DE10107317A1 - Method for the detection of mutations - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren und deren Verwendung, wobei neuartige Primer- Kombinationen verwendet werden, die eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlauben. Die Erfindung betrifft weiterhin Nachweiskits und Multi-Tag-Vektoren als Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren sowie deren Verwendung.The present invention relates to methods for the detection of mutations in nucleic acids and their use, whereby novel primer Combinations are used that make a distinction between Translation products of a wild-type nucleic acid and a mutant Allow nucleic acid. The invention further relates to detection kits and Multi-tag vectors as cloning and / or expression vectors as well their use.
Mutationen stellen durch chemische oder physikalische Einflüsse verursachte Veränderungen des genetischen Materials einer Zelle oder eines Organismus dar. So führen z. B. erkennbare Mutationen zu Änderungen in Struktur- oder Regulatorgenen und zeigen sich entweder durch das Fehlen oder durch Veränderungen von Enzymen, Strukturproteinen, Stoffwechselreaktionen oder Stoffwechselleistungen. Auswirkungen auf morphologische Merkmale können z. B. Änderungen in der Pigmentierung, Körperstruktur oder Reaktionen auf Umweltveränderungen sein. Daher spielt besonders in der Forschung und der medizinischen Diagnostik eine sensitive und spezifische Analyse von Mutationen eine wichtige Rolle.Mutations are caused by chemical or physical influences caused changes in the genetic material of a cell or of an organism. B. recognizable mutations Changes in structural or regulatory genes and show up either by the absence or by changes in enzymes, Structural proteins, metabolic reactions or metabolic performance. Effects on morphological features can e.g. B. Changes in pigmentation, body structure or reactions Environmental changes. Therefore, plays especially in research and medical diagnostics a sensitive and specific analysis of Mutations play an important role.
Die genaueste Methode zur Mutationsanalyse stellt die DNA-Sequenzierung dar. Mit diesem Verfahren kann eine DNA von einigen hundert Nukleotiden innerhalb weniger Stunden sequenziert werden. Allerdings handelt es sich bei diesem Verfahren um ein technisch sehr aufwendiges Verfahren mit einer relativ geringen Sensitivität. Daher findet die DNA-Sequenzierung zur Detektion von Mutationen nur in sehr wenigen Fällen Anwendung. The most accurate method for mutation analysis is DNA sequencing With this method, a DNA of several hundred nucleotides can can be sequenced within a few hours. However, it is in this process using a technically very complex process a relatively low sensitivity. Therefore, DNA sequencing takes place Mutation detection only used in very few cases.
Ein technisch wesentlich weniger aufwendiges Verfahren, das sich zudem zur Analyse einer großen Probenanzahl eignet, stellt die sequenzspezifische Hybridisierung, z. B. auf DNA-Chips dar. Solche Hybridisierungsverfahren ermöglichen eine sensitive und spezifische Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren, sind jedoch nur in den Fällen anwendbar, in denen die potentiellen Mutationen der Nukleinsäure vor der Analyse genau bekannt sind. Dadurch sind Hybridisierungsverfahren nur sehr begrenzt einsetzbar und dienen lediglich zur Identifizierung oder Kontrolle einer erwarteten Mutation in einer Nukleinsäure.A technically much less complex process that also suitable for analyzing a large number of samples, the sequence-specific Hybridization, e.g. B. on DNA chips. Such hybridization methods enable sensitive and specific detection of mutations in Nucleic acids, however, are only applicable in cases where the potential mutations in the nucleic acid are known prior to analysis are. As a result, hybridization methods can only be used to a very limited extent and are only used to identify or control an expected Mutation in a nucleic acid.
Ein weiteres Verfahren zur Mutationsdetektion in Nukleinsäuren mit relativ geringem technischen Aufwand und hoher Sensitivität, stellt der "Single Strand Conformation Polymorphism" (SSCP) dar. Dieses Verfahren basiert auf einer detektierbaren Konformationsänderung in Genen und ist daher lediglich auf sehr wenige Gene und sehr kurze Genabschnitte anwendbar. Eine Mutationsdetektion einer beliebig ausgewählten Nukleinsäure lässt sich daher in der Regel mit diesem Verfahren nicht durchführen.Another method for mutation detection in nucleic acids with relative low technical effort and high sensitivity, the "Single Strand Conformation Polymorphism "(SSCP). This method is based on a detectable conformational change in genes and is therefore only applicable to very few genes and very short gene segments. Mutation detection of an arbitrarily selected nucleic acid leaves therefore generally do not perform this procedure.
Das PTT ("Protein Truncation Test")-Verfahren ist ein weiteres Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren. Dieses Verfahren stellt aufgrund seiner großen Anwendbarkeit eines der gebräuchlichsten Verfahren zur Mutationsdetektion in Nukleinsäuren dar und ermöglicht eine Mutationsdetektion auf Proteinebene anhand der Translationsprodukte der untersuchten Nukleinsäure. Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende, isolierte genomische DNA oder cDNA zunächst in vitro transkribiert und translatiert. Bei der Translation werden radioaktiv markierte Aminosäuren (z. B. 35S Methionin) eingesetzt, um die translatierten Proteine nach Auftrennung durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese durch Autoradiographie zu detektieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine sensitive und spezifische Analyse von Mutationen anhand der Molekulargewichtsverteilung der translatierten Proteine, verfügt jedoch über zahlreiche Nachteile. Da die Mutationsdetektion des PTT-Verfahrens durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Autoradiographie der translatierten Proteine erfolgt, können mit Hilfe dieses Verfahrens nur Mutationen erfasst werden, die zu einem Translationsstop und damit zu einem im Vergleich zum Wildtyp-Protein deutlich kleineren Protein führen. Leseraster-Verschiebungsmutationen, die nicht zu einem Translationsstop führen und Leseraster-Verschiebungsmutationen oder Stop-Mutationen, die zu einem Translationsstop im Bereich des 3'-Endes der untersuchten Nukleinsäure führen, können mit dem PTT-Verfahren nicht detektiert werden, da der Molekulargewichtsunterschied zwischen mutiertem Protein und Wildtyp-Protein zu gering ist, um durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen zu werden. Ein weiterer Nachteil des herkömmlichen PTT-Verfahrens ist, dass aufgrund der notwendigen Verfahrensschritte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie keine vollständige Automatisierung des Verfahrens möglich ist. Durch den notwendigen Einsatz radioaktiver Aminosäuren kann das PTT-Verfahren nicht in jedem herkömmlichen Standardlabor durchgeführt werden und ist zudem sehr teuer in der Durchführung. Ein weiteres Problem, das sich bei dem PTT-Verfahren stellt, ist, dass vor der in vitro-Transkription und Translation keine Anreicherung der zu untersuchenden Nukleinsäure erfolgt. Daher können nur Proben untersucht werden, die eine große Kopienanzahl der zu untersuchenden Nukleinsäure enthalten, wie z. B. Tumore. Dadurch verfügt das PTT-Verfahren vor allem in der medizinischen Diagnostik über einen sehr geringen Anwendungsbereich.The PTT ("Protein Truncation Test") method is another method for the detection of mutations in nucleic acids. Because of its great applicability, this method represents one of the most common methods for mutation detection in nucleic acids and enables mutation detection at the protein level using the translation products of the nucleic acid under investigation. In this method, the isolated genomic DNA or cDNA to be examined is first transcribed and translated in vitro. Radioactively labeled amino acids (eg 35 S methionine) are used in the translation in order to detect the translated proteins after separation by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis by autoradiography. This method enables a sensitive and specific analysis of mutations based on the molecular weight distribution of the translated proteins, but has numerous disadvantages. Since the mutation detection of the PTT method is carried out by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and subsequent autoradiography of the translated proteins, this method can only detect mutations that lead to a translation stop and thus to a protein that is significantly smaller than the wild-type protein. Reading frame shift mutations that do not lead to a translation stop and reading frame shift mutations or stop mutations that lead to a translation stop in the region of the 3 ′ end of the nucleic acid under investigation cannot be detected with the PTT method, since the molecular weight difference between mutated Protein and wild-type protein is too low to be detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Another disadvantage of the conventional PTT method is that due to the necessary process steps SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography it is not possible to fully automate the process. Due to the necessary use of radioactive amino acids, the PTT process cannot be carried out in every conventional standard laboratory and is also very expensive to carry out. Another problem that arises with the PTT method is that there is no enrichment of the nucleic acid to be examined before the in vitro transcription and translation. Therefore, only samples can be examined that contain a large number of copies of the nucleic acid to be examined, such as. B. tumors. As a result, the PTT method has a very small area of application, especially in medical diagnostics.
Zusammenfassend ist in der Literatur bisher kein geeignetes Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren beschrieben, das gleichzeitig eine Analyse jeder Art von DNA und RNA sowie eine sensitive und spezifische Detektion praktisch aller möglichen relevanten Mutationen zulässt, nicht radioaktiv, technisch einfach und automatisierbar ist und sich für den Einsatz in Hochdurchsatz-Systemen einsetzen lässt. In summary, no suitable method for Detection of mutations in nucleic acids described simultaneously an analysis of every kind of DNA and RNA as well as a sensitive and specific detection of practically all possible relevant mutations permits, is not radioactive, is technically simple and can be automated and is for use in high-throughput systems.
Der vorliegenden Erfindung lag daher das Ziel zugrunde, Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitzustellen, welche die genannten Nachteile entsprechend dem Stand der Technik nicht aufweisen.The object of the present invention was therefore to develop methods for Detection of mutations in nucleic acids that provide the not have mentioned disadvantages according to the prior art.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur
Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
According to the invention, this object is achieved by a method for the detection of mutations in nucleic acids, comprising the steps:
- a) Amplifizieren der gesuchten Nukleinsäure, um ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt zu erhalten, unter Verwendung von Primer- Kombinationen, die so ausgewählt werden, dass das Amplifikationsprodukt eine Nukleotidsequenz aufweist, die (i) translatierbar ist und (ii) eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und den Translationsprodukten einer mutierten Nukleinsäure erlaubt,a) Amplify the nucleic acid sought to a double-stranded To obtain amplification product using primer Combinations that are selected so that the Amplification product has a nucleotide sequence which (i) is translatable and (ii) a distinction between Translation products of a wild-type nucleic acid and the Allows translation products of a mutated nucleic acid,
- b) in vitro Transkribieren und Translatieren der Amplifikationsprodukte undb) in vitro transcribing and translating the amplification products and
- c) Nachweisen der translatierten Proteine.c) detection of the translated proteins.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Primer-Kombinationen, die so ausgewählt werden, dass das Amplifikationsprodukt eine Nukleotidsequenz aufweist, die translatierbar ist und eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten, einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlaubt, wird erstmals ein Verfahren zur Mutationsdetektion bereitgestellt, das eine nicht-radioaktive, hoch sensitive und spezifische Detektion von Sequenzmutationen in Nukleinsäuren erlaubt, die zu einem Verlust oder zu einer Veränderung der Aminosäurenzusammensetzung eines Proteinabschnitts führen (siehe Fig. 1). Auf Grund des geringen technischen Aufwands des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Verfahren in jedem herkömmlichen Standardlabor eingesetzt werden, um jede Art von DNA oder RNA auf das Vorhandensein von Mutationen zu testen, ohne Kenntnis der zu erwartenden Mutationen. By using primer combinations according to the invention, which are selected such that the amplification product has a nucleotide sequence that is translatable and allows a distinction to be made between translation products, a wild-type nucleic acid and a mutated nucleic acid, a method for mutation detection is provided for the first time Non-radioactive, highly sensitive and specific detection of sequence mutations in nucleic acids, which lead to a loss or to a change in the amino acid composition of a protein segment (see FIG. 1). Because of the low technical complexity of the method according to the invention, the method can be used in any conventional standard laboratory in order to test any type of DNA or RNA for the presence of mutations, without knowing the mutations to be expected.
Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf der Amplifikation der zu untersuchenden Nukleinsäure, um ein transkribierbares und translatierbares Amplifikationsprodukt zu erhalten, das eine Detektion von Mutationen in der Nukleinsäure erlaubt. Für die Amplifikation der zu untersuchenden Nukleinsäure werden traditionelle Verfahren, wie PCR oder RT-PCR, herangezogen, wobei nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Primer-Kombinationen verwendet werden, die eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlauben.Step (a) of the method according to the invention is based on the amplification the nucleic acid to be examined in order to create a transcribable and to obtain translatable amplification product which is a detection of Mutations in the nucleic acid allowed. For the amplification of the Examining nucleic acids are traditional methods such as PCR or RT-PCR, used, according to the inventive method Primer combinations are used that make a distinction between translation products of a wild-type nucleic acid and one allow mutated nucleic acid.
Die neuartigen Primer-Kombinationen des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfassend in 5'→3'Richtung einen spezifischen Vorwärts-Primer mit
The novel primer combinations of the method according to the invention comprise a specific forward primer in the 5 '→ 3' direction
- a) einer Promotorsequenz für die Transkription,a) a promoter sequence for transcription,
- b) einem Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wildtyp-Nukleinsäure ermöglicht,b) a translation start motif, which is a translation in the reading frame which enables wild-type nucleic acid
- c) mindestens einem Sequenzabschnitt der, für ein nachweisbares erstes Peptid codiert undc) at least one sequence section of the, for a detectable encoded first peptide and
- d) einem Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlaubend) a sequence section that is sufficiently identical to the Sequence at the 5 'end of the nucleic acid searched for by one to allow specific attachment and amplification
und in 3'→5'Richtung einen spezifischen Rückwärts-Primer mitand in the 3 '→ 5' direction with a specific reverse primer
- 1. einem Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,1. a sequence section that is sufficiently complementary to Sequence at the 3 'end of the nucleic acid searched for by one to allow specific attachment and amplification,
- 2. mindestens einem Sequenzabschnitt, der für mindestens ein nachweisbares zweites Peptid, welches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wildtyp- Nukleinsäure liegt,2. at least one sequence section that is for at least one detectable second peptide, which is from the first peptide is different, coded and in the reading frame of the wild-type Nucleic acid,
- 3. Sequenzabschnitten, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp- Nukleinsäure entstehen und3. Sequence sections, each for at least one detectable third and fourth peptides, which are of the first and second peptides are different, encode and lie in the two reading frames that by shifting the reading frame of the wild-type Nucleic acid arise and
- 4. drei Stop-Motiven, eines für jeden möglichen Leserahmen,4. three stop motifs, one for every possible reading frame,
wobei die Reihenfolge der Sequenzabschnitte (b) und (c) des Rückwärts- Primers vertauscht sein kann.the order of the sequence sections (b) and (c) of the backward Primers can be swapped.
Ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass die beiden spezifischen Primer der erfindungsgemäßen Primer-Kombination Sequenzabschnitte aufweisen, die für mindestens ein nachweisbares erstes Peptid, mindestens ein nachweisbares zweites Peptid und mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid codieren. Diese Sequenzabschnitte können frei gewählt werden, besitzen jedoch vorzugsweise eine Länge im Bereich von 6-100 Nukleotiden, bevorzugt 9-60 Nukleotiden und besonders bevorzugt 9-45 Nukleotiden und codieren für nachweisbare Peptide, die entweder direkt, z. B. über direkte spezifische, hochaffine Wechselwirkung mit Bindepartnern wie vom Typ Ligand-Rezeptor, Antigen-Antikörper und/oder indirekt, z. B. über eine Aminosäureseitenketten-Markierung, nachweisbar sind. Die Erfindung sieht jedoch vorzugsweise vor, dass diese Sequenzabschnitte aus den in SEQ. ID NO.: 1-20 gezeigten Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden.A preferred feature of the method according to the invention is that the two specific primers of the primer combination according to the invention Have sequence sections for at least one detectable first Peptide, at least one detectable second peptide and at least one encode detectable third and fourth peptide. This Sequence sections can be chosen freely, but have preferably a length in the range of 6-100 nucleotides, preferred 9-60 nucleotides and particularly preferably 9-45 nucleotides and code for detectable peptides that are either direct, e.g. B. via direct specific, high affinity interaction with binding partners such as type Ligand receptor, antigen antibody and / or indirectly, e.g. B. via a Amino acid side chain labeling, are detectable. The invention sees however, preferably that these sequence sections from the in SEQ. ID NO .: 1-20 nucleic acid sequences shown can be selected.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen, neuartigen Primer- Kombinationen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das eine nicht-radioaktive Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren auf Proteinebene ermöglicht. Gleichzeitig erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine Unterscheidung zwischen einer Stop-Mutation oder einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Stop-Signal führt und einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Stop- Signal führt.By using the novel primer Combinations, the present invention provides a method that a non-radioactive detection of mutations in nucleic acids Protein level enables. At the same time, the invention allows Procedure for the first time a distinction between a stop mutation or a reading frame shift mutation that leads to a stop signal and a reading frame shift mutation that does not result in a stop Signal leads.
Codieren in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Sequenzabschnitte (c) des Vorwärts-Primers und die Sequenzabschnitte (b) und (c) des Rückwärts-Primers der erfindungsgemäßen Primer-Kombination für immunologisch nachweisbare Peptide, dann erfolgt der Nachweis der Peptide vorzugsweise über die entsprechenden spezifischen Antikörper. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine hoch sensitive und hoch spezifische Mutationsdetektion. Enthält der spezifische Vorwärts-Primer zusätzlich Sequenzabschnitte (c), die für zwei unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren, so kann Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens - der Nachweis der translatierten Proteine und somit die Mutationsdetektion - mittels differenziellem ELISA erfolgen.Coding in a preferred embodiment of the invention The sequence sections (c) of the forward primer and the Sequence sections (b) and (c) of the reverse primer of the Primer combination according to the invention for immunologically detectable Peptides, then the peptides are preferably detected via the corresponding specific antibodies. So it enables inventive method a highly sensitive and highly specific Mutation detection. Also contains the specific forward primer Sequence sections (c) for two different detectable first Coding peptides, step (c) of the method according to the invention can the detection of the translated proteins and thus the mutation detection - using a differential ELISA.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden Primer-Kombinationen verwendet, bei denen der spezifische Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (c) enthält, die für ein gleiches nachweisbares drittes und viertes Peptid codieren. In diesem Fall erfolgt die Detektion von Leseraster-Verschiebungsmutationen, die in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure entstehen und nicht zu einem Translationsstop führen, über das gleiche nachweisbare Peptid. Allerdings kann so der Leserahmen der mutierten Nukleinsäure nicht mehr eindeutig identifiziert werden. Soll der Leserahmen der mutierten Nukleinsäure hingegen genauer bestimmt werden, so enthält der Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (c), die für unterschiedliche dritte und vierte Peptide codieren.In a further embodiment of the method according to the invention, combinations of primers are used in which the specific Reverse primer contains sequence segments (c) that are the same encode detectable third and fourth peptide. In this case the Detection of reading frame shift mutations in the two Reading frames are located by shifting the reading frame of the searched wild-type nucleic acid arise and not to one Carry out translation stop via the same detectable peptide. Indeed the reading frame of the mutated nucleic acid can no longer be unambiguous be identified. Should the reading frame of the mutated nucleic acid the reverse primer contains Sequence sections (c) for different third and fourth peptides encode.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von
Mutationen in Nukleinsäuren umfasst die in vitro Transkription und
Translation der Amplifikationsprodukte aus Schritt (a). Vorzugweise erfolgt
die in vitro Transkription und Translation der Amplifikationsprodukte durch
Zugabe von Zelllysat. Als Zelllysate werden vorzugsweise kommerzielle
oder selbst hergestellte Lysate aus transkriptions- und translationsaktiven
Säugerzellen, wie z. B. Retikulozyten aus Kaninchen, Pflanzenzellen, wie
z. B. Weizenkeim und/oder Bakterienzellen, wie z. B. E. coli, verwendet. In
Abhängigkeit von dem Vorhandensein einer Mutation in der gesuchten
Nukleinsäure der zu analysierenden Probe, können in Schritt (b) des
erfindungsgemäßen Verfahrens im allgemeinen drei verschiedene
Mischungen von Translationsprodukten entstehen (Fig. 1):
Step (b) of the method according to the invention for the detection of mutations in nucleic acids comprises the in vitro transcription and translation of the amplification products from step (a). The in vitro transcription and translation of the amplification products is preferably carried out by adding cell lysate. As cell lysates are preferably commercial or self-made lysates from transcription and translation active mammalian cells, such as. B. rabbit reticulocytes, plant cells such. B. wheat germ and / or bacterial cells, such as. BE coli used. Depending on the presence of a mutation in the nucleic acid of the sample to be analyzed, three different mixtures of translation products can generally arise in step (b) of the method according to the invention ( FIG. 1):
- A) Enthält die gesuchte Nukleinsäure keine Mutationen, entsteht bei der Translation ausschließlich das Wildtyp-Protein, das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und am C-Terminus an mindestens ein nachweisbares zweites Peptid fusioniert ist.A) If the nucleic acid you are looking for does not contain any mutations, the Translation only the wild-type protein that is at the N-terminus at least one detectable first peptide and at the C-terminus is fused to at least one detectable second peptide.
- B) Enthält die gesuchte Nukleinsäure eine Stop-Mutation oder eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Translationsstop führt, entsteht bei der Translation mutiertes Protein, dessen Aminosäuregesamtlänge im Vergleich zum Wildtyp-Protein verkürzt ist und das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid fusioniert ist, während an den C-Terminus kein nachweisbares Peptid fusioniert ist. Wenn in der Probe auch nicht- mutierte gesuchte Nukleinsäure vorkommt, dann entsteht zusätzlich Wildtyp-Protein (I).B) Does the nucleic acid searched contain a stop mutation or a Reading frame shift mutation leading to a translation stop leads to the translation of mutated protein, the Total amino acid length shortened compared to the wild-type protein at the N terminus to at least one verifiable first Peptide is fused, while no at the C-terminus detectable peptide is fused. Even if not in the sample mutated searched nucleic acid occurs, then additionally arises Wild type protein (I).
