DE10107186B4

DE10107186B4 - Neue Form des PHGPx-Proteins als diagnostischer Marker bei männlicher Infertilität

Info

Publication number: DE10107186B4
Application number: DE10107186A
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr. Behne; Georg Dr. Bornkamm; Markus Dr. Brielmeier; Hennig Dr. Pfeifer; Antonios Dr. Kyriakopoulos; Marcus Dr. Conrad; Jörg Dr. Schmidt
Original assignee: Hahn Meitner Institut Berlin GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Berlin fuer Materialien und Energie GmbH
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2021-02-16
Also published as: AU2002304819A1; JP2004535160A; WO2002072626A3; US20040219562A1; EP1360279A2; DE10107186A1; WO2002072626A2

Abstract

Nukleinsäure, die für die Exons 2–7 des humanen PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.

Description

Diese Erfindung betrifft eine neue Form des PHGPx-Proteins, die Spermienkern-Glutathion-Peroxidase (snGPx) sowie Teile hiervon, die eine Rolle bei der Spermatogenese von Säugetieren spielen, sowie die diese kodierenden Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, die diese Nukleinsäuren enthalten und Wirtszellen, die durch diese Vektoren transformiert sind. Die Erfindung umfaßt weiterhin Antikörper, die für die vorgenannten Proteine/Peptide spezifisch sind, ebenso wie die Verwendung der Proteine/Peptide bei der Diagnose oder Therapie der männlichen Infertilität.
Die Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (PHGPx, auch GPx-4 genannt) ist ein Selenoenzym. Sie trägt Selenocystein, als 21. Aminosäure, im aktiven Zentrum und ist eine Oxidoreduktase, die H₂O₂ entgiften kann. Sie kommt in der Zelle im Cytosol und in den Mitochondrien vor, wird ubiquitär exprimiert und hat als Besonderheit, dass sie im Gegensatz zu anderen Glutathionproxidasen auch Lipidperoxide, oxidiertes LDL und oxidiertes Cholesterin, reduzieren kann, Im Gegenzug dazu wird Glutathion oxidiert. Eine weitere Besonderheit von PHGPx ist, dass bei Glutathion-Mangel, wenn Glutathion-Thiolgruppen nicht als Elektronenquelle zur Verfügung stehen, auch Protein-Thiole als Substrat benutzt und somit Disulfidbrücken in Proteine eingeführt werden können.
Mehrere Studien zeigten, daß Selen eine bedeutende Rolle in der Sperma-Entwicklung bei Säugetieren spielt. Bei Ratten wurde herausgefunden, daß sich die Selen-Konzentration im Hoden nach Beginn der Pubertät markant erhöht, und daß die Hauptzielzellen für das Element die Spermien sind, die bei weitem den höchsten Selen-Spiegel aller Kompartimente in der Ratte aufweisen (1). Selen-depletierte Ratten erzeugten Spermien mit einer verschlechterten Beweglichkeit und Anomalien im Mittelteil. Bei Selen-Mangelmäusen wurden ebenfalls Abnormalitäten beobachtet, die am häufigsten aus Mißbildungen des Spermienkopfes (3) bestanden. Eine ernsthafte Abreicherung von Selen bei Ratten führte zu einer testikulären Atrophie und einer vollständigen Unterbrechung der Spermatogenese (4).
Eine in vivo-Markierung von Ratten mit ⁷⁵Se und Trennung der Gewebshomogenate durch gelelektrophoretische Verfahren zeigte, daß das Element im Organismus in einer größeren Anzahl von Selen-haltigen Proteinen vorliegt (5, 6). Von diesen wird ein Protein mit einer apparenten Molekülmasse von ungefähr 34 kD nur im Hoden und in den Spermien gefunden (5). Es befindet sich in den Kernen der Spermazellen und wird in den späten Spermatiden in hohem Maße exprimiert (7). Während diesen Stadien durchlaufen die Kerne beträchtliche Veränderungen, die durch die Ersetzung der Histone durch die Protamine und durch die Reorganisation und Kondensation der DNA charakterisiert sind, die durch die Vernetzung der Protamin-Thiole bestimmt ist und eine Struktur zur Folge hat, die gegenüber chemischer und mechanischer Belastung hochbeständig sind (8). Die Tatsache, daß die Veränderungen mit dem Auftreten des 34 kD Selenoproteins koinzident sind, legt nahe, daß dieses in diesen Prozessen involviert ist.
Früher wurde diesem Enzym ausschließlich eine Funktion als Schutzenzym vor oxidativen Schädigungen zugesprochen. Vor eineinhalb Jahren haben Flohé und Ursini (29) jedoch gezeigt, dass das gleiche Enzym in oxidierter Form (d.h. mit inter- und intramolekular quervernetzten Disulfidbrücken) die mitochondriale Kapsel von Spermien (mit)ausbildet. Dafür werden große Mengen des Enzyms in Spermien benötigt.
Eine Strukturaufklärung dieses Selenoproteins bzw. der dieses Selenoprotein kodierenden Nukleinsäuren kann somit einen wichtigen Beitrag zur in vitro-Diagnose der männlichen Infertilität liefern und einen bedeutenden Beitrag zu zukünftigen Therapieansätzen liefern.
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein Selen-abhängiges Phospolipid-Gluthathion-Peroxidase-Protein kodiert ist bereits bekannt (Datenbankzugangsnummer: AF060972S1 ). Es ist jedoch lediglich die genomische PHGPx-Sequenz beschrieben und keine Hinweise sind enthalten, welche Teile dieser genomischen Sequenz als Exons und Introns definiert sind.
Hierin offenbart ist ein neues Selenoprotein bzw. die diesem Selenoprotein zu Grunde liegende Nukleinsäuresequenz. Die Erfinder haben nach Reinigung und Sequenzierung des Proteins festgestellt, dass dieses Selenoprotein eine neue Form von PHGPx ist, die durch alternatives Spleißen der PHGPx-RNA gebildet wird. Diese neue und alternative PHGPx Form wird nur im Hoden und dort sehr stark exprimiert. Das im neuen Spleißprodukt exprimierte alternative Exon ist stark basisch und vermittelt die Lokalisation des Proteins im Zellkern. Aufgrund seiner biochemischen Eigenschaften ist damit sehr wahrscheinlich, dass dieses Enzym für die Kernkondensation verantwortlich ist. Diese kommt durch inter- und intramolekulare Quervernetzung der Thiolgruppen in Protaminen zustande. Das alternative Exon hat hohe Sequenzhomologie zu Protaminen und bindet über die stark basischen Aminosäuren vermutlich direkt an DNA. Es wurde herausgefunden, dass die Kernkondensation durch hohe Konzentrationen von Dithiothreitol (DTT) rückgängig gemacht werden kann. Werden Ratten mit einer Selen-depletierten Nahrung gefüttert, bilden sie viel geringere Mengen des neuen Selenoproteins aus und zeigen eine Störung der Kernkondensation ihrer Spermien. Dies ist auch der Grund für die männliche Infertilität bei Ratten unter Selendepletion. Der kausale Zusammenhang zwischen der neuen PHGPx Form und der Kernkondensation ist somit funktionell zwingend.
