DE10109466A1

DE10109466A1 - Methods and agents for modifying human angiogenesis

Info

Publication number: DE10109466A1
Application number: DE2001109466
Authority: DE
Inventors: Herwig Brunner; Brigitte Koch-Pelster
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: KOCH-PELSTER, BRIGITTE, DR., 12163 BERLIN, DE
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: DE10109466B4; WO2002068636A1; DE10164805B4; EP1366155A1

Abstract

The invention relates to methods and agents for modifying human angiogenesis, whereby the agents used in these methods can be nucleic acids, nucleic acid complexes (angiotropin) or antibodies that are directed against these nucleic acids or nucleic acid complexes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft RNA-Bestandteile eines Metallo-Ribonucleoprotein-Morphogens aus Leu kocyten, Verfahren zu deren Herstellung und Charak terisierung sowie diese RNA-Bestandteile aufweisen de Nucleinsäure-Komplexe und Verfahren zu deren Verwendung, insbesondere Verfahren und Mittel zur Modifikation der Angiogenese und Verfahren und Mit tel zur Tumorzellbekämpfung.The present invention relates to RNA components of a metallo-ribonucleoprotein morphogen from Leu cocytes, process for their preparation and character terization and these RNA components de Nucleic acid complexes and methods for their Use, in particular methods and means for Modification of Angiogenesis and Procedures and With to fight tumor cells.

Unter Angiogenese versteht man die Ausbildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsystem (Hertig, 1935). Die im Rahmen der Angiogenese stattfindende Neovaskularisierung erfolgt in mehreren Teilschrit ten (Folkman und Shing, 1992). Dabei wird zunächst die die Blutgefäße umgebende Basalmembran mit Hilfe verschiedener proteolytischer Enzyme, zum Beispiel Kollagenase, abgebaut und zusätzlich wird die ext razelluläre Matrix im perivaskulären Raum fragmen tiert. Anschließend erfolgt die Differenzierung der Endothelzelle, wobei sich die Zellmorphologie än dert und damit verbunden Pseudopodien ausgebildet werden. Angiogene Stimuli bewirken, dass die frei gelegten Endothelzellen in Richtung eines chemotak tischen Reizes migrieren. Anschließend erfolgt eine Proliferation der Endothelzellen. Durch die Anei nanderlagerung der Außenwände einer oder mehrerer Endothelzellen werden neue Gefäßschleifen mit einem kapillarförmigen Lumen ausgebildet. Danach setzt die Synthese einer neuen Basalmembran ein. Sobald zwei Kapillarsprossen an der Spitze miteinander verschmelzen und ein gemeinsames Lumen bilden, ist die Ausbildung eines neuen funktionsfähigen Kapil larsystems abgeschlossen und der Blutfluss kann einsetzen. Unter nicht-pathologischen Bedingungen treten beim erwachsenen Mann, abgesehen von der Wundheilung, nahezu keine angiogenetischen Prozesse auf, so dass sich das Endothel nur wenige Male im Leben erneuert. Bei der erwachsenen Frau ist die Situation jedoch völlig anders, da insbesondere im Rahmen des Menstruationszykluses, das heißt während der Ovulation, der Reifung des Corpus luteum und des Aufbaus des Endometriums, bis zur Menopause an giogenetische Prozesse stattfinden. Während der Schwangerschaft tritt Angiogenese verstärkt auf, insbesondere bei der Plazentabildung und der Lakto genese in den Mammae (Hertig, 1935).Angiogenesis means the formation of new ones Blood vessels from sprouting capillaries an existing vascular system (Hertig, 1935). The one taking place in the context of angiogenesis Neovascularization takes place in several steps ten (Folkman and Shing, 1992). This will start with the basement membrane surrounding the blood vessels with the help various proteolytic enzymes, for example Collagenase, degraded and in addition the ext Fracture the cellular matrix in the perivascular space advantage. Then the differentiation takes place Endothelial cell, where the cell morphology changes changed and associated pseudopodia formed become. Angiogenic stimuli cause the free placed endothelial cells towards a chemotak migrate table stimuli. Then there is one Proliferation of endothelial cells. Through the Anei Storage of the outer walls of one or more Endothelial cells become new vascular loops with one capillary-shaped lumens. After that sets the synthesis of a new basement membrane. As soon as two capillary rungs at the top with each other merge and form a common lumen is the formation of a new functional Kapil larsystems complete and blood flow can deploy. Under non-pathological conditions occur in the adult male, apart from the Wound healing, almost no angiogenic processes so that the endothelium only Life renewed. In the adult woman it is However, the situation is completely different, especially in Framework of the menstrual cycle, i.e. during ovulation, maturation of the corpus luteum and endometrial build-up until menopause giogenetic processes take place. During the Pregnancy, angiogenesis increases, especially in placenta formation and lacto genesis in the Mammae (Hertig, 1935).

Neben der physiologisch essentiellen Angiogenese gibt es auch eine Vielzahl pathologischer angioge netischer Prozesse (Folkman, 1995a). Zu diesen ge hören beispielsweise die diabetische Retinopathie, die verschiedenen Formen von rheumatoider Arthritis und die Ausbildung von Hämangiomen. Diese patholo gischen Prozesse werden dadurch verursacht, dass angiogenetisch stimulierende Faktoren, wie zum Bei spiel Metalloproteasen, gegenüber ihren Inhibito ren, beispielsweise TIMP (tissue inhibitor of me talloproteases), im Überschuss vorliegen. Durch ge zielte Inhibition einzelner Angiogenese-Faktoren versucht man solche pathologischen angiogenetischen Prozesse zu inhibieren (Adamis et al., 1996). Ein Spezialfall der pathogenen Angiogenese stellt die Tumorangiogenese dar (Folkman 1971, Folkman 1995b). Beim Tumorwachstum sezernieren die Tumorzellen selbst angiogene Faktoren, die chemotaktisch die Aussprossung neuer Blutgefäße in Richtung des Tu mors induzieren. Durch eine erhöhte Anzahl von Blutgefäßen kann der Tumor verstärkt mit lebensnot wendigen Nährstoffen und Sauerstoff versorgt wer den. Dies hat wiederum ein verstärktes Tumorwachs tum zur Folge. Ein zur Zeit rasch expandierendes Forschungsgebiet innerhalb der Tumorforschung stellt daher die Anti-Angiogenese-Forschung dar. Auch hier wird nach Faktoren gesucht, die die Tumo rangiogenese und damit auch gleichzeitig das Tumor wachstum inhibieren (Folkman 1995a, Folkman 1995b).In addition to the physiologically essential angiogenesis there are also a variety of pathological angioge netic processes (Folkman, 1995a). To these ge hear for example diabetic retinopathy, the different forms of rheumatoid arthritis and the formation of hemangiomas. This patholo processes are caused by the fact that angiogenic stimulating factors, such as play metalloproteases against their inhibito ren, for example TIMP (tissue inhibitor of me talloproteases), in excess. By ge targeted inhibition of individual angiogenesis factors one tries such pathological angiogenic Inhibit processes (Adamis et al., 1996). On The special case of pathogenic angiogenesis is the Tumor angiogenesis (Folkman 1971, Folkman 1995b). When the tumor grows, the tumor cells secrete even angiogenic factors that chemotactically Sprouting of new blood vessels in the direction of the Tu induce mors. By an increased number of Blood vessels can make the tumor worse for life agile nutrients and oxygen the. This in turn has an increased tumor wax result. A rapidly expanding one at the moment Research area within tumor research therefore represents anti-angiogenesis research. Here, too, it looks for factors that affect the tumor rangiogenesis and with it the tumor inhibit growth (Folkman 1995a, Folkman 1995b).

Von Angiotropin, einem aus ischämischen Herzmuskel gewebe, Wundflüssigkeit und den Überständen serum freier Massenkulturen Lektin-stimulierter porciner Leucozyten isolierten Metallo-Ribonucleoprotein- Morphogen, ist bekannt, dass es ein Mediator angio genetischer Prozesse ist (Wissler und Renner 1981, Wissler 1982, Wissler 1984) Die angiogenetische Wirksamkeit von Angiotropin wurde mit Hilfe übli cher in vivo- und in vitro-Testsysteme nachgewie sen. So konnte beispielsweise mittels eines Tests an Corioallantois-Membranen des Hühnerembryos (CAM- Test) gezeigt werden, dass nach Verabreichung von Angiotropin eine verstärkte Kapillarisierung in dieser Membran erfolgte (Wissler 1982, Noll 1998, Kuhn 1998). Eine verstärkte Vaskularisierung wurde auch bei der intradermalen Injektion von Angiotro pin am Kaninchenohr beobachtet (Höckel et al. 1984, Höckel 1988). Im Endothelzell-Test konnten nach Verabreichung von Angiotropin zeit- und dosisabhän gige Änderungen der Zellmorphologie von ursprüng lich kontaktinhibierten konfluenten Endothelzellen beobachtet werden, wobei diese Änderungen in drei Stufen erfolgten (Höckel et al. 1986, Höckel 1988, Noll 1998). Im Stadium I, das heißt innerhalb von zwei bis drei Tagen, nahmen die ursprünglich fla chen polygonalen Endothelzellen eine abgerundete, bipolare, parallel orientierte Form an. Dabei bil deten sich in verstärktem Maße Pseudopodien und Va cuolen aus. Im Stadium II, das heißt nach etwa etwa vier bis sieben Tagen, waren lange bipolare Cy toplasma-Ausläufer mit tubulären Strukturen zu beo bachten, die sich spatial organisierten. Innerhalb der Endothelzellen waren dabei eine oder zwei große transparente Vakuolen mit beweglichen Granula vor handen. Wenn die Endothelzellen weiterhin mit Angi otropin-haltigem Medium stimuliert wurden, gingen sie in Stadium III über. Dabei verschwanden die Va kuolen und es traten unregelmäßig geformte Partikel außerhalb des Zellkörpers und der Pseudopodien auf. Wurden Endothelzellen im Stadium II mit neuem Medi um, das kein Angiotropin enthielt, weiterkulti viert, bildeten sich die zellmorphologischen Verän derungen nach 24 Stunden zurück, bis die Zellen wieder ihr ursprüngliches Erscheinungsbild zeigten.From angiotropin, one from ischemic heart muscle tissue, wound fluid and the supernatant serum free mass cultures of lectin-stimulated porciner Leucocyte isolated metallo-ribonucleoprotein Morphogen, is known to be an angio mediator genetic processes (Wissler and Renner 1981, Wissler 1982, Wissler 1984) The angiogenic Efficacy of angiotropin was assessed with the help in vivo and in vitro test systems sen. For example, using a test on corioallantoic membranes of the chicken embryo (CAM Test) showed that after administration of Angiotropin increased capillarization in this membrane was made (Wissler 1982, Noll 1998, Kuhn 1998). Increased vascularization was also with the intradermal injection of angiotro pin observed on the rabbit ear (Höckel et al. 1984, Höckel 1988). The endothelial cell test failed to Administration of angiotropin depends on time and dose current changes in cell morphology from original Lich contact-inhibited confluent endothelial cells are observed, with these changes in three Stages took place (Höckel et al. 1986, Höckel 1988, Noll 1998). In stage I, that is within two to three days, the originally took fla polygonal endothelial cells a rounded, bipolar, parallel oriented shape. Thereby bil Pseudopodia and Va cuolen out. In stage II, that is after about four to seven days, were long bipolar cy toplasma foothills with tubular structures to beo that organized themselves spatially. Within the endothelial cells were one or two large transparent vacuoles with movable granules handen. If the endothelial cells continue with Angi otropin-containing medium were stimulated went them in stage III. The Va disappeared cool and irregularly shaped particles appeared outside of the cell body and the pseudopodia. Were endothelial cells in stage II with new medi um, which did not contain angiotropin fourth, the cell morphological changes formed changes after 24 hours until the cells showed their original appearance again.

Anhand dieser Tests zeigte sich, dass Angiotropin eine reversible Veränderung der Zellmorphologie und damit des Phänotyps von Endothelzellen bewirkte. Von Bedeutung ist fernerhin, dass Angiotropin keine mitogene Wirkung auf Endothelzell-Kulturen ausübte und daher nur eine Differenzierung, jedoch keine Proliferation der Endothelzellen induzierte (Höckel et al. 1986, Höckel et al. 1987, Höckel 1988).These tests showed that angiotropin a reversible change in cell morphology and thus caused the phenotype of endothelial cells. It is also important that angiotropin is none exerted mitogenic effects on endothelial cell cultures and therefore only a differentiation, but not one Proliferation of endothelial cells (cusp et al. 1986, Höckel et al. 1987, Höckel 1988).

Ferner wurde gezeigt, dass Angiotropin die Migrati on von Endothelzellen stimulierte, nicht jedoch die Migration von 3T3-Fibroblasten (Höckel et al. 1987, Höckel 1988). Das heißt, dass Angiotropin eine spe zifische Wirkung auf Endothelzellen ausübt. Des weiteren konnte nachgewiesen werden, dass Angiotro pin eine Nuclease-Aktivität aufweist und bei in vitro-Translations-Assays die Translation inhibie ren kann (Seibt 1998, Noll 1998).It has also been shown that angiotropin is the migrati stimulated by endothelial cells, but not that Migration of 3T3 fibroblasts (Höckel et al. 1987, Höckel 1988). That means that angiotropin is a special has a specific effect on endothelial cells. Of further it could be shown that Angiotro pin has nuclease activity and at in vitro translation assays the translation inhibition can (Seibt 1998, Noll 1998).

Bei Angiotropin handelt es sich um einen metallhal tigen Ribonucleotidpolypeptid (RNP)-Komplex, der extrazellulär isoliert werden konnte. Als Metallio nen konnten Kupfer-, Calcium-, Natrium- und Kaliu mionen nachgewiesen werden (Wissler et al., 1986). Das Kupferion liegt darin vermutlich in zweiwerti ger Form vor (Kuhn et al., 1996, Kühn 1998). Die Sequenzierung des Protein-Bestandteils ARP (Angi otropin related protein) ergab, dass dieser zu 100% homolog zu Calgranulin C ist (Kuhn 1998). Das Pro tein gehört zur Familie der S100-Proteine und wurde bereits ohne RNA-Komponente aus Schweine- Granulocyten isoliert, in denen es 8% des gesamten cytosolischen Proteins bildet (Dell'Angelica et al., 1994). Es handelt sich um ein Protein mit 91 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 10614 Dalton. Wie andere S100-Proteine besitzt auch Calgranulin C zwei als EF-Handstrukturen bekannte Calcium-Bindungsmotive (Kretsinger 1980, Isobe et al. 1981; Moncrief et al. 1990; Klingman & Hilt 1988; Schäfer & Heizmann 1996). Angiotropin is a metal hal ribonucleotide polypeptide (RNP) complex, the could be isolated extracellularly. As a metallio copper, calcium, sodium and potassium ions can be detected (Wissler et al., 1986). The copper ion is presumably in two valences form (Kuhn et al., 1996, Kühn 1998). The Sequencing of the protein component ARP (Angi otropin related protein) showed that it was 100% is homologous to calgranulin C (Kuhn 1998). The pro tein belongs to the family of S100 proteins and was already without RNA components from pig Granulocytes isolated, making up 8% of the total forms cytosolic protein (Dell'Angelica et al., 1994). It is a protein with 91 Amino acids and a molecular weight of 10614 Dalton. Like other S100 proteins too Calgranulin C two known as EF hand structures Calcium binding motifs (Kretsinger 1980, Isobe et al. 1981; Moncrief et al. 1990; Klingman & Hilt 1988; Schäfer & Heizmann 1996).

Die DE 196 28 895 A1 beschreibt biologisch aktive metallhaltige, insbesondere Kupfer-, Zink- oder Calcium-haltige Ribonucleopolypeptide (RNPs) als nicht-mitogene Morphogene für Blutgefäße definier ter Primärstruktur sowie Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieser RNPs. Insbesondere werden eine Teilsequenz der porcinen Angiotropin-RNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenz des Proteinbestandteils beschrieben.DE 196 28 895 A1 describes biologically active metal-containing, in particular copper, zinc or Calcium-containing ribonucleopolypeptides (RNPs) as Define non-mitogenic morphogens for blood vessels ter primary structure and method of manufacture and obtaining these RNPs. In particular, a Partial sequence of the porcine angiotropin RNA sequence as well as the amino acid sequence of the protein component described.

Die DE 198 10 998 C1 beschreibt Sequenzen des RNA- Bestandteils (ARNA) von porcinem Angiotropin, ins besondere die Sequenzen ARNA II, ARNA III, ARNA IV und ARNA V.DE 198 10 998 C1 describes sequences of the RNA Component (ARNA) of porcine angiotropin, ins especially the sequences ARNA II, ARNA III, ARNA IV and ARNA V.

Die DE 198 11 047 C1 beschreibt weitere mit porci nem Angiotropin assoziierte RNA-Sequenzen, insbe sondere die ARNA I-Sequenz und die ARNA VI-Sequenz.DE 198 11 047 C1 describes others with porci nem angiotropin-associated RNA sequences, esp especially the ARNA I sequence and the ARNA VI sequence.

Die im Stand der Technik bekannten Dokumente offen baren ausschließlich RNA-Sequenzen, die mit Angi otropin vom Schwein assoziiert sind. Angesichts der experimentell nachgewiesenen Bedeutung von Angi otropin für die Angiogenese im Säugerorganismus, insbesondere hinsichtlich der Verwendung dieses Morphogens zur gezielten Modulation pathogener an giogenetischer Prozesse beim Menschen, beispiels weise zur Behandlung humaner Krankheiten, ist es jedoch wünschenswert, die RNA-Sequenzen von humanem Angiotropin zu isolieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus geben die im Stand der Technik be kannten Druckschriften keinerlei Einblicke in die molekularen Mechanismen, die der angiogenetischen Aktivität von Angiotropin zugrunde liegen. Insbesondere ist nicht bekannt, welche Funktion speziell der RNA-Bestandteil besitzt. Gerade im Hinblick auf eine humanmedizinische Anwendung von Angiotropin ist es jedoch wünschenswert, diese molekularen Me chanismen genau zu verstehen, um die angiogeneti sche Aktivität von Angiotropin gezielt modulieren zu können, das heißt je nach Bedarf zu induzieren beziehungsweise zu verstärken oder aber zu inhibie ren.The documents known in the prior art are open only RNA sequences that were generated with Angi Pig otropin associated. Given the experimentally proven meaning of angi otropin for angiogenesis in the mammalian organism, especially regarding the use of this Morphogen for targeted modulation of pathogenic giogenetic processes in humans, for example wise for treating human diseases, it is however, the human RNA sequences are desirable Isolate and characterize angiotropin. In addition, the be in the prior art did not have any insight into the publications molecular mechanisms of angiogenetic Of angiotropin activity. In particular is not known which function specifically has the RNA component. Especially with regard to a human medical application of angiotropin however, it is desirable to measure these molecular levels mechanisms to understand exactly the angiogeneti Targeted modulation of angiotropin activity to be able to, i.e. to induce as needed or to reinforce or inhibit ren.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zur Isolierung und Charakterisierung von RNA-Sequenzen für humanes Angiotropin sowie auf diesen Verfahren und Mitteln basierende weitere Verfahren und Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe insbesondere im menschlichen Körper physiolo gisch erwünschte Angiogenese-Prozesse, beispiels weise bei der Wundheilung, gezielt induziert oder verstärkt werden können oder aber pathologische An giogenese-Prozesse, beispielsweise bei der diabeti schen Retinopathie oder bei der Tumorbildung, ge zielt inhibiert werden können.The basis of the present invention So the technical problem is process and means for isolating and characterizing RNA sequences for human angiotropin as well other methods based on these methods and means To provide methods and means by whose Help especially in the human body physiolo genetically desired angiogenesis processes, for example wise in wound healing, specifically induced or can be reinforced or pathological giogenesis processes, for example in diabetes retinopathy or tumor formation, ge targets can be inhibited.

Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung der Lehre gemäß des Hauptan spruchs, insbesondere durch ein Nucleinsäuremole kül, das als funktionaler Bestandteil eines biolo gisch aktiven Metallo-Ribonucleoprotein-Komplexes geeignet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
The present invention solves this problem by providing the teaching according to the main claim, in particular by a nucleic acid molecule which is suitable as a functional component of a biologically active metallo-ribonucleoprotein complex, selected from the group consisting of:

a) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta- Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern, ins besondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder 7 dargestellten Primern, und einem Fragment davon;a) a nucleic acid molecule that is available by means of reverse transcription of placenta Total RNA with ARNA I-specific primers, ins especially with those in SEQ ID No. 6 and / or 7 primers shown, and a fragment thereof;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 5 und 8 bis 15 darge stellte Nucleotidsequenz umfasst, und einem Frag ment davon;b) a nucleic acid molecule which has at least one the Darge in SEQ ID No. 1 to 5 and 8 to 15 posed nucleotide sequence, and a question ment of it;
c) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nuc leinsäuremoleküls nach a) bis b);c) a nucleic acid molecule that is available through substitution, addition, inversion and / or Deletion of one or more bases of a nuc linseed acid molecule according to a) to b);
d) einem Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nuc leinsäuremolekül nach a) bis c) und einem Frag ment davon hybridisiert, undd) a nucleic acid molecule that with a Nuc Linseed acid molecule according to a) to c) and a question hybridized from it, and
e) einem Nucleinsäuremolekül, das zu einem Nuclein säuremolekül nach a) bis b) komplementär ist, und einem Fragment davon.e) a nucleic acid molecule that forms a nuclein acid molecule is complementary according to a) to b), and a fragment of it.

Die Erfindung löst dieses Problem auch durch die Bereitstellung von diese Nucleinsäuremoleküle ent haltenen Nucleinsäurekomplexen, die das erfindungs gemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit mindestens einem Metallion, das erfindungsgemäße Nucleinsäure molekül zusammen mit mindestens einem Metallion und mindestens einem Protein (hier auch als metallhal tige Ribonucleotidpolypeptide bezeichnet) oder das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit einem Protein enthalten (hier auch als Ribonucleo tidpolypeptide bezeichnet). Derartige Nucleinsäure- Komplexe, insbesondere metallhaltige Ribonucleotid polypeptide, sind für eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen in hervorra gender Weise geeignet.The invention also solves this problem by Providing these nucleic acid molecules holding nucleic acid complexes that the Invention appropriate nucleic acid molecule together with at least a metal ion, the nucleic acid of the invention molecule together with at least one metal ion and at least one protein (here also as a metal hal term ribonucleotide polypeptides) or that nucleic acid molecule according to the invention together with contain a protein (here also as a ribonucleo called tidpolypeptides). Such nucleic acid Complex, especially metal-containing ribonucleotide polypeptides are used for a wide range of diagnostic purposes and therapeutic applications in Hervra gender appropriate.

Erfindungsgemäß wurde das technische Problem in be vorzugter Ausführungsform gelöst, indem die mit hu manem Angiotropin assoziierte humane RNA-Sequenz ARNA I mit Hilfe des RT-PCR-Verfahrens unter Ver wendung der porcinen Primer ARNA I (forward) und ARNA I (reverse) aus der Gesamt-RNA von humaner Plazenta, einem angiogenetisch äußerst aktivem Ge webe, isoliert wurde. Diese humane ARNA-I-Sequenz enthält neben einem Sequenzabschnitt, der hinsicht lich seiner Länge und seiner Sequenz identisch mit der porcinen ARNA I-Sequenz ist, einen 42 Nucleoti de umfassenden Sequenzabschnitt, der in der porci nen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurde. Mit Hilfe des MFOLD-Programms wurde ein Computermodell der Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz er stellt und mit der Sekundärstruktur aller bekannten ARNA-Sequenzen einschließlich der porcinen ARNA- Sequenzen verglichen. Anhand dieses Vergleichs wur de gezeigt, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' aufweisen, die jeweils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife befindet. Diese bei allen bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadelschleife stellt, ohne durch die Theorie gebunden zu sein, möglicherweise die Bindungsdomäne dieser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C dar, was darauf hinweist, dass dieses Protein ein zelluläres Transportmolekül für verschiedene, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierte RNA-Moleküle ist. Diese anhand der computersimulierten Sekundär struktur nachgewiesene Haarnadelschleife mit der Konsensussequenz 5'-CUG-3', insbesondere der Se quenz gemäß der SEQ ID Nr. 12 und/oder 13, bietet erfindungsgemäß einerseits die Möglichkeit, den An giotropin-Proteinbestandteil ARP auch als Trans portmolekül für andere RNA-Sequenzen zu verwenden, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin- Komplex assoziiert sind. Um beispielsweise RNA- Sequenzen mit ribozymatischer Aktivität in Zielzel len des Angiotropin-Komplexes, zum Beispiel Endo thelzellen, einzuführen, werden diese RNA-Sequenzen unter Verwendung bekannter Verfahren der Gentechnik mit den Sequenzen, die bei den ARNA-Sequenzen diese Haarnadelschleife bilden, versehen und dann werden unter Verwendung dieser RNA-Sequenzen, des ARP- Bestandteils und von Metall-Ionen in vitro ternäre Komplexe gebildet, die in die zu behandelnden Zel len eingeführt werden. Andererseits bietet die nachgewiesene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen erfindungsgemäß die Möglichkeit, unter Verwendung der sie enthaltenden erfindungsgemäßen Nucleinsäu ren weitere Proteine, beispielsweise andere S100- Proteine, zu isolieren, die ähnlich wie ARP an sol che Haarnadel-Strukturen binden können und als po tentielle Transportmoleküle für ARNA-Sequenzen be ziehungsweise für erfindungsgemäß modifizierte Nuc leinsäuren, die natürlicherweise nicht mit dem An giotropin-Komplex assoziiert sind, verwendet werden können.According to the technical problem in be preferred embodiment solved by the hu human RNA sequence associated with angiotropin ARNA I using the RT-PCR method under Ver application of the porcine primers ARNA I (forward) and ARNA I (reverse) from the total RNA of human Placenta, an extremely active angiogenic gene weave, has been isolated. This human ARNA-I sequence contains in addition to a sequence section, as regards Lich identical in length and sequence of the porcine ARNA I sequence is a 42 nucleoti de comprehensive sequence section, which in the porci NEN ARNA I sequence was not detected. With With the help of the MFOLD program, a computer model was created the secondary structure of the human ARNA I sequence represents and with the secondary structure of all known ARNA sequences including the porcine ARNA Sequences compared. Based on this comparison en showed that all ARNA sequences are the common Have consensus sequence 5'-CUG-3 ', each only occurs in a sequence orientation and itself always in the area of a hairpin bow. This one found in all known ARNA sequences Hairpin bow poses without going through theory being bound, possibly the binding domain these ARNA sequences on ARP or Calgranulin C represents what indicates that this protein is a cellular transport molecule for different, with RNA molecules associated with the angiotropin complex is. This based on the computer-simulated secondary Structure-proven hairpin loop with the Consensus sequence 5'-CUG-3 ', especially the Se sequence according to SEQ ID No. 12 and / or 13 According to the invention on the one hand the possibility of the An giotropin protein component ARP also as a trans to use port molecule for other RNA sequences which naturally does not work with the angiotropin Complex associated. For example, in order to Sequences with ribozyme activity in target cell len of the angiotropin complex, for example Endo thel cells, these RNA sequences using known methods of genetic engineering with the sequences in the ARNA sequences this Form hairpin bow, provide and then become using these RNA sequences, the ARP Component and of metal ions in vitro ternary Complexes formed in the cell to be treated len are introduced. On the other hand, the proven hairpin loop of the ARNA sequences according to the invention, using of the nucleic acid according to the invention containing them other proteins, for example other S100- Isolate proteins that are similar to ARP on sol can bind hairpin structures and as po potential transport molecules for ARNA sequences be drawing for modified nuc according to the invention linseed acids, which naturally do not match the giotropin complex are used can.

Unter Verwendung von in vitro synthetisierten ARNA I-Sequenzen, CuCl₂ und des Proteinbestandteils ARP wurden in bevorzugter Ausführungsform erfindungsge mäß ternäre Angiotropin-Komplexe, also metallhalti ge Ribonucleotidproteine in vitro rekonstituiert und mit Hilfe des Corioallantois-Membran (CAM)- Tests am bebrüteten Hühnerei hinsichtlich ihrer an giogenetischen Aktivität in vivo getestet. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären An giotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I(Sense- beziehungsweise An tisense-)-Sequenzen über einen weiten Konzentrati onsbereich hinweg auf die untersuchten Hühnerembry onen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-lethalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA-abhängigen Regulati onsmechanismus der Angiotropin-induzierten Angioge nese. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus ARNA I (Sense oder Sinn)-RNA (ARNA I(s)), Kupfer(II)-Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die nur mit Kupfer(II)-Ionen kombinierte ARNA I(s)-Sequenz. Das heißt, für die angiogenetische Aktivität des Angiotropin-Komplexes ist der Proteinbestandteil Calgranulin C nicht er forderlich. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass mit der ARNA I (Antisense oder Antisinn)- Sequenz (ARNA I(as)) rekonstituierte ternäre Kom plexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar angiogeneti sche Prozesse hemmen konnten. Erfindungsgemäß ist daher in einer bevorzugten Ausführungsform vorgese hen, die humane ARNA I(s)-Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Induzierung der Angiogenese, beispielsweise im Rahmen der Wundheilung, zu ver wenden, während in einer weiteren bevorzugten Aus führungsform die humane ARNA I(as)-Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Hemmung pathogener angiogenetischer Prozesse, insbesondere von Tumorangiogenese, eingesetzt werden kann. In beiden vorgenannten Ausführungsformen kann die erfindungs gemäße ARNA I(s)- oder (as)-Sequenz zusammen mit Me tallionen und/oder Proteinen, zum Beispiel Calgra nulin C, beziehungsweise dessen Bestandteilen, ein gesetzt werden.Using in vitro synthesized ARNA I sequences, CuCl ₂ and the protein component ARP, ternary angiotropin complexes, ie metal-containing ribonucleotide proteins, were reconstituted in vitro in a preferred embodiment and with the help of the corioallantoic membrane (CAM) test on the incubated chicken egg tested for their giogenetic activity in vivo. It was shown that the reconstituted ternary angiotropin complexes or the in vitro synthesized ARNA I (sense or antisense) sequences had a toxic effect on the examined chicken embryos over a wide range of concentrations. Within the non-lethal concentration range, the results of the CAM assays showed an overall RNA-dependent regulation mechanism of angiotropin-induced angiogenesis. According to the invention, it was surprisingly found that not only the reconstituted ternary angiotropin complex comprising ARNA I (sense or sense) RNA (ARNA I (s)), copper (II) ions and native porcine calgranulin C showed angiogenic activity, but also that ARNA I (s) sequence combined only with copper (II) ions. This means that the protein constituent calgranulin C is not necessary for the angiogenic activity of the angiotropin complex. It was also surprisingly found that ternary complexes reconstituted with the ARNA I (antisense or antisense) sequence (ARNA I (as)) not only showed no angiogenic activity, but could even inhibit angiogenic processes in the test system. According to the invention it is therefore hen in a preferred embodiment to use the human ARNA I (s) sequence as an active ingredient for a therapeutic agent for inducing angiogenesis, for example in the context of wound healing, while in a further preferred embodiment the human ARNA I (as) sequence can be used as an active ingredient for a therapeutic agent for inhibiting pathogenic angiogenic processes, in particular tumor angiogenesis. In both of the aforementioned embodiments, the ARNA I (s) or (as) sequence according to the invention can be used together with metal ions and / or proteins, for example calgrainulin C, or its components.

Erfindungsgemäß wird erstmals eine mit humanem An giotropin assoziierbare Nucleinsäure bereitge stellt, bei der es sich um die humane ARNA I- Sequenz handelt. Die humane ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß aus einer humanen Plazenta-Gesamt- RNA mittels des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung der für die porcine ARNA I-Sequenz spezifischen Primer ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6) und ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7) isoliert und cloniert. Da bei wurde neben der humanen ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise 4) eine zweite, als humane Pseudo-ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) bezeichnete Sequenz isoliert und cloniert.According to the invention, for the first time one with a human character giotropin associable nucleic acid ready which is the human ARNA I- Sequence. The human ARNA I sequence was according to the invention from a total human placenta RNA using the RT-PCR method the specific for the porcine ARNA I sequence Primers ARNA I (forward) (SEQ ID No. 6) and ARNA I (reverse) (SEQ ID No. 7) isolated and cloned. because in addition to the human ARNA I sequence (SEQ ID No. 3 and 4) a second, as human Pseudo-ARNA-I sequence (SEQ ID No. 5) Sequence isolated and cloned.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter ARNA-Sequenzen Nucleinsäuren, insbesonde re RNAs, verstanden, die extrazellulär isoliert werden können und in nativer Form unter geeigneten Bedingungen zusammen mit einem Protein, insbesonde re ARP (Angiotropin related protein) oder Calgranu lin C oder ähnlichen Proteinen, und Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Calcium-, Natrium- oder Kali um-Ionen, einen ternären Komplex, insbesondere ei nen Angiotropin-Komplex, bilden, der angiogeneti sche Aktivität besitzt. Unter einer ARNA I-Sequenz wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA, verstan den, die bei Verfahren zur Aufreinigung von Angi otropin, beispielsweise unter Verwendung von Lek tin-induzierten Schweine-Leukocyten als Ausgangsma terial, nach verschiedenen Reinigungsschritten als einzige der bekannten ARNA-Sequenzen in der nach dem letzten Reinigungsschritt erhaltenen Fraktion, die noch angiogenetische Aktivität aufweist, spezi fisch angereichert vorliegt und von der deshalb an genommen wird, das sie die RNA-Form ist, die in den Angiotropin-Komplex eingebaut wird.In connection with the present invention who the nucleic acids under ARNA sequences, in particular re RNAs understood, which extracellularly isolated can be and in native form under suitable Conditions together with a protein, especially right ARP (Angiotropin related protein) or Calgranu lin C or similar proteins, and metal ions, especially copper, calcium, sodium or potash um ions, a ternary complex, especially egg form an angiotropin complex, the angiogeneti activity. Under an ARNA I sequence is in connection with the present invention a nucleic acid, especially an RNA, understood those involved in angi purification procedures otropin, for example using Lek tin-induced porcine leukocytes as a starting measure material, after various cleaning steps as only the known ARNA sequences in the after fraction obtained in the last purification step, that still has angiogenic activity, spec is enriched in fish and from there on is taken that it is the RNA form that is in the Angiotropin complex is incorporated.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be deutet der Begriff "angiogenetische Aktivität", dass eine Substanz die Fähigkeit aufweist, die Aus bildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsys tem zu induzieren oder zu verstärken.In connection with the present invention be does the term "angiogenic activity" mean that a substance has the ability to formation of new blood vessels by sprouting Capillaries from an existing vascular system to induce or reinforce the system.

Bei der Sequenzierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass sie einen Sequenzabschnitt enthält, der bezüglich seiner Län ge und seiner Sequenz vollkommen identisch mit der aus Lektin-stimulierten Schweine-Leukocyten iso lierten porcinen ARNA I-Sequenz ist. Die humane AR NA I-Sequenz enthält darüber hinaus einen human spezifischen 42 Nucleotide umfassenden Abschnitt, der in der porcinen Sequenz nicht nachgewiesen wur de und in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Die ersten 19 Nucleotide dieser 42 Nucleotide weisen besondere Humanspezifität auf und sind in beiden Orientie rungen in SEQ ID Nr. 14 und 15 dargestellt. Da die identifizierte humane ARNA I-Sequenz am 3'-Ende keinen Poly(A)-Tail enthielt, konnte nicht ermittelt werden, in welcher Orientierung die native Se quenz intra- oder extrazellulär vorliegt. Die nach stehend beschriebenen Sinn- beziehungsweise Anti sinn-Orientierungen der humanen ARNA I-Sequenz wur den daher willkürlich festgelegt. SEQ ID Nr. 2 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Antisinn- Orientierung. Die vollständige Nucleotidsequenz des humanen ARNA I-Moleküls in Sinn-Orientierung ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt, während SEQ ID Nr. 4 die vollständige Sequenz in Antisinn-Orientierung zeigt. Der 42 Nucleotide in Sinn-Orientierung um fassende Bereich (SEQ ID Nr. 1) befindet sich am 3'-Bereich der humanen ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3, Position 164 bis 205).When sequencing the human ARNA I sequence it was found according to the invention that they have a Contains sequence section that with respect to its Län ge and its sequence completely identical to the from lectin-stimulated porcine leukocytes iso porcine ARNA I sequence. The humane AR NA I sequence also contains a human specific 42 nucleotide section, that was not detected in the porcine sequence en and shown in SEQ ID No. 1. The first 19 Nucleotides of these 42 nucleotides have special ones Human specificity and are in both orientie is shown in SEQ ID No. 14 and 15. Since the identified human ARNA I sequence at the 3 'end contained no poly (A) tail could not be determined in which orientation the native Se intracellular or extracellular. The after meaning or anti described Orientations of the human ARNA I sequence were therefore arbitrarily determined. SEQ ID No. 2 shows the sequence of SEQ ID No. 1 in antisense Orientation. The complete nucleotide sequence of the human ARNA I molecule in sense orientation is in SEQ ID No. 3, while SEQ ID No. 4 the complete sequence in anti-sense orientation shows. The 42 nucleotides in sense orientation area (SEQ ID No. 1) is on 3 'region of the human ARNA-I sequence (SEQ ID No. 3, positions 164 to 205).

