DE10133667A1 - Preparation of L-amino acids, preferably L-threonine useful e.g. in medicine involves fermenting strains of Enterobacteriaceae family - Google Patents

Abstract

Preparation of L-amino acids, preferably L-threonine (I) comprises: (1) fermenting microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in which at least one of the genes of the cysteine biosynthesis pathway is enhanced, preferably overexpressed, and (2) concentrating (I) in the medium or in the cells of the microorganisms and isolation. Preparation of L-amino acids, preferably L-threonine (I) comprises: (1) fermenting microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in which at least one of the genes of the cysteine biosynthesis pathway is enhanced, preferably overexpressed; (2) concentrating (I) in the medium or in the cells of the microorganisms and (3) isolating the desired L-amino acid, constituents of the fermentation broth and/or the biomass in its entirety or portions (0-100%) optionally remaining in the product. The gene (G1) of the cysteine biosynthesis pathway is cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE, sbp, or nucleotide sequences coding for the genes.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eines oder mehrere der Gene der Cystein-Biosynthese, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp verstärkt wird (werden). This invention relates to a method of fermentative Production of L-amino acids, especially L-threonine, using family tribes Enterobacteriaceae, in which at least one or more the genes of cysteine biosynthesis selected from the group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp is reinforced (become).

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung. L-amino acids, especially L-threonine, can be found in the Human medicine and in the pharmaceutical industry, in the Food industry and especially in the Animal nutrition application.

Es ist bekannt L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen. L-amino acids are known from fermentation of strains the Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli (E. coli) and Serratia marcescens. Because of the great importance is constantly attached to the improvement of the Manufacturing process worked. process improvements can fermentation-related measures such. B. Stirring and supply of oxygen, or the composition of the Culture media such as B. the sugar concentration during the Fermentation, or the processing to product form, by z. B. ion exchange chromatography, or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren. To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. This way you get Strains resistant to antimetabolites such as B. that Threonine analog α-amino-β-hydroxyvaleric acid (AHV) or are auxotrophic for regulatory metabolites and L-amino acids such as B. Produce L-threonine.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht. Methods of recombinant DNA technology for strain improvement L- Strains of the family producing amino acids Enterobacteriaceae used by individual Amino acid biosynthesis genes amplified and the impact examined for production.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen. The inventors set themselves the task of creating new ones Measures to improve the fermentative production of L- To provide amino acids, especially L-threonine.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L- Aminosäuren produzieren, und in denen mindestens eine oder mehrere der für die Gene cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt wird (werden). The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, using microorganisms from the Family Enterobacteriaceae, which in particular already L- Produce amino acids, and in which at least one or several of the genes cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, nucleotide sequence (s) encoding cysE and sbp amplified will become).

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin. If L-amino acids or amino acids are mentioned below, are one or more amino acids included their salts, selected from the group L-asparagine, L- Threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L- Cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L- Tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine meant. L-threonine is particularly preferred.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "reinforcement" describes in this context the increase in the intracellular activity of one or several enzymes or proteins in a microorganism that can be encoded by the appropriate DNA by using for example the copy number of the gene or genes increased, a strong promoter or a gene or allele used that for a corresponding enzyme or protein encoded with a high activity and possibly this Combined measures.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht. Through the measures of reinforcement, in particular Overexpression, the activity or concentration of the corresponding protein in general by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000% based on that of the wild type Protein or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism increased.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysE, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, verstärkt wird (werden),
• b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
• c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben.