- C) Enthält die gesuchte Nukleinsäure eine Leseraster- Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Translationsstop führt, entsteht bei der Translation mutiertes Protein, das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und am C-Terminus an mindestens ein nachweisbares drittes oder viertes Peptid fusioniert ist. Wenn in der Probe auch nicht mutierte gesuchte Nukleinsäure vorkommt, dann entsteht zusätzlich Wildtyp-Protein (I).C) Does the nucleic acid searched contain a reading frame Displacement mutation that does not lead to a translation stop, During translation, mutant protein is produced, which is attached to the N-terminus at least one detectable first peptide and at the C-terminus at least one detectable third or fourth peptide fused is. If there is a non-mutated nucleic acid in the sample occurs, then additional wild-type protein (I) is formed.
Die neuartige Primer-Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht eine selektive und spezifische Mutationsdetektion, wobei das Translationsprodukt der gesuchten Nukleinsäure (nicht-mutiertes unverkürztes Wildtyp-Protein, mutiertes verkürztes Wildtyp-Protein aufgrund einer Leseraster-Verschiebungsmutation oder einer Punktmutation, die zu einem Translationsstop führt oder/und mutiertes unverkürztes Wildtyp-Protein aufgrund einer Leseraster- Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Translationsstop führt) anhand der verschiedenen nachweisbaren ersten, zweiten, dritten und vierten Peptide identifiziert werden kann. Wird nur das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure detektiert, das N-terminal an ein nachweisbares erstes Peptid und C-terminal an ein nachweisbares zweites Peptid fusioniert ist, liegt in der gesuchten Nukleinsäure keine Sequenzmutation vor. Ist das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure hingegen N-terminal an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und C-terminal an mindestens ein nachweisbares drittes oder viertes Peptid fusioniert, enthält die untersuchte Nukleinsäure eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Translationsstop führt. Verfügt das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure nur über mindestens ein N-terminal fusioniertes nachweisbares erstes Peptid, jedoch über kein C-terminal fusioniertes Peptid, so weist die untersuchte Nukleinsäure eine Stop-Mutation oder eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Translationsstop führt, oder den (monoallelischen) Verlust der gesamten Sequenz auf.The novel primer combination of the method according to the invention enables selective and specific mutation detection, whereby the Translation product of the nucleic acid sought (non-mutated unabridged wild-type protein, mutated truncated wild-type protein due to a reading frame shift mutation or Point mutation that leads to a translation stop or / and mutated unabridged wild-type protein due to a reading frame Displacement mutation that does not lead to a translation stop) the various detectable first, second, third and fourth Peptides can be identified. If only the translation product of investigated nucleic acid detected, the N-terminal to a detectable first peptide and C-terminal fused to a detectable second peptide there is no sequence mutation in the nucleic acid sought. Is this Translation product of the nucleic acid examined, however, at the N-terminal at least one detectable first peptide and C-terminal at least a detectable third or fourth peptide fused contains the nucleic acid examined a reading frame shift mutation that did not leads to a translation stop. Has the translation product of examined nucleic acid only via at least one N-terminally fused detectable first peptide, but not fused via a C-terminal Peptide, the nucleic acid examined has a stop mutation or a Reading frame shift mutation that leads to a translation stop, or the (monoallelic) loss of the entire sequence.
So ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelungen, ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitzustellen, das alle Sequenzmodulationen erfasst, die eine Leseraster-Verschiebung beinhalten und zum Verlust und zum vorzeitigen Stop der Translation eines Proteinabschnitts führen. Zusätzlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren jede Art von DNA und/oder RNA, die durch herkömmliche PCR und/oder RT-PCR amplifizierbar ist, einer Mutationsdetektion zu unterziehen. Aufgrund der nicht-radioaktiven Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren anhand der Anwesenheit der verschiedenen nachweisbaren ersten, zweiten, dritten und vierten Peptide im Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure, ist das erfindungsgemäße Verfahren in jedem herkömmlichen Standardlabor einsetzbar. The method according to the invention has succeeded in doing this to detect mutations in nucleic acids, all Sequence modulations recorded, which include a reading frame shift and the loss and premature stopping of translation Lead protein section. In addition, the invention enables Process any type of DNA and / or RNA by conventional PCR and / or RT-PCR is amplifiable to a mutation detection undergo. Due to the non-radioactive detection of mutations in Nucleic acids based on the presence of the different detectable first, second, third and fourth peptides in the translation product of examined nucleic acid, the method according to the invention is in each conventional standard laboratory.
In Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Nachweis der
translatierten Proteine, vorzugsweise umfassend die folgenden Schritte:
In step (c) of the method according to the invention, the translated proteins are detected, preferably comprising the following steps:
- a) ein zumindest teilweises Entfernen von nicht-mutiertem Wildtyp- Protein,a) an at least partial removal of non-mutated wild-type Protein,
- b) eine Immobilisierung der translatierten Proteine undb) immobilization of the translated proteins and
- c) eine Proteindetektion, die qualitativ, vorzugsweise jedoch auch quantitativ durchgeführt werden kann.c) a protein detection, qualitatively, but preferably also can be carried out quantitatively.
Vorzugsweise erfolgt die Immobilisierung der translatierten Proteine (ii) über
ein nachweisbares erstes Peptid. Dabei können die Translationsprodukte
der gesuchten Nukleinsäure beispielsweise an einer festen Matrix
immobilisiert werden, die einen spezifischen Bindepartner für das erste
Peptid enthält. Die nachfolgende Proteindetektion (iii) der immobilisierten
Proteine, die gleichzeitig die Mutationsanalyse beinhaltet, umfasst
vorzugweise die folgenden Schritte:
The translated proteins (ii) are preferably immobilized via a detectable first peptide. The translation products of the nucleic acid sought can be immobilized, for example, on a solid matrix which contains a specific binding partner for the first peptide. The subsequent protein detection (iii) of the immobilized proteins, which also includes the mutation analysis, preferably comprises the following steps:
- a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine durch Bestimmung eines weiteren nachweisbaren ersten Peptids oder durch einen Antikörper gegen das Protein,a) detection of the total amount of proteins by determining a further detectable first peptide or by an antibody against the protein,
- b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren zweiten Peptids und/oderb) detection of the amount of non-mutated wild-type protein by Determination of a detectable second peptide and / or
- c) Detektion der Menge an mutiertem Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren dritten und/oder vierten Peptids.c) detection of the amount of mutant protein by determining a detectable third and / or fourth peptide.
Das Vorhandensein einer nachweisbaren Mutation erfolgt vorzugsweise rechnerisch durch Differenz Gesamtprotein minus Wildtyp-Protein (siehe Fig. 1).The presence of a detectable mutation is preferably carried out arithmetically by difference total protein minus wild-type protein (see FIG. 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht zwei bevorzugte
Ausführungsformen für den Nachweis der translatierten Proteine (c) vor:
In einer ersten Ausführungsform erfolgt Schritt (c) des erfindungsgemäßen
Verfahrens mittels differenziellem ELISA, vorzugsweise dann, wenn es sich
bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide
handelt und wenn die Sequenzabschnitte (c) des spezifischen Vorwärts-
Primers der erfindungsgemäßen Primer-Kombinationen für mindestens zwei
unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren.The method according to the invention provides two preferred embodiments for the detection of the translated proteins (c):
In a first embodiment, step (c) of the method according to the invention is carried out by means of differential ELISA, preferably if the detectable peptides are immunologically detectable peptides and if the sequence sections (c) of the specific forward primer of the primer combinations according to the invention for at least encode two different detectable first peptides.
In diesem Fall erfolgt die Entfernung des nicht mutierten Wildtyp-Proteins (i) vorzugsweise durch Präzipitation mit Matrices oder immobilisierten Antikörpern, die an das immunologisch nachweisbare zweite Peptid binden. Für die Präzipitation des nicht mutierten Wildtyp-Proteins mit Matrices werden vorzugweise unlösliche Matrices verwendet, wie z. B. Cellulose oder Agarose, an denen entsprechende Antikörper und/oder andere Proteine, wie z. B. Avidin, immobilisiert sind, die entweder kovalent oder nichtkovalent, jedoch hoch affin das immunologisch nachweisbare zweite Peptid des Wildtyp-Proteins binden. Vorzugsweise werden Matrices in Form magnetischer oder nicht-magnetischer Beads verwendet, auf denen Antikörper gegen das immunologisch nachweisbare zweite Peptid immobilisiert sind. Dafür eignen sich kommerziell erhältliche Protein-A und/oder Protein-G-Matrices. Diese bestehen aus einer unlöslichen Kohlenhydrat-Matrix aus Cellulose oder Agarose, an die kovalent die bakteriellen Proteine, Protein A oder Protein G, gebunden sind, die wiederum nicht kovalent aber mit sehr hoher Affinität an fast alle Klassen von Antikörpern binden. Wird der entsprechende Antikörper an die Protein- A- oder Protein-G-Matrices gebunden, so erfolgt die Präzipitation des nicht- mutierten Wildtyp-Proteins über die Wechselwirkung zwischen Antikörper und immunologisch nachweisbarem zweiten Peptid. Ist das nachweisbare zweite Peptid des nicht mutierten Wildtyp-Proteins Biotin markiert, so erfolgt die Präzipitation vorzugsweise mit Matrices wie Cellulose oder Agarose, an die das Protein Avidin gebunden ist. Handelt es sich bei dem nachweisbaren zweiten Peptid hingegen um ein (His)6-Tag, so kann das nicht mutierte Wildtyp-Protein über eine Ni-NTA-Agarose-Matrix entfernt werden. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Anreicherung des mutierten Proteins und damit selbst eine Mutationsdetektion in Proben, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.In this case, the non-mutated wild-type protein (i) is preferably removed by precipitation with matrices or immobilized antibodies which bind to the immunologically detectable second peptide. For the precipitation of the non-mutated wild-type protein with matrices, preferably insoluble matrices are used, e.g. As cellulose or agarose, on which appropriate antibodies and / or other proteins, such as. B. avidin, are immobilized, which bind either covalently or non-covalently, but with high affinity, the immunologically detectable second peptide of the wild-type protein. Matrices in the form of magnetic or non-magnetic beads are preferably used, on which antibodies against the immunologically detectable second peptide are immobilized. Commercially available Protein A and / or Protein G matrices are suitable for this. These consist of an insoluble carbohydrate matrix made of cellulose or agarose, to which the bacterial proteins, protein A or protein G, are covalently bound, which in turn do not bind covalently but with very high affinity to almost all classes of antibodies. If the corresponding antibody is bound to the protein A or protein G matrices, the non-mutated wild-type protein is precipitated via the interaction between the antibody and the immunologically detectable second peptide. If the detectable second peptide of the non-mutated wild-type protein biotin is labeled, the precipitation is preferably carried out with matrices such as cellulose or agarose, to which the protein avidin is bound. However, if the detectable second peptide is a (His) 6 tag, the non-mutated wild-type protein can be removed using a Ni-NTA agarose matrix. The method according to the invention thus enables the mutated protein to be enriched and thus mutation detection in samples which contain only very small amounts of mutated DNA or RNA.