Grundsätzlich ist das neue Selenoprotein durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die die Exons 2–7 des PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens enthält. Zusätzlich kann die Nukleinsäure wahlweise das Exon 1 des PHGPx-Gens enthalten.
Bei den Exons 1–7 des PHGPx-Gens handelt es sich um hochkonservierte Sequenzen, die bereits für einige Säugetierarten (Maus: (39), Schwein: (40), Mensch: (41)) beschrieben worden sind.
Es hat sich jedoch überraschenderweise herausgestellt, dass die N-terminalen Aminosäuresequenzen des neuen Selenoproteins durch ein bisher unbekanntes alternatives Exon kodiert werden, das zwischen verschiedenen Säugetierspezies nur schwach konserviert ist.
Die Erfindung stellt somit in einem ersten Aspekt eine Nukleinsäure bereit, die für die Exons 2–7 des humanen PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der ein biologisch aktives Peptid kodiert.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren bereit, die für Maus-, Ratten- und Schweine-Selenoproteine kodieren und wie in den Ansprüchen 2–4 definiert sind.
Diese enthalten alternative Exons für Maus, Ratte und Schwein, die in den Seq. ID. Nr. 2–4 definiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin alternative Exons, die die in den Seq. ID. Nr. 1–4 dargestellten Sequenzen oder einen Teil hiervon umfassen, der ein biologisch aktives Peptid kodiert.
Der Begriff alternatives Exon, wie hierin verwendet, bedeutet ein Exon, das beispielsweise durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen RNA-Primärtranskriptes gebildet wird.
Gemäß weiteren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung ein Säugetier-Selenoprotein, das durch die Nukleinsäure von Anspruch 1–8 kodiert wird. Dieses kann vorzugsweise eine wie in den Seq. ID. Nr. 7–10 definierte N-terminale Sequenz oder Homologe oder Fragmente hiervon enthalten, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Weiterhin umfasst die Erfindung Peptide gemäß Seq. ID. Nr. 7–10.
Für den auf dem einschlägigen Fachgebiet tätigen Fachmann ist offensichtlich, daß die Ausübung der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der exakten Sequenzen beschränkt ist, wie sie in den Seq. ID. Nr. 1–10 definiert sind.
Modifikationen der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen (silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Als Beispiel hierfür werden Veränderungen in der Nukleinsäuresequenz betrachtet, die die Erzeugung einer äquivalenten Aminosäure an einer vorgegebenen Stelle zur Folge haben. Vorzugsweise sind derartige Aminosäure-Substitutionen das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Aspartinsäure und Glutaminsäure ein.
"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden.
Nucleotidveränderungen, die eine Veränderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls zur Folge haben, ändern häufig die Protein-Aktivität nicht, weil diese Anteile üblicherweise nicht in die biologische Aktivität involviert sind. Es kann ebenfalls erwünscht sein, ein oder mehrere der in der Sequenz vorliegenden Cysteine zu eliminieren, weil das Vorhandensein von Cysteinen eine unerwünschte Bildung von Multimeren zur Folge haben kann, wenn die Proteine rekombinant erzeugt werden, wodurch die Reinigung und Kristallisations-Verfahren kompliziert werden. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen bewegt sich innerhalb der technischen und naturwissenschaftlichen Grundkenntnisse, genauso wie die Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten Produkte.
Daraus ergibt sich, daß, wo der Begriff "DNA-Sequenz" entweder in der Beschreibung oder in den Ansprüchen verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten umfaßt, die in der Erzeugung eines biologisch äquivalenten Peptids/Proteins resultieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor, der eine der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen enthält.
Zahlreiche zur Verwendung beim Transformieren von bakteriellen Zellen geeignete Vektoren sind bekannt, beispielsweise können Plasmide und Bakteriophagen, wie der Phage λ, als die am häufigst verwendeten Vektoren für bakterielle Wirte verwendet werden. Sowohl in Säugetier- als auch Insektenzellen können beispielsweise virale Vektoren zur Expression eines exogenen DNA-Fragments verwendet werden. Beispielhafte Vektoren sind das SV40 oder Polyoma-Virus.
Die Transformierung der Wirtszellen kann alternativ direkt durch "nackte DNA" ohne Verwendung eines Vektors erfolgen.
Die Erzeugung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann entweder in eukaryotischen Zellen oder prokaryotischen Zellen erfolgen. Beispiele von geeigneten eukaryotischen Zellen schließen Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Insektenzellen ein. Geeignete prokaryotische Wirte schließen E.coli und Bacillus subtilis ein.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines im Wesentlichen reinen Selenoproteins/Peptids umfasst das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor nach Anspruch 19, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben und ein Isolieren des Selenoproteins/Peptids aus der Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Proteine/Peptide sind serologisch aktiv, immunogen und/oder antigen. Sie können daher weiterhin als Immunogene zur Erzeugung spezifischer, sowohl polyclonaler als auch monoclonaler, Antikörper verwendet werden.
Diese spezifischen Antikörper können zur Diagnose/Prognose verwendet werden. Die Selenoprotein/Peptid-spezifischen Antikörper können beispielsweise in der Labordiagnostik unter Verwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie oder der immunhistochemischen Färbung oder als ein Bestandteil in Immunassays zum Nachweis und/oder Quantifizieren des Selenoproteins/Peptids in klinischen Proben verwendet werden. Derartige spezifische Antikörper können als Bestandteile diagnostischer/prognostischer Kits verwendet werden. Darüberhinaus können derartige Antikörper zur Affinitätsreinigung der erfindungsgemäßen Selenoproteine/Peptide verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die eine Hybridoma enthält, die einen monoclonalen Antikörper mit einer Bindungsspezifität zu einem der offenbarten Proteine/Peptide aufweist.
Ein für die erfindungsgemäßen Selenoproteine/Peptide spezifischer monoklonaler Antikörper kann wie folgt hergestellt werden. Einer Maus werden zwei Injektionen des erfindungsgemäßen Selenoproteins/Peptids verabreicht. Die erste Injektion enthält das erfindungsgemäße Selenoprotein/Peptid in vollständigem Freund'schen Adjuvanz und wird subkutan verabreicht. Die zweite Injektion enthält das erfindungsgemäße Selenoprotein/Peptid in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz und wird intraperitoneal gegeben. Mehrere Injektionen folgen zu unterschiedlichen Zeitpunkten über einen Zeitraum von mehreren Monaten hinweg. Der Maus werden dann Milzzellen entnommen und in Polyethylenglykol mit Myelomzellen fusioniert. Die entstandenen Hybridzellen werden anschließend durchmustert, um festzustellen, welche den Antikörper mit der gewünschten Spezifität erzeugt (Nach Milstein, C. Monoclonal Antibodies, Scientific American).
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Screening-Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Fertilität eines Säugetiers, das die folgenden Schritte umfasst: Spermien-DNA wird isoliert, das alternative Exon des PHGPx-Gens wird durch PCR amplifiziert die amplifizierten Genabschnitte werden sequenziert und die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure eines erfindungsgemäßen alternativen Exons überprüft.
