DE10119274A1 - Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen - Google Patents
Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von KetoverbindungenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von organischen Ketoverbindungen zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen, eine Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor und ein Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von (S)-Hydroxyverbindung aus einem Razemat.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven
Reduktion von organischen Ketoverbindungen zu den entsprechenden chiralen
Hydroxyverbindungen, eine Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor und ein
enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von (S)-Hydroxyverbindung
aus einem Razemat.
Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle Synthesebausteine zur Herstellung
einer Vielzahl pharmakologisch wichtiger Verbindungen. Diese Verbindungen sind oft
schwer herstellbar durch klassische chemische Verfahren und können die für
pharmakologische Anwendungen geforderte Enantiomerenreinheit nur selten erreichen.
Daher werden zur Herstellung chiraler Verbindungen in der Regel biotechnologische
Verfahren angewendet, wobei die stereoselektive Reaktion entweder von ganzen
Mikroorganismen oder mit isolierten Enzymen durchgeführt wird.
Dabei hat sich oft der Einsatz von isolierten Enzymen als vorteilhaft erwiesen, da mit
solchen in der Regel höhere Ausbeuten sowie eine höhere Enantiomerenreinheit
erzielbar sind.
Dehydrogenasen und insbesondere Alkohol-Dehydrogenasen sind wertvolle
Katalysatoren zur Gewinnung von chiralen Produkten durch stereoselektive Reduktion
von organischen Ketoverbindungen zu den entsprechenden chiralen Alkoholen.
Bekannt sind im wesentlichen entsprechende Enzyme aus Hefe, Pferdeleber oder
Thermoanaerobium brockii. Diese Enzyme benötigen als Coenzym NADH
(Nicotinadenindinukleotid) oder NADPH (Nicotinadenindinukleotidphosphat). Weitere
bekannte Alkohol-Dehydrogenasen sind beispielsweise eine (S)-spezifische Alkohol-
Dehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis oder eine (R)-spezifische Alkohol-
Dehydrogenase aus der Gattung Lactobacillus. Beide Enzymtypen haben ein breites
Substratspektrum an Ketoverbindungen und weisen eine hohe Enantioselektivität auf.
Die Alkohol-Dehydrogenasen aus Lactobacillus kefir (DE 40 14 573) und Lactobacillus
brevis (DE 196 10 984) eignen sich insbesondere zur Gewinnung von chiralen (R)-
Alkoholen.
Nachteilig für die Anwendung von Alkohol-Dehydrogenasen sind allerdings die geringe
Enzymstabilität und Enzymaktivität der Alkohol-Dehydrogenasen in organischen
Lösungsmitteln und die oft nur geringe Wasserlöslichkeit der zu reduzierenden
Ketoverbindungen. Ferner ist ein weiterer limitierender Faktor für die Anwendung der
Alkohol-Dehydrogenasen in organischen Lösungsmitteln der notwendige Einsatz von
NADP oder NAD als Cofaktorbedarf, da der Cofaktor (NADP, NAD) wasserlöslich ist
und in ökonomischen Verfahren regeneriert wird.
Die Erfindung bezweckt durch Modifikation der Verfahrensbedingungen die genannten
Nachteile zu verbessern. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die
Verwendung eines Zwei-Phasen-Systems, enthaltend ein organisches Lösungsmittel,
Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor und Ketoverbindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Standzeit auf durch die
enzymstabilisierende Wirkung des Lösemittels, eine enantiomeren Reinheit von mehr
als 99,9% der hergestellten chiralen Hydroxyverbindungen und eine hohe Ausbeute
bezogen auf die eingesetzte Menge der Ketoverbindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft daher ein Verfahren zur enantioselektiven
Reduktion einer Ketoverbindung der Formel I
R1-C(O)-R2 (I)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
- 1. Wasserstoffatom,
- 2. -(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
- 3. -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
- 4. -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
- 5. -(C6-C14)-Aryl,
- 6. -(C1-C8)-Alkyl-(C5-C14)-Aryl, oder
- 7. R1 und R2 bilden zusammen mit dem -C(O)-Rest ein -(C6-C14-Aryl oder
einen -(C5-C14)-Heterocyclus,
wobei die oben unter 1. bis 7. genannten Reste unsubstituiert sind oder ein- bis dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch- a) -OH,
- b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod,
- c) -NO2,
- d) -C(O)-O-(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
- e) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro,
dadurch gekennzeichnet, dass man
- a) die Verbindung der Formel I, Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor und ein organisches Lösungsmittel mit einem logP von 0,5 bis 4,0,
- b) in einem Zwei-Phasen-System inkubiert und
- c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert.
Kohlenstoffatomen im Ring. -(C6-C14)-Arylreste sind beispielsweise Phenyl, Naphthyl.
Unter dem Begriff Aryl werden aromatische Kohlenstoffreste verstanden mit 6 bis 14
zum Beispiel 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Biphenylyl, zum Beispiel 2-Biphenylyl, 3-
Biphenylyl und 4-Biphenylyl, Anthryl oder Fluorenyl. Biphenylylreste, Naphthylreste und
insbesondere Phenylreste sind bevorzugte Arylreste. Unter dem Begriff "Halogen" wird
ein Element aus der Reihe Fluor, Chlor, Brom oder Jod verstanden. Unter dem Begriff
"-(C1-C20)-Alkyl wird ein Kohlenwasserstoffrest verstanden, dessen Kohlenstoffkette
geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält.
