DE10106163B4

DE10106163B4 - Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydraten

Info

Publication number: DE10106163B4
Application number: DE10106163A
Authority: DE
Inventors: Dirk Dr. Engels; Alireza Dr. Haji Begli; Markwart Prof. Dr. Kunz; Ralf Prof. Dr. Mattes; Mohammad Dr. Munir; Manfred Dr. Vogel
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-02-10
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2021-02-11
Also published as: DE10106163A1; ZA200304825B

Abstract

Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, oder mit einer Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert und in der Nucleinsäuresequenz mindestens eine Deletion im 5'- oder 3'-Bereich aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222
b) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385
c) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385
d) Deletion der Nucleotide 4 bis 222 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die modifizierte Polypeptide mit Fructosyltransferase-Aktivität codieren, diese Nucleinsäure enthaltende Vektoren zur Expression der modifizierten Fructosyltransferase in pro- oder eukaryontischen Zellen und diese Vektoren enthaltende Wirtszellen und/oder transgene Pflanzen.
Niedermolekulare Saccharide, beispielsweise Monosaccharide wie Glucose, und Oligosaccharide, wie Saccharose, finden Anwendung als Substrate für biotechnologische Prozesse beziehungsweise in modifizierter Form als Hilfsstoffe für unterschiedliche Industriezweige. So werden zum Beispiel größere Mengen von Glucose für chemische Synthesen, beispielsweise von Sorbit und Glutamat, und für technische Zwecke, unter anderem zur alkoholischen Gärung, eingesetzt. Saccharose, die volkswirtschaftlich bedeutendste Zuckerart, wird hauptsächlich zu Speisezwecken und zur Konservierung verwendet, kann jedoch auch für Kunststoffe, Firnisse, zur Synthese von Eiweiß, Aminosäuren, Antibiotika etc. sowie als Zuschlagsstoff für Hart-PUR-Schäume verwendet werden.
Wesentlich häufiger werden Polysaccharide, wie Cellulose und Stärke, in nativer beziehungsweise modifizierter Form in der Industrie eingesetzt. Stärke ist nicht nur das wichtigste Nahrungsmittel des Menschen. Fabrikmäßig gewonnene Stärke wird auch in der Papierindustrie, unter anderem zur Herstellung von Kartonagen oder als Papierhilfsmittel, beispielsweise zum Leimen von Papier, in der Textilindustrie, beispielsweise als Schlichte oder zum Appretieren und Beschweren neuer Gewebe oder als Steifungsmittel für Wäsche, und in der Pharmazie, beispielsweise als Spreng- und Füllmittel für Tabletten, als Gleit- und Füllmittel für Puder, als Grundlage für Salben etc., eingesetzt. Cellulose ist einer der wichtigsten Rohstoffe für zahlreiche Industriezweige. Die größten Cellulosemengen werden dabei von der Papier- und Textilindustrie verbraucht, wobei beispielsweise die verbreitesten Textilgewebe aus mehr oder weniger reiner, natürlicher oder künstlich umgewandelter Cellulose bestehen. Zunehmende Bedeutung erlangen Polysaccharide beziehungsweise Polysaccharid-Derivate auch als Zuschlagsstoff in der Bauindustrie.
Trotz der zahlreichen bereits etablierten Anwendungen besitzen sowohl Cellulose als auch Stärke gravierende Nachteile. Beispielsweise erfordert die Herstellung von chemischen Cellulose-Derivaten, also von Produkten, die beispielsweise über Veresterungs- und/oder Veretherungsreaktionen, Substitutionen, Oxidations- oder Vernetzungsreaktionen erzeugt werden, die Verwendung zahlreicher chemischer Reagenzien, insbesondere die Verwendung von Lösungsmitteln, deren nachfolgende Entsorgung zum Teil mit erheblichen Kosten verbunden ist. Die Herstellung von Cellulose-Derivaten ist daher im Allgemeinen wesentlich teurer als die Herstellung von Stärke-Derivaten. Hingegen ist die Herstellung von Stärke-Derivaten mit dem Problem verbunden, dass Stärke eine heterogene Verbindung ist, die aus der linear aufgebauten Amylose und dem stark verzweigten Amylopektin besteht. Aufgrund dieser Heterogenität ist es nicht oder nur bedingt möglich, eine chemische Stärke-Derivatisierung reproduzierbar und gezielt durchzuführen. Seit Jahren wird daher, allerdings mit bislang mäßigem Erfolg, versucht, Pflanzen zu züchten, die ausschließlich amylosehaltige Stärke liefern. Kostengünstige, für den großtechnischen Einsatz geeignete Polysaccharide mit vorwiegend linearer Struktur stehen daher zur Zeit auf dem Markt nicht zur Verfügung.
Für Anwendungsfälle, in denen insbesondere eine lineare Struktur der Kohlenhydrat-Polymere für die gewünschten Eigenschaftsprofile die entscheidende Voraussetzung ist, stellen daher längerkettige Polyfructane eine wichtige Alternative dar. Bei den Polyfructanen handelt es sich um Polysaccharide, bei denen hauptsächlich Fructose-Einheiten miteinander verknüpft sind. Polyfructane unterscheiden sich durch die Art der Verknüpfung der Fructose-Einheiten. Beispielsweise liegen die Fructose-Einheiten bei dem wichtigsten Polyfructan Inulin in furanosider Form mit β-1,2-Bindung vor. Bei dem Polyfructan Levan sind die Fructose-Einheiten über β-2,6-Bindungen verknüpft. Polyfructane sind Reserve-Kohlenhydrate, die bei einer Reihe monocotyler und dicotyler Pflanzen, beispielsweise Compositen, Gräsern und Getreiden, aber auch bei Algen sowie einigen grampositiven und gramnegativen Bakterien zu finden sind.
Inulin ist ein Polyfructan mit vorwiegend linearer Struktur, wobei Fructose-Einheiten über β-1,2-Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette wahrscheinlich von einer nicht reduzierenden α-D-Glucose-Einheit abgeschlossen wird. Inulin findet sich allein oder zusammen mit Stärke als Reserve-Kohlenhydrat unter anderem in Dahlienknollen, Artischocken, Topinamburknollen, Zichorienwurzeln und in den Zellen von Inula und anderen Korbblütlern (Compositae), seltener auch in verwandten Pflanzenfamilien (Campanulaceae, Lobeliaceae). Die Inuline aus verschiedenen Pflanzenarten unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihren mittleren Polymerisationsgrad. Beispielsweise besitzt Inulin aus Topinambur einen mittleren Polymerisationsgrad von 5–7, Inulin aus Zichorien einen mittleren Polymerisationsgrad von 10–12 und Inulin aus Artischocken einen mittleren Polymerisationsgrad von etwa 25 (Beck, R. H. F. und Praznik, W., Inulinhaltige Pflanzen aus Rohstoffquelle. Starch/Stärke, 38 (1986), 391–394). Aufgrund ihrer linearen Struktur können aus diesen Inulinen relativ problemlos Derivate hergestellt werden, wobei diese Derivate weitestgehend biologisch abbaubar sind. Wegen der relativ kurzen Ketten sind derartige Inuline beziehungsweise daraus hergestellte Derivate jedoch für einen Einsatz als polymere Tenside, Emulgatoren und Weichmacher nicht geeignet. Ebenso bekannt ist die Verwendung von Inulin als „bulking agent" beziehungsweise als Fettersatzstoff.

Es ist auch bekannt, Inulin zu Fructooligosacchariden zu hydrolysieren und diese als präbiotische Lebensmittelzutaten einzusetzen (Wang, X. und Gibson, G. R., J. Appl. Biochem., 75 (1993), 373–380). Ein gravierender Nachteil dieser Fructooligosaccharide besteht jedoch in ihrem relativ hohen Glucoseanteil. So enthalten Fructooligosaccharide, die aus dem Inulin von Topinambur hergestellt wurden, etwa 40 bis 20 % Glucose, während aus dem Inulin von Zichorien hergestellte Fructooligosaccharide etwa 8 bis 10 % Glucose enthalten. Solche Fructooligosaccharide sind nur in beschränktem Maße für die Ernährung von Diabetikern geeignet.

Aus der EP 657 106 A1 ist die Herstellung und Verwendung von hydrierten Fructooligosacchariden bekannt. Auch hier erweist sich der relativ hohe Glucoseanteil der eingesetzten Fructooligosaccharide als nachteilig.

Von besonderem Interesse sind Difructosedianhydride, die ebenfalls aus Inulin hergestellt werden können und die sich als Nahrungsmittelzutaten verwenden lassen. Sie zeichnen sich insbesondere dadurch aus, dass sie im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhaltig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand beitragen. In der Industrie besteht deshalb großes Interesse an einer kostengünstigen Herstellung von Difructosedianhydriden. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden sind bekannt (Seki, K. et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440–442; DE-PS 195 47 059; Uchiyama, T., in: Science and Technology of Fructans (Herausgeber Suzuki, M. und Chatterton, N. J.) (1993), CRC Boca Raton, Florida). Allerdings ist auch bei den so hergestellten Difructosedianhydriden der hohe Glucosegehalt nachteilig.