Bei bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Bestimmung für Mensch, Maus, Ratte und Schwein jeweils anhand der in den Seq. ID. Nr. 1–4 angegebenen Nukleinsäuren. Es ist jedoch offensichtlich, dass die Erfindung nicht auf diese Tierarten beschränkt ist. Sie ist vielmehr vorteilhaft bei der Fertilitätsbestimmung (und bei einer negativen Sequenzübereinstimmung dadurch auch bei der Bestimmung der Infertilität) aller Arten von Nutz- und Haustieren. Derartige Nutz- und Haustiere sind beispielsweise Rinder, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen und Hunde.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt zunächst eine Feststellung einer Kernkondensation von Spermien durch Anfärbung mit Acridinorange, Feulgen-Reagenz oder saurem Anilinblau und mikroskopischem Nachweis. Kondensierte Spermienkerne sind resistent gegenüber der Aufnahme von Farbstoffen (Feulgen-Reagenz, Anilinblau) und resistent gegenüber einer Denaturierung der DNA durch Hitze oder saures Milieu. Acridinorange färbt bei einer bestimmten UV-Anregung, doppelsträngige DNA grün, einzelsträngige DNA und RNA aber rot an. Bei gestörter Kernkondensation ist die DNA durch Säure (Fixierung in saurem Alkohol) oder Hitze denaturierbar. Der Kern wird dann durch Acridinorange rot angefärbt. Die DNA von kondensierten Kernen lässt sich nicht denaturieren und fluoresziert grün. Mit diesen Methoden können Patienten-Proben mit einer gestörten Kondensation des Spermienkopfes erkannt werden. Diese Vorauswahl sorgt für eine spezifische Selektion derjenigen Spermien-Proben, mit denen dann das aufwendigere Screeningverfahren durchgeführt wird.
Bei einem rekombinanten nicht menschlichen Säugetier kann die DNA-Sequenz von Anspruch 2–4 inaktiviert wurde. Beispielsweise wird eine rekombinante Maus bereitgestellt, bei der die bei der die Nukleinsäure von Seq. ID Nr. 2 inaktiviert wurde. Somit kann unter Verwendung einer derartigen rekombinanten knock-out-Maus ein Tiermodell errichtet werden. Diese Tiermodelle ermöglichen weitere Einsichten in die Ätiologie mehrerer Störungen in Verbindung mit der Infertilität bei männlichen Säugetieren.
Zuletzt umfaßt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines Proteins/Peptids nach einem der Ansprüche 10–18 in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst, sowie deren Verwendung in der in vitro Diagnose der männlichen Infertilität bzw. in der in vitro/in vivo Therapie der männlichen Infertilität.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1: Selenoprotein in CTAB-behandelten Sonifikations-beständigen Kernen von späten Spermatiden (SRS/CTAB Kerne) und von epididymalen Spermien (SRSP/CTAB-Kerne). Nach in vivo Markierung von Ratten mit ⁷⁵Se, Isolierung der Kerne durch SDS-PAGE wurden die auf eine PVDF-Membran übetragenen Selenoproteine mittels einer Immunreaktion mit einem PHGPx Antikörper oder durch Autoradiographie des ⁷⁵Se-Tracers bestimmt.
2: Unterschiede der isoelektrischen Punkte der im Spermienkern vorliegenden Selenoproteine, die auf eine teilweise Verarbeitung von snGPx zurückzuführen sind. Die Proteine von CTAB-behandelten epididymalen Spermienkernen wurden durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt und die ⁷⁵Se markierten Selenoproteine durch Autoradiographie bestimmt.
3: Zusammensetzung des alternativen Exons Ea, das die N-terminale Sequenz der Spermienkern-Glutathion-Peroxidase (snGBx) kodiert. A) Unterschiede in der Primärstruktur von PHGPx und snGPx: PHGPx wird durch die sieben Exons E1 bis E7 (28) kodiert, wohingegen snGPx, wegen alternativen Spleißens, durch die Exons Ea bis E7 kodiert wird. B) Sequenz von Ea und die entsprechende N-terminale Sequenz von snGPx bei der Maus, Ratte, Mensch und Schwein.
4: Verteilung von snGPx und PHGPx in Geweben der Maus, bestimmt durch Northern Blot-Analyse: 20 μg Gesamt-RNA wurden pro Bahn aufgetragen, auf eine Membran geblotted und mit der kodierenden Region für das alternative Exon (1) oder mit der gesamten cDNA von PHGPx (2) sondiert.
5: Wirkung des Selenmangels auf die Spermakern-Konzentration bei der Ratte. Spermien von Ratten, die mit adäquaten Mengen an Selen (a) versorgt wurden und Tiere mit Selen-Mangel (b) wurden aus dem vas deferens gesammelt und mit Acridinorange gefärbt. Acridinorange färbt doppelsträngige DNA grün und einsträngige DNA rot. Weil Sperma-DNA nur säurebeständig ist, wenn die Protamine durch Disulfide quervernetzt sind, ermöglicht das Verfahren die Bestimmung der Chromatin-Kondensation und des Protamindisulfid-Status. Beinahe alle Spermienkerne von Ratten mit Selenmangel zeigten eine abnormale Kondensation.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung:
Ein 34 KD-Selenoprotein, das aus Ratten-Hoden isoliert wurde, wurde als eine spezifische Spermienkern-Glutathion-Peroxidase(Sperm Nuclei Glutathion Peroxidase = snGPx) mit ähnlichen Eigenschaften wie PHGPx identifiziert. Die Bestimmung seiner Primärstruktur durch Analyse der ersten N-terminalen Aminosäuren, eine Datenbankrecherche, Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzieren der cDNA, zeigten, daß es sich von PHGPx in seiner N-terminalen Sequenz unterscheidet. Diese Sequenz, die durch ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert ist, zeigt mehr als 50% Homologie zu den Protamin-Sequenzen und enthält ein Kern-Lokalisationssignal. Bei Ratten wird snGPx in den Kernen später Spermatiden in hohem Maße exprimiert, wo es das einzige vorliegende Selenoprotein ist. Sein Auftreten ist mit der Reorganisation der DNA koinzident, die zu einem hochkondensierten Chromatin führt, das durch quervernetzte Protamin-Tiole stabilisiert ist. Bei Selen-depletierten Ratten, bei denen die Konzentration an snGPx auf ein Drittel des normalen Spiegels verringert wurde, wurde die Chromatinkondensation ernsthaft gestört. Wir haben bewiesen, daß snGPx als eine Protamin-thiol-Peroxidase wirkt, die für die Disulfid-Quervernetzung durch Reduktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies verantwortlich ist. Seine duale Funktion in der Chromatin-Kondensation und im Schutz von Sperma-DNA gegen Oxidation ist notwendig, um die männliche Fruchtbarkeit und Sperma-Qualität sicherzustellen.
Identifizierung des 34 kD-Selenproteins
As ein erster Schritt wurde das 34 kD Selenoprotein aus den SRS-Kernen der späten Spermatiden von Ratten, die mit einer Selen-adäquaten Diät gefüttert wurden, gereinigt. Nach der Behandlung der Oberflächen dieser Kerne mit den Detergenz CTAB stellte sich heraus, daß das 34 kD Protein das einzige Selenoprotein innerhalb dieser Kerne war, wie es durch das Autradiogramm in 1, Bahn 3, ersichtlich ist. Für die Selenkonzentration und somit das 34 kD-Selenoprotein in den CTAB-behandelten SRS-Kernen wurde ein relativ hoher Wert von ungefähr 60 μmol/kg Trockenmasse bestimmt, der die Selenkonzentration in den Kernfraktionen anderer Ratten-Gewebe wie beispielsweise der Leber (14 μmol Se/kg Trockenmasse) und des Gehirns (8 μmol Se/kg Trockenmasse) bei weitem überschritt.