Der Begriff "-(C5-C14)-Heterocyclus" steht für einen monocyclischen oder bicyclischen
5-gliedrigen bis 14-gliedrigen heterocyclischen Ring, der teilweise gesättigt oder
vollständig gesättigt ist. Beispiele für Heteroatome sind N, O und S. Beispiele für die
Begriffe -(C5-C14)-Heterocyclus sind Reste, die sich von Pyrrol, Furan, Thiophen,
Imidazol, Pyrazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, Tetrazol, 1,2,3,5-Oxathiadiazol-
2-Oxide, Triazolone, Oxadiazolone, Isoxazolone, Oxadiazolidindione, Triazole, welche
durch F, -CN, -CF3 oder -C(O)-O-(C1-C4)-Alkyl substituert sind, 3-Hydroxypyrro-2,4-
dione, 5-Oxo-1,2,4-Thiadiazole, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Indol, Isoindol, Indazol,
Phthalazin, Chinolin, Isochinolin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, -Carbolin und benz
anellierte, cyclopenta-, cyclohexa- oder cyclohepta-anellierte Derivate dieser
Heterocyclen ableiten. Insbesondere bevorzugt sind die Reste 2- oder 3-Pyrrolyl,
Phenylpyrrolyl wie 4- oder 5-Phenyl-2-pyrrolyl, 2-Furyl, 2-Thienyl, 4-Imidazolyl, Methyl
imidazolyl, zum Beispiel 1-Methyl-2-, -4- oder-5-imidazolyl, 1,3-Thiazol-2-yl, 2-Pyridyl,
3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl-N-oxid, 2-Pyrazinyl, 2-, 4- oder 5-Pyrimidinyl,
2-, 3- oder 5-Indolyl, substituiertes 2-Indolyl, zum Beispiel 1-Methyl-, 5-Methyl-, 5-
Methoxy-, 5-Benzyloxy-, 5-Chlor- oder 4,5-Dimethyl-2-indolyl, 1-Benzyl-2- oder -3-
indolyl, 4,5,6,7-Tetrahydro-2-indolyl, Cyclohepta[b]-5-pyrrolyl, 2-, 3- oder 4-Chinolyl, 1-,
3- oder 4-Isochinolyl, 1-Oxo-1,2-dihydro-3-isochinolyl, 2-Chinoxalinyl, 2-Benzofuranyl,
2-Benzo-thienyl, 2-Benzoxazolyl oder Benzothiazolyl oder Dihydropyridinyl, Pyrrolidinyl,
zum Beispiel 2- oder 3-(N-Methylpyrrolidinyl), Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl,
Tetrahydrothienyl oder Benzodioxolanyl.
Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester,
Acetophenon, Acetessigsäuremethylester, Ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat, 2,5-Hexandion
Ethylpyruvat oder 2-Octanon, bevorzugt 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester. Die
Verbindungen der Formel I werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge
von 2% bis 30% bezogen auf das Gesamtvolumen eingesetzt, bevorzugt von 10%
bis 25%, insbesondere von 15% bis 22%.
Dem Wasser wird bevorzugt ein Puffer zugesetzt, beispielsweise Kaliumphosphat-,
Tris/HCl- oder Triethanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein
pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration beträgt von 10 mM bis 150 mM, bevorzugt
von 90 mM bis 110 mM, insbesondere 100 mM. Zusätzlich enthält der Puffer auch
Magnesiumionen, beispielsweise MgCl2 in einer Konzentration von 0,2 mM bis 10 mM,
bevorzugt 0,5 bis 2 mM, insbesondere 1 mM.
Die Temperatur beträgt beispielsweise von etwa 10°C bis 70°C, bevorzugt von 30°C
bis 60°C.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren organischen Lösungsmittel haben bevorzugt einen
logP von 0,6 bis 2,0, insbesondere von 0,6 bis 1,9, insbesondere bevorzugt von 0,63
bis 1,75. Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind beispielsweise Diethylether,
tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether, Dibutylether oder Essigsäureethylester,
insbesondere Essigsäureethylester. Essigsäureethylester kann beispielsweise in einer
Menge von 1% bis 90% bezogen auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes
eingesetzt werden, vorzugsweise von 15% bis 60%, insbesondere von 20% bis 50
%.
Das Verhältnis von organischen Lösungsmittel zu Wasser beträgt von 9 zu 1 bis 1 zu
9, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 1 zu 3.
Das Wasser bildet im erfindungsgemäßen Zwei-Phasen-System die eine flüssige
Phase und das organische Lösungsmittel bildet die zweite flüssige Phase.
Gegebenenfalls kann auch noch eine feste oder weitere flüssige Phase vorliegen, die
beispielsweise durch nicht vollständig gelöste Alkohol-Dehydrogenase oder durch die
Verbindung der Formel I entsteht. Bevorzugt sind jedoch zwei flüssige Phasen ohne
feste Phase. Die zwei flüssigen Phasen werden bevorzugt mechanisch gemischt, so
dass große Oberflächen zwischen den beiden flüssigen Phasen erzeugt werden.
Die Konzentration des Cofaktors NADPH oder NADH bezogen auf die wäßrige Phase
beträgt von 0,05 mM bis 0,25 mM, insbesondere von 0,06 mM bis 0,2 mM.
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren noch ein weiterer Stabilisator der
Alkohol-Dehydrogenase eingesetzt. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise
Glycerin, Sorbitol oder Dimethylsulfoxid (DMSO).
Die Menge an Glycerin beträgt von 5% bis 30% bezogen auf das Volumen des
gesamten Ansatzes. Bevorzugte Mengen an Glycerin sind von 10% bis 20%,
insbesondere 20%.
Zu Regenerierung des verbrauchten NADH oder NADPH kann im erfindungsgemäßen
Verfahren zusätzlich Isopropanol zugefügt werden. Beispielsweise wird das Isopropanol
und NADP mit der Alkohol-Dehydrogenase zu NADPH und Aceton umgesetzt. Die
eingesetzte Isopropanolmenge beträgt von 5% bis 30% bezogen auf das Volumen des
gesamten Ansatzes. Bevorzugte Mengen an Isopropanol sind von 10% bis 20%,
insbesondere 10%.
Geeignete Alkohol-Dehydrogenasen stammen beispielsweise aus Hefe, Pferdeleber
oder Rhodococcus erythropolis, wobei diese Enzyme als Coenzym NADH benötigen,
oder aus Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis,
wobei diese Enzyme als Coenzym NADPH benötigen.
Wird eine Alkohol-Dehydrogenasen beispielsweise aus Hefe, Pferdeleber,
Thermoanaerobium brockii oder Rhodococcus erythropolis im erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt, so wird aus der Verbindung der Formel I die entsprechende (S)-
Hydroxyverbindung gewonnen. Wird eine Alkohol-Dehydrogenasen beispielsweise aus
Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt, so wird aus der Verbindung der Formel I die entsprechende (R)-Hydroxy
verbindung gewonnen.
Die Alkohol-Dehydrogenase kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder
vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder in Zellen
enthaltend verwendet werden. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, per
meabilisiert oder lysiert vorliegen.