Die Immobilisierung der translatierten Proteine (ii) erfolgt vorzugsweise über Antikörper gegen das erste nachweisbare erste Peptid auf einer Mikrotiter- Platte, oder über Bindepartner für das erste nachweisbare erste Peptid auf einer entsprechend modifizierten Platte (z. B. Ni2+-beschichtete Platte, Avidin-beschichtete Platte), wobei die zu analysierende Probe der Translationsprodukte in mindestens drei und vorzugsweise mindestens vier Aliquote aufgeteilt wird, die auf verschiedene Depots der Platte verteilt werden.The translated proteins (ii) are preferably immobilized via antibodies against the first detectable first peptide on a microtiter plate, or via binding partners for the first detectable first peptide on a correspondingly modified plate (e.g. Ni 2+ -coated plate, Avidin-coated plate), the sample of the translation products to be analyzed being divided into at least three and preferably at least four aliquots, which are distributed over different depots of the plate.
Die nachfolgende Proteindetektion (iii), die gleichzeitig die
Mutationsanalyse beinhaltet, umfasst in diesem Fall die folgenden Schritte:
In this case, the subsequent protein detection (iii), which also includes the mutation analysis, comprises the following steps:
- a) Detektion der Gesamtmenge der immobilisierten Proteine mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein weiteres immunologisch nachweisbares erstes Peptid (in einem ersten Depot der Mikrotiterplatte) oder durch einen Antikörper gegen das Protein,a) detection of the total amount of immobilized proteins with a monoclonal antibody against another immunologically detectable first peptide (in a first depot of the Microtiter plate) or by an antibody against the protein,
- b) Detektion der Menge an immobilisiertem nicht-mutiertem Wildtyp- Protein mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein nachweisbares zweites Peptid (in einem zweiten Depot der Mikrotiterplatte) und/oderb) detection of the amount of immobilized non-mutated wild-type Protein with a monoclonal antibody against a detectable second peptide (in a second depot of the microtiter plate) and or
-
c) Detektion der Menge an immobilisiertem mutiertem Protein mit
monoklonalen Antikörpern gegen ein immunologisch nachweisbares
drittes und viertes Peptid (in einem dritten und/oder vierten Depot
der Mikrotiterplatte),
wobei der Nachweis der Mutation durch Quantifizierung der detektierten Proteinmengen und Berechnung (differenzieller ELISA) erfolgt.c) detection of the amount of immobilized mutant protein with monoclonal antibodies against an immunologically detectable third and fourth peptide (in a third and / or fourth depot of the microtiter plate),
where the detection of the mutation is carried out by quantification of the detected protein amounts and calculation (differential ELISA).
Alternativ können für die Proteindetektion (iii) Nachweisreagenzien, z. B. Antikörper verwendet werden, die unterschiedliche Markierungen tragen, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emmissionsmaxima. Dies führt zu einer wesentlichen Vereinfachung des Nachweises der translatierten Proteine, da die zu untersuchende Probe der Translationsprodukte nun nicht mehr in Aliquote aufgeteilt werden muss, sondern eine Analyse der verschiedenen immunologisch nachweisbaren Peptide in nur einem Ansatz, z. B. einem Depot der Platte, ermöglicht wird.Alternatively, detection reagents, e.g. B. Antibodies with different labels are used, such as B. fluorescent dyes with different emission maxima. This leads to a significant simplification of the proof of translated proteins because the sample to be examined is the Translation products no longer have to be divided into aliquots, but an analysis of the various immunologically detectable Peptides in only one approach, e.g. B. a depot of the plate is made possible.
In einer zweiten Ausführungsform erfolgt Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels chromatographischer bzw. elektrophoretischer Auftrennung, z. B. nach Größe und nachfolgender Detektion, vorzugsweise dann, wenn es sich bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide oder direkt nachweisbare Peptide (über Avidin-Matrix oder Ni-NTA-Matrix) handelt.In a second embodiment, step (c) of the method according to the invention by means of chromatographic or electrophoretic separation, e.g. B. by size and subsequent Detection, preferably when it is in the detectable Peptides around immunologically detectable peptides or directly detectable peptides (via avidin matrix or Ni-NTA matrix).
In diesem Fall erfolgt die Entfernung des nicht mutierten Wildtyp-Proteins (i) vorzugsweise durch Affinitätschromatographie. Dieser affinitätschromatographische Reinigungsschritt führt zu einer Anreicherung der mutierten Proteine. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren selbst eine Mutationsdetektion in Proben, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.In this case, the non-mutated wild-type protein is removed (i) preferably by affinity chromatography. This Affinity chromatographic purification step leads to an enrichment of the mutated proteins. The method according to the invention thus enables even a mutation detection in samples containing only very small amounts contain mutated DNA or RNA.
Die analytische Trennung und Immobilisierung der translatierten Proteine (ii) erfolgt vorzugsweise mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließendem Western-Blotting, d. h. Transfer auf eine Membran.Analytical separation and immobilization of the translated proteins (ii) is preferably carried out by means of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and then Western blotting, d. H. Transfer to a membrane.
Die auf der Membran immobilisierten Proteine werden durch
Nachweisreagenzien, z. B. Antikörper gegen die verschiedenen
immunologisch nachweisbaren Peptide detektiert, wobei die
Proteindetektion (iii) folgende Schritte umfasst:
The proteins immobilized on the membrane are determined by detection reagents, e.g. B. Antibodies to the various immunologically detectable peptides are detected, the protein detection (iii) comprising the following steps:
- a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine mit einem Antikörper gegen ein immunologisch nachweisbares erstes Peptid oder mit einem Antikörper gegen das Protein, a) Detection of the total amount of proteins with an antibody against an immunologically detectable first peptide or with an antibody to the protein,
- b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein mit einem Antikörper gegen ein immunologisch nachweisbares zweites Peptid und/oderb) detection of the amount of non-mutated wild-type protein with a Antibodies against an immunologically detectable second peptide and or
- c) Detektion der Menge an mutiertem Protein mit Antikörpern gegen ein immunologisch nachweisbares drittes und viertes Peptid.c) detection of the amount of mutant protein with antibodies against a immunologically detectable third and fourth peptide.
Erfolgt die Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens über den Nachweis der translatierten Proteine, wird eine hoch sensitive und spezifische Mutationsdetektion ermöglicht. So werden ausschließlich Proteine erfasst, die als Ergebnis der in vitro Translation mit dem richtigen Start-Codon und im gewünschten Leserahmen entstanden sind. Unspezifische Nebenprodukte werden hingegen nicht detektiert. Des weiteren liegt die Nachweisgrenze der Detektion in Größenordnungen, die selbst eine Detektion von Mutationen in Proben zulässt, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.Mutations in nucleic acids are detected in accordance with this preferred embodiment of the method according to the invention Detection of the translated proteins becomes a highly sensitive and enables specific mutation detection. So only Proteins captured as a result of in vitro translation with the correct one Start codon and in the desired reading frame. However, non-specific by-products are not detected. Of further the detection limit of the detection lies in orders of magnitude that even a detection of mutations in samples, which only very contain small amounts of mutated DNA or RNA.
Wird der Nachweis der translatierten Proteine des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels ELISA durchgeführt, so kann das gesamte Verfahren problemlos automatisiert werden und an ein Hochdurchsatz-System angepasst werden. Somit wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitgestellt, das eine schnelle, hoch sensitive, hoch spezifische und automatisierbare Mutationsdetektion in jeder Art von DNA und/oder RNA ermöglicht.If the detection of the translated proteins of the invention Procedure carried out by means of ELISA, so the entire procedure can be easily automated and connected to a high-throughput system be adjusted. Thus, with the method according to the invention for the first time a method for the detection of mutations in nucleic acids provided that a fast, highly sensitive, highly specific and automatable mutation detection in any kind of DNA and / or RNA allows.
Erfolgt der Nachweis der translatierten Proteine durch chromatographische bzw. elektrophoretische Auftrennung und anschließender Detektion, so gibt ein weiterer Parameter, nämlich die Größe der translatierten Proteine, Aufschluss über die zu detektierenden Mutationen. The translated proteins are detected by chromatographic or electrophoretic separation and subsequent detection, so there another parameter, namely the size of the translated proteins, Information about the mutations to be detected.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird vor Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt die Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung an eine zur gesuchten Sequenz komplementäre Sequenz, die immobilisiert sein kann. Dieser Schritt ist für die eigentliche Mutationsdetektion nicht notwendig, erhöht jedoch zusätzlich die Sensitivität des nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Anreicherung der gesuchten Nukleotidsequenz ist vor allem dann günstig, wenn die gesuchte Nukleinsäure zwar in ausreichender Kopienzahl jedoch nur in sehr geringer Konzentration in der Probe vorliegt.In a further embodiment of the invention, step (a) of the inventive method an enrichment of the sought Nucleic acid performed. The enrichment of the wanted nucleic acid by hybridization to a wanted Sequence complementary sequence that can be immobilized. This Step is not necessary for the actual mutation detection, increased however, in addition, the sensitivity of the subsequent invention Process. The enrichment of the nucleotide sequence sought is above all then cheap if the nucleic acid sought is sufficient However, the number of copies is only present in the sample in a very low concentration.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch seine breite Anwendbarkeit, seine hohe Sensitivität, seine hohe Spezifität und durch die Möglichkeit der Automatisierbarkeit in weiten Bereichen der medizinischen Diagnostik einsetzbar. Beispielsweise kann das Verfahren zur Tumordiagnose (Tumorfrühdiagnose, Verlaufsdiagnose) und Tumorcharakterisierung (Tumor-Typisierung) eingesetzt werden, da praktisch alle Mutationen eines Tumor-Suppressor-Gens in der DNA aus Tumorzellen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden können. So können beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie Stuhl oder Urin eines Patienten auf tumorspezifische Mutationen in DNA mit dem Ziel der nicht-invasiven Diagnose von Darm- bzw. Blasentumoren untersucht werden. Als Analyseobjekt eignet sich hierbei z. B. das Tumor-Suppressor-Gen APC, das in mehr als 80% aller Darmtumoren mutiert ist, wobei mehr als 90% aller APC-Mutationen zu einem vorzeitigen Translationsstop führen. Vorzugsweise erfolgt in diesem Fall die Detektion der Proteingesamtmenge (Schritt (a) der Proteindetektion (i)) über einen speziell entwickelten Antikörper gegen das APC-Gen. Neben dem Tumor-Suppressor-Gen APC eignen sich auch andere Tumor-Suppressor-Gene wie p53, DCC, msh1, GTBP, mlh1, mlh2, DPC4, RB, WT1, WT2, NF1, NF2, BRCA1 und BRCA2 als Analyseobjekte zur Früh- oder Verlaufsdiagnose von Tumoren in Lunge, Pankreas, Rachenraum, Bauchraum, Brust und Gehirn, zur Tumor- Typisierung in chirurgisch entfernten Tumoren aus Lunge, Darm und Blase und zum Nachweis von vererbten Mutationen und damit von Erbkrankheiten in Keim-, Embryo- oder Blutzellen.The method according to the invention is due to its broad applicability, its high sensitivity, its high specificity and by the possibility of Can be automated in a wide range of medical diagnostics used. For example, the method for tumor diagnosis (Early tumor diagnosis, course diagnosis) and tumor characterization (Tumor typing) can be used because practically all mutations of one Tumor suppressor gene in the DNA from tumor cells using the method according to the invention can be detected. So can for example body fluids such as stool or urine from a patient tumor-specific mutations in DNA with the aim of non-invasive Diagnosis of intestinal or bladder tumors are examined. As Analysis object is suitable for. B. the tumor suppressor gene APC, that is mutated in more than 80% of all intestinal tumors, with more than 90% of all APC mutations lead to an early translation stop. In this case, the total amount of protein is preferably detected (Step (a) of protein detection (i)) via a specially developed Antibodies against the APC gene. In addition to the tumor suppressor gene APC other tumor suppressor genes such as p53, DCC, msh1, GTBP, mlh1, mlh2, DPC4, RB, WT1, WT2, NF1, NF2, BRCA1 and BRCA2 as analysis objects for the early or course diagnosis of tumors in the lungs, Pancreas, pharynx, abdomen, chest and brain, for tumor Typing in surgically removed tumors from the lungs, intestines and bladder and for the detection of inherited mutations and thus of Hereditary diseases in germ, embryo or blood cells.