Eine Proteinfragmentanalyse durch MALDI-MS nach tryptischer Verdauung zeigte eine beträchtliche Ähnlichkeit zwischen dem 34 kD Protein und einem anderen Selenoprotein, nämlich PHGPx, einem der vier Glutathion-Peroxidasen, die bis jetzt identifziert wurden, die die Reduktion von Peroxid durch die Oxidation von Gluthathion (12, 15–17) katalysieren.
Die Ähnlichkeit wurde in einem Experiment noch augenfälliger, indem sich herausstellte, daß das 34 kD-Protein mit einem PHGPx-Antikörper reagiert, wie es in der ersten Bahn von 1 dargestellt ist. Es hemmte ebenfalls die Glutathionperoxidase-Aktivität und katalysierte wie PHGPx die Reduktion verschiedener Peroxide, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid, t-Butylhydroperoxid und Phosphatidylcholinhydroperoxid (12). Seine spezifische Aktivität betrug ungefähr 3000 U/mg Protein, wenn das letztere als Substrat verwendet wurde. Wegen seiner Lokalisation wurde dieses Spermienkern-Glutathionperoxidase (sperm nuclei glutathione peroxidase = snGPx).
Während der Übertragung der Spermien vom Hoden auf die Epididymis wurden zwei Drittel des 34 kD Selenoproteins zu kleineren Proteinen mit Molekularmassen von 24, 22 und 20 kD umgewandelt, wie in den Bahnen 2 und 4 in 1 ersichtlich ist. Diese Trunkierung bzw. Verkürzung wird von einer Verschiebung des pH von einem extrem basischen Wert von mehr als 10 für das 34 kD-Protein zu einem Wert von ungefähr 7,5 für das 20 kD-Produkt (2) begleitet. Die Reduktion der Masse hat jedoch keine Wirkung auf die enzymatischen Eigenschaften der verarbeiteten Proteine.
Die Analyse der N-terminalen Sequenz der 34 kD-Verbindung zeigte, daß sie mit den Aminosäuren SRAAARGRKR startete. Datenbankrecherchen zeigten, daß das Protein bis jetzt unbekannt war. Wenn die Recherche jedoch auf alle verfügbaren genomischen Sequenzen ausgedehnt wurde und diese in alle Leseraster übertragen wurden, kamen wir bei einer ähnlichen Sequenz im ersten Intron des Maus PHGPx-Gens an. Ein alternatives Exon, das für die Bildung des neuen Selenoproteins verantwortlich ist, wurde in Maus- und Ratten-Testis-RNA unter Verwendung einer cDNA Amplifizierung mit Primern identifziert, die von den verfügbaren DNA- und Protein-Sequenz-Informationen abgeleitet waren (3). Die Sequenz dieses Exons in Maus und Ratte und das vermeintlich entsprechende Exon beim Mensch und Schwein ist in 3b dargestellt. Es kodiert eine argininreiche Sequenz unmittelbar nach dem ersten Methionin.
Informationen bezüglich der Funktion dieser Sequenz wurde in einem Experiment gewonnen, in dem zwei GFP-Fusionsgene konstruiert wurden. Für das erste wurde das gesamte alternative Exon der Maussequenz an GFP fusioniert und für das zweite die Sequenz nach dem zweiten Methionin. Nach Transfektion beider Konstrukte in zwei Säugetierzell-Linien wurde die subzelluläre Lokalisation der beiden Fusionsproteine mittels GFP-Fluoreszenz bestimmt. Nur das größte GFP-Fusionsprotein war in den Kern eingedrungen, was anzeigt, daß die N-terminale argininreiche Sequenz ein Kern-Lokalisations-Signal enthält (Daten nicht dargestellt).
Eine Northern-blot-Analyse unterschiedlicher Gewebe der Maus, die mit der Ea-Sequenz of snGPx oder mit der gesamten Sequenz von PHGPx sondiert wurde (4) zeigte, daß snGPx nur im Hoden exprimiert wird. Dies wurde durch Messen der Verteilung von ⁷⁵Se-markierten Proteinen im Maus-Organismus bestätigt. Hier wurde snGPx nur in Testis und in den Spermien nachgewiesen, wie es bereits früher bei Ratten herausgefunden wurde (5), eine Tatsache, die eine spezifische Funktion dieses Selenoenzyms nahelegt.
Untersuchung der Funktion von snGPx
Das Auftreten von snGPx in späten Stadien der Spermiogenese ist mit der Verpackung der DNA mit Protaminen und der Stabilisierung des sich ergebenden hochkondensierten Chromatins durch Vernetzung von Protamin-Disulfiden (8) koinzident. Dieses Verfahren wird durch reaktive Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species = ROS) (18) induziert und ist somit der Glutathion-Oxidation und Peroxid-Reduktion, die durch Glutathionperoxidasen katalysiert wird, analog. Dies legte zusammen mit der Entdeckung, daß die Glutathion-Konzentration in Spermatiden während der späten Stadien der Spermatiden-Entwicklung (19) deutlich abnimmt, nahe, daß das Selenoenzym in der Lage sein könnte, die Protamin-Cysteinreste als Reduktionsmittel zu verwenden, wodurch es als eine Protaminthiol-Peroxidase wirkt.
Es wurde deswegen die Spermienkern-Kondensation in Selen-Mangelratten, bei denen die Konzentration an Selen und somit an snGPX im CTAB-behandelten SRS-Kernen auf 20 μMol Se/kg Trockenmasse im Vergleich zum Wert von 60 μMol Se/kg Trockenmasse in Selen-adäquaten Tieren abgenommen hatte, untersucht. Die Kerne beider Gruppen wurden mit Acridinorange angefärbt, was es möglich macht, zwischen doppel- und einsträngigen Nukleinsäuren zu unterscheiden. Weil Spermien-DNA durch Säuren oder Hitze nur vor, jedoch nicht nach der Protamindisulfid-Vernetzung denaturiert werden kann, macht es eine Acridinorangefärbung nach der Behandlung möglich, den Thiol-Disulfid-Status während der Chromatinkondensation von Säugetierspermien-Kernen zu überwachen (14). Das Färben zeigte, daß beinahe alle aus dem Vas Deferens der Selenmangelratten entnommenen Spermienzellen unvollständig kondensiert waren (5).
In vitro-Experimente mit Spermienkernen aus Selen-adäquaten Ratten zeigten, daß der kondensierte Status während der Reduktion von Protamindisulfiden mit Dithiothreitol verloren ging und durch Zusatz von Wasserstoffperoxid wiederhergestellt werden konnte. Die Rekondensation wurde durch Zusatz von Bromsulfophthalcin, eines Inhibitors von PHGPx (20) oder durch einen Überschuß eines anderen Thiols in der Form von GSH blockiert. Aus diesen Feststellungen kann geschlossen werden, daß snGPx in die Protamindisulfid-Quervernetzung involviert ist.
