DE10113011A1 - Fermentative production of L-amino acids, useful especially in animal nutrition, by fermenting Coryneform bacteria in which fructose-bisphosphate aldolase gene in weakened - Google Patents

Fermentative production of L-amino acids, useful especially in animal nutrition, by fermenting Coryneform bacteria in which fructose-bisphosphate aldolase gene in weakened

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gene coding
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Abstract

Fermentative production of L-amino acids (I), particularly lysine, comprises: (i) growing a (I)-producing coryneform bacterium in which the activity of the fructose-bisphosphate aldolase (fda) gene is reduced; (ii) accumulating (I) in medium or cells and (iii) isolating (I), optionally with at least some of the components of the broth and/or the biomass remaining in the final product. An Independent claim is also included for Coryneform bacteria in which activity of at least the fda gene is weakened.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das fda-Gen, das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodiert, abgeschwächt ist.The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine, using coryneform bacteria in which the fda gene, which is responsible for the fructose bisphosphate aldolase encoded, weakened.

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, especially L-lysine, can be found in the Human medicine and in the pharmaceutical industry, in the Food industry and especially in the Animal nutrition application.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known that amino acids can be fermented by Strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum can be produced. Because of the great importance is constantly attached to the improvement of Manufacturing process worked. process improvements can take fermentation measures such as Stirring and supplying oxygen, or the Composition of the nutrient media such as the Sugar concentration during fermentation, or the Refurbishment to the product form by, for example Ion exchange chromatography or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren. To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. This way you get Strains resistant to antimetabolites such as the lysine analogue S- (2-aminoethyl) cysteine or auxotroph for regulatory-important metabolites and L- Produce amino acids.  

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosäure-Produktion untersucht.Methods of recombinant DNA technology for strain improvement L- Amino acid producing strains of Corynebacterium glutamicum by using individual amino acid Amplified biosynthesis genes and the effect on the L- Amino acid production examined.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.The inventors set themselves the task of creating new ones Basics for improved fermentative processes Production of L-amino acids, in particular L-lysine, with to provide coryneform bacteria.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.If L-amino acids or amino acids are mentioned below, are one or more amino acids included their salts, selected from the group L-asparagine, L- Threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L- Cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L- Tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine meant. L-lysine is particularly preferred.

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.If L-lysine or lysine are mentioned below not only the bases, but also the salts like z. B. lysine monohydrochloride or lysine sulfate.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Nukleotidsequenz (fda-Gen) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, under Use of coryneform bacteria in which one at least that for the fructose bisphosphate aldolase weakens coding nucleotide sequence (fda gene), particularly turns off or at a low level expressed.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren in dem folgende Schritte durchführt werden:
This invention furthermore relates to a process for the fermentative production of L-amino acids in which the following steps are carried out:

  • a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;a) Fermentation of the L-amino acid producing coryneform bacteria in which at least those for the Fructose bisphosphate encoding aldolase Nucleotide sequence attenuated, in particular turned off or at a low level is expressed;
  • b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; undb) Enrichment of the L-amino acids in the medium or in the Cells of the bacteria; and
  • c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen im Endprodukt vrebleiben.c) isolation of the desired L-amino acids, where optionally components of the fermentation broth and / or the biomass in parts or their Total quantities remain in the end product.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des fda-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.The strains used preferably pre-produce the attenuation of the fda gene L-amino acids, in particular L-lysine.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.Preferred embodiments can be found in the claims.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "weakening" describes in this Context the reduction or elimination of intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism caused by the corresponding DNA can be encoded, for example by uses a weak promoter or a gene or allele used that with a corresponding enzyme low activity encoded or the corresponding gene or Enzyme (protein) inactivated and possibly this Combined measures.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.The microorganisms that are the subject of the present Invention, amino acids can be derived from glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerin and ethanol. It can be Representative of coryneform bacteria, in particular of the genus Act Corynebacterium. In the genus Corynebacterium is especially the species Corynebacterium glutamicum too  name that is known in the professional world for its ability To produce L-amino acids.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, are in particular the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
and mutants or strains produced therefrom which produce L-amino acids
such as the L-lysine producing strains
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 and
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des fda-Gens in verbesserter Weise L- Aminosäuren produzieren.It has been found that coryneform bacteria after Attenuation of the fda gene in an improved manner L- Produce amino acids.