Die Tabellen 1 bis 3 zeigen verschiedene Tumorarten und die dazugehörigen Tumor-Suppressor-Gene, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert bzw. typisiert werden können, sowie die nach dem entsprechen den Analyseobjekt zu untersuchenden Körperflüssigkeiten eines Patienten.Tables 1 to 3 show different types of tumors and Associated tumor suppressor genes with the invention Procedures can be diagnosed or typed, as well as after the correspond to the body fluid to be examined Patients.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt in der Analyse von Mutationen der Keimbahn. Dabei ist es von Vorteil, intakte mRNA aus embryonalen Zellen oder Blutzellen zur Mutationsdetektion heranzuziehen. Diese Strategie hat den Vorteil, dass die Ränder des analysierenden Fragments nicht von Exon-Intron-Übergängen begrenzt werden und in einem Durchgang längere Sequenzabschnitte analysiert werden können. Im Idealfall kann die gesamte Sequenz der transkribierten mRNA, also das betreffende Gen in voller Länge, analysiert werden. Another application is in the analysis of mutations the germline. It is beneficial to have intact mRNA from embryonic Use cells or blood cells for mutation detection. This Strategy has the advantage that the edges of the analyzing fragment not limited by exon-intron transitions and in one Passage longer sections of sequence can be analyzed. in the Ideally, the entire sequence of the transcribed mRNA, that is gene in question in full length.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nachweiskit, der die dem erfingungsgemäßen Verfahren zugrunde liegenden Primer-Kombinationen enthält und z. B. zum Einsatz in der Diagnose von Tumoren, insbesondere Darmtumoren und Blasentumoren, geeignet ist.Another object of the invention is a detection kit that the primer combinations on which the method according to the invention is based contains and z. B. for use in the diagnosis of tumors, in particular Intestinal tumors and bladder tumors.
Der erfindungsgemäße Nachweiskit zur Detektion von Mutationen in
Nukleinsäuren umfasst:
The detection kit according to the invention for the detection of mutations in nucleic acids comprises:
-
a) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten
Vorwärts-Primer in 5'→3'Richtung, der folgende Elemente umfasst:
- a) eine Promotorsequenz für die Tanskription,
- b) ein Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wiltyp-Nukleinsäure ermöglicht,
- c) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für ein nachweisbares erstes Peptid codiert und
- d) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,
- a) a promoter sequence for transcription,
- b) a translation start motif which enables translation in the reading frame of the wilt-type nucleic acid,
- c) at least one sequence section which codes for a detectable first peptide and
- d) a sequence section which is sufficiently identical to the sequence at the 5 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification,
-
b) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten
Rückwärts-Primer in 3'→5'Richtung, der folgende Elemente umfasst:
- a) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,
- b) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für mindestens ein nachweisbares zweites Peptid, welches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wiltyp-Nukleinsäure liegt,
- c) Sequenzabschnitte, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure entstehen und
- d) drei Stop-Motive, eines für jeden möglichen Leserahmen,
- a) a sequence segment which is sufficiently complementary to the sequence at the 3 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification,
- b) at least one sequence segment which codes for at least one detectable second peptide, which is different from the first peptide, and which is in the reading frame of the desired type of nucleic acid,
- c) sequence sections which code for at least one detectable third and fourth peptide, which are different from the first and second peptide, and which lie in the two reading frames which result from shifting the reading frame of the wild-type nucleic acid sought and
- d) three stop motifs, one for every possible reading frame,
- c) gegebenenfalls Desoxyribonukleotide,c) optionally deoxyribonucleotides,
- d) gegebenenfalls ein zur Extension der Primer geeignetes Enzym,d) optionally an enzyme suitable for extending the primers,
- e) gegebenenfalls einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten Puffer, gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe,e) if appropriate, a suitable one for the amplification reaction Buffers, optionally other auxiliary substances,
- f) gegebenenfalls Zelllysat mit hoher Transkriptions- und Translationsaktivität,f) optionally cell lysate with high transcription and Translation activity,
- g) gegebenenfalls Nachweisreagenzien für die verschiedenen nachweisbaren Peptide,g) if necessary, detection reagents for the various detectable peptides,
- h) gegebenenfalls Reagenzien zur Proteinanreicherung undh) optionally reagents for protein enrichment and
- i) gegebenenfalls Reagenzien zur Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure,i) if necessary reagents for enriching the sought Nucleic acid,
wobei die Reihenfolge der Sequenzabschnitte (ii) und (iii) des Rückwärts- Primers vertauscht sein kann.the order of the sequence sections (ii) and (iii) of the backward Primers can be swapped.
Der erfindungsgemäße Nachweiskit zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren basiert vorzugsweise auf der Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens. Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Nachweiskits stellen die beiden neuartigen Vorwärts- Primer und Rückwärts-Primer dar, die Sequenzabschnitte aufweisen, die für mindestens ein nachweisbares erstes Peptid, mindestens ein nachweisbares zweites Peptid und mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, wie zuvor beschrieben, codieren.The detection kit according to the invention for the detection of mutations in Nucleic acids are preferably based on the application of the above described procedure. An essential feature of the detection kits according to the invention provide the two novel forward Primers and reverse primers that have sequence segments that are for at least one detectable first peptide, at least one detectable second peptide and at least one detectable third and encode fourth peptide as previously described.
Das für die Extension geeignete Enzym ist bevorzugt eine thermostabile DNA-Polymerase, die eine 5'-3-'Polymerase aufweist. Das Enzym kann außerdem eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität ("Proof-Reading") enthalten.The enzyme suitable for the extension is preferably a thermostable DNA polymerase that has a 5'-3 'polymerase. The enzyme can also contain a 3'-5 'exonuclease activity ("proof reading").
Vorzugsweise besitzt der Vorwärts-Primer einen identischen Sequenzabschnitt (iv) und der Rückwärts-Primer einen komplementären Sequenzabschnitt (i), die mit genomischer DNA eines Tumor-Suppressor- Gens aus Tumorzellen, insbesondere APC-DNA, hybridisieren. Preferably the forward primer has an identical one Sequence section (iv) and the reverse primer a complementary Sequence section (i) which is linked to genomic DNA of a tumor suppressor Hybridize gene from tumor cells, in particular APC-DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Nachweiskits enthält der Vorwärts-Primer Sequenzabschnitte (iii), die für zwei unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren und der Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (ii), die für ein gleiches drittes und viertes nachweisbares Peptid codieren. Handelt es sich bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide, erfolgt der Nachweis der translatierten Proteine (c) und somit die Mutationsdetektion vorzugsweise durch ELISA.In a preferred embodiment of the detection kit, the Forward primer sequence sections (iii) for two different detect the first peptides and the reverse primer Sequence sections (ii) for an equal third and fourth encode detectable peptide. Is it the detectable Peptides around immunologically detectable peptides are detected the translated proteins (c) and thus the mutation detection preferably by ELISA.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Multi-Tag-Vektor als Klonierungsvektor und/oder Expressionsvektor, der auf dem Prinzip der erfindungsgemäßen Primer-Kombinationen beruht.Another object of the invention is a multi-tag vector as Cloning vector and / or expression vector based on the principle of primer combinations according to the invention is based.
Der Multi-Tag-Vektor besitzt eine Multi-Tag-Sequenz, die folgende
Sequenzabschnitte in 5'→3'Richtung umfasst:
The multi-tag vector has a multi-tag sequence that comprises the following sequence sections in the 5 '→ 3' direction:
- a) gegebenenfalls eine Expressions-Kontrollsequenz umfassend einen Promotor und ein Translations-Startmotiva) optionally an expression control sequence comprising one Promoter and a translation motif
- b) mindestens ein Sequenzabschnitt, z. B. ein bis drei Sequenzabschnitte, der für jeweils ein unterschiedliches nachweisbares erstes Peptid codiert, wobei der oder die Sequenzabschnitte im Leserahmen des Startcodons einer in die multiple Klonierungsstelle klonierten Nukleinsäure liegen,b) at least one sequence section, e.g. B. one to three Sequence sections that are different for each detectable first peptide encoded, the or the Sequence sections in the reading frame of the start codon one in the multiple cloning site cloned nucleic acid,
- c) eine multiple Klonierungsstelle (MCS) zur Klonierung einer Nukleinsäure,c) a multiple cloning site (MCS) for cloning a Nucleic acid,
- d) ein bis drei Sequenzabschnitte, die für unterschiedliche nachweisbare zweite Peptide, die von den nachweisbaren ersten Peptiden verschieden sind, codieren, wobei die Sequenzabschnitte in gleichen oder unterschiedlichen Leserahmen bezüglich einer in die MCS klonierten Nukleinsäure liegen, wobei sie z. B. (i) alle im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegen oder (ii) der erste Sequenzabschnitt im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegt und der zweite und dritte Sequenzabschnitt in den Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des erwarteten Leserahmens der klonierten Nukleinsäure entstehen undd) one to three sequence sections for different detectable second peptides from the detectable first Peptides are different encode, the sequence segments in same or different reading frames with respect to one in the MCS cloned nucleic acid are, z. B. (i) all in expected reading frame of the cloned nucleic acid or (ii) the first sequence section in the expected reading frame of the cloned Nucleic acid and the second and third sequence section in the Reading frames lie by shifting the expected Reading frame of the cloned nucleic acid arise and
- e) drei Stop-Codons, eines für jeden möglichen Leserahmen.e) three stop codons, one for each possible reading frame.