Das 34 kD Selenoprotein, das in Testis und Spermien entdeckt wurde (5), wurde nunmehr als eine spezifische Spermienkern-Glutathionperoxidase mit Eigenschaften identifziert, die denjenigen von PHGPx ähnlich sind. Es wird durch das Gen für PHGPx kodiert, es wird jedoch im Gegensatz zu diesem Selenoenzym ausschließlich in Hoden exprimiert und startet mit einer argininreichen N-terminalen Sequenz, die durch ein alternatives Exon kodiert wird. Diese Sequenz enthält ein Kernlokalisations-Signal, das es dem snGPx ermöglicht, als das einzige Selenoprotein in den Spermienkern einzutreten.
Ein weiterer Hinweis auf die Signifikanz dieser Sequenz ist die Tatsache, daß sie mehr als 50% Homologie mit den Sequenzen der Protamine zeigt. Protamine sind kleine basische Proteine, die arginin- und cysteinreich sind, und die die Histone während der Spermien-Reifung ersetzen. Es ist bekannt, daß sie an DNA über ihre Polyarginin-Region binden (21) und es ist sehr wahrscheinlich, daß snGPx in einer ähnlichen Weise an die DNA angelagert wird.
Mit unseren Feststellungen, daß snGPx als eine Protaminthiol-Peroxidase wirkt, die für die Bildung von quervernetzten Protamin-Disulfiden und somit für die Stabilisierung der kondensierten Spermien-Kerne verantwortlich ist, und daß eine Abnahme in den snGPx-Spiegeln zu ernsthaften Störungen der Chromatin-Kondensation führt, wurde eine weitere bedeutende Rolle des Selens festgestellt. Der Prozeß der Chromatinkondensation scheint nicht nur für die Reifung der Spermazellen, jedoch auch für die Fertilität und die Genese der Nachkommenschaft entscheidend zu sein. Beim Menschen wurde eine hohe Korrelation zwischen einer regulären Sperma-Chromatinkondensation und der in vitro Fertilisations-Rate beobachtet (22). In vitro-Experimente mit Mäusen zeigten, daß ein kondensierter Spermien-Kern mit einer stabilen Matrix benötigt wird, um eine normale Befruchtung und Embryonalentwicklung sicherzustellen (23). Somit scheint die snGPx-abhängige Protaminthiol-Oxidation eine Schlüsselrolle in der männlichen Fertilität und Reproduktion zu spielen.
Wenn das Spermium den Caput Epididymis erreicht und der Kondensationsprozeß abgeschlossen wird, wird snGPx teilweise in kleinere Proteine mit derselben enzymatischen Aktivität, jedoch mit neutralen pH-Werten verarbeitet, was darauf hinweist, daß die basische arginin-reiche N-terminale Sequenz verloren ging. snGPx und die verarbeiteten Proteine erfüllen daher zwei Funktionen: Erstens, Oxidation von Protaminen durch die an volle-Länge-DNA-gebundene snGPx und zweitens, Schutz der Sperma-DNA gegen oxidative Schädigung durch das Enzym und der trunktierten Formen, die, weil sie nicht an die DNA gebunden sind, bei der ROS-Degradation effizienter sein könnten.
Es wurde in mehreren Studien dargelegt, daß die Qualität von menschlichem Sperma durch eine Zunahme von oxidativen DNA-Schädigungen abnimmt. Weil eine beschränkte Erzeugung an ROS jedoch für die Protaminthiol-Quervernetzung erforderlich ist, beeinträchtigt eine DNA-Beschädigung, die auf exzessiven Mengen von ROS zurückzuführen ist, die Gesundheit der Nachkommenschaft (24). Die Bestimmung des snGPx-Status des Spermien-Kerns kann deswegen von Bedeutung bei der Feststellung der Sperma-Qualität sein.
Es wurde vorgeschlagen, daß PHGPx eine Rolle in der Chromatinkondensation (25) und beim Schutz der Sperma-DNA gegen eine oxidative Schädigung (26) spielt. Jedoch wird PHGPx nur in einer cytosolischen und mitochondrialen Form exprimiert und ist in den Spermien hauptsächlich membran-gebunden (25). Mit der Identifizierung von snGPx als dem einzigen Selenoprotein, das in Spermatiden-Kernen vorliegt und mit dessen Charakterisierung als eine Protaminthiol-Peroxidase wurde diese Diskrepanz nunmehr aufgelöst.
Es ist bekannt, daß Selen eine Rolle bei verschiedenen Prozessen im männlichen reproduktiven System spielt. PHGPx wirkt als eine strukturelle Komponente in der mitochondrialen Kapsel (27) und wird somit bei der Bildung des Flagellums benötigt, wohingegen in den Kernen snGPx und seine verarbeiteten Produkte in die Chromatinkondensation und den Schutz der Keimbahn gegen eine oxidative Schädigung involviert sind. Selen wurde ebenfalls als für die Testosteron-Biosynthese in einer bis jetzt nicht identifizierten Art und Weise notwendig dargestellt (4). Es wird von großem Interesse sein herauszufinden, in welchem Ausmaß Störungen der Bildung und Funktion von Selenoproteinen zur Ethologie männlicher Fruchtbarkeitsstörungen beitragen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollten nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden.
Beispiele:
Die Konzentrationsaufgaben "M und mM" beziehen sich auf Mol/l bzw. mMol/l.
Tierexperimente
Ratten wurden für einige Generationen entweder einer Selen-Mangeldiät, die 2–5 μg Se/kg enthielt oder einer selen-adäquaten Diät unterworfen, die aus der Basal-Diät mit 300 μg Se/kg bestand, zugesetzt als Natriumselenit. In den Tracer-Experimenten wurden die Tiere in vivo durch Injektion einer Dosis von 20 MBq ⁷⁵Se (spezifische Aktivität zwischen 18 und 35 MBq/μg Se) als Natriumselenit markiert. Die Zusammensetzung der Diät und die Behandlung der Tiere wurden an anderer Stelle beschrieben (6). In den Tracer-Experimenten mit Mäusen wurden adulte Mäuse zwei Wochen lang der Basal-Diät unterworfen und wurden dann durch eine Injektion einer Dosis von 3 MBq ⁷⁵Se-Selenit markiert.
Selenbestimmung
Die Selenkonzentrationen von Geweben und testikulären Fraktionen wurden durch instrumentelle Neutron-Aktivierungs-Analyse, wie bereits an früherer Stelle beschrieben (9), bestimmt. In den Tracer Experimenten wurde die ⁷⁵Se-Aktivität in den Geweben und die Gewebs-Fraktionen mittels eines NAI(TI) Well-Typ Detektors gemessen, der an einen Multi-Kanal Analysegerät (Canberra, Frankfurt, Deutschland) angeschlossen war. Die ⁷⁵Se-markierten Selenoproteine, die durch SDS-PAGE getrennt wurden, wurden durch Autoradiographie unter Verwendung einer lichtempfindlichen Bildplatte (Fuji, BAS 1000, Ragtest, Straubenhardt, Deutschland) untersucht.