Es ist bekannt, dass Polyfructan-enthaltende Pflanzen ebenso wie eine Anzahl von Mikroorganismen Fructosyltransferase (Ftf)-Proteine exprimieren, die die Polymerisierung linearer oder verzweigter Fructose-Polymere katalysieren. Mikrobielle Fructosyltransferasen wurden beispielsweise in Streptococcus-, Bacillus-, Pseudomonas-, Xanthomonas-, Acetobacter-, Erwinia- und Rctinomyces-Stämmen nachgewiesen. Bei mikrobiellen Polyfructanen sind die Fructosereste über β-1,2- und/oder β-2,6-Bindung verknüpft. Das heißt, bei mikrobiellen Fructosyltransferasen handelt es sich entweder um Inulinsucrasen oder um Levansucrasen. Während pflanzliche Polyfructane ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweisen, wobei pro Molekül etwa 10 bis 30 Fructoseeinheiten verknüpft sind, besitzen mikrobielle Polyfructane ein Molekulargewicht von bis zu 10⁶ bis 10⁸, wobei mehr als 100 000 Fructose-Einheiten verknüpft sein können. Untersuchungen zur Polyfructan-Biosynthese haben zudem gezeigt, dass die Biosynthese in Bakterien generell wesentlich einfacher verläuft als in Pflanzen. Aus den genannten Gründen besteht ein starkes Interesse, insbesondere bakterielle Fructosyltransferasen zur Herstellung von Polyfructanen zu nutzen.

Derzeit ist jedoch lediglich eine bakterielle Fructosyltransferase bekannt, nämlich die aus dem grampositive Bakterium Streptococcus mutans, welche die Bildung von Inulin auf der Basis von Saccharose als Ausgangsmolekül katalysieren kann (Shiroza und Kuramitsu, J. Bacteriol., 170 (1988), 810–816); Rosell, K.-G. und Birkhead, D., Acta Chem. Scand., 28 (1974), 589). Das mit der S. mutans- Fructosyltransferase aus Saccharose hergestellte Inulin weist eine Molmasse von 20 – 60 × 10⁶ g/mol auf. Damit ist der Glucosegehalt des Inulins vernachlässigbar, so dass das Inulin prinzipiell für die Herstellung von Fructooligosacchariden geeignet wäre. Andererseits weist so hergestelltes Inulin jedoch etwa 7 % Verzweigungen auf und ist dadurch für einen Einsatz als Rohstoff zur weiteren chemischen Derivatisierung weniger geeignet. Darüber hinaus handelt es sich bei dem Mikroorganismus S. mutans um einen human-pathogenen Keim, so dass seine Verwendung und Vermehrung in industriellem Maßstab zur Enzymgewinnung mit großen Problemen behaftet ist.

Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat-Polymeren, insbesondere Polyfructanen, in transgenen Pflanzen unter Verwendung mikrobielle Fructosyltransferasen codierender ftf-Gene, beispielsweise des Fructosyltransferase-Gens von S. mutans, sind ebenfalls bekannt.

Die PCT/US89/02729 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Kohlenhydrat-Polymeren, insbesondere Dextran oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen. Zur Erzeugung dieser Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrasen oder Dextransucrasen aus verschiedenen Mikroorganismen vorgeschlagen.

Die PCT/EP93/02110 offenbart ein Verfahren zur Herstellung Polyfructose erzeugender transgener Pflanzen, die das lsc-Gen für eine Levansucrase aus einem gramnegativen Baterium enthalten.

Die PCT/US94/12778 beschreibt Verfahren zur Synthese und Akkumulation von Kohlenhydrat-Polymeren in transgenen Pflanzen, wobei unter anderem ein bakterielles Fructosyltransferase-Gen verwendet wird, das eine Levansucrase codiert.

Die PCT/NL93/00279 offenbart die Transformation von Pflanzen mit chimären Genen, die das sacB-Gen aus Bacillus subtiles oder das ftf-Gen aus Streptococcus mutans enthalten. Im Falle des eine Levansucrase codierenden sacB-Gens wird zur Erhöhung des Expressionsniveaus in transformierten Pflanzen eine Modifikation des 5'-untranslatierten Bereiches des bakteriellen Gens empfohlen. Für das Fructosyltransferase-Gen aus Streptococcus mutans werden keine Sequenzmodifikationen beschrieben, so dass das Expressionsniveau der Fructosyltransferase vergleichsweise sehr gering ist.

Die PCT/NL95/00241 beschreibt Verfahren zur Produktion von Oligosacchariden in transgenen Pflanzen, wobei das Fructosyltransferase-Gen von Streptococcus mutans (Shiroza und Kuramitsu, 1988) verwendet wurde. Darüber hinaus wurden andere Fructosyltransferase-Gene pflanzlichen Ursprungs verwendet. Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung der in transgenen Pflanzen erzeugten Oligosaccharide als Zuckerersatz, als Nahrungsergänzungsmittel und als bifidogenes Mittel in Nahrungsmitteln sowie als bifidogenes Mittel in Tierfutter.

Bei der Verwendung des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans in heterologen Expressionssystemen, das heißt sowohl heterologen bakteri ellen Expressionssystemen als auch pflanzlichen Systemen, hat sich jedoch herausgestellt, dass das native Protein in äußerst geringen Mengen erzeugt wird und daher auch die Inulin-Produktion nur in sehr beschränktem Maße erfolgt. Diese geringe Enzymproduktion in heterologen Wirtszellen geht einher mit schwerwiegenden Wachstumsstörungen der Wirtszellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, Verfahren und Mittel, insbesondere Verfahren und Mittel auf der Basis des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans, zur Herstellung von hochmolekularen Polyfructanen, insbesondere Inulin, mit β-1,2-Bindungen und einer im wesentlichen linearen Struktur und einem sehr geringen Glucose-Gehalt bereitzustellen, die eine einfache und kostengünstige Erzeugung der Polyfructane in großen Mengen ermöglichen, wobei die vorstehend beschriebenen Probleme im Stand der Technik, insbesondere die geringe Expression bakterieller Fructosyltransferase-Gene in heterologen Wirtssystemen, überwunden werden.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines modifizierten Fructosyltransferase-Gens aus Streptococcus mutans mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 codiert, das ein am N-Terminus und/oder am C-Terminus modifiziertes Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert, insbesondere wobei das Polypeptid am N-terminalen und/oder am C-terminalen Ende mindestens eine Deletion aufweist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinigtes, Nucleinsäuremolekül gemäß Hauptanspruch bereit, das ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase (ftf) codiert und welches in einer in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz oder in einer die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz mindestens eine Deletion aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222;
b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385;
c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385;
d) Deletion der Nucleotide 4 bis 222 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

Nicht erfindungsgemäß kann auch eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 aufgewiesen werden.

Durch die Deletion der Nucleotide 4 bis 222 beziehungsweise der Nucleotide 1 bis 104 wird die Signalsequenz des nativen Fructosyltransferase-Gens von S. mutans vollständig oder teilweise entfernt, so dass das codierte Signalpeptid der nativen S. mutans-Fructosyltransferase vollständig oder teilweise entfernt wird. Durch die somit erhaltene intrazelluläre Enzymproduktion werden die Wachstumsstörungen heterologer Wirtszellen, wie beispielsweise Escherichia coli, die auf die Expression der Fructosyltransferase von S. mutans zurückzuführen sind, beseitigt und das Enzym kann in hohen Volumenausbeuten aus diesen Zellen gewonnen werden.

Überraschenderweise wurde ebenso festgestellt, dass eine die Nucleotide 2254 bis 2385 umfassende Deletion am C-Terminus der Fructosyltransferase zu einer erheblichen Verbesserung des Wachstums heterologer Wirtszellen führt. Die Funktion des deletierten hydrophoben Bereiches im nativen Protein ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß führt auch diese Deletion innerhalb des C-terminalen Bereiches zu einer wesentlichen Verbesserung des Wachstums heterologer Wirtszellen und hohen Volumenausbeuten des exprimierten Proteins.

Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, dass die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt werden können, wobei es sich bei dem anderen Gen vorzugsweise um das lacZα-Gen handelt. Auch eine solche Mutation bewirkt ein verbessertes Wachstum heterologer Wirtszellen und hohe Volumenausbeuten des exprimierten Proteins.

Unter Verwendung der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle lassen sich daher Vektoren herstellen, die in pro- und/oder eukaryontischen Zellen eine hohe Expression eines modifizierten Polypeptids mit der Aktivität einer Fructosyltransferase gewährleisten. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine besonders hohe Volumenausbeute des exprimierten Proteins in bakteriellen Wirtssystemen erreicht wird, wenn die erfindungsgemäßen, am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende deletierten Nucleinsäuremoleküle beziehungsweise Nucleinsäuremoleküle, bei denen die am 5'-deletierten Sequenzen durch einen Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt sind, in die Expressionskassette des Escherichia coli-Vektors pJOE2702 (Volff et al., Mol. Microbiol., 21 (1996), 1037–1047; Stumpp et al., Biospektrum, 1 (2000), 33–36) integriert werden. Dieser Vektor ist durch L-Rhamnose induzierbar und wird positiv reguliert.