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Multi-Tag-Vektors stellen die Sequenzabschnitte (b) und (d) dar, die für unterschiedliche nachweisbare erste und unterschiedliche nachweisbare zweite Peptide codieren. Die nachweisbaren ersten Peptide sind dabei voneinander verschieden. Die nachweisbaren zweiten Peptide sind verschieden von den ersten Peptiden und untereinander verschieden. Die Sequenzabschnitte sind frei wählbar, weisen jedoch eine Länge im Bereich von 6-90 Nukleotiden, vorzugsweise 9-60 Nukleotiden und besonders bevorzugt 9-45 Nukleotiden auf und codieren für nachweisbare Peptide, die entweder direkt und/oder indirekt, z. B. über Aminosäureseitenketten-Markierung nachweisbar sind. Zusätzlich befindet sich zwischen den einzelnen Sequenzabschnitten der Multi-Tag-Sequenz mindestens jeweils eine Restriktionsschnittstelle für Restriktionsendonukleasen. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) enthält vorzugsweise mindestens eine Restriktionsschnittstelle für Restriktionsendonukleasen zur Klonierung einer Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt die Multi-Tag-Sequenz des Multi-Tag-Vektors je eine der in SEQ. ID NO. 21 und SEQ. ID NO. 22 angegebenen Sequenzen.An essential feature of the multi-tag vector according to the invention represent the sequence sections (b) and (d) for different detectable first and different detectable second peptides encode. The detectable first peptides are different from each other different. The detectable second peptides are different from that first peptides and different from each other. The sequence sections are freely selectable, but have a length in the range of 6-90 nucleotides, preferably 9-60 nucleotides and particularly preferably 9-45 Nucleotides and encode detectable peptides that are either directly and / or indirectly, e.g. B. via amino acid side chain labeling are detectable. In addition, there is between the individual Sequence sections of the multi-tag sequence at least one each Restriction interface for restriction endonucleases. The multiple Cloning site (MCS) preferably contains at least one Restriction interface for restriction endonucleases for cloning a Nucleic acid. In a preferred embodiment of the invention the multi-tag sequence of the multi-tag vector each one of the in SEQ. ID NO. 21 and SEQ. ID NO. 22 sequences indicated.
Zusätzlich erhält der Multi-Tag-Vektor gegebenenfalls weitere für eine prokaryontische und/oder eukaryontische Replikation und Expression benötigte übliche Elemente, wie z. B. ori, Selektionsmarker (beschrieben u. a. in Sambrook et. al).In addition, the multi-tag vector may receive more for one prokaryotic and / or eukaryotic replication and expression required common elements, such as. B. ori, selection marker (described inter alia. in Sambrook et. al).
Der erfindungsgemäße Multi-Tag-Vektor ist als Klonierungs- und/oder Expressionsvektor für prokaryontische und/oder eukaryontische Wirtszellen einsetzbar. Er kann z. B. verwendet werden, um den Leserahmen einer klonierten Nukleinsäure zu bestimmen und/oder zu verifizieren. Dazu wird eine zu untersuchende Nukleinsäure zunächst in die multiple Klonierungsstelle des Multi-Tag-Vektors einkloniert. Das so entstandene Expressionsplasmid wird dann für eine spätere Expression in eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen transformiert. Nach erfolgter Expression kann der Leserahmen der klonierten Nukleinsäure über die Anwesenheit der verschiedenen C-terminalen nachweisbaren zweiten Peptide des exprimierten Translationsproduktes bestimmt werden. Die nachweisbaren Peptide können dabei direkt oder indirekt, wie zuvor beschrieben, nachgewiesen werden. Vorzugsweise erfolgt ein direkter Nachweis der Peptide über spezifische Antikörper gegen die verschiedenen nachweisbaren Peptide.The multi-tag vector according to the invention is a cloning and / or Expression vector for prokaryotic and / or eukaryotic host cells used. He can e.g. B. used to read a reading frame to determine and / or verify cloned nucleic acid. This will a nucleic acid to be examined first into the multiple Cloned site of the multi-tag vector cloned. The resulting Expression plasmid is then used for later expression eukaryotic and / or prokaryotic cells transformed. To Once the expression is complete, the reading frame of the cloned nucleic acid can be used the presence of the various C-terminal detectable second Peptides of the expressed translation product can be determined. The Detectable peptides can be directly or indirectly, as before described, demonstrated. Preferably a more direct one Detection of the peptides via specific antibodies against the different detectable peptides.
Desweiteren kann der Multi-Tag-Vektor eingesetzt werden, um die Eignung der verschiedenen nachweisbaren ersten und zweiten Peptide für die Analyse und/oder Reinigung eines Proteins, das durch die klonierte Nukleinsäure codiert wird, in einem Schritt zu testen. Dazu wird die zu Vektors einkloniert und das so entstandene Expressionsplasmid für die Expression in eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen transformiert. Das Translationsprodukt ist N-terminal und C-terminal an verschiedene nachweisbare erste und zweite Peptide fusioniert. Diese Peptide können nun in der betreffenden Anwendung getestet werden. Da die einzelnen Sequenzabschnitte der Multi-Tag-Sequenz durch Restriktionsschnittstellen begrenzt werden, kann das Gen nach durchgeführter Analyse zusammen mit dem geeigneten nachweisbaren Peptid aus dem Multi-Tag-Vektor herausgeschnitten und in einen anderen Vektor für die eigentliche Anwendung ligiert werden.Furthermore, the multi-tag vector can be used to determine suitability of the various detectable first and second peptides for the Analysis and / or purification of a protein cloned by the Nucleic acid is encoded to test in one step. This will be the too Vector cloned and the resulting expression plasmid for Expression in eukaryotic and / or prokaryotic cells transformed. The translation product is N-terminal and C-terminal on different detectable first and second peptides fused. This Peptides can now be tested in the application in question. There the individual sequence sections of the multi-tag sequence Restriction sites can be limited, the gene can performed analysis together with the appropriate detectable Cut the peptide out of the multi-tag vector and into another Vector can be ligated for the actual application.
Die nachfolgenden Beispiele und Figuren sollen die Erfindung näher veranschaulichen. The following examples and figures are intended to illustrate the invention illustrate.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Detektion von Mutationen in DNA aus einer Stuhlprobe eines möglichen Darmtumorpatienten erfolgen.With the aid of the method according to the invention, the detection of Mutations in DNA from a stool sample of a possible Colon tumor patients take place.
Eine Dral-Restriktionsspaltung wurde mit 100 µl DNA einer Stuhlprobe eines möglichen Darmtumorpatienten nach bekannten Verfahrenstechniken und unter herkömmlichen Restriktionsbedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) durchgeführt.A Dral restriction digest was performed with 100 ul DNA of a stool sample of a possible intestinal tumor patient using known process techniques and under conventional restriction conditions (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
10 µl Streptavidin-Dynabeads wurden zweimal mit je 40 µl 1 × B (5 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,5 mM EDTA; 1 M NaCl) gewaschen und anschließend in 100 µl 2 × B resuspendiert. 100 µl der Dral restringierten Stuhl-DNA (Beispiel 1a) wurden mit 10 µmol APC1b-Biotin- Primer (Sequenz: 5'-TTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCACAGAAA CAGT-3', Annealing mit APC-Gen im Bereich von nt 3559 bis nt 3598; 10 pmol/µl) vermischt. Die DNA wurde im PCR-Gerät für 5 min bei 95°C denaturiert. Danach erfolgte ein Annealingschritt für 10 min bei 56°C mit anschließender Abkühlung für 10 min bei 4°C. Die DNA wurde mit den Dynabeads vermischt und der Ansatz wurde über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Roller inkubiert. Anschließend wurden die Dynabeads mit einem Magneten separiert und der Überstand entfernt. Die Dynabeads wurden zweimal mit je 200 µl 1 × B und einmal mit je 500 µl destilliertem Wasser gewaschen. Die APC-DNA-gebundenen Dynabeads wurden komplett in einer nachfolgenden 50 µl PCR-Reaktion eingesetzt. 10 ul streptavidin-Dynabeads were twice with 40 ul 1 × B (5 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.5 mM EDTA; 1 M NaCl) washed and then resuspended in 100 µl 2 × B. 100 µl of the Dral Restricted stool DNA (Example 1a) were mixed with 10 µmol APC1b-biotin Primer (sequence: 5'-TTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCACAGAAA CAGT-3 ', annealing with APC gene in the range from nt 3559 to nt 3598; 10 pmol / µl) mixed. The DNA was in the PCR device for 5 min at 95 ° C denatured. This was followed by an annealing step for 10 min at 56 ° C subsequent cooling for 10 min at 4 ° C. The DNA was created with the Dynabeads mixed and the approach was overnight at Incubated room temperature on a roller. Then the Dynabeads separated with a magnet and the supernatant removed. The Dynabeads were mixed twice with 200 µl 1 × B and once with 500 µl of distilled water each. The APC-DNA bound Dynabeads were completely processed in a subsequent 50 µl PCR reaction used.
Die in Beispiel 1b hergestellten Dynabeads mit gebundener APC-DNA
wurden mit 5,0 µl PCR-Puffer (10x), 5,0 µl BSA (1 µg/pl), 1,0 µl dNTP (10 mM
jeweils), 2,0 µl 5'-Primer (Sequenz: 5'-GGATCCTAATACGACTCACTA
TAGGAACAGACCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATG
TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCCCTTCATCACAGAAACAGTC-3',
der 5'-Primer enthält den für die Transkription notwendigen Promotor, zwei
Kopien des HA-Tags mit je einem Start-Codon und einen Bereich, der
identisch mit der Sequenz nt 3580 bis nt 3600 des APC-Gens ist; 10 pmol/µl),
2,0 µl 3'-Primer (Sequenz: 5'-CTACGGTGCTGTCCAGGCCC
AGCAGGGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCGGTGCTGTCCAGGCCCAGCAG
GGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCCTTGCCGTCGATAAGCCTGGGGTCCA
CCTGGTCCTCTGACTTTGTTGGCATGGCAG-3', der 3'-Primer enthält einen
Bereich, der komplementär zur Sequenz nt 4759 bis nt 4779 des APC-
Gens ist, den Protein C-Tag und zweimal den V5-Tag jeweils in den zum
Leserahmen des APC-Gens alternativen Rahmen sowie ein Stop-Codon; 10 pmol/µl)
und 0,5 µl HotStarTaq-Polymerase (5 U/µl) vermischt und das
Gemisch auf ein Gesamtvolumen von 50 µl mit destilliertem Wasser
aufgefüllt. Der so hergestellte PCR-Ansatz wurde in einem PCR-Gerät
folgendem PCR-Programm unterzogen:
The Dynabeads with bound APC-DNA produced in Example 1b were mixed with 5.0 µl PCR buffer (10x), 5.0 µl BSA (1 µg / pl), 1.0 µl dNTP (10 mM each), 2.0 µl 5'-primer (sequence: 5'-GGATCCTAATACGACTCACTA TAGGAACAGACCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATG TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCCCTTCATCACAGAAACAGTC-3 ', the 5'-primer contains one copy of the code and one copy of the promoter, the one with the transcription, one copy of the start and one transcription the sequence of nt 3580 to nt 3600 of the APC gene is 10 pmol / ul), 2.0 ul 3 'primer (sequence: 5'-CTACGGTGCTGTCCAGGCCC AGCAGGGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCGGTGCTGTCCAGGCCCAGCAG GGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCCTTGCCGTCGATAAGCCTGGGGTCCA CCTGGTCCTCTGACTTTGTTGGCATGGCAG-3', the 3 'primer contains a region, which is complementary to the sequence nt 4759 to nt 4779 of the APC gene, the protein C tag and twice the V5 tag in the frame alternative to the reading frame of the APC gene and a stop codon; 10 pmol / µl) and 0 , 5 µl HotStarTaq polymerase (5th U / µl) mixed and the mixture made up to a total volume of 50 µl with distilled water. The PCR mixture thus prepared was subjected to the following PCR program in a PCR device:
-
a) ein Denaturierungszyklus:
95°C, 15 mina) a denaturation cycle:
95 ° C, 15 min -
b) vierzig PCR-Zyklen:
- a) Denaturierung 95°C, 30 sec
- b) Annealing 56°C, 1 min
- c) Elongation 72°C, 1 min, 30 sec.