Reinigung des 34 kD-Selenoproteins
Nach Entkapselung wurden die Hoden im vierfachen Volumen eines Puffers A (20 mM MES, 0,31 M Sucrose, 3 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 50 mM Benzamid HCl, 0,1 mM PMSF, pH 6,0–6,1) homogenisiert. Nach Zentrifugieen bei 1000 × g wurden die Beschallung resistenten Kerne (SRS-Kerne) von späten Spermatiden wie bereits an früherer Stelle beschrieben, isoliert (10), indem eine B15 Branson Zell-Disruptor (Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Deutschland) verwendet wurde. Nach Inkubation in Puffern B (1% CTAB, 50 mM Tris, 20 mM DTT, pH 8) und C (1% CHAPS, 50 mM Tris, 20 mM DTT, pH 8), wiederholtem Waschen mit Puffer D (50 mM Tris, 20 mM DTT, pH 8), Extraktion mit einer NaCl Lösung (1 M NaCl in 50 mM Tris, 2% β-Mercaptoethanol, pH 8) und Zentrifugieren bei 1000 × g wurde der Überstand gegen Aqua dest. dialysiert und das 34 kD-Protein von anderen Proteinen durch SDS-PAGE getrennt.
Proteinidentifizierung durch MALDI-MS
Nach Trennung durch SDS-PAGE wurde die 34 kD-Bande aus dem Gel ausgeschnitten und eine tryptische Verdauung wurde wie beschrieben (11) durchgeführt. Der Digest wurde mit 1% Trifluoressigsäure in Acetonitril extrahiert. Die Fragmentmassen wurden mittels eines modifizierten Broker Reflex III bestimmt, der mit verzögerter Extraktion ausgestattet war. Zur Massenidentifizierung wurde Peptide Search ("Protein identification by peptide mass data", EMBL-Heidelberg) verwendet.
Enzymatischer Assay
Die Glutathionperoxidase-Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 340 nm, wie beschrieben (12), bestimmt, indem Wasserstoffperoxid oder t-Butylhydroperoxid als Substrate verwendet wurden. Die PHGPx-Aktivität wurde durch Phosphatidylcholin-hydroperoxidase gemessen, die als ein spezifisches Substrat verwendet wurde.
Reaktion mit einem PHGPx-Antikörper
Das 34 kD-Protein, das durch SDS PAGE isoliert wurde, wurde auf eine PVDF-Membran (Biometra, Göttingen, Deutschland) übertragen und mit einem gereinigten Antikörper gegen Ratten-PHGPx sondiert.
N-terminale Sequenzierung
Das 34 kD Protein wurde durch SDS-PAGE isoliert, auf eine PVDF-Membran übertragen (Biometra, Göttingen, Deutschland) und mit Amidoschwarz angefärbt. Eine N-terminale Sequenzierung wurde bezüglich der interessierenden Banden unter Verwendung eines ABI 494 Procise Edman Sequencer (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt, nachdem sie ausgeschnitten wurden. Die Aminosäuren wurden als PTH-Derivate analysiert. Die auf diese Weise gewonnenen Sequenzdaten wurden mit den Sequenzen in Datenbanken unter Verwendung der "BLAST SEARCH" bei NCBI verglichen.
cDNA Synthese mittels PCR
Die 3'RACE-Experimente wurden im GENEAmp-System 2400 Termalcycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) durchgeführt. Zum nachfolgenden Sequenzieren wurde das entsprechende PCR-Produkt in den pCR2.1-TOPO-Vektor (Invitrogen Groningen, Niederlande) kloniert.
Maus snGPx: PolyA + RNA wurden aus Maushoden unter Verwendung des PolyATract mRNA-Isolierungssystems IV (Promega, Madison, WI, USA) isoliert. Adaptor-gebundene Testis-cDNA wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers synthetisiert (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Das alternative Exon wurde durch 3'RACE unter Verwendung des Primers PHGPx Ea-fl (GGGACGCTGCAGACAGCGCGGCGGATCC) und der Advantage 2-Polymerase (Clontech) amplifiziert.
Ratten snGPx: Die Datenbankrecherche mit der Sequenz des alternativen Exons Ea von der Maus hatte einen Est-Klon der Ratte zur Folge (Gi: 3399319), der Identität zu Exon I von PHGPx aus der Ratte und zu Ea von der Maus zeigte. Die Gesamt-RNA wurde aus homogenisiertem Testis durch das saure Guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-Verfahren (13) isoliert. Eine RT-PCR wurde mittels des Super Script One Step RT-PCR-Systems (Life Technologies, Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung des snGPx spezifischen Primers (ATGGGCCGCGCGGCCG) und des Primers aus dem Ratten PHGPx Exon 7 (CGGCAGGTCCTTCTCTATCACCTG) durchgeführt.
Humanes snGPx: Ein vermeintliches Ea für das menschliche 34 kD wurde nach Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit dem menschlichen PHGPx-Gen (Nukleotid 770–964 aus dem Gen AF 060973) gefunden. Eine 3'RACE wurde mit einer Adaptor-ligierten Testis-cDNA (Clontech) unter Verwendung des snGPx spezifischen Primers 1 (ATGGGCCGCGCGGGCGCAGGCTCCC) und Primers 2 (CTTGCGACCGGAGATCCACGAATGTCCC) und der Andvantage2 Polymerase (Clontech) durchgeführt. Nur die letzten 14 Nukleotide aus dem Exon Ea und der Übergang zu PHGPx wurden gewonnen. Die Recherche in der Est-Datenbank hatte einen Est-Klone zu Folge (Gi: 2754408), der die Ea-Sequenz von Base 838 an abdeckt und einen weiteren Est-Klon (Gi: 6703705), der das vermeintliche Start-Methionin enthält.
Schweine snGPx: Wie bei der menschlichen snGPx wurde ein vermeintliches alternatives Exon aus dem Schweine PHGPx-Gen (Sus scrofa Zugangsnummer: X76088) durch Vergleich der abgeleiteten Aminosäuren gewonnen. Es kodiert eine argininreiche-Sequenz nach dem vermeintlichen Translations-Start. Die Transition zu PHGPx ist zweifelhaft, jedoch ist die Nukleotidseuquenz zur menschlichen identisch.
Nothern-blot-Analyse
Die Gesamt RNA wurde aus homogenisiertem Gewebe unter Verwendung von peqGOLDTriFast (peqLab, Erlangen, Deutschland) isoliert. 20 μg Gesamt RNA wurden pro Bahn aufgetragen, auf Hybond-N⁺ geblottet (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) und mit der kodierenden Region des alternativen Exons wurde mit der Gesamt cDNA von PHGPx sondiert.