Die Volumenaktivität der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase beträgt von 100 Units/ml
(U/ml) bis 2000 U/ml, bevorzugt etwa 800 U/ml, bei einem Proteingehalt von etwa 20 mg/ml
bis 22 mg/ml. Die bevorzugt eingesetzte Alkohol-Dehydrogenase hat eine
spezifische Aktivität von etwa 35 bis 40 U/mg Protein. Je kg umzusetzender Verbindung
der Formel I werden 20 000 bis 200 000 U Alkohol-Dehydrogenase eingesetzt,
bevorzugt etwa 100 000 U. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge
die benötigt wird um 1 µmol der Verbindung der Formel I je Minute (min) umzusetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise in einem geschlossen
Reaktionsgefäß aus Glas oder Metall durchgeführt. Dazu werden die Komponenten
einzeln in das Reaktionsgefäß überführt und Rühren unter einer Atmosphäre von
beispielsweise Stickstoff oder Luft gerührt. Je nach Substrat und eingesetzter
Verbindung der Formel I beträgt die Reaktionszeit von 1 Tag bis 14 Tage, bevorzugt
4 bis 7 Tage.
Anschließend wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird die wäßrige Phase
abgetrennt, die Essigsäureethylester-Phase wird gefiltert. Die wäßrige Phase kann
gegebenenfalls noch einmal extrahiert werden und wie die Essigsäureethylester-Phase
weiter aufgearbeitet werden. Danach wird die gefilterte Phase unter vermindertem
Druck verdampft. Man erhält so beispielsweise das Produkt 4-Chlor-3-(S)-hydroxy
butansäureethylester mit einer Enantiomerenreinheit von mehr als 99,9% und im
wesentlichen frei vom Edukt 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester. Die Gesamtausbeute
der Prozesse beträgt nach Destillation des Produktes von 82% bis 88% bezogen auf
die eingesetzte Eduktmenge.
Überraschenderweise zeigen die organischen Lösungsmittel mit einem log-P-Wert von
0 bis 4 eine stabilisierende Wirkung auf die Alkohol-Dehydrogenase, während im Stand
der Technik von der Verwendung der Zwei-Phasen-Systeme mit organischen
Lösungsmittel abgeraten wird (M. R. Kula, U. Kragel; Kapitel 28, Dehydrogenases in
Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000;
Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and
Application, In: H. J. Rehm, G. Reed Biotechnology, Vol 3, Bioprocessing, VCH
Weinheim, 1993; J. Lynda et al., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis,
Biotechnol. Prog. 1991, 7, Seiten 116-124). Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als
organische Phase Essigsäureethylester verwendet, wobei die organische Phase zum
einen als Reservoir für die Verbindung der Formel I dient, aber auch gleichzeitig das
Reaktionsprodukt, die chirale Hydroxyverbindung aus der wäßrigen Phase extrahiert.
Im Gegensatz zum Stand der Technik führt der Einsatz von organischen
Lösungsmitteln mit einem log-P-Wert von 0 bis 3 zu einer zusätzlichen im Zeitverlauf
zunehmenden Stabilisierung der Alkohol-Dehydrogenase. Im Stand der Technik üben
insbesondere organische Lösungsmittel mit einem log-P-Wert (Logarithmus des
Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten) von 0 bis 2 eine besonders instabilisierende
Wirkung auf Enzyme aus und kommen somit als organische Phase im Zwei-Phasen-
System kaum in Betracht (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, 3rd edition
1997, Springer Verlag, Kapitel 3. Bis 3.17).
Die Erfindung betrifft ferner die Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor mit
hohem Temperaturoptimum. Die Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor hat
die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 4 gemäß des beiliegenden Sequenzprotokolls. Diese Alkohol-Dehydrogenase aus
Lactobacillus minor ist R-spezifisch, wobei beispielsweise aus einer Verbindung der
Formel I die entsprechende (R)-Hydroxyverbindung gewonnen werden kann. Die
enantioselektive Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor lässt sich
überraschenderweise in Escherichia coli RB 791 überexprimieren, während Alkohol-
Dehydrogenasen aus anderen Arten der Gattung Lactobacillus nur in wesentlich
geringerer Weise exprimiert werden konnten. Dies ist um so überraschender, da die
Alkohol-Dehydrogenase im Wildstamm von Lactobacillus minor selbst nur sehr gering
exprimiert wird und somit mit gängigen Screeningverfahren (Ganzzellbiotransformation,
Aktivitätstest) nicht nachweisbar war. Es war daher sehr überraschend, dass sich aus
Lactobacillus minor eine R-enantioselektive Alkohol-Dehydrogenase klonieren ließ und
in Escherichia coli so außerordentlich stark überexprimierbar war (50% des Zellproteins
des Klons, 20.000 Units/g Feuchtgewicht).
Das gereinigte Enzym aus Lactobacillus minor ist stabil in einem pH-Bereich von etwa
5,5 bis 8,5. Das Enzym ist bis etwa 40°C stabil und das pH-Optimum der
enzymatischen Reaktion liegt im Bereich von pH 7 bis pH 7,5. Das Temperaturoptimum
der enzymatischen Reaktion liegt bei etwa 55°C. das Enzym weist ein breites
Substratspektrum auf.
Das Enzym läßt sich mittels hydrophober Interaktionschromatographie bis zu einer
spezifischen Aktivität von 35 bis 40 U/mg Protein reinigen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung der Alkohol-Dehydrogenase
aus Lactobacillus minor. Dazu wird die DNA, die für die Alkohol-Dehydrogenase aus
Lactobacillus minor kodiert, in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen
Mikroorganismus exprimiert. Bevorzugt wird die Alkohol-Dehydrogenase aus
Lactobacillus minor in einen Escherichia coli Stamm transformiert und exprimiert,
insbesondere in Escherichia coli RB 791.