- a) Denaturation 95 ° C, 30 sec
- b) Annealing 56 ° C, 1 min
- c) elongation 72 ° C, 1 min, 30 sec.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde nach bekannten Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) aufgereinigt. The PCR product thus obtained was according to known methods (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
20 µl des TNT T7 PCR Quick Master Mix (Fa. Clontech) wurden mit 0,5 µl Methionin (1 mM), 2,0 µl destilliertem Wasser und 2,5 µl PCR-Produkt vermischt. Die Mischung wurde für 90 min bei 30°C inkubiert.20 µl of the TNT T7 PCR Quick Master Mix (Clontech) was mixed with 0.5 µl Methionine (1 mM), 2.0 µl distilled water and 2.5 µl PCR product mixed. The mixture was incubated at 30 ° C for 90 min.
Geeignete Beads, wie z. B. Ni-NTA-magnetische Beads, Protein G-Agarose mit gebundenen Antikörpern, etc. wurden mit einem geeigneten Puffer (abhängig von den verwendeten Beads, z. B. PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Beads in 20 µl eines geeigneten Puffers (abhängig von den verwendeten Beads, z. B. PBS) aufgenommen und mit 20 µl der TNT-Reaktionsmischung aus Beispiel 1d vermischt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C auf einem Roller inkubiert. Die Beads wurden separiert, mittels Magnet oder Zentrifuge, und der Überstand entfernt. Nun wurden die Beads zweimal mit je 200 µl Puffer gewaschen und in 20 µl 1 × SDS-Beladelösung resuspendiert.Suitable beads, such as. B. Ni-NTA magnetic beads, Protein G agarose with bound antibodies, etc. were with a suitable buffer (depending on the beads used, e.g. PBS). The beads were then placed in 20 μl of a suitable buffer (depending on the beads used, e.g. PBS) added and with 20 μl of the TNT reaction mixture from Example 1d are mixed. The approach was incubated overnight at 4 ° C on a roller. The beads were separated, using a magnet or centrifuge, and the supernatant removed. Now the beads were washed twice with 200 ul buffer and in 20 ul 1 × SDS loading solution resuspended.
Auf ein 12%iges SDS-Polyacrylamidgel (Acrylamid : Bisacryamid 37,5 : 1) wurden 1-5 µl der TNT-Reaktionsmischung aus Beispiel 1d oder 1-5 µl Eluat aus Beispiel 1e aufgetragen und eine herkömmliche SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt (siehe z. B. Sambrook et al., supra).On a 12% SDS polyacrylamide gel (acrylamide: bisacryamide 37.5: 1) 1-5 ul of the TNT reaction mixture from Example 1d or 1-5 ul Eluate from Example 1e applied and a conventional SDS Polyacrylamide gel electrophoresis performed (see e.g. Sambrook et al., supra).
Nach beendeter SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde ein Semidry- Western-Blot unter Verwendung einer PVDF-Membran nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt (siehe Sambrook et al., supral. Danach wurde die PVDF-Membran entfernt und für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungslösung (PBS, 0,1% Tween, 5% Magermilchpulver) inkubiert. Anschließend wurde die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur in Antikörperlösung (anti-HA-Peroxidase 1 : 5000, anti-ProtC 1 : 400, anti-V5 1 : 10000) inkubiert und dreimal für je 10 min bei Raumtemperatur mit Waschlösung (PBS, 0,1% Tween) gewaschen. Nun wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einer zweiten Antikörperlösung (anti-Maus- HRP) behandelt und dreimal für je 10 min bei Raumtemperatur mit Waschlösung (PBS, 0,1% Tween) gewaschen. Die Detektion erfolgte mit ECL-Plus-Reagenz.After SDS polyacrylamide gel electrophoresis had been completed, a semidry Western blot using a conventional PVDF membrane Procedure carried out (see Sambrook et al., Supral. Then the PVDF membrane removed and in for 1 h at room temperature Blocking solution (PBS, 0.1% Tween, 5% skimmed milk powder) incubated. The PVDF membrane was then in for 1 h at room temperature Antibody solution (anti-HA peroxidase 1: 5000, anti-ProtC 1: 400, anti-V5 1: 10000) and three times for 10 min each at room temperature Wash solution (PBS, 0.1% Tween). Now the membrane for 1 h at room temperature with a second antibody solution (anti-mouse HRP) treated and three times for 10 min each at room temperature Wash solution (PBS, 0.1% Tween). The detection was carried out with ECL Plus reagent.
Fig. 1 zeigt einen Überblick über das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren. Ausgehend von gereinigter DNA oder RNA werden die Nukleinsäurekopien, die analysiert werden sollen, durch Hybridisierung an immobilisierte komplementäre Sequenzen gefischt. Bei Verwendung von RNA wird anschließend eine reverse Transkription durchgeführt. Dann wird die Nukleinsäuresequenz in einer konventionellen PCR amplifiziert, wobei erfindungsgemäße Primer- Kombinationen verwendet werden, die spezifische Vorwärts-Primer und spezifische Rückwärts-Primer umfassen, die eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlauben. In der anschließenden in vitro Transkription und Translation können drei Kombinationen (I bis III) von Proteinen entstehen. Zur Erhöhung der Detektionssensitivität kann ein Teil des Wildtyp-Proteins abgetrennt werden. Zur anschließenden Detektion der Mutation gibt es zwei Möglichkeiten, der differentielle ELISA (links) oder die SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit anschließendem Western-Blotting (rechts). Fig. 1 shows an overview of the inventive method for detecting mutations in nucleic acids. Starting from purified DNA or RNA, the nucleic acid copies to be analyzed are fished by hybridization to immobilized complementary sequences. When using RNA, reverse transcription is then carried out. The nucleic acid sequence is then amplified in a conventional PCR, using primer combinations according to the invention which comprise specific forward primers and specific reverse primers which allow a distinction to be made between translation products of a wild-type nucleic acid and a mutated nucleic acid. In the subsequent in vitro transcription and translation, three combinations (I to III) of proteins can arise. To increase the detection sensitivity, part of the wild-type protein can be separated. There are two options for the subsequent detection of the mutation, differential ELISA (left) or SDS-polyacrylamide gel electrophoresis with subsequent Western blotting (right).
Fig. 2A zeigt schematisch die Technik der Anreicherung der interessierenden Genkopien (hier: APC-Gene) durch Hybridisierung. Zur aus Stuhl gereinigten DNA werden Oligonukleotide der Sequenz des APC-Gens gegeben, die eine Biotin-Markierung tragen. Nach Hybridisierung mit den APC-Genkopien werden die Oligonukleotide aus der Lösung mit Hilfe Streptavidin-gekoppelter magnetischer Beads gefischt. Nach einem Wasch- Schritt können die angereicherten APC-Genkopien als Template in einer PCR-Reaktion eingesetzt werden. Fig. 2A schematically shows the technique of enhancement of gene copies of interest (here: APC gene) by hybridization. Oligonucleotides of the sequence of the APC gene which carry a biotin label are added to the DNA purified from stool. After hybridization with the APC gene copies, the oligonucleotides are fished from the solution with the aid of streptavidin-coupled magnetic beads. After a washing step, the enriched APC gene copies can be used as templates in a PCR reaction.
Fig. 2B zeigt ein Agarose-Gel, das die Anreicherung einer gesuchten DNA- Sequenz aus menschlichem Stuhl durch Hybridisierung an eine zur gesuchten Sequenz komplementäre, immobilisierte synthetische Sequenz veranschaulicht. Das Agarose-Gel zeigt das Ergebnis von PCR Reaktionen ausgehend von einer DNA-Probe, wobei als Template in einer direkten PCR Amplifikation das APC-Gen diente (Spur 2 und 3). Nach Anreicherung der gesuchten Sequenz durch Hybridisierung an einen spezifischen komplementären Primer lässt sich das Gen zwar aus dem Pellet amplifizieren (Spur 6 und 7), nicht jedoch aus dem Überstand (Spur 6S und 7S). Umgekehrt lässt sich das Gen ohne spezifischen komplementären Primer nicht aus dem Pellet (Spur 4 und 5), jedoch aus dem Überstand amplifizieren (Spur 4S und 55). Auf Spur M wurde ein DNA-Marker, auf Spur 1 eine negative Kontrolle ohne DNA aufgetragen. Fig. 2B shows an agarose gel that demonstrates the enrichment of a desired DNA sequence from human stool by hybridization to a complementary sequence to the desired immobilized synthetic sequence. The agarose gel shows the result of PCR reactions based on a DNA sample, the APC gene serving as template in a direct PCR amplification (lanes 2 and 3). After the desired sequence has been enriched by hybridization to a specific complementary primer, the gene can be amplified from the pellet (lanes 6 and 7), but not from the supernatant (lanes 6S and 7S). Conversely, the gene cannot be amplified from the pellet (lanes 4 and 5) without a specific complementary primer, but from the supernatant (lanes 4S and 55). A DNA marker was applied to lane M and a negative control without DNA was applied to lane 1.
Fig. 3A zeigt einen Western-Blot, in dem - ausgehend von Kontroll-DNA oder auch menschlicher genomischer DNA aus Stuhl - die verschiedenen in vitro transkribierten und translatierten Proteine nachweisbar sind. Die Proteine wurden detektiert mit Antikörpern gegen die verschiedenen nachweisbaren Peptide. Auf Spur A. dest wurde eine negative Kontrolle aufgetragen. Ausgehend von Plasmid-DNA, zeigt das Ergebnis des Western-Blots das nicht mutierte APC Protein in voller Länge (wt, APC wt), das Protein mit einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einer Verkürzung führt (frameshift) und das Protein mit einer Mutation, die zu einem frühen Stop der Translation führt (stop, APC Δ). FIG. 3A shows a Western blot, in which - starting from control DNA or also human genomic DNA from stool - the various proteins transcribed and translated in vitro can be detected. The proteins were detected with antibodies against the various detectable peptides. A negative control was applied to trace A. dest. Based on plasmid DNA, the result of the Western blot shows the non-mutated full-length APC protein (wt, APC wt), the protein with a reading frame shift mutation that does not lead to a shortening (frameshift) and the protein with a Mutation that leads to an early stop of translation (stop, APC Δ).
Fig. 3B zeigt einen Western-Blot mit dem Ergebnis der DNA-Analyse mit der entwickelten Methode. Spur 1 bis 3: Plasmid-DNA als positive Kontrollproben. Erkennbar sind die unterschiedlichen Größen der Fragmente des normalen Wildtyp-Gens und der zwei verschiedenen mutierten Sequenzen, die zu Stop-Mutationen führen (stop 1, stop 2). Spur 4: Tumor- DNA zeigt die normale Sequenz (wt) und das verkürzte Fragment (mut). Spur 5 bis 8: DNA aus zwei verschiedenen Stuhlproben (S1, S2) zeigt in beiden Fällen das mutierte zusätzlich zum normalen Fragment. Die Analysen wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt. Spur 9: Negativ- Kontrolle ohne DNA. Fig. 3B shows a Western blot with the results of DNA analysis using the method developed. Lane 1 to 3: plasmid DNA as positive control samples. The different sizes of the fragments of the normal wild-type gene and the two different mutated sequences which lead to stop mutations can be recognized (stop 1, stop 2). Lane 4: Tumor DNA shows the normal sequence (wt) and the truncated fragment (mut). Lanes 5 to 8: DNA from two different stool samples (S1, S2) shows the mutated in addition to the normal fragment in both cases. The analyzes were carried out in duplicate. Lane 9: negative control without DNA.