Die erfindungsgemäß hergestellten pro- und eukaryontischen Wirtszellen können in Verfahren zur Herstellung von Polyfructanen mit β-1,2-Bindungen verwendet werden, wobei nach der Kultivierung und Vermehrung dieser Wirtszellen aus den Zellen ein Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase isoliert wird und das isolierte Protein in vitro zur Behandlung einer Saccharoselösung eingesetzt wird. Anschließend kann das enzymatisch gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und auf gereinigt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Polyfructan direkt aus Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten, oder aus einer transgenen Pflanze, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthält, isoliert werden. Bei dem so hergestellten Polyfructan handelt es sich vorzugsweise um Inulin mit einem Polymerisationsgrad von > 100 und einem Verzweigungsgrad von ≤ 8 %, vorzugsweise ≤ 3.

Das hergestellte Inulin wird in weiteren Ausführungsformen zur Herstellung von Fructooligosacchariden beziehungsweise Difructosedianhydriden verwendet. Ein Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden sieht vor, dass das hergestellte Inulin mit einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharose-Lösung gleichzeitig mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die enzymatisch erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere mögliche Ausführungsformen betreffen Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden. In einer Ausgestaltung wird hergestelltes Inulin mit einer Endo-Inulinase und Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo-Inulinase und Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird also in bevorzugter Ausführungsform ein, vorzugsweise isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein bakterielles Fructosyltransferase (ftf)-Gen ist und ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert und am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende mindestens eine Deletion enthält.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem bakteriellen Fructosyltransferase-Gen oder einem Nucleinsäuremolekül, das ein bakterielles Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert, die codierende DNA-Sequenz eines Genes verstanden, dessen Genprodukt die Aktivität einer Saccharose: 2,1-β-D-fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) aufweist und das ursprünglich aus einem Bakterium, vorzugsweise aus Streptococcus mutans, stammt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Fructosyltransferase" oder "β-D-Fructosyltransferase" ein Polypeptid oder ein Protein, das die Synthese eines hochmolekularen, aus sich wiederholenden Fructose-Einheiten bestehenden Kohlenhydrat-Polymers katalysieren kann, wobei Saccharose als Ausgangssubstrat für die weitere Polymerisation dient. In dem so synthetisierten polymeren Produkt sind die sich wiederholenden Fructose-Einheiten über β-1,2-Bindungen miteinander verknüpft, so dass die Fructosyltransferase, die die Synthese dieses Produktes katalysiert, auch als Inulinsucrase bezeichnet werden kann. Das synthetisierte, aus sich wiederholenden Fructose-Einheiten bestehende hochmolekulare Polymer weist vorzugsweise eine lineare Struktur auf, kann einen terminalen, von einem Saccharose-Molekül stammenden Glucose-Rest enthalten und umfasst mindestens zwei Fructose-Reste. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird dieses Kohlenhydrat als Polyfructan bezeichnet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem synthetisierten Polyfructan um Inulin.

Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Beispiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann beispielsweise aus Streptococcus mutans-Zellen isoliert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein.

Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül weist in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mindestens eine Deletion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) den Nucleotiden 4 bis 222, b) den Nucleotiden 1 bis 104 und den Nucleotiden 2254 bis 2385 auf, c) den Nucleotiden 2254 bis 2385 und d) den Nucleotiden 1 bis 104 und den Nucleotiden 2254 bis 2385. Nicht erfindungsgemäß können auch die Nucleotide 1 bis 104 deletiert sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Deletion" eine Mutation verstanden, bei dem ein Teil der im Wildtyp-Gen vorhandenen Nucleinsäuresequenz fehlt. Deletionen können beispielsweise in vitro unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden, wenn der zu deletierende Bereich von geeigneten Restriktions-Schnittstellen flankiert wird. Deletionsmutationen lassen sich auch mit Hilfe bestimmter Endonucleasen, beispielsweise unter Verwendung des Enzyms BAL-31, einführen. Derartige Enzyme bauen die Enden ab, die durch Restriktionsenzym-Spaltung erzeugt wurden. Eine Deletionsmutagenese kann aber auch unter Verwendung eines mutierten Primers in einer PCR-Reaktion erreicht werden. Die Sequenz eines solchen Primers überspannt dabei den Bereich, der deletiert werden soll, wobei der Primer an zwei Bereiche einer Zielregion bindet, die den zu deletierende Bereich flankieren. Bei der Amplifikation wird also der vom Primer überspannte Bereich nicht erfaßt und somit nicht amplifiziert.

Die erfindungsgemäßen Deletionen des Fructosyltransferasegens betreffen vorzugsweise den 5'-Bereich und den 3'-Bereich des nativen Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform mit einer Deletion im 5'-Bereich, die die Nucleotide 4 bis 222 umfasst, ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Protein mit der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Im Ursprungsorganismus S. mutans vermittelt eine Signalsequenz die Sekretion des Enzyms aus dem Cytoplasma, wobei die Signalsequenz während des Sekretionsvorgangs durch eine Signalpeptidase abgespalten wird. Der Signalpeptidabhängige Proteinexport, der bei grampositiven und gramnegativen Bakterien in ähnlicher Weise abläuft, ist ein komplexer energieabhängiger Prozeß, an dem eine Vielzahl löslicher und membrangebundener Proteine beteiligt sind (Schatz und Beckwith, Annu. Rev. Genet., 24 (1990), 215). Bei einer angestrebten Überproduktion des Fructosyltransferase-Proteins in einem heterologen Wirtsorganismus könnte die Signalsequenz insofern zu einer Beeinträch tigung des Wachstums des Wirtes und somit zur Verringerung der Produktausbeute führen, wenn die Signalsequenz auch im heterologen Wirt funktionell ist und die produzierte Proteinmenge die Kapazität des Sekretionsmechanismus übersteigt und/oder wenn andere physiologische intra- oder extrazelluläre Prozesse im Bereich der Zellmembran durch das rekombinante Protein selbst oder durch die Sekretion des rekombinanten Proteins gestört werden.

Eine vollständige Entfernung der das Signalpeptid codierenden Nucleinsäuresequenzen in dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 3 führt zu einer vollständigen Entfernung des Signalpeptids, so dass die Expression des modifizierten Fructosyltransferase-Proteins in einem heterologen Wirt zur intrazellulären Produktion des Genprodukts führt. Durch die intrazelluläre Produktion der Fructosyltransferase werden die Wachstumsstörungen, die bei Wirtssystemen, die das native Fructosyltransferase-Protein exprimieren, nahezu vollständig beseitigt und das gewünschte Proteinprodukt kann in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für eine Deletion im 3'-Bereich des nativen Fructosyltranbsferasegens ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Bei diesem Nucleinsäuremolekül sind die Nucleotide 2254 bis 2385 deletiert. Dieser Bereich weist einen hohen Hydropathie-Index auf, wie mittels des Verfahrens von Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol., 157 (1982), 105–142) gezeigt wurde. Obwohl diesem hydrophoben Bereich keine direkte Funktion zugeordnet werden kann, zeigen heterologe Wirtssysteme bei der Expression eines solchen modifizierten Fructosyltransferase-Proteins gegenüber Wirtszellen, die das native Fructosyltransferase-Protein exprimieren, ein erheblich verbessertes Wachstumsverhalten. Das modifizierte Protein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten isoliert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die im 5'-Bereich des Fructosyltransferasegens deletierten Sequenzen durch den Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem anderen Gen um das lacZα-Gen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Ersetzen", dass die das Signalpeptid codierenden ftf-Sequenzen vollständig oder teilweise durch äquivalente Sequenzen eines anderen Gens ersetzt werden können. Bei Verwendung des 1acZα-Gens werden also äquivalente Sequenzen dieses Gens mit dem am 5'-Ende deletierten Fructosyltransferasegen fusioniert. Ein besonders bevorzugtes Beispiel dafür ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Bei dieser ftf-Genvariante wurden die Nucleotide 1 bis 104 der nativen Fructosyltransferase-Nucleinsäuresequenz gegen die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ausgetauscht. Das Nucleinsäuremolekül weist daher gegenüber der nativen ftf-Sequenz eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 auf. Der Austausch am 5'-Ende führt bei einer Expression des Fusionsproteins in heterologen Wirtssystemen zur einer Lokalisation des Genproduktes im periplasmatischen Raum. Mit einem solchen Plasmid transformierte Wirtszellen zeigen daher gegenüber das Wildtyp-ftf-Gen enthaltenden heterologen Wirtszellen ein deutlich verbessertes Wachstum und das Fusionsprotein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, und das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 11 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 12 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Das Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 9 weist am 5'-Ende eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 auf und am 3'-Ende eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385. Bei dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 11 sind die Nucleotide 1 bis 104 durch die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ersetzt worden und das 3'-Ende weist ebenfalls eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 auf. Beide ftf-Genvarianten führen bei Expression der entsprechenden Genprodukte in heterologen Wirtssystemen zu einer deutlichen Verbesserung des Wachstums, wobei die entsprechenden Genprodukte in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden können.

