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Diese
Erfindung betrifft eine neue Form des PHGPx-Proteins, die Spermienkern-Glutathion-Peroxidase (snGPx)
sowie Teile hiervon, die eine Rolle bei der Spermatogenese von Säugetieren
spielen, sowie die diese kodierenden Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft
weiterhin Vektoren, die diese Nukleinsäuren enthalten und Wirtszellen,
die durch diese Vektoren transformiert sind. Die Erfindung umfaßt weiterhin
Antikörper,
die für die
vorgenannten Proteine/Peptide spezifisch sind, ebenso wie die Verwendung
der Proteine/Peptide bei der Diagnose oder Therapie der männlichen
Infertilität.
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Die
Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (PHGPx, auch GPx-4
genannt) ist ein Selenoenzym. Sie trägt Selenocystein, als 21. Aminosäure, im
aktiven Zentrum und ist eine Oxidoreduktase, die H2O2 entgiften kann. Sie kommt in der Zelle
im Cytosol und in den Mitochondrien vor, wird ubiquitär exprimiert
und hat als Besonderheit, dass sie im Gegensatz zu anderen Glutathionproxidasen
auch Lipidperoxide, oxidiertes LDL und oxidiertes Cholesterin, reduzieren
kann, Im Gegenzug dazu wird Glutathion oxidiert. Eine weitere Besonderheit
von PHGPx ist, dass bei Glutathion-Mangel, wenn Glutathion-Thiolgruppen
nicht als Elektronenquelle zur Verfügung stehen, auch Protein-Thiole
als Substrat benutzt und somit Disulfidbrücken in Proteine eingeführt werden
können.
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Mehrere
Studien zeigten, daß Selen
eine bedeutende Rolle in der Sperma-Entwicklung bei Säugetieren
spielt. Bei Ratten wurde herausgefunden, daß sich die Selen-Konzentration
im Hoden nach Beginn der Pubertät
markant erhöht,
und daß die
Hauptzielzellen für
das Element die Spermien sind, die bei weitem den höchsten Selen-Spiegel
aller Kompartimente in der Ratte aufweisen (1). Selen-depletierte
Ratten erzeugten Spermien mit einer verschlechterten Beweglichkeit
und Anomalien im Mittelteil. Bei Selen-Mangelmäusen wurden ebenfalls Abnormalitäten beobachtet,
die am häufigsten
aus Mißbildungen
des Spermienkopfes (3) bestanden. Eine ernsthafte Abreicherung von
Selen bei Ratten führte
zu einer testikulären
Atrophie und einer vollständigen
Unterbrechung der Spermatogenese (4).
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Eine
in vivo-Markierung von Ratten mit 75Se und
Trennung der Gewebshomogenate durch gelelektrophoretische Verfahren
zeigte, daß das
Element im Organismus in einer größeren Anzahl von Selen-haltigen Proteinen
vorliegt (5, 6). Von diesen wird ein Protein mit einer apparenten
Molekülmasse
von ungefähr
34 kD nur im Hoden und in den Spermien gefunden (5). Es befindet
sich in den Kernen der Spermazellen und wird in den späten Spermatiden
in hohem Maße
exprimiert (7). Während
diesen Stadien durchlaufen die Kerne beträchtliche Veränderungen,
die durch die Ersetzung der Histone durch die Protamine und durch
die Reorganisation und Kondensation der DNA charakterisiert sind,
die durch die Vernetzung der Protamin-Thiole bestimmt ist und eine
Struktur zur Folge hat, die gegenüber chemischer und mechanischer
Belastung hochbeständig sind
(8). Die Tatsache, daß die
Veränderungen
mit dem Auftreten des 34 kD Selenoproteins koinzident sind, legt
nahe, daß dieses
in diesen Prozessen involviert ist.
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Früher wurde
diesem Enzym ausschließlich
eine Funktion als Schutzenzym vor oxidativen Schädigungen zugesprochen. Vor
eineinhalb Jahren haben Flohé und
Ursini (29) jedoch gezeigt, dass das gleiche Enzym in oxidierter
Form (d.h. mit inter- und intramolekular quervernetzten Disulfidbrücken) die
mitochondriale Kapsel von Spermien (mit)ausbildet. Dafür werden
große
Mengen des Enzyms in Spermien benötigt.
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Eine
Strukturaufklärung
dieses Selenoproteins bzw. der dieses Selenoprotein kodierenden
Nukleinsäuren
kann somit einen wichtigen Beitrag zur in vitro-Diagnose der männlichen
Infertilität
liefern und einen bedeutenden Beitrag zu zukünftigen Therapieansätzen liefern.
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Eine
Nukleinsäuresequenz,
die ein Selen-abhängiges
Phospolipid-Gluthathion-Peroxidase-Protein kodiert ist bereits bekannt
(Datenbankzugangsnummer:
AF060972S1 ).
Es ist jedoch lediglich die genomische PHGPx-Sequenz beschrieben
und keine Hinweise sind enthalten, welche Teile dieser genomischen
Sequenz als Exons und Introns definiert sind.
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Hierin
offenbart ist ein neues Selenoprotein bzw. die diesem Selenoprotein
zu Grunde liegende Nukleinsäuresequenz.
Die Erfinder haben nach Reinigung und Sequenzierung des Proteins
festgestellt, dass dieses Selenoprotein eine neue Form von PHGPx
ist, die durch alternatives Spleißen der PHGPx-RNA gebildet wird.
Diese neue und alternative PHGPx Form wird nur im Hoden und dort
sehr stark exprimiert. Das im neuen Spleißprodukt exprimierte alternative
Exon ist stark basisch und vermittelt die Lokalisation des Proteins
im Zellkern. Aufgrund seiner biochemischen Eigenschaften ist damit
sehr wahrscheinlich, dass dieses Enzym für die Kernkondensation verantwortlich
ist. Diese kommt durch inter- und intramolekulare Quervernetzung
der Thiolgruppen in Protaminen zustande. Das alternative Exon hat
hohe Sequenzhomologie zu Protaminen und bindet über die stark basischen Aminosäuren vermutlich
direkt an DNA. Es wurde herausgefunden, dass die Kernkondensation
durch hohe Konzentrationen von Dithiothreitol (DTT) rückgängig gemacht
werden kann. Werden Ratten mit einer Selen-depletierten Nahrung
gefüttert,
bilden sie viel geringere Mengen des neuen Selenoproteins aus und
zeigen eine Störung
der Kernkondensation ihrer Spermien. Dies ist auch der Grund für die männliche
Infertilität
bei Ratten unter Selendepletion. Der kausale Zusammenhang zwischen
der neuen PHGPx Form und der Kernkondensation ist somit funktionell
zwingend.
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Grundsätzlich ist
das neue Selenoprotein durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die die
Exons 2–7 des
PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens
enthält.
Zusätzlich
kann die Nukleinsäure
wahlweise das Exon 1 des PHGPx-Gens enthalten.
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Bei
den Exons 1–7
des PHGPx-Gens handelt es sich um hochkonservierte Sequenzen, die
bereits für einige
Säugetierarten
(Maus: (39), Schwein: (40), Mensch: (41)) beschrieben worden sind.
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Es
hat sich jedoch überraschenderweise
herausgestellt, dass die N-terminalen Aminosäuresequenzen des neuen Selenoproteins
durch ein bisher unbekanntes alternatives Exon kodiert werden, das
zwischen verschiedenen Säugetierspezies
nur schwach konserviert ist.
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Die
Erfindung stellt somit in einem ersten Aspekt eine Nukleinsäure bereit,
die für
die Exons 2–7
des humanen PHGPx-Gens und ein alternatives Exon im ersten Intron
des PHGPx-Gens kodiert, wobei das alternative Exon die in Seq. ID.
Nr. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil hiervon umfaßt, der
ein biologisch aktives Peptid kodiert.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren bereit, die für Maus-,
Ratten- und Schweine-Selenoproteine kodieren und wie in den Ansprüchen 2–4 definiert
sind.
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Diese
enthalten alternative Exons für
Maus, Ratte und Schwein, die in den Seq. ID. Nr. 2–4 definiert sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin alternative Exons, die
die in den Seq. ID. Nr. 1–4
dargestellten Sequenzen oder einen Teil hiervon umfassen, der ein
biologisch aktives Peptid kodiert.
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Der
Begriff alternatives Exon, wie hierin verwendet, bedeutet ein Exon,
das beispielsweise durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen RNA-Primärtranskriptes
gebildet wird.
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Gemäß weiteren
Ausführungsformen
umfasst die vorliegende Erfindung ein Säugetier-Selenoprotein, das durch die Nukleinsäure von
Anspruch 1–8
kodiert wird. Dieses kann vorzugsweise eine wie in den Seq. ID.
Nr. 7–10
definierte N-terminale Sequenz oder Homologe oder Fragmente hiervon
enthalten, die eine biologische Aktivität beibehalten.
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Weiterhin
umfasst die Erfindung Peptide gemäß Seq. ID. Nr. 7–10.
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Für den auf
dem einschlägigen
Fachgebiet tätigen
Fachmann ist offensichtlich, daß die
Ausübung
der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der exakten
Sequenzen beschränkt
ist, wie sie in den Seq. ID. Nr. 1–10 definiert sind.
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Modifikationen
der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen
in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen
(silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs
der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
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Als
Beispiel hierfür
werden Veränderungen
in der Nukleinsäuresequenz
betrachtet, die die Erzeugung einer äquivalenten Aminosäure an einer
vorgegebenen Stelle zur Folge haben. Vorzugsweise sind derartige Aminosäure-Substitutionen
das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen
strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative
Aminosäureersetzungen.
Aminosäuresubstitutionen
können
auf Grundlage der Ähnlichkeit
in der Polarität,
Ladung, Löslichkeit,
Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen)
Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare
(hydrophobe) Aminosäuren
sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan
und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin,
Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene
(basische) Aminosäuren
schließen
Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Aspartinsäure und
Glutaminsäure
ein.
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"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise
im Bereich von ein bis fünf
Aminosäuren. Der
erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene
Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in
einem Polypeptidmolekül
unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen
der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt
werden.
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Nucleotidveränderungen,
die eine Veränderung
der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls zur Folge
haben, ändern
häufig
die Protein-Aktivität
nicht, weil diese Anteile üblicherweise
nicht in die biologische Aktivität
involviert sind. Es kann ebenfalls erwünscht sein, ein oder mehrere
der in der Sequenz vorliegenden Cysteine zu eliminieren, weil das
Vorhandensein von Cysteinen eine unerwünschte Bildung von Multimeren
zur Folge haben kann, wenn die Proteine rekombinant erzeugt werden,
wodurch die Reinigung und Kristallisations-Verfahren kompliziert
werden. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen bewegt sich innerhalb der
technischen und naturwissenschaftlichen Grundkenntnisse, genauso
wie die Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten
Produkte.
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Daraus
ergibt sich, daß,
wo der Begriff "DNA-Sequenz" entweder in der
Beschreibung oder in den Ansprüchen
verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten
umfaßt,
die in der Erzeugung eines biologisch äquivalenten Peptids/Proteins
resultieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor,
der eine der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen enthält.
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Zahlreiche
zur Verwendung beim Transformieren von bakteriellen Zellen geeignete
Vektoren sind bekannt, beispielsweise können Plasmide und Bakteriophagen,
wie der Phage λ,
als die am häufigst
verwendeten Vektoren für
bakterielle Wirte verwendet werden. Sowohl in Säugetier- als auch Insektenzellen
können
beispielsweise virale Vektoren zur Expression eines exogenen DNA-Fragments
verwendet werden. Beispielhafte Vektoren sind das SV40 oder Polyoma-Virus.
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Die
Transformierung der Wirtszellen kann alternativ direkt durch "nackte DNA" ohne Verwendung
eines Vektors erfolgen.
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Die
Erzeugung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins
kann entweder in eukaryotischen Zellen oder prokaryotischen Zellen
erfolgen. Beispiele von geeigneten eukaryotischen Zellen schließen Säugetierzellen, Pflanzenzellen,
Hefezellen und Insektenzellen ein. Geeignete prokaryotische Wirte
schließen
E.coli und Bacillus subtilis ein.
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Ein
Verfahren zur Erzeugung eines im Wesentlichen reinen Selenoproteins/Peptids
umfasst das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor nach
Anspruch 19, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die
eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben und ein
Isolieren des Selenoproteins/Peptids aus der Wirtszelle.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine/Peptide
sind serologisch aktiv, immunogen und/oder antigen. Sie können daher
weiterhin als Immunogene zur Erzeugung spezifischer, sowohl polyclonaler
als auch monoclonaler, Antikörper
verwendet werden.
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Diese
spezifischen Antikörper
können
zur Diagnose/Prognose verwendet werden. Die Selenoprotein/Peptid-spezifischen
Antikörper
können
beispielsweise in der Labordiagnostik unter Verwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie
oder der immunhistochemischen Färbung
oder als ein Bestandteil in Immunassays zum Nachweis und/oder Quantifizieren
des Selenoproteins/Peptids in klinischen Proben verwendet werden. Derartige
spezifische Antikörper
können
als Bestandteile diagnostischer/prognostischer Kits verwendet werden.
Darüberhinaus
können
derartige Antikörper
zur Affinitätsreinigung
der erfindungsgemäßen Selenoproteine/Peptide
verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die eine Hybridoma
enthält,
die einen monoclonalen Antikörper
mit einer Bindungsspezifität
zu einem der offenbarten Proteine/Peptide aufweist.
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Ein
für die
erfindungsgemäßen Selenoproteine/Peptide
spezifischer monoklonaler Antikörper
kann wie folgt hergestellt werden. Einer Maus werden zwei Injektionen
des erfindungsgemäßen Selenoproteins/Peptids
verabreicht. Die erste Injektion enthält das erfindungsgemäße Selenoprotein/Peptid
in vollständigem
Freund'schen Adjuvanz
und wird subkutan verabreicht. Die zweite Injektion enthält das erfindungsgemäße Selenoprotein/Peptid in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz und
wird intraperitoneal gegeben. Mehrere Injektionen folgen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten über
einen Zeitraum von mehreren Monaten hinweg. Der Maus werden dann
Milzzellen entnommen und in Polyethylenglykol mit Myelomzellen fusioniert.
Die entstandenen Hybridzellen werden anschließend durchmustert, um festzustellen,
welche den Antikörper
mit der gewünschten
Spezifität
erzeugt (Nach Milstein, C. Monoclonal Antibodies, Scientific American).
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Screening-Verfahren
zur in vitro-Bestimmung
der Fertilität
eines Säugetiers,
das die folgenden Schritte umfasst: Spermien-DNA wird isoliert, das alternative Exon des
PHGPx-Gens wird durch PCR amplifiziert die amplifizierten Genabschnitte
werden sequenziert und die Übereinstimmung
der amplifizierten Genabschnitte mit der Nukleinsäure eines
erfindungsgemäßen alternativen
Exons überprüft.
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Bei
bevorzugten Ausführungsformen
erfolgt die Bestimmung für
Mensch, Maus, Ratte und Schwein jeweils anhand der in den Seq. ID.
Nr. 1–4
angegebenen Nukleinsäuren.
Es ist jedoch offensichtlich, dass die Erfindung nicht auf diese
Tierarten beschränkt
ist. Sie ist vielmehr vorteilhaft bei der Fertilitätsbestimmung
(und bei einer negativen Sequenzübereinstimmung
dadurch auch bei der Bestimmung der Infertilität) aller Arten von Nutz- und
Haustieren. Derartige Nutz- und Haustiere sind beispielsweise Rinder,
Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen und Hunde.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
erfolgt zunächst
eine Feststellung einer Kernkondensation von Spermien durch Anfärbung mit
Acridinorange, Feulgen-Reagenz oder saurem Anilinblau und mikroskopischem
Nachweis. Kondensierte Spermienkerne sind resistent gegenüber der
Aufnahme von Farbstoffen (Feulgen-Reagenz, Anilinblau) und resistent
gegenüber
einer Denaturierung der DNA durch Hitze oder saures Milieu. Acridinorange
färbt bei
einer bestimmten UV-Anregung, doppelsträngige DNA grün, einzelsträngige DNA
und RNA aber rot an. Bei gestörter
Kernkondensation ist die DNA durch Säure (Fixierung in saurem Alkohol)
oder Hitze denaturierbar. Der Kern wird dann durch Acridinorange
rot angefärbt.
Die DNA von kondensierten Kernen lässt sich nicht denaturieren
und fluoresziert grün.
Mit diesen Methoden können
Patienten-Proben mit einer gestörten
Kondensation des Spermienkopfes erkannt werden. Diese Vorauswahl
sorgt für eine spezifische
Selektion derjenigen Spermien-Proben, mit denen dann das aufwendigere
Screeningverfahren durchgeführt
wird.
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Bei
einem rekombinanten nicht menschlichen Säugetier kann die DNA-Sequenz
von Anspruch 2–4
inaktiviert wurde. Beispielsweise wird eine rekombinante Maus bereitgestellt,
bei der die bei der die Nukleinsäure von
Seq. ID Nr. 2 inaktiviert wurde. Somit kann unter Verwendung einer
derartigen rekombinanten knock-out-Maus ein Tiermodell errichtet
werden. Diese Tiermodelle ermöglichen
weitere Einsichten in die Ätiologie
mehrerer Störungen
in Verbindung mit der Infertilität
bei männlichen
Säugetieren.
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Zuletzt
umfaßt
die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge
eines Proteins/Peptids nach einem der Ansprüche 10–18 in Kombination mit einem
pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst,
sowie deren Verwendung in der in vitro Diagnose der männlichen
Infertilität
bzw. in der in vitro/in vivo Therapie der männlichen Infertilität.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
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1:
Selenoprotein in CTAB-behandelten Sonifikations-beständigen Kernen
von späten
Spermatiden (SRS/CTAB Kerne) und von epididymalen Spermien (SRSP/CTAB-Kerne).
Nach in vivo Markierung von Ratten mit 75Se,
Isolierung der Kerne durch SDS-PAGE wurden die auf eine PVDF-Membran übetragenen
Selenoproteine mittels einer Immunreaktion mit einem PHGPx Antikörper oder
durch Autoradiographie des 75Se-Tracers
bestimmt.
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2:
Unterschiede der isoelektrischen Punkte der im Spermienkern vorliegenden
Selenoproteine, die auf eine teilweise Verarbeitung von snGPx zurückzuführen sind.
Die Proteine von CTAB-behandelten epididymalen Spermienkernen wurden
durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt und die 75Se
markierten Selenoproteine durch Autoradiographie bestimmt.
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3:
Zusammensetzung des alternativen Exons Ea, das die N-terminale Sequenz
der Spermienkern-Glutathion-Peroxidase (snGBx) kodiert. A) Unterschiede
in der Primärstruktur von
PHGPx und snGPx: PHGPx wird durch die sieben Exons E1 bis E7 (28)
kodiert, wohingegen snGPx, wegen alternativen Spleißens, durch
die Exons Ea bis E7 kodiert wird. B) Sequenz von Ea und die entsprechende
N-terminale Sequenz von snGPx bei der Maus, Ratte, Mensch und Schwein.
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4:
Verteilung von snGPx und PHGPx in Geweben der Maus, bestimmt durch
Northern Blot-Analyse: 20 μg
Gesamt-RNA wurden pro Bahn aufgetragen, auf eine Membran geblotted
und mit der kodierenden Region für
das alternative Exon (1) oder mit der gesamten cDNA von PHGPx (2)
sondiert.
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5:
Wirkung des Selenmangels auf die Spermakern-Konzentration bei der
Ratte. Spermien von Ratten, die mit adäquaten Mengen an Selen (a)
versorgt wurden und Tiere mit Selen-Mangel (b) wurden aus dem vas
deferens gesammelt und mit Acridinorange gefärbt. Acridinorange färbt doppelsträngige DNA
grün und
einsträngige
DNA rot. Weil Sperma-DNA
nur säurebeständig ist,
wenn die Protamine durch Disulfide quervernetzt sind, ermöglicht das
Verfahren die Bestimmung der Chromatin-Kondensation und des Protamindisulfid-Status.
Beinahe alle Spermienkerne von Ratten mit Selenmangel zeigten eine
abnormale Kondensation.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung:
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Ein
34 KD-Selenoprotein, das aus Ratten-Hoden isoliert wurde, wurde
als eine spezifische Spermienkern-Glutathion-Peroxidase(Sperm Nuclei
Glutathion Peroxidase = snGPx) mit ähnlichen Eigenschaften wie PHGPx
identifiziert. Die Bestimmung seiner Primärstruktur durch Analyse der
ersten N-terminalen Aminosäuren,
eine Datenbankrecherche, Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzieren der
cDNA, zeigten, daß es
sich von PHGPx in seiner N-terminalen
Sequenz unterscheidet. Diese Sequenz, die durch ein alternatives
Exon im ersten Intron des PHGPx-Gens kodiert ist, zeigt mehr als
50% Homologie zu den Protamin-Sequenzen
und enthält
ein Kern-Lokalisationssignal. Bei Ratten wird snGPx in den Kernen
später
Spermatiden in hohem Maße exprimiert,
wo es das einzige vorliegende Selenoprotein ist. Sein Auftreten
ist mit der Reorganisation der DNA koinzident, die zu einem hochkondensierten
Chromatin führt,
das durch quervernetzte Protamin-Tiole stabilisiert ist. Bei Selen-depletierten
Ratten, bei denen die Konzentration an snGPx auf ein Drittel des normalen Spiegels
verringert wurde, wurde die Chromatinkondensation ernsthaft gestört. Wir
haben bewiesen, daß snGPx
als eine Protamin-thiol-Peroxidase wirkt, die für die Disulfid-Quervernetzung durch
Reduktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies verantwortlich ist. Seine
duale Funktion in der Chromatin-Kondensation und im Schutz von Sperma-DNA
gegen Oxidation ist notwendig, um die männliche Fruchtbarkeit und Sperma-Qualität sicherzustellen.
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Identifizierung des 34 kD-Selenproteins
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As
ein erster Schritt wurde das 34 kD Selenoprotein aus den SRS-Kernen
der späten
Spermatiden von Ratten, die mit einer Selen-adäquaten Diät gefüttert wurden, gereinigt. Nach
der Behandlung der Oberflächen dieser
Kerne mit den Detergenz CTAB stellte sich heraus, daß das 34
kD Protein das einzige Selenoprotein innerhalb dieser Kerne war,
wie es durch das Autradiogramm in 1, Bahn
3, ersichtlich ist. Für
die Selenkonzentration und somit das 34 kD-Selenoprotein in den
CTAB-behandelten SRS-Kernen wurde ein relativ hoher Wert von ungefähr 60 μmol/kg Trockenmasse
bestimmt, der die Selenkonzentration in den Kernfraktionen anderer
Ratten-Gewebe wie beispielsweise der Leber (14 μmol Se/kg Trockenmasse) und
des Gehirns (8 μmol Se/kg
Trockenmasse) bei weitem überschritt.
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Eine
Proteinfragmentanalyse durch MALDI-MS nach tryptischer Verdauung
zeigte eine beträchtliche Ähnlichkeit
zwischen dem 34 kD Protein und einem anderen Selenoprotein, nämlich PHGPx,
einem der vier Glutathion-Peroxidasen, die bis jetzt identifziert
wurden, die die Reduktion von Peroxid durch die Oxidation von Gluthathion
(12, 15–17)
katalysieren.
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Die Ähnlichkeit
wurde in einem Experiment noch augenfälliger, indem sich herausstellte,
daß das
34 kD-Protein mit einem PHGPx-Antikörper reagiert, wie es in der
ersten Bahn von 1 dargestellt ist. Es hemmte
ebenfalls die Glutathionperoxidase-Aktivität und katalysierte wie PHGPx
die Reduktion verschiedener Peroxide, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid,
t-Butylhydroperoxid
und Phosphatidylcholinhydroperoxid (12). Seine spezifische Aktivität betrug
ungefähr
3000 U/mg Protein, wenn das letztere als Substrat verwendet wurde.
Wegen seiner Lokalisation wurde dieses Spermienkern-Glutathionperoxidase
(sperm nuclei glutathione peroxidase = snGPx).
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Während der Übertragung
der Spermien vom Hoden auf die Epididymis wurden zwei Drittel des
34 kD Selenoproteins zu kleineren Proteinen mit Molekularmassen
von 24, 22 und 20 kD umgewandelt, wie in den Bahnen 2 und 4 in 1 ersichtlich
ist. Diese Trunkierung bzw. Verkürzung
wird von einer Verschiebung des pH von einem extrem basischen Wert
von mehr als 10 für
das 34 kD-Protein zu einem Wert von ungefähr 7,5 für das 20 kD-Produkt (2)
begleitet. Die Reduktion der Masse hat jedoch keine Wirkung auf
die enzymatischen Eigenschaften der verarbeiteten Proteine.
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Die
Analyse der N-terminalen Sequenz der 34 kD-Verbindung zeigte, daß sie mit
den Aminosäuren SRAAARGRKR
startete. Datenbankrecherchen zeigten, daß das Protein bis jetzt unbekannt
war. Wenn die Recherche jedoch auf alle verfügbaren genomischen Sequenzen
ausgedehnt wurde und diese in alle Leseraster übertragen wurden, kamen wir
bei einer ähnlichen
Sequenz im ersten Intron des Maus PHGPx-Gens an. Ein alternatives
Exon, das für
die Bildung des neuen Selenoproteins verantwortlich ist, wurde in
Maus- und Ratten-Testis-RNA
unter Verwendung einer cDNA Amplifizierung mit Primern identifziert,
die von den verfügbaren
DNA- und Protein-Sequenz-Informationen abgeleitet waren (3).
Die Sequenz dieses Exons in Maus und Ratte und das vermeintlich
entsprechende Exon beim Mensch und Schwein ist in 3b dargestellt.
Es kodiert eine argininreiche Sequenz unmittelbar nach dem ersten
Methionin.
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Informationen
bezüglich
der Funktion dieser Sequenz wurde in einem Experiment gewonnen,
in dem zwei GFP-Fusionsgene konstruiert wurden. Für das erste
wurde das gesamte alternative Exon der Maussequenz an GFP fusioniert
und für
das zweite die Sequenz nach dem zweiten Methionin. Nach Transfektion
beider Konstrukte in zwei Säugetierzell-Linien
wurde die subzelluläre
Lokalisation der beiden Fusionsproteine mittels GFP-Fluoreszenz
bestimmt. Nur das größte GFP-Fusionsprotein
war in den Kern eingedrungen, was anzeigt, daß die N-terminale argininreiche
Sequenz ein Kern-Lokalisations-Signal enthält (Daten nicht dargestellt).
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Eine
Northern-blot-Analyse unterschiedlicher Gewebe der Maus, die mit
der Ea-Sequenz of snGPx oder mit der gesamten Sequenz von PHGPx
sondiert wurde (4) zeigte, daß snGPx
nur im Hoden exprimiert wird. Dies wurde durch Messen der Verteilung
von 75Se-markierten Proteinen im Maus-Organismus
bestätigt.
Hier wurde snGPx nur in Testis und in den Spermien nachgewiesen,
wie es bereits früher
bei Ratten herausgefunden wurde (5), eine Tatsache, die eine spezifische
Funktion dieses Selenoenzyms nahelegt.
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Untersuchung der Funktion
von snGPx
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Das
Auftreten von snGPx in späten
Stadien der Spermiogenese ist mit der Verpackung der DNA mit Protaminen
und der Stabilisierung des sich ergebenden hochkondensierten Chromatins
durch Vernetzung von Protamin-Disulfiden (8) koinzident. Dieses
Verfahren wird durch reaktive Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species
= ROS) (18) induziert und ist somit der Glutathion-Oxidation und
Peroxid-Reduktion, die durch Glutathionperoxidasen katalysiert wird,
analog. Dies legte zusammen mit der Entdeckung, daß die Glutathion-Konzentration in
Spermatiden während
der späten
Stadien der Spermatiden-Entwicklung (19) deutlich abnimmt, nahe,
daß das
Selenoenzym in der Lage sein könnte,
die Protamin-Cysteinreste
als Reduktionsmittel zu verwenden, wodurch es als eine Protaminthiol-Peroxidase wirkt.
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Es
wurde deswegen die Spermienkern-Kondensation in Selen-Mangelratten,
bei denen die Konzentration an Selen und somit an snGPX im CTAB-behandelten
SRS-Kernen auf 20 μMol
Se/kg Trockenmasse im Vergleich zum Wert von 60 μMol Se/kg Trockenmasse in Selen-adäquaten Tieren
abgenommen hatte, untersucht. Die Kerne beider Gruppen wurden mit
Acridinorange angefärbt,
was es möglich
macht, zwischen doppel- und einsträngigen Nukleinsäuren zu
unterscheiden. Weil Spermien-DNA durch Säuren oder Hitze nur vor, jedoch
nicht nach der Protamindisulfid-Vernetzung denaturiert werden kann,
macht es eine Acridinorangefärbung
nach der Behandlung möglich,
den Thiol-Disulfid-Status während
der Chromatinkondensation von Säugetierspermien-Kernen
zu überwachen
(14). Das Färben
zeigte, daß beinahe
alle aus dem Vas Deferens der Selenmangelratten entnommenen Spermienzellen
unvollständig
kondensiert waren (5).
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In
vitro-Experimente mit Spermienkernen aus Selen-adäquaten Ratten
zeigten, daß der
kondensierte Status während
der Reduktion von Protamindisulfiden mit Dithiothreitol verloren
ging und durch Zusatz von Wasserstoffperoxid wiederhergestellt werden
konnte. Die Rekondensation wurde durch Zusatz von Bromsulfophthalcin,
eines Inhibitors von PHGPx (20) oder durch einen Überschuß eines
anderen Thiols in der Form von GSH blockiert. Aus diesen Feststellungen
kann geschlossen werden, daß snGPx
in die Protamindisulfid-Quervernetzung
involviert ist.
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Das
34 kD Selenoprotein, das in Testis und Spermien entdeckt wurde (5),
wurde nunmehr als eine spezifische Spermienkern-Glutathionperoxidase
mit Eigenschaften identifziert, die denjenigen von PHGPx ähnlich sind.
Es wird durch das Gen für
PHGPx kodiert, es wird jedoch im Gegensatz zu diesem Selenoenzym
ausschließlich
in Hoden exprimiert und startet mit einer argininreichen N-terminalen
Sequenz, die durch ein alternatives Exon kodiert wird. Diese Sequenz
enthält
ein Kernlokalisations-Signal, das es dem snGPx ermöglicht, als
das einzige Selenoprotein in den Spermienkern einzutreten.
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Ein
weiterer Hinweis auf die Signifikanz dieser Sequenz ist die Tatsache,
daß sie
mehr als 50% Homologie mit den Sequenzen der Protamine zeigt. Protamine
sind kleine basische Proteine, die arginin- und cysteinreich sind,
und die die Histone während
der Spermien-Reifung
ersetzen. Es ist bekannt, daß sie
an DNA über
ihre Polyarginin-Region binden (21) und es ist sehr wahrscheinlich,
daß snGPx
in einer ähnlichen
Weise an die DNA angelagert wird.
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Mit
unseren Feststellungen, daß snGPx
als eine Protaminthiol-Peroxidase wirkt, die für die Bildung von quervernetzten
Protamin-Disulfiden und somit für
die Stabilisierung der kondensierten Spermien-Kerne verantwortlich
ist, und daß eine
Abnahme in den snGPx-Spiegeln
zu ernsthaften Störungen
der Chromatin-Kondensation führt,
wurde eine weitere bedeutende Rolle des Selens festgestellt. Der
Prozeß der
Chromatinkondensation scheint nicht nur für die Reifung der Spermazellen,
jedoch auch für
die Fertilität
und die Genese der Nachkommenschaft entscheidend zu sein. Beim Menschen
wurde eine hohe Korrelation zwischen einer regulären Sperma-Chromatinkondensation
und der in vitro Fertilisations-Rate beobachtet (22). In vitro-Experimente
mit Mäusen
zeigten, daß ein
kondensierter Spermien-Kern
mit einer stabilen Matrix benötigt wird,
um eine normale Befruchtung und Embryonalentwicklung sicherzustellen
(23). Somit scheint die snGPx-abhängige Protaminthiol-Oxidation
eine Schlüsselrolle
in der männlichen
Fertilität
und Reproduktion zu spielen.
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Wenn
das Spermium den Caput Epididymis erreicht und der Kondensationsprozeß abgeschlossen wird,
wird snGPx teilweise in kleinere Proteine mit derselben enzymatischen Aktivität, jedoch
mit neutralen pH-Werten verarbeitet, was darauf hinweist, daß die basische
arginin-reiche N-terminale Sequenz verloren ging. snGPx und die
verarbeiteten Proteine erfüllen
daher zwei Funktionen: Erstens, Oxidation von Protaminen durch die
an volle-Länge-DNA-gebundene snGPx
und zweitens, Schutz der Sperma-DNA gegen oxidative Schädigung durch
das Enzym und der trunktierten Formen, die, weil sie nicht an die
DNA gebunden sind, bei der ROS-Degradation effizienter sein könnten.
-
Es
wurde in mehreren Studien dargelegt, daß die Qualität von menschlichem
Sperma durch eine Zunahme von oxidativen DNA-Schädigungen abnimmt. Weil eine
beschränkte
Erzeugung an ROS jedoch für
die Protaminthiol-Quervernetzung erforderlich ist, beeinträchtigt eine
DNA-Beschädigung,
die auf exzessiven Mengen von ROS zurückzuführen ist, die Gesundheit der
Nachkommenschaft (24). Die Bestimmung des snGPx-Status des Spermien-Kerns
kann deswegen von Bedeutung bei der Feststellung der Sperma-Qualität sein.
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Es
wurde vorgeschlagen, daß PHGPx
eine Rolle in der Chromatinkondensation (25) und beim Schutz der
Sperma-DNA gegen eine oxidative Schädigung (26) spielt. Jedoch
wird PHGPx nur in einer cytosolischen und mitochondrialen Form exprimiert
und ist in den Spermien hauptsächlich
membran-gebunden (25). Mit der Identifizierung von snGPx als dem
einzigen Selenoprotein, das in Spermatiden-Kernen vorliegt und mit
dessen Charakterisierung als eine Protaminthiol-Peroxidase wurde
diese Diskrepanz nunmehr aufgelöst.
