DE10112102A1 - Process for the fermentative production of D-pantothenic acid and / or its salts - Google Patents

Abstract

The invention provides a process for the preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof or feedstuffs additives comprising these, by fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in particular those which already produce D-pantothenic acid, wherein the nucleotide sequence(s) in the microorganisms which code(s) for the poxB gene is (are) attenuated, in particular eliminated.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Microorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens das poxB-Gen abgeschwächt wird.This invention relates to a method of fermentative Production of D-pantothenic acid and / or its salts or mixtures containing them using Microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in which at least the poxB gene is weakened.

Stand der TechnikState of the art

Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet. Der Bedarf steigt.Pantothenic acid is of the order of magnitude worldwide produced several thousand tons a year. It gets under other in human medicine, in pharmaceutical Industry and used in the food industry. On Much of the pantothenic acid produced is used for Feeding livestock such as poultry and pigs used. The demand is increasing.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.Pantothenic acid can be by chemical synthesis or biotechnical through fermentation of suitable microorganisms be prepared in suitable nutrient solutions. In the chemical synthesis, DL-pantolactone is an important one Precursor. It is made in a multi-step process Formaldehyde, isobutyl aldehyde and cyanide are produced in further process steps the racemic mixture separated, the D-pantolactone condensed with β-alanine and so get D-pantothenic acid.

Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.The typical commercial form is the calcium salt of D- Pantothenic acid. The calcium salt of the racemic mixture D, L-pantothenic acid is also common.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.The advantage of fermentative production through Microorganisms lie in the direct formation of the desired stereoisomeric form, namely the D form, the is free of L-pantothenic acid.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β- Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.Different types of bacteria, such as B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium  erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes and also yeasts, such as B. Debaromyces castellii can be as in EP-A 0 493 060 shown in a nutrient solution, the glucose, DL-pantoic acid and contains β-alanine to produce D-pantothenic acid. EP-A 0 493 060 further shows that in E. coli by Amplification of pantothenic acid biosynthetic genes from E. coli contained on the plasmids pFV3 and pFV5, in a nutrient solution containing glucose, DL-pantoic acid and β- Contains alanine, which improves the formation of D-pantothenic acid becomes.

EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α- Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D- Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β- Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.EP-A 0 590 857 and U.S. Patent 5,518,906 describe from E. coli strain IFO3547 derived mutants such as FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 and FV5069, the resistances against various antimetabolites such as salicylic acid, α- Ketobutyric acid, β-hydroxyaspartic acid, O-methylthreonine and carry α-ketoisovaleric acid. You produce in one Nutrient solution containing glucose, pantoic acid, and in one Nutrient solution D-pantothenic acid containing glucose and β-alanine. In EP-A 0 590 857 and US Patent 5,518,906 further indicated that after amplification of pantothenic acid BB synthesis panB, panC and panD genes on the plasmid pFV31 should be included in the above strains in nutrient solutions containing glucose, the production of D- Pantoic acid and in a nutrient solution, the glucose and β- Contains alanine, the production of D-pantothenic acid is improved.

Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A- 1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.Furthermore, WO 97/10340 describes the beneficial Effect of the amplification of the ilvGM operon on the Production of D-pantothenic acid is reported. In the EP-A- 1001027 will eventually talk about the effect of reinforcement of the panE gene for the formation of D-pantothenic acid reported.

Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet.According to the prior art, D-pantothenic acid or the corresponding salt is isolated from the fermentation broth and cleaned (EP-A-0590857 and WO 96/33283) and accordingly used in purified form or the D-  Fermentation broth containing pantothenic acid overall dried (EP-A-1050219) and especially as Feed additive used.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.The inventors set themselves the task of creating new ones Measures to improve fermentative production of D- Pantothenic acid and / or its salts or containing them To provide animal feed additives.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.If in the following D-pantothenic acid or pantothenic acid or Pantothenate mentioned are not just the free ones Acids, but also the salts of D-pantothenic acid like z. B. the calcium, sodium, ammonium or potassium salt meant.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D- Pantothensäure produzieren und in denen die für das poxB- Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden.The invention relates to a method for fermentative production of D-pantothenic acid and / or their salts using microorganisms of Family Enterobacteriaceae, which in particular already D- Produce pantothenic acid and in which the poxB Gene-encoding nucleotide sequence (s) weakened, in particular be turned off.

Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:
In particular, it is a method which is characterized in that the following steps are carried out:

• a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen dass poxB-Gen abgeschwächt wird, ggf. in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene, unda) Fermentation of family microorganisms Enterobacteriaceae, in which the poxB gene is weakened, possibly in combination with the Weakening or enhancement of other genes, and
• b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzugefügt werden, b) optionally in the presence of Alkaline earth compounds, these preferably in stoichiometric amounts continuously or be added discontinuously,  
• c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae undc) Enrichment of D-pantothenic acid or corresponding salt in the medium or Fermentation broth or in the cells of the Enterobacteriaceae and
• d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder des entsprechenden Salzes.d) after completion of the fermentation, isolating the D- Pantothenic acid, and / or the corresponding salt.

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die auch weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.The invention also relates to a method in which after completion of the fermentation, the biomass partially or remains overall in the fermentation broth and so obtained broth, if necessary after concentrating a solid D-pantothenic acid and / or its salts containing mixture, which also contains other components of the Contains fermentation broth, is processed.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "weakening" describes in this Context the reduction or elimination of intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism caused by the corresponding DNA can be encoded, for example by uses a weak promoter or a gene or allele used with a corresponding enzyme (protein) encodes a low activity or the corresponding one Gene or enzyme (protein) inactivated and if necessary combined these measures.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12 Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al. Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen D-Pantothensäure zu produzieren.The microorganisms that are the subject of the present Invention, D-pantothenic acid can be obtained from glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, Produce cellulose or from glycerin and ethanol. It are representatives of Enterobacteriaceae, especially the genus Escherichia. In the genus Escherichia is particularly the species Escherichia coli too call. Within the species Escherichia coli they are so-called K-12 strains, such as. B. the strains MG1655 or W3110 (Neidhard et al. Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) or the Escherichia coli wild-type strain IFO3547 (Institute of Fermentation, Osaka, Japan) and the like  derived mutants that have the ability To produce D-pantothenic acid.

Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3Suitable strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, which produce D-pantothenic acid are, for example
Escherichia coli FV5069 / pFV31
Escherichia coli FV5069 / pFV202
Escherichia coli FE6 / pFE80 and
Escherichia coli KE3

Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Abschwächung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2)kodierenden poxB- Gens in verbesserter Weise D-Pantothensäure produzieren.It has been found that Enterobacteriaceae after attenuation of the poxB- coding for the pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) Gens produce D-pantothenic acid in an improved manner.

Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens von Escherichia coli wurde von Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986)) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli unter der Accession Number AE000188 entnommen werden.The nucleotide sequence of the poxB gene from Escherichia coli was developed by Grabau and Cronan (Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986)) and can also be the by Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) published genome sequence of Escherichia coli under the Accession number AE000188.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen poxB-Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des poxB-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.The poxB genes described in the specified passages can be used according to the invention. Can continue Alleles of the poxB gene that result from the Degeneracy of the genetic code or through result in function-neutral sense mutations.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des poxB-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.For example, to achieve a weakening Expression of the poxB gene or the catalytic Properties of the enzyme protein reduced or turned off. If necessary, both measures be combined.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).The reduction in gene expression can be reduced by appropriate Culture management, through genetic modification (mutation) of the Signal structures of gene expression or through Antisense RNA technology is used. Signal structures of the Gene expression is, for example, repressor genes, Activator genes, operators, promoters, attenuators,  Ribosome binding sites, the start codon and terminators. The person skilled in the art will find information on this among other things for example at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) by Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or that of Winnacker ("Genes and Clones", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations that lead to a change or reduction in the lead catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art. Examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991). Summary Representations can be found in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. that of Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) become.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnonmmen werden.Transitions, transversions, Insertions and deletions are considered. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is caused by false sense mutations ("missense mutations ") or nonsense mutations" spoken. Insertions or deletions of at least a base pair in a gene lead to Frame shift mutations, which lead to the incorporation of wrong amino acids or the translation is terminated prematurely. Deletions of multiple codons typically result in one complete loss of enzyme activity. Instructions for Generation of such mutations are part of the prior art  Technology and can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Gene and Clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Geeignete Mutationen im poxB-Gen wie beispielsweise Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.Suitable mutations in the poxB gene such as Deletion mutations can be caused by gene or allele exchange be built into suitable trunks.

Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.A common method is that of Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) described method of gene exchange using a conditionally replicating pSC101 derivative pMAK705. Other methods described in the prior art such as for example, that of Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) or that of Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) can also be used.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im poxB-Gen oder Mutationen, die die Expression des poxB-Gens betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.It is also possible to find mutations in the poxB gene or Mutations affecting the expression of the poxB gene by conjugation or transduction into different strains to convict.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gen ein oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe
Furthermore, it can be advantageous for the production of D-pantothenic acid with strains of the Enterobacteriaceae family, in addition to the attenuation of the poxB gene, one or more genes selected from the group

• - das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)- The coding for acetohydroxy acid synthase II ilvGM operon (WO 97/10340)
• - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5,518,906),- That for the ketopantoate hydroxymethyl transferase encoding panB gene (US-A-5,518,906),
• - das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027) - The panE gene coding for the ketopantoate reductase (EP-A-1001027)  
• - das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906),- The panD gene coding for the aspartate decarboxylase (US-A-5,518,906),
• - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906),- The panD gene coding for pantothenate synthetase (US-A-5,518,906),
• - das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)),- the serC coding for the phosphoserine transaminase Gen (Duncan and Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)),
• - die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-­ 548 (1993)), und- those for the glycine cleavage system (glycine cleavage system) coding genes gcvT, gcvH and gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539- 548 (1993)), and
• - das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983)))- The coding for the serine hydroxymethyltransferase glyA gene (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11 (7): 2065-2075 (1983)))

zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.to amplify, especially to overexpress.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "reinforcement" describes in this context the increase in the intracellular activity of one or several enzymes or proteins in a microorganism that can be encoded by the appropriate DNA by using for example the number of copies of the gene or genes increased, a strong promoter or a gene or allele used that for a corresponding enzyme or protein encoded with a high activity and possibly this Combined measures.

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft, sein zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens
Finally, it can be beneficial for the production of D-pantothenic acid with strains of the Enterobacteriaceae family, in addition to the attenuation of the poxB gene

• - das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A- 1001027) und- the avtA gene coding for transaminase C (EP-A- 1001027) and
• - das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))- the pckA gene coding for the PEP carboxykinase (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren.weaken, especially turn off or on low level express.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein neben der Abschwächung des poxB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des D-Pantothensäures verringern.It can also be used for the production of D-pantothenic acid be advantageous in addition to the attenuation of the poxB gene to eliminate undesirable side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). By doing Bacteria can be used in the method according to the invention in which the metabolic pathways are at least partially are switched off, which the formation of D-pantothenic acid reduce.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention can in batch process (set cultivation), in fed batch (Feed process) or in the repeated fed batch process (repetitive feed process) can be cultivated. A Summary of known cultivation methods are in the Textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to bio-process engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General. Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. The culture medium to be used must be in a suitable manner The requirements of the respective tribes meet. descriptions of culture media of various microorganisms are in "Manual of Methods for General. Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included. Sugar and Carbohydrates such as B. glucose, sucrose, lactose, Fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and Fats such as B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and Coconut fat, fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as e.g. B. glycerin and ethanol and organic acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture become.  

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Organic nitrogen-containing can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D-Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must also contain salts of metals such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, for the Growth are necessary. After all, essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition to above substances are used. The culture medium can also precursors of D-pantothenic acid such as Aspartate, β-alanine, ketoisovalerate, ketopantoic acid or Pantoic acid and optionally its salts added be added. The feedstocks mentioned can be used for Culture added in the form of a unique approach or appropriately fed during cultivation become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner.

Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu versetzen. Auf diese Weise wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die Fermentationsbrühe eingetragen.It is also possible to represent the Alkaline earth metal salts of pantothenic acid, especially the Calcium salt, during the fermentation the suspension or Solution of an alkaline earth-containing inorganic compound such as calcium hydroxide or an organic Compound like the alkaline earth salt of an organic acid for example calcium acetate, continuous or to move discontinuously. That way it will to represent the desired alkaline earth salt of the D- Pantothenic acid necessary cation directly in the desired  Amount, preferably in stoichiometric amounts, in the Fermentation broth entered.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.Anti-foam agents can be used to control the development of foam such as B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics to be added. To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 25 ° C to 45 ° C and preferably at 30 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of D- Has formed pantothenic acid. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.

Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure kann anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.The D-pantothenic acid contained in the fermentation broth or the corresponding salts of D-pantothenic acid then isolated according to the prior art and getting cleaned.

Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier- Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung mit der gewünschten Korgrößenverteilung von gegenfalls 20 bis 2000 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.It is also possible to use D-pantothenic acid and / or its Fermentation broths containing salts are preferred first by known separation methods such as Example of centrifugation, filtration, the Decant or a combination thereof completely or to get rid of some of the biomass. However, it is also possible to completely absorb the biomass in the fermentation broth leave. Generally the suspension or solution preferably concentrated and for example with the help a spray dryer or a freeze dryer worked up a powder. Then this powder generally by means of suitable compacting or granulating Process z. B. also build-up granulation in a coarser-grained, free-flowing, storable and largely dust-free product with a Grain size distribution with the desired Coresize distribution from 20 to 2000 µm transferred. Beneficial for granulation or  Compacting is the use of common organic or inorganic auxiliaries, or carriers such as Starch, gelatin, cellulose derivatives or the like Substances as they are commonly used in food or Feed processing as binding, gelling, or Find thickeners, or others Substances such as silicas, silicates or Stearates.

Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.Alternatively, the fermentation product can be with or without more of the usual fermentation components on a in known and customary in feed processing organic or inorganic carrier such as Silicas, silicates, meal, bran, flour, starches Sugar or other raised and / or with usual Thickeners or binders are stabilized. Application examples and procedures for this are in the Literature (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Page 817).

Gegebenenfalls wird auf einer geeigneten Verfahrensstufe D-Pantothensäure oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung hinzugefügt, um den gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz im Endprodukt zu erzielen bzw. einzustellen.If necessary, at a suitable process stage D-pantothenic acid or the desired salt of the D-pantothenic acid or one containing these compounds Preparation added to the desired level of Pantothenic acid or the desired salt in the end product achieve or adjust.

Der gewünschte Gehalt liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).The desired content is generally in the range of 20 to 80% by weight (dry matter).

Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.The concentration of pantothenic acid can with known chemical (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) or microbiological methods such as. As the Lactobacillus plantarum test (DIFCO MANUAL, 10 ^th Edition, pp 1100-1102; Michigan, USA) are determined.

Claims (10)

1. Verfahren zu Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) mindestens das (die) in den Mikroorganismen für die poxB-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abschwächt, insbesondere ausschaltet,
• b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert, und
• c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenenfalls vollständig oder teilweise abtrennt.

1. A process for the preparation of D-pantothenic acid and / or its alkaline earth metal salts or feed additives containing them by fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in particular those which already produce D-pantothenic acid, characterized in that

• a) at least weakens, in particular switches off, the nucleotide sequence (s) coding for the poxB gene in the microorganisms,
• b) accumulates the D-pantothenic acid and / or its salts in the medium or in the cells of the microorganisms, and
• c) the desired products are isolated after the end of the fermentation, the biomass and / or further constituents of the fermentation broth being left in the product or, if appropriate, completely or partially separated off.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich oder diskontinuierlich in insbesondere stöchiometrischen Mengen zugeführt werden, und ein Erdalkalisalze der D- Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt gewinnt.2. The method according to claim 1, characterized in that the fermentation in the presence of alkaline earth salts carries out, this continuously or discontinuously in stoichiometric in particular Amounts are supplied, and an alkaline earth metal salt of D- Pantothenic acid containing or consisting thereof Product wins. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae der Gattung Escherichia angehören.3. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that the microorganisms of the family Enterobacteriaceae belong to the genus Escherichia. 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli stammen. 4. The method according to claim 3, characterized in that the microorganisms from the genus Escherichia, especially the species Escherichia coli.   5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, verstärkt insbesondere überexprimiert:

• 1. 5.1 das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon,
• 2. 5.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,
• 3. 5.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen,
• 4. 5.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen,
• 5. 5.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen,
• 6. 5.6 das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
• 7. 5.7 die für das Glycin Spaltungssystem kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam,
• 8. 5.8 das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen.

5. The method according to claim 1, characterized in that, in addition to the attenuation of the poxB gene, one or more of the genes selected from the group are particularly overexpressed:

• 1. 5.1 the ilvGM operon coding for acetohydroxy acid synthase II,
• 2. 5.2 the panB gene coding for the ketopantoate hydroxymethyltransferase,
• 3. 5.3 the panE gene coding for the ketopantoate reductase,
• 4. 5.4 the panD gene coding for the aspartate decarboxylase,
• 5. 5.5 the panC gene coding for the pantothenate synthetase,
• 6. 5.6 the serC gene coding for the phosphoserine transaminase,
• 7. 5.7 the genes gcvT, gcvH and gcvP coding for the glycine cleavage system, individually or together,
• 8. 5.8 the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern, insbesondere das für

• 1. 6.1 die Transaminase C kodierende avtA-Gen, und
• 2. 6.2 das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA- Gen.

6. The method according to claim 1, characterized in that bacteria are used in which the metabolic pathways are at least partially switched off, which reduce the formation of D-pantothenic acid, in particular for

• 1. 6.1 the avamin gene encoding the transaminase C, and
• 2. 6.2 the pckA gene coding for the PEP carboxykinase.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des (der) Polynukleotids (e), das (die) für das poxB-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet.7. The method according to claim 1, characterized in that that expression of the polynucleotide (s),  that (s) encode the poxB gene attenuates, especially turns off. 8. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man

• a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe abtrennt,
• b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und
• c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und
• d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.

8. A process for the preparation of feed additives containing D-pantothenic acid and / or salts thereof, according to claim 1, characterized in that

• a) the biomass and / or part of the ingredients are separated off from a fermentation broth obtained by fermentation and, if appropriate in whole or in part, from D-pantothenic acid,
• b) the mixture thus obtained is optionally concentrated, and
• c) the feed additive containing the pantothenic acid and / or the pantothenate is converted into a free-flowing form by suitable measures, and
• d) a suitable free-flowing animal feed additive with a particle size distribution of 20 to 2000 µm is obtained by suitable measures.

9. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel- Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D- Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der Gruppe Magnesium- oder Calciumsalz in dem Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmass) aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

• a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
• b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100%,
• c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel- Additiv im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
• d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.

9. A process for the preparation of animal feed additives according to claim 8 with a content of D-pantothenic acid and / or its salts selected from the group consisting of magnesium or calcium salt in the range from about 20 to 80% by weight (dry matter) from fermentation broths, characterized by the steps

• a) optionally removing water from the fermentation broth (concentration),
• b) removal of the biomass formed during the fermentation in an amount of 0 to 100%,
• c) optionally adding one or more of the compounds mentioned to the fermentation broths obtained according to a) and b), the amount of the added compounds being such that their total concentration in the animal feed additive is in the range from about 20 to 80% by weight lies, and
• d) Obtaining the animal feed additive in the desired powder or preferably granular form.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salze und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder anorganischen Hilfsstoffen durch

• a) Trocknen und Kompaktieren, oder
• b) Sprühtrocknen, oder
• c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
• d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,

ein Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Korngröße gewinnt.10. The method according to claim 8, characterized in that from the fermentation broth, optionally after adding D-pantothenic acid and / or its salts and optionally after adding organic or inorganic auxiliaries

• a) drying and compacting, or
• b) spray drying, or
• c) spray drying and granulating, or
• d) spray drying and build-up granulation,

an animal feed additive in the desired grain size wins.