The process is characterized in that the following steps are carried out:

• a) fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family in which one or more of the genes selected from the group cysG, cysE, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH , cysE and sbp, will be strengthened,
• b) enrichment of the corresponding L-amino acid in the medium or in the cells of the microorganisms of the Enterobacteriaceae family, and
• c) Isolation of the desired L-amino acid, where appropriate components of the fermentation broth and / or the biomass in their entirety or in portions (> 0 to 100%) thereof remain in the product.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen. The microorganisms that are the subject of the present L-amino acids from glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, optionally starch, optionally cellulose or Make glycerin and ethanol. It is a matter of Representative of the Enterobacteriaceae family, selected from the genera Escherichia, Erwinia, Providencia and Serratia. The genera Escherichia and Serratia are prefers. In the genus Escherichia is particularly Kind Escherichia coli and in the genus Serratia especially the species Serratia marcescens.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132 Suitable, in particular L-threonine-producing strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, are for example
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetic MG442
Escherichia coli VNIIgenetics M1
Escherichia coli VNIIgenetics 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000 Suitable strains of the genus Serratia, in particular of the species Serratia marcescens, which produce L-threonine are, for example
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung. L-threonine-producing strains from the Enterobacteriaceae preferably have, among others or more of the genetic or phenotypic traits selected from the group: resistance to α-amino-β- Hydroxyvaleric acid, resistance to thialysine, resistance against ethionine, resistance against α-methylserine, resistance against diamino succinic acid, resistance against α-aminobutyric acid, resistance to borrelidine, resistance against rifampicin, resistance to valine analogues such as for example valine hydroxamate, resistance to Purine analogs such as 6-dimethylaminopurine, Need for L-methionine, partial and if necessary Compensable need for L-isoleucine, need for meso-diaminopimelic acid, auxotrophy related Dipeptides containing threonine, resistance to L-threonine, Resistance to L-homoserine, resistance to L-lysine, Resistance to L-methionine, resistance to L-glutamic acid, resistance to L-aspartate, resistance to L-leucine, resistance to L-phenylalanine, resistance to L-serine, resistance to L-cysteine, resistance to L-valine, sensitivity to fluoropyruvate, defective Threonine dehydrogenase, optionally ability to Sucrose utilization, enhancement of the threonine operon, Enhancement of homoserine dehydrogenase I aspartate kinase I prefers the feed back resistant form, reinforcement of the Homoserine kinase, enhancement of threonine synthase, Enhancement of the aspartate kinase, possibly the feed back resistant form, reinforcement of aspartate semialdehyde Dehydrogenase, enhancement of phosphoenolpyruvate Carboxylase, optionally the feed-back-resistant form, Enhancement of phosphoenolpyruvate synthase, enhancement transhydrogenase, enhancement of the RhtB gene product, Enhancement of the RhtC gene product, enhancement of the YfiK Gene product, enhancement of a pyruvate carboxylase, and Attenuation of acetic acid formation.

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression mindestens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysw, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren. It has been found that family microorganisms Enterobacteriaceae after reinforcement, in particular Overexpression of at least one or more of the genes, selected from the group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysw, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, in an improved way L-amino acids, especially produce L-threonine.

Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden. The nucleotide sequences of the genes from Escherichia coli belong to the state of the art and can also be that of Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) published genome sequence from Escherichia coli become.

cysG-Gen:
Bezeichnung: Uroporphyrinogen III Methyltransferase
Referenz: Peakman et al., European Journal of Biochemistry 191, 315-23 (1990)
Accession No.: AE000412 cysG gene:
Name: Uroporphyrinogen III methyl transferase
Reference: Peakman et al., European Journal of Biochemistry 191, 315-23 (1990)
Accession No .: AE000412

cysB-Gen:
Bezeichnung: Positiver Regulator des cys-Regulon, Transkriptionsaktivator
Referenz: Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 262, 5999-6005 (1987)
Accession No.: AE000225 cysB gene:
Name: Positive regulator of the cys regulon, transcription activator
Reference: Ostrowski et al .; Journal of Biological Chemistry 262, 5999-6005 (1987)
Accession No .: AE000225

cysZ-Gen:
Bezeichnung: Sulfat-Transporter
Referenz: Byrne et al.; Journal of Bacteriology 170, 3150-7 (1988)
Accession No.: AE000329 cysZ gene:
Name: sulfate transporter
Reference: Byrne et al .; Journal of Bacteriology 170, 3150-7 (1988)
Accession No .: AE000329