Die Nukleotidsequenz des fda-Gens von Corynebacterium glutamicum wurde von Sinskey (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625-­ 1637 (1989)) publiziert kann ebenfalls der Genbank unter der Accession Number X17313 entnommen werden.The nucleotide sequence of the Corynebacterium fda gene glutamicum was described by Sinskey (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625- 1637 (1989)) can also be published at the Genbank can be found in Accession Number X17313.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Fruktose-Bisphosphat Aldolase verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.The sequences described in the specified passages coding for the fructose bisphosphate aldolase can  can be used according to the invention. Furthermore, alleles of fructose bisphosphate aldolase can be used derive from the degeneracy of the genetic code or through function-neutral sense mutations result.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des fda-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.To achieve a weakening, either Expression of the fda gene or the catalytic Properties of the gene products reduced or turned off. If necessary, both measures combined.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).The gene expression can by appropriate culture or through genetic modification (mutation) of the Signal structures of gene expression can be reduced. Signal structures of gene expression are, for example Repressor genes, activator genes, operators, promoters, Attenuators, ribosome binding sites, the start codon and Terminators. The person skilled in the art finds z. B. in patent application WO 96/15246, to Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), by Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or that of Winnacker ("Gene and clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations that lead to a change or reduction in the lead catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art; as examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("Die Threonindehydratase aus  Corynebacterium glutamicum: cancellation of allosteric Regulation and structure of the enzyme ", reports of the Research Center Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Summary presentations can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. that of Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) become.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Transitions, transversions, Insertions and deletions are considered. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is caused by false sense mutations ("missense mutations ") or nonsense mutations" spoken. Insertions or deletions of at least a base pair in a gene lead to Frame shift mutations, in the result of which incorrect amino acids are incorporated or the Translation terminates prematurely. Deletions of several Codons typically lead to a complete one Loss of enzyme activity. Generation Instructions such mutations belong to the prior art and can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Gene and Clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").A common way to get genes from C. glutamicum mutate is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) described method of gene disruption ("gene disruption") and gene exchange ("gene replacement ").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.The method of gene disruption becomes a central one Part of the coding region of the gene of interest into one  Plasmid vector cloned into a host (typically E. coli), but not in C. glutamicum. As Vectors come, for example, pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; U.S. Patent 5,487,993), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) or pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in question. The plasmid vector that contains central part of the coding region of the gene then by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum transferred. The method the conjugation is described, for example, in Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) described. Methods of transformation are for example in Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). After homologous recombination using a "cross-over" - Event becomes the coding region of the gene in question interrupted by the vector sequence and you get two incomplete alleles to which the 3'- or 5'- The end is missing. This method was developed by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) for switching off the recA gene from C. glutamicum used.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.In the method of gene exchange a mutation such as B. a deletion, insertion or Base exchange in the gene of interest in vitro manufactured. The allele produced is in turn transformed into one cloned for C. glutamicum non-replicative vector and  this then by transformation or conjugation transferred to the desired host by C. glutamicum. To homologous recombination using a first, integration causing "cross-over" event and a suitable one second, excision-causing "cross-over" event in the target gene or in the target sequence you achieve the incorporation the mutation or the allele. This method was for example by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) used the C. pyc gene of C. switch off glutamicum by deletion.

In das fda-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.In this way, a deletion, Insertion or a base exchange can be installed.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des fda-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.It can also be used for the production of L-amino acids be beneficial in addition to attenuating the fda gene one or more enzymes of the respective biosynthetic pathway, glycolysis, anaplerotic, the citric acid cycle, of the pentose phosphate cycle, amino acid export and if necessary to strengthen regulatory proteins, especially overexpress.

Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "reinforcement" or "reinforcement" describes in in this context the increase in intracellular Activity of one or more enzymes or proteins in one Microorganism encoded by the corresponding DNA by, for example, the copy number of the gene or the genes increased, a strong promoter or a gene used that for a corresponding enzyme or protein encoded with a high activity and possibly this Combined measures.

So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der Abschwächung des fda-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
Thus, in addition to the attenuation of the fda gene, one or more of the genes selected from the group can be used for the production of L-lysine

  • - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),- for a feed-back resistant aspartate kinase coding gene lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),- The gene coding for the dihydrodipicolinate synthase dapA (EP-B 0 197 335),
  • - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- That for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase encoding gene gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
  • - gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),- At the same time that coding for the pyruvate carboxylase Gene pyc (DE-A-198 31 609),
  • - das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),- the gene coding for malate: quinone oxidoreductase mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
  • - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),- The coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase Gene twelve (JP-A-09224661),
  • - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),- at the same time the gene lysE coding for the export of lysine (DE-A-195 48 222),
  • - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115)The gene coding for the Zwa1 protein zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115)
  • - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und- The gene tpi coding for the triose phosphate isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), and
  • - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- The gene coding for the 3-phosphoglycerate kinase pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, especially overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des fda-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
Furthermore, it can be advantageous for the production of amino acids, in particular L-lysine, in addition to the attenuation of the fda gene, at the same time one or more of the genes selected from the group

  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),- The coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
  • - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),- The gene coding for glucose-6-phosphate isomerase pgi (US 09 / 396,478, DSM 12969),
  • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7, DSM 13114),- The poxB gene coding for pyruvate oxidase (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
  • - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113)The gene coding for the Zwa2 protein zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.attenuate, especially to decrease expression.

Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des fda-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).Finally, it can be used for the production of amino acids, may be beneficial in addition to attenuating the fda gene to eliminate undesirable side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. The microorganisms produced according to the invention are also subject of the invention and can continuously or discontinuously in a batch process (Set cultivation) or in fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) cultivated for the production of L-amino acids become. A summary of known ones Cultivation methods is in Chmiel's textbook (Bioprocess engineering 1. Introduction to Bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).  

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.The culture medium to be used must be in a suitable manner The requirements of the respective tribes meet. descriptions of culture media of various microorganisms are in "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Sugar and carbohydrates such as z. B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, Molasses, starch and cellulose, oils and fats such as B. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such as B. Glycerin and ethanol and organic Acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Organic nitrogenous substances can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must also contain salts of metals such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, for the Growth are necessary. After all, essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition to above substances are used. The culture medium Suitable precursors can also be added. The The feedstocks mentioned can be used for culture in the form of a one-off approach or appropriately to be fed during cultivation.  

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff­ haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. to Antifoam agents such as z. B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics are added. To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 20 ° C to 45 ° C and preferably at 25 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of desired product. That goal will usually within 10 hours to 160 hours reached.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.Methods for the determination of L-amino acids are from the State of the art known. The analysis can be done as with Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin derivatization, or they can be done by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) described.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention is described below with reference to Exemplary embodiments explained in more detail.

Claims (9)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt,
  • a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das fda-Gen abschwächt;
  • b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
  • c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen im Endprodukt vrebleiben.
1. A process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine, characterized in that the following steps are carried out,
  • a) fermentation of the coryneform bacteria producing the desired L-amino acid, in which at least the fda gene is weakened;
  • b) enrichment of the desired product in the medium or in the cells of the bacteria, and
  • c) isolation of the desired L-amino acids, components of the fermentation broth and / or the biomass optionally remaining in parts or their total amounts in the end product.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L- Aminosäure verstärkt.2. The method according to claim 1, characterized, that you use bacteria in which you additionally further genes of the biosynthetic pathway of the desired L- Amino acid enhanced. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.3. The method according to claim 1, characterized, that you use bacteria in which the Metabolic pathways at least partially switched off which are the formation of the desired L-amino acid reduce. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotides(e), das (die) für das fda-Gen kodiert, verringert. 4. The method according to claim 1, characterized, that the expression of the polynucleotide (s), encoding the fda gene.   5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) verringert, für das das Polynukleotid fda kodiert.5. The method according to claim 1, characterized, that the catalytic properties of the Polypeptide (enzyme protein) for which the Polynucleotide encoded fda. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  • 1. 6.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
  • 2. 6.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
  • 3. 6.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
  • 4. 6.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
  • 5. 6.5 das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
  • 6. 6.6 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
  • 7. 6.7 gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
  • 8. 6.8 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1
  • 9. 6.9 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, und
  • 10. 6.10 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
verstärkt, insbesondere überexprimiert.6. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-lysine coryneform microorganisms are fermented, in which one simultaneously one or more of the genes selected from the group
  • 1. 6.1 the gene lysC coding for a feedback-resistant aspartate kinase,
  • 2. 6.2 the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase,
  • 3. 6.3 the gene gap coding for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
  • 4. 6.4 the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase,
  • 5. 6.5 the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase,
  • 6. 6.6 the gene coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase zwf,
  • 7. 6.7 at the same time the lysE gene coding for lysine export,
  • 8. 6.8 the gene coding for the Zwa1 protein
  • 9. 6.9 the gene coding for the triose phosphate isomerase tpi, and
  • 10. 6.10 the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase,
amplified, especially overexpressed. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  • 1. 7.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
  • 2. 7.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen
  • 3. 7.3. das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB, oder
  • 4. 7.4. das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2
abschwächt.7. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-amino acids coryneform microorganisms are fermented, in which one simultaneously one or more of the genes selected from the group
  • 1. 7.1 the pck gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase,
  • 2. 7.2 the pgi gene coding for the glucose-6-phosphate isomerase
  • 3. 7.3. the gene poxB coding for the pyruvate oxidase, or
  • 4. 7.4. the gene coding for the Zwa2 protein, zwa2
weakens. 8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.8. The method according to one or more of the preceding Claims, characterized, that microorganisms of the species Corynebacterium glutamicum. 9. Coryneforme Bakterien, in denen zumindest das fda-Gen in abgeschwächter Form vorliegt.9. Coryneform bacteria in which at least the fda gene is in a weakened form.
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