Eine Analyse der humanen ARNA I-Sequenz ergab, dass sie ausschließlich mit dem porcinen ARNA I (for ward)-Primer amplifiziert wurde, was sich am besten dadurch erklären lässt, dass es sich bei der ur sprünglich amplifizierten Nucleinsäuresequenz um ein circuläres Molekül handelt. Einen weiteren Hin weis darauf, dass es sich bei der ursprünglich amplifizierten Nucleinsäure um ein circuläres Mole kül handelt, liefert die erfindungsgemäß identifi zierte humane ARNA I-Nucleotidsequenz selbst. Die Sequenz ihres 5'-Endes und die Sequenz ihres 3'- Endes sind komplementär zueinander, das heißt, die Sequenzen des 5'-Endes und des 3'-Endes können sich unter geeigneten Bedingungen aneinanderlagern und somit zu einer Circularisierung des Moleküls füh ren. Es ist bekannt, dass bei der Prozessierung von prä-mRNAs circuläre RNAs erhalten werden können (Padgett et al. 1984; Reed und Maniatis 1985). Da bei werden die darin enthaltenen Introns in Form von Lariaten gespleißt. Die isolierte humane ARNA I-Sequenz stellt daher mit großer Wahrscheinlich keit die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA dar.Analysis of the human ARNA I sequence revealed that only with the porcine ARNA I (for ward) primer was amplified, which works best can be explained by the fact that the ur originally amplified nucleic acid sequence is a circular molecule. Another hint points out that the original amplified nucleic acid around a circular mole acts cool, provides the identifi according to the invention adorned human ARNA I nucleotide sequence itself Sequence of its 5 'end and the sequence of its 3' Endings are complementary to each other, that is, the Sequences of the 5 'end and the 3' end can be different under suitable conditions and thus lead to a circularization of the molecule ren. It is known that when processing pre-mRNAs circular RNAs can be obtained (Padgett et al. 1984; Reed and Maniatis 1985). because at the introns contained therein are in shape spliced by lariat. The isolated human ARNA I-sequence is therefore very likely the intron sequence of a longer pre-mRNA.

Unterstützt wird diese Vermutung durch die zweite isolierte Nucleinsäuresequenz, die humane Pseudo- ARNA I-Sequenz. Wie Untersuchungen von Sequenzüber einstimmungen zeigten, besteht diese erfindungsge mäße Nucleinsäure, bei der es sich vermutlich um eine prä-mRNA oder ein Teilstück einer größeren prä-mRNA handelt, aus zwei unterschiedlichen Ab schnitten und ist in SEQ ID Nr. 5 sowie schematisch in Fig. 3 dargestellt. Bei diesen beiden Abschnit te der Pseudo-ARNA I-Sequenz handelt es sich wahr scheinlich um Intron-(ARNA I(as))- und Exon-(L27a Exon II)-Sequenzen. Der 5' gelegene Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst die ersten 63 Nucleotide (SEQ ID Nr. 11) des 5'-Endes der humanen ARNA I-(Antisinn)-Sequenz (SEQ ID Nr. 4), denen sich die Sequenz des zweiten Exons der mRNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins und ein Poly(A)-Tail am 3'-Ende anschließen. Die ersten (das heißt 5' gelegenen) 23 Nucleotide der genann ten 63 Nucleotide entsprechen den ersten 23 Nucleo tiden der porcinen ARNA I(s)-Sequenz. Dies ist auf die Selbstkomplementarität des 5'- und 3'-Endes der humanen ARNA I(as) zurückzuführen. Gleiches gilt für die ARNA I(s). Die Nucleotide 43 bis 49 (je weils einschließlich) sind Bestandteile der Intron sequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz. Dabei stellen die 19 Nucleotide 24 bis 42 (jeweils einschließ lich) der genannten 63 Nucleotide der humanen ARNA I(as)-Sequenz die human-spezifische Antisinn- Nucleotidsequenz in SEQ ID Nr. 2 dar. Überraschenderweise sind die letzten (das heißt 3' gelegenen Positionen 50 bis 63 in SEQ ID Nr. 4 oder 11) 14 Nucleotide (also: 5'-GCU AAC AAA GUU UU-3') des 63 Nucleotide langen ARNA I(as)-Sequenzabschnittes (SEQ ID Nr. 11) innerhalb der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz homolog zu einem Teilabschnitt des zwei ten Exons der prä-mRNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins. Dieser 14 Nucleotide umfassende Ab schnitt der ARNA I(as)-Sequenz könnte daher Be standteil der 3'-Spleiß-Stelle dieser prä-mRNA sein.This assumption is supported by the second isolated nucleic acid sequence, the human pseudo-ARNA I sequence. As studies of sequence matching showed, this nucleic acid according to the invention, which is presumably a pre-mRNA or a section of a larger pre-mRNA, consists of two different sections and is shown in SEQ ID No. 5 and schematically in FIG shown. 3,. These two sections of the pseudo-ARNA I sequence are probably intron (ARNA I (as)) and exon (L27a exon II) sequences. The 5 'section of the pseudo-ARNA I sequence (SEQ ID No. 5) comprises the first 63 nucleotides (SEQ ID No. 11) of the 5' end of the human ARNA I (antisense) sequence (SEQ ID No. . 4), which are followed by the sequence of the second exon of the mRNA of the human ribosomal L27a protein and a poly (A) tail at the 3 'end. The first (i.e. 5 'located) 23 nucleotides of the 63 nucleotides mentioned correspond to the first 23 nucleotides of the porcine ARNA I (s) sequence. This is due to the self-complementarity of the 5 'and 3' end of human ARNA I (as). The same applies to ARNA I (s). Nucleotides 43 to 49 (each inclusive) are part of the intron sequence of the pseudo-ARNA-I sequence. The 19 nucleotides 24 to 42 (each inclusive) of the 63 nucleotides of the human ARNA I (as) sequence mentioned represent the human-specific antisense nucleotide sequence in SEQ ID No. 2. Surprisingly, the last (ie 3 ' positions 50 to 63 in SEQ ID No. 4 or 11) 14 nucleotides (ie: 5'-GCU AAC AAA GUU UU-3 ') of the 63 nucleotide-long ARNA I (as) sequence section (SEQ ID No. 11) within the human pseudo-ARNA I sequence homologous to a section of the second exon of the pre-mRNA of the human ribosomal L27a protein. This 14 nucleotide section of the ARNA I (as) sequence could therefore be part of the 3 'splice site of this pre-mRNA.

Ein weiterer, in SEQ ID Nr. 5 nicht dargestellter, Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz umfasst die in Fig. 3 dargestellten 5'-wärts von der 63 Nucleoti de umfassenden Sequenz gelegene ARNA(as)-Sequenz mit den Nucleotiden 64 bis 205 und die wiederum 5' davon gelegene L27a Exon I-Sequenz.Another, in SEQ ID NO. 5, not shown, portion of the pseudo-ARNA I sequence comprises in FIG. 3 represented the 5 'direction from the 63 de Nucleoti acid sequence located ARNA (as) sequence with nucleotides 64 to 205 and the L27a exon I sequence located 5 'therefrom.

Von ribosomalen Proteinen ist allgemein bekannt, dass diese entwicklungsbiologisch zu den ältesten Proteinen gehören und dass die ihnen zu Grunde lie genden Gene hochkonserviert sind. Vom humanen ribo somalen L27a-Protein ist außerdem bekannt, dass die mRNA dieses Proteins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark übe rexprimiert wird, so dass zu vermuten ist, dass dieses Protein an einer verstärkten Zellprolifera tion beteiligt ist (Frigerio et al. 1995). Obwohl dem der Pseudo-ARNA I-Sequenz zu Grunde liegenden Gen zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine eindeutige Funktion zugeordnet werden kann, kann man davon ausgehen, dass es sich mit großer Wahrscheinlich keit um ein Pseudogen des ribosomalen L27a-Gens handelt. Pseudogene sind insbesondere bei Genfami lien anzutreffen, deren Produkte häufig benötigt werden. Bei der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz ist weiterhin bemerkenswert, dass die darin enthaltende Teilsequenz der ARNA I-Sequenz als mutmaßliche Intron-Sequenz offensichtlich spezies-übergreifend konserviert ist, da dieser Sequenzbereich ebenfalls in der porcinen ARNA I-Sequenz enthalten ist. Durch die Pseudo-ARNA I-Sequenz wird die Vermutung unter mauert, dass die ARNA I-Sequenz die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA ist und daraus in circulä rer Form gespleißt wird. Die potentielle Generie rung einer zirkulären ARNA I(s) ist in Fig. 3 dar gestellt.It is generally known that ribosomal proteins are one of the oldest proteins in terms of developmental biology and that the genes on which they are based are highly conserved. It is also known from human ribo somal L27a protein that the mRNA of this protein is strongly expressed in carcinoma cells compared to the mRNA of other ribosomal proteins, so that it can be assumed that this protein is involved in an increased cell proliferation (Frigerio et al. 1995). Although the gene underlying the pseudo-ARNA I sequence cannot be assigned a clear function at the present time, it can be assumed that it is very likely that it is a pseudogen of the ribosomal L27a gene. Pseudogenes are particularly common in genealogies, whose products are often needed. In the case of the human pseudo-ARNA I sequence, it is also noteworthy that the partial sequence of the ARNA I sequence contained therein is obviously conserved across all species as a putative intron sequence, since this sequence region is also contained in the porcine ARNA I sequence. The pseudo-ARNA I sequence supports the assumption that the ARNA I sequence is the intron sequence of a longer pre-mRNA and is spliced from it in a circular form. The potential generation of a circular ARNA I (s) is shown in FIG. 3.

Erfindungsgemäß wird also eine, vorzugsweise iso lierte und vollständig gereinigte, Nucleinsäure be reitgestellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
According to the invention, a preferably isolated and completely purified nucleic acid is provided, selected from the group consisting of:

a) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta-Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern insbesondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder Nr. 7 dargestellten Nucleotidsequenzen, oder einem Fragment davon;a) a nucleic acid which is obtainable by means of reverse transcription of total placenta RNA with ARNA I-specific primers, in particular with those shown in SEQ ID No. 6 and / or No. 7 Nucleotide sequences, or a fragment thereof;
b) einer Nucleinsäure, die mindestens eine in SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 8, 10, 12 oder/und 14 darge stellte Nucleotidsequenz umfasst;b) a nucleic acid containing at least one in SEQ ID No. 1, 3, 5, 8, 10, 12 or / and 14 Darge posed nucleotide sequence;
c) einer Nucleinsäure, die zu einer Nucleinsäure nach a) bis b) komplementär ist, insbesondere einer Nucleinsäure mit mindestens einer der in SEQ ID Nr. 2, 4, 9, 11, 13 oder/und 15 dargestellten Nucleotidsequenz, oder einem Fragment davon;c) a nucleic acid leading to a nucleic acid according to a) to b) is complementary, in particular a nucleic acid with at least one of the in SEQ ID No. 2, 4, 9, 11, 13 or / and 15 Nucleotide sequence, or a fragment from that;
d) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Dele tion einer oder mehrerer Basen einer Nucleinsäu re nach a) bis c); undd) a nucleic acid obtainable by Substitution, addition, inversion and / or dele tion of one or more bases of a nucleic acid right according to a) to c); and
e) einer Nucleinsäure, die aufgrund der Degenera tion des genetischen Codes mit einer Nuclein säure nach a) bis d) oder einem Fragment davon hybridisiert.e) a nucleic acid that is due to the degenera tion of the genetic code with a nuclein acid according to a) to d) or a fragment thereof hybridized.

Die Nucleinsäure kann sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig vorliegen.The nucleic acid can be single-stranded or also double-stranded.

Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Bei spiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz oder eine cDNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Im Falle einer DNA-Sequenz sind bei dargestellten RNA- Sequenzen die mit U gekennzeichneten Uracilbasen durch T, also Thyminbasen, auszutauschen und umge kehrt. Die Nucleinsäure kann Teil eines längeren nativen Nucleinsäuremoleküls sein. Die Nucleinsäure kann sowohl als circuläres als auch als lineares Nucleinsäuremolekül vorliegen. Die Nucleinsäuren, dargestellt in den SEQ ID Nr. 1 bis 15, werden von der Erfindung in beiden Orientierungen 5' zu 3' und 3' zu 5' sowie als Sinn- und Antisinn-Strang er fasst. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ur sprungs sein, das heißt, sie kann sowohl extra- als auch intrazellulär aus Zellen, Geweben oder Organen eines Säugerorganismus isoliert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein. Außerdem kann die Nucleinsäure sowohl mit Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Natrium-, Kalium- oder Calcium-Ionen, als auch mit Proteinen, wie Calgranulin C oder ARP, as soziiert vorliegen.The nucleic acid can be a DNA sequence play part of a genomic DNA sequence or a cDNA sequence, or an RNA sequence, for example an mRNA sequence or a part thereof. in the In the case of a DNA sequence, the RNA Sequences the uracil bases marked with U. by T, i.e. thymine bases, and vice versa versa. The nucleic acid can be part of a longer one native nucleic acid molecule. The nucleic acid can be both circular and linear Nucleic acid molecule are present. The nucleic acids represented in SEQ ID Nos. 1 to 15, by the invention in both orientations 5 'to 3' and 3 'to 5' and as a sense and antisense strand summarizes. The nucleic acid can both natural Ur be jump, that is, it can be both extra and also intracellularly from cells, tissues or organs of a mammalian organism can be isolated, as well be of synthetic origin. In addition, the Nucleic acid with both metal ions, in particular Copper, sodium, potassium or calcium ions, as also with proteins such as calgranulin C or ARP, as socially available.

Die Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäu ren, die beispielsweise durch Substitution, Addi tion, Inversion und/oder Deletion einer oder meh rerer Basen einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuren, die als Mutanten, Derivate oder funktionellen Äqui valente einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure be zeichnet werden können. Die Sequenz der Nucleinsäu ren kann beispielsweise gezielt modifiziert werden, um innerhalb der Nucleinsäuresequenz geeignete Restriktions-Schnittstellen bereitzustellen oder nicht erforderliche Nucleinsäuresequenzen oder Restriktions-Schnittstellen zu entfernen. Dabei werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in Plas miden inseriert und mittels Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletio nen oder Substitutionen, wie Transitionen und Transversionen, sind beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "primer repair"-Verfahren so wie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren ge eignet (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). Sequenz veränderungen lassen sich auch durch Anlagerung na türlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen. Beispiele für synthetische Nucleinsäuresequenzen sind Adaptoren oder Linker, die u. a. auch zur Verknüpfung von Nucleinsäure-Fragmenten an die se Fragmente angefügt werden.The invention also includes modified nucleic acid ren, for example, by substitution, Addi tion, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid according to the invention are available, that means also nucleic acids, the as mutants, derivatives or functional equi be a nucleic acid according to the invention can be drawn. The sequence of the nucleic acid ren can be specifically modified, for example, to be appropriate within the nucleic acid sequence To provide restriction interfaces or unnecessary nucleic acid sequences or Remove restriction interfaces. there the nucleic acids according to the invention are in Plas advertised and using the standard procedure of Microbiology / molecular biology of a mutagenesis or a sequence change by recombination subjected. To create insertions, deletio or substitutions such as transitions and Transversions, for example, are procedures for in vitro mutagenesis, "primer repair" method so such as restriction and / or ligation procedures suitable (see Sambrook et al., 1989, Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). sequence Changes can also be made by adding na natural or synthetic nucleic acid sequences to reach. Examples of synthetic nucleic acid sequences are adapters or linkers that u. a. also to link nucleic acid fragments to the fragments are added.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäu ren, die mit einer der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren nach a) bis d) hybridisieren. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwen dete Ausdruck "Nucleinsäure, die mit einer Nuclein säure nach a) bis d) hybridisiert" bedeutet eine Nucleinsäure, die unter mäßig stringenten Bedingun gen mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) hybridi siert. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit einer radioaktiven Gensonde in einer Hybridisie rungslösung (25% Formamid; 5 × SSPE; 0,1% SDS; 5 × Denhardt-Lösung; 50 µg/ml Heringsperma-DNA; bezüg lich Zusammensetzung der Einzelkomponenten vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Labo ratory Press, NY, USA) 20 Stunden bei 37°C erfol gen. Anschließend wird unspezifisch gebundene Sonde durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C entfernt. Vorzugsweise werden die Fil ter mit 0,5 × SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 42°C gewaschen.The present invention also encompasses nucleic acid ren, with one of the above Hybridize nucleic acids according to a) to d). The one in Use in connection with the present invention dete expression "nucleic acid with a nuclein acid hybridizes according to a) to d) "means one Nucleic acid that is under moderately stringent conditions gene with a nucleic acid according to a) to d) hybridi Siert. For example, the hybridization with a radioactive gene probe in a hybridisie solution (25% formamide; 5 × SSPE; 0.1% SDS; 5 × Denhardt's solution; 50 µg / ml herring sperm DNA; bezüg Lich composition of the individual components cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Labo ratory Press, NY, USA) 20 hours at 37 ° C Then unspecifically bound probe by washing the filter several times in 2 × SSC / 0.1% SDS removed at 42 ° C. Preferably, the fil ter with 0.5 × SSC / 0.1% SDS, particularly preferably with Washed 0.1 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.

Zur Charakterisierung der erfindungsgemäß identifi zierten humanen ARNA I-Sequenz wurde von dieser Nucleinsäure unter Verwendung des MFOLD-Programms ein Modell der Sekundärstruktur modelliert. Das MFOLD-Programm, Version 2 (Zuker 1989; Jaeger et al. 1989; Jaeger et al. 1990) liefert Aussagen über die Strukturen von Nucleinsäuren mit der geringsten freien Enthalpie. Ebenso wurden von allen bekannten ARNA-Sequenzen einschließlich der bekannten porci nen ARNA-Sequenzen Modelle der Sekundärstrukturen erstellt, um mögliche Strukturhomologien zwischen diesen Nucleinsäuren zu bestimmen und somit wesent liche funktionelle Bereiche der Nucleinsäuren zu charakterisieren.To characterize the identifi graced human ARNA I sequence was from this Nucleic acid using the MFOLD program modeled a model of the secondary structure. The MFOLD program, version 2 (Zuker 1989; Jaeger et al. 1989; Jaeger et al. 1990) provides statements about the structures of nucleic acids with the lowest free enthalpy. Likewise, were known by all ARNA sequences including the known porci ARNA sequences models of secondary structures created to identify possible structural homologies between to determine these nucleic acids and thus essential functional areas of the nucleic acids characterize.