Die Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor läßt sich beispielsweise so
gewinnen, dass die rekombinanten Escherichia coli Zellen kultiviert werden, die
Expression der Alkohol-Dehydrogenase induziert wird und anschließend nach etwa 10
bis 18 Stunden (h) die Zellen durch Ultraschallbehandlung oder durch French-Press
(Gaullin, Siemens) aufgeschlossen werden. Der erhaltene Zellextrakt kann entweder
direkt verwendet werden oder weiter gereinigt werden. Dazu wird der Zellextrakt
beispielsweise zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird einer hydrophoben
Interaktionschromatographie unterworfen. Diese Chromatographie erfolgt bevorzugt bei
pH 7,0 in einem wässrigen Puffer der auch Magnesiumionen enthält.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung einer enantioselektiven (S)-
Hydroxyverbindung der Formel II
R1-C(OH)-R2 (II)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
- 1. Wasserstoffatom,
- 2. -(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
- 3. -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
- 4. -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
- 5. -(C6-C14)-Aryl,
- 6. -(C1-C8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl, oder
- 7. R1 und R2 bilden zusammen mit dem -C(O)-Rest ein -(C6-C14)-Aryl oder einen
-(C6-C14-Heterocyclus,
wobei die oben unter 1. bis 7. genannten Reste unsubstituiert sind oder ein- bis dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch- a) -OH,
- b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod,
- c) -NO2,
- d) -C(O)-O-(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
- e) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro,
dadurch gekennzeichnet, dass man
- a) ein racemisches Gemisch, enthaltend die Verbindung der Formel II, die erfindungsgemäße Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor und ein orga nisches Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel mit einem logP von 0,5 bis 4,0, beispielsweise aus der Reihe Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether oder Essigsäureethylester,
- b) in einem Zwei-Phasen-System inkubiert und
- c) die gebildete enantiomerenreine (S)-Hydroxyverbindung isoliert.
Die Reaktionsbedingungen sind im wesentlichen dieselben wie im obengenannten
Verfahren zur enantiospezifischen Reduktion der Ketoverbindung der Formel I. Im
Verfahren wird jedoch statt einer enantioselektiven Reduktion der Ketoverbindung der
Formel I, die ensprechende (R)-Hydroxyverbindung der Formel II zur entsprechenden
Ketoverbindung oxydiert. Ferner wird im Verfahren anstelle von Isopropanol Aceton zur
Regenerierung von NADP eingesetzt. Beispielsweise wird das Aceton und NADPH mit
der erfindungsgemäßen Alkohol-Dehydrogenase zu NADP und Isopropanol umgesetzt.
Die eingesetzte Acetonmenge beträgt von 5% bis 30% bezogen auf das Volumen des
gesamten Ansatzes. Bevorzugte Mengen an Aceton sind von 10% bis 20%,
insbesondere 10%.
Die erfindungsgemäße Alkohol-Dehydrogenase kann für die Herstellung der
Verbindung der Formel II entweder vollständig oder teilweise gereinigt vorliegen oder
kann auch enthaltend in Zellen im Verfahren eingesetzt werden. Die Zellen können
dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombinanter Klon von Escherichia coli RB
791, der die Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor exprimiert und am 26.
März 2001 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124
Braunschweig unter der Nummer DSM 14196 hinterlegt wurde.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:
Zum Screening wurden verschiedene Lactobacillenstämme in folgendem Medium
kultiviert (Angaben jeweils g/l,): Glucose (20), Hefeextrakt (5), Fleischextrakt (10), Di-
Ammoniumhydrogencitrat (2), Natriumacetat (5), Magnesiumsulfat (0,2), Mangansulfat
(0,05), Di-Kaliumhydrogenphosphat (2).
Das Medium wurde bei 121°C sterilisiert und die Stämme der Gattung Lactobacillus
(im folgenden mit L. abgekürzt) wurden ohne weitere pH-Regulierung oder
Sauerstoffzufuhr kultiviert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und für die
Ganzzellbiotransformation wurden jeweils 4 g Zellen in einem Endvolumen von 10 ml
Kaliumphosphatpuffer (KPi-Puffer) (50 mM, pH = 7.0) resuspendiert. Nach Zugabe von
je 0,1 g Glucose wurden die Zellen für 15 min bei 30°C geschüttelt.
Zur Zellsuspension wurde 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester 4 in einer
Endkonzentration von 40 mM zugegeben und nach jeweils 10 min und 120 min erfolgte
die gaschromatographische Analyse des Medium. Dazu wurden die Zellen
abzentrifugiert, der Überstand filtriert und in Chloroform bis zu einer Endkonzentration
von 10-15 µg/ml 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester verdünnt.
Der als Substrat eingesetzte 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester wurde von den
verschiedenen Lactobacillenstämmen mit folgender Enantiomerenreinheit zum Ethyl
(S)-4 chloro-3-hydroxybutyrat umgesetzt.
Der Enantiomerenüberschuß berechnet sich wie folgt: ee(%) = ((R-Alkohol - S-
Alkohol)/(R-Alkohol + S-Alkohol)) × 100.
Das Zellpellet aus etwa 2 ml Kulturflüssigkeit der Gattung Lactobacillus wurde in 300 µl
TE-Puffer (enthaltend 10 mM Tris/HCl, pH = 8, 1 mM EDTA) resuspendiert, mit 20 mg/ml
Lysozym versetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 100 µl
Natriumdodecylsulfat (SDS) (10%), 100 µl Na-Perchlorat (5 M) und 500 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zugegeben. Nach kräftigem Schütteln wurde das
Protein abzentrifugiert und die wäßrige Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
Danach wurden 800 µl Ethanol (EtOH) (96%) zugegeben. Das Eppendorfgefäß wurde
mehrfach invertiert und anschließend die ausgefallene chromosomale DNA in ein neues
Eppendorfgefäß überführt und mit 200 µl EtOH gewaschen. Die DNA wurde wiederum
in ein neues Eppendorfgefäß überführt, unter verminderten Druck getrocknet und in
100 µl TE-Puffer gelöst.
Die für die PCR verwendeten Primer wurden von der bekannten N-terminalen und C-
terminalen Sequenz der Alkohol-Dehydrogenase aus L. kefir abgeleitet. Dabei wurden
bekannte Präferenzen für bestimmte Codons in Lactobacillen berücksichtigt. So wurde
vor jeden 5'-Primer das Codon ATG (Met) als Startcodon vorgesetzt, weiterhin wurde
am 5'-Primer dem Startcodon die Schnittstelle für das Restriktionsenzym Bam HI
(GGATCC) vorangestellt um die spätere Klonierung in den Expressionsektor zu
ermöglichen. Hinter den 3'-Primer wurde das Stop codon (TAG) und die Schnittstelle
für Hind III (AAGCTT) gesetzt. Die Primerkonstrukte sind im folgenden aufgelistet
N = A,T,Coder G; Y = T oder C; R = A oder G
5'Primer
5'GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' (SEQ ID NO: 1)
3'Primer
5'GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (SEQ ID NO: 2)
Die Primer wurden nach bekannten Verfahren hergestellt.