Konstrukte mit dem grünfluoreszierenden Protein (Freen Fluorescent Proteins = GFP)
Zwei N-terminale GFP-Fusionsproteine wurden durch Overlap-PCR erzeugt. Eine enthielt die gesamte kodierende Region für das alternative Exon, die andere begann am zweiten vermeintlichen Translations-Start. Die Primerpaare (GATCTCTAGACCGGCGGGCATGGGCCGCGCG)(GFP-Ea-f1) und (GCTCCTCGCCCTTGCTCACCAAGCCCAGGAACTCGGAGC)(GFP-Ea-r2) ebenso wie (GATCTCAGACTCGCCGGATGGAGCCCATTCC)(GFP-Ea-f2) und GFP-Ea-r2 wurden zur Amplifizierung der N-terminalen Teile für die lange bzw. die kürzere Version verwendet, indem pMC42 als die Matrize verwendet wurde. (GCTCCGAGTTCCTGGGCTTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC)(GFP-F3) und (CCTCTACAAATGTGGTATGG)(GFP-r1) wurden zur Erzeugung des GFP-Teils mit pEGFP-N1 als der Matrize verwendet. Eine Overlap-PCR wurde durch Kombinieren der Produkte mit den äußeren Primern durchgeführt. Alle PCRs wurden im Perkin Elmer GENEAmp System 2400 Termalcycler durchgeführt. Die beiden Produkte wurden in pCDNA3 über XhoI/Xbal kloniert und vorübergehend in NIH3T3 und HELA-Zellen transfiziert.
Acridinorange-Färbung von Spermien-Kernen
Die Wirkung des Selen-Status auf die Kondensation und den Thiol-Status in vivo wurde durch Anfärben mit Acdridinorange bestimmt. Spermien wurden aus dem Vas deferens ausgedrückt und wurden mit Methanol/Essigsäure (3:1) auf Objektträgern fixiert. Eine Acridinorangefärbung wurde in Phosphat/Citratpuffer (pH 2,5), wie beschrieben, für 5 Minuten durchgeführt (14).
Referenzen:

1. Behne D., Duk. M., and W. Elger W. (1986) Selenium content and glutathione peroxidase activity in the testis of the maturing rat. J. Nutr. 116, 1442–1447.
2. Wu A.S.H., Oldfield J.E., Shull, L.R., and Cheeke, P.R. (1979) Specific effect of selenium deficiency on rat sperm. Biol. Reprod. 20, 793–798.
3. Watanabe T., and Endo, E. (1991) Effects of selenium deficiency on sperm morphology and spermatocyte chromosomes in mice. Mutation Res. 262, 93–99.
4. Behne D., Weiler H., and Kyriakopoulos A. (1996) Effects of selenium deficiency on testicular morphology and function in rats. J. Reprod. Fertil. 106, 291–297.
5. Behne D., Hilmert H., Scheid S., Gessner H., and Elger W. (1988) Evidence for specific selenium target tissues and new biologically important selenoproteins. Biochim. Biophys. Acta 966, 12–21.
6. Behne D., Kyriakopoulos A., Weiss-Nowak C., Kalcklösch M., Westphal C., and Gessner H. (1996) Newly found selenium-containing proteins in the tissues of the rat. Biol. Trace Element Res. 55, 99–110.
7. Behne D., Kyriakopoulos A., Kalcklösch M., Weiss-Nowak C., Pfeifer H., Gessner H., and Hammel C. (1997) Two new selenoproteins found in the prostaric glandular epithelium and in the spermatid nuclei. Biomed. Environ. Sci. 10, 340–345 (1997).
8. Barone L.G., De Lara J., Cummings K.B., and Ward W.S. (1994) DNA organization in human spermatozoa. J. Androl. 15, 139–144.
9. Behne D., Weiss-Nowak C., Kalcklösch M., Westphal C., Gessner H., and Kyriakopoulos A. (1994) Application of nuclear analytical methods in the investigation and identification of new selenoproteins. Biol. Trace. Elem. Res. 43–45, 287–297.
10. Platz R.O., Meistrich M.L., and Grimes S.R. Jr. (1977) Low-molecular-weight basic proteins in spermatids. Methods Cell. Biol. 16, 297–316.
11. Gevaert K., Verschelde J.L., Puype M., Van Damme J., Goethals M., De Boeck S., and Vandekerckhove J. (1996) Structural analysis and identification of gel-purified proteins, available in the femtomole range, using a novel computer program for peptide sequence assignment, by matrix-assisted laser desorption ionization reflectron time-of-flight-mass spectrometry. Electrophoresis 17, 918–24.
12. Ursini F., Maiorino M., and Gregolin C. (1985) The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochim. Biophys. Acta 839, 62–70.
13. Chirgwin J.M., Przybyla A.F., MacDonald R.J., and Rutter W.J. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18, 5294–5299.
14. Kosower N.S., Katayose H., and Yanagimachi R.J. (1992) Thiol-disulfide status and acridine orange fluorescence of mammalian sperm nuclei. J. Androl. 13, 342–348.
15. Rotruck J.T., Pope A.L., Ganther H.E., Swanson A.B., Hafeman D.G., and Hoekstra W.G. (1973) Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science 179, 588–590.
16. Takahashi K., Avissar N., Whitin J., and Cohen H. (1987) Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: a selenoglycoprotein distinct from the known cellular enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 256, 677–686.
17. Chu F.F., Doroshow J.H., and Esworthy R.S. (1993) Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI. J. Biol. Chem. 268, 2571–2576.
18. Holland M.K., Alavarez J.G., and Storey B.T. (1982) Production of superoxide and activity of superoxide dismutase in rabbit epididymal spermatozoa. Biol. Reprod. 27, 1109–1118.
19. Li T.K. (1975) The glutathione and thiol content of mammalian spermatozoa and seminal plasma. Biol. Reprod. 12, 641–646.
20. Tramer F., Rocco F., Micali F., Sandri G., and Panfili E. (1998) Antioxidant systems in rat epididymal spermatozoa. Biol. Reprod. 59, 753–758.
21. Pognay G.C., Corzett M., Weston S., and Balhorn R. (1986) DNA and protein content of mouse sperm. Implications regarding sperm chromatin structure. Exp. Cell Res. 136, 127–136.
22. Claasens O.E., Menkveld R., Franken D.R., Pretorius E., Swart Y., Lombard C.J., and Kruger T.F. (1992) The Acridine Orange test: determining the relationship between sperm morphology and fertilization in vitro. Hum. Reprod. 7, 242–247.
23. Ward W.S., Kimura Y., and Yanagimachi R. (1999) An intact sperm nuclear matrix may be necessary for the mouse paternal genome to participate in embryonic development. Biol. Reprod. 60, 702–706.
24. Aitken R.J. (1999) The Amoroso Lecture. The human spermatozoon – a cell in crisis? J. Reprod, Fertil. 115, 1–7.
25. Godeas C., Tramer F., Micali F., Soranzo M., Sandri G., and Panfili E. (1997) Distribution and possible novel role of phospholipid hydroperoxidase glutathione peroxidase in rat epididymal spermatozoa. Biol. Reprod. 57, 1502–1508.
26. Hughes C.M., Lewis S.E., McKelvey-Martin V.J., and Thompson W. (1996) A comparison of baseline and induced DNA damage in human spermatozoa from fertile and infertile men, using a modified comet assay. Mol. Hum. Reprod. 2, 613–619.
27. Ursini F., Heim S., Kiess M., Maiorino M., Roveri A., Wissing J., and Flohe L. (1999) Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation. Science 285, 1393–1396.
28. Kelner M.J., and Montoya M.A. (1998) Structural organization of the human selenium-dependent phospholipid hydroperoxidase glutathione peroxidase gene (GPX4): chromosomal localization to 19p13.3. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 53–55.
29. Ursini, F., Heim, S., Kiess, M., Maiorino, M., Roveri, A., Wissing, J., and Flohe, L. (1999). Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation [see comments], Science 285, 1393–6.