Die erfindungsgemäß vorgenommene Computer- Modellierung der in Fig. 1 dargestellten Sekundär struktur der humanen ARNA I(s)-Sequenz zeigte, dass diese Nucleinsäure aufgrund ihrer Vielzahl von se quenzkomplementären Bereichen eine hochsymmetri sche, über weite Sequenzabschnitte hinweg dop pelsträngige Sekundärstruktur bildet, die insbeson dere durch zwei Kleeblattstrukturen gekennzeichnet ist. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, unterscheidet sich die zweite Kleeblattstruktur von der ersten dadurch, dass sie das offene 5'-3'-Ende des Nuc leinsäuremoleküls enthält. Aus der Fig. 1 ist e benfalls ersichtlich, dass, wie vorstehend be schrieben, die Sequenz des 3'-Endes der humanen AR NA I-Sequenz komplementär zur Sequenz des 5'-Endes ist. Diese Sequenzkomplementarität ermöglichte auch die Amplifikation der humanen ARNA I-Sequenz mit nur einem Primer.The computer modeling according to the invention of the secondary structure of the human ARNA I (s) sequence shown in FIG. 1 showed that due to its large number of sequence complementary regions, this nucleic acid forms a highly symmetrical secondary structure which is double-stranded over large sequence sections, in particular which is characterized by two cloverleaf structures. As can be seen from Fig. 1, the second cloverleaf structure differs from the first in that it contains the open 5'-3 'end of the nucleic acid molecule. It can also be seen from FIG. 1 that, as described above, the sequence of the 3 'end of the human AR NA I sequence is complementary to the sequence of the 5' end. This sequence complementarity also made it possible to amplify the human ARNA I sequence with only one primer.

Ein Vergleich der erstellten Sekundärstruktur mit denen anderer bekannter ARNA-Sequenzen zeigte, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus- Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere die in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen aufweisen, die je weils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife be findet. Diese bei allen Sekundärstrukturmodellen der bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadel schleife stellt vermutlich die Bindungsdomäne die ser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein dar. Die in der Haarnadel schleife enthaltene Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' be findet sich in einem Sequenzabschnitt, der Homolo gien zur Sequenz des Hammerhead-Ribozyms aufweist. Das Hammerhead-Ribozym ist Bestandteil sich selbst spleißender, circulärer, viraler RNA-Moleküle, die sich entweder allein oder in Abhängigkeit von Hel fer-Viren replizieren (Haseloff und Gerlach 1988). Die konservierte Konsensus-Sequenz 5'- CUGANGA(N)_xGAAAC des Hammerhead-Ribozyms ist teil weise auch in der humanen ARNA I-Sequenz (Sinnori entierung) (5'-CUG GAU UGA AAA G-3', SEQ ID Nr. 8) enthalten. Das deutet darauf hin, dass das ARNA I- Molekül, wie auch die anderen ARNA-Moleküle, in diesem Sequenzabschnitt neben der Proteinbindungs domäne einen weiteren funktionellen Bereich ent hält, der ribozymatische Aktivität besitzt.A comparison of the secondary structure created with that of other known ARNA sequences showed that all ARNA sequences have the common consensus sequence 5'-CUG-3 ', in particular the sequences shown in SEQ ID Nos. 12 and 13, each of which only occurs in a sequence orientation and is always in the area of a hairpin loop. This hairpin loop found in all the secondary structure models of the known ARNA sequences presumably represents the binding domain of these ARNA sequences to ARP or calgranulin C or a similar protein. The consensus sequence 5'-CUG-3 'contained in the hairpin loop is found in a sequence section that has homology to the sequence of the hammerhead ribozyme. The hammerhead ribozyme is a component of self-splicing, circular, viral RNA molecules that replicate either alone or as a function of helper viruses (Haseloff and Gerlach 1988). The conserved consensus sequence 5'-CUGANGA (N) _x GAAAC of the hammerhead ribozyme is partly also in the human ARNA I sequence (sense orientation) (5'-CUG GAU UGA AAA G-3 ', SEQ ID No. 8) included. This indicates that the ARNA I molecule, like the other ARNA molecules, contains in this sequence section, in addition to the protein binding domain, a further functional region which has ribozyme activity.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Nucleinsäu re, die in ihrer Sekundärstruktur eine Haarnadel schleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', ins besondere mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 ge zeigten Sequenzen ausbildet. Die Erfindung betrifft ferner eine Nucleinsäure, deren in der Sekundärstruktur ausgebildete Haarnadelschleife mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen die Bindung der Nucleinsäure an ein Protein, insbesondere ein Angiotropin related protein-Molekül vermittelt. The invention therefore also relates to a nucleic acid re, which in its secondary structure is a hairpin loop with the consensus sequence 5'-CUG-3 ', ins especially with one of the ge in SEQ ID Nos. 12 and 13 showed sequences trained. The invention relates also a nucleic acid, whose in the Secondary structure trained hairpin with one of those shown in SEQ ID Nos. 12 and 13 Sequences the binding of the nucleic acid to a Protein, especially an angiotropin related protein molecule mediates.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine erst malig nachgewiesene Bindungsdomäne von Nucleinsäu ren, insbesondere ARNA-Nucleinsäuren, zur Bindung an Proteine, insbesondere ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, die gekennzeichnet ist durch die Ausbildung einer charakteristischen Haar nadelschleife mit der jeweils nur in einer Sequenz orientierung auftretenden Konsensus-Sequenz 5'-CUG- 3', insbesondere einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr. 12 oder 13, wobei letztere gegebenenfalls eine höhere Spezifität zur Proteinbindungsdomäne ARP beziehungsweise Cal C aufweisen.The present invention also relates to a first maligned binding domain of nucleic acid ren, especially ARNA nucleic acids, for binding of proteins, especially ARP or calgranulin C or similar proteins that are labeled through the formation of a characteristic hair needle loop with only one sequence at a time orientation consensus sequence 5'-CUG- 3 ', in particular a sequence selected from SEQ ID No. 12 or 13, the latter being optional a higher specificity to the protein binding domain Have ARP or Cal C.

Die Tatsache, dass die vorstehend beschriebene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen, also die ver mutliche Bindungsdomäne an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein, in der Sekundärstruktur unterschiedlicher ARNA-Sequenzen vorhanden ist, weist darauf hin, dass ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine Moleküle für den inter- und/oder intrazellulären Transport der verschiedenen, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA- Bestandteile sind. Dies bietet erfindungsgemäß die Möglichkeit, den Angiotropin-Proteinbestandteil ARP oder ähnliche Proteine, insbesondere andere S100- Proteine, auch für RNA-Moleküle, die natürlicher weise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziiert sind, als Transportmoleküle zu nutzen.The fact that the one described above Hairpin loop of the ARNA sequences, i.e. the ver courageous binding domain to ARP or calgranulin C or a similar protein, in the secondary structure different ARNA sequences is present, indicates that ARP or Calgranulin C or Similar proteins molecules for the inter and / or intracellular transport of the different, with RNA associated with the angiotropin complex Components are. According to the invention, this offers Possibility of ARP, the angiotropin protein component or similar proteins, especially other S100- Proteins, even for RNA molecules that are more natural wise not associated with the angiotropin complex are to be used as transport molecules.

Erfindungsgemäß können RNA-Moleküle mit enzymati scher Aktivität, wie zum Beispiel Ribozyme, oder Nucleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle, die die Transkriptionsprodukte von Genen von potentiellem therapeutischem oder diagnostischem Interesse darstellen, mit den erfindungsgemäßen ARNA- spezifischen Sequenzen versehen werden, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarna delschleife zur Bindung an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, insbesondere andere S100- Proteine, führen, die der bei ARNA-Sequenzen nach gewiesenen entspricht. Vorzugsweise werden solche Nucleinsäuren, die eine ARNA-spezifische Haarnadel struktur zur Bindung an ARP oder ähnliche Trans portproteine aufweisen, unter Verwendung herkömmli cher synthetischer oder gentechnischer Verfahren (vgl. Sambrook et al. 1989) hergestellt. Soll die zu transferierende Nucleinsäure ribozymatische Ak tivität aufweisen, kann die angelagerte Haarnadel schleifen-Sequenz gegebenenfalls so modifiziert werden, dass sie eine stärkere Homologie zur Kon sensus-Sequenz von Hammerhead-Ribozymen als die er findungsgemäße Haarnadelschleife der humanen ARNA I-Sequenz aufweist. Soll die zu transferierende Nucleinsäure keine ribozymatische Aktivität aufwei sen, kann die Sequenz zur Ausbildung einer Haarna delschleife so modifiziert werden, dass die für die Ribozym-Aktivität relevanten Nucleotide gegen Nuc leotide ausgetauscht werden, die zu einer Blockie rung der Ribozym-Aktivität führen. Solche Sequenz modifikationen können mit Hilfe üblicher gentechni scher Verfahren, beispielsweise Verfahren der in vitro-Mutagenese, erfolgen.According to the invention, RNA molecules with enzymati activity, such as ribozymes, or Nucleic acids, for example RNA molecules that the Transcription products of genes of potential represent therapeutic or diagnostic interest, with the ARNA- specific sequences can be provided under suitable conditions for the formation of a Haarna del loop for binding to ARP or Calgranulin C or similar proteins, especially other S100- Proteins, which follow that of ARNA sequences indicated corresponds. Such are preferred Nucleic acids that are an ARNA-specific hairpin structure for binding to ARP or similar trans have port proteins using conventional synthetic or genetic engineering processes (see Sambrook et al. 1989). Should the nucleic acid to be transferred riboZymatic Ak activity, the attached hairpin loop sequence modified if necessary that they have a stronger homology to Kon sensus sequence of hammerhead ribozymes as the he hairpin loop of the human ARNA according to the invention I sequence. Should be the one to be transferred Nucleic acid has no ribozyme activity sen, the sequence for the formation of a Haarna delschleife be modified so that for the Ribozyme activity relevant nucleotides against Nuc leotides are exchanged, leading to a blockage tion of ribozyme activity. Such sequence modifications can be made using conventional gene technology processes, for example processes of the vitro mutagenesis.

Nach Bildung eines ternären Komplexes mit ARP und Metall-Ionen, beispielsweise Kupfer-Ionen, können die so hergestellten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren gezielt in solche Zellen und/oder Ge webe eingeschleust werden, die natürliche Zielzellen oder Zielgewebe für Angiotropin darstellen, zum Beispiel Endothelzellen. Sollen die so hergestell ten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren spezifisch in andere Zielzellen eingeführt werden, werden zur Bildung ternärer Komplexe andere Protei ne, beispielsweise andere S100-Proteine, verwendet, die gegebenenfalls andere Zielzell-Spezifitäten aufweisen. Erfindungsgemäß können für die Assozia tion der Nucleinsäure mit dem Protein solche Prote ine verwendet werden, die eine Bindung an die Nuc leinsäure ermöglichen. Dies können Proteine sein, die dieselbe Bindungsdomäne an RNAs wie ARP oder Cal C besitzen. Diese Proteine können an eine RNA binden, die innerhalb einer Haarnadelschleife ent weder die Sequenzabfolge 5'-CUG-3' oder die Se quenzabfolge der SEQ ID Nr. 12 oder der SEQ ID Nr. 13 aufweist. Diese Proteine können noch zusätzli che, das heißt von ARP beziehungsweise Cal C ver schiedene Sequenzdomänen aufweisen. Diese weiteren Sequenzdomänen können eine von ARP und Cal C abwei chende Zielzellspezifität vermitteln.After formation of a ternary complex with ARP and Metal ions, for example copper ions, can the so produced or modified Target nucleic acids into such cells and / or Ge weave into the natural target cells or target tissue for angiotropin to Example endothelial cells. Should they be made like this th or modified nucleic acids specifically introduced into other target cells become another protein to form ternary complexes ne, for example other S100 proteins, used the possibly other target cell specificities exhibit. According to the invention for the association tion of the nucleic acid with the protein such protein be used which bind to the Nuc enable linseic acid. These can be proteins that have the same binding domain to RNAs as ARP or Own Cal C. These proteins can bind to an RNA tie that ent within a hairpin loop neither the sequence sequence 5'-CUG-3 'or the Se Sequence of SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 13 has. These proteins can be added che, that is from ARP or Cal C ver have different sequence domains. These others Sequence domains can differ from ARP and Cal C convey appropriate target cell specificity.

Aufgrund dieser gezielt modifizierten Zielzellspe zifität kann der gebildete Nucleinsäurekomplex spe zifisch an die jeweils gewünschten Zellen andocken, in diese penetrieren und anschließend die gewünsch te Aktivität entfalten. Der gebildete Nucleinsäure komplex kann in vivo oder in vitro in beliebige eu karyontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, ins besondere jedoch Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, eingeschleust werden.Because of this specifically modified target cell spectrum The nucleic acid complex formed can be specific dock specifically to the desired cells, penetrate into them and then the desired Develop activity. The nucleic acid formed complex can in vivo or in vitro in any eu caryotic cells, cell cultures or tissues, ins special however cells and tissues of mammals and Birds to be smuggled in.

Nach Einführung solcher modifizierten Nucleinsäuren können in den Zellen beispielsweise spezifische Nucleinsäuren oder Gene ausgeschaltet werden, zum Beispiel über eine ribozymatische Aktivität der eingeschleusten Nucleinsäuren, über einen Anti sense-Mechanismus oder einen Cosuppressions-Effekt. Es können auch Gene eingeführt werden, die vorher in diesen Zellen nicht vorhanden waren beziehungs weise deren Funktion in diesen Zellen gestört war. So ist zum Beispiel eine gezielte Tumortherapie möglich, indem Zielzellen durch diese spezifisch erkennende Nucleinsäurekomplexe erkannt und be kämpft werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eig net sich insbesondere auch zur somatischen Genthe rapie. Ebenso können auch Gene in Zellen einge führt, die als Reporter-Gene fungieren, beispiels weise um solche Zellen zu markieren oder nachzuwei sen.After the introduction of such modified nucleic acids can be specific in the cells for example Nucleic acids or genes are turned off for Example of a ribozyme activity of the injected nucleic acids, via an anti sense mechanism or a cosuppression effect. Genes can also be introduced that previously were not present in these cells as their function was disturbed in these cells. For example, targeted tumor therapy possible by targeting through this specifically recognizing nucleic acid complexes recognized and be to be fought. The method according to the invention is also particularly related to somatic genthe therapy. Genes can also be inserted into cells leads that act as reporter genes, for example wise to mark or detect such cells sen.

Dem therapeutischen Einsatz von Ribozymen standen in der Vergangenheit prinzipiell zwei Probleme ge genüber. Zum einen sind RNA-Moleküle allgemein sehr Hydrolyse-empfindlich, was zu einer relativ kurzen Halbwertszeit der Moleküle führt. Zum anderen war in der Vergangenheit die Effizienz bei herkömmli chen Verfahren zur Transfektion von RNA-Molekülen sehr gering. Im Stand der Technik sind jedoch meh rere Verfahren beschrieben, mit deren Hilfe die ge nannten Probleme überwunden werden können. Bei spielsweise kann durch eine chemische Modifikation des Ribose-Phosphat-Gerüstes eine RNA so stabili siert werden, dass sie gegenüber Hydrolyse größere Resistenz zeigt (Perreault et al., 1991; Yang et al. 1992; Heidenreich et al. 1993), wobei insbeson dere 2'-OH-Gruppen durch andere funktionelle Grup pen, beispielsweise Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder O-Methylgruppen substituiert werden. Die Effizienz der Transfektion von RNAs kann beispielsweise da durch erhöht werden, dass die Transfektion über Li posomen vermittelt wird, insbesondere solche, die kationische Lipide und neutrale Phospholipide um fassen (Felgner et al. 1993). Mit Hilfe solcher Li posomen können RNA-Moleküle intrazellulär einge schleust werden (Akhtar et al. 1991).The therapeutic use of ribozymes stood in the past there were basically two problems genüber. For one thing, RNA molecules are generally very good Hydrolysis sensitive, resulting in a relatively short Half-life of the molecules leads. Second was in the past, the efficiency of conven Chen procedure for the transfection of RNA molecules very low. However, there are more in the prior art rere procedures described, with the help of the ge mentioned problems can be overcome. at for example, by chemical modification of the ribose-phosphate scaffold an RNA so stabili that they are larger than hydrolysis Shows resistance (Perreault et al., 1991; Yang et al. 1992; Heidenreich et al. 1993), in particular their 2'-OH groups by other functional groups pen, for example amino, fluoro-, O-allyl or O-methyl groups can be substituted. The efficiency the transfection of RNAs can, for example be increased by transfection over Li posomen is mediated, especially those that cationic lipids and neutral phospholipids summarize (Felgner et al. 1993). With the help of such Li Posomes can insert RNA molecules intracellularly are smuggled (Akhtar et al. 1991).