cysK-Gen:
Bezeichnung: Cystein-Synthase A, O-Acetylserin (thiol)- Lyase-A
EC-Nr.: 4.2.99.8
Referenz: Byrne et al.; Journal of Bacteriology 170, 3150-7 (1988)
Accession No.: AE000329
Alternativer Genname: cysZ cysK gene:
Name: Cysteine synthase A, O-acetylserine (thiol) - Lyase-A
EC No .: 4.2.99.8
Reference: Byrne et al .; Journal of Bacteriology 170, 3150-7 (1988)
Accession No .: AE000329
Alternative name: cysZ

cysM-Gen:
Bezeichnung: O-Acetylserin (thiol)-Lyase-B
EC-Nr.: 4.2.99.8
Referenz: Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No.: AE000329 cysM gene:
Name: O-acetylserine (thiol) lyase-B
EC No .: 4.2.99.8
Reference: Sirko et al .; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No .: AE000329

cysA-Gen:
Bezeichnung: Sulfat-Permease
Referenz: Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No.: AE000329 cysA gene:
Name: sulfate permease
Reference: Sirko et al .; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No .: AE000329

cysW-Gen:
Bezeichnung: Membran-gebundenes Sulfat-Transportprotein
Referenz: Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No.: AE000329, AE000330 cysW gene:
Name: Membrane-bound sulfate transport protein
Reference: Sirko et al .; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No .: AE000329, AE000330

cysU-Gen:
Bezeichnung: Sulfat-Transportsystem, Permeaseprotein
Referenz: Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No.: AE000330
Alternativer Genname: cysT cysU gene:
Name: sulfate transport system, permease protein
Reference: Sirko et al .; Journal of Bacteriology 172, 3351-7 (1990)
Accession No .: AE000330
Alternative name: cysT

cysP-Gen:
Bezeichnung: Periplasmatisches Sulfat-Bindeprotein
Referenz: Hryniewicz et al.; Journal of Bacteriology 172, 3358-66 (1990)
Accession No.: AE000330 cysP gene:
Name: Periplasmic sulfate binding protein
Reference: Hryniewicz et al .; Journal of Bacteriology 172, 3358-66 (1990)
Accession No .: AE000330

cysD-Gen:
Bezeichnung: ATP: Sulfat-Adenylyltransferase
EC-Nr.: 2.7.7.4
Referenz: Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No.: AE000358 cysD gene:
Name: ATP: sulfate adenylyl transferase
EC No .: 2.7.7.4
Reference: Leyh et al .; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No .: AE000358

cysN-Gen:
Bezeichnung: ATP: Sulfat-Adenylyltransferase
Referenz: Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No.: AE000358 cysN gene:
Name: ATP: sulfate adenylyl transferase
Reference: Leyh et al .; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No .: AE000358

cysC-Gen:
Bezeichnung: P-Adenylylsulfat-Kinase
EC-Nr.: 2.7.1.25
Referenz: Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No.: AE000358 cysC gene:
Name: P-adenylyl sulfate kinase
EC No .: 2.7.1.25
Reference: Leyh et al .; Journal of Biological Chemistry 267, 10405-10 (1992)
Accession No .: AE000358

cysJ-Gen:
Bezeichnung: NADPH-Sulfit-Reduktase Flavoprotein
EC-Nr.: 1.8.1.2
Referenz: Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264, 15796-808 (1989)
Accession No.: AE000360
Alternativer Genname: cysP cysJ gene:
Name: NADPH sulfite reductase flavoprotein
EC No .: 1.8.1.2
Reference: Ostrowski et al .; Journal of Biological Chemistry 264, 15796-808 (1989)
Accession No .: AE000360
Alternative name: cysP

cysI-Gen:
Bezeichnung: NADPH-Sulfit-Reduktase Hämoprotein
EC-Nr.: 1.8.1.2
Referenz: Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264, 15726-37 (1989)
Accession No.: AE000360
Alternativer Genname: cysQ cysI gene:
Name: NADPH sulfite reductase hemoprotein
EC No .: 1.8.1.2
Reference: Ostrowski et al .; Journal of Biological Chemistry 264, 15726-37 (1989)
Accession No .: AE000360
Alternative name: cysQ