Die Erfindung umfasst ebenfalls modifizierte Nucleinsäuremoleküle, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Derivate und funktionelle Äquivalente, also strukturverschiedene aber funktionsidentische oder funktionsähnliche Abwandlungen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls bezeichnet werden können. Die Sequenz von Nucleinsäuremolekülen kann beispielsweise weiter gezielt modifiziert werden, um innerhalb der Nucleotidsequenz geeignete Restriktionsschnittstellen zu erzeugen oder nicht erforderliche Sequenzteile zu entfernen. Die Modifikationen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie erfolgen. Dazu werden die entsprechenden Nucleinsäuren in Plasmiden inseriert und Mutagenese-Verfahren oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterworfen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie Transitionen oder Transversionen, eignen sich beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "Primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren (vergleiche Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). Weitere Sequenzveränderungen lassen sich auch durch Anlagerung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugsweise um Plasmide, Cosmide, Viren, Liposomen, Bakteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere funktionelle Elemente enthalten, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einer Wirtszelle bewirken oder zumindest dazu beitragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül unter der funktionellen Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff "regulatorisches Element" solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nucleinsäuremolekülen in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen gewährleisten, so dass ein Polypeptid oder Protein exprimiert wird. Bei regulatorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Silencer und/oder Transkriptionsterminationssignale handeln. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, insbesondere den Protein-codierenden Abschnitten dieser Nucleotidsequenz, funktionell verbunden sind, können Nucleotidsequenzen sein, die aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Protein-codierende Nucleotidsequenz selbst. Beispiele davon sind: T7, T3, SP6 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur in vitro-Transkription; P_LAC, P_Lte _t und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in E. coli; GAL1-10, MET25, CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 und andere Regulationselemente zur Expression in der Bäckerhefe S. cerevisiae; Polyhedrin zur Expression in Baculovirus-Systemen; P_CMV, P_SV40 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen; gewebe- oder organspezifische- insbesondere speicherorganspezifische Promotoren, wie der Vicillin-Promotor aus Pisum sativum, der Arabidopsis-Promotor AtAAP1 oder der Patatin-B33-Promotor, zur Expression in pflanzlichen Systemen.

In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit einer Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplasmatische Retikulum einer Pflanzenzelle und zur Weiterleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteilhaft. Erfindungsgemäß können beispielsweise Signalpeptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste, Signalsequenzen aus einem Patatin-Gen der Kartoffel oder Signalsequenzen von reifem Phytohämaglutinin der Bohne verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die regulatorischen Elemente vom L-Rhamnose-Operon von Escherichia coli stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül in die Expressionskassette des Vektors pJOE2702 (Volff et al., 1996; Stumppet al., 2000) integriert. Die Expressionskassette umfaßt den Promotor rha_P, der aus dem zweistufig regulierten L-Rhamnose-Operon rhaBAD von Escherichia coli stammt (Egan und Schleif, J. Mol. Biol., 243 (1994), 821–829). Bei dem Vektor pJOE2702 handelt es sich also um einen über zwei Stufen positiv regulierbaren, L-Rhamnoseinduzierbaren Expressionsvektor, der im Wirtsbakterium Escherichia coli in hoher Kopiezahl vorhanden ist. Die Transkriptionstermination und die Translationsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen der im Vektor enthaltenen Expressionskassette. Gegenüber den meisten kommerziell erhältlichen E. coli-Expressionsvektoren besitzt pJOE2702 zwei entscheidende Vorteile. Erstens führt der Vektor im nicht-induzierten Zustand zu einer sehr niedrigen Basisexpression des zu exprimierenden Polypeptids. Zweitens wird die Transkription der Expressionskassette verzögert induziert. Der Vektor eignet sich daher insbesondere zur Clonierung und Produktion von Proteinen, die die Vitalität und die Wachstumseigenschaften der Wirtszelle negativ beeinflussen, wie beispielsweise von bakteriellen Fructosyltransferasen. Obwohl Escherichia coli-Zellen, die den Vektor pJOE2702 mit dem voll-ständigen S. mutans-Fructosyltransferase-Gen enthalten, nach Induktion eine vollständige Wachstumshemmung zeigen, eignet sich der Vektor in besonderem Maße zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die am 5'-Ende und am 3'-Ende mindestens eine der erfindungsgemäßen Deletionen enthalten.

Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständlich auch Vektoren, die nicht nur eines, sondern mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Dabei können die Nucleotidsequenzen so angeordnet sein, dass gegebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, insbesondere der in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 beschriebenen Sequenzen, von einem einzigen Satz regulatorischer Elemente kontrolliert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vektoren umfassen, und die fähig sind, die von den Nucleinsäuremolekülen codierten Polypeptide mit der Aktivität einer Fructosyltransferase zu exprimieren. Bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um prokaryontische als auch um eukaryontische Zellen handeln. Bevorzugte Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Erfindungsgemäß bevorzugte Beispiele für eukaryontische Wirtszellen umfassen Hefezellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz in Bezug auf die transformierte Zelle heterolog ist, das heißt, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt oder aber an einem anderen Ort in diesen Zellen oder aber in einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom dieser Zellen lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Wirtszelle um eine gramnegative Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli-Zelle. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine grampositive Zelle, beispielsweise um eine Bacillus-subtilis-Zelle handeln.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryontische Wirtszelle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine Hefezelle, zum Beispiel eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle, handeln. Weitere bevorzugte Zellen Insektenzellen, beispielsweise die Insektenzelllinie IPLB-Sf21. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Pflanzenzelle, insbesondere um eine Zelle solcher Pflanzen, die natürlicherweise Polyfructane, insbesondere Inulin, erzeugen, wie beispielsweise eine Topinambur-, Artischocken- oder Zichorienzelle, oder um Zellen von landwirtschaftlich bedeutsamen Pflanzen, die natürlicherweise andere Monosaccharide, Oligosaccharide und/oder Polysaccharide erzeugen, wie beispielsweise eine Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Zelle.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen aufweisen, wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase oder ein Fragment davon zu produzieren.

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die in mindestens einer ihrer Zellen mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder aber die mindestens eine, vorzugsweise jedoch eine Vielzahl von Wirtszellen enthalten, die das erfindungsgemäße Fructosyltransferasegen oder dieses enthaltende Vektoren oder Plasmide aufweisen, und die in folge dessen hochmolekulare Polyfructane, insbesondere hochmolekulares Inulin, erzeugen können. Die Erfindung ermöglicht also auch die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Lage sind, hochmolekulares Inulin zu erzeugen. Gegenüber den wenigen Pflanzen, die natürlicherweise Inulin erzeugen können, ergibt sich der Vorteil, dass eine gezielte Lokalisierung des gebildeten Inulins möglich ist und dass zudem eine Erhöhung der Expressionsrate und damit der Menge an gebildeten Inulin erreicht wird. Zudem weist das in diesen transgenen Pflanzen erzeugte Inulin ein höheres Molekulargewicht auf als natürlicherweise gebildetes pflanzliches Inulin. Während natürlicherweise erzeugtes pflanzliches Inulin durchschnittlich 10 bis 30 Fructoseeinheit pro Molekül aufweist, kann das in transgenen Pflanzen gebildete Polyfructan mehr als 100 000 Fructoseeinheiten aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthaltendes transgenes Ernte- und Vermehrungsmaterial der Pflanze sowie Teile oder Kalli einer erfindungsgemäßen Pflanze, zum Beispiel Speicherorgane, Früchte, Knollen, Rüben, Samen, Blätter, Blüten oder ähnliches.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die zu transformierende Pflanze entweder eine Pflanze ist, die natürlicherweise ein Polyfructan, insbesondere Inulin, erzeugen kann, vorzugsweise eine Topinambur-, Artischocken- oder Zichorien-Pflanze, oder eine landwirtschaftlich bedeutsame Nutzpflanze, die natürlicherweise Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide erzeugen kann, vorzugsweise eine Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor der Erfindung, die Integration des in diesem Vektor enthaltenen Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle(n) und die Regeneration der Pflanzenzelle(n) zu intakten, transformierten Pflanzen, die ein hochmolekulares Polyfructan, insbesondere Inulin erzeugen können.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein modifiziertes Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Saccharose in ein Polyfructan, insbesondere Inulin, mit furanosiden β-1,2-Bindungen katalysieren kann. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinigtes, Protein, das durch Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküles oder eines Fragmentes davon in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Pflanze erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Eigenschaften, insbesondere die gleiche Aktivität einer Fructosyltransferase wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. nigtes, Protein, das durch Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküles oder eines Fragmentes davon in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Pflanze erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Eigenschaften, insbesondere die gleiche Aktivität einer Fructosyltransferase wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung erfindungsgemäßer Proteine zur Herstellung eines Antikörpers, bevorzugt eines monoclonalen, polyclonalen und/oder modifizierten Antikörpers.