Bevor die erfindungsgemäß modifizierten Nucleinsäu ren in Zielzellen eingeführt werden, können sie da her gegebenenfalls chemisch modifiziert werden, in dem beispielsweise eine oder mehrere funktionelle 2'-OH-Gruppen des Zucker-Phosphat-Gerüsts gegen an dere funktionelle Gruppen, beispielsweise eine Ami no-, Fluoro-, O-Allyl- oder O-Methylgruppe ausge tauscht werden, um die Nucleinsäure zu stabilisie ren. Die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen kom plexierten Nucleinsäuren können gegebenenfalls un ter Verwendung von Liposomen in Zielzellen einge führt werden, um die Effizienz des Transports in die gewünschten Zielzellen zu verbessern. Selbst verständlich erfasst die Erfindung auch natürli cherweise in Zellen stattfindende posttranskriptio nale Modifikationen.Before the nucleic acid modified according to the invention they can be introduced into target cells forth may be chemically modified in for example one or more functional ones 2'-OH groups of the sugar-phosphate framework against their functional groups, for example an Ami no, fluoro, O-allyl or O-methyl group exchanged to stabilize the nucleic acid ren. The com with metal ions and / or proteins plexed nucleic acids can optionally un ter use of liposomes in target cells be led to the efficiency of transportation in to improve the desired target cells. itself understandably, the invention also includes natural post-transcription that usually occurs in cells nale modifications.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Ver fahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eukaryontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere Zellen und Gewebe von Säugern und Vö geln, in vitro oder in vivo umfassend die folgenden Schritte:
The present invention therefore relates to a method for transporting a nucleic acid molecule into eukaryotic cells, cell cultures or tissues, in particular cells and tissues from mammals and birds, in vitro or in vivo comprising the following steps:

- Modifikation des zu transportierenden Nucleinsäu remoleküls, das natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex und/oder ähnlichen Komplexen im Zusammenhang steht, durch Anlagerung von Se quenzen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole küls, die unter geeigneten Bedingungen zur Aus bildung einer Haarnadelschleife mit der Konsen sus-Sequenz 5'-CUG-3' geeignet sind;- Modification of the nucleic acid to be transported remolecule that naturally does not match the Angiotropin complex and / or similar complexes related, by attachment of Se sequences of a nucleic acid mole according to the invention küls, which under suitable conditions to Aus formation of a hairpin with the cones sus sequence 5'-CUG-3 'are suitable;
- Herstellung eines ternären Komplexes durch in vitro Zugabe von Metall-Ionen und mindestens ei nem Protein zu dem modifizierten Nucleinsäuremo lekül;- Production of a ternary complex by in Vitro addition of metal ions and at least one egg a protein to the modified nucleic acid mo lekül;
- Applikation des hergestellten ternären Komplexes auf Zellen oder Gewebe, in die das modifizierte Nucleinsäuremolekül eingebracht werden soll.- Application of the ternary complex produced on cells or tissues in which the modified Nucleic acid molecule is to be introduced.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eine eukaryontische Zelle, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranu lin C oder ein ähnliches Protein, insbesondere ein das Bindemotiv von ARP oder Calgranulin C für das Nucleinsäuremolekül aufweisendes Protein ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung des ternären Komplexes Metallionen wie Cu²⁺-, Mg²⁺-, Ca²⁺-, Na⁺-, K⁺- oder Zn²⁺-Ionen verwendet. In noch einer weiteren bevorzugten Aus führungsform der Erfindung ist das modifizierte Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit enzymatischer Aktivität. In a preferred embodiment, the present invention relates to a method for transporting a nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, the protein being an ARP molecule, Calgranulin C or a similar protein, in particular a protein having the binding motif of ARP or Calgranulin C for the nucleic acid molecule , In a further preferred embodiment, metal ions such as Cu ²⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ or Zn ²⁺ ions are used to produce the ternary complex. In yet another preferred embodiment of the invention, the modified nucleic acid molecule is a molecule with enzymatic activity.

Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, die ARNA für diagnostische Zwecke spezifisch zu markieren. Dies kann beispielsweise mit einem radioaktiven Label, mit Digoxigenin oder mit fluoreszierenden Markern erfolgen. Mittels radioaktiv und Digoxigenin mar kierter ARNA können beispielsweise in situ Hybridi sierungen durchgeführt werden, die eine zelluläre Lokalisation der ARNA nach der zellulären Aufnahme ermöglichen würden. Eine mit fluoreszierenden Sub stanzen markierte ARNA kann beispielsweise in kul tivierten Zellen nach deren zellulärer Aufnahme mikroskopisch sowohl zeitlich als auch räumlich verfolgt werden.According to the invention, the ARNA for to specifically mark diagnostic purposes. This for example, with a radioactive label, with digoxigenin or with fluorescent markers respectively. Using radioactive and digoxigenin mar cated ARNA can, for example, in situ hybridi sations that are cellular Localization of the ARNA after cellular uptake would enable. One with fluorescent sub punch marked ARNA can for example in cul activated cells after their cellular uptake microscopically both temporally and spatially be followed.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vor liegenden Erfindung sieht daher die Verwendung von ARNA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsge mäßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' enthaltenden Haar nadelstruktur fähig sind, zur Modifikation von na türlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten Nucleinsäuren zur Herstellung von Di agnostika und Therapeutika vor. Die so modifizier ten Nucleinsäuren lassen sich als Diagnostika oder Therapeutika für spezifische Zellen oder Gewebe verwenden, indem sie an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Transportmoleküle gebunden und über diese Transportmoleküle in die zu behandelnden Zielzellen eingeschleust werden.A particularly preferred embodiment of the front lying invention therefore sees the use of ARNA-specific sequences, ie the fiction moderate nucleic acids, especially sequences that under suitable conditions for training a the hair containing 5'-CUG-3 'consensus sequence are able to modify na naturally not with the angiotropin complex associated nucleic acids for the preparation of Di agnostics and therapeutics. The so modified nucleic acids can be used as diagnostics or Therapeutic agents for specific cells or tissues use by connecting to ARP or Calgranulin C or similar transport molecules bound and via this Transport molecules into the target cells to be treated be smuggled in.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter Diagnostika beliebige Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Ab wesenheit erkennen können und insbesondere Rück schlüsse auf Krankheitszustände geben können. Di agnostika weisen häufig erkennende und markierende Funktionen auf.In connection with the present invention who the meaning of any substance under diagnostics, which specifically the existence of conditions Processes or substances or their ab being able to recognize essence and especially re can give conclusions about disease states. di agnostics often have recognizing and marking Functions.

Unter dem Begriff Therapeutika werden insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder prophylak tisch oder krankheitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krankheitszustände zu vermeiden, zu lin dern oder zu beseitigen.The term therapeutic agents in particular understood such substances that are either prophylactic table or accompanying illness can, to avoid disease states, to lin change or eliminate.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter Krankheiten auch Zustände wie unnatürli che Gemütszustände, Schwangerschaften, Alterser scheinungen, Entwicklungsstörungen oder ähnliches verstanden.In connection with the present invention who conditions such as unnatural among diseases mood, pregnancy, aging symptoms, developmental disorders or the like Roger that.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorlie genden Erfindung sieht daher die Verwendung von AR NA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsgemä ßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die un ter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere eine Se quenz dargestellt in SEQ ID Nr. 12 oder 13, enthal tenden Haarnadelstruktur fähig sind, zur Isolierung von Proteinen vor, die ähnlich wie ARP an solche Haarnadel-Strukturen binden können. Bei solchen Proteinen kann es sich beispielsweise um andere Vertreter der S100-Proteine handeln, die gegebenen falls andere Zellspezifitäten aufweisen als ARP.Another preferred embodiment of the present The present invention therefore provides the use of AR NA-specific sequences, ie the sequence according to the invention ß nucleic acids, especially sequences that un suitable conditions for training a Consensus sequence 5'-CUG-3 ', especially one Se sequence shown in SEQ ID No. 12 or 13, incl tendency hairpin structure are capable of isolation of proteins that are similar to ARP to those Can bind hairpin structures. In such Proteins can be others, for example Representatives of the S100 proteins act as given if cell specificities are different from ARP.

Erfindungsgemäß wurde die Funktion der erfindungs gemäßen humanen ARNA I-Sequenz in vivo unter Verwendung des Chorioallantois-Membran-Tests am bebrü teten Hühnerei bestimmt. Der Chorioallantois- Membran-Test stellt ein einfaches Testsystem zur Untersuchung von Neovaskularisierungs-Prozessen dar. Eine angiogenetische Wirkung lässt sich anhand der Ausbildung von Blutgefäßen leicht nachweisen. In vitro synthetisierte Angiotropin-RNA wurde mit ARP (Calgranulin C) und CuCl₂ zu einem ternären An giotropin-Komplex rekonstituiert und auf die frei gelegte Membran appliziert. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären Angiotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I (Sense- beziehungsweise Antisense-)-Sequenzen über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg auf die Hühnerembryonen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-letalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA- abhängigen Regulationsmechanismus der Angiotropin- induzierten Angiogenese. Erfindungsgemäß wurde ü berraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus AR NA I(s)-RNA, Kupfer(II)-Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die ARNA I(s)-Sequenz in Kombination mit Kupfer(II)-Ionen, jedoch ohne den Proteinbe standteil Calgranulin C. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass ARNA I(Antisense)-Sequenzen (ARNA I(as)) enthaltende ternäre Komplexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar die Angiogenese hemmen konnten.According to the invention, the function of the human ARNA I sequence according to the invention was determined in vivo using the chorioallantoic membrane test on the broiled egg. The chorioallantoic membrane test is a simple test system for examining neovascularization processes. An angiogenic effect can easily be demonstrated by the formation of blood vessels. Angiotropin RNA synthesized in vitro was reconstituted with ARP (Calgranulin C) and CuCl ₂ to a ternary angiotropin complex and applied to the exposed membrane. It was shown that the reconstituted ternary angiotropin complexes or the in vitro synthesized ARNA I (sense or antisense) sequences had a toxic effect on the chicken embryos over a wide concentration range. Within the non-lethal concentration range, the results of the CAM assays showed an RNA-dependent regulatory mechanism for angiotropin-induced angiogenesis. According to the invention, it was surprisingly found that not only the reconstituted ternary angiotropin complex consisting of AR NA I (s) RNA, copper (II) ions and native porcine calgranulin C showed angiogenic activity, but also the ARNA I (s) sequence in combination with copper (II) ions, but without the protein constituent calgranulin C. It was also surprisingly found that ternary complexes containing ARNA I (antisense) sequences (ARNA I (as)) not only showed no angiogenic activity, but in Test system could even inhibit angiogenesis.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher vorgesehen, die erfindungsgemäße ARNA I-Sequenz als Wirkstoff zur Modulation an giogenetischer Prozesse einzusetzen.In a further preferred embodiment of the Invention is therefore provided, the invention ARNA I sequence as an active ingredient for modulation to use giogenetic processes.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I(s)-Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Induzie rung angiogenetische Prozesse, insbesondere zur Wundheilung, verwendet. In einer vorteilhaften Aus gestaltung kann das ARNA I(s)-Molekül in der Trans plantationschirurgie eingesetzt werden, um durch die verstärkte Vaskularisierung die Integration des Transplantats zu beschleunigen und die Bildung i schämischer Nekrosen zu vermeiden. In einer weite ren vorteilhaften Ausgestaltung kann das ARNA I(s)- Molekül zur Induzierung der Neovaskularisierung von Herzkranzgefäßen verwendet werden. Dadurch läßt sich eine Coronarangioplastie unter Verwendung ei nes Ballonkatheders oder mittels einer Bypass- Operation vermeiden. Erfindungsgemäß kann die ARNA I(s)-Sequenz entweder in Kombination mit Kup fer(II)-Ionen und Calgranulin C oder nur in Kombi nation mit Kupfer(II)-Ionen, das heißt ohne das Protein Calgranulin C, eingesetzt werden.In a particularly preferred embodiment of the Invention is the ARNA I (s) sequence as an active ingredient for the production of a therapeutic agent for induction tion of angiogenic processes, especially for Wound healing, used. In an advantageous way the ARNA I (s) molecule in the trans Plantation surgery used to go through the increased vascularization the integration of the Accelerate graft and education i to avoid shameful necrosis. In a wide its advantageous embodiment, the ARNA I (s) - Molecule for inducing neovascularization of Coronary vessels are used. This leaves a coronary angioplasty using an egg balloon catheter or by means of a bypass Avoid surgery. According to the ARNA I (s) sequence either in combination with Kup fer (II) ions and calgranulin C or only in combination nation with copper (II) ions, that is, without that Calgranulin C protein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I(as)-Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Hemmung pathogener angiogenetischer Prozesse, insbesondere bei Hämangiomen oder bei der Tumorangiogenese, ver wendet. Vorzugsweise liegt die ARNA I(as)-Sequenz in Form eines ternären Komplexes, das heißt in Kom bination mit Calgranulin C und Kupfer(II)-Ionen, vor. In bevorzugter Ausführungsform liegt dieser ternäre Komplex zusammen mit Kalium- und Natriumio nen vor.In a further preferred embodiment of the Invention is the ARNA I (as) sequence as an active ingredient for the production of a therapeutic agent for inhibition pathogenic angiogenic processes, in particular in hemangiomas or tumor angiogenesis, ver applies. The ARNA I (as) sequence is preferably located in the form of a ternary complex, i.e. in com combination with calgranulin C and copper (II) ions, in front. In a preferred embodiment, this is ternary complex together with potassium and sodium ion before.

Erfindungsgemäß können die zur Verwendung als Wirk stoff zur Modulierung angiogenetischer Prozesse vorgesehenen Nucleinsäuren auch chemisch modifi ziert werden, indem beispielsweise ein oder mehrere funktionelle 2'-OH-Gruppen des Zucker-Phosphat- Gerüsts gegen andere funktionelle Gruppen, bei spielsweise eine Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder O- Methylgruppe ausgetauscht werden, um die Nuclein säure zu stabilisieren. Gegebenenfalls können die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen komplexierten Nucleinsäuren auch unter Verwendung von Liposomen in die Zielzellen eingeführt werden, um die Effi zienz der Transfektion zu verbessern.According to the invention for use as an active ingredient material for modulating angiogenic processes provided nucleic acids also chemically modified be decorated by, for example, one or more functional 2'-OH groups of the sugar-phosphate Against other functional groups for example an amino, fluoro-, O-allyl or O- Methyl group exchanged to the nuclein stabilize acid. If necessary, the complexed with metal ions and / or proteins Nucleic acids also using liposomes are introduced into the target cells in order to to improve transfection efficiency.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Induzierung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:
The present invention therefore also relates to a method for inducing angiogenic processes in tissues of a mammalian organism, comprising the following steps:

- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküls in Sinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und- Production of a ternary complex by com plexing of a nucleic acid according to the invention molecule in sense orientation with metal ions and optionally a protein in vitro; and
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen der angiogenetische Prozess in duziert werden soll.- Application of the complexed nucleic acid Tissues in which the angiogenic process in should be reduced.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die fol genden Schritte:
The present invention also relates to a method for inhibiting angiogenic processes in tissues of a mammalian organism, comprising the following steps:

- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküls in Antisinn-Orientierung mit Metall- Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und- Production of a ternary complex by com plexing of a nucleic acid according to the invention molecule in antisense orientation with metal Ions and optionally a protein in vitro; and
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen ein angiogenetischer Prozess ge hemmt werden soll.- Application of the complexed nucleic acid Tissues in which an angiogenic process occurs should be inhibited.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin sich aus Fig. 2 ergebene Verfahren und Verwendungen, mittels derer die molekularen Funktionen des mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA-Bestand teils ARNA I bei der Differenzierung von Endothel zellen zu kapillaren Zellen im Rahmen der Angioge nese genutzt werden können.The present invention further relates to methods and uses resulting from FIG. 2, by means of which the molecular functions of the RNA component associated with the angiotropin complex ARNA I can be used in the differentiation of endothelial cells to capillary cells in the context of angiogenesis ,

Die im nativen Angiotropin vorliegende ARNA I(s)- Sequenz ist partiell komplementär zur Intron- Sequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz. Das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt daher wohl das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Die ses Antisinn-Transkript wird analog einer prä-mRNA transkribiert und enthält die ARNA I(s) als Intron. Aus diesem Transkript wird dann ARNA I(s)-Form, ge gebenenfalls in circulärer Form, gespleißt. Die po tentielle Generierung der ARNA I(s)-Sequenz ist in Fig. 3 dargestellt. Die ARNA I(s)-Sequenz liegt vermutlich circulär vor. Durch Assoziation des ARNA I(s)-Moleküls mit ARP und Cu²⁺- und/oder gegebenen falls Zink-, Calcium-, Kalium- und/oder Natrium- Ionen wird der vollständige Metallo-RNP-Komplex An giotropin konstituiert. Bei Bedarf wird dieser Komplex aus der Zelle sezerniert, diffundiert zu den Endothelzellen und gelangt mittels Endocytose oder über einen Rezeptor in das Zellinnere der Endothel zellen. Dort lagert sich die einsträngige ARNA I(s)-Sequenz an homologe Bereiche der prä-mRNA be ziehungsweise mRNA des L27a-Gens, so dass diese nicht mehr als Transkriptionsmatrize zur Synthese des ribosomalen L27a-Proteins fungieren kann. Da außerdem in der Proteinbindungsdomäne des ARNA I(s)-Moleküls ein zur Konsensus-Sequenz der Ham merhead-Ribozyme homologer Sequenzabschnitt identi fiziert wurde, könnte zudem eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise mRNA des L27a-Gens erfolgen. Auch dies hätte zur Folge, dass die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins unter brochen wird. Da sich ohne das L27a-Protein jedoch keine funktionsfähigen Ribosomen konstituieren kön nen, führt dies zur vollständigen Inhibition der gesamten zellulären Translation. Dies wiederum be wirkt, dass Endothelzellen nicht mehr prolifieren könnten. Dass Angiotropin die Proliferation von En dothelzellen hemmt, wurde experimentell nachgewie sen (Höckel et al. 1987; Noll 1998). Sobald kein Angiotropin mehr in den Zellen vorhanden ist, kann deren Proliferation wieder stattfinden, so dass dieser Prozess reversibel ist. Die durch die Hem mung der zellulären Translation erzwungene Umstel lung des Stoffwechsels der Zelle führt dann zu der experimentell nachgewiesenen Differenzierung von Endothelzellen zu kapillaren Zellen.The ARNA I (s) sequence present in the native angiotropin is partially complementary to the intron sequence of the pseudo-ARNA I sequence. The antisense transcript of the pseudo-ARNA I gene therefore probably represents the precursor transcript for ARNA I (s). This antisense transcript is transcribed analogously to a pre-mRNA and contains the ARNA I (s) as an intron. ARNA I (s) form, possibly in circular form, is then spliced from this transcript. The potential generation of the ARNA I (s) sequence is shown in FIG. 3. The ARNA I (s) sequence is presumably circular. The complete metallo-RNP complex an giotropin is constituted by association of the ARNA I (s) molecule with ARP and Cu ²⁺ and / or, if appropriate, zinc, calcium, potassium and / or sodium ions. If necessary, this complex is secreted from the cell, diffuses to the endothelial cells and reaches the interior of the endothelial cells by means of endocytosis or via a receptor. There, the single-stranded ARNA I (s) sequence is attached to homologous regions of the pre-mRNA or mRNA of the L27a gene, so that it can no longer function as a transcription template for the synthesis of the ribosomal L27a protein. Since, in addition, a sequence segment homologous to the consensus sequence of the hammerhead ribozymes was identified in the protein binding domain of the ARNA I (s) molecule, sequence-specific hydrolysis of the pre-mRNA or mRNA of the L27a gene could also take place. This would also result in the synthesis of the ribosomal L27a protein being interrupted. However, since no functional ribosomes can be constituted without the L27a protein, this leads to complete inhibition of the entire cellular translation. This in turn means that endothelial cells could no longer proliferate. Experimental evidence has shown that angiotropin inhibits the proliferation of endothelial cells (Höckel et al. 1987; Noll 1998). As soon as there is no more angiotropin in the cells, their proliferation can take place again, so that this process is reversible. The change in cell metabolism forced by the inhibition of cellular translation then leads to the experimentally proven differentiation of endothelial cells into capillary cells.