Zyklus:
95°C 2 min. danach
80°C halten
heißer Start, danach
95°C 30 sec, danach
40°C 1 min 30×
danach jeweils 30 mal 95°C 30 sec, und 40°C 1 min. anschließend
72°C 2,5 min
danach
72°C 2,5 min
danach
10°C halten
95°C 2 min. danach
80°C halten
heißer Start, danach
95°C 30 sec, danach
40°C 1 min 30×
danach jeweils 30 mal 95°C 30 sec, und 40°C 1 min. anschließend
72°C 2,5 min
danach
72°C 2,5 min
danach
10°C halten
Für die Analytik wurden 10 µl des Ansatzes auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen
und bei konstant 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die PCR zeigte die deutliche
Amplifikation eines DNA-Stückes von etwa 750 bp.
Zur Gewinnung des PCR-Fragments wurde der gesamte PCR-Ansatz auf ein 1%iges
Agarosegel aufgetragen und bei konstant 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Dazu
wurde das Gel in zwei Spuren geteilt, wovon eine den kompletten PCR-Ansatz und die
andere nur eine Probe von 5 µl enthielt, so dass zum Ausschneiden des PCR-
Fragments aus dem Gel zur Orientierung nur die Spur mit der Probe mit
Ethidiumbromid angefärbt wurde um eine Schädigung des zu isolierenden PCR-
Fragment durch Ethidiumbromid und durch UV-Licht auszuschließen.
Die Isolierung aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit von der Firma
Qiagen aus Hilden.
Die Konzentrationsbestimmung ergab eine Gesamtkonzentration von 20 ng/µl DNA.
Zur Vorbereitung der Ligation wurden das gereinigte PCR-Fragment und der
verwendete Klonierungsvektor pQE30 oder pQE 70 beide von der Firma Quiagen mit
Bam HI und Hind III geschnitten (4 µl DNA = 200 ng DNA, 1 µl 10 × Puffer, 1 µl Enzym, BSA
und H2O (Biolabs, New England)).
Das geschnittene Plasmid wurde dann erneut mittels QIAquick Gel Extraction Kit
gereinigt, in Wasser aufgenommen mittels alkalischer Phosphatase dephosphoryliert
(USB, Amersham Life Science).
Zur Reinigung wurden die entsprechenden Reaktionsansätze erneut auf ein 1%iges
Agarosegel aufgetragen und so das verdaute Amplifikat sowie das Plasmid wie unter
D.) beschrieben aus dem Gel isoliert. Die Konzentration von Plasmid und Amplifikat
nach der Reinigung betrug etwa 20 ng/µl.
Zur Ligation wurden 3 µl pQE30 oder pQE 70 (60 ng), 2,5 µl Amplifikat (50 ng), 2 µl
Ligasepuffer (Boehringer; Mannheim), 1,5 µl H2O und 1 pl T4-Ligase (Boehringer;
Mannheim) eingesetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 16°C inkubiert.
Anschließend wurden 40 µl elektrokompetente Zellen von Escherichia coli RB791 mit
1,5 µl Ligationsansatz durch Elektroporation transformiert. Die Zellen wurden in 500 µl
SOC-Medium gegeben, 45 min bei 37°C inkubiert und anschließend je 250 µl auf
LBamp-Agarplatten ausplattiert. Das SOC-Medium enthält pro Liter Wasser 20 g Trypton,
5 g Hefe-Extrakt, 0,5 g NaCl, 10 ml von 1 M MgSO4 und 10 ml von 1 M MgCl2. LBamp-
Agarplatten enthalten pro Liter Wasser 10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 10 g NaCl, 20 g
Agar, pH 7,0 und 50 mg Ampicillin.
Gewachsene Kolonien wurden abgeimpft und in 4 ml Flüssigkultur (LBamp-Medium) über
Nacht bei 37°C kultiviert. Von dieser Zellsuspension wurden je 2 ml zur Plasmidpräpa
ration (entsprechend dem Quiagen miniprep Protokoll (Quiagen, Hilden)) eingesetzt.
Von der Plasmidpräparation wurden ein Restriktionsverdau mit Bam HI und Hind III
angesetzt. Der komplette Verdau wurde auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und
bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt (Nachweis des 750 kp Inserts) und die
Plasmide daraufhin gegebenenfalls zur Sequenzierung eingesetzt.
Klone mit 750 kp Insert wurden dann auf LBamp-Agarplatten ausplattiert.
Die Sequenzierung wurde mittels dem SequiThermEXCEL II Long-Read DNA
Sequencing Kit (Biozym, Oldendorf) am Li-Cor-Sequenzer (MWG Biotech, Ebersberg)
entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Als Primer wurden die
Standard Sequenzierungsprimer für pQE-Vektoren benutzt.
Klone mit Inserts von 750 kp wurden hinsichtlich enzymatischer Aktivität und
Stereoselektivität untersucht. Dazu wurden die Kolonien von den LBamp-Agarplatten
abgeimpft und in 20 ml Flüssigkulturen (LBamp-Medium) bei 25°C kultiviert. Bei einer
Zelldichte (OD500) von 0,5 erfolgte dann die Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D
thiogalactopyranosid (IPTG). Nach 18 h wurden die Zellen abzentrifugiert und je 40 mg
Zellen in 350 µl Kpi-Puffer (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl2) aufgenommen. Die Enzym
freisetzung aus den Zellen wurde durch Naßvermahlung mit Hilfe von Glasperlen (0,5 g,
0,3 mm) erreicht. Dazu erfolgte ein 20 minütlicher Aufschluß mittels Retsch-Mühle
bei 4°C.
Der Enzymtest enthielt 870 µl Triethanolaminpuffer (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2),
100 µl einer 100mmolaren Lösung 4-Cl-Acetessigsäureethylester, 10 µl NADPH (End
konzentration 0,19 mM) und 20 µl Enzymlösung.
Die Definition der Enzymeinheit: 1 U entspricht der Enzymmenge die benötigt wird um
1 µmol Substrat (4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester) pro 1 min umzusetzen.
Zum Nachweis der Stereoselektivität wurden 480 µl Triethanolaminpuffer (100 mM,
pH = 7,0, 1 mM MgCl2) mit 1,0 mM 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester, 1,9 mM NADPH
(jeweils Endkonzentration) und 20 µl Enzymlösung inkubiert. Nach 15 min Inkubation
wurde der Reaktionsansatz filtriert und 1 : 10 in Chloroform verdünnt und eine Probe
wurde mittels GC-MS analysiert.