cysH-Gen:
Bezeichnung: Adenylylsulfat-Reduktase
EC-Nr.: 1.8.99.2
Referenz: Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264, 15726-37 (1989)
Accession No.: AE000360 cysH gene:
Name: Adenylyl sulfate reductase
EC No .: 1.8.99.2
Reference: Ostrowski et al .; Journal of Biological Chemistry 264, 15726-37 (1989)
Accession No .: AE000360

cysE-Gen:
Bezeichnung: Serin-Acetyl-Transferase
EC-Nr.: 2.3.1.30
Referenz: Denk & Böck; Journal of General Microbiology 133, 515-25 (1987)
Accession No.: AE000438 cysE gene:
Name: Serine acetyl transferase
EC No .: 2.3.1.30
Reference: Denk &Böck; Journal of General Microbiology 133, 515-25 (1987)
Accession No .: AE000438

sbp-Gen:
Bezeichnung: Periplasmatisches Sulfat-Bindeprotein
Referenz: Hellinga & Evans, European Journal of Biochemistry 149, 363-73 (1985)
Accession No.: AE000466 sbp gene:
Name: Periplasmic sulfate binding protein
Reference: Hellinga & Evans, European Journal of Biochemistry 149, 363-73 (1985)
Accession No .: AE000466

Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden. The nucleic acid sequences can be found in the databases of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA), the European Molecular Biologies nucleotide sequence database Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany or Cambridge, UK) or the DNA database of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) be removed.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben. The genes described in the specified passages can be used according to the invention. Can continue Alleles of the genes that are derived from the Degeneracy of the genetic code or through Functionally neutral sense mutations result.

Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden. To achieve reinforcement, for example Expression of the genes or the catalytic properties of the proteins are increased. If necessary, both can Measures are combined.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. To achieve overexpression, the number of copies of the corresponding genes can be increased, or it can Promoter and regulatory region or the Ribosome binding site located upstream of the Structural gene located to be mutated. In the same way expression cassettes act upstream of the Structural gene can be installed. By inducible It is also possible for promoters to express in History of fermentative L-threonine production increase. Through measures to extend the lifespan expression of the m-RNA is also improved. Furthermore, by preventing the degradation of the Enzyme protein also increases enzyme activity. The Genes or gene constructs can either be found in plasmids different number of copies are present or in the chromosome be integrated and amplified. Alternatively, you can continue to overexpress the genes in question Change in media composition and culture management can be achieved.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. The expert can find instructions on this among others Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), by Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), in Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), in de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), in LaVallie et al. (BIO / TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT / US97 / 13359, by Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), by Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), by Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysE, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp oder dafür codierende Nucleotidsequenzen trägt. Plasmids vectors replicable in Enterobacteriaceae such as z. B. cloning vectors derived from pACYC184 (Bartolomé et al .; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al .; Gene 69: 301-315 (1988)) or pSC101 derivatives (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) can be used. In one The method according to the invention can be used with a Use plasmid vector transformed strain, the Plasmid vector of at least one or more of the genes selected from the group cysG, cysE, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp or nucleotide sequences coding therefor wearing.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression der jeweiligen Gene betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al. Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen. It is also possible to mutate the expression of the relevant genes, by sequence exchange (Hamilton et al. Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), conjugation or transduction into different To transfer tribes.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysu, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin- Dinukleotid-Phosphat zu verstärken. It can also be used for the production of L-amino acids, especially L-threonine with strains of the family Enterobacteriaceae may be beneficial in addition to Amplification of one or more of the genes selected from the Group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysu, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, a or several enzymes of the known threonine biosynthetic pathway or enzymes of anaplerotic metabolism or enzymes for the production of reduced nicotinamide adenine Enhance dinucleotide phosphate.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
• - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE- A-198 31 609),
• - das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
• - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
• - die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
• - das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
• - das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 10 03 4833.5),
• - das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
• - das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 10 02 6494.8), und
• - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)).