In der erfindungsgemäß vorgesehenen Verfahrensweise zur Angiotropin-induzierten Differenzierung von Zellen, insbesondere stark proliferierenden Zellen, wie Tumorzellen und Stammzellen, aber auch Endo thelzellen und Nervenzellen, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Molekülen, die ins besondere eine Bindung an die mRNA des L27a-Gens ermöglichen, zum Beispiel die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 5, 10 und 11, nimmt die Inhibition des ribosomalen L27a-Proteins eine Schlüsselstelle ein. Wie vorstehend erwähnt, wird die mRNA dieses Prote ins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark überexprimiert, so dass ein direkter Zusammenhang zwischen diesem Protein und einer verstärkten Zellproliferation besteht. Erfindungsgemäß besteht daher die Möglichkeit, Kar zinomzellen direkt zu behandeln, indem ARNA I- Sequenzen umfassende Angiotropin-Komplexe in diese Zellen eingeschleust werden. Die ARNA I-Sequenzen führen in den Karzinomzellen zu einer direkten Hem mung der L27a-Translation und damit zu einer Hem mung der Proliferation dieser Zellen.In the procedure provided according to the invention for angiotropin-induced differentiation of Cells, especially proliferating cells, like tumor cells and stem cells, but also endo cell and nerve cells, using the Nucleic acid molecules according to the invention, which ins especially binding to the mRNA of the L27a gene enable, for example the sequences of the SEQ ID Nos. 1 to 5, 10 and 11, inhibits the ribosomal L27a protein a key site. As mentioned above, the mRNA of this protein ins in carcinoma cells versus the mRNA of others ribosomal proteins strongly overexpressed so that a direct link between this protein and there is increased cell proliferation. According to the invention, there is therefore the possibility of Kar to treat zinoma cells directly by using ARNA I- Sequences encompassing angiotropin complexes in these Cells are introduced. The ARNA I sequences lead to a direct inhibition in the carcinoma cells L27a translation and thus to a Hem the proliferation of these cells.

Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Re duktion der Proliferation von Zellen und/oder zur vorzeitigen Einleitung der Differenzierung dieser Zellen, wobei ein Nucleinsäuremolekül der vorlie genden Erfindung, insbesondere ein Nucleinsäuremo lekül dargestellt in einer der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 10 und/oder 11, ein diese Nucleinsäuremolekü le enthaltener Vektor, ein diese Moleküle oder Vek toren enthaltene Wirtszelle, eine diese Nucleinsäu remoleküle enthaltender Komplex und/oder ein Anti körper gegen diesen Komplex in die Zelle einge schleust wird, dabei die Aktivität und/oder Expres sion des L27a-Gens oder davon codierten Genproduk tes gehemmt oder reduziert und so die Proliferation der Zelle reduziert oder gehemmt wird sowie gegebe nenfalls dadurch eine vorzeitige Einleitung der Differenzierung erfolgt. In einer bevorzugten Aus führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens han delt es sich also bei den Zellen um stark prolife rierende Zellen, insbesondere Stammzellen, Tumor zellen und Zellen, die zum Beispiel aufgrund patho gener Prozesse degeneriert sind und stark prolife rieren, aber auch um Endothelzellen. In einer wei teren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um krankhaft veränderte Zellen, bei spielsweise um Zellen, die bei der Schuppenflechte (Psoriasis-Formenkreis) entstehen. In weiteren be vorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den Zellen um Nervenzellen.The invention therefore also relates to methods for re production of cell proliferation and / or early initiation of differentiation this Cells, one of which is a nucleic acid molecule ing invention, especially a nucleic acid mo shown in one of SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 10 and / or 11, a this nucleic acid molecule le contained vector, a these molecules or Vek contained host cell, one of these nucleic acid complex containing remolecules and / or an anti body against this complex into the cell the activity and / or expresses sion of the L27a gene or gene product encoded thereby tes inhibited or reduced and so proliferation the cell is reduced or inhibited and given otherwise this will lead to an early initiation of Differentiation takes place. In a preferred out management form of the method according to the invention So the cells are very proliferous cells, especially stem cells, tumor cells and cells, for example, due to patho general processes are degenerate and proliferate but also around endothelial cells. In a white teren preferred embodiment in the cells around pathologically altered cells, in for example, cells that have psoriasis (Psoriasis form) arise. In further be preferred embodiments are the Cells around nerve cells.

In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Er findung ist es vorgesehen, in dem Nucleinsäure komplex der vorgenannten Art ein Protein einzuset zen, welches einerseits das Nucleinsäuremolekül bindet, andererseits aber auch Spezifität im Hin blick auf die zu transformierende Zielzelle auf weist. Ein solches Molekül kann Calgranulin C oder ARP oder ein ähnliches Protein sein. Ein ähnliches Protein im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin dung ist ein Protein, welches eine Bindung an ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, insbesondere der vorstehend definierten Art ermög licht, insbesondere eine Bindungsdomäne von Calgra nulin C oder ARP an das Nucleinsäuremolekül auf weist. Dieses Protein weist erfindungsgemäß Erken nungsstellen auf, die eine spezifische Erkennung, Bindung und Penetration von bestimmten zu transfor mierenden Zielzellen ermöglicht, so dass nicht sämtliche Zellen des behandelten Organismus erfasst werden. Aufgrund der durch diese Bindungs- und Er kennungsstellen des Proteins vermittelten Spezifi tät ist es möglich, einzelne Zelltypen in einem Or ganismus gezielt den erfindungsgemäß erzielten Ef fekten auszusetzen, das heißt beispielsweise diese Zellen mittels der erfindungsgemäß vorgesehenen Wirkung dosisabhängig entweder zu töten oder die Proliferation zu unterbinden und die Differenzie rung einzuleiten.In a preferred embodiment of the present Er Invention is provided in the nucleic acid complex to insert a protein of the aforementioned type zen, which on the one hand is the nucleic acid molecule binds, but also specificity in the outward direction look at the target cell to be transformed has. Such a molecule can be calgranulin C or ARP or a similar protein. A similar Protein related to the present invention manure is a protein that binds to a protein Nucleic acid molecule of the present invention, especially of the type defined above light, especially a Calgra binding domain nulin C or ARP to the nucleic acid molecule has. According to the invention, this protein has orken centers that require specific recognition, Binding and penetration from certain to transfor allowing target cells, so that not all cells of the treated organism are recorded become. Because of this bond and Er identification points of the protein mediated speci It is possible to separate individual cell types in an Or ganismus targeted the Ef achieved according to the invention to suspend effects, for example this Cells by means of those provided according to the invention Effect depending on dose either kill or die To prevent proliferation and the difference initiate.

Die Erfindung betrifft auch Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfin dung, gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen Elementen, Elementen, die die Replikation in einem Wirt ermöglichen, Elementen, die die Selektion mit dem Vektor transformierter Zellen ermöglichen oder sonstigen im Stand der Technik bekannten Elementen. Erfindungsgemäß kann der Vektor zum Beispiel ein Cosmid, Phage oder Plasmid sein.The invention also relates to vectors containing a nucleic acid sequence of the present invention dung, if necessary together with regulatory Elements, elements that replicate in one Host allow elements that have the selection with enable the vector of transformed cells or other elements known in the prior art. According to the invention, the vector can be, for example Be a cosmid, phage or plasmid.

Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die derar tige Vektoren enthalten. Derartige Wirtszellen kön nen bakterielle, pflanzliche, tierische oder menschliche Zellen sein, zum Beispiel Primatenzel len, Mauszellen, Hamsterzellen oder auch Insekten zellen.The invention also relates to host cells which are derar included vectors. Such host cells can bacterial, vegetable, animal or human cells, for example primate cells len, mouse cells, hamster cells or insects cells.

Wie vorstehend erläutert, erfasst die Erfindung auch Nucleinsäurekomplexe, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, entweder zusammen mit mindestens einem Metallion und/oder einem Protein. Das Protein kann beispiels weise aus der Familie der S100-Proteine (Dell'Angelica et al., a. a. O.) stammen, insbesondere ein hu manes oder porcines Calgranulin C oder Angiotropin related-Proteinmolekül sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem S100- Protein ein Protein mit zwei Calciumbindungsmotiven verstanden, die als EF-Handstrukturen bezeichnet werden, insbesondere ein Protein mit einer Amino säuresequenzidentität von mindestens 50%, mindes tens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, min destens 90% und bevorzugt mindestens 95%, 97% und 99% zu humanem ARP. Als Metallion können bei spielsweise Ca²⁺-, Cu²⁺-, Na⁺-, K⁺-, Zn²⁺- oder Mg²⁺- Ionen verwendet werden.As explained above, the invention also encompasses nucleic acid complexes comprising at least one nucleic acid molecule of the present invention, either together with at least one metal ion and / or a protein. The protein can, for example, come from the family of S100 proteins (Dell'Angelica et al., Loc. Cit.), In particular a human or porcine calgranulin C or angiotropin-related protein molecule. In connection with the present invention, a S100 protein is understood to mean a protein with two calcium binding motifs, which are referred to as EF hand structures, in particular a protein with an amino acid sequence identity of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80 %, at least 90% and preferably at least 95%, 97% and 99% to human ARP. For example, Ca ²⁺ , Cu ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , Zn ²⁺ or Mg ²⁺ ions can be used as the metal ion.

Ein erfindungsgemäßer Nucleinsäurekomplex umfassend ein Nucleinsäuremolekül und ein Protein oder dessen Bestandteil, zum Beispiel Oligopeptid oder Polypep tid, wird auch als Ribonucleotidpolypeptid und, wenn dieser Metallionen enthält, als metallhaltiges Ribonucleotidpolypeptid bezeichnet. Derartige Kom plexe können chemische, radioaktive oder fluores zente Markierungen, auch mit cytotoxischer Wirkung, aufweisen.Comprising a nucleic acid complex according to the invention a nucleic acid molecule and a protein or its Component, for example oligopeptide or polypep tid, is also called a ribonucleotide polypeptide and, if it contains metal ions, as metal-containing Ribonucleotide polypeptide. Such com plexes can be chemical, radioactive or fluorescent central markings, also with cytotoxic effects, exhibit.

Die Erfindung betrifft auch Antikörper, insbesonde re monoclonale oder polyclonale Antikörper, die spezifisch einen der vorgenannten Nucleinsäure- Komplexe erkennen und binden können.The invention also relates to antibodies, in particular re monoclonal or polyclonal antibodies that specifically one of the aforementioned nucleic acid Recognize and bind complexes.

Die Erfindung betrifft auch mindestens eins der vorstehend genannten Agenzien enthaltende diagnos tische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, wo bei derartige Agenzien die erfindungsgemäßen Nuc leinsäuren, Vektoren, Wirtszellen, Nucleinsäure- Komplexe oder Antikörper sein können. Diese Zusam mensetzungen weisen weiterhin gegebenenfalls Zu satz- oder Hilfsstoffe, wie pharmazeutisch verträg liche Träger, Farbstoffe, Aromastoffe, Süßungsmit tel, Verdickungsmittel, Trennmittel, Säuerungsmit tel, Gleitmittel, Konservierungsmittel oder ähnli ches auf. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur spezifischen Beeinflussung der Angio morphogenese und des vaskulären Zustands eines Ge webes des Körpers von Organismen, zur Übertragung genetischer Informationen in Zellen, zur selektiven Veränderung des Nucleinsäuregehaltes von Zellen, zur Induzierung angiogenetischer Prozesse und/oder zur Wundheilung, zur Hemmung angiogenetischer Pro zesse und/oder zur Bekämpfung von Tumoren einge setzt werden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur zellselekti ven reversiblen Inhibierung der Proteinbiosynthese, zum Beispiel in Endothelzellen, zur Inhibierung von Blutendothelzellen, zur spezifischen in vivo oder in vitro Beeinflussung der Blutgefäßbildung, insbe sondere bei Herz- und Gefäßerkrankungen, in der Transplantationschirurgie oder zur Inhibition des Wachstums von Tumoren ebenso wie in der Wundheilung einzusetzen. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure komplexe weisen auch eine zellselektive morphogene Wirkung in vitro auf isolierte primäre und/oder clonierte Blutkapillarendothelzellen in Kultur zur nichtmitogenen Induktion der Änderung des Zellphä notyps aus dem konfluenten Zustand oder/und zur nichtmitogenen Änderung der spatiotemporalen supra zellulären Organisation der Zellen zu dreidimensio nalen organoiden kapillarähnlichen Strukturen in Kultur auf. Schließlich sind sie zur spezifischen chemotropischen Wirkung auf Blutgefäße in vivo, zur Induktion eines Richtungswachstums von Blutgefäßen in vivo und zur Induktion einer Neovaskualisierung von Geweben durch gerichtetes Einwachsen von Blut gefäßen geeignet.The invention also relates to at least one of the Diagnostics containing the aforementioned agents table or pharmaceutical compositions where with such agents, the nuc according to the invention linseed acids, vectors, host cells, nucleic acid Can be complexes or antibodies. This together Measures continue to assign if necessary Substitutes or auxiliaries, such as pharmaceutically acceptable carriers, colorants, flavorings, sweeteners tel, thickeners, release agents, acidulants tel, lubricants, preservatives or the like ches on. The pharmaceutical compositions can specifically influence the angio morphogenesis and vascular state of a Ge webes of the body of organisms, for transmission genetic information in cells, for selective Change in the nucleic acid content of cells, for inducing angiogenic processes and / or for wound healing, for inhibiting angiogenic pro processes and / or to combat tumors be set. According to the invention, it is also possible the above-mentioned agents for cell selection ven reversible inhibition of protein biosynthesis, for example in endothelial cells, for the inhibition of Blood endothelial cells, for specific in vivo or in vitro influence on blood vessel formation, esp especially for heart and vascular diseases, in the Transplant surgery or to inhibit the Growth of tumors as well as in wound healing use. The nucleic acid according to the invention complexes also have a cell-selective morphogenic Effect in vitro on isolated primary and / or cloned blood capillary endothelial cells in culture for non-mitogenic induction of cell phase change notyps from the confluent state and / or to non-mitogenic change in the spatiotemporal supra cellular organization of the cells to three dimensions nale organoid capillary-like structures in Culture on. After all, they are specific chemotropic effect on blood vessels in vivo, for Induction of directional growth of blood vessels in vivo and for induction of neovascularization of tissues by directional ingrowth of blood suitable for vessels.

Die erfindungsgemäß vorgesehenen diagnostischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten zum Beispiel die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäurekomplexe. Sie können bei spielsweise subkutan, intrakutan, intramuskulär o der intravenös appliziert werden. Es sind jedoch selbstverständlich auch weitere im Stand der Tech nik gebräuchliche Applikationsmöglichkeiten ein setzbar. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen topisch oder systemisch einge setzt werden.The diagnostic and pharmaceutical compositions contain for Example the nucleic acids according to the invention and / or nucleic acid complexes. You can at for example subcutaneously, intracutaneously, intramuscularly o which are administered intravenously. However, there are of course also other in the state of the tech no common application options settable. In particular, the inventive Compositions applied topically or systemically be set.

Die diagnostischen Zusammensetzungen können zum Beispiel zur Diagnose von Veränderungen des Blutge fäßwachstums eingesetzt werden.The diagnostic compositions can be used for Example of diagnosing changes in blood barrel growth can be used.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur Strukturanalyse von Nuclein säuren, Nucleosiden oder Nucleotiden einzusetzen, zum Beispiel zur Deaminierung von Adenosin und Deo xiadenosin, zur Hydrolyse von Inosin und Deoxiino sin, zur Hydrolyse von Guanosin, zur Deaminierung von Guanin, zur Hydrolyse von Phosphorsäure diestern, zur Hydrolyse von Phosphorsäuremonoes tern, zur Hydrolyse von Nucleinsäuresubstraten e benso wie zur Herstellung von Nucleinsäuren in vivo und in vitro. Gegebenenfalls kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Verwendungen auch in Gegenwart von Magnesium²⁺-Ionen durchzuführen. Insbeson dere kann erfindungsgemäß mit den vorstehend ge nannten Agenzien die Herstellung von Adenosin, De soxiadenosin, Guanosin, Desoxiguanosin, Inosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin oder Xanthin durchge führt werden.According to the invention, it is also possible to use the above-mentioned agents for the structural analysis of nucleic acids, nucleosides or nucleotides, for example for the deamination of adenosine and deoxiadenosine, for the hydrolysis of inosine and deoxiino sin, for the hydrolysis of guanosine, for the deamination of guanine Hydrolysis of phosphoric acid diesters, for the hydrolysis of phosphoric acid monoesters, for the hydrolysis of nucleic acid substrates as well as for the production of nucleic acids in vivo and in vitro. If appropriate, it can be provided that the uses according to the invention are also carried out in the presence of magnesium ²⁺ ions. In particular, the preparation of adenosine, de soxiadenosine, guanosine, deoxiguanosine, inosine, adenine, guanine, hypoxanthine or xanthine can be carried out according to the invention with the agents mentioned above.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der vorste hend genannten Agenzien für die vorstehend genann ten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Hei lung von Erkrankungen ebenso wie die Verwendung der vorstehend genannten Agenzien zur Herstellung von Arzneimitteln zur Erzielung der genannten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Heilung von Krank heiten.The invention relates to the use of the foregoing Agents mentioned for the above ten purposes, in particular for prophylaxis or Hei treatment of diseases as well as the use of Agents for the preparation of Medicines to achieve the stated purposes, especially for the prophylaxis or healing of sick people units.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von S100-Proteinen, insbesondere ARP, Calgranulin C, oder der Nucleinsäure-Komplexe der vorgenannten Er findung als Transportmolekül für Nucleotidsequen zen, insbesondere RNA-Moleküle.The invention also relates to the use of S100 proteins, especially ARP, calgranulin C, or the nucleic acid complexes of the aforementioned Er invention as a transport molecule for nucleotide sequences zen, especially RNA molecules.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous configurations result from the subclaims.

Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung.The following figures and examples explain the Invention.

Fig. 1 zeigt die mit Hilfe des MFOLD-Programms er stellte Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz (Antisinn). Fig. 1 shows the secondary structure of the human ARNA I sequence (antisense) with the help of the MFOLD program.

Fig. 2 zeigt in schematischer Form den Mechanismus der ARNA I(s)-induzierten Translationsinhibition über einen Antisinn-Mechanismus. Dieser Antisinn- Mechanismus führt zur Differenzierung von Endothel zellen, wobei Kapillaren gebildet werden. Fig. 2 shows in schematic form the mechanism of ARNA I (s) -induced translation inhibition via an antisense mechanism. This antisense mechanism leads to the differentiation of endothelial cells, whereby capillaries are formed.

Fig. 3 zeigt schematisch die Struktur der erfin dungsgemäßen Pseudo-ARNA I-Sequenz (oben: Sinn strang, unten: Antisinnstrang). Fig. 3 shows schematically the structure of the pseudo-ARNA I sequence according to the invention (top: sense strand, bottom: anti-sense strand).

Das Sequenzprotokoll (alle Sequenzen sind in 5' zu 3'-Orientierung dargestellt) umfasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spe zifischen ARNA I-Sequenz, die in der entsprechenden porcinen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurden (Sinn-Orientierung).
SEQ ID Nr. 2 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spe zifischen ARNA-I-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Antisinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 3 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz, die den 163 Nucleotide umfassenden Sequenzteil umfasst, der identisch mit der Sequenz der porcinen ARNA I- Sequenz ist, in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 4 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 in Antisinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 5 zeigt die 235 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz (Sinn- Orientierung), inclusive der am 5' Ende vorhandenen ARNA I Nucleotide 1 bis 63 in Antisinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 6 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (forward).
SEQ ID Nr. 7 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (reverse).
SEQ ID Nr. 8 zeigt einen Teilabschnitt der humanen ARNA-I Sequenz (Sinnorientierung) mit potentieller ribozymatischer Aktivität.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 8 in Antisinnorientierung.
SEQ ID Nr. 10 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Sinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Antisinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 12 zeigt den im Haarnadelschleifenbe reich gelegenen Konsensusbereich zwischen ARNA I(s) und ARNA II(as) Sequenzen in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 12 in Antisinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 14 zeigt den 19 Nucleotide mit besonde rer Humanspezifität aufweisenden Bereich der SEQ ID Nr. 1 in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 15 zeigt den 19 Nucleotide umfassenden besonders humanspezifischen Bereich der SEQ ID Nr. 2 in Antisinn-Orientierung.The sequence listing (all sequences are shown in 5 'to 3' orientation) includes:
SEQ ID No. 1 shows 42 nucleotides of the human, specific ARNA I sequence which were not detected in the corresponding porcine ARNA I sequence (sense orientation).
SEQ ID No. 2 shows 42 nucleotides of the human, specific ARNA-I sequence from SEQ ID No. 1 in an anti-sense orientation.
SEQ ID No. 3 shows the complete, 205 nucleotide sequence of the human ARNA I sequence, which comprises the 163 nucleotide sequence part, which is identical to the sequence of the porcine ARNA I sequence, in sense orientation.
SEQ ID No. 4 shows the complete, 205 nucleotide sequence of the human ARNA I sequence from SEQ ID No. 3 in the anti-sense orientation.
SEQ ID No. 5 shows the sequence of the human pseudo-ARNA I sequence (sense orientation) comprising 235 nucleotides, including the ARNA I nucleotides 1 to 63 present at the 5 'end in the anti-sense orientation.
SEQ ID No. 6 shows the sequence of the primer ARNA I (forward) used to isolate the human ARNA I sequence.
SEQ ID No. 7 shows the sequence of the primer ARNA I (reverse) used to isolate the human ARNA I sequence.
SEQ ID No. 8 shows a section of the human ARNA-I sequence (sense orientation) with potential ribozyme activity.
SEQ ID No. 9 shows the sequence of SEQ ID No. 8 in an anti-sense orientation.
SEQ ID No. 10 shows the 63 nucleotides of human ARNA I mentioned in SEQ ID No. 5 in sense orientation.
SEQ ID No. 11 shows the 63 nucleotides of human ARNA I mentioned in SEQ ID No. 5 in an anti-sense orientation.
SEQ ID No. 12 shows the consensus area between ARNA I (s) and ARNA II (as) sequences in the hairpin loop area in sense orientation.
SEQ ID No. 13 shows the sequence of SEQ ID No. 12 in an anti-sense orientation.
SEQ ID No. 14 shows the 19 nucleotides with special human specificity area of SEQ ID No. 1 in sense orientation.
SEQ ID No. 15 shows the 19 nucleotides, particularly human-specific region of SEQ ID No. 2 in an antisense orientation.

Beispiel 1example 1 Identifizierung von ARNA I-Sequenzen in humanem ProbenmaterialIdentification of ARNA I sequences in human sample material

Voruntersuchungen mittels RT-PCR unter Verwendung verschiedener Primer hatten gezeigt, dass zur por cinen ARNA I-Sequenz homologe Nucleinsäuren sowohl in kommerzieller humaner Plazenta-Gesamt-RNA als auch in Con A-stimulierter Leukocyten-Gesamt-RNA nachgewiesen werden konnten.Preliminary investigations using RT-PCR using different primers had shown that por cine ARNA I sequence homologous nucleic acids both in commercial human total placenta RNA as also in Con A-stimulated leukocyte total RNA could be demonstrated.

Zur Clonierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde Ge samt-RNA von humaner Plazenta unter Verwendung des Primers ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6), der eine Eco RI-Schnittstelle enthält, und des Primers ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7), der eine Bam HI- Restriktionsstelle enthält, einer RT-PCR unterwor fen. Die erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Bam HI ge spalten und einer gelelektrophoretischen Aufreini gung auf einem 2,5%-igen Agarose-Gel unterworfen. Nach Aufreinigung der Fragmente wurden diese in den Vektor pUC 19 cloniert, der zuvor mit Eco RI und Bam HI gespalten worden war. Nach Transformation und Selektion geeigneter Transformanten wurde die Sequenz der Insertionen im Clonierungsvektor be stimmt. Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des Dye Terminator Cycle Sequencing Kits und des ABI PRISM 377A DNA-Sequenators. Die dabei erhaltenen vollständigen und partiellen Sequenzen von ARNA I(s), ARNA I(as) und Pseudo-ARNA I sind in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und 8 bis 15 gezeigt. In Fig. 3 wird in schematischer Weise die Pseudo-ARNA I-Sequenz gezeigt. Der obere Bereich stellt die 5'- 3' Orientierung eines Sinntranskripts von der Pseu do-ARNA I in prä-mRNA Form dar, also das potentiel le L27a Exon I und das potentielle Intron umfassend die ARNA I-Nucleotide Nr. 64-205 und 1-63, beide in Antisinn-Orientierung, L27a Exon II und Poly A Schwanz (in 5' zu 3' Richtung). Dabei stellen die Nucleotide 50-63 der ARNA I(as) einen gemeinsamen Sequenzabschnitt zwischen ARNA I(as) und dem Be reich des Pseudo-ARNA I Transkripts dar, der homo log zum 5'-Ende des Exon II von L27a ist. Die 3' Spleißstelle der prä-mRNA von L27a beziehungsweise möglicherweise auch der Pseudo-ARNA I(s) Sequenz liegt im mit dem Doppelpfeil gekennzeichneten Be reich. Im darunter gelegenen Bereich wird in 3'-5'- Orientierung (Antisinn-Transkript) dargestellt, wie das entsprechende Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I-Sequenz aufgebaut ist, nämlich (in 3' zu 5' Richtung): L27a Exon I in Antisinn, Intron aus ARNA I Nt 142-1 und ARNA I Nt 205-143 beide in Sinn- Orientierung, L27a Exon I (Antisinn). Der poten tielle Intronbereich der Pseudo-ARNA I-Sequenz wird durch die ARNA I (as) Bereiche 64 bis 205 und 1 bis 63 konstituiert. Im Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I (unterer Bereich) befindet sich der entspre chende Intronbereich ARNA I(s) 142 bis 1 und ARNA I(s) 205 bis 143, der als Template für die Generie rung einer zirkulären ARNA I(s)-Sequenz dient. Mit tels des dargestellten Pfeils wird die potentielle Zirkularisierung dieser Sequenz dargestellt. Dabei kennzeichnet die Pfeilspitze die Position der 5'- und das Pfeilende die Position der 3'-Spleiß-Stelle der ARNA I(s) innerhalb des Antisinn-Transkriptes der Pseudo-ARNA I-Sequenz. Die Nucleotide 143-156 der ARNA I(s) können ab der Position der 3' Spleiß stelle des Exons II der mRNA beziehungsweise prä- mRNA des L27a-Gens gegen dieses Exon hybridisieren.To clone the human ARNA I sequence, total RNA from human placenta was used using the primer ARNA I (forward) (SEQ ID No. 6), which contains an Eco RI site, and the primer ARNA I (reverse) ( SEQ ID No. 7), which contains a Bam HI restriction site, subjected to RT-PCR. The amplification products obtained were cleaved with the restriction enzymes Eco RI and Bam HI and subjected to gel electrophoretic purification on a 2.5% agarose gel. After the fragments had been purified, they were cloned into the vector pUC 19, which had previously been cleaved with Eco RI and Bam HI. After transformation and selection of suitable transformants, the sequence of the insertions in the cloning vector was determined. Sequencing was carried out using the Dye Terminator Cycle Sequencing Kit and the ABI PRISM 377A DNA sequencer. The complete and partial sequences of ARNA I (s), ARNA I (as) and pseudo-ARNA I obtained in this way are shown in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 and 8 to 15. In Fig. 3, the pseudo-ARNA is shown I sequence in a schematic manner. The upper area represents the 5'-3 'orientation of a sense transcript from the pseu do ARNA I in pre-mRNA form, that is to say the potential le L27a exon I and the potential intron comprising the ARNA I nucleotides No. 64-205 and 1-63, both in anti-sense orientation, L27a exon II and poly A tail (in 5 'to 3' direction). Nucleotides 50-63 of ARNA I (as) represent a common sequence section between ARNA I (as) and the region of the pseudo-ARNA I transcript that is homologous to the 5 'end of exon II of L27a. The 3 'splice point of the pre-mRNA of L27a or possibly also of the pseudo-ARNA I (s) sequence lies in the region indicated by the double arrow. In the area below it is shown in 3'-5 'orientation (antisense transcript) how the corresponding antisense transcript of the pseudo-ARNA I sequence is structured, namely (in 3' to 5 'direction): L27a exon I in antisense, intron from ARNA I Nt 142-1 and ARNA I Nt 205-143 both in sense orientation, L27a exon I (antisense). The potential intron region of the pseudo-ARNA I sequence is constituted by the ARNA I (as) regions 64 to 205 and 1 to 63. In the antisense transcript of the pseudo-ARNA I (lower area) is the corresponding intron area ARNA I (s) 142 to 1 and ARNA I (s) 205 to 143, which serves as a template for the generation of a circular ARNA I (see ) Sequence is used. The potential circularization of this sequence is shown by means of the arrow shown. The arrow head indicates the position of the 5 'and the arrow end the position of the 3' splice site of ARNA I (s) within the antisense transcript of the pseudo-ARNA I sequence. Nucleotides 143-156 of ARNA I (s) can hybridize against this exon from the position of the 3 'splice site of exon II of the mRNA or pre-mRNA of the L27a gene.

Beispiel 2Example 2 In vitro-RNA-Synthese von ARNA I-SequenzenIn vitro RNA synthesis of ARNA I sequences

Die clonierten ARNA I-Sequenzen wurden als Matrizen zur in vitro-RNA-Synthese verwendet. Dazu wurden via PCR blunt-end DNA-Templates hergestellt, die eine definierte Terminierung des nachfolgenden RNA- Transkripts ermöglichten. Diese DNA-Templats ent hielten am 5'-Ende eine Promotorsequenz für die T7- RNA-Polymerase und 3'-terminal zur Promotorsequenz die gewünschte DNA-Sequenz, deren RNA synthetisiert werden sollte. Die RNA-Synthese erfolgte unter Ver wendung hochkonzentrierter T7-RNA-Polymerase nach dem Verfahren von Milligan und Uhlenbeck (1989), wobei die RNA-Synthese jedoch über 18 h durchge führt wurde. Nach der Synthese wurde die RNA mit tels DNase-Behandlung und Phenol/Chloroform- Behandlung gereinigt. Nach Aufreinigung der RNA mittels Microkonzentrationen von Amicon (optional auch ersetzt durch Ethanolfüllung) konnte die so synthetisierte RNA zur in vitro-Rekonstitution ter närer Angiotropin-Komplexe eingesetzt werden.The cloned ARNA I sequences were used as templates used for in vitro RNA synthesis. To do this produced via PCR blunt-end DNA templates that a defined termination of the subsequent RNA Transcripts enabled. This DNA template ent held a promoter sequence for the T7 at the 5 'end. RNA polymerase and 3'-terminal to the promoter sequence the desired DNA sequence whose RNA is synthesized should be. RNA synthesis was carried out under Ver use of highly concentrated T7 RNA polymerase the method of Milligan and Uhlenbeck (1989), the RNA synthesis, however, over 18 h was led. After synthesis, the RNA was with DNase treatment and phenol / chloroform Treatment cleaned. After purification of the RNA using microconcentrations from Amicon (optional also replaced by ethanol filling) synthesized RNA for in vitro reconstitution nary angiotropin complexes are used.

Beispiel 3Example 3 Rekonstitution ternärer Angiotropin-KomplexeReconstitution of ternary angiotropin complexes

Zur Rekonstitution ternärer Angiotropin-Komplexe wurde die in Beispiel 2 synthetisierte RNA eingesetzt. Als Protein-Komponente wurde intrazellulär isoliertes und aufgereinigtes porcines Calgranulin C aus Schweine-Granulocyten verwendet. Außerdem wurde CuCl₂ eingesetzt. Da das Konzentrations verhältnis zwischen RNA und Calgranulin C bisher experimentell nicht eindeutig quantifiziert werden konnte (Kuhn 1998), erfolgte die Rekonstitution der ternären Komplexe unter Verwendung verschiedener Konzentrationen. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Komplexe mit Pufferlösung 1 : 100 verdünnt.The RNA synthesized in Example 2 was used to reconstitute ternary angiotropin complexes. Intracellularly isolated and purified porcine calgranulin C from porcine granulocytes was used as the protein component. CuCl _{2 was also} used. Since the concentration ratio between RNA and calgranulin C has not yet been clearly quantified experimentally (Kuhn 1998), the ternary complexes were reconstituted using different concentrations. After a 1 hour incubation at 37 ° C the complexes were diluted 1: 100 with buffer solution.

Beispiel 4Example 4 Bestimmung der angiogenetischen Aktivität mittels des CAM-TestsDetermination of angiogenic activity using of the CAM test

Der CAM-Test wurde durchgeführt wie von Noll (1998) und Kuhn (1998) beschrieben.The CAM test was carried out as described by Noll (1998) and Kuhn (1998).

Positive angiogenetische Reaktionen wurden entspre chend der Ausbildung von Blutgefäßen im Bereich der aufgetragenen Probe entweder mit "++++" (sehr star ke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen), "+++" (starke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetz strukturen), "++" (leichte Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen), "+" (sehr geringe Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) oder "0" (keine Veränderung; entspricht der Reaktion auf Puffer ohne Substrat). Eine Verringerung der Anzahl der Kapillarnetzstrukturen wurde mit "-" beurteilt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in nachste hender Tabelle zusammengefasst. Positive angiogenic reactions were followed chend the formation of blood vessels in the area of applied sample either with "++++" (very star ke increase in the number of capillary network structures), "+++" (strong increase in the number of capillary networks structures), "++" (slight increase in the number of Capillary network structures), "+" (very slight increase the number of capillary network structures) or "0" (no change; corresponds to the reaction to Buffer without substrate). A decrease in the number the capillary network structures were rated "-". The results of the investigations are in the next summarized in the table below.

Tabelle table

CAM-Testserie mittels PCR-Template synthetisierter ARNA I CAM test series ARNA I synthesized using a PCR template

Beispiel 5Example 5 Mechanismus der ARNA I-regulierten Angiogenese des Angiotropins mittels Antisense-InhibierungMechanism of ARNA I regulated angiogenesis of the Angiotropins using antisense inhibition

Fig. 2 stellt schematisch den zellulären Mechanis mus der durch native humane ARNA I(s) induzierten Translationsinhibition mittels Antisinn-Mechanismus dar. Die in Leucozyten 50 generierte ARNA I(s) (als 10 in Fig. 2 bezeichnet) stellt das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens mit der schwarz dargestellten ARNA I(s)-Sequenz als Intron-Sequenz dar. Diese Intron-Sequenz umfasst die vollständige Sequenz von ARNA I(s) (SEQ ID Nr. 3), die somit ei nem zellulären Spleiß-Mechanismus unterliegt. Das Genprodukt des Pseudo-ARNA-Gens befindet sich daher nicht beziehungsweise nicht nur auf dem Sinnatrang, sondern vielmehr auf dem Antisinnstrang. Damit ist das Antisinn-Transkript das funktionelle Transkript dieses Gens. Das Antisinntranskript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Durch Assoziation der herausgespleißten, vermutlich circularisierten ARNA I(s) (15) mit ARP 18 und Cu²⁺-Ionen wird der erfindungsgemäße voll ständige Metallo-RNP-Komplex Angiotropin 20 konsti tuiert. Der Metallo-RNP-Komplex Angiotropin (als 20 bezeichnet) wird bei Bedarf in den extrazellulären Raum 30 sezerniert und diffundiert zu den Endothel zellen 40. In diesen hybridisiert die ARNA I(s) 15 gegen die prä-mRNA 60 beziehungsweise mRNA des L27a-Gens beziehungsweise direkt gegen das L27a-Gen auf Transkriptionsebene. Dadurch wird die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins inhibiert. Da innerhalb einer Haarnadelschleife der ARNA I(s) 15 eine Konsensussequenz zum Hammerhead-Ribozym identifi ziert wurde, kann gegebenenfalls darüber hinaus noch eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise der mRNA des L27a-Gens stattfinden. FIG. 2 shows schematically the cellular mechanism of the translation inhibition induced by native human ARNA I (s) by means of an antisense mechanism. The ARNA I (s) generated in leucocytes 50 (designated as 10 in FIG. 2) represents the antisense transcript of the pseudo-ARNA I gene with the ARNA I (s) sequence shown in black as the intron sequence. This intron sequence comprises the complete sequence of ARNA I (s) (SEQ ID No. 3), which thus comprises a cellular splicing mechanism is subject. The gene product of the pseudo-ARNA gene is therefore not or not only on the sense rank, but rather on the antisense strand. The antisense transcript is thus the functional transcript of this gene. The antisense transcript of the pseudo-ARNA I gene represents the precursor transcript for the ARNA I (s). By association of the spliced, presumably circularized ARNA I (s) ( 15 ) with ARP 18 and Cu ²⁺ ions, the invention is complete Metallo-RNP complex angiotropin 20 constituted. The metallo-RNP complex angiotropin (designated 20 ) is secreted into the extracellular space 30 if necessary and diffuses to the endothelial cells 40 . In these, ARNA I (s) 15 hybridizes against the pre-mRNA 60 or mRNA of the L27a gene or directly against the L27a gene at the transcription level. This inhibits the synthesis of the ribosomal L27a protein. Since a consensus sequence for the hammerhead ribozyme was identified within a hairpin loop of ARNA I (s) 15, sequence-specific hydrolysis of the pre-mRNA or the mRNA of the L27a gene can optionally also take place.