30. Evenson, D.P., Darzynkiewicz, Z., and Melamed, M.R. (1980). Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility, Science 210, 1131–3.
31. Tejada, R.I., Mitchell, J.C., Norman, A., Marik, J.J., and Friedman, S. (1984). A test for the practical evaluation of male fertility by acridine orange (AO) fluorescence, Fertil Steril 42, 87–91.
32. Claassens, O.E., Menkveld, R., Franken, D.R., Pretorius, E., Swart, Y., Lombard, C. J., and Kruger, T. F. (1992). The Acridine Orange test: determining the relationship between sperm morphology and fertilization in vitro, Hum Reprod 7, 242–7.
33. Hammadeh, M.E., al-Hasani, S., Stieber, M., Rosenbaum, P., Kupker, D., Diedrich, K., and Schmidt, W. (1996). The effect of chromatin condensation (aniline blue staining) and morphology (strict criteria) of human spermatozoa on fertilization, cleavage and pregnancy rates in an intracytoplasmic sperm injection programme, Hum Reprod 11, 2468–71.
34. Haidl, G., and Schill, W.B. (1994). Assessment of sperm chromatin condensation: an important test for prediction of IVF outcome, Arch Androl 32, 263–6.
35. Hammadeh, M.E., Stieber, M., Haidl, G., and Schmidt, W. (1998). Association between sperm cell chromatin condensation, morphology based on strict criteria, and fertilization, cleavage and pregnancy rates in an IVF program, Andrologia 30, 29–35.
36. Hammadeh, M.E., Askari, A.S., Georg, T., Rosenbaum, P., and Schmidt, W. (1999). Effect of freezethawing procedure on chromatin stability, morphological alteration and membrane integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men, Int J Androl 22, 155–62.
37. Hammadeh, M.E., al-Hasani, S., Doerr, S., Stieber, M., Rosenbaum, P., Schmidt, W., and Diedrich, K. (1999). Comparison between chromatin condensation and morphology from testis biopsy extracted and ejaculated spermatozoa and their relationship to ICSI outcome, Hum Reprod 14, 363–7.
38. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, de Angelis P, Claussen OP. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod. 1999 Apr; 14(4): 1039–49
39. Knopp EA, Arndt TL, Eng KL, Caldwell M, LeBoeuf RC, Deeb SS, O'Brien KD. Murine phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase: cDNA sequence, tissue expression, and mapping. Mamm Genome. 1999 Jun; 10(6): 601–5.
40. Brigelius-Flohe R, Aumann KD, Blocker H, Gross G, Kiess M, Kloppel KD, Maiorino M, Roveri A, Schuckelt R, Usani F, et al. Phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase. Genomic DNA, cDNA, and Deduced amino acid sequence. J Biol Chem. 1994 Mar 11; 269(10): 7342–8.
41. Kelner MJ, Montoya MA. Structural organization of the human selenium-dependent phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene (GPX4): chromosomal localization to 19p13.3. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Aug 10; 249(1): 53–5.

Sequenzliste

Claims

Nukleinsäure, die für die Exons 2–7 des humanen PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Nukleinsäure, die für die Exons 2–7 des murinen PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 2 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Nukleinsäure, die für die Exons 2–7 des Ratten-PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 3 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Nukleinsäure, die für die Exons 2–7 des Schweine-PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, wobei das alternative Exon die in Seq. ID. Nr. 4 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, das die in Seq. ID. Nr. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, das die in Seq. ID. Nr. 2 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, das die in Seq. ID. Nr. 3 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens, das die in Seq. ID. Nr. 4 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der eine biologisch aktive Spermienkern-Glutathion-Peroxidase kodiert.
Primer zur Amplifizierung des alternativen Exons nach Anspruch 1, die die Sequenzen von Seq. ID. Nr. 5 und 6 aufweisen.
Säugetier-Selenoprotein, das durch die Nukleinsäure von Anspruch 1–8 kodiert wird.
Humanes Selenoprotein nach Anspruch 10, dessen N-terminale Sequenz durch Seq. ID. Nr. 7 oder durch Homologe oder Fragmente hiervon definiert ist, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Murines Selenoprotein nach Anspruch 10, dessen N-terminale Sequenz durch Seq. ID. Nr. 8 oder durch Homologe oder Fragmente hiervon definiert ist, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Ratten-Selenoprotein nach Anspruch 10, dessen N-terminale Sequenz durch Seq. ID. Nr. 9 oder durch Homologe oder Fragmente hiervon definiert ist, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Schweine-Selenoprotein nach Anspruch 10, dessen N-terminale Sequenz durch Seq. ID. Nr. 10 oder durch Homologe oder Fragmente hiervon definiert ist, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Peptid, das durch Seq. ID. Nr. 7 definiert ist.
Peptid, das durch Seq. ID. Nr. 8 definiert ist.
Peptid, das durch Seq. ID. Nr. 9 definiert ist.
Peptid, das durch Seq. ID. Nr. 10 definiert ist.
Expressionsvektor, der die Nukleinsäure eines der Ansprüche 1–8 umfaßt.
Wirtszelle, (ausgenommen eine menschliche embryon nach Stammzelle), die mit einem Vektor nach Anspruch 19 transformiert ist.
Screening-Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Fertilität eines Säugetiers, das die folgenden Schritte umfasst: – Spermien-DNA wird isoliert – das alternative Exon des PHGPx-Gens wird durch PCR amplifiziert – die amplifizierten Genabschnitte werden sequenziert – die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure des alternativen Exons im ersten Intron des PHGPx-Gens wird überprüft, wobei die männliche Fertilität beim Menschen bestimmt wird und die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure des alternativen Exons nach Seq. ID Nr. 1 überprüft wird, oder die männliche Fertilität bei der Maus bestimmt wird und die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure des alternativen Exons nach Seq. ID Nr. 2 überprüft wird, oder die männliche Fertilität bei der Ratte bestimmt wird und die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure des alternativen Exons nach Seq. ID Nr. 3 überprüft wird, oder die männliche Fertilität beim Schwein bestimmt wird und die Übereinstimmung der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure des alternativen Exons nach Seq. ID Nr. 4 überprüft wird.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Spermien zuvor durch einen Färbetest auf Kernkondensation überprüft werden.
Verfahren nach Anspruch 22, bei der eine Färbung durch Acridinorange erfolgt.
Antikörper, der spezifisch an eine der Aminosäuresequenzen von Anspruch 10–18 bindet.
Antikörper nach Anspruch 24, der monoklonal ist.
Antikörper nach Anspruch 24 oder 25, wobei der Antikörper an ein chemotherapeutisches Mittel oder ein toxisches Mittel und/oder an ein bildgebendes Mittel gebunden ist.
Hybridoma, die einen monoklonalen Antikörper mit einer Bindungsspezifität zu einer der Aminosäuren von Anspruch 10–18 produziert.
Test Kit, der Antikörper nach Anspruch 24–26 enthält.
Test Kit, der die Primer nach Anpruch 9 umfasst.
Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Proteins/Peptids nach einem der Ansprüche 10–18, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Verwendung der Zusammensetzungen von Anspruch 30 in der Therapie der männlichen Infertilität.