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden. For example, one or more of the genes selected from the group can be used simultaneously

• the thrABC operon coding for aspartate kinase, homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase (US Pat. No. 4,278,765),
• the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase (DE-A-198 31 609),
• the pps gene coding for phosphoenolpyruvate synthase (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
• the ppc gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase (Gene 31: 279-283 (1984)),
• the genes pntA and pntB coding for the transhydrogenase (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
• the rhtB gene which mediates resistance to homoserine (EP-A-0 994 190),
• the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase (DE 10 03 4833.5),
• the rreC gene which mediates resistance to threonine (EP-A-1 013 765),
• - The thrE gene from Corynebacterium glutamicum (DE 10 02 6494.8) coding for threonine export, and
• - the gdhA gene coding for glutamate dehydrogenase (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)).

amplified, especially overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
• - das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
• - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• - das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al. Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)),
• - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan Nucleic Acids Research 14 (13), 5449-5460 (1986)),
• - das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Matsuoko und McFadden, Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988)),
• - das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase- Systems kodierende dgsA-Gen (Hosono et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256-251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist, und
• - das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Jahreis et al., Molecular and General Genetics 226, 332-336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern. Furthermore, it can be advantageous for the production of L-amino acids, in particular L-threonine, in addition to amplifying one or more of the genes selected from the group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD , cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, one or more of the genes selected from the group

• the tdh gene coding for threonine dehydrogenase (Ravnikar and Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
• the mdh gene coding for malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37) (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
• - the gene product of the open reading framework (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• - the gene product of the open reading framework (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• the pckA gene coding for the enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase (Medina et al. Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)),
• the poxB gene coding for pyruvate oxidase (Grabau and Cronan Nucleic Acids Research 14 (13), 5449-5460 (1986)),
• the aceA gene coding for the enzyme isocitrate lyase (Matsuoko and McFadden, Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988)),
• - The dgsA gene coding for the DgsA regulator of the phosphotransferase system (Hosono et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256-251 (1995)), which is also known under the name mlc gene, and
• the fruR gene coding for the fructose repressor (Jahreis et al., Molecular and General Genetics 226, 332-336 (1991)), which is also known under the name cra gene,

weaken, in particular switch off or reduce expression.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "weakening" describes in this Related to reducing or eliminating the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism caused by the corresponding DNA can be encoded, for example by uses a weak promoter or a gene or allele, that for a corresponding enzyme with a low Activity coded or the corresponding enzyme (protein) or gene inactivated and, if necessary, these measures combined.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Through the mitigation measures, the activity or concentration of the corresponding protein in the general to 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type Protein, or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). It can also be used for the production of L-amino acids, L-threonine in particular may be advantageous in addition to Amplification of one or more of the genes selected from the Group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, to eliminate unwanted side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. The microorganisms produced according to the invention can in batch process (batch cultivation), in fed batch (Feed process) or in the repeated fed batch process (repetitive feed process) can be cultivated. A Summary of known cultivation methods are in the Textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. The culture medium to be used must be in a suitable manner The requirements of the respective tribes meet. descriptions of culture media of various microorganisms are in "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Sugar and carbohydrates such as z. B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, Molasses, starch and possibly cellulose, oils and fats such as B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, Fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and Linoleic acid, alcohols such as B. glycerin and ethanol and organic acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture become.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Organic nitrogenous substances can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must also contain salts of metals included, such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, the are necessary for growth. Finally, you can essential growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the substances mentioned above. Suitable precursors can also be used in the culture medium be added. The feedstocks mentioned can be used for Culture added in the form of a unique approach or appropriately fed during cultivation become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. to Antifoam agents such as z. B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics to be added. To aerobic conditions will maintain oxygen or Oxygen-containing gas mixtures such as B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 25 ° C to 45 ° C and preferably at 30 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of L- Has formed amino acids or L-threonine. That goal will usually within 10 hours to 160 hours reached.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. The analysis of L-amino acids can be done by Anion exchange chromatography with subsequent Ninhydrin derivatization take place, as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), or it can be done by reversed phase HPLC, such as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:  1167-1174).