Ohne ribosomales L27a-Protein kann keine Bildung von funktionsfähigen Ribosomen stattfinden. Die In hibition der Translation ist die Folge, so dass die zelluläre Proteinbiosynthese gestoppt wird. Die En dothelzellen können nicht mehr proliferieren und erhalten dadurch die benötigte Zeit zur Umdifferen zierung in Kapillaren 70. Dieser Effekt scheint re versibel zu sein, da, wenn keine weitere ARNA I(s)- RNA 15 in die Endothelzellen eingeschleust wird, Proliferation wieder stattfindet.Without ribosomal L27a protein, functional ribosomes cannot form. The consequence of this is translation, so that cellular protein biosynthesis is stopped. The endothelial cells can no longer proliferate and thus receive the time required for redifferentiation in capillaries 70 . This effect appears to be reversible, since if no further ARNA I (s) - RNA 15 is introduced into the endothelial cells, proliferation takes place again.

Das vorgenannte System kann als Modellsystem für den zellselektiven RNA-Transfer und die Stabilisie rung von RNA bei Antisinn- und Ribozymstrategien herangezogen werden. Die Erfindung erfasst daher auch endothelspezifische Transfektionskits.The aforementioned system can be used as a model system for cell-selective RNA transfer and stabilization RNA in anti-sense and ribozyme strategies be used. The invention therefore covers also endothelium-specific transfection kits.

Insbesondere erlaubt es die Erfindung hinsichtlich der ARNA I(s)-Sequenz und diese enthaltenden Nuc leinsäure-Komplexe Wunden zu heilen, koronare Herz kranzgefäßerkrankungen zu heilen und eine verbes serte Transplantationschirurgie durchzuführen. Die erfindungsgemäße ARNA I(s)-Sequenz und diese ent haltende Nucleinsäurekomplexe können darüber hinaus auch zur Induktion des Wachstums von Nervenzellen verwendet werden. In particular, the invention allows for the ARNA I (s) sequence and Nuc containing it linseic acid complex to heal wounds, coronary heart to cure coronary artery disease and a verbes perform transplant surgery. The ARNA I (s) sequence according to the invention and this ent holding nucleic acid complexes can also also to induce the growth of nerve cells be used.

Hinsichtlich der ARNA I(as)-Sequenz und diese ent haltenden Nucleinsäure-Komplexen ist es möglich, die Tumorangiogenese zu inhibieren und Gentherapien zum Beispiel bei Hämangiomen durchzuführen. Regarding the ARNA I (as) sequence and this ent holding nucleic acid complexes it is possible inhibit tumor angiogenesis and gene therapies for example with hemangiomas.

Literaturliterature

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SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, das als funktionaler Be standteil eines biologisch aktiven Metallo- Ribonucleoprotein-Komplexes geeignet ist, ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta- Gesamt-RNA mit den ARNA I-spezifischen Primern mit den in SEQ ID Nr. 6 oder/und 7 dargestellten Nucleotidsequenzen, und einem Fragment davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 5 oder 8 bis 15 darge stellte Nucleotidsequenz umfasst;
c) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nuc leinsäuremoleküls nach a) bis b);
d) einem Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nuc leinsäuremolekül nach a) bis c) und einem Frag ment davon hybridisiert, und
e) einem Nucleinsäuremolekül, das zu einem Nuclein säuremolekül nach a) bis b) komplementär ist, und einem Fragment davon.

1. nucleic acid molecule which is suitable as a functional component of a biologically active metallo-ribonucleoprotein complex, selected from the group consisting of:

a) a nucleic acid molecule which is obtainable by reverse transcription of total placental RNA with the ARNA I-specific primers with the nucleotide sequences shown in SEQ ID No. 6 or / and 7, and a fragment thereof;
b) a nucleic acid molecule which comprises at least one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID Nos. 1 to 5 or 8 to 15;
c) a nucleic acid molecule which can be obtained by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid molecule according to a) to b);
d) a nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleic acid molecule according to a) to c) and a fragment thereof, and
e) a nucleic acid molecule which is complementary to a nucleic acid molecule according to a) to b), and a fragment thereof.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass es eine DNA oder RNA ist.2. Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized ge indicates that it is a DNA or RNA.

3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, da durch gekennzeichnet, dass es Teil einer längeren nativen Nucleinsäuremoleküls ist.3. Nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, since characterized by being part of a longer one native nucleic acid molecule.

4. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in circulä rer oder in linearer Form vorliegt.4. Nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is in circulä rer or in linear form.

5. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in seiner Sekundärstruktur eine Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere mit der Sequenz aus SEQ ID Nr. 12 oder 13 ausbildet.5. Nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 4, characterized in that it is in its Secondary structure with a hairpin loop Consensus sequence 5'-CUG-3 ', especially with the Sequence from SEQ ID No. 12 or 13 is formed.

6. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass die in der Sekundärstruktur des Nucleinsäuremoleküls ausgebildete Haarnadelschleife die Bindung des Nucleinsäuremoleküls an ein Protein vermittelt.6. Nucleic acid molecule according to claim 5, characterized ge indicates that those in the secondary structure of the Nucleic acid molecule formed hairpin loop binding of the nucleic acid molecule to a protein taught.

7. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder 6, da durch gekennzeichnet, dass die in der Sekundär struktur des Nucleinsäuremoleküls ausgebildete Haarnadelschleife die Bindung des Nucleinsäuremole küls an ein Angiotropin related protein-Molekül vermittelt.7. Nucleic acid molecule according to claim 5 or 6, there characterized by that in the secondary Structure of the nucleic acid molecule Hairpin loop binding the nucleic acid mole küls to an angiotropin related protein molecule taught.

8. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gegebenenfalls zusam men mit regulatorischen Elementen. 8. Vector containing a nucleic acid molecule after one of claims 1 to 7, optionally together with regulatory elements.

9. Vektor nach Anspruch 8, der ein Cosmid, Phage, Liposom oder Plasmid ist.9. The vector of claim 8, which is a cosmid, phage, Is liposome or plasmid.

10. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9.10. Host cell containing a vector after one of claims 8 or 9.

11. Nucleinsäure-Komplex, umfassend ein Nucleinsäu remolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und Me tallionen oder/und ein Protein.11. Nucleic acid complex comprising a nucleic acid remolecule according to one of claims 1 to 7 and Me tallions and / or a protein.

12. Nucleinsäure-Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Familie der S100-Proteine stammt.12. Nucleic acid complex according to claim 11, characterized characterized that the protein from the family of the S100 proteins.

13. Nucleinsäure-Komplex nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Angio tropin related protein-Molekül oder Calgranulin C ist.13. Nucleic acid complex according to claim 11 or 12, characterized in that the protein is an angio tropin related protein molecule or calgranulin C. is.

14. Nucleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Metall ionen Cu²⁺-, Mg²⁺-, Ca²⁺-, Na⁺-, K⁺- oder Zn²⁺-Ionen sind.14. Nucleic acid complex according to one of claims 11 to 13, characterized in that the metal ions are Cu ²⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ or Zn ²⁺ ions.

15. Nucleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Nuc leinsäure-Komplex ein Ribonucleotidpolypeptid ist.15. Nucleic acid complex according to one of the claims 11 to 14, characterized in that the nuc linseic acid complex is a ribonucleotide polypeptide.

16. Nucleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein metallhaltiges Ribonucleotidpolypeptid ist.16. Nucleic acid complex according to one of the claims 11 to 15, characterized in that this one metal-containing ribonucleotide polypeptide.

17. Antikörper, der spezifisch einen Nucleinsäure- Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 erkennt und bindet. 17. Antibody that specifically targets a nucleic acid Recognizes complex according to one of claims 11 to 16 and binds.

18. Antikörper nach Anspruch 17, der ein monoclona ler oder polyclonaler Antikörper ist.18. Antibody according to claim 17, which is a monoclona ler or polyclonal antibody.

19. Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremole küls in eukaryontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, in vitro oder in vivo umfassend die folgenden Schritte:

- Modifikation des zu transportierenden Nucleinsäu remoleküls, das natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex und/oder ähnlichen Komplexen in Zusammenhang steht, durch Anlagerung von Se quenzen eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Bedingun gen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' geeignet sind;
- Herstellung eines ternären Komplexes durch in vitro Zugabe von Metall-Ionen und mindestens ei nem Protein zu dem modifizierten Nucleinsäuremo lekül; und
- Applikation des hergestellten ternären Komplexes auf Zellen oder Gewebe, in die das modifizierte Nucleinsäuremolekül eingebracht werden soll.

19. A method for transporting a nucleic acid molecule in eukaryotic cells, cell cultures or tissues, in particular cells and tissues of mammals and birds, in vitro or in vivo, comprising the following steps:

- Modification of the Nucleinsäu remoleküls to be transported, which is naturally not related to the angiotropin complex and / or similar complexes, by attachment of Se sequences of a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 7, the conditions under suitable conditions to form a hairpin with the consensus sequence 5'-CUG-3 'are suitable;
- Production of a ternary complex by in vitro addition of metal ions and at least one protein to the modified nucleic acid molecule; and
- Application of the ternary complex produced to cells or tissues into which the modified nucleic acid molecule is to be introduced.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das modifi zierte Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit enzyma tischer Aktivität ist.20. The method of claim 19, wherein the modifi graced nucleic acid molecule with enzyma activity.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die Metall-Ionen Cu²⁺-, Zn²⁺-, Mg²⁺- oder Ca²⁺- Ionen sind. 21. The method according to any one of claims 19 or 20, wherein the metal ions are Cu ²⁺ , Zn ²⁺ , Mg ²⁺ or Ca ²⁺ ions.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranulin C oder ein ähnliches Protein, insbesondere ein das Bindemotiv von ARP oder Calgranulin C für das Nuc leinsäuremolekül aufweisendes Protein ist.22. The method according to any one of claims 19 to 21, the protein being an ARP molecule, calgranulin C or a similar protein, especially one that ARP or Calgranulin C binding motif for the Nuc protein containing linseic acid molecule.

23. Verfahren zur Induzierung angiogenetischer Pro zesse in Gewebe eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:

- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom plexierung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Sinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen der angiogenetische Prozess in duziert werden soll.

23. A method for inducing angiogenic processes in tissue of a mammalian organism, comprising the following steps:

- Preparation of a ternary complex by complexing a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 7 in sense orientation with metal ions and optionally a protein in vitro; and
- Application of the complexed nucleic acid to tissue in which the angiogenic process is to be induced.

24. Verfahren zur Hemmung angiogenetischer Prozesse in Gewebe eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:

- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom plexierung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Antisinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen ein angiogenetischer Prozess ge hemmt werden soll.

24. A method for inhibiting angiogenic processes in tissue of a mammalian organism, comprising the following steps:

- Preparation of a ternary complex by complexing a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 7 in antisense orientation with metal ions and optionally a protein in vitro; and
- Application of the complexed nucleic acid to tissue in which an angiogenic process is to be inhibited.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Metall- Ionen Cu²⁺-, Mg²⁺-, Ca²⁺-, Na⁺-, K⁺- oder Zn²⁺-Ionen sind.25. The method according to claim 24, wherein the metal ions are Cu ²⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ or Zn ²⁺ ions.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranulin C oder ein ähnliches Protein ist.26. The method of claim 24 or 25, wherein the Protein an ARP molecule, calgranulin C or a is similar protein.

27. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, einen Nucleinsäu re-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 gegebenenfalls zusammen mit einem Träger.27. Diagnostic composition comprising a Nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 7, a vector according to one of claims 8 or 9, a host cell according to claim 10, a nucleic acid re-complex according to one of claims 11 to 16 or an antibody according to any one of claims 17 or 18 optionally together with a carrier.

28. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, einen Nucleinsäu re-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.28. A pharmaceutical composition comprising a Nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 7, a vector according to one of claims 8 or 9, a host cell according to claim 10, a nucleic acid re-complex according to one of claims 11 to 16 or an antibody according to any one of claims 17 or 18 optionally together with a pharmaceutical compatible carrier.

29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur spezifischen Beeinflussung der Angiomorpho genese und des vaskulären Zustand eines Gewebes des Körpers von Organismen.29. Pharmaceutical composition according to claim 28 for specific influencing of angiomorpho genesis and vascular condition of a tissue of the Body of organisms.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur Übertragung genetischer Informationen in Zellen. 30. Pharmaceutical composition according to claim 28 for the transmission of genetic information in Cells.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur selektiven Veränderung des Nucleinsäurege haltes von Zellen.31. A pharmaceutical composition according to claim 28 for selective change of the nucleic acid gene hold of cells.

32. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei nem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Be dingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' fähig ist, zur Modifikation von Nucleinsäuremolekülen, die natür licherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex im Zusammenhang stehen, so dass diese modifizierten Nucleinsäuremoleküle unter geeigneten Bedingungen an ARP, Calgranulin C oder ähnliche Proteine binden und in Zielzellen transportiert werden können.32. Use of a nucleic acid molecule according to ei nem of claims 1 to 7, which under suitable loading conditions for forming a hairpin loop with the consensus sequence 5'-CUG-3 'is capable of Modification of nucleic acid molecules that are natural certainly not with the angiotropin complex in the Related, so this modified Nucleic acid molecules under suitable conditions bind to ARP, calgranulin C or similar proteins and can be transported in target cells.

33. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei nem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Be dingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' fähig ist, zur Isolierung und/oder zum Transport von Proteinen, an die diese Nucleinsäuremoleküle binden können und die so zum Transport von Nucleinsäuremolekülen in Zielzellen eingesetzt werden können.33. Use of a nucleic acid molecule according to ei nem of claims 1 to 7, which under suitable loading conditions for forming a hairpin loop with the consensus sequence 5'-CUG-3 'is capable of Isolation and / or for the transport of proteins that can bind these nucleic acid molecules and which are used to transport nucleic acid molecules in Target cells can be used.

34. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei nem der Ansprüche 1 bis 7 in Sinn-Orientierung zur Herstellung von Therapeutika zur Induzierung angio genetischer Prozesse und/oder zur Wundheilung.34. Use of a nucleic acid molecule according to ei nem of claims 1 to 7 in sense orientation Manufacture of therapeutic agents for inducing angio genetic processes and / or for wound healing.

35. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei nem der Ansprüche 1 bis 7 in Antisinn-Orientierung zur Herstellung von Therapeutika zur Hemmung angio genetischer Prozesse und/oder zur Bekämpfung von Tumoren. 35. Use of a nucleic acid molecule according to ei nem of claims 1 to 7 in anti-sense orientation for the production of therapeutic agents for inhibiting angio genetic processes and / or to combat Tumors.

36. Verwendung von ARP, Calgranulin C oder der Nuc leinsäurekomplexe nach einem der Ansprüche 11 bis 16 als Transportmolekül für Nucleotidsequenzen, insbesondere RNA-Moleküle.36. Use of ARP, Calgranulin C or the Nuc linseic acid complexes according to any one of claims 11 to 16 as a transport molecule for nucleotide sequences, especially RNA molecules.

37. Verfahren zur Reduktion der Proliferation von Zellen und/oder zur vorzeitigen Einleitung der Dif ferenzierung von Zellen, wobei ein Nucleinsäuremo lekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ein Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, ein Nucleinsäurekomplex nach ei nem der Ansprüche 11 bis 16 und/oder ein Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 in die Zelle eingeschleust wird und dabei die Aktivität und/oder Expression des L27a-Gens oder davon codierten Gen produktes hemmt oder reduziert.37. Procedure for reducing the proliferation of Cells and / or for the early initiation of the dif differentiation of cells, wherein a nucleic acid mo lekül according to one of claims 1 to 7, a vector according to one of claims 8 or 9, a host cell according to claim 10, a nucleic acid complex according to ei nem of claims 11 to 16 and / or an antibody according to one of claims 17 or 18 in the cell is introduced and thereby the activity and / or Expression of the L27a gene or gene encoded thereby product inhibits or reduces.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle ei ne stark proliferierende Zelle, insbesondere eine Stammzelle, degenerierte Zelle oder Tumorzelle ist.38. The method of claim 37, wherein the cell is egg ne proliferating cell, especially one Stem cell, degenerate cell or tumor cell.

39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle ei ne krankhaft veränderte Zelle, insbesondere eine Zelle des Psoriasis-Formenkreises ist.39. The method of claim 37, wherein the cell is egg ne pathologically altered cell, especially one Is the cell of the psoriasis form.

40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle ei ne Nervenzelle ist.40. The method of claim 37, wherein the cell is egg ne nerve cell.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei ein Nucleinsäurekomplex nach einem der An sprüche 11 bis 16 eingesetzt wird.41. The method according to any one of claims 37 to 40, wherein a nucleic acid complex according to one of the An sayings 11 to 16 is used.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Nuclein säurekomplex ein Protein aufweist, das die Bin dungsdomäne von Calgranulin C oder ARP an das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, insbesondere die ARNA I(s)-Sequenz, und eine Bin dungsdomäne an einen Oberflächenrezeptor der Zelle aufweist.42. The method of claim 41, wherein the nuclein acid complex has a protein that the bin domain of Calgranulin C or ARP to the nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 7, especially the ARNA I (s) sequence, and a bin domain to a cell surface receptor having.