Bedingungen der Gaschromatographie (GC):
chirale Säule: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel)
chirale Säule: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel)
- 1. 2 min 60°C
- 2. in 28 min von 60°C auf 130°C mit einer Rate von 2,5°C pro Minute
- 3. 15 min bei 130°C
Aus den folgenden Lactobacillenstämmen konnte eine (R)-spezifische Alkohol-
Dehydogenase kloniert und aktiv überexprimiert werden:
Der Stamm mit der höchsten enzymatischen Aktivität wurde zur Enzymgewinnung im
Fermenter (Fed batch, 10 l) kultiviert. Die Induktion erfolgte bei einer OD500 von 40 mit
1 mM IPTG. Nach 18 h erfolgte die Zellernte wobei 300 g Zellen in 3 l Kpi-Puffer (50 mM,
pH = 7, 1 mM MgCl2) aufgenommen wurden, anschließend erfolgte der Zellaufschluß
mittels French-Press (Gaullin, Siemens). Der nach Zentrifugation erhaltene Überstand
wird im folgenden als Rohextrakt bezeichnet und wies eine Volumenaktivität von etwa
2000 U/ml (20 000 U/g Feuchtmasse) auf.
Für die Enzymcharakterisierung wurde ein Teil des erhaltenen Enzyms mittels
hydrophober Interaktionschromatographie auf Q-Sepharose ff (fast flow) gereinigt. Die
verwendete Säule wurde dazu mit 50 mM Kpi-Puffer pH = 7.0, 1 mM MgCl2 äquilibriert.
Nach Auftragen des Rohextrakts auf die Säule und kurzem Spülen mit dem
Äquilibrierungspuffer wurde das Enzym mit einem steigenden linearem Salzgradienten
(0-1 M NaCl, 1 ml/min) bei einer Salzkonzentration von etwa 0,3 M NaCl eluiert. Nach
Vereinigen der enzymhaltigen Fraktionen erhielt man etwa 25 ml des gereinigten
Enzyms mit einer Volumenaktivität von etwa 800 U/ml und einem Proteingehalt von 20
bis 22 mg/ml. Das so gereinigte Enzym hat also eine spezifische Aktivität von etwa 35
bis 40 U/mg Protein.
Alle enzymatischen Aktivitäten wurden bei 25°C bestimmt. Die Enzymaktivität wurde
wie folgt berechnet:
Berechnung: 1 Unit = 1 µmol Substratumsatz/min
Lambert-Beersches Gesetz
Berechnung: 1 Unit = 1 µmol Substratumsatz/min
Lambert-Beersches Gesetz
Abnahme des NADPH wurde bei 340 nm verfolgt (siehe enzymatischer
Testansatz) = ΔE/min
N = Verdünnungsfaktor Enzym
V = Volumen Enzym im ml (0,01)
Vküvette = Küvettenvolumen = 1 ml
d = Schichtdicke der Küvette = 1 cm
eNADPH = Extinktionskoeffizient NADPH = 6,22[mM-1.cm-1]
N = Verdünnungsfaktor Enzym
V = Volumen Enzym im ml (0,01)
Vküvette = Küvettenvolumen = 1 ml
d = Schichtdicke der Küvette = 1 cm
eNADPH = Extinktionskoeffizient NADPH = 6,22[mM-1.cm-1]
Aktivität = (ΔE/min.N.Vküvette)/(eNADPH.V.d)
Proteinbestimmung wurde nach Bradford angewandt (Bio-Rad- Laboratories GmbH,
Protein Assay)
Für die enzymkatalysierte Synthese von Ethyl (S)-4 chloro-3-hydroxybutyrat aus 4-
Chlor-3-oxo- butansäureethylester wurde der in Beispiel 2 gewonnene Rohextrakt der
Alkohol-Dehydrogenase und das Coenzym NADP eingesetzt. Das oxidierte Coenzym
wurde durch gleichzeitige Anwesenheit von Isopropanol kontinuierlich regeneriert, so
dass die Reaktion nur katalytische Mengen an Coenzym erfordert.
Der Ansatz enthielt:
2 l Triethanolamin- Puffer 100 mM pH = 7.0, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin,
400 mg NADP,
600 ml Isopropanol,
800 ml Essigsäureethylester,
600 ml 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester und
etwa 100 000 Units Alkohol-Dehydrogenase.
2 l Triethanolamin- Puffer 100 mM pH = 7.0, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin,
400 mg NADP,
600 ml Isopropanol,
800 ml Essigsäureethylester,
600 ml 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester und
etwa 100 000 Units Alkohol-Dehydrogenase.
Nach 3 Tagen Rühren bei Raumtemperatur konnte gaschromatographisch der
vollständige Umsatz des 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester zum Ethyl (S)-4 chloro-3-
hydroxybutyrat mit über 99,9% Enantiomerenreinheit nachgewiesen werden.
Nach Abtrennung der wässrigen Phase, Abdampfen des Lösungsmittels und gege
benenfalls Destillation erhält man das saubere Ethyl (S)-4 chloro-3-hydroxybutyrat mit
über 99,9%iger Enantiomerenreinheit.
Der Reaktionsansatz zum Umsatz von 10 l 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester ist
wie folgt zusammengesetzt;:
18 l Triethanolamin-Puffer 100 mM pH = 7.0, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin,
4 g NADP,
10 l Isopropanol,
10 l Essigsäureethylester,
10 l 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester und
etwa 2 Millionen Units Alkohol-Dehydrogenase (1,251 Rohextrakt).
18 l Triethanolamin-Puffer 100 mM pH = 7.0, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin,
4 g NADP,
10 l Isopropanol,
10 l Essigsäureethylester,
10 l 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester und
etwa 2 Millionen Units Alkohol-Dehydrogenase (1,251 Rohextrakt).
Nach 7 Tagen Rühren bei Raumtemperatur konnte gaschromatographisch der
vollständige Umsatz des 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylesters zum Ethyl (S)-4 chloro-3-
hydroxybutyrat mit über 99,9% Enantiomerenreinheit nachgewiesen werden.