Vorliegende Offenbarung umfasst auch isolierte und vollständig gereinigte monoclonale oder polyclonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Protein so spezifisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoclonalen oder polyclonalen Antikörper oder deren Fragmente mit Hilfe üblicher immunologischer Verfahren beispielsweise ein Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Offenbart sind daher monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Proteins mit der Aktivität einer Fructosyltransferase identifizieren und/oder daran binden können. Bei einer solchen Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Beziehung steht. Offenbart sind auch Anti körper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergebnis posttranslationaler Modifikationen des erfindungsgemäßen Proteines entstanden sind. Offenbart sind auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc- oder F(ab')₂- beziehungsweise Fab-Fragmente.

Ferner sind Antikörper möglich, die gegen einen erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet sind, das heißt einen erfindungsgemäßen Antikörper identifizieren und daran binden können, so dass ein spezifischer Nachweis der erfindungsgemäßen Antikörper möglich ist.

Ferner stehen mit der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Herstellung von längerkettigen Polyfructanen mit linearer Struktur in Verbindung, wobei die Fructose-Einheiten in der Kette durch β-1,2-Bindungen verknüpft sind, und mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 100 und einem Verzweigungsgrad von weniger als 3 %. In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass das Polyfructan aus erfindungsgemäß transformierten transgenen Pflanzen, insbesondere aus deren Vakuolen, isoliert und aufgereinigt wird. Möglich ist die Isolierung und Gewinnung von Polyfructanen aus den Speicherorganen von Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanzen. Das Verfahren umfasst die mechanische Zerkleinerung größerer pflanzlicher Zellmassen mit Hilfe eines Turbinenmischers, beispielsweise eines Waring Blender, wobei das Zerkleinern vorzugsweise in einem großen Volumen wässrigen Mediums bei tiefen Temperaturen, beispielsweise +4°C, erfolgt. Der weitere aufschluss kann mit Hilfe physikalischer Aufschlussverfahren, bei.

Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Polyfructanen sieht vor, dass erfindungsgemäße Wirtszellen, beispielsweise pflanzliche Wirtszellen oder mikrobielle Wirtszellen, beispielsweise Escherichia coli-Zellen, in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert und vermehrt werden. Anschließend wird das erzeugte Zellmaterial mit Hilfe geeigneter physikalischer, chemischer und/oder enzymatischer Verfahren aufgeschlossen und die Proteine mit der Aktivität einer Fructosyltransferase werden aus dem Aufschlussmaterial auf gereinigt. Die weitere Aufreinigung der enzymatischen Aktivität erfolgt mit Hilfe üblicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Zur Gewinnung eines Rohextraktes wird die Aufschlusslösung beispielsweise mit Hilfe von Extraktionsverfahren, Zentrifugationsverfahren und Filtrationsverfahren behandelt. Die Fällung der Proteine aus dem Rohextrakt sowie Ultrafiltrationsverfahren sind effiziente Verfahren zur Konzentrierung von Proteinen aus einer größeren Flüssigkeitsmenge. Als Fällungsmittel kommen unter anderem anorganische Salze, beispielsweise Natrium- und Amoniumsulfat, organische Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, und Polymere, beispielsweise Polyethylenglycol, zur Anwendung. Zur Abtrennung der verwendeten Fällungsmittel kann anschließend ein Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Feinreinigung kann mit Hilfe chromatographischer Verfahren und Verteilungsverfahren, beispielsweise unter Verwendung wässriger Phasensysteme, erfolgen. Zu diesen Verfahren zählen unter anderem Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gel-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie.

Gegebenenfalls kann die isolierte Fructosyltransferase auch mittels Adsorption an einem inerten oder an einem elektrisch geladenen, anorganischen oder organischen Trägermaterial immobilisiert werden. Als Trägermaterial kommen anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, Aluminiumoxid, Hydroxylapatit oder verschiedene Metalloxide, natürliche Polymere, beispielsweise Cellulose, Stärke, Alginate, Agarose oder Collagen, oder synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methylacrylat, Nylon oder Oxirane zur Anwendung. Die Immobilisierung erfolgt dabei durch physikalische Bindungskräfte wie beispielsweise Van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische Bindungen. Die Immobilisierung der Fructosylferase kann auch mittels kovalenter Bindung an Trägermaterialien erfolgen. Die Träger müssen dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen können. Geeignete Gruppen sind beispielsweise Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen. Die Oberfläche von porösen Gläsern kann beispielsweise durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Proteinen umgesetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können mit Bromcyan und Carboxy-Gruppen mit Thionylchlorid aktiviert und anschließend mit Enzymen gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit der Immobilisierung von Fructosyltransferasen besteht im Einschluss in dreidimensionalen Netzwerken. Ein Vorteil dabei ist, dass die Enzyme innerhalb des Netzwerkes in freier, nicht gebundener Form vorliegen. Poren der umgebenden Matrix müssen dabei klein genug sein, um das Enzym zurückzuhalten.

Nach der Gewinnung der Fructosyltransferase aus den erfindungsgemäßen Wirtszellen, entweder als Rohextrakt, in hoch auf gereinigter Form und/oder in immobilisierter Form an einem festen Träger wird eine Saccharoselösung unter geeigneten Bedingungen mit dem isolierten Enzym behandelt, wobei in vitro ein Polyfructan gebildet wird. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen. Anschließend wird das gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt.

Die Erfindung steht ebenfalls mit dem mit Hilfe der vorstehend genannten Verfahren hergestellten hochmolekularen Polyfructan in Verbindung. Das so hergestellte Polyfructan ist durch eine vorwiegend lineare Struktur gekennzeichnet, wobei innerhalb der Kette Fructose-Einheiten durch β-1,2-Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette als Abschluss eine nicht-reduzierende α-D-Glucose-Einheit trägt. Das Polyfructan zeichnet sich durch einen sehr hohen Polymerisationsgrad von > 100 und einen sehr niedrigen Verzweigungsgrad von < 3 % aus. Aufgrund der geringen Verzweigung enthält das so hergestellte Polyfructan nur sehr wenige endständige Glucose-Einheiten. Unter anderem handelt es sich bei dem Polyfructan um Inulin, das durch ein hohes Molekulargewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton gekennzeichnet ist.

Aufgrund des geringen Glucose-Gehaltes kann das hergestellte Polyfructan, insbesondere Inulin, zur Herstellung von Fructooligosacchariden verwendet werden, die sich als diätisches Lebensmittel eignen.

Eine mögliche Ausführungsform betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden. In einer Ausführungsform wird das hergestellte Inulin unter geeigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten geeigneten Endo-Inulinase behandelt und anschließend werden die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und auf gereinigt. Unter einer "Endo-Inulinase" wird eine 2,1-β-D-Fructan-Fructanhydrolase verstanden, das den Abbau von Inulin zu Fructooligosacchariden katalysiert, wobei die enzymatische Wirkung insbesondere innerhalb der Polymerkette erfolgt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Fructooligosacchariden Saccharide verstanden, die aus 2 bis 10 Fructoseeinheiten bestehen, die β-glycosidisch miteinander verbunden sind. Die verwendete Endo-Inulinase kann dabei in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen. Die Immobilisierung der Endo-Inulinase kann dabei so erfolgen, wie vorstehend für die erfindungsgemäße Fructosyltransferase beschrieben. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Fructooligosacchariden ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung in vitro unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Fructo syltransferase und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem in vitro Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Die Erfindung steht daher ebenfalls mit Fructooligosacchariden, die nach einem der vorstehend genannten Verfahren hergestellt wurden, im Zusammenhang. Die mit Hilfe eines Verfahrens hergestellten Fructooligosaccharide zeichnen sich insbesondere durch einen sehr niedrigen Glucose-Gehalt aus und sind daher in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel, insbesondere für Diabetiker, geeignet. Während Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Topinambur hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 14 bis 20 % aufweisen und Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Zichorien hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 10 % enthalten, besitzen die wie beschrieben hergestellten Fructooligosaccharide einen Glucosegehalt von weniger als 3 %, vorzugsweise von weniger als 1 %.

Die wie beschrieben hergestellten Fructooligosaccharide können darüber hinaus einer Hydrierung unterworfen werden, wobei hydrierte Fructooligosaccharide hergestellt werden, die sich ebenfalls in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel eignen. Die Hydrierung der Fructooligosaccharide kann beispielsweise unter Anwendung höherer Drücke und Verwendung von Katalysatoren erfolgen.

Schließlich steht die vorliegende Erfindung mit Verfahren zur Herstellung von Difruktosedianhydri den im Zusammenhang. Difructosedianhydride sind als Nahrungsmittelzusatz von besonderem Interesse, da sie im Dünndarm unverdaulich sind und im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhaltig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand beitragen.