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie beispielsweise L- Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin. The method according to the invention is used for fermentative purposes Production of L-amino acids, such as L- Threonine, L-isoleucine, L-valine, L-methionine, L-homoserine and L-lysine, especially L-threonine.

Claims (7)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man eines oder mehrere der Gene der Cystein-Biosynthese, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100) davon im Produkt verbleiben. 1. A process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, characterized in that the following steps are carried out: a) fermentation of the desired L-amino acid-producing microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in which one or more of the genes of cysteine biosynthesis, selected from the group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, or nucleotide sequences coding therefor are amplified, in particular overexpressed, b) enrichment of the desired L-amino acid in the medium or in the cells of the microorganisms, and c) Isolation of the desired L-amino acid, components of the fermentation broth and / or the biomass in their entirety or proportions (> 0 to 100) thereof remaining in the product, if appropriate. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt. 2. The method according to claim 1, characterized characterized that microorganisms uses, in which one also additional genes of Biosynthetic pathway of the desired L-amino acid strengthened. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern. 3. The method according to claim 1, characterized characterized that microorganisms uses in which the metabolic pathways at least are partially turned off, which is the formation of the reduce the desired L-amino acid. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotids (e), das (die) für eines oder mehrere der Gene der Cystein-Biosynthese, ausgewählt aus der Gruppe cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, kodiert (kodieren) erhöht. 4. The method according to claim 1, characterized characterized in that the expression of polynucleotide (s) for one or selected several of the genes of cysteine biosynthesis from the group cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE and sbp, coded (coding) increased. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften der Polypeptide (Proteine) verbessert oder erhöht, für die die Polynukleotide cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysu, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp kodieren. 5. The method according to claim 1, characterized characterized that one the regulatory and / or catalytic properties the polypeptides (proteins) are improved or increased, for which the polynucleotides cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysu, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, encode cysH, cysE and sbp. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 1. 6.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon, 2. 6.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen, 3. 6.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen, 4. 6.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen, 5. 6.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB, 6. 6.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB, 7. 6.7 das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen, 8. 6.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC, und 9. 6.9 das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen 10. 6.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen verstärkt, insbesondere überexprimiert. 6. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-amino acids microorganisms of the Enterobacteriaceae family are fermented, in which one additionally one or more of the genes selected from the group: 1. 6.1 the thrABC operon coding for aspartate kinase, homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase, 2. 6.2 the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase, 3. 6.3 the pps gene coding for the phosphoenolpyruvate synthase, 4. 6.4 the ppc gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase, 5. 6.5 the genes pntA and pntB coding for the transhydrogenase, 6. 6.6 the gene which mediates homoserine resistance rhtB, 7. 6.7 the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase, 8. 6.8 the gene mediating threonine resistance rhtC, and 9. 6.9 the thrE gene coding for threonine export 10. 6.10 the gdhA gene coding for glutamate dehydrogenase amplified, especially overexpressed. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 1. 7.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen, 2. 7.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen, 3. 7.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA, 4. 7.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP, 5. 7.5 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen, 6. 7.6 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen, 7. 7.7 das für die Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen, 8. 7.8 das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen, 9. 7.9 das für den Fructose-Repressor kodierende fruR- Gen, abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert. 7. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-amino acids, microorganisms of the Enterobacteriaceae family are fermented, in which additionally one or more of the genes selected from the group: 1. 7.1 the tdh gene coding for the threonine dehydrogenase, 2. 7.2 the mdh gene coding for malate dehydrogenase, 3. 7.3 the gene product of the open reading frame (orf) yjfA, 4. 7.4 the gene product of the open reading frame (orf) ytfP, 5. 7.5 the pckA gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase, 6. 7.6 the poxB gene coding for the pyruvate oxidase, 7. 7.7 the aceA gene coding for the isocitrate lyase, 8. 7.8 the dgsA gene coding for the DgsA regulator of the phosphotransferase system, 9. 7.9 the fruR gene coding for the fructose repressor, attenuates, in particular switches off or the expression decreases.