Die Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms bei Lagerung in Puffern mit verschiedenen
pH-Werten wurde im Bereich von pH 4 bis 11 untersucht. Dazu wurden verschiedene
Puffer (50 mM) im Bereich von pH 4 bis 11 angesetzt und das in Beispiel 2 gereinigte
Enzym darin 1 : 100 verdünnt und 30 min inkubiert. Alle Puffer enthielten 1 mM MgCl2.
Anschließend wurden davon 10 µl im normalen Enzymtest eingesetzt (Triethanol
aminpuffer 100 mM pH = 7.0, 1 mM MgCl2, 10 mM
4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester und 0,19 mM NADPH). Die Reaktion wurde für
1 min bei 30°C und 340 nm verfolgt.
Ausgangswert ist dabei der Messwert, den man unmittelbar nach Verdünnung des
Enzyms in Triethanolaminpuffer 50 mM pH = 7.0 erhält. Dieser Wert entsprach unter
vorgegeben Bedingungen einer Extinktionsänderung von 0,20/min und wurde als
100%-Wert gesetzt und alle folgenden Messwerte wurden zu diesem Wert ins
Verhältnis gesetzt.
Tabelle 2 zeigt, dass das Enzym eine gute pH-Stabilität insbesondere im sauren
Bereich aufweist, dabei scheint die Enzymstabilität nicht nur vom pH-Wert, sondern
auch vom verwendeten Puffersystem abhängig zu sein. Beispielsweise stellt man bei
der Verwendung von TRIS und MES-Puffer bei gleichem pH-Wert eine stärkere
Inaktivierung des Enzyms fest als im KPi-Puffer.
Im KPi-Puffer zeigte sich im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 keine signifikante Inaktivierung.
In analoger Weise wie unter A.) beschrieben wurde die Temperaturstabilität für den
Bereich von 25°C bis 50°C bestimmt. Dazu wurde jeweils eine 1 : 100 Verdünnung des
gereinigten Enzyms für 30 min bei der jeweiligen Temperatur inkubiert und
anschließend bei 30°C mit dem obigen Testansatz gemessen. Auch hier wurde als
Ausgangswert der Meßwert herangezogen, den man unmittelbar nach Verdünnung des
Enzyms in Triethanolaminpuffer 50 mM pH = 7.0 erhält. Dieser Wert wurde auch hier
als 100%-Wert gesetzt. Die Alkohol-Dehydrogenase aus L. minor ist bis zu einer
Temperatur von 40°C stabil. Danach sinkt die Aktivität rapide ab.
Zur Bestimmung des pH-Optimums wurde die enzymatische Reaktion in dem jeweiligen
in Tabelle 3 aufgeführten Puffer bestimmt. Die Konzentration des 4-Chlor-3-oxo-
butansäureethylester betrug wie im Standardtest 10 mM und von NADPH 0,19 mM. Die
Reaktion wurde bei 30°C bestimmt. Dabei konnte für das erfindungsgemäße Enzym
ein pH-Optimum zwischen 7 und 7,5 ermittelt werden.
Zur Bestimmung der optimalen Testtemperatur wurde die Enzymaktivität von 25°C bis
60°C gemessen. Der Testansatz entsprach der Standardkonzentration von 4-Chlor-3-
oxo-butansäureethylester und NADPH. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich hat das Enzym
seine optimale Testtemperatur bei 55°C, anschließend sinkt die Aktivität rapide ab.
Ferner wurden anstelle von 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester noch weitere Substrate
in dem enzymatischen Testansatz eingesetzt. Dafür wurde folgender Testansatz
verwendet:
970 µl Triethanolaminpuffer (100 mM, pH = 7.0, 1 mM MgCl2 mit 10 mM Ketoverbindung)
20 µl NADPH (0,19 mM im Testansatz)
10 µl Enzym (1 : 100)
970 µl Triethanolaminpuffer (100 mM, pH = 7.0, 1 mM MgCl2 mit 10 mM Ketoverbindung)
20 µl NADPH (0,19 mM im Testansatz)
10 µl Enzym (1 : 100)
Dabei wurde die mit 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester ermittelte Aktivität 100%
gesetzt und die Enzymaktivitäten der anderen Substrate zu diesem Wert ins Verhältnis
gesetzt.
Zur Untersuchung der Enzymstabilität bei Kontakt mit organischen Lösungsmitteln
wurde die Alkohol-Dehydrogenase aus L. minor in den angegebenen Löungsmittel
gemischen 1 : 100 verdünnt und bei Raumtemperatur inkubiert (bei nicht-wasser
mischbaren organischen Lösungsmitteln bezieht sich die Verdünnung auf die wäßrige
Phase). Dabei wurde eine ständige Durchmischung beider Phasen gewährleistet
(Shaker, 200 rpm). Anschließend wurden 10 µl der Enzymlösung im Standardtestansatz
eingesetzt. Auch hier wurde der Ausgangswert nach Verdünnung im Puffer
(Triethanolaminpuffer 100 mM, pH = 7.0, 1 mM MgCl2) gleich 100% gesetzt und alle
weiteren Werte zu diesem ins Verhältnis gesetzt.
Wie aus Tabelle 7A ersichtlich wirken Glyzerin, DMSO und Sorbitol aktivierend bzw.
stabilisierend auf die eingesetzte Alkoholdehydrogenase. Das im Prozess einzu
setzende Isopropanol hingegen wirkt inaktivierend.
Wie aus Tabelle 7B ersichtlich zeigt die untersuchte Alkoholdehydrogenase in einer
breiten Zahl organischer Lösungsmittel eine beachtliche Stabilität. Auffallend ist dabei,
dass Lösungsmittel mit logP-Werten zwischen 0 und 3 die untersuchte Alkohol
dehydrogenase nicht stärker inhibieren als solche mit logP-Werten zwischen 3 und 4, 5,
insbesondere im Hinblick auf längere Inkubationszeiten (24 h und 48 h) haben
Lösungsmittel mit logP-Werten zwischen 0 und 3 stabilisierende Wirkung auf die
untersuchte ADH, verglichen mit den entsprechenden Werten im Puffer. Die
untersuchten aliphatischen Lösungsmittel Pentan, Hexan, Heptan und Octan zeigen
diese stabilisierende Wirkung bei Langzeitinkubation nicht.