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Es
ist bekannt, daß Selen
eine Rolle bei verschiedenen Prozessen im männlichen reproduktiven System
spielt. PHGPx wirkt als eine strukturelle Komponente in der mitochondrialen
Kapsel (27) und wird somit bei der Bildung des Flagellums benötigt, wohingegen
in den Kernen snGPx und seine verarbeiteten Produkte in die Chromatinkondensation
und den Schutz der Keimbahn gegen eine oxidative Schädigung involviert
sind. Selen wurde ebenfalls als für die Testosteron-Biosynthese
in einer bis jetzt nicht identifizierten Art und Weise notwendig
dargestellt (4). Es wird von großem Interesse sein herauszufinden,
in welchem Ausmaß Störungen der
Bildung und Funktion von Selenoproteinen zur Ethologie männlicher
Fruchtbarkeitsstörungen
beitragen.
-
Die
nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und
sollten nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen
werden.
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Beispiele:
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Die
Konzentrationsaufgaben "M
und mM" beziehen
sich auf Mol/l bzw. mMol/l.
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Tierexperimente
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Ratten
wurden für
einige Generationen entweder einer Selen-Mangeldiät, die 2–5 μg Se/kg enthielt oder
einer selen-adäquaten
Diät unterworfen,
die aus der Basal-Diät
mit 300 μg
Se/kg bestand, zugesetzt als Natriumselenit. In den Tracer-Experimenten
wurden die Tiere in vivo durch Injektion einer Dosis von 20 MBq 75Se (spezifische Aktivität zwischen 18 und 35 MBq/μg Se) als
Natriumselenit markiert. Die Zusammensetzung der Diät und die
Behandlung der Tiere wurden an anderer Stelle beschrieben (6). In
den Tracer-Experimenten mit Mäusen
wurden adulte Mäuse
zwei Wochen lang der Basal-Diät
unterworfen und wurden dann durch eine Injektion einer Dosis von
3 MBq 75Se-Selenit markiert.
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Selenbestimmung
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Die
Selenkonzentrationen von Geweben und testikulären Fraktionen wurden durch
instrumentelle Neutron-Aktivierungs-Analyse, wie bereits an früherer Stelle
beschrieben (9), bestimmt. In den Tracer Experimenten wurde die 75Se-Aktivität in den Geweben und die Gewebs-Fraktionen
mittels eines NAI(TI) Well-Typ Detektors gemessen, der an einen
Multi-Kanal Analysegerät (Canberra,
Frankfurt, Deutschland) angeschlossen war. Die 75Se-markierten Selenoproteine,
die durch SDS-PAGE getrennt wurden, wurden durch Autoradiographie
unter Verwendung einer lichtempfindlichen Bildplatte (Fuji, BAS
1000, Ragtest, Straubenhardt, Deutschland) untersucht.
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Reinigung des 34 kD-Selenoproteins
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Nach
Entkapselung wurden die Hoden im vierfachen Volumen eines Puffers
A (20 mM MES, 0,31 M Sucrose, 3 mM MgCl2,
0,1% Triton X-100, 50 mM Benzamid HCl, 0,1 mM PMSF, pH 6,0–6,1) homogenisiert. Nach
Zentrifugieen bei 1000 × g
wurden die Beschallung resistenten Kerne (SRS-Kerne) von späten Spermatiden
wie bereits an früherer
Stelle beschrieben, isoliert (10), indem eine B15 Branson Zell-Disruptor
(Heinemann, Schwäbisch
Gmünd,
Deutschland) verwendet wurde. Nach Inkubation in Puffern B (1% CTAB,
50 mM Tris, 20 mM DTT, pH 8) und C (1% CHAPS, 50 mM Tris, 20 mM
DTT, pH 8), wiederholtem Waschen mit Puffer D (50 mM Tris, 20 mM
DTT, pH 8), Extraktion mit einer NaCl Lösung (1 M NaCl in 50 mM Tris,
2% β-Mercaptoethanol,
pH 8) und Zentrifugieren bei 1000 × g wurde der Überstand
gegen Aqua dest. dialysiert und das 34 kD-Protein von anderen Proteinen
durch SDS-PAGE getrennt.
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Proteinidentifizierung durch
MALDI-MS
-
Nach
Trennung durch SDS-PAGE wurde die 34 kD-Bande aus dem Gel ausgeschnitten
und eine tryptische Verdauung wurde wie beschrieben (11) durchgeführt. Der
Digest wurde mit 1% Trifluoressigsäure in Acetonitril extrahiert.
Die Fragmentmassen wurden mittels eines modifizierten Broker Reflex
III bestimmt, der mit verzögerter
Extraktion ausgestattet war. Zur Massenidentifizierung wurde Peptide
Search ("Protein
identification by peptide mass data", EMBL-Heidelberg) verwendet.
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Enzymatischer Assay
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Die
Glutathionperoxidase-Aktivität
wurde spektrophotometrisch bei 340 nm, wie beschrieben (12), bestimmt,
indem Wasserstoffperoxid oder t-Butylhydroperoxid als Substrate
verwendet wurden. Die PHGPx-Aktivität wurde durch Phosphatidylcholin-hydroperoxidase
gemessen, die als ein spezifisches Substrat verwendet wurde.
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Reaktion mit einem PHGPx-Antikörper
-
Das
34 kD-Protein, das durch SDS PAGE isoliert wurde, wurde auf eine
PVDF-Membran (Biometra, Göttingen,
Deutschland) übertragen
und mit einem gereinigten Antikörper
gegen Ratten-PHGPx sondiert.
-
N-terminale Sequenzierung
-
Das
34 kD Protein wurde durch SDS-PAGE isoliert, auf eine PVDF-Membran übertragen
(Biometra, Göttingen,
Deutschland) und mit Amidoschwarz angefärbt. Eine N-terminale Sequenzierung
wurde bezüglich der
interessierenden Banden unter Verwendung eines ABI 494 Procise Edman
Sequencer (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt, nachdem
sie ausgeschnitten wurden. Die Aminosäuren wurden als PTH-Derivate
analysiert. Die auf diese Weise gewonnenen Sequenzdaten wurden mit
den Sequenzen in Datenbanken unter Verwendung der "BLAST SEARCH" bei NCBI verglichen.
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cDNA Synthese mittels PCR
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Die
3'RACE-Experimente
wurden im GENEAmp-System 2400 Termalcycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT,
USA) durchgeführt.
Zum nachfolgenden Sequenzieren wurde das entsprechende PCR-Produkt
in den pCR2.1-TOPO-Vektor (Invitrogen Groningen, Niederlande) kloniert.
-
Maus
snGPx: PolyA + RNA wurden aus Maushoden unter Verwendung des PolyATract
mRNA-Isolierungssystems IV (Promega, Madison, WI, USA) isoliert.
Adaptor-gebundene Testis-cDNA wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers
synthetisiert (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Das alternative Exon
wurde durch 3'RACE
unter Verwendung des Primers PHGPx Ea-fl (GGGACGCTGCAGACAGCGCGGCGGATCC)
und der Advantage 2-Polymerase
(Clontech) amplifiziert.
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Ratten
snGPx: Die Datenbankrecherche mit der Sequenz des alternativen Exons
Ea von der Maus hatte einen Est-Klon der Ratte zur Folge (Gi: 3399319),
der Identität
zu Exon I von PHGPx aus der Ratte und zu Ea von der Maus zeigte.
Die Gesamt-RNA wurde aus homogenisiertem Testis durch das saure
Guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-Verfahren (13) isoliert. Eine RT-PCR
wurde mittels des Super Script One Step RT-PCR-Systems (Life Technologies, Gibco BRL,
Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung des snGPx spezifischen
Primers (ATGGGCCGCGCGGCCG) und des Primers aus dem Ratten PHGPx
Exon 7 (CGGCAGGTCCTTCTCTATCACCTG) durchgeführt.
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Humanes
snGPx: Ein vermeintliches Ea für
das menschliche 34 kD wurde nach Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz
mit dem menschlichen PHGPx-Gen (Nukleotid 770–964 aus dem Gen AF 060973)
gefunden. Eine 3'RACE
wurde mit einer Adaptor-ligierten Testis-cDNA (Clontech) unter Verwendung des
snGPx spezifischen Primers 1 (ATGGGCCGCGCGGGCGCAGGCTCCC) und Primers
2 (CTTGCGACCGGAGATCCACGAATGTCCC) und der Andvantage2 Polymerase
(Clontech) durchgeführt.
Nur die letzten 14 Nukleotide aus dem Exon Ea und der Übergang
zu PHGPx wurden gewonnen. Die Recherche in der Est-Datenbank hatte
einen Est-Klone zu Folge (Gi: 2754408), der die Ea-Sequenz von Base
838 an abdeckt und einen weiteren Est-Klon (Gi: 6703705), der das vermeintliche
Start-Methionin enthält.
-
Schweine
snGPx: Wie bei der menschlichen snGPx wurde ein vermeintliches alternatives
Exon aus dem Schweine PHGPx-Gen (Sus scrofa Zugangsnummer: X76088)
durch Vergleich der abgeleiteten Aminosäuren gewonnen. Es kodiert eine
argininreiche-Sequenz nach dem vermeintlichen Translations-Start.
Die Transition zu PHGPx ist zweifelhaft, jedoch ist die Nukleotidseuquenz
zur menschlichen identisch.
-
Nothern-blot-Analyse
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Die
Gesamt RNA wurde aus homogenisiertem Gewebe unter Verwendung von
peqGOLDTriFast (peqLab, Erlangen, Deutschland) isoliert. 20 μg Gesamt
RNA wurden pro Bahn aufgetragen, auf Hybond-N+ geblottet
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) und mit der kodierenden
Region des alternativen Exons wurde mit der Gesamt cDNA von PHGPx
sondiert.
-
Konstrukte mit dem grünfluoreszierenden Protein (Freen
Fluorescent Proteins = GFP)
-
Zwei
N-terminale GFP-Fusionsproteine wurden durch Overlap-PCR erzeugt.
Eine enthielt die gesamte kodierende Region für das alternative Exon, die
andere begann am zweiten vermeintlichen Translations-Start. Die
Primerpaare (GATCTCTAGACCGGCGGGCATGGGCCGCGCG)(GFP-Ea-f1) und (GCTCCTCGCCCTTGCTCACCAAGCCCAGGAACTCGGAGC)(GFP-Ea-r2)
ebenso wie (GATCTCAGACTCGCCGGATGGAGCCCATTCC)(GFP-Ea-f2) und GFP-Ea-r2
wurden zur Amplifizierung der N-terminalen Teile für die lange bzw.
die kürzere
Version verwendet, indem pMC42 als die Matrize verwendet wurde.
(GCTCCGAGTTCCTGGGCTTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC)(GFP-F3) und (CCTCTACAAATGTGGTATGG)(GFP-r1)
wurden zur Erzeugung des GFP-Teils mit pEGFP-N1 als der Matrize
verwendet. Eine Overlap-PCR wurde durch Kombinieren der Produkte
mit den äußeren Primern
durchgeführt.
Alle PCRs wurden im Perkin Elmer GENEAmp System 2400 Termalcycler
durchgeführt.
Die beiden Produkte wurden in pCDNA3 über XhoI/Xbal kloniert und
vorübergehend
in NIH3T3 und HELA-Zellen transfiziert.
-
Acridinorange-Färbung von
Spermien-Kernen
-
Die
Wirkung des Selen-Status auf die Kondensation und den Thiol-Status
in vivo wurde durch Anfärben
mit Acdridinorange bestimmt. Spermien wurden aus dem Vas deferens
ausgedrückt
und wurden mit Methanol/Essigsäure
(3:1) auf Objektträgern
fixiert. Eine Acridinorangefärbung
wurde in Phosphat/Citratpuffer (pH 2,5), wie beschrieben, für 5 Minuten
durchgeführt
(14).
-
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