In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass Inulin unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase und immobilsierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird. Dabei katalysiert die Endo-Inulinase, wie vorstehend ausgeführt, die Umwandlung von Inulin in Fructooligosaccharide. Diese werden anschließend durch die Inulinfructotransferase von A. globiformis oder A. ureafaciens (Seki et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440–442) umgewandelt. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung liegen die Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens in immobilisierter Form vor. Zur Immobilisierung der Mikroorganismen können kultivierte inaktivierte Zellen nach geeigneter Copolymerisation, beispielsweise unter Zugabe eines neutralen Proteins und Vernetzung mit Glutardialdehyd, direkt als Biokatalysatoren verwendet werden. Ebenso ist es möglich, vitale Mikroorganismen in Polymere, zum Beispiel Carrageen, einzuschließen und anschließend eine Inkubation in einem geeigneten Nährmedium durchzuführen. Die Polymerpartikel können dann für den eigentlichen Prozess eingesetzt und gegebenenfalls durch erneute Inkubation auch wieder regeneriert werden. Ebenso besteht die Möglichkeit, Mikroorganismen in Form photovernetzter Polymere zu verwenden, wobei eine Mikroorganismen-Suspension mit den löslichen Präpolymeren in dünner Schicht durch Bestrahlung mit beispielsweise einer Tageslichtlampe polymerisiert wird.

Geeignete Bedingungen zur Herstellung von Difructosedianhydriden umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen.

Eine weitere mögliche Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Difructosedianhydriden sieht vor, dass eine Saccharoselösung gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten erfindungsgemäßen Fructosyltransferase, einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

In weiteren Ausführungsformen kann die Verwendung des Inulins in verschiedenen Non-Food-Anwendungen vorgesehen sein. Dabei wird das Inulin entsprechenden Derivatisierungs-Reaktionen unterworfen, wobei Inulinether und Inulinester hergestellt werden. Die so hergestellten Inulinether und Inulinester können beispielsweise als polymere Tenside, Weichmacher oder Emulgatoren eingesetzt werden.

Es kann ferner die Verwendung der Fructooligosaccharide, der hydrierten Fructooligosaccharide und der Difructosedianhydride als Lebensmittelzusatz, diätisches Lebensmittel und als Tierfutterzusatz vorgesehen sein.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, sollen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken.

1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE113, dass das vollständige Fructosyltransferase (ftf)-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz im L-Rhamnose-induzierbaren Escherichia coli-Expressionsvektor pJOE2702 enthält.

2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE225, dass das modifizierte Fructosyltransferase-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ4 → 222) mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das am 5'-Ende um 219 Nucleotide verkürzt ist, im Expressionsvektor pJOE2702 enthält.

3 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH171, dass das Fusionsgen lacZα(1 → 83) :: ftf (105 → 2388) mit der in SEQ ID NR. 5 gezeigten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fusionsgen 83 Nucleotide des lacZα-Gens vom Vektor pBluescript II KS+ und ein modifiziertes, am 5'-Ende um 104 Nucleotide verkürztes Fructosyltransferasegen aus Streptococcus mutans DSM20523 umfasst.

4 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH132, dass das modifizierte Fructosyltransferasegen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist.

5 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE172, dass das modifizierte Fructosyltransferasegen ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 sowie der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist.

6 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE143, dass das Fusionsgen lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 11 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist und wobei der deletierte 5'-Bereich an 83 Nucleotide des lacZα-Gens fusioniert ist.

Das zu der erfindungsgemäßen Lehre gehörende Sequenzprotokoll umfasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt die 2388 Nucleotide umfassende. DNA-Sequenz des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523.
SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 795 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 3 zeigt die 2169 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase-Gens ftf (Δ4 → 222).
SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete 722 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines modifizierten Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 5 zeigt die 2367 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Fusionsgens lacZα(1 → 83) :: ftf (1052388).
SEQ ID Nr. 6 zeigt die von SEQ ID Nr. 5 abgeleitete 788 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
SEQ ID Nr. 7 zeigt die 2256 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferasegens ftf (Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 8 zeigt die aus SEQ ID Nr. 7 abgeleitete 751 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die 2037 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen modifizierten Fructosyltransferasegens ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 10 zeigt die aus SEQ ID Nr. 9 abgeleitete 678 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz ei nes erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die 2235 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Fusionsgens lacZα (1 → 83) :: ftf (1052388, Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 12 zeigt die aus SEQ ID Nr. 11 abgeleitete 744 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz des Primers ftf1(upper).
SEQ ID Nr. 14 zeigt die Sequenz des Primers ftf2 (lower).
SEQ ID Nr. 15 zeigt die Sequenz des Primers ftf3 (upper).
SEQ ID Nr. 16 zeigt die Sequenz des Primers ftf4 (upper).
SEQ ID Nr. 17 zeigt die Sequenz des Primers ftf5 (upper).
SEQ ID Nr. 18 zeigt die Sequenz des Primers ftf6 (lower).

Beispiel 1

Clonierung des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523

Zur Clonierung des Fructosyltransferase-Gens aus S. mutans DSM20523 wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, wobei der Primer ftf1 (upper) mit der Sequenz: 5'-TATATATCATATGGAAACTRAAGTTAG-3' und der Primer ftf2 (lower) mit der Sequenz: 5'-TAGGATCCTTATTTAAAACCAATGCT-3' verwendet wurden. Der Primer ftf1 (upper) enthielt dabei eine NdeI-Restriktions-Schnittstelle und der Primer ftf2 (lower) enthielt eine BamHI-Restriktions-Schnittstelle. Chromosomale DNA aus S. mutans DSM20523, die mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Reinigungs-Kits isoliert worden war, diente in der PCR-Reaktion als Template. Die PCR-Reaktion wurde in 40 μl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 50 ng DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo-Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO₄, 5% Dimethylsulfoxid, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste dabei die folgenden Schritte: 5-minütige Denaturierung bei 96°C, 5 Zyklen, umfassend jeweils eine 1-minütige Denaturierung bei 63°C, eine 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 40°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde Polymerisation bei 68°C, 25 weitere Zyklen, umfassend jeweils eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Denaturierung bei 92°C, eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 49°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde Polymerisation bei 68°C, sowie eine 5-minütige Abschluss-Polymerisationsreaktion bei 68°C. Mit Hilfe der PCR-Reaktion wurde ein etwa 2,4 kb großes Fragment amplifiziert. Das isolierte Fragment wurde mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und mit dem Vektor pJOE2702 (Volff et al., Mol. Microbiol., 21 (1996) 1037–1047; Stumpp et al., Biospectrum, 1 (2000) 33–36) ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Die codierende Sequenz des ftf-Gens wurde somit im korrekten Leseraster in die im Vektor enthaltene, L-Rhamnoseinduzierbare Expressionskassette cloniert, so dass die Transkription der insertierten Nucleinsäure unter der Kontrolle des in dem Vektor pJOE2702 enthaltenen Promoters rha_P steht. Die Transkriptionstermination des ftf-Gens und die Translationsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen des Vektors. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE113 transformiert. Transformanten wurden dabei über Ampicillin-Resistenz selektiert.

Beispiel 2

Modifikationen des clonierten ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523

Zur Modifizierung des ftf-Genproduktes im Bereich des N-terminalen Signalpeptides wurden am 5'-OH-Ende des ftf-Gens Deletionen eingeführt oder Sequenzbereiche ausgetauscht.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransferase-Gens ftf (Δ4 → 222) wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf3 (upper) mit der Sequenz 5'-TATATATCATATGGAARCTCCATCRACAARTCCCG-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf3 (upper) enthält eine NdeI-Schnittstelle. Als Template wurde gereinigte DNA des Plasmides pDHE113, dass das clonierte vollständige ftf-Gen aus S. mutans DSM20523 enthält, verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in 40 μl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 100 ng Plasmid-DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo-Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO₄, 0, 2 mM dATP, 0, 2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste die folgenden Schritte: eine 2-minütige Denaturierung bei 94°C, 25 Zyklen, umfassend jeweils eine 1-minütige Denaturierung bei 93°C, eine Primeranlagerung für 1 Minute 30 Sekunden bei 55°C und eine Polymerisation für 2 Minuten 20 Sekunden bei 68°C, und eine 5-minütige Abschlusspolymerisation bei 68°C. Das erhaltene, etwa 2,2 kb-PCR-Produkt wurde isoliert, mit NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE225 transformiert. Das Genprodukt der Variante ftf (Δ1 -> 222) ist gegenüber der Wildtyp-Sequenz am N-Terminus um 73 Aminosäuren verkürzt.