Der logP-Wert einer KomponenteX ist der Logarithmus des Verteilungskoeffizient
von X im Octanol/Wasser Zweiphasensystem (50/50)
P = Konzentration von X in Octanolphase/Konzentration von X in wäßriger Phase
P = Konzentration von X in Octanolphase/Konzentration von X in wäßriger Phase
Zur Untersuchung der Enzymstabilität unter Prozessbedingungen wurde die Alkohol-
Dehydrogenase aus L. minor mit den im Zwei-Phasen-System verwendeten Löungs
mittelgemischen 1 : 100 verdünnt und bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurden 10 µl der Enzymlösung im Standardtestansatz eingesetzt.
In Tabelle 8 sind die Enzymaktivitäten in % vom Ausgangswert dargestellt.
Es wurde festgestellt, dass die rekombinate Alkohol-Dehydrogenase aus L. minor in
der im Zwei-Phasen-System verwendeten Kombination von Lösungsmitteln mehrere
Tage stabil und aktiv ist.
Claims (24)
1. Verfahren zur enantioselektiven Reduktion einer Ketoverbindung der Formel I
R1-C(O)-R2 (I)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
R1-C(O)-R2 (I)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
- 1. Wasserstoffatom,
- 2. -(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
- 3. -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und gege benenfalls ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
- 4. -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gege benenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
- 5. -(C6-C14)-Aryl,
- 6. -(C1-C8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl, oder
- 7. R1 und R2 bilden zusammen mit dem -C(O)-Rest ein -(C6-C14)-Aryl oder einen
-(C5-C14)-Heterocyclus,
wobei die oben unter 1. bis 7. genannten Reste unsubstituiert sind oder ein- bis dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch- a) -OH,
- b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod,
- c) -NO2,
- d) -C(O)-O-(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
- e) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro,
- a) die Verbindung der Formel I, Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor und ein organisches Lösungsmittel mit einem logP von 0,5 bis 4,0,
- b) in einem Zwei-Phasen-System inkubiert und
- c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung
der Formel I aus der Reihe 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester, Acetophenon,
Acetessigsäuremethylester, Ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat, 2,5-Hexandion,
Ethylpyruvat oder 2-Octanon eingesetzt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein
organisches Lösungsmittel mit einem logP von 0,6 bis 3,0, insbesondere von 0,6
bis 1,9, eingesetzt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein organisches
Lösungsmittel mit einem logP von 0,63 bis 1,75 eingesetzt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches
Lösungsmittel Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether oder
Essigsäureethylester eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, dass eine Alkohol-Dehydrogenasen aus Hefe, Pferdeleber,
Thermoanaerobium brockii, Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus kefir,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor oder eine Alkohol-Dehydrogenase mit
der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 eingesetzt wird.
7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Puffer wie Kaliumphosphat-, Tris/HCl- oder
Triethanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, bevorzugt mit einem pH-
Wert von 6 bis 9, zugesetzt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass dem Puffer
Magnesiumionen wie MgCl2, in einer Konzentration von 0,2 mM bis 10 mM,
bevorzugt 0,5 mM bis 2 mM, zugesetzt werden.
9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, dass als Cofaktor NADPH oder NADH in einer Menge von 0,05 mM
bis 0,25 mM, insbesondere von 0,06 mM bis 0,2 mM, bezogen auf die
wäßrige Phase, zugesetzt wird.
10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, dass als Stabilisator für die Alkohol-Dehydrogenase Glycerin,
Sorbitol oder Dimethylsulfoxid zugefügt wird.
11. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass Isopropanol zugefügt wird.
12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass die Verbindungen der Formel I in einer Menge von 2%
bis 30% bezogen auf das Gesamtvolumen, bevorzugt von 10% bis 25%,
insbesondere von 15% bis 22%, eingesetzt wird.
13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 10°C bis
70°C, bevorzugt von 30°C bis 60°C, durchgeführt wird.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel in einer Menge von 1% bis
90% bezogen auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes, vorzugsweise
von 15% bis 60%, insbesondere von 20% bis 50% eingesetzt werden.
15. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, dass das Verhältnis von organischen Lösungsmittel zu Wasser
von 9 zu 1 bis 1 zu 9, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 1 zu 3, beträgt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator
in einer Menge von 5% bis 30% bezogen auf das Volumen des gesamten
Reaktionsansatzes, bevorzugte von 10% bis 20%, insbesondere 20%,
eingesetzt wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Isopropanol in
einer Menge von 5% bis 30% bezogen auf das Volumen des gesamten
Reaktionsansatzes, bevorzugte von 10% bis 20%, insbesondere 10%,
eingesetzt wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkohol-
Dehydrogenase in einer Menge von 20 000 U bis 200 000 U pro kg
umzusetzender Verbindung der Formel I, bevorzugt etwa 100 000 U, eingesetzt
wird.
19. Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor mit der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID NO: 4.
20. DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3.
21. Mutierte Escherichia coli Zelle hinterlegt unter DSM 14196.
22. Verfahren zur Gewinnung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor
gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man die DNA, die für die
Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus minor kodiert, in einem geeigneten
prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismus exprimiert, insbesondere
in Zellen von Escherichia coli Zelle hinterlegt unter DSM 14196 exprimiert, und
gegebenenfalls die Alkohol-Dehydrogenase reinigt.
23. Verfahren zur Gewinnung einer enantioselektiven (S)-Hydroxyverbindung der
Formel II
R1-C(OH)-R2 (II)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
R1-C(OH)-R2 (II)
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander gleich oder verschieden sind und für
- 1. Wasserstoffatom,
- 2. -(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
- 3. -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
- 4. -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
- 5. -(C6-C14)-Aryl,
- 6. -(C1-C8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl, oder
- 7. R1 und R2 bilden zusammen mit dem -C(O)-Rest ein -(C6-C14)-Aryl oder
einen -(C6-C14)-Heterocyclus,
wobei die oben unter 1. bis 7. genannten Reste unsubstituiert sind oder ein- bis dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch- a) -OH,
- b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod,
- c) -NO2,
- d) -C(O)-O-(C1-C20)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
- e) -(C6-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro,
- a) ein racemisches Gemisch, enthaltend die Verbindung der Formel II, die erfindungsgemäße Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor und ein organisches Lösungsmittel mit einem logP von 0,5 bis 4,0, beispielsweise aus der Reihe Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether oder Essigsäureethylester,
- b) in einem Zwei-Phasen-System inkubiert und
- c) die gebildete enantiomerenreine (S)-Hydroxyverbindung isoliert.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Aceton zugefügt
wird.
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