Fig. 4 zeigt eine beispielhafte Abbildung eines Multi-Tag-Vektors. Die Zahlen stehen für Restriktionsschnittstellen. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) trägt 6 Schnittstellen. Die Schnittstellen sind durch waagrechte Linien über der Sequenz gekennzeichnet. Die Sequenzabschnitte, die für nachweisbare erste und zweite Peptide codieren, die Start- und Stop- Codons sind unterstrichen. A. Die Multi-Tag-Sequenz besitzt die in SEQ. ID NO. 21 angegebene Sequenz. Alle Sequenzabschnitte, die für nachweisbare erste und zweite Peptide codieren, liegen in dem vom Start- Codon definierten Leserahmen. B. Die Multi-Tag-Sequenz besitzt die in SEQ. ID NO. 22 angegebene Sequenz. Nur die Sequenzabschnitte vor der MCS, die für nachweisbare erste Peptide codieren, liegen in dem vom Start-Codon definierten Leserahmen (x). Hinter der MCS liegen die Sequenzabschnitte für nachweisbare zweite Peptide in alternativen, zu dem vom Start-Codon unterschiedlichen Leserahmen (x + 1, x + 2). Fig. 4 is an exemplary illustration shows a multi-tag vector. The numbers stand for restriction interfaces. The multiple cloning site (MCS) has 6 interfaces. The interfaces are identified by horizontal lines above the sequence. The sequence sections coding for detectable first and second peptides, the start and stop codons are underlined. A. The multi-tag sequence has that in SEQ. ID NO. 21 indicated sequence. All sequence segments which code for detectable first and second peptides lie in the reading frame defined by the start codon. B. The multi-tag sequence has that in SEQ. ID NO. 22 indicated sequence. Only the sequence sections before the MCS, which code for detectable first peptides, lie in the reading frame (x) defined by the start codon. Behind the MCS are the sequence sections for detectable second peptides in alternative reading frames (x + 1, x + 2) that differ from the start codon.
Fig. 5 zeigt einige Beispiele für mögliche Peptide mit Aminosäuresequenz sowie entsprechendem Nachweisreagenz (mAK: monoklonaler Antikörper, pAK: polyklonaler Antikörper), die an das zu analysierende Protein N- oder C-terminal fusioniert werden können. Die dazu notwendigen Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ. ID NO: 1-20 angegeben. Fig. 5 shows some examples of possible peptides having amino acid sequence as well as the appropriate detection reagent (mAb: monoclonal antibody, pAK: polyclonal antibodies), which can be fused C-terminally to the protein to be analyzed or N-. The nucleic acid sequences required for this are in SEQ. ID NO: 1-20 specified.
Claims (43)
- a) Amplifizieren der gesuchten Nukleinsäure, um ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt zu erhalten, unter Verwendung von Primerkombinationen, die so ausgewählt werden, dass das Amplifikationsprodukt eine Nukleotidsequenz aufweist, die (i) translatierbar ist und (ii) eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und den Translationsprodukten einer mutierten Nukleinsäure erlaubt,
- b) in vitro Transkribieren und Translatieren der Amplifikations- Produkte und
- c) Nachweisen der translatierten Proteine.
- a) amplifying the nucleic acid sought to obtain a double-stranded amplification product using primer combinations which are selected such that the amplification product has a nucleotide sequence which is (i) translatable and (ii) a distinction between translation products of a wild-type nucleic acid and allows the translation products of a mutated nucleic acid,
- b) in vitro transcribing and translating the amplification products and
- c) detection of the translated proteins.
- a) einer Promotorsequenz für die Transkription,
- b) einem Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wildtyp-Nukleinsäure ermöglicht,
- c) mindestens einem Sequenzabschnitt, der für ein nachweisbares erstes Peptid codiert und
- d) einem Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben
in 3'→5'Richtung einen spezifischen Rückwärts-Primer mit
- a) einem Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,
- b) mindestens einem Sequenzabschnitt, der für mindestens ein nachweisbares zweites Peptid, welches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure liegt,
- c) Sequenzabschnitten, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure entstehen und
- d) drei Stop-Motiven, eines für jeden möglichen Leserahmen,
- a) a promoter sequence for transcription,
- b) a translation start motif which enables translation in the reading frame of the wild-type nucleic acid,
- c) at least one sequence section which codes for a detectable first peptide and
- d) a sequence section which is sufficiently identical to the sequence at the 5 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification
in the 3 '→ 5' direction with a specific reverse primer
- a) a sequence section which is sufficiently complementary to the sequence at the 3 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification,
- b) at least one sequence segment which codes for at least one detectable second peptide, which is different from the first peptide, and which is in the reading frame of the wild-type nucleic acid sought,
- c) sequence sections which code for at least one detectable third and fourth peptide, which are different from the first and second peptide, and which lie in the two reading frames which result from shifting the reading frame of the wild-type nucleic acid sought and
- d) three stop motifs, one for every possible reading frame,
- a) ein zumindest teilweises Entfernen von nicht-mutiertem Wildtyp-Protein,
- b) eine Immobilisierung der translatierten Proteine und
- c) eine Proteindetektion
- a) an at least partial removal of non-mutated wild-type protein,
- b) immobilization of the translated proteins and
- c) protein detection
- a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine durch Bestimmung eines weiteren nachweisbaren ersten Peptids,
- b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren zweiten Peptids und/oder
- c) Detektion der Menge an mutiertem Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren dritten und vierten Peptids.
- a) detection of the total amount of proteins by determining a further detectable first peptide,
- b) detection of the amount of non-mutated wild-type protein by determination of a detectable second peptide and / or
- c) detection of the amount of mutant protein by determining a detectable third and fourth peptide.
- a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine durch Bestimmung eines nachweisbaren ersten Peptids,
- b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren zweiten Peptids und/oder
- c) Detektion der Menge an mutiertem Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren dritten und vierten Peptids.
- a) detection of the total amount of proteins by determining a detectable first peptide,
- b) detection of the amount of non-mutated wild-type protein by determination of a detectable second peptide and / or
- c) detection of the amount of mutant protein by determining a detectable third and fourth peptide.
- a) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten
Vorwärts-Primer in 5'→3'Richtung, der folgende Elemente
umfasst:
- a) eine Promotorsequenz für die Transkription,
- b) ein Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wildtyp-Nukleinsäure ermöglicht,
- c) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für ein nachweisbares erstes Peptid codiert und
- d) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,
- b) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten
Rückwärts-Primer in 3'→5'Richtung, der folgende Elemente
umfasst:
- a) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben,
- b) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für ein nachweisbares zweites Peptid, welches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure liegt,
- c) Sequenzabschnitte, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp- Nukleinsäure entstehen und
- d) drei Stop-Motive, eines für jeden möglichen Leserahmen,
- c) gegebenenfalls Desoxyribonukleotide,
- d) gegebenenfalls ein zur Extension der Primer geeignetes Enzym,
- e) gegebenenfalls einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe,
- f) gegebenenfalls Zelllysat mit hoher Transkriptions- und Translationsaktivität,
- g) gegebenenfalls Nachweisreagenzien für die verschiedenen nachweisbaren Peptide,
- h) gegebenenfalls Reagenzien zur Proteinanreicherung und
- i) gegebenenfalls Reagenzien zur Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure,
- a) at least one forward primer suitable for the amplification reaction in the 5 '→ 3' direction, which comprises the following elements:
- a) a promoter sequence for transcription,
- b) a translation start motif which enables translation in the reading frame of the wild-type nucleic acid,
- c) at least one sequence section which codes for a detectable first peptide and
- d) a sequence section which is sufficiently identical to the sequence at the 5 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification,
- b) at least one reverse primer in the 3 '→ 5' direction suitable for the amplification reaction, which comprises the following elements:
- a) a sequence segment which is sufficiently complementary to the sequence at the 3 'end of the nucleic acid sought to allow specific attachment and amplification,
- b) at least one sequence segment which codes for a detectable second peptide which is different from the first peptide and which is in the reading frame of the wild-type nucleic acid sought,
- c) Sequence sections which code for at least one detectable third and fourth peptide, which are different from the first and second peptide, and which lie in the two reading frames which result from shifting the reading frame of the wild-type nucleic acid sought and
- d) three stop motifs, one for every possible reading frame,
- c) optionally deoxyribonucleotides,
- d) optionally an enzyme suitable for extending the primers,
- e) if appropriate, a buffer suitable for the amplification reaction and, if appropriate, further auxiliaries,
- f) optionally cell lysate with high transcription and translation activity,
- g) if necessary, detection reagents for the various detectable peptides,
- h) optionally reagents for protein enrichment and
- i) if necessary, reagents for enriching the nucleic acid sought,
- a) gegebenenfalls eine Expressions-Kontrollsequenz umfassend einen Promotor und ein Translations-Startmotiv,
- b) mindestens ein Sequenzabschnitt, z. B. ein bis drei Sequenzabschnitte, der für jeweils ein unterschiedliches nachweisbares erstes Peptid codiert, wobei der oder die Sequenzabschnitte im Leserahmen des Startcodons einer in die multiple Klonierungsstelle klonierten Nukleinsäure liegen,
- c) eine multiple Klonierungsstelle (MCS) zur Klonierung einer Nukleinsäure,
- d) ein bis drei Sequenzabschnitte, die für unterschiedliche nachweisbare zweite Peptide, welche von den ersten Peptiden verschieden sind, codieren, wobei die Sequenzabschnitte in gleichen oder unterschiedlichen Leserahmen bezüglich einer in die MCS klonierten Nukleinsäure liegen, wobei sie z. B. (i) alle im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegen oder (ii) der erste Sequenzabschnitt im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegt und der zweite und dritte Sequenzabschnitt in den Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des erwarteten Leserahmens der klonierten Nukleinsäure entstehen und
- e) drei Stopcodons, eines für jeden möglichen Leserahmen.
- a) optionally an expression control sequence comprising a promoter and a translation start motif,
- b) at least one sequence section, e.g. B. one to three sequence sections, each coding for a different detectable first peptide, the sequence section or sections being in the reading frame of the start codon of a nucleic acid cloned into the multiple cloning site,
- c) a multiple cloning site (MCS) for cloning a nucleic acid,
- d) one to three sequence sections which code for different detectable second peptides which are different from the first peptides, the sequence sections being in the same or different reading frames with respect to a nucleic acid cloned into the MCS; B. (i) all lie in the expected reading frame of the cloned nucleic acid or (ii) the first sequence section lies in the expected reading frame of the cloned nucleic acid and the second and third sequence sections lie in the reading frame which result from shifting the expected reading frame of the cloned nucleic acid and
- e) three stop codons, one for each possible reading frame.
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