Zur Erzeugung des modifizierten Fusionsgens 1acZα (183) :: ftf (1052388) wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf4 (upper) mit der Sequenz: 5'-ATATATGTCGACGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf4 (upper) enthält eine SalI-Schnittstelle. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet, das eine Insertion des vollständigen ftf-Gens aus S. mutans DSM20523 enthält. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie vorstehend be schrieben. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen SalI und BamHI gespalten und in den Vektor pBluescript II KS+ cloniert, wobei der verkürzte ftf-Leserahmen am 5'-Ende mit dem Anfangsbereich des im Vektor enthaltenen lacZα-Leserahmens fusioniert wurde. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem resultierenden Plasmid pDHE166 transformiert. In einem zweiten PCR-Schritt wurde das in dem Vektor pDHE166 enthaltene Fusionsgen lacZα (1 → 83)::ftf (105 → 2388) in den Expressionsvektor pJOE2702 umcloniert. Dazu wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf5 (upper) mit der Sequenz: 5'-TATATATCATATGACCATGATTACGCCAAGC-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf5 (upper) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase NdeI. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE166 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Das erhaltene etwa 2,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE171 transformiert.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransferase-Gens ftf (Δ2254 → 2385) wurde der PCR-Primer ftf6(lower) mit der Sequenz: 5'-TTGGATCCTTATTTTTGAGAAGGTTTGACAG-3' in Kombination mit anderen der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt. Der Primer ftf6(lower) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase BamHI. Als Template wurde die gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Danach wurde das Amplifikationsprodukt isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Unter Verwendung der Primerkombination ftf1 (upper/ftf6 (lower) wurde so das Plasmid pDHE132 erhalten, das das vorstehend beschriebene modifizierte ftf-Gen enthält.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransferase-Gens ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385) wurde unter Verwendung der DNA des Plasmides pDHE113 als Template und den Primern ftf3 (upper) und ftf6(lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Nach Integration des Amplifikationsproduktes in den Vektor pJOE2702 wurde das Plasmid pDHE172 erhalten.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransferase-Gens 1cZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) wurde unter Verwendung der DNA des Vektor pDHE113 und der Primer ftf4 (upper) und ftf6(lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Das erhaltene, etwa 2,2 kb große PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen SalI und BamHI in den Vektor Bluescript II KS+ integriert. Dabei wurde das Plasmid pDHE140 erhalten. Anschließend wurde eine zweite PCR-Reaktion durchgeführt, wobei die Primer ftf5 (upper) und ftf6(lower) sowie die DNA des Plasmides pDHE140 als Template verwendet wurden. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Dabei wurde das Plasmid pDHE143 erhalten.

Beispiel 3

Heterologe Expression der verschiedenen Varianten des ftf-Gens in E. coli

Zum Nachweis der Genprodukte in Rohextrakten des zur Expression verwendeten E. coli-Stammes JM109 wurden E. coli-Stämme, die eines der vorstehend hergestellten Plasmide beziehungsweise das Plasmid pJOE2702 zur Kontrolle enthielten, kultiviert und induziert. Die Stämme wurden die Nacht über in 5 ml dYT-Vollmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) mit 100 μg Ampicillin/ml bei 30°C im Brutroller vorkultiviert. Mit der Übernachtkultur wurden je 50 ml dYT-Medium so angeimpft, dass die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) etwa 0,02 betrug. Dann wurden die Zellen in Erlenmeyerkolben auf dem Brutschüttler bis zu einer OD₆₀₀ von 0,2 kultiviert. Zur Induktion des mit L-Rhamnose induzierbaren Promoters wurden 0,2 % (Gew./Vol.) L-Rhamnose zum Medium gegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 7 Stunden kultiviert. Nach der 7-stündigen Induktion wurden die Zellen mittels Zentrifugation, Waschen der Zellen in 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄-Puffer, pH-Wert 6, 5, und anschließender Resuspension der Zellen in dem gleichen Puffer geerntet. Danach wurde die Suspension auf einen OD₆₀₀-Wert von 10 eingestellt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbehandlung oder mittels French-Press-Behandlung aufgeschlossen. Anschließend wurden alle Extrakte mittels einer 20-minütigen Zentrifugation bei 10000 × g behandelt. Danach wurde der Gesamt-Proteingehalt nach Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248–254) bestimmt, wobei ein Rinderserumalbumin-kalibriertes Reagenz von Biorad (Biorad-Laboratories GmbH, München) verwendet wurde. Zum Vergleich der Proteinmuster der erhaltenen Rohextrakte mit dem Proteinmuster der nicht-induzierten Kontrolle wurden die Extrakte elektrophoretisch in 7,5 %igen SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt (Laemmli, Nature, 227 (1979) 680–685).

Die quantitative Bestimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte, indem die spezifischen Ftf-Aktivitäten in Rohextrakten gemessen wurden. Zellkultivierung, Zellaufschluss und die Herstellung der Rohextrakte wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Da bei jedem Umsatz von einem Molekül Saccharose jeweils ein Molekül Glucose freigesetzt wird, wurde die Aktivität ermittelt, indem die pro Zeiteinheit freigesetzte Glucose-Menge ermittelt wurde. Die Bestimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 30°C unter Verwendung einer etwa 1 bis 3 mE Fructosyltransferase enthaltenden Rohextraktmenge in einem Volumen von 1 ml mit 100 mM Scr in 50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₉-Puffer, pH 6,5. Eine Einheit entspricht dabei der Freisetzung von 1 μmol Glucose pro Minute in Gegenwart von 100 mM Saccharose bei 30°C und einem pH-Wert von 6,5. Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen bei 100°C beendet.

Danach erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 10000 × g. Anschließend wurde in einem 100 μl-Aliquot die freigesetzte Glucose-Menge mit Hilfe des gekoppelten Glucoseoxidase (GOD)/Peroxidase (POD)-Enzymtests (Werner et al., Z. Analyt. Chem., 252 (1970) 224–228) bestimmt. Dabei wurde der GOD-Perid^®-Test (Roche Diagnostics) verwendet, bei dem photometrisch die Oxidation des Farbstoffs 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (ABTS^®) nachgewiesen wird. Der Test wurde in einem Gesamtvolumen von 1 ml mit 80 μg/ml GOD, 10 μg/ml POD und 1 μg/ml ABTS^® in 50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH-Wert 6,5, durchgeführt, wobei nach 30 Minuten die Extinktion bei 578 nm gemessen wurde. Die Kalibrierung des Testes erfolgte mit Hilfe von Glucose-Standardlösungen. Die für die Rohextrakte der verschiedenen Expressionsstämme ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 Spezifische Ftf-Aktivitäten im Rohextrakt von E. coli-Stämmen, die mit den erfindungsgemäßen Plasmiden transformiert wurden

Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigen E. coli-Stämme, die mit einem im Vektor pJOE2702 enthalte nen, erfindungsgemäßen ftf-Nucleotidmolekül transformiert sind, nach einer Induktionsdauer von 6 h gegenüber dem E. coli-Stamm, der das vollständige ftf-Gen enthält, ein deutlich erhöhte Zelldichte, d.h. das Wachstum dieser Stämme ist somit deutlich verbessert. Gleichzeitig ist auch die Volumenausbeute des exprimierten Proteins gegenüber dem E. coli-Stamm mit dem vollständigen ftf-Gen deutlich erhöht.

Beispiel 4

Isolierung und Immobilisierung der Fructosyltransferase

Vorkultur 1: 5 ml Medium (pro 1000 ml Wasser, pH 7, 0, 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 100 mg Ampicillin) wurden mit dem Stamm E. coli JM109 (pDHE143) beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert.

Vorkultur 2: 200 ml des gleichen Mediums wurden mit 1 ml der Vorkultur 1 beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert.

Kultivierung im Fermenter und Expression der Fructosyltransferase: 16 l Medium, dem 0,2 % L-Rhamnose zur Expression der Fructosyltransferase zugesetzt worden waren, wurden mit 200 ml Vorkultur 2 beimpft und bei 30°C, 400 Upm und 0,5 vvm Luft etwa 12 Stunden, das heißt bis zu einer optischen Dichte (OD₅₇₈) von etwa 0, 6 oder mehr kultiviert.

Zellernte und Aufschluss: Die Zellen wurden mit einer kontinuierlichen Zentrifuge, beispielsweise ei ner Contifuge (Heraeus) bei 4°C und 24300 × g abzentrifugiert. Die Zellmasse wurde 1-mal mit 2000 ml eines 100 mM-Phosphatpuffers, pH-Wert 6,5, gewaschen und dann in 100 ml Phosphatpuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen im Homogenisator bei 800 bar aufgeschlossen. Danach wurde die Suspension 20 Minuten bei 17360 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer von dem im Überstand vorliegenden Enzym zu trennen.

Immobilisierung: Der Rohextrakt wurde zunächst gefriergetrocknet. Vom Lyophylisat wurden 23,6 g (ca. 10 g Protein) in 500 ml 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5, gelöst und nach Zugabe von 100 g EUPERGIT^® C (Röhm) 94 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Das Ftf-Immobilisat wurde danach mit 50 mM Phosphatpuffer gewaschen.

