oder als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR), hierbei insbesondere zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuren kodierend für Enzyme mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere Esterasen und/oder Lipasen, oder Teile davon, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen oder zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologe Nukleinsäuren können aber auch durch Zufallsmutagenese oder zielgerichtete Mutagenese, in einer dem Fachmann bekannten Weise, erhalten werden.
Nach Einbau in einen Expressionsvektor können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielsweise zur gezielten Herstellung einzelner Domänen oder Epitope des erfindungsgemäßen Proteins oder von Fusionsproteinen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren, um eine Nukleinäure zu erhalten, die für ein Protein mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere für eine Esterase und/oder Lipase kodiert, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäurebibliothek wird mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kontaktiert,
b) eine Nukleinsäure, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisiert, wird identifiziert,
c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein Verfahren zur Isolierung einer für ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere für eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) ausgehend von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure werden Primer hergestellt,
b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren, vor allem cDNAs, unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren,
c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäure-Bibliothek wird mit einem Assay, beispielsweise einer Farbreaktion, der die Identifikation von Hydrolase-kodierenden Gensequenzen erlaubt, untersucht,
b) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert, beispielsweise durch visuelle Beobachtung, durch automatisierte Imageanalyse oder mittels photometrischer Messung, und gereinigt,
c) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (b) identifizierten Klonen werden sequenziert.

Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird Mutagenese-Experimenten unterworfen,
b) die erhaltenen Mutanten werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert,
c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität, insbesondere Esterase- und/oder Lipase-Aktivität, hin untersucht,
d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigten, werden sequenziert.

Zur Durchführung der Mutagenese-Experimente kann beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Die Mutagenese-Experimente können hierbei beispielsweise, insbesondere bei Verwendung einer Taq- Polymerase, so durchgeführt werden, dass Reaktionsparameter wie die Mg²⁺- Konzentration, der pH-Wert, die Reaktionstemperatur oder die Substratkonzentrationen variiert werden, oder es kann zum Einsatz von Error-prone- PCR-Techniken kommen, die beispielsweise auf der Zugabe von Mn²⁺ oder auf der Zugabe ungleicher Nukleotidkonzentrationen beruhen.
Bei der Nukleinsäurebibliothek handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine cDNA-, genomische oder artifizielle Bibliothek, besonders bevorzugt um eine mikrobielle, vor allem bakterielle Bibliothek, insbesondere um eine solche aus Rhodococcus, besonders bevorzugt aus Rhodococcus sp.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nukleinsäure, die nach einem der vorher genannten Verfahren erhältlich ist.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz oder anhand der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz auf Grundlage des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor, insbesondere ein Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, umfassend eine der vorher genannten Nukleinsäuren. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein prokaryotischer oder eukaryotischer Expressionsvektor sein. Bei den prokaryotischen Vektoren zum Einbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich beispielsweise um die Plasmide pBSII, pGEM-5Zf(+/-) oder pMS470Δ8 oder um ein anderes high copy number-Plasmid. Bei den erhältlichen Expressionsvekoren für die Expression in E. coli handelt es sich entsprechend beispielsweise um die Vektoren pBSII-RR1, pGEM-RR1 und pMS-RR1 zur Expression eines Proteins gemäß SEQ ID No. 2.
Bei den Expressionsvektoren für die Expression in E. coli kann es sich beispielsweise aber auch um andere kommerziell erhältliche Vektoren handeln, wie etwa den T7-Expressionsvektor pGM10 oder pGEX-4T-1 GST (Pharmacia Biotech), welche für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodieren, der die Reinigung des exprimierten Proteins über ein Ni²⁺-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1, für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirusvektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. SV40-Vektoren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer Ausführungsform so mit flankierenden Nukleinsäuren in einen Vektor eingebaut werden, dass bei Expression des Vektors die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide als Fusionsproteine vorliegen oder mit einem Tag, einer markierenden Aminosäuresequenz, versehen werden, der beispielsweise die Reinigung oder Detektion der Polypeptide erleichtern kann. Bei dem Tag kann es sich besipielsweise um das strep-, flag-, myc- oder his-Tag handeln.
Die Expressionsvektoren enthalten bevorzugt die für die Wirtszelle geeigneten regulatorischen Sequenzen, hierbei vorzugsweise den lac- oder den tac-Promotor für die Expression in E. coli, den ADH-2-, GAL1- oder AOX-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen oder den frühen SV40-Promotor oder LTR-Promotoren für die Expression in Säugerzellen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor, wobei es sich bei der Wirtszelle bevorzugt um Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus sp., oder E. coli, insbesondere um den E. coli-Stamm BL21(DE3), handelt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden bevorzugt nach Einbau in einen geeigneten Vektor durch die dem Fachmann bekannten Methoden der Transfektion, Transformation oder Elektroporation in die Wirtszellen eingebracht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2,
b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a), insbesondere solche, die genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) besitzen,
c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60% oder 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90%, insbesondere mindestens 95% in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) Polypeptide, die von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden,
e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 oder 6, bevorzugt mindestens 10 oder 15, besonders bevorzugt mindestens 20 oder 30, insbesondere mindestens 40, 50 oder 60 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b),
f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 60, 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c)
g) Polypeptide, die mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide umfassen.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um Polypeptide, die eine Hydrolyse-Reaktion katalysieren, insbesondere die Hydrolyse von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halidbindungen, oder Teile, insbesondere Epitope oder Domänen, von solchen Polypeptiden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Enzyme, die eine katalytische Triade, umfassend ein Nukleophil, ein Aspartat oder Glutamat und ein Histidin, oder eine katalytische Diade in ihrem reaktiven Zentrum haben. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Esterasen oder Lipasen, besonders bevorzugt um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxylesterase, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder starke Homologie zu den Enzymen dieser Familie aufweist, wobei das Serin im aktiven Zentrum (S*) vorzugsweise in der Aminosäuresequenz IVLAGDS*AGGNLA (SEQ ID NO. 9) anzutreffen ist, und/oder es handelt sich um ein Enzym, das alpha/beta-Hydrolase-Faltung aufweist. Bei den Verbindungen, die durch die erfindungsgemäßen Polypeptide gespalten werden können, handelt es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide, bevorzugt um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, wobei mit kurzer Acyl-Kette insbesondere der Acyl-Rest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der spaltbaren Verbindung um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine aromatische oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2- oktyl-acetat.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden um Esterasen, bevorzugt um mikrobielle, insbesondere bakterielle Esterasen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Esterase aus Rhodococcus sp., insbesondere um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um eine wasserlösliche Esterase.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Mischungen und Präparationen, vor allem bakterielle Präparationen, die in einer dem Fachmann bekannten Weise durchgeführt werden können, enthaltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur hydrolytischen Spaltung und/oder zur Knüpfung von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei bei den zu spaltenden oder herzustellenden Verbindungen um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, ganz besonders bevorzugt um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine ungesättigte oder aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2- octyl-acetat.
Mit "kurzer Acyl-Kette" ist hierbei vorzugsweise ein Carbonsäurerest mit nicht mehr als 6 C-Atomen, besonders bevorzugt mit nicht mehr als 4 C-Atomen, insbesondere ein Acetat-, Propionat-, Butyrat- oder Valeratrest gemeint, wobei die Wasserstoffatome des Restes auch substituiert sein können, insbesondere durch organische Gruppen oder Halogenatome. Bei dem Alkohol-Rest des Esters handelt es sich erfindungsgemäß bspw. um Naphthol, Glycerin, p- und o-Nitrophenol oder um ein Naphthol AS-Substrat.
Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind im allgemeinen Verbindungen der Formel R¹-C(O)-R², wobei R² für eines der Halogene F, Cl, Br, I, für eine Aminogruppe NR³R⁴, für ein Thiol SR³ oder für einen Alkohol OR³ steht und es sich bei R¹ vorzugsweise um eine Kohlenwasserstoffkette, die bevorzugt bis zu 5, besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatome, vor allem genau 1 Kohlenstoffatom umfassen kann, handelt, wobei die Kohlenwasserstoffkette vorzugsweise unverzweigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann, und wobei mindestens eines der Wasserstoffatome auch durch andere Gruppen substituiert sein kann, wie beispielsweise durch Halogene, Kohlenwasserstoffreste oder Ethergruppen.
Bei dem Alkohol, Thiol oder Amin handelt es sich vorzugsweise um eine sperrige Gruppe. Bei R³ kann es sich so beispielsweise um eine Gruppe CR⁵R⁶R⁷ handeln, wobei mindestens einer, insbesondere genau einer, der Reste R⁵, R⁶ und R⁷ ein sperriges Kohlenwasserstoffgerüst, beispielsweise eine aromatische Gruppe, darstellt, das auch substituiert sein kann. Bei der aromatischen Gruppe kann es sich hierbei auch um einen Heterozyklus handeln. Bei den übrigen Resten, bei denen es sich um keine sperrige Gruppe und/oder um keinen Aromaten handelt, handelt es sich vorzugsweise um ein Wasserstoffatom oder um eine kurzkettige Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8, besonders bevorzugt bis zu 6 C-Atomen, wobei mindestens eines der C-Atome auch einen Substituenten tragen kann, beispielsweise ein Halogenatom. Die Kohlenwasserstoffkette kann hierbei unverzweigt, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein. Andererseits kann es sich aber auch bei R³ selbst um einen Aromaten, insbesondere auch um einen heterozyklischen Aromaten, handeln, dessen Wasserstoffe auch substituiert sein können.
Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind desweiteren Verbindungen der Formel R¹-C(O)-R², wobei es sich bei R¹ um eine sterisch anspruchsvolle Gruppe, vor allem um ein quaternäres Kohlenstoffatom, handelt, das vorzugsweise ein Chrialitätszentrum darstellt. Es kann sich hierbei beispielsweise um das alpha-C-Atom einer alpha-substituierten alpha-Aminosäure handeln oder um ein Kohlenstoffatom als Teil eines Hexanringes, wobei der Hexanring vorzugsweise mindestens einen weiteren Substituenten trägt, beispielsweise in Form einer Kohlenwasserstoffkette oder eines Halogenatoms. Als weiteren Substituenten kann das quaternäre Kohlenstoffatom beispielsweise eine Kohlenwasserstoffkette, insbesondere eine Methyl- oder eine Ethylgruppe tragen. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei R² vorzugsweise um eine einfach aufgebaute Gruppe, beispielsweise um einen Amin- oder einen Alkohol-Rest, der bis zu 6, vor allem bis zu 4 C-Atome umfasst, wobei der Alkoholrest vorzugsweise unverzweigt und ungesättigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann.
In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat oder der herzustellenden Verbindung um ein Glycerinderivat, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform alle drei Hydroxygruppen, vorzugsweise mit kurzkettigen Säuren, verestert sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat um Triacetin.
Die Hydrolyse kann erfindungsgemäß beispielsweise in Gegenwart von BSA und/oder in Gegenwart eines Detergens, insbesondere eines nicht-ionischen, wie z. B. Octylglucosid, durchgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet, um enantioselektiv Bindungen zu spalten oder zu knüpfen, wobei der enantiomere Überschuß (e. e.) der betreffenden Reaktion vorzugsweise größer gleich 20%, besonders bevorzugt größer gleich 40%, vor allem größer gleich 60% ist. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch verwendet werden, um ausgehend von racemischen Mischungen eine Isolierung oder Anreicherung eines der beiden Enantiomere zu erreichen.
Bei der Knüpfungsreaktion kann es sich beispielsweise um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Mögliche industrielle Anwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptide sind beispielsweise die Herstellung oder selektive Anreicherung von Geschmackskomponenten in der Lebensmittelindustrie, von Detergentien in der Waschmittelindustrie, von Feinchemikalien in der chemischen Industrie oder von therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen in der Pharmaindustrie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Spaltung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Moleküle, die die entsprechenden Bindungen umfassen, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid inkubiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ferner ebenso ein Verfahren zur Knüpfung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid- Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Carbonsäuren und/oder Carbonsäureester, -thioester, -amide oder -halide mit einem Alkohol, Thiol, Amin oder Hydrogenhalogenid in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids inkubiert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können desweiteren beispielsweise als Epitope zur Herstellung von mono- oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, indem sie an einen Träger, bspw. Rinder-Serumalbumin, gekoppelt werden und anschließend ein Säuger, bevorzugt eine Maus, ein Hase oder ein Kaninchen, mit dem Epitop, bevorzugt unter Verwendung von Adjuvantien, immunisiert wird. Hierzu eignen sich bevorzugt Polypeptide mit einer Länge von 6-12, insbesondere 8, Aminosäuren. Polypeptide mit einer Länge von mehr als 60, insbesondere mehr als 75 Aminosäuren können auch ohne Träger zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die entstandenen Antikörper können anschließend gegebenenfalls isoliert werden, und ausgehend von den Antikörpern oder der für sie kodierenden Nukleinsäuren können gegebenenfalls Antikörperfragmente, beispielsweise Fab- oder scFv-Fragmente hergestellt werden.
An ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindende Peptide können alternativ auch durch ein dem Fachmann bekanntes in vitro-Verfahren, wie beispielsweise Phage Display, Yeast Display, Bacterial Display oder etwa die sogenannte Fusagen- Technologie erhalten werden, bei der die Nukleinsäure und das von dieser kodierten Polypeptid über ein Puromycin kovalent miteinander verknüpft sind.
Die durch Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden erhältlichen Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente sowie die durch eines der genannten in vitro-Verfahren erhältlichen Peptide eignen sich beispielsweise zur Untersuchung von Genexpressionsbanken, um zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden homologe Proteine, insbesondere solche mit hydrolytischer Aktivität, vor allem esterolytischer und/oder lipolytischer Aktivität, ausfindig zu machen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie andere an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide, insbesondere erhältich durch eines der zuvor genannten Verfahren. Antiserum, Antikörper und Antikörperfragment sowie sonstige an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide werden im folgenden der Einfachheit halber "Antikörper" genannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle, insbesondere in E. coli, vor allem E. coli BL21(DE3), oder in Rhodococcus, vor allem Rhodococcus sp., exprimiert wird. Anschließend kann gegebenenfalls Reinigung, vor allem chromatographische Reinigung des Proteins erfolgen.
Das Verfahren kann beispielsweise auf folgende Weise durchgeführt werden:

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und E. coli wird mit dem Vektor transformiert,
b) nach der Expression des Proteins werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen,
c) das Protein wird aus dem so erhaltenen Überstand gegebenenfalls aufgereinigt.

Kultivierung von E. coli erfolgt hierbei vorzugsweise zwischen 15 und 40°C, bevorzugt zwischen 25 und 37°C, besonders bevorzugt bei etwa 30°C. Erfolgt Induktion der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beispielsweise durch IPTG oder Laktose, so werden die Zellen nach Induktion der Expression vorzugsweise für zwischen 3 und 15 Stunden wachsen gelassen, besonders bevorzugt für zwischen 5 und 10 Stunden. Alternativ kann auf die Induktion der Expression auch verzichtet werden.
Der Aufschluß der geernteten Zellen erfolgt durch eine dem Fachmann bekannte Methode, beispielsweise French Press, Ultraschall, Kugelmühle, besonders bevorzugt jedoch durch Einsatz eines Sonifikators. Alternativ können die Zellen auch chemisch, beispielsweise durch EDTA oder Polymyxin B, permeabilisiert werden.
Die gegebenenfalls durchzuführende Reinigung des Proteins erfolgt vorzugsweise chromatographisch. Die chromatographische Reinigung des Proteins kann beispielsweise die Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und/oder die Gelfiltration umfassen.
Die chromatographische Reinigung umfasst jedoch vorzugsweise, insbesondere zur Reinigung des Proteins gemäß SEQ ID NO. 2, die folgenden Schritte:

a) der Überstand wird auf eine Anionenaustauschsäule gegeben,
b) nach der Elution werden die aktiven Fraktionen gegebenenfalls vereint und
c) auf eine Gelfiltrationssäule gegeben, anschließend
d) werden die aktiven Fraktionen gegebenenfalls wiederum vereint und anschließend eingeengt.

Bei der Anionenaustauschsäule handelt es sich hierbei bevorzugt um eine Q- Sepharosesäule, insbesondere um eine Q-Sepharosesäule FF von Pharmacia. Bei der Gelfiltrationssäule handelt es sich bevorzugt um eine Superdex-Säule, insbesondere um eine Superdex 75-Säule von Pharmacia.
Auftrag auf und Elution von der Anionenaustauschsäule erfolgt vorzugsweise zwischen pH 5.0 und 7.5, besonders bevorzugt zwischen pH 6.0 und 7.0, insbesondere etwa bei pH 6.5. Zur Elution wird vorzugsweise ein Salzgradient angelegt. Die Elution der erfindungsgemäßen Polynukleotide erfolgt beispielsweise bei einer Konzentration zwischen 0,4 und 0,5 M NaCl oder unter Einsatz eines anderen Salzes bei entsprechender Ionenstärke.
Auftrag auf und Elution von der Gelfiltrationssäule erfolgt ebenfalls vorzugsweise bei dem gleichen pH-Wert wie für die Anionenaustauschsäule. In den Puffer wird vorzugsweise 0,2 M NaCl gegeben oder unter Einsatz eines anderen Salzes eine entsprechende Ionenstärke eingestellt.
Vor allem die kurzkettigen erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem zur Identifizierung von Substraten oder funktionellen Interaktoren enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
Erfindungsgemäß kann auch ein Nukleotid oder mehrere Nukleotide der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder eine oder mehrere Aminosäuren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder der erfindungsgemäßen Antikörper modifiziert sein. Bei der Modifikation kann es sich etwa handeln um eine radioaktive, fluorogene oder chromogene Gruppe oder um eine posttranslationale Modifikation.
Im folgenden werden bestimmte Ausführungsformen der Erfindung exemplarisch anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen erläutert.

Abbildungen

In Fig. 1 ist schematisch die Herstellung des Plasmids pMS-RR1 ausgehend von der genomischen DNA dargestellt.
In Fig. 2 ist die Nukleotidsequenz des Sau3AI/SmaI-Fragments, das das Esterase- Gen EstA und seine flankierenden Regionen umfasst (SEQ ID NO. 1), dargestellt. Die unterstrichene Region in 5'-Richtung vom Startkodon ist die putative ribosomale Bindungsregion (S/D). Das Hydrolasemotiv der GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme ist durch einen grauen Balken in der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) gekennzeichnet. Die Positionen und Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärts-PCR- Primer, die für die Sequezierung verwendet wurden, sind durch Pfeile gekennzeichnet. Start- und Stopp-Kodons sind fett gedruckt. Die Numerierung auf der linken Seite bezieht sich auf die Nukleinsäuresequenz, diejenige auf der rechten Seite auf die Aminosäuresequenz.
In Fig. 3 ist ein Aminosäuresequenzvergleich der Esterase EstA mit homologen Enzymen dargestellt. Die Ausrichtung der Sequenzen erfolgte unter Verwendung des Programms Multalin am INRA [52] unter Vorgabe der Parameter: symbol comparison table - blosum 62; gap weight - 12; gap length weight - 2. Folgende Enzyme wurden miteinander verglichen: Esterase EstA aus Rhodococcus sp. NCIMB 11216; eine Lipase aus Pseudomonas sp. B11-1 [57]; eine Carboxylesterase aus Archaeoglobus fulgidus [58]; eine Esterase aus Amycolatopsis mediterranei [59]; eine Heroinesterase aus Rhodococcus sp. [49]; die Lipase 2 aus Moraxella sp. [56]. Die Aminosäuren, die bei zumindest vier dieser sechs Enzyme identisch sind, wurden durch einen grauen Balken gekennzeichnet. Die putativen Aminosäuren des aktiven Zentrums der Esterase EstA sind durch einen Stern gekennzeichnet.
In Fig. 4 ist dargestellt ein Sequenzvergleich der Esterase EstA mit einer Lipase aus Geotrichum candidum (GCL). Die Amionsäurereste sind numeriert. Die Sequenzen wurden unter Verwendug des Programms CLUSTALW am PBIL [51] zunächst unter Vorgabe Parameter: weight matrix - blosum; gap opening penalty - 12; gap extension penalty - 3; aneinander ausgerichtet und anschließend nochmals manuell unter Berücksichtigung der Sekundärstrukturelemente aneinander ausgerichtet. Zur Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet. Die Symbole bedeuten folgendes: * - Identität; : - starke Homologie; . - geringe Homologie. Oberhalb und unterhalb der Aminosäuresequenz sind vermutete Sekundärstrukturelemente genannt, die nach der Methode von Garnier (GOR4) [53] ermittelt wurden. Die Buchstaben stehen für: h - helix, e - sheet, t - turn. Darunter sind die Sekundärstrukturelemente der Geotrichum candidum-Lipase angegeben [54]. Gepunktete Balken stehen für α-Helices, gestreifte für β-Faltblattstrukturen. Das Erkennungszeichen der Carboxylesterasen vom Typ B ist durch einen grauen Balken gekennzeichnet und das Serin des aktiven Zentrums ist schwarz markiert.
In Fig. 5 ist ein Polyacrylamidgel mit rekombinant exprimierter Esterase EstA dargestellt. In Spur 1 wurde aufgetragen Rohlysat von E. coli BS21(DE3)/pMS- RR1, induziert mit IPTG, in Spur 2 LMW-Standard.
In Fig. 6 ist die Reinigung von EstA anhand eines 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gels dargestellt. In Spur 1 wurde aufgetragen LMW-Standard, in Spur 2 Rohlysat, in Spur 3 die isolierte Fraktion nach der IEC (QFF), in Spur 4 die isolierte Fraktion nach der SEC (Superdex 75).
In Fig. 7 sind die Naphthyl und Naphthol AS-Substrate dargestellt, deren Hydrolyse unter Verwendung von EstA untersucht wurde (s. Tabelle 2).
In Fig. 8 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf die Hydrolyse von o- und p- Nitrophenylester dargestellt. Die Aktivität wurde unter Verwendung von Überstandfraktionen von E. coli BL21(DE3)/pMS-RR1 spektrophotometrisch ermittelt. C2-C12 steht für die Länge der Kohlenstoffkette des Carbonsäurerests des Nitrophenylesters.
In Fig. 9 sind Substrate für Esterasen und Lipasen gezeigt, die auf Spaltung durch EstA untersucht wurden.
In Fig. 10 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf kurz- und langkettige Fettsäureester (Fig. 9A) unter Zusatz von Rinderserumalbumin (BSA) bzw. Octylglucosid (OG) gezeigt.
In Fig. 11 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf typische lipolytische Substrate (short-chain und long-chain TG) unter Zusatz von Rinderserumalbumin (BSA) bzw. Octylglucosid (OG) gezeigt (s. Fig. 9B und 9C).
In Fig. 12 ist die Umsetzung von rac-Linalylacetat bzw. rac-Linaloylacetat (die beiden Begriffe werden synonym verwendet) mittels eines erfindungsgemäßen Enzyms dargestellt. Das (S)-Enantiomere wird unter Freisetzung von (S)-Linalool umgesetzt, während das (R)-Enantiomere nicht umgesetzt wird.

Material und Methoden

a) Bakterienstämme und Plasmide zur Klonierung und Expression der Nukleinsäuren

Die Vektoren pBluescript II SK+/- (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) und pGEM-5Zf(+) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) wurden für die Klonierungsexperimente verwendet. E. coli SURE (e14^-(McrA^-) Δ(mcrCB-hsdSMR- mrr) 171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::TnS (Kan^r) uvrC [F' proAB Iacl^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)]) und E. coli HB101 (F^- thi-1 hsdS20(r_B ^- m_B ^-) supE44 recA13 ara14 leuB6 proA2 lacY1 galK2 rpsL20(str^r) xyl-5 mtl-1 λ-) waren die Wirtszellen für die rekombinante DNA. Heterologe Enzymexpression in E. coli BL21(DE3) (F^- dcm ompT hsdS(r_B ^- m_B ^-) gal λ(DE3)) wurde mit dem high copy number plasmid pMS470Δ8 [33] durchgeführt. Dieser Vektor basiert auf dem stark regulierten tac-Promoter und erlaubt die Insertion des Gens am Start ATG abwärts von der hocheffizienten Shine-Dalgarno-Sequenz, die vom Gen 10 des Bakteriophagen T7 abstammt. pMS470Δ8 enthält einen 1.4 kb Platzhalterfragment (stuffer insert) zwischen den Schnittstellen NdeI und SphI. pMS4K, die Form ohne Insert (Grohmann et al. (1997), Microbiology 143, 3889-3898), wurde als Kontrolle eingesetzt.

b) Kulturmedien und Wachstumsbedingungen zur Kultivierung der E. coli- Zellen

LB Medium [34] wurde normalerweise für das Wachstum von E. coli bei 37°C und für die Überproduktion von EstA bei 30°C verwendet. Zur Herstellung von festem Medium wurde Agar bis zu einer Konzentration von 15 g/l, hinzugegeben. Mit Ampicillin und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) wurden, falls erforderlich, finale Konzentrationen von 0.1 g/l bzw. 0.1 mM eingestellt.

c) DNA-Modifikation und Transformation zur Herstellung der Expressionsvektoren und Expressionssysteme

Verwendet wurden Restriktionsendonukleasen und modifizierende Enzyme von New England BioLabs (Beverly, USA), Boehringer (Mannheim, FRG), und Promega Corporation (Madison, USA). Alle Restriktionsreaktionen und DNA-Modifikationen wurden ausgeführt wie vom Hersteller empfohlen. Die Transformation von E. coli- Stämmen wurde mit der SEM-Mehode [35] durchgeführt.

d) DNA-Sequenzierung und Analyse

Die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA wurde nach dem Dideoxy- Kettenterminations-Verfahren durchgeführt [36] unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequenziergeräts, des Dye-Deoxy Terminator Sequencing Kits (Applied Biosystems, Inc., Faster City, CA, USA) und der AmplyTaq DNA Polymerase (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA). Einige Gen-spezifische Primer wurden mit dem ABI 392 DNA/RNA-Synthesizer synthetisiert.
DNA-Analyse und die Suche nach Homologen wurden durchgeführt unter Verwendung des Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG program) [37].

e) Proteinbestimmung, SDS-PAGE und Gelfärbemethoden

Die Proteinkonzentration wurde mit der Bradford-Methode bestimmt [40] (Bio-Rad, USA). BSA wurde als Standard verwendet.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mit 12%igen Polyacrylamid-Gelen durchgeführt [41]. Die Proben wurden für 5 Minuten in 2fachem Ladungspuffer (70 ml Tris (0,125 M, pH 6.75), 20 ml Glycerin, 4 g SDS, 10 ml β-Mercaptoethanol und 0,002 g Bromphenolblau) gekocht. Als Marker wurde LMW-Marker von Pharmacia Biotech (USA) verwendet. Die Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt.

Beispiel 1

Klonierung, Sequenzierung und Sequenzanalyse des Esterase- Gens estA

Eine genomische Bibliothek von Rhodococcus sp. NCIMB 11216 wurde mittels α- Naphthylacetat auf Hydrolyse-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein positiver Klon ausfindig gemacht, der das Plasmid pRR1 mit einem 4.5 kb-Fragment enthielt. Er zeigte interessanterweise die Fähigkeit, die sterisch schwer zugängliche Esterbindung des Linalylacetats zu spalten [32]. Unter Verwendung von Sma I wurde das 3'-Ende des Fragments deletiert, um das Fragment in etwa auf die für die Esterase kodierende Region zu reduzieren. Der resultierende Vektor, pBSII-RR1, der ein 1.2 kb-Insert enthielt, zeigte nach Transformation in E. coli gute Esterase- Aktivität auf Agarplatten mit dem oben genannten Substrat.
Die Nukleinsäuresequenz des im Plasmid pBSII-RR1 enthaltenen Inserts wurde bestimmt (Fig. 2). Die Sequenzanalyse zeigte einen G+C-Gehalt von 65.1%, was typisch für Rhodococcus-Gene ist [48, 49]. Es konnte ein open reading frame (ORF), der für ein Protein mit 306 Aminosäuren kodiert, identifiziert werden, wobei sich das Startkodon ATG an der Position 195 und das Stopkodon TGA sich an der Position 1113 befindet (Fig. 2, linke Seite). Das berechnete Molekulargewicht beträgt 33.5 kDa.
Eine putative Ribosomen-Bindungssequenz [50], GAGGA, ist 8 bp vor dem vermuteten ATG-Startkodon anzutreffen.
Es konnten keine typischen Escherichia coli-artigen Promoter-Sequenzmotive in der DNA-Sequenz in 5'-Richtung von dem estA-Gen angetroffen werden, auch nicht in 3'-Richtung vom Transkriptions-Terminationsmotiv. Es ist zu vermuten, daß die Transkription des estA-Gens ausgelöst wird durch einen Rhodococcus-spezifischen Mechanismus, wobei die Sequenzmotive, die darin involviert sind, noch unbekannt sind, wie das etwa auch mit dem her-Gen aus dem Rhodococcus sp. Stamm H1 [49] der Fall ist.

Beispiel 2

Konstruktion des Plasmids pMS-RR1 zur Überexpression des Rhodococcus Esterase-Gens

Da das Expressionsniveau des Proteins eher niedrig war, wurde das für die Esterase kodierende Gen in einen E. coli-Expressionsvektor auf Basis des tac-Promotors kloniert. Um Nde I und Sph I-Schnittstellen in die 5'- bzw. 3'-flankierenden Regionen des Gens einzuführen, wurde das 1,2 kb große SpeI-SmaI-Insert aus dem Plasmid pBSII-RR1 in das Plasmid pGEM-5Zf(+/-) kloniert, wodurch das Plasmid pGEM-RR1 erhalten wurde. In diesem Plasmid wurde in einem weiteren Schritt das NdeI/EcoO109I-Fragment, das noch 5'-nicht translatierte Sequenzen enthält durch den folgenden synthetischen Nde I/EcoO109 I-Adapter ersetzt:

(5'-TATGTCATTGCACCCCGAAGTCGAGTCCATGTTGAAG-3' (SEQ ID NO. 3)
3'-ACAGTAACGTGGGGCTTCAGCTCAGGTACAACTTCCGG-5' (SEQ ID NO. 4))
Dieser Adapter führte eine NdeI-Schnittstelle beim Start-ATG ein und enthält die ersten 36 Nukleotide des Esterase-Strukturgens bis zur EcoO109I-Schnittstelle. Das erhaltene Plasmid wurde pGEM-RR1/adapter benannt. Aus diesem Plasmid wurde das für Esterase EstA kodierende DNA-Fragment als NdeI-SphI-Fragment entnommen und in den Expressionsvektor pMS470Δ8 kloniert.
Nach Transformation in E. coli BL21(DE3) konnte für das Konstrukt pMS-RR1 gezeigt werden, dass es gute Esterase-Aktivität vermittelt, was beispielsweise durch Hydrolyse von α-Naphtylacetat in einem Agarplatten-Screeningtest (Schlacher et al. (1998) J. Biotechnol. 62: 47-54) gezeigt werden kann. Die Herstellung des Plasmids pMS-RR1 ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.

Beispiel 3

Expression der Esterase EstA und Präparation von Zelllysaten

Eine Kultur von E. coli BL21(DE3) pMS-RR1, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befand, wurde 10fach mit frischem Amp-haltigen LB-Medium verdünnt und bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Die Genexpression wurde induziert durch Zugabe von IPTG bei einer OD₅₉₅ von 1,3. Die Zellen wurden für weitere 6 Stunden inkubiert (OD₅₉₅ = 5,0), anschließend durch Zentrifugation geerntet (6000 rpm, 10 min), in 10 ml Tris-HCl (100 mM, pH 7.0) resuspendiert und bei -20°C eingefroren. Nach dem Auftauen erfolgte Aufschluß der Zellen auf Eis durch 6fache Behandlung mit einem Sonifikator (Braun Labsonic 2000, Branson Sonifier 250) für jeweils 20 Sekunden und bei einem Puls von 70% s^-1.
Die Esterase-Aktivität im Überstand sowie im resuspendierten Pellet (100 mM Tris- HCl, pH 7.0) nach Ultrazentrifugation bei 4°C (32 000 rpm (ca. 80 000 g), 60 min) wurde bestimmt. Das aktive Enzym EstA wurde hauptsächlich im Überstand vorgefunden, aus dem die rekombinante Esterase für weitere Experimente verwendet wurde. E. coli BL21(DE3)/pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
Optimale Expression von EstA wurde erreicht durch Kultivierung von E. coli BL21(DE3)/pMS-RR1 in LB/Amp-Medium bei 30°C für etwa 10 h.
Induktion des tac-Promotors mit 0.1 mM IPTG resultierte in spezifischen Aktivitätswerten von 25 U/mg bei Verwendung von p-Nitrophenylacetat als Substrat. Für den Überstand des Lysats konnte eine starke Proteinbande bei etwa 33 kDa durch SDS-PAGE ausfindig gemacht werden (Fig. 5). Die Größe dieses Produkts entsprach sehr gut dem Molekulargewicht, das auf Grundlage der Aminosäuresequenz der Esterase EstA berechnet worden war. Bestimmung der Esteraseaktivität im Pellet und in den Überstand-Fraktionen zeigte, daß sich 95% der Aktivität im Überstand befand. Daraus konnte man darauf schließen, dass es sich bei EstA um ein wasserlösliches, intrazelluläres Protein handelt.
In E. coli BL21(DE3) mit dem Kontrollplasmid pMS4K ohne dem estA-Gen konnte keine signifikante Aktivität gemessen werden.

Beispiel 4

Reinigung der Esterase EstA

Der Überstand des E. coli BL21(DE3)/pMS-RR1 Zell-Lysats wurde auf eine Anionen- Austauschsäule (Q-Sepharose FF, Pharmacia), die mit Tris-HCl Puffer (0,01 M, pH 6.5) voräquilibriert worden war, aufgetragen. Nach der Adsorption wurden die Proteine mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M NaCl in Äquilibrationspuffer eluiert; die Esterase EstA wurde bei etwa 0,45 M NaCl eluiert. Die Fraktionen mit Esterase-Aktivität wurden vereint, konzentriert (Omegacell, Filtron Technology) und auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 75, Pharmacia) geladen, die vorher mit Tris-HCl-Puffer (0,01 M, pH 6.5), enthaltend 0,2 M NaCl, äquilibriert worden war. Elution des Proteins erfolgte mit demselben Puffer. Die Fraktionen, die das Enzym EstA enthielten, wurden gesammelt, entsalzt und durch Ultrazentrifugation, wie zuvor beschrieben, konzentriert.
Die chromatographischen Reinigungsschritte wurden mit einem Pharmacia FPLC System ausgeführt. Der Ausfluß wurde mit einem UV-Detektor bei 280 nm beobachtet. Die erhaltenen Proteinproben wurden durch Auftrag auf 12%-ige SDS- Polyacrylamidgele untersucht.
Homogen sauberes Protein konnte so in zwei Schritten erhalten werden, durch Anionen-Austauschchromatographie und anschließende Größenausschluß- Chromatographie. Die Reinigungsschritte und Ausbeuten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine 3,2fach angereicherte Esterase konnte als einziges Band auf einem SDS-Gel nachgewiesen werden (Fig. 6). Augrund der Laufstrecke sollte das Molekulargewicht etwa 33 kDa betragen. Tabelle 1 Die Reinigungsschritte und Ausbeuten der Esterase EstA; spektrophotometrischer Assay mit p-Nitrophenylacetat als Substrat

Beispiel 5

Enzym-Assays zur Bestimmung der Aktivität und Spezifität

Soweit nicht anders angegeben wurden Substrate von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) verwendet.
Fünf verschiedene Methoden kamen zur Anwendung, um die Esterase-Aktivität zu ermitteln:

a) qualitativer Assay

Zur vorläufigen Charakterisierung des estA-Genprodukts in Hinblick auf eine Präferenz in Bezug auf die Kettenlänge der Fettsäureeinheit des Substrats, wurde der Überstand des rekombinanten E. coli BL21(DE3)/pMS-RR1-Lysats mit verschiedenen Naphthylestern getestet.
Die Esterase-Aktivität wurde hierbei in situ auf einem 15%igen nativen Polyacrylamidgel gemessen. Die Proben wurden hierzu bei Raumtemperatur in 2× Dissoziationspuffer (50 ml Tris (20 mM, pH 7.4), 50 ml Glycerin, 1 g Triton X-100 und 0,1 g Bromphenolblau) inkubiert und anschließend auf das Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese und Proteinauftrennung wurden die Gele in einer Lösung von 20 ml Natriumphosphat (0,1 M, pH 7.0), 2 ml Substrat-Stammlösung (α- und β- Naphthylester, 1% (w/v) in Aceton) und 500 µl Fast Blue B (o-Dianisidin, tetrazodiert von Sigma)-Stammlösung (2% (w/v) in Wasser) inkubiert. Die Esterhydrolyse wurde als dunkelrote Bande sichtbar. E. coli BL21(DE3) pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß die Esterase EstA Naphthylester mit kurzkettigen Säuren bevorzugt. Fast keine Aktivität wurde angetroffen für Säuren mit mehr als fünf Kohlenstoff-Atomen wie auch mit sperrigen Naphthol AS und Naphthol AS-D Estern.

Tabelle 2

Die relativen Aktivitäten der Esterase EstA in Bezug auf verschiedene Naphthylester; qualitativer Assay. E. coli BL21(DE3)/pMS-RR1 wurde bei dem Experiment als Enzymquelle verwendet. Die Aktivität wurde aufgrund der Färbung abgeschätzt: +++ intensiv gefärbte breite Bande; ++ stark gefärbte Bande; + schwach gefärbte Bande; +/- kaum wahrnehmbare Bande; - keine Bande wahrnehmbar.

b) Titrimetrie

1 ml eines rohen Bakterienlysats wurde mit 50 ml Natriumphosphatpuffer (20 mM, pH 7.0) und jeweils 100 µl verschiedener Triacylglyceride (Triacetin, Tributyrin oder Tricaproin) bei Raumtemperatur gemischt. Die Esterase-Aktivität wurde ermittelt, indem die freie Fettsäure mit NaOH (0,1 M, pH 7.0) titriert wurde unter Verwendung von Mettler-Toledo DL21 pH-stat. Eine Einheit enzymatischer Aktivität wird hierbei definiert als die Menge Enzym, die 1 µmol Säure pro Minute unter den Assay- Bedingungen freisetzt. E. coli BL21(DE3) pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
In Titrationsanalyseexperimenten mit verschiedenen Triacylglyceriden zeigte die Esterase EstA Aktivität nur mit dem Substrat Triacetin (7.2 U/mg).

c) Plattenassay

Der Triglycerid-Agar-Diffusions-Assay wurde durchgeführt, um die E. coli- Transformanten auf lipolytische Aktivität hin zu testen. Ampicillin-enthaltenden Agarplatten wurde verschiedene durch Sonifikation emulsifizierte Triglyceride als Substrat zugesetzt unter Einstellung einer finalen Konzentration von 7 g/l. Die Größe der geklärten Zone um die gewachsenen Kolonien herum erlaubte hierbei eine halbquantitative Abschätzung der Enzymaktivität. Lipasen aus verschiedenen Spezies (Geotrichum candidum, Rhizopus orryzae, Candida Cylindracea and Pseudomonas fluoreszenz), die auf die Platten gegeben wurden, wurden als Positivkontrolle eingesetzt.
Substrate mit einer Säurenkette länger als sechs C-Atome wurden im Plattenassay getestet (Material und Methoden). Verschiedene Lipasen, die als Positivkontrollen verwendet wurden, produzierten ein deutliches Signal (halo) auf Platten, die Tricapryolin, Trilaurin oder Triolein als Substrat enthielten. Eine Halo-Bildung konnte nicht beobachtet werden, wenn rekombinante E. coli Zellen mit dem Plasmid pMS- RR1 auf diesen Platten wuchsen, wodurch deutlich wurde, dass das Enzym nicht in der Lage ist wasserunlösliche emulsifizierte langkettige Fettsäuresubstrate zu hydrolisieren.

d) Spektrophotometrie

Die Esterase-Aktivität wurde mit verschiedenen o- und p-Nitrophenylester (o-NPE und p-NPE) als Substraten analysiert. Die photometrischen Messungen wurden bei Raumtemperatur in Phosphatpuffer (100 mM, pH 7.0), der 4 mM Substrat (aufgelöst in DMSO) enthielt, durchgeführt. Absorptionskoeffizienten von 2.42 ml µmol^-1 cm^-1 für o-NPE und 9,6 ml µmol^-1 cm^-1 für p-NPE bei 405 nm wurden der Berechnung zugrundegelegt. Falls die Aktivität von Zellextrakten von E. coli, die ein Kontrollplasmid pMS4K enthielten, gemessen wurde, wurde die geringe Hintergrundaktivität von den für die Proben erhaltenen Aktivitätswerten abgezogen. Die Enzymwirkung auf die zuvor beschriebenen o- und p-Nitrophenylsäüreester zeigte, daß die rekombinante Rhodococcus sp. Esterase maximale Aktivität aufweist, wenn Nitrophenylacetat als Substrat verwendet wurde, wobei das p- Substrat bevorzugt gespalten wurde (Fig. 8). Die Aktivität nahm rapide ab bei Verwendung von Nitrophenylpropionat. Es konnte keine bedeutende Aktivität gefunden werden, wenn die Acylkette länger war als 4 C-Atome war (Fig. 8).

e) Fluoreszenz-Assay

Die Fluoreszenz-Assays für die lipolytischen Enzyme wurden nach den Protokollen von Zandonella et al. durchgeführt. In der Regel wurden Lösungen von 18 nmol Substrat in 25 µl Tetrahydrofuran in 9 ml Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 7.4) in Anwesen- oder Abwesenheit von 2 nmol Fettsäure-freiem Albumin pro ml und 2 mM Octylglucosid (unter der CMC) injiziert. Nach Zugabe der sauberen Esterase EstA (0,5 mg), wurde die Fluoreszenzintensität bei 400 nm (λ_ex = 342 nm) bei 37°C als Funktion der Zeit aufgenommen. Verwendet wurde hierbei ein Perkin-Elmer LS 50B- Fluorometer.
Die gereinigte Esterase EstA wurde mit zwei verschiedenen fluorogenen Substraten getestet (Material und Methoden), die einerseits spezifisch für Esterasen, andererseits spezifisch für Esterasen und Lipasen sind. Beide Substrate enthielten Pyren als Fluoreszenz-Reporter und die Trinitrophenylaminogruppe als Fluoreszenz- Quencher (Fig. 9). Die Fluoreszenz des intakten Substratmoleküls war sehr gering. Enzymatische Freisetzung der Fettsäureketten führte zu einer Aufhebung des Fluoreszenz-Quenching. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse konnte gemessen werden aufgrund der zeitabhängigen Zunahme der Fluoreszenzintensität. Zwei verschiedene Systeme wurden verwendet, um die markierten Substrate zu dispergieren, nämlich Komplexierung mit Albumin sowie Solubilisierung mit dem nicht-ionischen Detergens Octylglucosid.
Bei Verwendung von Esterase-Substraten zeigte die Esterase EstA wie erwartet größere Aktivität bei kurzkettigen Verbindungen (C4- und C6-Carbonsäuren). Geringe Aktivität wurde angetroffen, wenn die Acylkette 12 C-Atome umfasste. Zugabe des Detergens Octylglucosid steigerte die Enzymaktivität in Bezug auf C4- und C6-Fettsäureestern (Fig. 10).
Bei Verwendung von Alkyldiacyl-Glycerinen zeigte die Esterase EstA eine Präferenz für kurzkettige Lipide. Hierbei wurde eine bemerkenswerte Stereoselektivität für das sn-3 Acyl-Isomer festgestellt (Fig. 11). In der Anwesenheit von Detergens war die Esterase EstA in der Lage, ein langkettiges Alkyldiacyl-Glycerin zu hydrolisieren, ein typisches Substrat für eine Lipase (Fig. 11). Dies steht in Einklang mit der besseren Zugänglichkeit und Mobilität des Substrats in diesem System [46]. Vermutlich führt die Solubilisierung des Lipids durch das Albumin zu einem Komplex, der aus Albumin und Alkyldiacylglycerin besteht [47,60]. Das Substrat ist in einem solchen Komplex aufgrund sterischer Behinderung durch das Protein vermutlich nicht leicht zugänglich. Die Reaktionsgeschwindigkeiten in Anwesenheit des Albumins sind immer geringer als die in Anwesenheit des Detergens [46].

f) Gaschromatographie (GC) und HPLC (high pressure liquid chromatography)

Die Umsetzungen für das GC/HPLC-Screening wurden in 5 ml 0,1 M NaH₂PO₄ (pH 7,3) durchgeführt. Zu dem Puffer wurden 250 µl Enzym und anschließend 100 µl Substrat hinzugegeben. Als Substrat wurden 2-Phenyl-2-hexyl-acetat sowie 2- Phenyl-2-butyl-acetat eingesetzt. Als Negativkontrolle wurde Puffer mit Substrat sowie Puffer mit Enzym eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden bei 25°C mit 150 rpm inkubiert. Nach 24 Stunden wurden Proben entnommen.
Zur Aufarbeitung der Proben wurde 1 ml Probe mit 0,5 ml CH₂Cl₂ extrahiert, die erhaltene Mischung 2 Minuten mit 12 000 rpm zentrifugiert und anschließend wurde die organische von der wässrigen Phase getrennt. Zu der organischen Phase wurden weitere 0,5 ml CH₂Cl₂ hinzugegeben und anschließend wurde die organische Phase mittels Na₂SO₄ getrocknet und mittels HPLC-Filter filtriert.
Nachdem das Lösungsmittel abgezogen worden war, fiel im Falle der Probe, bei der 2-Phenyl-2-hexyl-acetat als Substrat eingesetzt worden war, ein weißer Niederschlag aus, der sich im Laufmittel (Heptan : iso-Propanol - 90 : 10) nicht löste. Deshalb wurden zusätzlich zum Laufmittel 400 µl CH₂Cl₂ hinzugegeben, um den Niederschlag in Lösung zu bringen.
Für die HPLC wurde eine ChiraCel OJ-Säule eingesetzt. Es wurde eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewählt. Die Absorption wurde bei 254 nm gemessen, es wurde eine Temperatur von 25°C vorgegeben. Als Fließmittel wurde eine Mischung aus Heptan und Isopropanol eingesetzt. Zunächst wurde Heptan : Isopropanol im Verhältnis 95 : 5 vorgegeben. Nach 5 Minuten wurde ein Verhältnis Heptan : Isopropanol 85 : 15 vorgegeben, dieses wurde 20 Minuten konstant gehalten und anschließend wurde wieder ein Verhältnis von 95 : 5 eingestellt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Die angegebenen ee%-Werte beziehen sich zum einen auf den gebildeten Alkohol, zum anderen auf das verbliebene Substrat. Für den freigesetzten Alkohol konnte hierbei eine signifikante Enantioselektivität beobachtet werden. Tabelle 3 Ergebnisse der GC/HPLC-Untersuchungen

Beispiel 6

Herstellung des Trinitrophenylaminohexanoyl-pyrenmethylesters

Eine Lösung von Trinitrophenylamino-Hexansäure (260 µmol) und Pyrenmethanol (43 µmol), Dicyclohexylcarbodiimid (170 µmol) und Dimethylaminopyridin (130 µmol) in 1 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nach Zugabe von 9 ml Methylenchlorid wurde die organische Lösung mit 9 ml 0,1 N HCl und anschließend mit Wasser gewaschen. Anschließend erfolgte Trocknung über Na₂SO₄. Die reine Verbindung wurde erhalten durch präparative TLC auf Silica Gel 60 unter Verwendung von Chloroform-Methanol 95/5 (v/v) als Lösungsmittel (R_f = 0,4). Spuren von Unreinheit wurden durch Titration des isolierten Peptids mit Diethylether entfernt.
Die Trinitrophenylaminobutanoyl- und Trinitrophenylaminododecanoyl-Pyrenmethyl- Ester wurden nach demselben Verfahren hergestellt. 1(3)-O-Hexadecyl-2- pyrendecanoyl-3(1)-trinitro-phenylaminododecanoyl-sn-Glycerol und 1(3)-O-Octyl-2- Pyrenbutanoyl-3(1)trinitro-phenylaminohexanoyl-sn-Glycerol, fluorogene Alkyldiacylglycerole, wurden hergestellt wie in [47] beschrieben.

Beispiel 7

GLC Analyse mit Linaloylacetat als Substrat

Das gereinigte Enzym (1 mg) wurde mit 2 ml Tris-Puffer (10 mM, pH 7.5) und 10 µl racemischem Linalylacetat (Fluka, Schweiz) gemischt. Die Mischung wurde für 14 Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Rollen inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit Diethylether extrahiert (4 × 4 ml) und die organische Phase wurde mit Na₂SO₄ getrocknet. Nach Zugabe eines internen Standards (100 µl 0,1 M Menthol) wurde das organische Lösungsmittel durch Verdampfung konzentriert und mittels GLC analysiert.
Der Fortschritt der Reaktion wurde durch GLC-Analyse auf einer Permethylsiloxan- Säule (Biorad RSL 1701) beobachtet. Verwendet wurde das Programm 110/0-10- 160/0-20-220/2 bei einem bar N₂.
Die optische Reinheit des (s)-(+)-Linalools wurde auf einer Permethyl-β- Cyclodextrin-Säule (Chrompack Chirasil-Dex CB) mit (R)-Linalool (Fluka, Schweiz) als Bezugsstandard bestimmt. Verwendet wurde das Programm: 87°C isotherm, 0,5 bar H₂.
Das (S)-Enantiomer des Linalylacetats wurde bevorzugt gespalten, wobei das (S)- (+)-Linalool in 40%igem Überschuß bei einer Konversion von 24% entstand. Das verbleibende (R)-Acetat zeigte eine geringe optische Reinheit von e. e. 13%. Die Selektivität der Reaktion, ausgedrückt als enantiomeres Verhältnis, wurde mit in etwa gleich 3 berechnet. Obwohl die Selektivität nicht besonders hoch erscheint, ist die Fähigkeit des estA-Genproduktes, sterisch behinderte Ester tertiärer Alkohole zu spalten, bemerkenswert, vor allem bei der großen Anzahl an Lipasen, Proteasen und ganzen Zellen, die mittlerweile getestet worden sind, und die nicht dazu in der Lage waren [29, 30].

Beispiel 8

Vergleich der Sequenz von EstA mit Sequenzen anderer Serinhydrolasen

Tabelle 4

Identität und Homologie in Bezug auf die gesamte Proteinsequenz von EstA aus Rhodococcus sp. NCIMB 11216 in Vergleich zu Lipasen und Esterasen aus verschiedenen Organismen. Der Vergleich wurde ausgeführt unter Verwendung von CLUSTALW von PBIL [51] mit den folgenden Parametern: weight matrix - blosum; gap opening penalty - 10.0; gap extension penalty - 0.05.
Es zeigte sich, dass die Sequenz um das Ser-156 bei allen Enzymen sehr stark konserviert ist (Fig. 3), was darauf hinweist, daß es sich um einen katalytisch wichtigen Aminosäurerest handelt, möglicherweise um ein Mitglied der katalytischen Triade Ser-Asp-His, die beteiligt ist am charge transfer-Mechanismus der Serinhydrolase-Esterasen. Dieser putative Aminosäurerest des aktiven Zentrums befindet sich inmitten einer konservierten Region, die als typisches "signature pattern" für die GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme [11] angesehen werden kann.
Bei EstA handelt es sich bei der entsprechenden Sequence um die Sequenz: IVLAGDS¹⁵⁶AGGNLA (SEQ ID NO. 9).

Beispiel 9

Mutagenese-Experimente mit dem estA-Gen

Das 624 bp-Fragment am 3'-Ende des estA-Gens (64,9% GC-Anteil) wurde für die Mutagenese-Experimente verwendet. Neben einer PCR-Reaktion unter Standard- Reaktionsbedingungen wurden die in der Tabelle 5 angegebenen 6 verschiedenen Mutagenese-Bedingungen in der PCR vorgegebenen (A bis F).
Die Versuchsbedingungen A bis C unterscheiden sich nur in Bezug auf die Mn²⁺- Konzentration. Die hohen Mg²⁺- und dNTP-Konzentrationen wurden gewählt, um den Fehleinbau weiter zu begünstigen. Da die erhöhte Mg²⁺-Konzentration gewöhnlich die Bildung von AT-Paarungen auf Kosten von GC-Paarungen begünstigt, wurde für die Versuchsbedingungen D bis F ein Überschuß von dCTP und dTTP gegenüber dATP und dGTP vorgegeben, um dieses Problem zu überwinden.
Da auch eine höhere Enzymkonzentration den Fehleinbau von Nukleotiden begünstigt, wurden in allen Versuchen A bis F 8 anstatt 4 Einheiten (Units) Dynazyme™ II-DNA-Polymerase eingesetzt. Tabelle 5 Unterschiedliche PCR-Bedingungen
Zur Durchführung der PCR wurde das Plasmid pMS-RR1 eingesetzt, das das estA- Gen enthält, sowie die in der Tabelle β angegebenen Primer. Tabelle 6 Primer, die für die Zufallsmutagenese verwendet wurden * - Positionen nach der Numerierung in Fig. 2
Die Plasmid- (30 ng) und Primermenge (200 ng) wurde bei allen sieben PCR- Bedingungen konstant gehalten (jeweils Zugabe von 100 µl). Das folgende Temperaturprogramm, das gute Amplifikationsergebnisse für das 624 bp-Fragment unter "normalen" PCT-Bedingungen lieferte, kam zur Anwendung: 35 Zyklen (1' 94°C/1' 58°C/1' 72°C).
Nach Trennung auf einem Agarose-Gel wurden die gewünschten DNA-Fragmente gereinigt und in den Vektor pGEM-T ligiert (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Das resultierende Plasmid wurde unter Verwendung der SEM-Methode in kompetente E. coli-SURE-Zellen transformiert. Die Zellen wurden auf Amp/IPTG/X- GaI-Platten wachsen gelassen. Ungefähr 30% der Klone waren religierte Vektoren. Insertionen von einigen verschiedenen Plasmiden aus jedem Experiment, die nach Linearisierung mit Apa I die gewünschte Größe hatten, wurden unter Verwendung des Primers SP6 sequenziert. Die Sequenzen und Chromatogramme der mutierten Insertionen wurden mit der Sequenz und dem Chromatogramm des estA-Gens verglichen.
Die Tabellen 7 und 8 geben einen Überblick über die Anzahl und die Art der Mutationen, die in den Mutanten angetroffen wurden. Die Mutationsrate war umso höher, umso höher die Mn²⁺-Konzentration war, mit Ausnahme des Experimentes E. Da nur etwa 250 Nukleotide des 624 bp-Fragments sequenziert wurden, könnte das beobachtete Ergebnis aber auch auf eine statistische Abweichung zurückzuführen sein.
Außerdem wurde festgestellt, dass die beobachteten Mutationen in keiner besonderen Region kumulierten, also offenbar keine sogenannten "hot spots" in der estA-Sequenz enthalten sind. Tabelle 7 Mutationen, die im 624 bp-Insert gefunden wurden, das unter Verwendung der Primer M5test(480) und M5c0 erhalten wurde

Tabelle 8 Mutationsraten und Präferenzen bei verschiedenen Reaktionsbedingungen

Beispiel 10

Herstellung von Mutantenbibliotheken

Auf Grundlage der Ergebnisse aus Beispiel 9 wurden die Versuchsbedingungen B, C, E und F zur Herstellung der Mutantenbibliotheken verwendet. Das Plasmid pMS- RR1 und die in der Tabelle angegebenen Primer wurden in der PCR eingesetzt. Die 5'-Enden der Primer pMSStart und pMSEnd sind 125 bzw. 150 bp von der Nde I- bzw. Sph I-Klonierungsregion des Vektors pMS-RR1 entfernt.
Die PCR-Parameter waren dieselben wie in Beispiel 9 angegeben. Agarose- Gelelektrophorese führte zu einem 1,2 kb-Produkt in zwei von vier Versuchen. Leider konnte unter den Reaktionsbedingungen E und F keine PCR-Produkte erhalten werden, auch wenn die PCR-Parameter, wie Annealing-Temperatur, Nukleotid-Konzentration oder MgCl₂-Konzentration geändert wurden. Wahrscheinlich führt der Überschuß an dCTP und dTTP zu einer verminderten Produkt-Ausbeute in der PCR. Tabelle 9 Primer für die estA-Amplifikation
Die 1,2 kb-Fragmente, die uner den Reaktionsbedingungen B und C erhalten wurden, wurden gereinigt und mit NdeI und SphI verdaut, unter Erhalt von Ansammlungen von mutierten estA-Genen mit einer Länge von 918 Basenpaaren. Der Vektor pMS470Δ8 wurde mit den selben Restriktionsenzymen verdaut, und nach der Reinigung des linearisierten Vekors (3,9 kb) erfolgte Ligation der estA-Mutanten mit dem Vektor. Zur Analyse der Mutanten-Bibliotheken wurden 2 µl der 50 µl- Ligationsmischung in SEM-kompetente E. coli-XL1-blue-Zellen transformiert. Etwa 10 000 Klone konnten für jeden Mutagenese-Ansatz erhalten werden, bei einem schwachen Hintergrund von 1% an religiertem Vektor. Man kann deshalb davon ausgehen, dass die erhaltene Bibliothek etwa 250 000 Mutanten umfasst.
11 Klone aus Ansatz B und 10 Klone aus Ansatz C wurden nach dem Zufallsprinzip zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Alle unteruchten Plasmide hatten die korrekte Größe von 4.8 kb. Die Insertionen wurden unter Verwendung der Primer TaqNeu und TaqStop sequenziert.
Die Sequenzen wurden mit der estA-Sequenz verglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 dargestellt. Die beobachtete Frequenzhäufigkeit war geringer als in Beispiel 9. Jedoch kann von einer Mutationshäufigkeit von 2 bis 3 Substitutionen pro mutiertem estA-Gen ausgegangen werden. Tabelle 10 Substitutionen and Frameshift-Mutationen, die in estA-Fragmenten verschiedener Bibliotheken gefunden wurden

Tabelle 1 Mutationsraten und Präferenzen in der Mutantenbibliothek

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Claims

1. Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 195 bis 1115 gemäß SEQ ID No. 1,

b) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2,

c) natürlicherweise vorkommende Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b),

d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide,

e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide,

f) Polynukleotid mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50% in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d),

g) Polynukleotid, bestehend aus mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c) oder (d),

h) Polynukleotid mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 50 Nukleotiden gegenüber einer Nukleinsäure gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),

i) Polynukleotide, die mindestens eine der unter (a) bis (h) genannten Nukleinsäuren umfassen.

2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodierend für eine Enzym mit hydrolytischer Aktivität.

3. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Enzym um eine Esterase oder Lipase handelt.

4. Polynukleotid gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase handelt.

5. Polynukleotid gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei es sich bei der Esterase um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 handelt.

6. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Enzym um ein Enzym mit alpha/beta-Hydrolase-Faltung handelt.

7. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen umfasst.

8. Verfahren zur Herstellung und/oder Identifzierung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird und/oder anhand einer Sonde, eines Antikörpers oder eines Hydrolase-Aktivitätstests aus einer Genbank isoliert wird und/oder durch Polymerase-Kettenreaktion und/oder durch Mutagenese-Experimente erhalten wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäurebliothek wird mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kontaktiert,

b) eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert, wird identifiziert,

c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.

10. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend:

a) ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 werden Primer hergestellt,

b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren,

c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.

11. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäure-Bibliothek wird mit einem Assay, der die Identifikation von Hydrolase-kodierenden Gensequenzen erlaubt, untersucht,

b) die Hydrolase-positiven Klone werden identifiziert und gereinigt,

c) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (b) identifizierten Klonen werden sequenziert.

12. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 wird Mutagenese-Experimenten unterworfen,

b) die erhaltenen Mutanten werden sequenziert, in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert,

c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität hin untersucht,

d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigen, werden sequenziert.

13. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.

14. Wirtszelle enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 13.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Wirtszelle um Rhodococcus oder E. coli handelt.

16. Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2,

b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptid gemäß (a),

c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50% in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen,

d) Polypeptide, die von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 kodiert werden,

e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b),

f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 60 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c),

g) Polypeptide, die mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide umfassen.

17. Polypeptid gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität handelt.

18. Polypeptid gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei dem Enzym um eine Esterase oder Lipase handelt.

19. Polypeptid nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um eine Serin-Esterase handelt.

20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei es sich bei dem Polypeptid um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 handelt.

21. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz IVLAGDSAGGNLA umfasst.

22. Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei es sich um ein wasserlösliches Protein handelt.

23. Präparationen, enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 22.

24. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Wirtszelle um Rhodococcus oder E. coli handelt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, folgende Schritte umfassend:

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und E. coli wird mit dem Vektor transformiert,

b) nach der Expression des Proteins werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen,

c) das Protein wird aus dem so erhaltenen Überstand gereinigt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung die Schritte Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltration umfasst.

28. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22.

29. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 immunisiert wird und gegebenenfalls die entstandenen Antikörper isoliert werden.

30. Testsystem zur Identifizierung von Substraten oder funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, ein Polypeptid gemäß Anspruch 15 oder einen Antikörper gemäß Anspruch 26 und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

31. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 zur hydrolytischen Spaltung oder Knüpfung von Ester-, Thioester-, Amid-, Halid- oder Peptid-Bindungen.

32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennezeichnet, dass die Reaktion enantioselektiv verläuft.

33. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, wobei es sich bei den Substraten oder Produkten um Triglyceride und/oder Carbonsäureester kurzkettiger Fettsäuren handelt.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Bindung sterisch schwer zugänglich ist.

35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Substrat um den Ester eines Tertiäralkohols handelt.

36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei es sich bei dem Ester um Linaloylacetat, 2-Phenyl-2-butyl-acetat oder 2-Phenyl-2-hexyl-acetat handelt.