Beispiel 5

Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein zur Polyfructan-Herstellung

60 l einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden nach Zugabe von 640 E Fructosyltransferase pro Liter Ansatzlösung 28 Stunden bei 30°C unter Rühren inkubiert, wobei ein Rohextrakt des E. coli-Stammes JM109 (pDHE143) verwendet wurde. Anschließend wurde die Lösung einer direkten Ultrafiltration (Sartocon Mini; 3 Module mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 100 000 Dalton) ausgesetzt. Das erhaltene Retentat von 4,5 l wurde 2-mal mit jeweils 6 l entsalztem Wasser verdünnt und schließlich auf 4,5 l konzentriert. Anschließend wurde Inulin mit Isopropanol (Endkonzentration 62 Gew.-%) ausgefällt. Der abgetrennte Niederschlag wurde mit 5 l der gleichen Isopropanol-Lösung gewaschen und anschließend bei 45°C schonend getrocknet. Dabei wurden 0.36 kg eines weißen Produktes mit einem Trockensubstanzgehalt (TS) von 93 % erhalten. Bezogen auf den Saccharoseverbrauch wurde eine Ausbeute von 8,5 % erreicht. Das unter Verwendung des HPLC-GPC-Verfahrens ermittelte Molekulargewicht von Inulin beträgt 40 × 10⁶ g/mol, wobei der Verzweigungsgrad 3 Mol% beträgt.

Beispiel 7

Umsetzung von Ftf-Inulin mit Endo-Inulinase zur Herstellung von Fructooligosacchariden

20 g des in Beispiel 6 erhaltenen Ftf-Inulins mit 95 % TS wurden nach Herstellung einer 1 %igen Lösung durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C und Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 unter Verwendung von 0,1 molarer Essigsäure mit Endo-Inulinase (0,13 ml/Ansatz; SP 168, Fa. Novo) 8 Stunden bei 50°C unter Rühren inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C wurden die gebildeten Fructooligosaccharide mittels Ultrafiltration (Sartocon Mini, Modul mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 10 000 Dalton) abgetrennt. Das Permeat enthielt 7,5 g Fructooligosaccharide, während das auf 1 l verdünnte Retentat entsprechend 11,6 g TS enthielt. Anschließend wurde das Retentat nach erneutem Einstellen des pH-Wertes mit Endo-Inulinase bei einem konstanten Enzym/Substrat-Verhältnis inkubiert, wie zuvor beschrieben. Dieser Vorgang wurde insgesamt 5-mal wiederholt. Mittels einer Gelpermeations-Chromatographie wurde in den vereinigten Permeaten die folgende Kettenlängenverteilung bestimmt:

Die Kohlenhydratzusammensetzung wurde wie folgt bestimmt: 0,5 ml vereinigte Permeatlösung (1 % TS) wurden nach Zugabe von 0,5 ml 1 %iger Oxalsäure 2,5 h bei 65°C hydrolysiert. Eine Analyse mittels des HPAEC-Verfahrens zeigte, dass Fructose der einzige Kohlenhydratbaustein war, das heißt bei den isolierten Oligosacchariden handelt es sich um homooligomere Fructooligosaccharide vom Typ F_n mit n = 1 – 25.

Beispiel 8

Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein und immobilisierter Endo-Inulinase

Endo-Inulinase (beispielsweise SP 168; NOVO) wurde wie in Beispiel 5 für Fructosyltransferase beschrieben, an EUPERGIT^® C (Röhm) immobilisiert. Zu 1 l einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructosyltrans ferase (vergleiche Beispiel 2) und 20 g immobilisierte Endo-Inulinase zugegeben und unter langsamen Rühren inkubiert. Stündlich wurden Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reaktion beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration entfernt. Mittels Gelpermeations-Chromatographie wurde die Zusammensetzung der dabei erhaltenen Produktlösung wie folgt bestimmt:

Gegenüber Beispiel 7 wurden somit Produkte mit einem wesentlich höheren Fructosegehalt erhalten.

Beispiel 9

Herstellung von hydrierten Fructooligosacchariden

Die in den Beispielen 7 und 8 erhaltenen homooligomeren Fructooligosaccharid-Gemische mit einer Kettenlänge von DP 1–DP 25 wurden durch Eindampfen auf jeweils einen Trockensubstanzgehalt von 10 eingestellt. 450 ml jeder Lösung wurden in einem Laborautoklaven in Gegenwart von Raney-Nickel 10 Stunden mit Wasserstoff bei 150 bar und 80°C hydriert. Die dabei erhaltene Lösung wurde aus dem Autoklaven gepumpt, filtriert und mittels Ionenaustauscher gereinigt. Eine Analyse zeigte, dass die Lösung (Fructosyl)_n-mannit, (Fructosyl)_n-sorbit (n = 1 – 24) sowie Mannit und Sorbit, die aus der in der Ausgangslösung vorhandenen Fructose gebildet worden waren, enthielt. Mannit und Sorbit wurden mit Hilfe bekannter Chromatographie-Verfahren abgetrennt, so dass ein aus (Fructosyl)_n-mannit und (Fructosyl)_n-sorbit bestehendes Produkt erhalten wurde.

Beispiel 10

Umsetzung von Saccharose mit Fructosyltransferase, Endo-Inulinase und Arthrobacter ureafaciens zur Bildung von Difructosedianhydrid III

Zellen des Stammes Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 wurden in vier Schüttelkolben mit jeweils 100 ml einer Nährlösung, enthaltend 8 g Zichorien-Inulin (Raftiline^®), 2 g Na₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄, 1 g NH₄NO₃, 0,5 g MgSO₄, 0,01 g Fe₂SO₄, 0,03 g CaSO₄, 0,5 g Hefe-Extrakt in entsalztem Wasser, überimpft. Danach wurde eine 24-stündige Inkubation bei 27°C unter Schütteln bei 150 Upm durchgeführt. Danach wurden die Zellen mittels Zentrifugation abgeerntet und in Polyvinylalkohol-Gelpartikeln immobilisiert.

Zu 1 l einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructo syltransferase (vergleiche Beispiel 5) und 20 g immobilisierte Endo-Inulinase sowie immobilisierte A. ureafaciens-Zellen gegeben. Danach wurde bei 30°C unter langsamem Rühren eine Inkubation durchgeführt. Es wurden stündlich Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reaktion beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration abgetrennt.

Eine HPLC-Analyse der erhaltenen Produktlösung zeigte die Bildung von 18 g DFA III.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, oder mit einer Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert und in der Nucleinsäuresequenz mindestens eine Deletion im 5'- oder 3'-Bereich aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222 b) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 c) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 d) Deletion der Nucleotide 4 bis 222 und Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 3 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon; b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon; c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 7 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon; d) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 8 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon; e) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 9 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon; f) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon; und g) einem funktionellen Äquivalent, das durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a) bis f) erhältlich ist, oder einem komplementären Strang davon.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Bereich eines anderen Gens ersetzt sind.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch Sequenzen des lacZα- Gens ersetzt sind, wobei das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 11 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon; b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 12 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon; und c) einem funktionellen Äquivalent, das durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a) bis d) erhältlich ist, oder einem komplementären Strang davon.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein DNA- oder RNA-Molekül ist.
Vektor, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Vektor nach Anspruch 6, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage, Liposom oder Virus ist.
Vektor nach Anspruch 6 oder 7, wobei das mindestens eine Nucleinsäuremolekül unter der funktionellen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das in pro- und eukaryontischen Zellen die Transkription einer translatierbaren RNA und/oder die Translation der RNA in ein Polypeptid oder Protein gewährleistet.
Vektor nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promoter, Enhancer, Silencer oder 3'-Transkriptionsterminator ist.
Vektor nach Anspruch 8 oder 9, wobei das mindestens eine regulatorische Element eine Signalsequenz zur Lokalisierung des vom Nucleinsäuremolekül codierten Polypeptids oder Proteins innerhalb bestimmter Zellorganellen, Kompartimente oder im extrazellulären Raum ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das mindestens eine regulatorische Element vom L-Rhamnose-Operon von Escherichia coli stammt.
Wirtszelle, enthaltend mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 11.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine pro- oder eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, ausgewählt aus Bakterien, Hefezellen und Pflanzenzellen.
Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Zelle ist.
Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder die mindestens eine Zelle nach Anspruch 15 enthält.
Pflanze nach Anspruch 16, wobei es sich um eine Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze handelt.
Samen, Früchte, Vermehrungsmaterial, Erntematerial und Pflanzengewebe, das von einer Pflanze nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.
Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Saccharose in ein Polyfructan mit vorwiegend β-2,1-Bindungen katalysiert und durch die Expression eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlich ist.
Protein nach Anspruch 19, das durch Expression in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder in einer Pflanze nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 19 oder 20 zur Herstellung eines Antikörpers.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Antikörper ein monoclonaler, polyclonaler und/oder modifizierter Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanze, umfassend a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10, b) die Integration des in dem Vektor enthaltenen Fructosyltransferase-Gens in das Genom der transformierten Zelle(n), und c) die Regeneration von intakten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanzen.