DE10106163A1

DE10106163A1 - New truncated nucleic acid encoding fructosyl transferase, useful for preparing polyfructans, or derivatives, from sucrose, for use as food and feed additives

Info

Publication number: DE10106163A1
Application number: DE10106163A
Authority: DE
Inventors: Dirk Engels; Begli Alireza Haji; Markwart Kunz; Ralf Mattes; Mohammad Munir; Manfred Vogel
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-02-10
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2021-02-11
Also published as: ZA200304825B; DE10106163B4

Abstract

Nucleic acid (I) comprising a 2388 base pair sequence (S1), or encoding a 795 residue amino acid sequence (S2) with fructosyl transferase (FT) activity, both given in the specification, and having at least one deletion in the 5'- or 3'-regions of nucleotides 4-222, 1-104 or 2254-2385, is new. Independent claims are also included for the following: (1) vector containing (I); (2) host cell containing (I) or the vector of (1); (3) plant (A) that contains in at least one cell, (I) or the vector of (1), or at least one cell of (2); (4) seeds, fruits, replicative or harvested materials, or plant tissues of (A); (5) protein (II) with FT activity obtained by expressing (I); (6) antibody specific for (II); (7) antibody (AAb) specific for Ab; (8) producing a genetically modified plant (A') able to produce a polyfructan (PF); (9) producing PF by culturing cells of (2) or (A), or their tissues; (10) PF produced by method (9); (11) producing fructo-oligosaccharides (FOS); (12) FOS produced by method (11); (13) hydrogenated FOS produced by hydrogenating the FOS of (12); (14) producing difructosedianhydrides (DFDA); and (15) DFDA produced by method of (14). ACTIVITY : Gastrointestinal-Gen. No biological data is given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die modifizierte Polypeptide mit Fructosyltransfe rase-Aktivität codieren, diese Nucleinsäure enthal tende Vektoren zur Expression der modifizierten Fructosyltransferase in pro- oder eukaryontischen Zellen, diese Vektoren enthaltende Wirtszellen und/oder transgene Pflanzen, Verfahren zur Herstel lung von hochmolekularen Polyfructanen mit vorwie gend (β-1,2-Bindungen und einem sehr niedrigen Ver zweigungsgrad, insbesondere von Inulin, Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Inu lins oder unter Verwendung von Saccharose, sowie Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydri den unter Verwendung des erfindungsgemäß herge stellten Inulins oder unter Verwendung von Saccha rose, sowie die Verwendung des erfindungsgemäß her gestellten Inulins zur Herstellung von Inulinethern und Inulinestern und die Verwendung von Fructooli gosacchariden oder hydrierten Fructooligosacchari den und Difructosedianhydriden als Lebensmittel zusatz, insbesondere als diätisches Lebensmittel.The present invention relates to nucleic acids the modified polypeptides with fructosyl transfer encode rase activity, contain this nucleic acid Ending vectors for the expression of the modified Fructosyltransferase in pro- or eukaryotic Cells, host cells containing these vectors and / or transgenic plants, method of manufacture high molecular weight polyfructanes with gend (β-1,2 bonds and a very low ver Degree of branching, especially of inulin, method for the production of fructooligosaccharides under Use of the Inu produced according to the invention lins or using sucrose, as well Process for the preparation of difructosedianhydri the using the herge according to the invention made inulin or using saccha rose, and the use of the invention ago provided inulin for the production of inulin ethers and inulin esters and the use of fructooli gosaccharides or hydrogenated fructooligosacchari den and difructose dianhydrides as food additive, especially as a dietary food.

Niedermolekulare Saccharide, beispielsweise Mono saccharide wie Glucose, und Oligosaccharide, wie Saccharose, finden Anwendung als Substrate für bio technologische Prozesse beziehungsweise in modifi zierter Form als Hilfsstoffe für unterschiedliche Industriezweige. So werden zum Beispiel größere Mengen von Glucose für chemische Synthesen, bei spielsweise von Sorbit und Glutamat, und für tech nische Zwecke, unter anderem zur alkoholischen Gä rung, eingesetzt. Saccharose, die volkswirtschaft lich bedeutendste Zuckerart, wird hauptsächlich zu Speisezwecken und zur Konservierung verwendet, kann jedoch auch für Kunststoffe, Firnisse, zur Synthese von Eiweiß, Aminosäuren, Antibiotika etc. sowie als Zuschlagsstoff für Hart-PUR-Schäume verwendet wer den.Low molecular saccharides, for example mono saccharides such as glucose, and oligosaccharides such as Sucrose are used as substrates for bio technological processes or in modifi adorned form as auxiliary substances for different Industries. For example, larger ones Amounts of glucose for chemical synthesis, at for example of sorbitol and glutamate, and for tech African purposes, including for alcoholic drinks tion, used. Sucrose, the economy The most important type of sugar, mainly becomes Can be used for food and preservation but also for plastics, varnishes, for synthesis of protein, amino acids, antibiotics etc. as well as Additive for hard PUR foams used the.

Wesentlich häufiger werden Polysaccharide, wie Cel lulose und Stärke, in nativer beziehungsweise modi fizierter Form in der Industrie eingesetzt. Stärke ist nicht nur das wichtigste Nahrungsmittel des Menschen. Fabrikmäßig gewonnene Stärke wird auch in der Papierindustrie, unter anderem zur Herstellung von Kartonagen oder als Papierhilfsmittel, bei spielsweise zum Leimen von Papier, in der Textilin dustrie, beispielsweise als Schlichte oder zum Ap pretieren und Beschweren neuer Gewebe oder als Steifungsmittel für Wäsche, und in der Pharmazie, beispielsweise als Spreng- und Füllmittel für Tab letten, als Gleit- und Füllmittel für Puder, als Grundlage für Salben etc., eingesetzt. Cellulose ist einer der wichtigsten Rohstoffe für zahlreiche Industriezweige. Die größten Cellulosemengen werden dabei von der Papier- und Textilindustrie ver braucht, wobei beispielsweise die verbreitesten Textilgewebe aus mehr oder weniger reiner, natürli cher oder künstlich umgewandelter Cellulose beste hen. Zunehmende Bedeutung erlangen Polysaccharide beziehungsweise Polysaccharid-Derivate auch als Zu schlagsstoff in der Bauindustrie.Polysaccharides such as Cel Lulose and starch, in native or modes form used in industry. Strength is not just the most important food of the People. Factory-made starch is also in the paper industry, including manufacturing of cardboard boxes or as paper aids, at for example for gluing paper, in the textile industry, for example as a size or for ap pretend and weight new tissues or as Stiffening agents for laundry and in pharmacy, for example as an explosive and filler for tab letten, as a lubricant and filler for powder, as Basis for ointments etc. used. cellulose is one of the most important raw materials for numerous Industries. The largest amounts of cellulose will be thereby from the paper and textile industry ver needs, for example the most common Textile fabric made of more or less pure, natural best or artificially converted cellulose hen. Polysaccharides are becoming increasingly important or polysaccharide derivatives also as Zu impact material in the construction industry.

Trotz der zahlreichen bereits etablierten Anwendun gen besitzen sowohl Cellulose als auch Stärke gra vierende Nachteile. Beispielsweise erfordert die Herstellung von chemischen Cellulose-Derivaten, al so von Produkten, die beispielsweise über Ver esterungs- und/oder Veretherungsreaktionen, Substi tutionen, Oxidations- oder Vernetzungsreaktionen erzeugt werden, die Verwendung zahlreicher chemi scher Reagenzien, insbesondere die Verwendung von Lösungsmitteln, deren nachfolgende Entsorgung zum Teil mit erheblichen Kosten verbunden ist. Die Her stellung von Cellulose-Derivaten ist daher im All gemeinen wesentlich teurer als die Herstellung von Stärke-Derivaten. Hingegen ist die Herstellung von Stärke-Derivaten mit dem Problem verbunden, dass Stärke eine heterogene Verbindung ist, die aus der linear aufgebauten Amylose und dem stark verzweig ten Amylopektin besteht. Aufgrund dieser Heteroge nität ist es nicht oder nur bedingt möglich, eine chemische Stärke-Derivatisierung reproduzierbar und gezielt durchzuführen. Seit Jahren wird daher, al lerdings mit bislang mäßigem Erfolg, versucht, Pflanzen zu züchten, die ausschließlich amylosehal tige Stärke liefern. Kostengünstige, für den groß technischen Einsatz geeignete Polysaccharide mit vorwiegend linearer Struktur stehen daher zur Zeit auf dem Markt nicht zur Verfügung.Despite the numerous already established applications gen have both cellulose and starch gra four disadvantages. For example, the Manufacture of chemical cellulose derivatives, al so of products that, for example, via Ver esterification and / or etherification reactions, Substi tion, oxidation or crosslinking reactions generated, the use of numerous chemi reagent, especially the use of Solvents, their subsequent disposal for Part is associated with considerable costs. The Her The position of cellulose derivatives is therefore in space mean much more expensive than the production of Starch derivatives. The production of Starch derivatives associated with the problem that Strength is a heterogeneous connection that arises from the linear amylose and strongly branched ten amylopectin. Because of this heterogeneity it is not possible or only possible to a limited extent chemical starch derivatization reproducible and to carry out specifically. For years, therefore, al with moderate success so far, tried Grow plants that are exclusively amylose-haled deliver strength. Inexpensive, for the big technical use with suitable polysaccharides a predominantly linear structure is currently available not available on the market.

Für Anwendungsfälle, in denen insbesondere eine li neare Struktur der Kohlenhydrat-Polymere für die gewünschten Eigenschaftsprofile die entscheidende Voraussetzung ist, stellen daher längerkettige Po lyfructane eine wichtige Alternative dar. Bei den Polyfructanen handelt es sich um Polysaccharide, bei denen hauptsächlich Fructose-Einheiten mitein ander verknüpft sind. Polyfructane unterscheiden sich durch die Art der Verknüpfung der Fructose- Einheiten. Beispielsweise liegen die Fructose- Einheiten bei dem wichtigsten Polyfructan Inulin in furanosider Form mit β-1,2-Bindung vor. Bei dem Po lyfructan Levan sind die Fructose-Einheiten über β- 2,6-Bindungen verknüpft. Polyfructane sind Reserve- Kohlenhydrate, die bei einer Reihe monocotyler und dicotyler Pflanzen, beispielsweise Compositen, Grä sern und Getreiden, aber auch bei Algen sowie eini gen grampositiven und gramnegativen Bakterien zu finden sind.For applications in which a li near structure of carbohydrate polymers for the the desired property profiles Prerequisite is, therefore, make longer-chain buttocks lyfructane is an important alternative Polyfructans are polysaccharides, which mainly include fructose units are linked. Differentiate polyfructans the way in which fructose is linked Units. For example, the fructose Units of the main polyfructan inulin in furanoside form with a β-1,2 bond. At the bottom lyfructan levan are the fructose units above β- 2,6 bonds linked. Polyfructans are reserve Carbohydrates found in a number of monocotylers and dicotyledonous plants, for example composites, grains seeds and cereals, but also with algae and some against gram-positive and gram-negative bacteria are to be found.

Inulin ist ein Polyfructan mit vorwiegend linearer Struktur, wobei Fructose-Einheiten über. β-1,2- Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette wahr scheinlich von einer nicht reduzierenden α-D- Glucose-Einheit abgeschlossen wird. Inulin findet sich allein oder zusammen mit Stärke als Reserve- Kohlenhydrat unter anderem in Dahlienknollen, Arti schocken, Topinamburknollen, Zichorienwurzeln und in den Zellen von Inula und anderen Korbblütlern (Compositae), seltener auch in verwandten Pflanzen familien (Campanulaceae, Lobeliaceae). Die Inuline aus verschiedenen Pflanzenarten unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihren mittleren Polymerisati onsgrad. Beispielsweise besitzt Inulin aus Topinam bur einen mittleren Polymerisationsgrad von 5-7, Inulin aus Zichorien einen mittleren Polymerisati onsgrad von 10-12 und Inulin aus Artischocken einen mittleren Polymerisationsgrad von etwa 25 (Beck, R. H. F. und Praznik, W., Inulinhaltige Pflanzen aus Rohstoffquelle. Starch/Stärke, 38 (1986), 391-394). Aufgrund ihrer linearen Struktur können aus diesen Inulinen relativ problemlos Derivate hergestellt werden, wobei diese Derivate weitestgehend biolo gisch abbaubar sind. Wegen der relativ kurzen Ket ten sind derartige Inuline beziehungsweise daraus hergestellte Derivate jedoch für einen Einsatz als polymere Tenside, Emulgatoren und Weichmacher nicht geeignet. Ebenso bekannt ist die Verwendung von I nulin als "bulking agent" beziehungsweise als Fett ersatzstoff.Inulin is a predominantly linear polyfructan Structure, with fructose units above. β-1,2 Bonds are linked and the chain is true apparently from a non-reducing α-D Glucose unit is completed. Inulin finds alone or together with starch as a reserve Carbohydrate in dahlia tubers, arti shock, Jerusalem artichoke tubers, chicory roots and in the cells of Inula and other daisies (Compositae), less often in related plants families (Campanulaceae, Lobeliaceae). The inuline differ from different plant species essentially by their medium polymer onsgrad. For example, inulin has topiname bur an average degree of polymerization of 5-7, Inulin from chicory a medium polymer Degree of 10-12 and inulin from artichokes average degree of polymerization of about 25 (Beck, R. H. F. and Praznik, W., Inulin-Containing Plants Source of raw materials. Starch / Starke, 38 (1986), 391-394). Because of their linear structure, these can Inulins are relatively easy to make derivatives are, these derivatives largely biolo are biodegradable. Because of the relatively short ket ten are such inulins or from them manufactured derivatives, however, for use as polymeric surfactants, emulsifiers and plasticizers are not suitable. The use of I is also known nulin as "bulking agent" or as fat replacement material.

Es ist auch bekannt, Inulin zu Fructooligosacchari den zu hydrolysieren und diese als präbiotische Le bensmittelzutaten einzusetzen (Wang, X. und Gibson, G. R., J. Appl. Biochem., 75 (1993), 373-380). Ein gravierender Nachteil dieser Fructooligosaccharide besteht jedoch in ihrem relativ hohen Glucosean teil. So enthalten Fructooligosaccharide, die aus dem Inulin von Topinambur hergestellt wurden, etwa 40 bis 20% Glucose, während aus dem Inulin von Zi chorien hergestellte Fructooligosaccharide etwa 8 bis 10% Glucose enthalten. Solche Fructooligosac charide sind nur in beschränktem Maße für die Er nährung von Diabetikern geeignet.It is also known to inulin to fructooligosacchari the hydrolyze and this as prebiotic Le use food ingredients (Wang, X. and Gibson, G. R., J. Appl. Biochem., 75 (1993), 373-380). On serious disadvantage of these fructooligosaccharides however, is their relatively high glucose part. So fructooligosaccharides contain that from the inulin of Jerusalem artichoke were made, for example 40 to 20% glucose, while from the inulin of Zi fructooligosaccharides produced by chories about 8 contain up to 10% glucose. Such fructooligosac charids are only for Er suitable for diabetics.

Aus der EP 657 106 A1 ist die Herstellung und Ver wendung von hydrierten Fructooligosacchariden be kannt. Auch hier erweist sich der relativ hohe Glu coseanteil der eingesetzten Fructooligosaccharide als nachteilig. From EP 657 106 A1 is the manufacture and Ver use of hydrogenated fructooligosaccharides known. Here, too, the relatively high glu is evident cos content of the fructooligosaccharides used as a disadvantage.

Von besonderem Interesse sind Difructosedianhydri de, die ebenfalls aus Inulin hergestellt werden können und die sich als Nahrungsmittelzutaten ver wenden lassen. Sie zeichnen sich insbesondere da durch aus, dass sie im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhal tig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand bei tragen. In der Industrie besteht deshalb großes In teresse an einer kostengünstigen Herstellung von Difructosedianhydriden. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden sind bekannt (Seki, K. et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442; DE-PS 195 47 059; Uchiyama, T., in: Science and Technolo gy of Fructans (Herausgeber Suzuki, M. und Chatter ton, N. J.) (1993), CRC Boca Raton, Florida). Al lerdings ist auch bei den so hergestellten Difruc tosedianhydriden der hohe Glucosegehalt nachteilig.Difructosedianhydri are of particular interest de, which are also made from inulin can and which ver as food ingredients have it turned. They stand out particularly there by pronouncing a in the colon Develop prebiotic effects and thereby sustained contributes to a healthy intestinal flora and intestinal wall wear. There is therefore a big trend in industry interest in an inexpensive production of Difructosedianhydriden. Manufacturing process of difructosedian hydrides are known (Seki, K. et al., Starch / Starke, 40: 440-442 (1988); DE-PS 195 47 059; Uchiyama, T., in: Science and Technolo gy of Fructans (editors Suzuki, M. and Chatter ton, N.J. (1993), CRC Boca Raton, Florida). al However, the Difruc tosian hydrides the high glucose disadvantageous.

Es ist bekannt, dass Polyfructan-enthaltende Pflan zen ebenso wie eine Anzahl von Mikroorganismen Fructosyltransferase (Ftf)-Proteine exprimieren, die die Polymerisierung linearer oder verzweigter Fructose-Polymere katalysieren. Mikrobielle Fructo syltransferasen wurden beispielsweise in Strepto coccus-, Bacillus-, Pseudomonas-, Xanthomonas-, A cetobacter-, Erwinia- und Actinomyces-Stämmen nach gewiesen. Bei mikrobiellen Polyfructanen sind die Fructosereste über β-1,2- und/oder β-2,6-Bindung verknüpft. Das heißt, bei mikrobiellen Fructo syltransferasen handelt es sich entweder um Inulin sucrasen oder um Levansucrasen. Während pflanzliche Polyfructane ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweisen, wobei pro Molekül etwa 10 bis 30 Fructo seeinheiten verknüpft sind, besitzen mikrobielle Polyfructane ein Molekulargewicht von bis zu 10⁶ bis 10⁸, wobei mehr als 100 000 Fructose-Einheiten verknüpft sein können. Untersuchungen zur Polyfruc tan-Biosynthese haben zudem gezeigt, dass die Bio synthese in Bakterien generell wesentlich einfacher verläuft als in Pflanzen. Aus den genannten Gründen besteht ein starkes Interesse, insbesondere bakte rielle Fructosyltransferasen zur Herstellung von Polyfructanen zu nutzen.Plants containing polyfructan, like a number of microorganisms, are known to express fructosyl transferase (Ftf) proteins that catalyze the polymerization of linear or branched fructose polymers. Microbial fructosyltransferases have been detected, for example, in Strepto coccus, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Erwinia and Actinomyces strains. In microbial polyfructans, the fructose residues are linked via a β-1,2 and / or a β-2,6 bond. This means that microbial fructosyltransferases are either inulin sucrases or levan sucrases. While vegetable polyfructans have a relatively low molecular weight, with about 10 to 30 fructose units being linked per molecule, microbial polyfructans have a molecular weight of up to 10 ⁶ to 10 ⁸ , with more than 100,000 fructose units being linked. Studies on polyfructan biosynthesis have also shown that bio-synthesis is generally much easier in bacteria than in plants. For the reasons mentioned, there is a strong interest in using bacterial fructosyltransferases in particular for the production of polyfructanes.

Derzeit ist jedoch lediglich eine bakterielle Fruc tosyltransferase bekannt, nämlich die aus dem gram positive Bakterium Streptococcus mutans, welche die Bildung von Inulin auf der Basis von Saccharose als Ausgangsmolekül katalysieren kann (Shiroza und Ku ramitsu, J. Bacteriol., 170 (1988), 810-816); Ro sell, K.-G. und Birkhead, D., Acta Chem. Scand., 28 (1974), 589). Das mit der S. mutans- Fructosyltransferase aus Saccharose hergestellte Inulin weist eine Molmasse von 20-60 × 10⁶ g/mol auf. Damit ist der Glucosegehalt des Inulins ver nachlässigbar, so dass das Inulin prinzipiell für die Herstellung von Fructooligosacchariden geeignet wäre. Andererseits weist so hergestelltes Inulin jedoch etwa 7% Verzweigungen auf und ist dadurch für einen Einsatz als Rohstoff zur weiteren chemi schen Derivatisierung weniger geeignet. Darüber hinaus handelt es sich bei dem Mikroorganismus S. mutans um einen human-pathogenen Keim, so dass sei ne Verwendung und Vermehrung in industriellem Maß stab zur Enzymgewinnung mit großen Problemen behaf tet ist. Currently, however, only one bacterial fructosyltransferase is known, namely that from the gram-positive bacterium Streptococcus mutans, which can catalyze the formation of inulin based on sucrose as the starting molecule (Shiroza and Ku ramitsu, J. Bacteriol., 170 (1988), 810-816); Ro sell, K.-G. and Birkhead, D., Acta Chem. Scand., 28 (1974), 589). The inulin produced from sucrose with the S. mutans fructosyl transferase has a molecular weight of 20-60 × 10 ⁶ g / mol. The glucose content of the inulin is therefore negligible, so that the inulin would in principle be suitable for the production of fructooligosaccharides. On the other hand, inulin produced in this way has about 7% branching and is therefore less suitable for use as a raw material for further chemical derivatization. In addition, the microorganism S. mutans is a human pathogenic germ, so that its use and multiplication on an industrial scale for enzyme production is associated with major problems.

Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat- Polymeren, insbesondere Polyfructanen, in transge nen Pflanzen unter Verwendung mikrobielle Fructo syltransferasen codierender ftf-Gene, beispielswei se des Fructosyltransferase-Gens von S. mutans, sind ebenfalls bekannt.Process for making carbohydrate Polymers, especially polyfructans, in transge plants using microbial fructo ftf genes encoding syltransferases, for example se of the fructosyltransferase gene from S. mutans, are also known.

Die PCT/US 89/02729 beschreibt ein Verfahren zur Er zeugung von Kohlenhydrat-Polymeren, insbesondere Dextran oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen. Zur Erzeugung dieser Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrasen oder Dextransucrasen aus ver schiedenen Mikroorganismen vorgeschlagen.PCT / US 89/02729 describes a method for Er generation of carbohydrate polymers, in particular Dextran or polyfructose, in transgenic plants. Use is made to produce these plants from Levansucrasen or Dextransucrasen from ver proposed different microorganisms.

Die PCT/EP 93/02110 offenbart ein Verfahren zur Her stellung Polyfructose erzeugender transgener Pflan zen, die das lsc-Gen für eine Levansucrase aus ei nem gramnegativen Baterium enthalten.PCT / EP 93/02110 discloses a method for manufacturing position polyfructose-producing transgenic plant zen, the lsc gene for a levan sucrase from egg contain a gram negative battery.

Die PCT/US 94/12778 beschreibt Verfahren zur Synthe se und Akkumulation von Kohlenhydrat-Polymeren in transgenen Pflanzen, wobei unter aderem ein bakte rielles Fructosyltransferase-Gen verwendet wird, das eine Levansucrase codiert.PCT / US 94/12778 describes methods of synthesis se and accumulation of carbohydrate polymers in transgenic plants, among which a bacterium rielles fructosyltransferase gene is used which encodes a levan sucrase.

Die PCT/NL 93/00279 offenbart die Tansformation von Pflanzen mit chimären Genen, die das sacB-Gen aus Bacillus subtiles oder das ftf-Ge aus Streptococ cus mutans enthalten. Im Falle des eine Levansucra se codierenden sacB-Gens wird zur Erhöhung des Ex pressionsniveaus in transformiertn Pflanzen eine Modifikation des 5'-untranslatierten Bereiches des bakteriellen Gens empfohlen. Für das Fructo syltransferase-Gen aus Streptococcus mutans werden keine Sequenzmodifikationen beschrieben, so dass das Expressionsniveau der Fructosyltransferase ver gleichsweise sehr gering ist.PCT / NL 93/00279 discloses the transformation of Plants with chimeric genes that make up the sacB gene Bacillus subtiles or the ftf-Ge from Streptococ cus mutans included. In the case of a Levansucra se encoding sacB gene is used to increase the Ex levels of pressure in transformed plants Modification of the 5'-untranslated region of the bacterial gene recommended. For the fructo Streptococcus mutans syltransferase gene no sequence modifications described, so that the expression level of the fructosyltransferase ver is equally very low.

Die PCT/NL 95/00241 beschreibt Verfahren zur Produk tion von Oligosacchariden in transgenen Pflanzen, wobei das Fructosyltransferase-Gen von Streptococ cus mutans (Shiroza und Kuramitsu, 1988) verwendet wurde. Darüber hinaus wurden andere Fructosyltrans ferase-Gene pflanzlichen Ursprungs verwendet. Eben falls beschrieben ist die Verwendung der in trans genen Pflanzen erzeugten Oligosaccharide als Zu ckerersatz, als Nahrungsergänzungsmittel und als bifidogenes Mittel in Nahrungsmitteln sowie als bi fidogenes Mittel in Tierfutter.PCT / NL 95/00241 describes processes for product tion of oligosaccharides in transgenic plants, the fructosyltransferase gene from Streptococ cus mutans (Shiroza and Kuramitsu, 1988) has been. In addition, other fructosyltrans ferase genes of plant origin are used. just if described is the use of the trans plants produced oligosaccharides as Zu sugar substitute, as a dietary supplement and as bifidogenic agent in food as well as bi fidogenic agent in animal feed.

Bei der Verwendung des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans in heterologen Expressi onssystemen, das heißt sowohl heterologen bakteri ellen Expressionssystemen als auch pflanzlichen Systemen, hat sich jedoch herausgestellt, dass das native Protein in äußerst geringen Mengen erzeugt wird und daher auch die Inulin-Produktion nur in sehr beschränktem Maße erfolgt. Diese geringe En zymproduktion in heterologen Wirtszellen geht ein her mit schwerwiegenden Wachstumsstörungen der Wirtszellen.When using the fructosyltransferase gene of Streptococcus mutans in heterologous expressions onsystems, that means both heterologous bacteria expression systems as well as plant Systems, it has been found that the native protein produced in extremely small amounts and therefore the inulin production only in very limited. This low en zym production in heterologous host cells goes down forth with severe growth disorders Host cells.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das techni sche Problem zugrunde, Verfahren und Mittel, insbe sondere Verfahren und Mittel auf der Basis des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans, zur Herstellung von hochmolekularen Polyfructanen, insbesondere Inulin, mit β-1,2-Bindungen und einer im wesentlichen linearen Struktur und einem sehr geringen Glucose-Gehalt bereitzustellen, die eine einfache und kostengünstige Erzeugung der Polyfruc tane in großen Mengen ermöglichen, wobei die vor stehend beschriebenen Probleme im Stand der Tech nik, insbesondere die geringe Expression bakteriel ler Fructosyltransferase-Gene in heterologen Wirts systemen, überwunden werden.The present invention is therefore techni underlying problem, procedures and means, esp special procedures and means on the basis of Streptococcus mutans fructosyltransferase gene, for the production of high molecular weight polyfructanes, especially inulin, with β-1,2 bonds and one essentially linear structure and a very to provide low glucose content, which is a simple and inexpensive production of the Polyfruc enable tane in large quantities, the above problems described in the prior art nik, especially the low expression bacterial Fructosyltransferase genes in heterologous hosts systems to be overcome.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines modifizierten Fructosyltransferase-Gens aus Strep tococcus mutans mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 codiert, das ein am N-Terminus und/oder am C-Terminus modi fiziertes Polypeptid mit der Aktivität einer Fruc tosyltransferase codiert, insbesondere wobei das Polypeptid am N-terminalen und/oder am C-terminalen Ende mindestens eine Deletion aufweist. Insbesonde re stellt die vorliegende Erfindung ein, vorzugs weise isoliertes und vollständig gereinigtes, Nuc leinsäuremolekül gemäß Hauptanspruch bereit, das ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo syltransferase (ftf) codiert und welches in einer in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz oder in einer die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Amino säuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz min destens eine Deletion aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
The present invention solves this technical problem in particular by providing a modified fructosyltransferase gene from Strep tococcus mutans with a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID No. 1 or a nucleic acid sequence that encodes an amino acid sequence as shown in SEQ ID No. 2, which is a at the N-terminus and / or at the C-terminus modified polypeptide encoded with the activity of a fructosyltransferase, in particular wherein the polypeptide has at least one deletion at the N-terminal and / or at the C-terminal end. In particular, the present invention provides a preferably isolated and completely purified nucleic acid molecule according to the main claim, which encodes a polypeptide with the activity of a fructosyltransferase (ftf) and which is in a nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 1 or in one of them Nucleic acid sequence coding for amino acid sequence given in SEQ ID No. 2 has at least one deletion selected from the group consisting of:

a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222;a) Deletion of nucleotides 4 to 222;
b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104; und b) deletion of nucleotides 1 to 104; and
c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.c) Deletion of nucleotides 2254 to 2385.

Durch die Deletion der Nucleotide 4 bis 222 bezie hungsweise der Nucleotide 1 bis 104 wird die Sig nalsequenz des nativen Fructosyltransferase-Gens von S. mutans vollständig oder teilweise entfernt, so dass das codierte Signalpeptid der nativen S. mutans-Fructosyltransferase vollständig oder teil weise entfernt wird. Durch die somit erhaltene in trazelluläre Enzymproduktion werden die Wachstums störungen heterologer Wirtszellen, wie beispiels weise Escherichia coli, die auf die Expression der Fructosyltransferase von S. mutans zurückzuführen sind, beseitigt und das Enzym kann in hohen Volu menausbeuten aus diesen Zellen gewonnen werden.By deleting nucleotides 4 to 222 approximately of nucleotides 1 to 104, the Sig nal sequence of the native fructosyltransferase gene completely or partially removed from S. mutans, so that the encoded signal peptide of the native S. Complete or partial mutans fructosyl transferase is wisely removed. Through the thus obtained in tracellular enzyme production will be the growth disorders of heterologous host cells, such as wise Escherichia coli, which is based on the expression of the S. mutans fructosyltransferase are eliminated and the enzyme can be in high volu yields can be obtained from these cells.

Überraschenderweise wurde ebenso festgestellt, dass eine die Nucleotide 2254 bis 2385 umfassende Dele tion am C-Terminus der Fructosyltransferase zu ei ner erheblichen Verbesserung des Wachstums hetero loger Wirtszellen führt. Die Funktion des deletier ten hydrophoben Bereiches im nativen Protein ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß führt auch diese De letion innerhalb des C-terminalen Bereiches zu ei ner wesentlichen Verbesserung des Wachstums hetero loger Wirtszellen und hohen Volumenausbeuten des exprimierten Proteins.Surprisingly, it was also found that a dele comprising nucleotides 2254 to 2385 tion at the C-terminus of the fructosyltransferase a significant improvement in growth hetero leads host cells. The function of the deletier th hydrophobic region in the native protein not known. According to the invention, this leads De letion within the C-terminal region to egg ner significant improvement in growth hetero loger host cells and high volume yields of expressed protein.

Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, dass die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Se quenzbereich eines anderen Gens ersetzt werden kön nen, wobei es sich bei dem anderen Gen vorzugsweise um das lacZα-Gen handelt. Auch eine solche Mutation bewirkt ein verbessertes Wachstum heterologer Wirtszellen und hohe Volumenausbeuten des expri mierten Proteins.According to the invention it was also found that the in the 5 'region of the nucleic acid sequence of the ftf gene deleted sequences by at least one Se range of another gene can be replaced nen, the other gene being preferred is the lacZα gene. Such a mutation too causes improved growth more heterologous Host cells and high volume yields of the expri protein.

Unter Verwendung der vorstehend genannten erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle lassen sich daher Vektoren herstellen, die in pro- und/oder eukaryon tischen Zellen eine hohe Expression eines modifi zierten Polypeptids mit der Aktivität einer Fructo syltransferase gewährleisten. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine besonders hohe Volumenaus beute des exprimierten Proteins in bakteriellen Wirtssystemen erreicht wird, wenn die erfindungsge mäßen, am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende deletierten Nucleinsäuremoleküle beziehungsweise Nucleinsäure moleküle, bei denen die am 5'-deletierten Sequenzen durch einen Sequenzbereich eines anderen Gens er setzt sind, in die Expressionskassette des Escheri chia coli-Vektors pJOE2702 (Volff et al., Mol. Mic robiol., 21 (1996), 1037-1047; Stumpp et al., Bio spektrum, 1 (2000), 33-36) integriert werden. Die ser Vektor ist durch L-Rhamnose induzierbar und wird positiv reguliert.Using the above invented nucleic acid molecules according to the invention can therefore Produce vectors in pro- and / or eukaryon cells express a high expression of a modifi graced polypeptide with the activity of a fructo Ensure syltransferase. According to the invention found that a particularly high volume prey of the expressed protein in bacterial Host systems is achieved when the fiction moderate, deleted at the 5 'end and / or at the 3' end Nucleic acid molecules or nucleic acid molecules in which the most 5'-deleted sequences through a sequence region of another gene in the Escheri expression cassette chia coli vector pJOE2702 (Volff et al., Mol. Mic robiol., 21: 1037-1047 (1996); Stumpp et al., Bio spectrum, 1 (2000), 33-36) can be integrated. the This vector is inducible by L-rhamnose and is regulated positively.

Die erfindungsgemäß hergestellten pro- und eukary ontischen Wirtszellen können in Verfahren zur Her stellung von Polyfructanen mit β-1,2-Bindungen ver wendet werden, wobei nach der Kultivierung und Ver mehrung dieser Wirtszellen aus den Zellen ein Pro tein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase isoliert wird und das isolierte Protein in vitro zur Behandlung einer Saccharoselösung eingesetzt wird. Anschließend kann das enzymatisch gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein Polyfructan direkt aus Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nuc leinsäuremoleküle enthalten, oder aus einer trans genen Pflanze, die eines der erfindungsgemäßen Nuc leinsäuremoleküle enthält, isoliert werden. Bei dem so hergestellten Polyfructan handelt es sich vor zugsweise um Inulin mit einem Polymerisationsgrad von < 100 und einem Verzweigungsgrad von ≦ 8%, vor zugsweise ≦ 3%.The pro- and eukary produced according to the invention ontic host cells can be used in processes for the production of position of polyfructanes with β-1,2 bonds ver be used, after cultivation and ver multiplication of these host cells from the cells a pro complex with the activity of a fructosyltransferase is isolated and the isolated protein in vitro used to treat a sucrose solution becomes. Then the enzymatically formed Polyfructan isolated from the reaction mixture and be cleaned up. In another preferred Embodiment can be a polyfructan directly Host cells that one of the Nuc contain linseic acid molecules, or from a trans gene plant that one of the Nuc contains linseic acid molecules can be isolated. In which Polyfructan produced in this way is before preferably around inulin with a degree of polymerization of <100 and a degree of branching of ≦ 8% preferably ≦ 3%.

Das erfindungsgemäß hergestellte Inulin wird in weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfin dung zur Herstellung von Fructooligosacchariden be ziehungsweise Difructosedianhydriden verwendet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Fructoo ligosacchariden sieht vor, dass das erfindungsgemäß hergestellte Inulin mit einer Endo-Inulinase behan delt wird und anschließend die erzeugten Fructcooli gosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert wer den. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharose-Lösung gleich zeitig mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltrans ferase und einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die enzymatisch erzeugten Fructooligo saccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.The inulin produced according to the invention is in further preferred embodiments of the inven for the production of fructooligosaccharides or difructose dianhydrides. On preferred method of making fructoo ligosaccharides provides that the invention manufactured inulin with an endo-inulinase delt and then the generated Fructcooli gosaccharide isolated from the reaction mixture the. In another preferred embodiment It is intended that a sucrose solution be the same early with a fructosyltrans according to the invention ferase and an endo-inulinase is treated and then the enzymatically generated fructooligo saccharide isolated from the reaction mixture and be cleaned up.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung von Difructose dianhydriden. In einer Ausgestaltung wird erfin dungsgemäß hergestelltes Inulin mit einer Endo- Inulinase und Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgese hen, dass eine Saccharoselösung mit einer erfin dungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo- Inulinase und Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens behandelt wird und anschließend die er zeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsan satz isoliert und aufgereinigt werden.Further preferred embodiments of the invention relate to processes for making difructose dianhydrides. In one embodiment, inventions are made Inulin manufactured according to the invention with an endo- Arthrobacter globiformis inulinase and cells or Arthrobacter ureafaciens treated. In a Another preferred embodiment is vorese that a sucrose solution with an invent fructosyltransferase according to the invention and an endo- Inulinase and A. globiformis or A. cells ureafaciens is treated and then he generated difructosedianhydrides from the reaction be isolated and cleaned.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention result from the remaining subclaims.

Erfindungsgemäß wird also in bevorzugter Ausfüh rungsform ein, vorzugsweise isoliertes und gerei nigtes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein bakterielles Fructosyltransferase (ftf)-Gen ist und ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo syltransferase codiert und am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende mindestens eine Deletion enthält.According to the invention, it is therefore preferred tion form, preferably insulated and free nended nucleic acid molecule provided that a bacterial fructosyltransferase (ftf) gene is and a polypeptide with the activity of a fructo syltransferase encoded and at the 5 'end and / or 3'-end contains at least one deletion.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem bakteriellen Fructosyltransferase-Gen oder einem Nucleinsäuremolekül, das ein bakteriel les Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo syltransferase codiert, die codierende DNA-Sequenz eines Genes verstanden, dessen Genprodukt die Akti vität einer Saccharose: 2,1-β-D-fructosyltrans ferase (EC 2.4.1.9) aufweist und das ursprünglich aus einem Bakterium, vorzugsweise aus Streptococcus mutans, stammt. Im Zusammenhang mit der vorliegen den Erfindung bedeutet der Begriff "Fructosyl transferase" oder "β-D-Fructosyltransferase" ein Polypeptid oder ein Protein, das die Synthese eines hochmolekularen, aus sich wiederholenden Fructose- Einheiten bestehenden Kohlenhydrat-Polymers katalysieren kann, wobei Saccharose als Ausgangssubstrat für die weitere Polymerisation dient. In dem so synthetisierten polymeren Produkt sind die sich wiederholenden Fructose-Einheiten über β-1,2- Bindungen miteinander verknüpft, so dass die Fruc tosyltransferase, die die Synthese dieses Produktes katalysiert, auch als Inulinsucrase bezeichnet wer den kann. Das synthetisierte, aus sich wiederholen den Fructose-Einheiten bestehende hochmolekulare Polymer weist vorzugsweise eine lineare Struktur auf, kann einen terminalen, von einem Saccharose- Molekül stammenden Glucose-Rest enthalten und um fasst mindestens zwei Fructose-Reste. Im Zusammen hang mit der Erfindung wird dieses Kohlenhydrat als Polyfructan bezeichnet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem synthetisierten Polyfructan um Inulin.In connection with the present invention under a bacterial fructosyltransferase gene or a nucleic acid molecule that is a bacterial The polypeptide with the activity of a fructo syltransferase encodes the coding DNA sequence understood a gene, the gene product of which Akti Quantity of sucrose: 2,1-β-D-fructosyltrans ferase (EC 2.4.1.9) and that originally from a bacterium, preferably from Streptococcus mutans. In connection with the present the invention means the term "fructosyl transferase "or" β-D-fructosyltransferase " Polypeptide or a protein that synthesizes a high molecular weight, from repeating fructose Catalyze units of existing carbohydrate polymer can, with sucrose as the starting substrate serves for further polymerization. In that way synthesized polymeric product are the themselves repeating fructose units above β-1,2- Bonds linked so that the Fruc tosyltransferase, which is the synthesis of this product catalyzed, also referred to as inulin sucrase that can. The synthesized, repeating itself the high-molecular fructose units Polymer preferably has a linear structure on, can be a terminal, from a sucrose Contain molecule derived glucose residue and around holds at least two fructose residues. Together Hang with the invention, this carbohydrate is considered Designated polyfructan. It is preferably the synthesized polyfructan is inulin.

Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Bei spiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann beispielsweise aus Streptococcus mutans-Zellen iso liert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein.The nucleic acid can be a DNA sequence play part of a genomic DNA sequence, or a RNA sequence, for example an mRNA sequence or be part of it. The nucleic acid can both of natural origin, that is, it can for example from Streptococcus mutans cells iso be lined, as well as synthetic origin his.

Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül weist in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mindestens eine Deletion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) den Nucleotiden 4 bis 222, b) den Nucleotiden 1 bis 104 und c) den Nucle otiden 2254 bis 2385 auf. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "Deletion" eine Mutation verstanden, bei dem ein Teil der im Wildtyp-Gen vorhandenen Nucleinsäuresequenz fehlt. Deletionen können beispielsweise in vitro unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden, wenn der zu deletierende Bereich von geeig neten Restriktions-Schnittstellen flankiert wird. Deletionsmutationen lassen sich auch mit Hilfe be stimmter Endonucleasen, beispielsweise unter Ver wendung des Enzyms BAL-31, einführen. Derartige En zyme bauen die Enden ab, die durch Restriktionsen zym-Spaltung erzeugt wurden. Eine Deletionsmutage nese kann aber auch unter Verwendung eines mutier ten Primers in einer PCR-Reaktion erreicht werden. Die Sequenz eines solchen Primers überspannt dabei den Bereich, der deletiert werden soll, wobei der Primer an zwei Bereiche einer Zielregion bindet, die den zu deletierende Bereich flankieren. Bei der Amplifikation wird also der vom Primer überspannte Bereich nicht erfaßt und somit nicht amplifiziert.The nucleic acid molecule according to the invention has in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 1, which is the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2 encoded, at least one deletion selected from the group consisting of a) nucleotides 4 to 222, b) nucleotides 1 to 104 and c) the nucleus otides 2254 to 2385. In connection with the the present invention is called "deletion" understood a mutation in which part the nucleic acid sequence present in the wild-type gene is missing. For example, deletions can be performed in vitro generated using restriction enzymes if the area to be deleted is suitable Restriction interfaces are flanked. Deletion mutations can also be solved with the help tuned endonucleases, for example under Ver using the enzyme BAL-31. Such en zymes break down the ends by restriction zym cleavage were generated. A deletion mutage nese can also use a mutier ten primers can be achieved in a PCR reaction. The sequence of such a primer spans the area to be deleted, with the Primer binds to two areas of a target region, that flank the area to be deleted. In the The amplification is the one spanned by the primer Area not covered and therefore not amplified.

Die erfindungsgemäßen Deletionen des Fructo syltransferasegens betreffen vorzugsweise den 5'- Bereich und den 3'-Bereich des nativen Fructo syltransferase-Gens von Streptococcus mutans.The fructo deletions according to the invention syltransferase gene preferably affect the 5'- Area and the 3 'area of the native fructo Streptococcus mutans syltransferase gene.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform mit einer Deletion im 5'-Bereich, die die Nucleotide 4 bis 222 umfasst, ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Protein mit der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäu resequenz codiert. Im Ursprungsorganismus S. mutans vermittelt eine Signalsequenz die Sekretion des En zyms aus dem Cytoplasma, wobei die Signalsequenz während des Sekretionsvorgangs durch eine Signalpeptidase abgespalten wird. Der Signalpeptid abhängige Proteinexport, der bei grampositiven und gramnegativen Bakterien in ähnlicher Weise abläuft, ist ein komplexer energieabhängiger Prozeß, an dem eine Vielzahl löslicher und membrangebundener Pro teine beteiligt sind (Schatz und Beckwith, Annu. Rev. Genet., 24 (1990), 215). Bei einer angestreb ten Überproduktion des Fructosyltransferase- Proteins in einem heterologen Wirtsorganismus könn te die Signalsequenz insofern zu einer Beeinträch tigung des Wachstums des Wirtes und somit zur Ver ringerung der Produktausbeute führen, wenn die Sig nalsequenz auch im heterologen Wirt funktionell ist und die produzierte Proteinmenge die Kapazität des Sekretionsmechanismus übersteigt und/oder wenn an dere physiologische intra- oder extrazelluläre Pro zesse im Bereich der Zellmembran durch das rekombi nante Protein selbst oder durch die Sekretion des rekombinanten Proteins gestört werden.A particularly preferred embodiment with a Deletion in the 5 'region, which the nucleotides 4 to 222 comprises, the nucleic acid molecule with the in SEQ ID No. 3 shown nucleic acid sequence, the one Protein with the amino acid shown in SEQ ID No. 4 sequence encoded. In the original organism S. mutans a signal sequence mediates the secretion of the ene zymes from the cytoplasm, the signal sequence during the secretion process by a signal peptidase is split off. The signal peptide dependent protein export, which is used in gram positive and gram-negative bacteria works in a similar way, is a complex energy dependent process on which a variety of soluble and membrane-bound pro teine are involved (Schatz and Beckwith, Annu. Rev. Genet., 24 (1990), 215). At one aimed overproduction of fructosyltransferase Proteins in a heterologous host organism The signal sequence was therefore a nuisance growth of the host and thus for ver lead to a reduction in product yield if the Sig nal sequence is also functional in the heterologous host and the amount of protein produced is the capacity of the Secretion mechanism exceeds and / or when on their physiological intra- or extracellular pro processes in the area of the cell membrane through the recombi nante protein itself or by secretion of the recombinant protein.

Eine vollständige Entfernung der das Signalpeptid codierenden Nucleinsäuresequenzen in dem Nuclein säuremolekül mit der SEQ ID Nr. 3 führt zu einer vollständigen Entfernung des Signalpeptids, so dass die Expression des modifizierten Fructosyltransfe rase-Proteins in einem heterologen Wirt zur intra zellulären Produktion des Genprodukts führt. Durch die intrazelluläre Produktion der Fructosyltransfe rase werden die Wachstumsstörungen, die bei Wirts systemen, die das native Fructosyltransferase- Protein exprimieren, nahezu vollständig beseitigt und das gewünschte Proteinprodukt kann in hohen Vo lumenausbeuten gewonnen werden. Complete removal of the signal peptide coding nucleic acid sequences in the nuclein acid molecule with SEQ ID No. 3 leads to a complete removal of the signal peptide so that the expression of the modified fructosyltransfe rase protein in a heterologous host for intra leads to cellular production of the gene product. By intracellular production of fructosyltransfer The growth disturbances that occur in hosts systems that use native fructosyltransferase Express protein, almost completely eliminated and the desired protein product can be in high volume lumen yields are obtained.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für eine Deletion im 3'-Bereich des nativen Fructosyltranbs ferasegens ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten Amino säuresequenz codiert. Bei diesem Nucleinsäuremole kül sind die Nucleotide 2254 bis 2385 deletiert. Dieser Bereich weist einen hohen Hydropathie-Index auf, wie mittels des Verfahrens von Kyte und Doo little (J. Mol. Biol., 157 (1982), 105-142) gezeigt wurde. Obwohl diesem hydrophoben Bereich keine di rekte Funktion zugeordnet werden kann, zeigen hete rologe Wirtssysteme bei der Expression eines sol chen modifizierten Fructosyltransferase-Proteins gegenüber Wirtszellen, die das native Fructo syltransferase-Protein exprimieren, ein erheblich verbessertes Wachstumsverhalten. Das modifizierte Protein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten isoliert werden.A particularly preferred embodiment for a Deletion in the 3'-region of the native fructosyl tranbs ferasegens is the nucleic acid molecule with the in SEQ ID No. 7 shown nucleic acid sequence, the one Polypeptide with the amino shown in SEQ ID No. 8 acid sequence encoded. At this nucleic acid mole The nucleotides 2254 to 2385 have been deleted. This area has a high hydropathy index on how using the procedure of Kyte and Doo little (J. Mol. Biol., 157 (1982), 105-142) has been. Although no di right function can be assigned, show hete rologous host systems in the expression of a sol Chen modified fructosyltransferase protein versus host cells that contain the native fructo syltransferase protein express a significantly improved growth behavior. The modified Protein can also be used in high volume yields be isolated.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die im 5'-Bereich des Fructosyltransferasegens de letierten Sequenzen durch den Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt. In einer besonders bevorzug ten Ausführungsform handelt es sich bei dem anderen Gen um das lacZα-Gen. Im Zusammenhang mit der vor liegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Erset zen", dass die das Signalpeptid codierenden ftf- Sequenzen vollständig oder teilweise durch äquivalente Sequenzen eines anderen Gens ersetzt werden können. Bei Verwendung des lacZα-Gens werden also äquivalente Sequenzen dieses Gens mit dem am 5'-Ende deletierten Fructosyltransferasegen fusio niert. Ein besonders bevorzugtes Beispiel dafür ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 5 ge zeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Bei die ser ftf-Genvariante wurden die Nucleotide 1 bis 104 der nativen Fructosyltransferase-Nucleinsäure sequenz gegen die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ausgetauscht. Das Nucleinsäuremolekül weist daher gegenüber der nativen ftf-Sequenz eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 auf. Der Austausch am 5'-Ende führt bei einer Expression des Fusionsproteins in heterologen Wirtssystemen zur einer Lokalisation des Genproduktes im periplasmatischen Raum. Mit ei nem solchen Plasmid transformierte Wirtszellen zei gen daher gegenüber das Wildtyp-ftf-Gen enthalten den heterologen Wirtszellen ein deutlich verbesser tes Wachstum und das Fusionsprotein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden.In a further preferred embodiment those in the 5 'region of the fructosyltransferase gene de lethal sequences by the sequence area of a other gene replaced. In a particularly preferred The third embodiment is the other Gene around the lacZα gene. In connection with the before lying invention means the term "replacement zen "that the ftf coding for the signal peptide Sequences completely or partially equivalent sequences of another gene replaced can be. When using the lacZα gene equivalent sequences of this gene with the am 5 'end of deleted fructosyltransferase gene fusio ned. A particularly preferred example of this is the nucleic acid molecule with the ge in SEQ ID No. 5 showed nucleic acid sequence that a in SEQ ID NO. 6 amino acid sequence shown encoded. At the This ftf gene variant became nucleotides 1 to 104 the native fructosyltransferase nucleic acid sequence against nucleotides 1 to 83 of the lacZα gene replaced. The nucleic acid molecule therefore has compared to the native ftf sequence Nucleotides 1 to 104. The exchange at the 5 'end leads to an expression of the fusion protein in heterologous host systems for localization of the gene product in the periplasmic space. With egg transformed such a plasmid host cells gene compared to the wild-type ftf gene a distinct improvement in the heterologous host cells growth and the fusion protein can also can be obtained in high volume yields.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind das Nuc leinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 dar gestellte Aminosäuresequenz codiert, und das Nuc leinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 11 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 12 dar gestellte Aminosäuresequenz codiert. Das Nuclein säuremolekül mit der SEQ ID Nr. 9 weist am 5'-Ende eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 auf und am 3'-Ende eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385. Bei dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 11 sind die Nucleotide 1 bis 104 durch die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ersetzt worden und das 3'- Ende weist ebenfalls eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 auf. Beide ftf-Genvarianten führen bei Expression der entsprechenden Genprodukte in heterologen Wirtssystemen zu einer deutlichen Ver besserung des Wachstums, wobei die entsprechenden Genprodukte in hohen Volumenausbeuten gewonnen wer den können.Further preferred embodiments are the nuc Linseed acid molecule with the one shown in SEQ ID No. 9 Nucleic acid molecule, which is one in SEQ ID No. 10 amino acid sequence, and the Nuc Linseed acid molecule with the one shown in SEQ ID No. 11 Nucleic acid sequence, which is one in SEQ ID No. 12 provided amino acid sequence encoded. The nuclein acid molecule with SEQ ID No. 9 has at the 5 'end a deletion of nucleotides 4 to 222 on and on 3'-end a deletion of nucleotides 2254 to 2385. For the nucleic acid molecule with SEQ ID No. 11 are nucleotides 1 through 104 through the nucleotides 1 to 83 of the lacZα gene have been replaced and the 3'- End also shows a deletion of the nucleotides 2254 to 2385. Both ftf gene variants lead when expressing the corresponding gene products in heterologous host systems to a clear ver improvement in growth, taking the appropriate Gene products obtained in high volume yields that can.

Die Erfindung umfasst ebenfalls modifizierte Nuc leinsäuremoleküle, die beispielsweise durch Substi tution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines erfindungsgemäßen Nuc leinsäuremoleküls erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Deri vate und funktionelle Äquivalente, also struktur verschiedene aber funktionsidentische oder funkti onsähnliche Abwandlungen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls bezeichnet werden können. Die Sequenz von Nucleinsäuremolekülen kann beispiels weise weiter gezielt modifiziert werden, um inner halb der Nucleotidsequenz geeignete Restriktions schnittstellen zu erzeugen oder nicht erforderliche Sequenzteile zu entfernen. Die Modifikationen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Standardverfahren der Mikrobiolo gie/Molekularbiologie erfolgen. Dazu werden die entsprechenden Nucleinsäuren in Plasmiden inseriert und Mutagenese-Verfahren oder einer Sequenzverände rung durch Rekombination unterworfen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie Transitionen oder Transversionen, eignen sich beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "Primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren (vergleiche Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). Weitere Sequenzveränderungen lassen sich auch durch Anlagerung natürli cher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen er reichen.The invention also includes modified nuc linseic acid molecules, for example by Substi tution, addition, inversion and / or deletion of a or more bases of a nuc according to the invention are available, that is also nucleic acid molecules that act as mutants, Deri vate and functional equivalents, i.e. structure different but functionally identical or functi ons-like modifications of an inventive Nucleic acid molecule can be called. The Sequence of nucleic acid molecules can, for example be further modified in a targeted manner in order to suitable restriction half of the nucleotide sequence generate interfaces or unnecessary Remove sequence parts. The modifications of the Nucleic acid molecules according to the invention can with Using standard microbiolo procedures gie / molecular biology. To do this, the corresponding nucleic acids inserted in plasmids and mutagenesis method or a sequence change subjected to recombination. For generation of insertions, deletions or substitutions, such as transitions or transversions are suitable for example methods for in vitro mutagenesis, "Primer repair" procedure and restriction and / or ligation procedures (see Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2nd edition (1989), Cold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). More sequence changes can also be added naturally cher or synthetic nucleic acid sequences pass.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ent halten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugs weise um Plasmide, Cosmide, Viren, Liposomen, Bak teriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere funktio nelle Elemente enthalten, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einer Wirtszel le bewirken oder zumindest dazu beitragen.The present invention further relates to vectors ent ent the nucleic acid molecules of the invention hold. The vectors are preferred wise about plasmids, cosmids, viruses, liposomes, Bak teriophages, shuttle vectors and others in the Genetic engineering commonly used vectors. The Vectors according to the invention can further functio contain elements that provide stabilization and / or replication of the vector in a host cell le effect or at least contribute to it.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform um fasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen mindestens ein erfindungsgemäßes Nuclelnsäuremole kül unter der funktionellen Kontrolle von mindes tens einem regulatorischen Element steht. Erfin dungsgemäß werden unter dem Begriff "regulatori sches Element" solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nuclein säuremolekülen in prokaryontischen und/oder eukary ontischen Wirtszellen gewährleisten, so dass ein Polypeptid oder Protein exprimiert wird. Bei regu latorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Silencer und/oder Transkriptionstermina tionssignale handeln. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, ins besondere den Protein-codierenden Abschnitten die ser Nucleotidsequenz, funktionell verbunden sind, können Nucleotidsequenzen sein, die aus anderen Or ganismen oder anderen Genen stammen als die Protein-codierende Nucleotidsequenz selbst. Beispiele davon sind: T7, T3, SP6 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur in vitro-Transkription; P_LAC, P_Ltet und weitere gebräuchliche Regulationsele mente zur Expression in E. coli; GAL1-10, MET25, CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 und andere Regu lationselemente zur Expression in der Bäckerhefe S. cerevisiae; Polyhedrin zur Expression in Baculovi rus-Systemen; P_CMV, P_SV40 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen; gewebe- oder organspezifische- insbesondere spei cherorganspezifische Promotoren, wie der Vicillin- Promotor aus Pisum sativum, der Arabidopsis- Promotor AtAAP1 oder der Patatin-B33-Promotor, zur Expression in pflanzlichen Systemen.In a particularly preferred embodiment, the present invention includes vectors in which at least one nucleic acid molecule according to the invention is coolly under the functional control of at least one regulatory element. According to the invention, the term “regulatory element” is understood to mean those elements which ensure the transcription and / or translation of nucleic acid molecules in prokaryotic and / or eukaryotic host cells, so that a polypeptide or protein is expressed. Regulatory elements can be promoters, enhancers, silencers and / or transcription termination signals. Regulatory elements which are functionally linked to a nucleotide sequence according to the invention, in particular the protein-coding sections of this nucleotide sequence, can be nucleotide sequences which originate from other organisms or genes than the protein-coding nucleotide sequence itself. Examples thereof are: T7 , T3, SP6 and other common regulatory elements for in vitro transcription; P _LAC , P _Ltet and other common regulatory elements for expression in E. coli; GAL1-10, MET25, CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 and other regulatory elements for expression in the baker's yeast S. cerevisiae; Polyhedrin for expression in Baculovirus systems; P _CMV , P _SV40 and other common regulatory elements for expression in mammalian cells; Tissue- or organ-specific - in particular memory-organ-specific promoters, such as the Vicillin promoter from Pisum sativum, the Arabidopsis promoter AtAAP1 or the patatin B33 promoter, for expression in plant systems.

In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfin dung vor, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküle mit einer Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplas matische Retikulum einer Pflanzenzelle und zur Wei terleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteil haft. Erfindungsgemäß können beispielsweise Signal peptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste, Signalsequenzen aus einem Patatin-Gen der Kartoffel oder Signalsequenzen von reifem Phytohä maglutinin der Bohne verwendet werden.In another embodiment, the inventor sees tion that the nucleic acid of the invention molecules are fused to a signal sequence, which is a signal peptide for inclusion in the endoplas matic reticulum of a plant cell and for white coding into the vacuole. A vacuolar Localization of the gene products is particularly advantageous way. According to the invention, for example, signal peptides for the vacuolar localization of lectin Barley, signal sequences from a patatin gene Potato or signal sequences from ripe Phytohä maglutin be used in the bean.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgese hen, dass die regulatorischen Elemente vom L- Rhamnose-Operon von Escherichia coli stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform wird ein er findungsgemäßes Nucleinsäuremolekül in die Expressionskassette des Vektors pJOE2702 (Volff et al., 1996; Stumppet al., 2000) integriert. Die Expressi onskassette umfaßt den Promotor rha_P, der aus dem zweistufig regulierten L-Rhamnose-Operon rhaBAD von Escherichia coli stammt (Egan und Schleif, J. Mol. Biol., 243 (1994), 821-829). Bei dem Vektor pJOE2702 handelt es sich also um einen über zwei Stufen positiv regulierbaren, L-Rhamnose- induzierbaren Expressionsvektor, der im Wirtsbakte rium Escherichia coli in hoher Kopiezahl vorhanden ist. Die Transkriptionstermination und die Transla tionsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen der im Vektor enthaltenen Expressi onskassette. Gegenüber den meisten kommerziell er hältlichen E. coli-Expressionsvektoren besitzt pJOE2702 zwei entscheidende Vorteile. Erstens führt der Vektor im nicht-induzierten Zustand zu einer sehr niedrigen Basisexpression des zu exprimieren den Polypeptids. Zweitens wird die Transkription der Expressionskassette verzögert induziert. Der Vektor eignet sich daher insbesondere zur Clonie rung und Produktion von Proteinen, die die Vitali tät und die Wachstumseigenschaften der Wirtszelle negativ beeinflussen, wie beispielsweise von bakte riellen Fructosyltransferasen. Obwohl Escherichia coli-Zellen, die den Vektor pJOE2702 mit dem voll ständigen S. mutans-Fructosyltransferase-Gen ent halten, nach Induktion eine vollständige Wachstums hemmung zeigen, eignet sich der Vektor in besonde rem Maße zur Expression der erfindungsgemäßen Nuc leinsäuremoleküle, die am 5'-Ende und am 3'-Ende mindestens eine der erfindungsgemäßen Deletionen enthalten. In a preferred embodiment it is provided that the regulatory elements derive from the L-rhamnose operon from Escherichia coli. In a particularly preferred embodiment, a nucleic acid molecule according to the invention is integrated into the expression cassette of the vector pJOE2702 (Volff et al., 1996; Stumpp et al., 2000). The expression cassette comprises the promoter rha _P , which is derived from the two-stage regulated L-rhamnose operon rhaBAD from Escherichia coli (Egan and Schleif, J. Mol. Biol., 243 (1994), 821-829). The vector pJOE2702 is therefore an L-rhamnose-inducible expression vector which can be positively regulated over two stages and which is present in the host bacterium rium Escherichia coli in high copy numbers. The transcription termination and the translation initiation of the transcripts also take place via sequences of the expression cassette contained in the vector. Compared to most commercially available E. coli expression vectors, pJOE2702 has two decisive advantages. First, the vector in the non-induced state leads to a very low base expression of the polypeptide to be expressed. Second, transcription of the expression cassette is induced with a delay. The vector is therefore particularly suitable for cloning and producing proteins which negatively affect the vitality and the growth properties of the host cell, such as bacterial fructosyltransferases. Although Escherichia coli cells, which contain the vector pJOE2702 with the complete S. mutans fructosyltransferase gene, show complete growth inhibition after induction, the vector is particularly suitable for expression of the nucleic acid molecules according to the invention which 'End and at the 3' end contain at least one of the deletions according to the invention.

Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständ lich auch Vektoren, die nicht nur eines, sondern mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Dabei können die Nucleotidsequenzen so angeordnet sein, dass gegebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, insbesondere der in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 beschrie benen Sequenzen, von einem einzigen Satz regulato rischer Elemente kontrolliert werden.The present invention naturally includes Lich also vectors that not only one, but several of the nucleic acid molecules according to the invention contain. The nucleotide sequences can do this be arranged that one, two or several of the nucleotide sequences according to the invention, in particular that in SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11 sequences, from a single set of regulato elements are checked.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vek toren umfassen, und die fähig sind, die von den Nucleinsäuremolekülen codierten Polypeptide mit der Aktivität einer Fructosyltransferase zu exprimie ren. Bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um prokaryontische als auch um eukary ontische Zellen handeln. Bevorzugte Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Bei spiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Er findungsgemäß bevorzugte Beispiele für eukaryonti sche Wirtszellen umfassen Hefezellen, Insektenzel len und Pflanzenzellen. Die erfindungsgemäße Wirts zelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz in Bezug auf die transformierte Zelle heterolog ist, das heißt, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt oder aber an einem anderen Ort in diesen Zellen oder aber in einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom dieser Zellen lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.In a preferred embodiment, the present invention host cells which one or several of the nucleic acid molecules according to the invention or one or more of the Vek according to the invention gates include, and are capable of those of the Nucleic acid molecules encoded polypeptides with the Activity of a fructosyltransferase to express ren. With the host cells according to the invention it can both prokaryotic and eukary act ontic cells. Preferred examples of prokaryotic cells are bacteria, such as play Escherichia coli or Bacillus subtilis. he preferred examples of eukaryonti according to the invention Host cells include yeast cells, insect cells oils and plant cells. The host according to the invention cell can be characterized in that the introduced nucleotide sequence according to the invention in Is heterologous with respect to the transformed cell, that is, the introduced invention Nucleotide sequence naturally not in these Cells occurs or in another place in these cells or in another copy number or orientation localized in the genome of these cells is natural as the corresponding one occurring sequence.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Wirtszelle um eine gramnegative Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli-Zelle. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine grampositive Zelle, beispielsweise um eine Bacillus-subtilis-Zelle handeln.In a particularly advantageous embodiment of the The present invention is the Host cell around a gram negative cell, in particular an Escherichia coli cell. In another advantageous embodiment, it can also a gram-positive cell, for example one Act Bacillus subtilis cell.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform han delt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryontische Wirtszelle. In einer beson ders bevorzugten Ausführungsform kann es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine Hefezelle, zum Beispiel eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle, handeln. Weitere bevorzugte Zellen Insektenzellen, beispielsweise die Insektenzelllinie IPLB-Sf21. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Pflanzenzelle, insbesondere um eine Zelle solcher Pflanzen, die natürlicherweise Polyfructane, insbesondere Inulin, erzeugen, wie beispielsweise eine Topinambur-, Ar tischocken- oder Zichorienzelle, oder um Zellen von landwirtschaftlich bedeutsamen Pflanzen, die natür licherweise andere Monosaccharide, Oligosaccharide und/oder Polysaccharide erzeugen, wie beispielswei se eine Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Zelle.In a further preferred embodiment han it is the host cell according to the invention a eukaryotic host cell. In a particular the preferred embodiment, it can be the host cell according to the invention around a yeast cell, for example a Saccharomyces cerevisiae cell, act. Other preferred cells insect cells, for example the insect cell line IPLB-Sf21. In a particularly preferred embodiment the host cell is a plant cell, especially around a cell of such plants that naturally polyfructans, especially inulin, generate, such as a Jerusalem artichoke, Ar table or chicory cell, or around cells from agriculturally significant plants that are natural Licher other monosaccharides, oligosaccharides and / or generate polysaccharides, such as se a potato, cassava or sugar beet cell.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen, die min destens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen auf weisen, wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase oder ein Fragment davon zu produzieren.The invention also relates to cell cultures that min at least one of the host cells according to the invention have, wherein a cell line according to the invention Has ability to use a polypeptide or protein the activity of a fructosyltransferase or a To produce a fragment of it.

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die in min destens einer ihrer Zellen mindestens ein erfin dungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder aber die mindestens eine, vorzugsweise jedoch eine Viel zahl von Wirtszellen enthalten, die das erfindungs gemäße Fructosyltransferasegen oder dieses enthal tende Vektoren oder Plasmide aufweisen, und die in folge dessen hochmolekulare Polyfructane, insbeson dere hochmolekulares Inulin, erzeugen können. Die Erfindung ermöglicht also auch die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Lage sind, hochmolekulares Inulin zu erzeu gen. Gegenüber den wenigen Pflanzen, die natürli cherweise Inulin erzeugen können, ergibt sich der Vorteil, dass eine gezielte Lokalisierung des ge bildeten Inulins möglich ist und dass zudem eine Erhöhung der Expressionsrate und damit der Menge an gebildeten Inulin erreicht wird. Zudem weist das in diesen transgenen Pflanzen erzeugte Inulin ein hö heres Molekulargewicht auf als natürlicherweise ge bildetes pflanzliches Inulin. Während natürlicher weise erzeugtes pflanzliches Inulin durchschnitt lich 10 bis 30 Fructoseeinheit pro Molekül auf weist, kann das in transgenen Pflanzen gebildete Polyfructan mehr als 100 000 Fructoseeinheiten auf weisen. The invention also relates to plants that are min at least one of their cells invented at least one nucleic acid molecule according to the invention or at least contain a vector according to the invention or else the at least one, but preferably a lot number of host cells containing the invention appropriate fructosyltransferase gene or contain it end vectors or plasmids, and which in follow its high molecular weight polyfructans, in particular which can produce high molecular weight inulin. The Invention also makes provision possible of plants of different types, genera, Families, orders and classes based on the introduced nucleic acid molecules according to the invention are able to produce high molecular weight inulin Compared to the few plants that naturally able to produce inulin, the result is The advantage that a targeted localization of the ge formed inulin is possible and that also a Increasing the expression rate and thus the amount of formed inulin is reached. In addition, in Inulin produced a trans higher molecular weight than natural ge forms vegetable inulin. While more natural wise vegetable inulin average 10 to 30 fructose units per molecule indicates that can be formed in transgenic plants Polyfructan has more than 100,000 fructose units point.

Die Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthaltendes transgenes Ernte- und Vermehrungsmaterial der Pflanze sowie Teile oder Kalli einer erfindungsgemäßen Pflanze, zum Beispiel Speicherorgane, Früchte, Knollen, Rüben, Samen, Blätter, Blüten oder ähnliches.The invention also relates to an invention Transgenic Harvest Containing Nucleic Acid Molecule and plant propagation material and parts or calli of a plant according to the invention, for Example storage organs, fruits, tubers, beets, Seeds, leaves, flowers or the like.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die zu transformierende Pflanze entweder eine Pflanze ist, die natürlicherweise ein Polyfructan, insbesondere Inulin, erzeugen kann, vorzugsweise eine Topinam bur-, Artischocken- oder Zichorien-Pflanze, oder eine landwirtschaftlich bedeutsame Nutzpflanze, die natürlicherweise Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide erzeugen kann, vorzugsweise ei ne Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze.The invention particularly provides that the transforming plant is either a plant which is naturally a polyfructan, in particular Inulin, preferably a topiname bur, artichoke or chicory plant, or an agriculturally important crop that naturally monosaccharides, oligosaccharides or can produce polysaccharides, preferably egg ne potato, cassava or sugar beet plant.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel lung der vorgenannten Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor der Erfindung, die Integration des in diesem Vektor enthaltenen Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle(n) und die Regenera tion der Pflanzenzelle(n) zu intakten, transfor mierten Pflanzen, die ein hochmolekulares Polyfruc tan, insbesondere Inulin erzeugen können.The invention also relates to manufacturing processes development of the aforementioned plants, comprising the Transformation of one or more plant cells with a vector of the invention, the integration of the nucleic acid molecule contained in this vector into the genome of the plant cell (s) and the Regenera tion of the plant cell (s) to intact, transfor plants that have a high molecular weight polyfruc Tan, especially inulin.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein modifiziertes Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Sac charose in ein Polyfructan, insbesondere Inulin, mit furanosiden β-1,2-Bindungen katalysieren kann. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinigtes, Protein, das durch Expression eines erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküles oder eines Frag mentes davon in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Pflanze erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Ei genschaften, insbesondere die gleiche Aktivität ei ner Fructosyltransferase wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.The invention also relates to a modified one Polypeptide or protein with the activity of a Fructosyltransferase, which is the conversion of Sac charose into a polyfructan, especially inulin, can catalyze with furanoside β-1,2 bonds. The present invention relates in particular a, preferably isolated and completely cleaned, Protein that is expressed by expression of an invented nucleic acid molecule according to the invention or a Frag mentes thereof in a host cell according to the invention or a plant according to the invention is available and has the aforementioned biological activity. The protein preferably has the same egg properties, in particular the same activity ner fructosyltransferase like the protein produced by a nucleic acid molecule with the one in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown is encoded and whose amino acid sequence is shown in SEQ ID No. 2 is.

Vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte und vollständig gereinigte monoclonale oder polyclonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem er findungsgemäßen Polypeptid oder Protein so spezi fisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoclonalen oder po lyclonalen Antikörper oder deren Fragmente mit Hil fe üblicher immunologischer Verfahren beispielswei se ein Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst daher monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines er findungsgemäßen Polypeptids oder Proteins mit der Aktivität einer Fructosyltransferase identifizieren und/oder daran binden können. Bei einer solchen Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Koh lenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Bezie hung steht. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergebnis posttranslationaler Modifikationen des erfin dungsgemäßen Proteines entstanden sind. Die Erfin dung umfasst auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc- oder F(ab')₂-beziehungswei se Fab-Fragmente.The present invention also encompasses isolated and completely purified monoclonal or polyclonal antibodies or fragments thereof, which react with a polypeptide or protein according to the invention so specifically and with such an affinity that, using these monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments, it is more common to use them immunological methods, for example, detection of a protein according to the invention is possible. A preferred embodiment of the invention therefore comprises monoclonal and polyclonal antibodies which can specifically identify and / or bind to a structure of a polypeptide or protein according to the invention with the activity of a fructosyltransferase. Such a structure can be a protein, peptide, carbohydrate, proteoglycan and / or a lipid complex which is part of the protein according to the invention or has a specific relationship therewith. The invention also encompasses antibodies which are directed against structures which have arisen as a result of post-translational modifications of the protein according to the invention. The invention also includes fragments of such antibodies, such as Fc or F (ab ') ₂ or relationship Fab fragments.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Antikör per, die gegen einen erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet sind, das heißt einen erfindungsgemäßen Antikörper identifizieren und daran binden können, so dass ein spezifischer Nachweis der erfindungsge mäßen Antikörper möglich ist.The present invention further relates to antibody per, against an antibody according to the invention are directed, that is, an inventive Identify and bind antibodies so that a specific proof of the fiction moderate antibody is possible.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von längerkettigen Polyfructanen mit linearer Struktur, wobei die Fructose-Einheiten in der Kette durch β-1,2-Bindungen verknüpft sind, und mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 100 und einem Verzweigungsgrad von weniger als 3%. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polyfructan aus erfindungsgemäß transfor mierten transgenen Pflanzen, insbesondere aus deren Vakuolen, isoliert und aufgereinigt wird. Besonders bevorzugt ist die Isolierung und Gewinnung von Po lyfructanen aus den Speicherorganen von Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanzen. Das Verfahren umfasst die mechanische Zerkleinerung größerer pflanzlicher Zellmassen mit Hilfe eines Turbinenmischers, bei spielsweise eines Waring Blender, wobei das Zer kleinern vorzugsweise in einem großen Volumen wäss rigen Mediums bei tiefen Temperaturen, beispiels weise +4°C, erfolgt. Der weitere Aufschluss kann mit Hilfe physikalischer Aufschlussverfahren, beispielsweise mittels Ultraschall, einer "French press"-Vorrichtung, Mühlen oder Pressen, mit Hilfe chemischer Aufschlussverfahren, beispielsweise ei ner Lyophilisation oder unter Verwendung von Deter genzien oder unter Anwendung osmotischer Druckände rung, oder mit Hilfe biologischer Aufschlussverfah ren, beispielsweise unter Verwendung von die Zell wand angreifenden Enzymen oder mittels einer Säure- /Lauge-Behandlung, erfolgen. In einer besonders be vorzugten Ausführungsform erfolgt die Gewinnung des hochmolekularen Polyfructans durch Herstellung ei nes wässrigen Extraktes, insbesondere der Speicher organe, und anschließendes Fällen mit Alkohol.The present invention further relates to methods for the production of longer-chain polyfructans with a linear structure, the fructose units are linked in the chain by β-1,2 bonds, and with a degree of polymerization of more than 100 and a degree of branching of less than 3%. In an advantageous embodiment is provided that the polyfructane from transfor mated transgenic plants, especially from their Vacuoles, isolated and cleaned. Especially isolation and extraction of Po is preferred lyfructans from the storage organs of potato, Jerusalem artichoke, artichoke, chicory, cassava or sugar beet plants. The process includes the mechanical crushing of larger plant Cell masses with the help of a turbine mixer example of a Waring Blender, the Zer smaller preferably in a large volume of water medium at low temperatures, for example wise + 4 ° C. The further information can using physical digestion processes, for example by means of ultrasound, a "French press "device, mills or presses, with the help chemical digestion processes, for example egg ner lyophilization or using Deter or using osmotic pressure changes tion, or with the help of biological digestion ren, for example using the cell enzymes attacking the wall or using an acid / Lye treatment. In a particularly be preferred embodiment, the extraction of high molecular polyfructan by making egg aqueous extract, especially the storage organs, and subsequent precipitation with alcohol.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des Ver fahrens zur Herstellung von Polyfructanen sieht vor, dass erfindungsgemäße Wirtszellen, beispiels weise pflanzliche Wirtszellen oder mikrobielle Wirtszellen, beispielsweise Escherichia coli- Zellen, in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert und ver mehrt werden. Anschließend wird das erzeugte Zell material mit Hilfe geeigneter physikalischer, che mischer und/oder enzymatischer Verfahren aufge schlossen und die Proteine mit der Aktivität einer Fructosyltransferase werden aus dem Aufschlussmate rial aufgereinigt. Die weitere Aufreinigung der en zymatischen Aktivität erfolgt mit Hilfe üblicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Zur Gewin nung eines Rohextraktes wird die Aufschlussläsung beispielsweise mit Hilfe von Extraktionsverfahren, Zentrifugationsverfahren und Filtrationsverfahren behandelt. Die Fällung der Proteine aus dem Rohex trakt sowie Ultrafiltrationsverfahren sind effiziente Verfahren zur Konzentrierung von Proteinen aus einer größeren Flüssigkeitsmenge. Als Fällungs mittel kommen unter anderem anorganische Salze, beispielsweise Natrium- und Amoniumsulfat, organi sche Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, und Polymere, beispielsweise Polyethylenglycol, zur An wendung. Zur Abtrennung der verwendeten Fällungs mittel kann anschließend ein Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Feinreinigung kann mit Hilfe chromatographischer Verfahren und Verteilungsverfahren, beispielsweise unter Verwen dung wässriger Phasensysteme, erfolgen. Zu diesen Verfahren zählen unter anderem Adsorptionschroma tographie, Ionenaustauschchromatographie, Gel- Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie.Another advantageous embodiment of the Ver driving for the production of polyfructans before that host cells according to the invention, for example wise plant host cells or microbial Host cells, for example Escherichia coli Cells, in a suitable nutrient medium and under cultivated suitable cultural conditions and ver be increased. Then the generated cell material with the help of suitable physical, che Mixer and / or enzymatic processes closed and the proteins with the activity of a Fructosyltransferase are made from the digestion mate rial cleaned up. The further purification of the zymatic activity takes place with the help of usual in the field of known methods. To win The digestion solution becomes the raw extract for example with the help of extraction processes, Centrifugation and filtration processes treated. Precipitation of the proteins from the raw hex tract and ultrafiltration processes are efficient Process for concentrating proteins from a larger amount of liquid. As a precipitation agents include inorganic salts, for example sodium and ammonium sulfate, organi cal solvents, for example alcohols, and Polymers, for example polyethylene glycol, for example turn. To separate the precipitation used a dialysis procedure can then be used be performed. Another fine cleaning can with the help of chromatographic methods and Distribution procedure, for example using of aqueous phase systems. To this Processes include adsorption chromium topography, ion exchange chromatography, gel Chromatography and Affinity Chromatography.

Gegebenenfalls kann die isolierte Fructosyltransfe rase auch mittels Adsorption an einem inerten oder an einem elektrisch geladenen, anorganischen oder organischen Trägermaterial immobilisiert werden. Als Trägermaterial kommen anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, Aluminiumoxid, Hydro xylapatit oder verschiedene Metalloxide, natürliche Polymere, beispielsweise Cellulose, Stärke, Algina te, Agarose oder Collagen, oder synthetische Poly mere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methy lacrylat, Nylon oder Oxirane zur Anwendung. Die Im mobilisierung erfolgt dabei durch physikalische Bindungskräfte wie beispielsweise Van-der-Waals- Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische Bindungen. Die Immobilisierung der Fructosylferase kann auch mittels kovalenter Bindung an Trägermate rialien erfolgen. Die Träger müssen dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen können. Geeignete Gruppen sind beispielsweise Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen. Die Oberfläche von porösen Gläsern kann beispielsweise durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Proteinen umgesetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können mit Bromcyan und Carboxy-Gruppen mit Thionylchlorid aktiviert und anschließend mit Enzymen gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit der Immobilisie rung von Fructosyltransferasen besteht im Ein schluss in dreidimensionalen Netzwerken. Ein Vor teil dabei ist, dass die Enzyme innerhalb des Netz werkes in freier, nicht gebundener Form vorliegen. Poren der umgebenden Matrix müssen dabei klein ge nug sein, um das Enzym zurückzuhalten.If necessary, the isolated fructosyltransfe rase also by adsorption on an inert or on an electrically charged, inorganic or organic carrier material can be immobilized. Inorganic materials come as carrier material, such as porous glasses, silica gel, aluminum oxide, hydro xylapatite or various metal oxides, natural Polymers, for example cellulose, starch, algina te, agarose or collagen, or synthetic poly mers, such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, methyl Acrylate, nylon or oxirane for use. The Im mobilization takes place through physical Binding forces such as Van der Waals Forces, hydrophobic interactions and ionic Bonds. Immobilization of fructosylferase can also be covalently bound to carrier mate rialien done. The carriers must be reactive Have groups with amino acid side chains can form homeopolar bonds. suitable Groups are, for example, carboxy, hydroxy and Sulfide groups. The surface of porous glasses can, for example, by treatment with silanes activated and then reacted with proteins become. Hydroxy groups of natural polymers can with cyanogen bromide and carboxy groups with thionyl chloride activated and then coupled with enzymes become. Another possibility of immobilization Fructosyltransferases consist of one in three-dimensional networks. A before part of it is that the enzymes within the network works are available in free, not bound form. Pores of the surrounding matrix must be small be enough to hold back the enzyme.

Nach der Gewinnung der Fructosyltransferase aus den erfindungsgemäßen Wirtszellen, entweder als Rohex trakt, in hoch aufgereinigter Form und/oder in im mobilisierter Form an einem festen Träger wird eine Saccharoselösung unter geeigneten Bedingungen mit dem isolierten Enzym behandelt, wobei in vitro ein Polyfructan gebildet wird. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugs weise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeig neten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen. Anschließend wird das gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt.After obtaining the fructosyltransferase from the host cells according to the invention, either as Rohex tract, in highly purified form and / or in mobilized form on a solid support becomes a Sucrose solution under suitable conditions with treated the isolated enzyme, being an in vitro Polyfructan is formed. Suitable conditions include a suitable temperature, preferably as 30 ° C, a suitable pH value, a suitable neten buffer and suitable substrate concentrations. Then the polyfructan formed from the The reaction mixture is isolated and purified.

Die Erfindung betrifft ebenfalls das mit Hilfe der vorstehend genannten Verfahren hergestellte hochmo lekulare Polyfructan. Das so hergestellte Polyfruc tan ist durch eine vorwiegend lineare Struktur ge kennzeichnet, wobei innerhalb der Kette Fructose- Einheiten durch β-1,2-Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette als Abschluss eine nicht reduzierende α-D-Glucose-Einheit trägt. Das Po lyfructan zeichnet sich durch einen sehr hohen Po lymerisationsgrad von < 100 und einen sehr niedrigen Verzweigungsgrad von < 3% aus. Aufgrund der gerin gen Verzweigung enthält das so hergestellte Po lyfructan nur sehr wenige endständige Glucose- Einheiten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Po lyfructan um Inulin, das durch ein hohes Molekular gewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton gekennzeichnet ist.The invention also relates to the hochmo lecular polyfructan. The polyfruc so produced Tan is characterized by a predominantly linear structure indicates, with fructose- within the chain Units are linked by β-1,2 bonds and with the chain as a conclusion not one reducing α-D-glucose unit carries. The bottom lyfructan is characterized by a very high bottom Degree of polymerization of <100 and a very low one Degree of branching of <3%. Because of the gerin the bum thus produced contains branching lyfructan very few terminal glucose Units. It is preferably the bottom lyfructan to inulin by a high molecular weight weight of more than 1.5 million Daltons is.

Aufgrund des geringen Glucose-Gehaltes kann das er findungsgemäß hergestellte Polyfructan, insbesonde re Inulin, zur Herstellung von Fructooligosacchari den verwendet werden, die sich als diätisches Le bensmittel eignen.Because of the low glucose content, he can Polyfructan produced in accordance with the invention, in particular re inulin, for the production of fructooligosacchari used as a dietary le suitable for food.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be trifft daher auch Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden. In einer besonders bevor zugten Ausführungsform der Erfindung wird das er findungsgemäß hergestellte Inulin unter geeigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten geeigneten Endo-Inulinase behandelt und anschließend werden die erzeugten Fructooligo saccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt. Erfindungsgemäß wird unter einer "En do-Inulinase" eine 2,1-β-D-Fructan-Fructanhydrolase verstanden, das den Abbau von Inulin zu Fructooli gosacchariden katalysiert, wobei die enzymatische Wirkung insbesondere innerhalb der Polymerkette er folgt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Fructooligosacchariden Saccharide verstanden, die aus 2 bis 10 Fructoseeinheiten be stehen, die β-glycosidisch miteinander verbunden sind. Die verwendete Endo-Inulinase kann dabei in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen. Die Immobilisierung der Endo-Inulinase kann dabei so erfolgen, wie vorstehend für die er findungsgemäße Fructosyltransferase beschrieben. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH- Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Sub stratkonzentrationen.A preferred embodiment of the invention be therefore also applies to processes for the production of Fructooligosaccharides. In a particularly before preferred embodiment of the invention, he will Inulin produced according to the invention under suitable Conditions with an immobilized or non- immobilized suitable endo-inulinase treated and then the generated fructooligo saccharide isolated from the reaction mixture and purified. According to the invention under an "En do-inulinase "is a 2,1-β-D-fructan fructan hydrolase understood that the breakdown of inulin to fructooli Catalyzed gosaccharides, the enzymatic Effect especially within the polymer chain follows. In connection with the present invention are among fructooligosaccharides saccharides understood that be from 2 to 10 fructose units stand, the β-glycosidically linked are. The endo-inulinase used can be in immobilized or non-immobilized form available. Immobilization of endo-inulinase can be done as above for which he fructosyltransferase according to the invention. Suitable conditions include a suitable one Temperature, preferably 30 ° C, a suitable pH Value, a suitable buffer and suitable sub stratkonzentrationen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Fructooligosacchari den ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung in vitro unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten oder nicht-immobilisierten Fructosyltransferase und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem in vitro Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.In a further preferred embodiment of the Process for making fructooligosacchari It is envisaged that a sucrose solution in in vitro under suitable conditions simultaneously with an immobilized manufactured according to the invention or non-immobilized fructosyltransferase and an immobilized or non-immobilized Endo-inulinase is treated and then the generated fructooligosaccharides from the in vitro Reaction approach isolated and purified.

Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Fructooligo saccharide, die nach einem der vorstehend genannten Verfahren hergestellt wurden. Die mit Hilfe des er findungsgemäßen Verfahrens hergestellten Fructooli gosaccharide zeichnen sich insbesondere durch einen sehr niedrigen Glucose-Gehalt aus und sind daher in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel, insbe sondere für Diabetiker, geeignet. Während Fructoo ligosaccharide, die aus Inulin von Topinambur her gestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 14 bis 20% aufweisen und Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Zichorien hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 10% enthalten, besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide einen Glucosegehalt von weniger als 3%, vorzugs weise von weniger als 1%.The invention therefore also relates to fructooligo saccharide, according to any of the above Processes were made. With the help of the he Fructooli produced according to the method gosaccharides are particularly characterized by a very low glucose content and are therefore in especially as a dietary food, esp especially suitable for diabetics. During Fructoo ligosaccharides made from inulin from Jerusalem artichoke a glucose content of about 14 have up to 20% and fructooligosaccharides, the made from chicory inulin, one Contain glucose content of about 10%, have Fructooligosaccharides produced according to the invention a glucose content of less than 3%, preferably less than 1%.

Die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosac charide können darüber hinaus einer Hydrierung un terworfen werden, wobei hydrierte Fructooligosac charide hergestellt werden, die sich ebenfalls in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel eignen. Die Hydrierung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide kann beispielsweise unter An wendung höherer Drücke und Verwendung von Katalysa toren erfolgen.The fructooligosac prepared according to the invention Charides can also be hydrogenated be thrown, being hydrogenated fructooligosac charide that are also manufactured in Particularly suitable as a dietary food. The hydrogenation of those produced according to the invention Fructooligosaccharides can, for example, under An application of higher pressures and use of catalytic converter goals.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Ver fahren zur Herstellung von Difruktosedianhydriden. Difructosedianhydride sind als Nahrungsmittelzusatz von besonderem Interesse, da sie im Dünndarm unver daulich sind und im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhal tig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand bei tragen.Finally, the present invention relates to Ver drive to the production of difructose dianhydrides. Difructosedianhydride are as a food additive of particular interest, since they are not found in the small intestine are at home and pronounced in the large intestine Develop prebiotic effects and thereby sustained contributes to a healthy intestinal flora and intestinal wall wear.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgese hen, dass erfindungsgemäß hergestelltes Inulin un ter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo- Inulinase und immobilsierten oder nicht- immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird. Dabei katalysiert die Endo-Inulinase, wie vorstehend ausgeführt, die Umwandlung von Inulin in Fructooligo saccharide. Diese werden anschließend durch die Inulinfructotransferase von A. globiformis oder A. ureafaciens (Seki et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442) umgewandelt. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung liegen die Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens in immobilisierter Form vor. Zur Immobilisierung der Mikroorganismen können kul tivierte inaktivierte Zellen nach geeigneter Copo lymerisation, beispielsweise unter Zugabe eines neutralen Proteins und Vernetzung mit Glutardialde hyd, direkt als Biokatalysatoren verwendet werden. Ebenso ist es möglich, vitale Mikroorganismen in Polymere, zum Beispiel Carrageen, einzuschließen und anschließend eine Inkubation in einem geeigne ten Nährmedium durchzuführen. Die Polymerpartikel können dann für den eigentlichen Prozess eingesetzt und gegebenenfalls durch erneute Inkubation auch wieder regeneriert werden. Ebenso besteht die Mög lichkeit, Mikroorganismen in Form photovernetzter Polymere zu verwenden, wobei eine Mikroorganismen- Suspension mit den löslichen Präpolymeren in dünner Schicht durch Bestrahlung mit beispielsweise einer Tageslichtlampe polymerisiert wird.In one embodiment of the invention, it is provided hen that inulin produced according to the invention un suitable conditions simultaneously with a immobilized or non-immobilized endo- Inulinase and immobilized or non- immobilized cells from Arthrobacter globiformis or Arthrobacter ureafaciens is treated. there catalyzes the endo-inulinase, as stated above, the conversion of inulin to fructooligo saccharides. These are then replaced by the A. globiformis or A. inulin fructotransferase ureafaciens (Seki et al., Starch / Starke, 40 (1988), 440-442). According to an advantageous The cells of A. globiformis lie in an embodiment or A. ureafaciens in immobilized form. To immobilize the microorganisms, cul activated inactivated cells after suitable copo lymerization, for example with the addition of a neutral protein and cross-linking with glutardialde hyd, can be used directly as biocatalysts. It is also possible to inject vital microorganisms Include polymers, for example carrageenan and then an incubation in a suitable nutrient medium. The polymer particles can then be used for the actual process and possibly also by renewed incubation be regenerated again. There is also the possibility microorganisms in the form of photocrosslinked To use polymers, where a microorganism Suspension with the soluble prepolymers in thin Layer by irradiation with, for example, a Daylight lamp is polymerized.

Geeignete Bedingungen zur Herstellung von Difructo sedianhydriden umfassen dabei eine geeignete Tempe ratur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkon zentrationen.Suitable conditions for making difructo Sedian hydrides include a suitable temperature temperature, preferably 30 ° C, a suitable pH, a suitable buffer and suitable substrate con concentrations.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfah rens zur Herstellung von Difructosedianhydriden sieht vor, dass eine Saccharoselösung gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten erfindungsgemäßen Fructosyltransfe rase, einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedian hydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufge reinigt werden.Another preferred embodiment of the method rens for the production of difructose dianhydrides provides for a sucrose solution at the same time with an immobilized or non- immobilized fructosyl transfer according to the invention lawn, an immobilized or non- immobilized endo-inulinase and immobilized or non-immobilized cells from Arthrobacter treated globiformis or Arthrobacter ureafaciens and then the generated difructosedian hydrides isolated from the reaction mixture and opened be cleaned.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Inu lins in verschiedenen Non-Food-Anwendungen vorgese hen. Dabei wird das erfindungsgemäß hergestellte Inulin entsprechenden Derivatisierungs-Reaktionen unterworfen, wobei Inulinether und Inulinester her gestellt werden. Die so hergestellten Inulinether und Inulinester können beispielsweise als polymere Tenside, Weichmacher oder Emulgatoren eingesetzt werden.In further embodiments of the invention Use of the Inu produced according to the invention Lins in various non-food applications hen. The manufactured according to the invention Inulin corresponding derivatization reactions subjected to inulin ether and inulin ester be put. The inulin ethers thus produced and inulin esters can be used, for example, as polymers Surfactants, plasticizers or emulsifiers used become.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Verwen dung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligo saccharide, der erfindungsgemäß hergestellten hyd rierten Fructooligosaccharide und der erfindungsge mäß hergestellten Difructosedianhydride als Lebens mittelzusatz, diätisches Lebensmittel und als Tier futterzusatz vor.The present invention further provides uses tion of the fructooligo produced according to the invention saccharide, the hyd fructooligosaccharides and the fiction made difructosedianhydride as life additive, dietary food and as an animal feed additive before.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vor liegende Erfindung näher erläutern, sollen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken. The following figures and examples are intended to illustrate the explain the present invention, but should do not limit the scope of the invention.

Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE113, dass das vollständige Fructosyltransferase (ftf)-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz im L- Rhamnose-induzierbaren Escherichia coli- Expressionsvektor pJOE2702 enthält. Fig. 1 shows a restriction map of the plasmid pDHE113 that the complete fructosyltransferase (ftf) gene from Streptococcus mutans DSM20523 with that shown in SEQ ID NO. 1 nucleic acid in the L- rhamnose-inducible Escherichia coli expression vector pJOE2702 contains.

Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE225, dass das modifizierte Fructosyltransfera se-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ4 → 222) mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nuc leinsäuresequenz, das am 5'-Ende um 219 Nucleotide verkürzt ist, im Expressionsvektor pJOE2702 ent hält. FIG. 2 shows a restriction map of the plasmid pDHE225 that the modified fructosyltransferase gene from Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ4 → 222) with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 3 is shortened by 219 nucleotides at the 5 'end , contains in the expression vector pJOE2702.

Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH171, dass das Fusionsgen lacZα (1 → 83):: ftf (105 → 2388) mit der in SEQ ID NR. 5 gezeigten Nuclein säuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fusionsgen 83 Nucleotide des lacZα-Gens vom Vektor pBluescript II KS+ und ein modifizier tes, am 5'-Ende um 104 Nucleotide verkürztes Fruc tosyltransferasegen aus Streptococcus mutans DSM20523 umfasst. Fig. 3 shows a restriction map of plasmid pDH171 that the fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388) with the in SEQ ID NO. 5 contains the nucleic acid sequence shown in the expression vector pJOE2702, the fusion gene comprising 83 nucleotides of the lacZα gene from the vector pBluescript II KS + and a modified fructosyltransferase gene from Streptococcus mutans DSM20523 shortened by 104 nucleotides at the 5 'end.

Fig. 4 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH132, dass das modifizierte Fructosyltransferase gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Nuc leinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 ent hält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Dele tion der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist. FIG. 4 shows a restriction map of the plasmid pDH132 that the modified fructosyltransferase gene from Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ2254 → 2385) with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 7 in the expression vector pJOE2702, the fructotide transcription gene containing a deluctosyltransferase gene 2254 to 2385.

Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE172, dass das modifizierte Fructosyltransfera segen ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expres sionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructo syltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 sowie der Nucleotide 2254 bis 2385 auf weist. Fig. 5 shows a restriction map of the plasmid pDHE172 that the modified Fructosyltransfera ftf beneficial (Δ4 → 222 Δ2254 → 2385) having the sion vector in SEQ ID NO. Nucleic acid sequence shown 9 in Expres pJOE2702, wherein the fructo syltransferasegen a deletion of nucleotides 4 to 222 and nucleotides 2254 to 2385.

Fig. 6 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE143, dass das Fusionsgen lacZα (1 → 83):: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) mit der in SEQ ID Nr. 11 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressions vektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltrans ferasegen eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist und wobei der deletierte 5'-Bereich an 83 Nucleotide des lacZα-Gens fusioniert ist. Fig. 6 shows a restriction map of the plasmid pDHE143 that the fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 11 in the expression vector pJOE2702, the fructosyltrans ferasegen has a deletion of nucleotides 1 to 104 and nucleotides 2254 to 2385 and wherein the deleted 5 'region is fused to 83 nucleotides of the lacZα gene.

Das zu der erfindungsgemäßen Lehre gehörende Se quenzprotokoll umfasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt die 2388 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523.
SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 795 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 3 zeigt die 2169 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase- Gens ftf (Δ4 → 222).
SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete 722 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines modifizierten Fructosyltransferase-Proteins.
SEQ ID Nr. 5 zeigt die 2367 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Fusionsgens lacZα(1 → 83):: ftf (105 → 2388).
SEQ ID Nr. 6 zeigt die von SEQ ID Nr. 5 abgeleitete 788 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
SEQ ID Nr. 7 zeigt die 2256 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase gens ftf (Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 8 zeigt die aus SEQ ID Nr. 7 abgeleitete 751 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransferase- Proteins.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die 2037 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen modifizierten Fructosyltransferasegens ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 10 zeigt die aus SEQ ID Nr. 9 abgeleite te 678 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz ei nes erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransfe rase-Proteins.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die 2235 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Fusionsgens lacZα (1 → 83):: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385).
SEQ ID Nr. 12 zeigt die aus SEQ ID Nr. 11 abgelei tete 744 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz des Primers ftf1(upper).
SEQ ID Nr. 14 zeigt die Sequenz des Primers ftf2 (lower).
SEQ ID Nr. 15 zeigt die Sequenz des Primers ftf3 (upper).
SEQ ID Nr. 16 zeigt die Sequenz des Primers ftf4 (upper).
SEQ ID Nr. 17 zeigt die Sequenz des Primers ftf5 (upper).
SEQ ID Nr. 18 zeigt die Sequenz des Primers ftf6(lower)The sequence protocol belonging to the teaching according to the invention comprises:
SEQ ID No. 1 shows the 2388 nucleotide DNA sequence of the ftf gene from Streptococcus mutans DSM20523.
SEQ ID No. 2 shows the amino acid sequence comprising 795 amino acids derived from SEQ ID No. 1 of the fructosyltransferase protein according to the invention.
SEQ ID No. 3 shows the 2169 nucleotide DNA sequence of the modified fructosyltransferase gene ftf (Δ4 → 222).
SEQ ID No. 4 shows the 722 amino acid sequence, derived from SEQ ID No. 3, of a modified fructosyltransferase protein.
SEQ ID No. 5 shows the 2367 nucleotide DNA sequence of the fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388).
SEQ ID No. 6 shows the amino acid sequence of 788 amino acids derived from SEQ ID No. 5 of a fusion protein according to the invention.
SEQ ID No. 7 shows the 2256 nucleotide DNA sequence of the modified fructosyltransferase gene ftf (Δ2254 → 2385).
SEQ ID No. 8 shows the amino acid sequence comprising 751 amino acids derived from SEQ ID No. 7 of a fructosyltransferase protein modified according to the invention.
SEQ ID No. 9 shows the 2037 nucleotides DNA sequence of the modified fructosyltransferase gene ftf according to the invention (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385).
SEQ ID No. 10 shows the 678 amino acids sequence of 678 amino acids derived from SEQ ID No. 9 of a fructosyltransferase protein modified according to the invention.
SEQ ID No. 11 shows the 2235 nucleotides DNA sequence of the fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) according to the invention.
SEQ ID No. 12 shows the 744 amino acid sequence derived from SEQ ID No. 11 and comprising an amino acid sequence of a fusion protein according to the invention.
SEQ ID No. 13 shows the sequence of the primer ftf1 (upper).
SEQ ID No. 14 shows the sequence of the primer ftf2 (lower).
SEQ ID No. 15 shows the sequence of the primer ftf3 (upper).
SEQ ID No. 16 shows the sequence of the primer ftf4 (upper).
SEQ ID No. 17 shows the sequence of the primer ftf5 (upper).
SEQ ID No. 18 shows the sequence of the primer ftf6 (lower)

Beispiel 1example 1 Clonierung des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523Cloning of the ftf gene from Streptococcus mutans DSM20523

Zur Clonierung des Fructosyltransferase-Gens aus S. mutans DSM20523 wurde eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, wobei der Primer ftf1(upper) mit der Sequenz: 5'- TATATATCATATGGAAACTAAAGTTAG-3' und der Primer ftf2(lower) mit der Sequenz: 5'- TAGGATCCTTATTTAAAACCAATGCT-3' verwendet wurden. Der Primer ftf1(upper) enthielt dabei eine NdeI- Restriktions-Schnittstelle und der Primer ftf2(lower) enthielt eine BamHI-Restriktions- Schnittstelle. Chromosomale DNA aus S. mutans DSM20523, die mit Hilfe eines kommerziell erhältli chen Reinigungs-Kits isoliert worden war, diente in der PCR-Reaktion als Template. Die PCR-Reaktion wurde in 40 µl Reaktionsvolumen mit je 8 µmol Pri mer, 50 ng DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO₄, 5% Dimethylsulfoxid, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste dabei die folgenden Schritte: 5-minütige Denaturierung bei 96°C, 5 Zyklen, umfassend jeweils eine 1- minütige Denaturierung bei 63°C, eine 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 40°C und eine 2 Minu ten, 30 Sekunden dauernde Polymerisation bei 68°C, 25 weitere Zyklen, umfassend jeweils eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Denaturierung bei 92°C, eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 49°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde Po lymerisation bei 68°C, sowie eine 5-minütige Ab schluss-Polymerisationsreaktion bei 68°C. Mit Hilfe der PCR-Reaktion wurde ein etwa 2,4 kb großes Frag ment amplifiziert. Das isolierte Fragment wurde mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und mit dem Vektor pJOE2702 (Volffet al., Mol. Microbiol., 21 (1996) 1037-1047; Stumpp et al., Biospectrum, 1 (2000) 33-36) ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Die codierende Sequenz des ftf-Gens wurde somit im korrekten Le seraster in die im Vektor enthaltene, L-Rhamnose- induzierbare Expressionskassette cloniert, so dass die Transkription der insertierten Nucleinsäure un ter der Kontrolle des in dem Vektor pJOE2702 ent haltenen Promoters rha_P steht. Die Transkripti onstermination des ftf-Gens und die Translationsi nitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen des Vektors. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resul tierenden Plasmid pDHE113 transformiert. Transfor manten wurden dabei über Ampicillin-Resistenz se lektiert.A polymerase chain reaction (PCR) was carried out for cloning the fructosyltransferase gene from S. mutans DSM20523, the primer ftf1 (upper) with the sequence: 5'-TATATATCATATGGAAACTAAAGTTAG-3 'and the primer ftf2 (lower) with the sequence: 5'- TAGGATCCTTATTTAAAACCAATGCT-3 'were used. The primer ftf1 (upper) contained an NdeI restriction site and the primer ftf2 (lower) contained a BamHI restriction site. Chromosomal DNA from S. mutans DSM20523, which had been isolated using a commercially available cleaning kit, served as a template in the PCR reaction. The PCR reaction was carried out in 40 μl reaction volume, each with 8 μmol primer, 50 ng DNA template and 2.5 units of polymer polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH 8.85, 25 mM KCl, 5 mM ( NH ₄ ) SO ₄ , 2 mM MgSO ₄ , 5% dimethyl sulfoxide, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dGTP and 0.2 mM dCTP. The PCR reaction involved the following steps: 5-minute denaturation at 96 ° C, 5 cycles, each comprising a 1-minute denaturation at 63 ° C, a 30-second primer addition at 40 ° C and a 2 minute, 30 Polymerization lasting for seconds at 68 ° C, 25 further cycles, each comprising a 1 minute, 30 second denaturation at 92 ° C, a 1 minute, 30 second primer addition at 49 ° C and a 2 minute, 30 second polymerisation 68 ° C, and a 5-minute final polymerization reaction at 68 ° C. An approximately 2.4 kb fragment was amplified using the PCR reaction. The isolated fragment was digested with the NdeI and BamHI restrictionases and ligated with the vector pJOE2702 (Volff et al., Mol. Microbiol., 21 (1996) 1037-1047; Stumpp et al., Biospectrum, 1 (2000) 33-36) which had been cleaved with the same restrictionases. The coding sequence of the ftf gene was thus cloned in the correct reading frame into the L-rhamnose-inducible expression cassette contained in the vector, so that the transcription of the inserted nucleic acid is under the control of the promoter rha _{P contained} in the vector pJOE2702. The transcription termination of the ftf gene and the translation initiation of the transcripts also take place via sequences of the vector. The E. coli strain JM109 was then transformed with the plasmid pDHE113 resulting from the ligation. Transformants were selected for ampicillin resistance.

Beispiel 2Example 2 Modifikationen des clonierten ftf-Gens aus Strepto coccus mutans DSM20523Modifications of the cloned ftf gene from Strepto coccus mutans DSM20523

Zur Modifizierung des ftf-Genproduktes im Bereich des N-terminalen Signalpeptides wurden am 5'-OH- Ende des ftf-Gens Deletionen eingeführt oder Se quenzbereiche ausgetauscht.To modify the ftf gene product in the area of the N-terminal signal peptide were 5'-OH- End of ftf gene introduced deletions or Se frequency ranges exchanged.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera se-Gens ftf (Δ4 → 222) wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf3(upper) mit der Sequenz: 5'- TATATATCATATGGAAACTCCATCAACAAATCCCG-3' und dem Pri mer ftf2(lower) durchgeführt. Der Primer ftf3 (up per) enthält eine NdeI-Schnittstelle. Als Template wurde gereinigte DNA des Plasmides pDHE113, dass das clonierte vollständige ftf-Gen aus S. mutans DSM20523 enthält, verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in 40 µl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 100 ng Plasmid-DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste die folgenden Schritte: eine 2-minütige Denaturierung bei 94°C, 25 Zyklen, um fassend jeweils eine 1-minütige Denaturierung bei 93°C, eine Primeranlagerung für 1 Minute 30 Sekun den bei 55°C und eine Polymerisation für 2 Minuten 20 Sekunden bei 68°C, und eine 5-minütige Ab schlusspolymerisation bei 68°C. Das erhaltene, etwa 2,2 kb-PCR-Produkt wurde isoliert, mit NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE225 transformiert. Das Genprodukt der Variante ftf(Δ1 → 222) ist gegenüber der Wildtyp- Sequenz am N-Terminus um 73 Aminosäuren verkürzt.To generate the modified fructosyltransferase gene ftf (Δ4 → 222), a PCR reaction with the primer ftf3 (upper) was carried out with the sequence: 5'-TATATATCATATGGAAACTCCATCAACAAATCCCG-3 'and the primer ftf2 (lower). The primer ftf3 (up per) contains an NdeI interface. Purified DNA of the plasmid pDHE113, which contains the cloned complete ftf gene from S. mutans DSM20523, was used as template. The PCR reaction was carried out in 40 μl reaction volume with 8 pmol primer, 100 ng plasmid DNA template and 2.5 units Pwo polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH 8.85, 25 mM KCl, 5 mM (NH ₄ ) SO ₄ , 2mM MgSO ₄ , 0.2mM dATP, 0.2mM dTTP, 0.2mM dGTP and 0.2mM dCTP. The PCR reaction comprised the following steps: a 2-minute denaturation at 94 ° C, 25 cycles, each comprising a 1-minute denaturation at 93 ° C, a primer attachment for 1 minute 30 seconds at 55 ° C and a polymerization for 2 minutes 20 seconds at 68 ° C, and a 5-minute final polymerization at 68 ° C. The approximately 2.2 kb PCR product obtained was isolated, digested with NdeI and BamHI and ligated into the vector pJOE2702, which had been digested with the same restriction enzymes. The E. coli strain JM109 was then transformed with the plasmid pDHE225 resulting from the ligation. The gene product of the variant ftf (Δ1 → 222) is shortened by 73 amino acids compared to the wild-type sequence at the N-terminus.

Zur Erzeugung des modifizierten Fusionsgens lacZα (1 → 83):: ftf(105 → 2388) wurde eine PCR- Reaktion mit dem Primer ftf4(upper) mit der Se quenz: 5'-ATATATGTCGACGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3' und dem Primer ftf2(lower) durchgeführt. Der Primer ftf4(upper) enthält eine SalI-Schnittstelle. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet, das eine Insertion des vollstän digen ftf-Gens aus S. mutans DSM20523 enthält. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie vorstehend be schrieben. Das erhaltene, etwa 2,3 kb größe PCR- Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen SalI und BamHI gespalten und in den Vektor pBluescript II KS+ cloniert, wobei der verkürzte ftf-Leserahmen am 5'-Ende mit dem Anfangsbereich des im Vektor enthaltenen lacZα-Leserahmens fusioniert wurde. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem resultierenden Plasmid pDHE166 transformiert. In einem zweiten PCR-Schritt wurde das in dem Vektor pDHE166 enthaltene Fusionsgen lacZα (1 → 83):: ftf (105 → 2388) in den Expressionsvektor pJOE2702 um cloniert. Dazu wurde eine PCR-Reaktion mit dem Pri mer ftf5(upper) mit der Sequenz: 5'- TATATATCATATGACCATGATTACGCCAAGC-3' und dem Primer ftf2(lower) durchgeführt. Der Primer ftf5(upper) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase NdeI. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE166 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Das erhaltene etwa 2,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Li gierung resultierenden Plasmid pDHE171 transfor miert.To generate the modified fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388) a PCR was Reaction with the primer ftf4 (upper) with the Se quenz: 5'-ATATATGTCGACGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3 'and the primer ftf2 (lower). The primer ftf4 (upper) contains a SalI interface. As The template was a purified DNA of the plasmid pDHE113 uses an insertion of the complete contains the ftf gene from S. mutans DSM20523. The PCR reaction was carried out as described above wrote. The approximately 2.3 kb PCR Product was isolated with the SalI restrictionases and BamHI cleaved and into the vector pBluescript II KS + cloned, with the shortened ftf reading frame at the 5 'end with the beginning area of the in the vector contained lacZα reading frame was merged. Subsequently the E. coli strain JM109 with the resulting plasmid pDHE166 transformed. In A second PCR step was carried out in the vector pDHE166 contained fusion gene lacZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388) into the expression vector pJOE2702 cloned. A PCR reaction with the Pri mer ftf5 (upper) with the sequence: 5'- TATATATCATATGACCATGATTACGCCAAGC-3 'and the primer ftf2 (lower) performed. The primer ftf5 (upper) contains an interface for the restrictionase Nde. A purified DNA of the Plasmids pDHE166 were used. The PCR reaction was performed as previously described. The received approximately 2.4 kb PCR product was isolated using cleaved the restrictionases NdeI and BamHI and in ligated the vector pJOE2702 to the same Restrictions had been split. Subsequently the E. coli strain JM109 with the from Li resulting plasmid pDHE171 transfor mized.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe rase-Gens ftf (Δ2254 → 2385) wurde der PCR-Pimer ftf6(lower) mit der Sequenz: 5'- TTGGATCCTTATTTTTGAGAAGGTTTGACAG-3' in Kombination mit anderen der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt. Der Primer ftf6(lower) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase BamHI. Als Template wurde die gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchge führt, wie vorstehend beschrieben. Danach wurde das Amplifikationsprodukt isoliert, mit den Restrikta sen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Unter Verwendung der Primerkombination ftf1 (upper/ftf6(lower) wurde so das Plasmid pDHE132 erhalten, das das vorstehend beschriebene modifizierte ftf-Gen enthält.For the production of the modified fructosyltransfe rase gene ftf (Δ2254 → 2385) became the PCR pimer ftf6 (lower) with the sequence: 5'- TTGGATCCTTATTTTTGAGAAGGTTTGACAG-3 'in combination with other of the primers described above used. The primer ftf6 (lower) contains one BamHI restriction site. As The purified DNA of the plasmid was the template pDHE113 used. The PCR reaction was carried out performs as described above. After that it was Amplification product isolated, with the restriction sen NdeI and BamHI split and into the vector pJOE2702 ligated previously with the same Restrictions had been split. Under use the primer combination ftf1 (upper / ftf6 (lower) thus obtained the plasmid pDHE132 which does the above contains the modified ftf gene described.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera se-Gens ftf(Δ4 → 222, Δ2254 → 2385) wurde unter Ver wendung der DNA des Plasmides pDHE113 als Template und den Primern ftf3(upper) und ftf6(lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Nach Integration des Amplifikationsproduktes in den Vektor pJOE2702 wur de das Plasmid pDHE172 erhalten.To create the modified Fructosyltransfera se gene ftf (Δ4 → 222, Δ2254 → 2385) was calculated under Ver Use of the DNA of the plasmid pDHE113 as a template and primers ftf3 (upper) and ftf6 (lower) one PCR reaction performed. After integrating the Amplification product in the vector pJOE2702 was de received the plasmid pDHE172.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe rase-Gens lcZα(1 → 83):: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) wurde unter Verwendung der DNA des Vektor pDHE113 und der Primer ftf4(upper) und ftf6(lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Das erhaltene, etwa 2,2 kb große PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen SalI und BamHI in den Vektor Bluescript II KS+ in tegriert. Dabei wurde das Plasmid pDHE140 erhalten. Anschließend wurde eine zweite PCR-Reaktion durch geführt, wobei die Primer ftf5(upper) und ftf6(lower) sowie die DNA des Plasmides pDHE140 als Template verwendet wurden. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Dabei wurde das Plasmid pDHE143 erhalten. For the production of the modified fructosyltransfe rase gene lcZα (1 → 83) :: ftf (105 → 2388, Δ2254 → 2385) was generated using the DNA of the vector pDHE113 and the primers ftf4 (upper) and ftf6 (lower) one PCR reaction performed. The obtained, about 2.2 kb large PCR product was made via the interfaces SalI and BamHI in the vector Bluescript II KS + in tegriert. The plasmid pDHE140 was obtained. A second PCR reaction was then carried out led, with the primers ftf5 (upper) and ftf6 (lower) and the DNA of the plasmid pDHE140 as Template were used. The resultant, about 2.3 kb large PCR product was isolated using the Restrictionases NdeI and BamHI cleaved and into the Vector pJOE2702 ligated previously with the same Restrictions had been split. It was Obtain plasmid pDHE143.

Beispiel 3Example 3 Heterologe Expression der verschiedenen Varianten des ftf-Gens in E. coliHeterologous expression of the different variants of the ftf gene in E. coli

Zum Nachweis der Genprodukte in Rohextrakten des zur Expression verwendeten E. coli-Stammes JM109 wurden E. coli-Stämme, die eines der vorstehend hergestellten Plasmide beziehungsweise das Plasmid pJOE2702 zur Kontrolle enthielten, kultiviert und induziert. Die Stämme wurden die Nacht über in 5 ml dYT-Vollmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), CSH Labora tory Press, Cold Spring Harbor, New. York) mit 100 µg Ampicillin/ml bei 30°C im Brutroller vorkulti viert. Mit der Übernachtkultur wurden je 50 ml dYT- Medium so angeimpft, dass die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) etwa 0,02 betrug. Dann wurden die Zellen in Erlenmeyerkolben auf dem Brutschüttler bis zu einer OD₆₀₀ von 0,2 kultiviert. Zur Indukaion des mit L-Rhamnose induzierbaren Promoters wurden 0,2% (Gew./Vol.) L-Rhamnose zum Medium gegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 7 Stunden kultiviert. Nach der 7-stündigen Induktion wurden die Zellen mittels Zentrifugation, Waschen der Zel len in 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄-Puffer, pH-Wert 6,5, und anschließender Resuspension der Zellen in dem glei chen Puffer geerntet. Danach wurde die Suspension auf einen OD₆₀₀-Wert von 10 eingestellt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbehandlung oder mittels French-Press-Behandlung aufgeschlossen. Anschlie ßend wurden alle Extrakte mittels einer 20- minütigen Zentrifugation bei 10 000 × g behandelt. To detect the gene products in crude extracts of the E. coli strain JM109 used for expression, E. coli strains which contained one of the plasmids prepared above or the plasmid pJOE2702 for control purposes were cultivated and induced. The strains were overnight in 5 ml dYT complete medium (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) with 100 µg ampicillin / ml pre-cultivated in a brooder at 30 ° C. 50 ml of dYT medium were inoculated with the overnight culture in such a way that the optical density at 600 nm (OD ₆₀₀ ) was approximately 0.02. The cells were then cultivated in Erlenmeyer flasks on an incubator shaker to an OD ₆₀₀ of 0.2. To inducion the L-rhamnose inducible promoter, 0.2% (w / v) L-rhamnose was added to the medium. The cells were then cultivated for a further 7 hours. After the 7-hour induction, the cells were harvested by centrifugation, washing the cells in 50 mM KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ buffer, pH 6.5, and then resuspending the cells in the same buffer. The suspension was then adjusted to an OD ₆₀₀ value of 10. The cells were disrupted by ultrasound treatment or by French press treatment. All extracts were then treated by centrifugation at 10,000 × g for 20 minutes.

Danach wurde der Gesamt-Proteingehalt nach Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) be stimmt, wobei ein Rinderserumalbumin-kalibriertes Reagenz von Biorad (Biorad-Laboratories GmbH, Mün chen) verwendet wurde. Zum Vergleich der Protein muster der erhaltenen Rohextrakte mit dem Protein muster der nicht-induzierten Kontrolle wurden die Extrakte elektrophoretisch in 7,5%igen SDS- Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt (Laemmli, Nature, 227 (1979) 680-685).After that, the total protein content was according to Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) true, with a calf serum albumin calibrated Reagent from Biorad (Biorad-Laboratories GmbH, Mün chen) was used. To compare the protein Sample of the crude extracts obtained with the protein patterns of non-induced control were the Extracts electrophoretically in 7.5% SDS Polyacrylamide gels separated (Laemmli, Nature, 227 (1979) 680-685).

Die quantitative Bestimmung der Ftf-Aktivitäten er folgte, indem die spezifischen Ftf-Aktivitäten in Rohextrakten gemessen wurden. Zellkultivierung, Zellaufschluss und die Herstellung der Rohextrakte wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Da bei jedem Umsatz von einem Molekül Saccharose je weils ein Molekül Glucose freigesetzt wird, wurde die Aktivität ermittelt, indem die pro Zeiteinheit freigesetzte Glucose-Menge ermittelt wurde. Die Be stimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 30°C unter Verwendung einer etwa 1 bis 3 mE Fructosyltransferase enthal tenden Rohextraktmenge in einem Volumen von 1 ml mit 100 mM Scr in 50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 6,5. Eine Einheit entspricht dabei der Freisetzung von 1 µmol Glucose pro Minute in Gegenwart von 100 mM Saccharose bei 30°C und einem pH-Wert von 6,5. Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Reak tion durch 10-minütiges Erhitzen bei 100°C beendet. Danach erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g. Anschließend wurde in einem 100 µl- Aliquot die freigesetzte Glucose-Menge mit Hilfe des gekoppelten Glucoseoxidase (GOD)/Peroxidase (POD)-Enzymtests (Werner et al., Z. Analyt. Chem., 252 (1970) 224-228) bestimmt. Dabei wurde der GOD- Perid®-Test (Roche Diagnostics) verwendet, bei dem photometrisch die Oxidation des Farbstoffs 2,2'- Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (ABTS®) nachgewiesen wird. Der Test wurde in einem Gesamt volumen von 1 ml mit 80 µg/ml GOD, 10 µg/ml POD und 1 µg/ml ABTS® in 50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH-Wert 6,5, durchgeführt, wobei nach 30 Minuten die Ex tinktion bei 578 nm gemessen wurde. Die Kalibrie rung des Testes erfolgte mit Hilfe von Glucose- Standardlösungen. Die für die Rohextrakte der ver schiedenen Expressionsstämme ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. The quantitative determination of the Ftf activities was done by measuring the specific Ftf activities in raw extracts. Cell cultivation, cell disruption and the preparation of the crude extracts were carried out as described above. Since each molecule of sucrose releases one molecule of glucose at each conversion, the activity was determined by determining the amount of glucose released per unit of time. The Ftf activities were determined over a period of 60 minutes at 30 ° C. using a crude extract amount containing about 1 to 3 mU of fructosyltransferase in a volume of 1 ml with 100 mM Scr in 50 mM K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ buffer, pH 6.5. One unit corresponds to the release of 1 µmol of glucose per minute in the presence of 100 mM sucrose at 30 ° C and a pH of 6.5. After an hour's incubation, the reaction was terminated by heating at 100 ° C for 10 minutes. This was followed by centrifugation at 10,000 × g for 10 minutes. The amount of glucose released was then determined in a 100 μl aliquot using the coupled glucose oxidase (GOD) / peroxidase (POD) enzyme test (Werner et al., Z. Analyt. Chem., 252 (1970) 224-228) , The GOD-Perid® test (Roche Diagnostics) was used, in which the oxidation of the dye 2,2'-azino-di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonate) (ABTS®) is detected photometrically. The test was carried out in a total volume of 1 ml with 80 µg / ml GOD, 10 µg / ml POD and 1 µg / ml ABTS® in 50 mM K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ buffer, pH 6.5 , carried out, the extinction being measured at 578 nm after 30 minutes. The test was calibrated using standard glucose solutions. The results obtained for the crude extracts of the different expression strains are summarized in Table 1.

Tabelle 1Table 1

Spezifische Ftf-Aktivitäten im Rohextrakt von E. coli- Stämmen, die mit den erfindungsgemäßen Plasmiden trans formiert wurden.
Specific Ftf activities in the crude extract of E. coli strains which were transformed with the plasmids according to the invention.

Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigen E. coli- Stämme, die mit einem im Vektor pJOE2702 enthalte nen, erfindungsgemäßen ftf-Nucleotidmolekül trans formiert sind, nach einer Induktionsdauer von 6 h gegenüber dem E. coli-Stamm, der das vollständige ftf-Gen enthält, ein deutlich erhöhte Zelldichte, d. h. das Wachstum dieser Stämme ist somit deutlich verbessert. Gleichzeitig ist auch die Volumenaus beute des exprimierten Proteins gegenüber dem E. coli-Stamm mit dem vollständigen ftf-Gen deutlich erhöht.As can be seen from the table, E. coli Strains containing one in the vector pJOE2702 NEN, ftf nucleotide molecule according to the invention trans are formed after an induction period of 6 h against the E. coli strain, which is the complete ftf gene contains a significantly increased cell density, d. H. the growth of these strains is therefore clear improved. At the same time, the volume is also off prey of the expressed protein against E. coli strain with the full ftf gene clearly elevated.

Beispiel 4Example 4 Isolierung und Immobilisierung der Fructosyltrans feraseIsolation and immobilization of the fructosyltrans transferase Vorkultur 1Pre-culture 1

5 ml Medium (pro 1000 ml Wasser, pH 7,0, 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 100 mg Ampicillin) wurden mit dem Stamm E. coli JM109 (pDHE143) beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert.5 ml medium (per 1000 ml water, pH 7.0, 16 g tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl and 100 mg ampicillin) were with the strain E. coli JM109 (pDHE143) inoculated and 12 to 15 hours Incubated at 37 ° C with shaking (150 rpm).

Vorkultur 2Pre-culture 2

200 ml des gleichen Mediums wurden mit 1 ml der Vorkultur 1 beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert.200 ml of the same medium were mixed with Inoculated 1 ml of the preculture 1 and 12 to 15 hours incubated at 37 ° C with shaking.

Kultivierung im Fermenter und Expression der Fruc tosyltransferaseCultivation in the fermenter and expression of the Fruc tosyltransferase

16 l Medium, dem 0,2% L-Rhamnose zur Expression der Fructosyltransferase zugesetzt worden waren, wurden mit 200 ml Vorkultur 2 beimpft und bei 30°C, 400 Upm und 0,5 vvm Luft etwa 12 Stunden, das heißt bis zu einer optischen Dichte (OD₅₇₈) von etwa 0,6 oder mehr kultiviert.16 l of medium to which 0.2% L-rhamnose had been added to express the fructosyltransferase were inoculated with 200 ml of preculture 2 and at 30 ° C., 400 rpm and 0.5 vvm air for about 12 hours, that is to say up to one optical density (OD ₅₇₈ ) of about 0.6 or more.

Zellernte und AufschlussCell harvesting and digestion

Die Zellen wurden mit ei ner kontinuierlichen Zentrifuge, beispielsweise ei ner Contifuge (Heraeus) bei 4°C und 24 300 × g ab zentrifugiert. Die Zellmasse wurde 1-mal mit 2000 ml eines 100 mN-Phosphatpuffers, pH-Wert 6,5, gewa schen und dann in 100 ml Phosphatpuffer resuspen diert. Anschließend wurden die Zellen im Homogeni sator bei 800 bar aufgeschlossen. Danach wurde die Suspension 20 Minuten bei 17 360 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer von dem im Überstand vorliegenden Enzym zu trennen.The cells were covered with egg ner continuous centrifuge, for example egg ner Contifuge (Heraeus) at 4 ° C and 24 300 × g centrifuged. The cell mass was treated once with 2000 ml a 100 mN phosphate buffer, pH 6.5, wt and then resuspend in 100 ml of phosphate buffer diert. The cells were then homogenized opener at 800 bar. After that the Suspension centrifuged for 20 minutes at 17 360 × g, cell debris from that present in the supernatant Separate enzyme.

Immobilisierungimmobilization

Der Rohextrakt wurde zunächst ge friergetrocknet. Vom Lyophylisat wurden 23,6 g (ca. 10 g Protein) in 500 ml 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5, gelöst und nach Zugabe von 100 g EUPERGIT® C (Röhm) 94 Stunden bei Raumtemperatur unter Schüt teln inkubiert. Das Ftf-Immobilisat wurde danach mit 50 mM Phosphatpuffer gewaschen.The crude extract was initially ge freeze dried. 23.6 g (approx. 10 g protein) in 500 ml 1 M phosphate buffer, pH 6.5, dissolved and after adding 100 g EUPERGIT® C (Röhm) 94 hours at room temperature under pouring incubated. The Ftf Immobilisat was then washed with 50 mM phosphate buffer.

Beispiel 5Example 5 Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein zur Polyfruetan-HerstellungImplementation of sucrose with the Ftf protein Polyfruetan production

60 l einer 10%igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden nach Zugabe von 640 E Fructosyltransferase pro Liter Ansatzlösung 28 Stunden bei 30°C unter Rühren inkubiert, wobei ein Rohextrakt des E. coli- Stammes JM109 (pDHE143) verwendet wurde. Anschlie ßend wurde die Lösung einer direkten Ultrafiltrati on (Sartocon Mini; 3 Module mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 100 000 Dalton) ausgesetzt. Das erhaltene Retentat von 4,5 l wurde 2-mal mit jeweils 6 l entsalztem Wasser verdünnt und schließ lich auf 4,5 l konzentriert. Anschließend wurde Inulin mit Isopropanol (Endkonzentration 62 Gew.-%) ausgefällt. Der abgetrennte Niederschlag wurde mit 5 l der gleichen Isopropanol-Lösung gewaschen und anschließend bei 45°C schonend getrocknet. Dabei wurden 0.36 kg eines weißen Produktes mit einem Trockensubstanzgehalt (TS) von 93% erhalten. Bezo gen auf den Saccharoseverbrauch wurde eine Ausbeute von 8,5% erreicht. Das unter Verwendung des HPLC- GPC-Verfahrens ermittelte Molekulargewicht von Inu lin beträgt 40 × 10⁶ g/mol, wobei der Verzweigungs grad 3 Mol% beträgt.60 l of a 10% sucrose solution, pH 6.5, were added after the addition of 640 U fructosyl transferase per liter of batch solution for 28 hours at 30 ° C. with stirring, using a crude extract of the E. coli strain JM109 (pDHE143) , The solution was then subjected to direct ultrafiltration (Sartocon Mini; 3 modules with a molecular retention capacity of 100,000 Daltons). The 4.5 l retentate obtained was diluted twice with 6 l of deionized water and finally concentrated to 4.5 l. Inulin was then precipitated with isopropanol (final concentration 62% by weight). The separated precipitate was washed with 5 l of the same isopropanol solution and then gently dried at 45 ° C. This gave 0.36 kg of a white product with a dry matter content (TS) of 93%. A yield of 8.5% was achieved in relation to sucrose consumption. The molecular weight of inulin, determined using the HPLC-GPC method, is 40 × 10 ⁶ g / mol, the degree of branching being 3 mol%.

Beispiel 7Example 7 Umsetzung von Ftf-Inulin mit Endo-Inulinase zur Herstellung von FructooligosaccharidenImplementation of Ftf inulin with endo-inulinase for Production of fructooligosaccharides

20 g des in Beispiel 6 erhaltenen Ftf-Inulins mit 95% TS wurden nach Herstellung einer 1%igen Lö sung durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C und Ein stellen des pH-Wertes auf 5,0 unter Verwendung von 0,1 molarer Essigsäure mit Endo-Inulinase (0,13 ml/Ansatz; SP 168, Fa. Novo) 8 Stunden bei 50°C un ter Rühren inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C wurden die ge bildeten Fructooligosaccharide mittels Ultrafiltra tion (Sartocon Mini, Modul mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 10 000 Dalton) abgetrennt. Das Permeat enthielt 7,5 g Fructooligosaccharide, während das auf 1 l verdünnte Retentat entsprechend 11,6 g TS enthielt. Anschließend wurde das Retentat nach erneutem Einstellen des pH-Wertes mit Endo- Inulinase bei einem konstanten Enzym/Substrat- Verhältnis inkubiert, wie zuvor beschrieben. Dieser Vorgang wurde insgesamt 5-mal wiederholt. Mittels einer Gelpermeations-Chromatographie wurde in den vereinigten Permeaten die folgende Kettenlängenver teilung bestimmt:
20 g of the Ftf-inulin obtained in Example 6 with 95% TS were after preparing a 1% solution by heating for 15 minutes at 95 ° C. and adjusting the pH to 5.0 using 0.1 molar Acetic acid with endo-inulinase (0.13 ml / batch; SP 168, Novo) incubated for 8 hours at 50 ° C. with stirring. After inactivating the enzyme by heating at 95 ° C. for 15 minutes, the fructooligosaccharides formed were separated by means of ultrafiltration (Sartocon Mini, module with a molecular retention capacity of 10,000 daltons). The permeate contained 7.5 g fructooligosaccharides, while the retentate diluted to 1 l contained 11.6 g TS. The retentate was then incubated with the endo-inulinase at a constant enzyme / substrate ratio, as previously described, after the pH had been adjusted again. This process was repeated 5 times in total. The following chain length distribution was determined in the combined permeates by means of gel permeation chromatography:

Die Kohlenhydratzusammensetzung wurde wie folgt be stimmtThe carbohydrate composition was as follows Right

0,5 ml vereinigte Permeatlösung (1% TS) wurden nach Zugabe von 0,5 ml 1%iger Oxalsäure 2,5 h bei 65°C hydrolysiert. Eine Analyse mittels des HPAEC-Verfahrens zeigte, dass Fructose der einzige Kohlenhydratbaustein war, das heißt bei den iso lierten Oligosacchariden handelt es sich um homoo ligomere Fructooligosaccharide vom Typ F_n mit n = 1-25.0.5 ml of combined permeate solution (1% TS) were hydrolyzed at 65 ° C. for 2.5 hours after the addition of 0.5 ml of 1% oxalic acid. An analysis using the HPAEC method showed that fructose was the only carbohydrate building block, i.e. the isolated oligosaccharides are homoo ligomeric fructooligosaccharides of type F _n with n = 1-25.

Beispiel 8Example 8 Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein und immobilisierter Endo-InulinaseImplementation of sucrose with the Ftf protein and immobilized endo-inulinase

Endo-Inulinase (beispielsweise SP 168; NOVO) wurde wie in Beispiel 5 für Fructosyltransferase be schrieben, an EUPERGIT® C (Röhm) immobilisiert. Zu 1 l einer 10%igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructosyltrans ferase (vergleiche Beispiel 2) und 20 g immobili sierte Endo-Inulinase zugegeben und unter langsamen Rühren inkubiert. Stündlich wurden Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald kei ne Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reakti on beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration entfernt. Mittels Gelpermeati ons-Chromatographie wurde die Zusammensetzung der dabei erhaltenen Produktlösung wie folgt bestimmt:
Endo-inulinase (for example SP 168; NOVO) was, as described in Example 5 for fructosyl transferase, immobilized on EUPERGIT® C (Röhm). To 1 liter of a 10% sucrose solution, pH 6.5, 50 g of immobilized fructosyl transferase (see Example 2) and 20 g of immobilized endo-inulinase were added at 30 ° C. and incubated with slow stirring. Samples were taken every hour and checked for sucrose content. As soon as sucrose was no longer detectable, the reaction was complete and the enzymes were removed from the mixture by filtration. The composition of the product solution obtained was determined as follows by means of gel permeation chromatography:

Gegenüber Beispiel 7 wurden somit Produkte mit ei nem wesentlich höheren Fructosegehalt erhalten.Compared to Example 7, products with egg get a much higher fructose content.

Beispiel 9Example 9 Herstellung von hydrierten FructooligosaccharidenManufacture of hydrogenated fructooligosaccharides

Die in den Beispielen 7 und 8 erhaltenen homooligo meren Fructooligosaccharid-Gemische mit einer Ket tenlänge von DP1-DP25 wurden durch Eindampfen auf jeweils einen Trockensubstanzgehalt von 10% eingestellt. 450 ml jeder Lösung wurden in einem Laborautoklaven in Gegenwart von Raney-Nickel 10 Stunden mit Wasserstoff bei 150 bar und 80°C hyd riert. Die dabei erhaltene Lösung wurde aus dem Autoklaven gepumpt, filtriert und mittels Ionenaus tauscher gereinigt. Eine Analyse zeigte, dass die Lösung (Fructosyl)_n-mannit, (Fructosyl)_n-sorbit (n = 1-24) sowie Mannit und Sorbit, die aus der in der Ausgangslösung vorhandenen Fructose gebildet worden waren, enthielt. Mannit und Sorbit wurden mit Hilfe bekannter Chromatographie-Verfahren abgetrennt, so dass ein aus (Fructosyl)_n-mannit und (Fructosyl)_n- sorbit bestehendes Produkt erhalten wurde.The homooligomeric fructooligosaccharide mixtures obtained in Examples 7 and 8 with a chain length of DP1-DP25 were adjusted by evaporation to a dry matter content of 10% in each case. 450 ml of each solution were hydrogenated in a laboratory autoclave in the presence of Raney nickel for 10 hours with hydrogen at 150 bar and 80 ° C. The solution obtained was pumped out of the autoclave, filtered and purified using an ion exchanger. An analysis showed that the solution contained (fructosyl) _n- mannitol, (fructosyl) _n -sorbitol (n = 1-24) as well as mannitol and sorbitol, which had been formed from the fructose present in the starting solution. Mannitol and sorbitol were separated using known chromatography methods, so that a product consisting of (fructosyl) _n- mannitol and (fructosyl) _n -sorbitol was obtained.

Beispiel 10Example 10 Umsetzung von Saccharose mit Fructosyltransferase, Endo-Inulinase und Arthrobacter ureafaciens zur Bildung von Difructosedianhydrid IIIImplementation of sucrose with fructosyltransferase, Endo-inulinase and Arthrobacter ureafaciens for Formation of difructosedianhydride III

Zellen des Stammes Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 wurden in vier Schüttelkolben mit jeweils 100 ml einer Nährlösung, enthaltend 8 g Zichorien- Inulin (Raftiline®), 2 g Na₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄, 1 g NH₄NO₂, 0,5 g MgSO₄, 0,01 g Fe₂SO₄, 0,03 g CaSO₄, 0,5 g Hefe-Extrakt in entsalztem Wasser, überimpft. Da nach wurde eine 24-stündige Inkubation bei 27°C un ter Schütteln bei 150 Upm durchgeführt. Danach wur den die Zellen mittels Zentrifugation abgeerntet und in Polyvinylalkohol-Gelpartikeln immobilisiert.Cells of the strain Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 were placed in four shake flasks, each with 100 ml of a nutrient solution, containing 8 g chicory inulin (Raftiline®), 2 g Na ₂ HPO ₄ , 1 g KH ₂ PO ₄ , 1 g NH ₄ NO ₂ , 0.5 g MgSO ₄ , 0.01 g Fe ₂ SO ₄ , 0.03 g CaSO ₄ , 0.5 g yeast extract in deionized water, inoculated. A 24-hour incubation was then carried out at 27 ° C. with shaking at 150 rpm. The cells were then harvested by centrifugation and immobilized in polyvinyl alcohol gel particles.

Zu 1 l einer 10%igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructo syltransferase (vergleiche Beispiel 5) und 20 g im mobilisierte Endo-Inulinase sowie immobilisierte A. ureafaciens-Zellen gegeben. Danach wurde bei 30°C unter langsamem Rühren eine Inkubation durchge führt. Es wurden stündlich Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Sac charose mehr nachweisbar war, war die Reaktion be endet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration abgetrennt.To 1 l of a 10% sucrose solution, pH 6.5, 50 g immobilized Fructo were at 30 ° C. syltransferase (see Example 5) and 20 g in mobilized endo-inulinase and immobilized A. ureafaciens cells. Then was at 30 ° C. incubate with slow stirring leads. Samples were taken and opened every hour checked the sucrose content. As soon as no sac charose was more detectable, the reaction was be ends and the enzymes were removed from the batch using Filtration separated.

Eine HPLC-Analyse der erhaltenen Produktlösung zeigte die Bildung von 18 g DFA III. An HPLC analysis of the product solution obtained showed the formation of 18 g DFA III.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleinsäurese quenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, oder einer Nuc leinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 angegebe ne Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nucleinsäu resequenz ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert und in der Nucleinsäu resequenz mindestens eine Deletion im 5'- oder 3'- Bereich aufweist, wobei die Deletion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222,
b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und
c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

1. Nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence shown in SEQ ID No. 1, or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence given in SEQ ID No. 2, the nucleic acid sequence encoding a polypeptide with the activity of a fructosyltransferase and in the nucleic acid has at least one deletion in the 5 'or 3' range, the deletion being selected from the group consisting of:

a) deletion of nucleotides 4 to 222,
b) Deletion of nucleotides 1 to 104 and
c) Deletion of nucleotides 2254 to 2385.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 3 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon;
c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 7 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;
d) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 8 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon;
e) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 9 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;
f) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 angegebene Aminosäuresequenz codiert, o der einem komplementären Strang davon; und
g) einem Nucleinsäuremolekül, das durch Substituti on, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a) bis f) erhältlich ist, oder einem kom plementären Strang davon.

2. The nucleic acid molecule according to claim 1, wherein the nucleic acid sequence is selected from the group consisting of:

a) a nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 3 or a complementary strand thereof;
b) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence given in SEQ ID No. 4 or a complementary strand thereof;
c) a nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 7 or a complementary strand thereof;
d) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence given in SEQ ID No. 8 or a complementary strand thereof;
e) a nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 9 or a complementary strand thereof;
f) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence given in SEQ ID No. 10, or that of a complementary strand thereof; and
g) a nucleic acid molecule which is obtainable by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid molecule according to a) to f), or a complementary strand thereof.

3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wo bei die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest ei nen Bereich eines anderen Gens ersetzt sind.3. Nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, where at which in the 5 'region of the nucleic acid sequence of ftf gene deleted sequences by at least one a region of another gene is replaced.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch Sequenzen des lacZα- Gens ersetzt sind, wobei das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 5 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 6 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon;
c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 11 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder ei nem komplementären Strang davon;
d) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 12 angegebene Aminosäuresequenz codiert, o der einem komplementären Strang davon; und
e) einem Nucleinsäuremolekül, das durch Substituti on, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a) bis d) erhältlich ist, oder einem komple mentären Strang davon.

4. The nucleic acid molecule according to claim 3, wherein the sequences deleted in the 5 'region of the nucleic acid sequence of the ftf gene are replaced by sequences of the lacZα gene, the nucleic acid molecule being selected from the group consisting of:

a) a nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 5 or a complementary strand thereof;
b) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence given in SEQ ID No. 6 or a complementary strand thereof;
c) a nucleic acid molecule with a nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 11 or a complementary strand thereof;
d) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence given in SEQ ID No. 12, or that of a complementary strand thereof; and
e) a nucleic acid molecule which is obtainable by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid molecule according to a) to d), or a complementary strand thereof.

5. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein DNA- oder RNA-Molekül ist.5. Nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 4, which is a DNA or RNA molecule.

6. Vektor, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremo lekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.6. Vector comprising at least one nucleic acid mo lekül according to one of claims 1 to 5.

7. Vektor nach Anspruch 6, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage, Liposom oder Virus ist.7. The vector of claim 6, wherein the vector is a Plasmid, cosmid, bacteriophage, liposome or virus is.

8. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, wobei das mindes tens eine Nucleinsäuremolekül unter der funktionel len Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das in pro- und eukaryontischen Zel len die Transkription einer translatierbaren RNA und/oder die Translation der RNA in ein Polypeptid oder Protein gewährleistet.8. Vector according to claim 6 or 7, wherein the mindes tens one nucleic acid molecule under the functional len control of at least one regulatory element stands in pro- and eukaryotic cells len the transcription of a translatable RNA and / or the translation of the RNA into a polypeptide or protein guaranteed.

9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das mindestens ei ne regulatorische Element ein Promoter, Enhancer, Silencer oder 3'-Transkriptionsterminator ist.9. The vector of claim 8, wherein the at least one egg ne regulatory element a promoter, enhancer, Silencer or 3'-transcription terminator.

10. Vektor nach Anspruch 8 oder 9, wobei das min destens eine regulatorische Element eine Signalse quenz zur Lokalisierung des vom Nucleinsäuremolekül codierten Polypeptids oder Proteins innerhalb be stimmter Zellorganellen, Kompartimente oder im ext razellulären Raum ist.10. Vector according to claim 8 or 9, wherein the min least a regulatory element a signal sequence for the localization of the nucleic acid molecule encoded polypeptide or protein within be certain cell organelles, compartments or in ext is cellular space.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das mindestens eine regulatorische Element vom L- Rhamnose-Operon von Escherichia coli stammt.11. Vector according to one of claims 8 to 10, wherein the at least one regulatory element from the L- Rhamnose operon is from Escherichia coli.

12. Wirtszelle, enthaltend mindestens ein Nuclein säuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 11.12. Host cell containing at least one nuclein acid molecule according to one of claims 1 to 5 or at least one vector according to one of claims 6 until 11.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Wirts zelle eine pro- oder eukaryontische Zelle ist.13. The host cell of claim 12, wherein the host cell is a pro- or eukaryotic cell.

14. Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, ausgewählt aus Bakterien, Hefezellen und Pflanzenzellen.14. Host cell according to claim 12 or 13, selected from bacteria, yeast cells and plant cells.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine Kartof fel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Mani ok- oder Zuckerrüben-Zelle ist. 15. Host cell according to claim 14, which is a Kartof fel, Jerusalem artichoke, artichoke, chicory, mani is ok or beet cell.

16. Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder die mindestens eine Zelle nach Anspruch 15 enthält.16. Plant in at least one of their cells at least one nucleic acid molecule according to one of the Claims 1 to 5 or at least one vector according to one of claims 6 to 10 or at least contains a cell according to claim 15.

17. Pflanze nach Anspruch 16, wobei es sich um eine Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze handelt.17. The plant of claim 16, which is a Potato, Jerusalem artichoke, artichoke, chicory, Cassava or sugar beet plant.

18. Samen, Früchte, Vermehrungsmaterial, Erntemate rial und Pflanzengewebe, das von einer Pflanze nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.18. Seeds, fruits, propagation material, harvest material rial and plant tissue derived from a plant Claim 16 or 17 is available.

19. Protein mit der Aktivität einer Fructosyltrans ferase, das die Umwandlung von Saccharose in ein Polyfructan mit vorwiegend β-2,1-Bindungen kataly siert und durch die Expression eines Nucleinsäure moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhält lich ist.19. Protein with the activity of a fructosyltrans ferase, which is the conversion of sucrose into a Polyfructan with predominantly β-2,1 bonds catalyzed siert and by the expression of a nucleic acid Molecule according to one of claims 1 to 5 is.

20. Protein nach Anspruch 19, das durch Expression in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder in einer Pflanze nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.20. Protein according to claim 19, which by expression in a host cell according to any one of claims 12 to 15 or in a plant according to claim 16 or 17 is available.

21. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach An spruch 19 oder 20 erkennt und bindet.21. Antibody that specifically a protein according to An say 19 or 20 recognizes and binds.

22. Antikörper nach Anspruch 21, der ein monoclona ler, polyclonaler und/oder modifizierter Antikörper ist.22. The antibody of claim 21, which is a monoclona ler, polyclonal and / or modified antibody is.

23. Antikörper, der gegen einen Antikörper nach An spruch 21 oder 22 gerichtet ist. 23. Antibody that is against an antibody according to An saying 21 or 22 is directed.

24. Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanze, umfassend

a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzen zellen mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10,
b) die Integration des in dem Vektor enthaltenen Fructosyltransferase-Gens in das Genom der transformierten Zelle(n), und
c) die Regeneration von intakten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanzen.

24. A method of making a genetically modified polyfructan-producing plant comprising

a) the transformation of one or more plant cells with a vector according to any one of claims 6 to 10,
b) the integration of the fructosyltransferase gene contained in the vector into the genome of the transformed cell (s), and
c) the regeneration of intact plants producing a polyfructan.

25. Verfahren zur Herstellung eines Polyfructans, wobei Wirtszellen gemäß Anspruch 15 oder Pflanzen gemäß Anspruch 16 oder 17 oder Pflanzengewebe gemäß Anspruch 18 unter für die Herstellung des Polyfruc tans geeigneten Bedingungen kultiviert werden, das Polyfructan isoliert und aufgereinigt wird.25. Process for the production of a polyfructan, wherein host cells according to claim 15 or plants according to claim 16 or 17 or plant tissue according to Claim 18 under for the manufacture of the Polyfruc suitable conditions are cultivated, the Polyfructan is isolated and purified.

26. Verfahren zur Herstellung eines Polyfructans, umfassend die folgenden Schritte:

a) Kultivierung und Vermehrung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in einem ge eigneten Nährmedium und unter geeigneten Kultur bedingungen,
b) Aufschluss des erzeugten Zellmaterials mittels geeigneter physikalischer, chemischer und/oder enzymatischer Verfahren und Isolierung und/oder Aufreinigung eines Proteins mit der Aktivität einer Fructosyltransferase entweder als Rohextrakt, in hoch aufgereinigter Form und/oder in immobilisierter Form an einem festen Träger,
c) Behandlung einer Saccharoselösung mit einem bei b) gewonnenen Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase und
d) Isolierung und Aufreinigung des gebildeten Po lyfructans aus dem Reaktionsansatz.

26. A process for producing a polyfructan, comprising the following steps:

a) cultivating and multiplying a host cell according to one of claims 12 to 15 in a suitable nutrient medium and under suitable culture conditions,
b) disruption of the cell material produced by means of suitable physical, chemical and / or enzymatic processes and isolation and / or purification of a protein with the activity of a fructosyltransferase either as a crude extract, in highly purified form and / or in immobilized form on a solid support,
c) treatment of a sucrose solution with a protein obtained in b) with the activity of a fructosyltransferase and
d) isolation and purification of the formed polyfructans from the reaction mixture.

27. Polyfructan, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26.27. Polyfructan made by a process according to claim 25 or 26.

28. Polyfructan nach Anspruch 27, wobei es sich um Inulin mit einem Polymerisationsgrad < 100 und ei nem Verzweigungsgrad ≦ 3% handelt.28. The polyfructan of claim 27, which is Inulin with a degree of polymerization <100 and egg degree of branching ≦ 3%.

29. Verfahren zur Herstellung von Fructooligosac chariden, wobei Inulin nach Anspruch 28 unter ge eigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosacchari de aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgerei nigt werden.29. Process for the production of fructooligosac chariden, wherein inulin according to claim 28 under ge suitable conditions with an immobilized or non-immobilized endo-inulinase is treated and then the generated fructooligosacchari de isolated from the reaction mixture and cleaned up be inclined.

30. Verfahren zur Herstellung von Fructooligosac chariden, wobei eine Saccharose-Lösung unter geeig neten Bedingungen gleichzeitig mit einem immobili sierten oder nicht-immobilisierten Protein nach An spruch 19 oder 20 und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosacchari de aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgerei nigt werden. 30. Process for the preparation of fructooligosac chariden, taking a sucrose solution under appro conditions simultaneously with an immobili based or non-immobilized protein according to An saying 19 or 20 and an immobilized or non-immobilized endo-inulinase is treated and then the generated fructooligosacchari de isolated from the reaction mixture and cleaned up be inclined.

31. Fructooligosaccharide, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 29 oder 30.31. Fructooligosaccharides, made after The method of claim 29 or 30.

32. Hydrierte Fructooligosaccharide, hergestellt durch Hydrierung der Fructooligosaccharide nach An spruch 31.32. Hydrogenated fructooligosaccharides made by hydrogenating the fructooligosaccharides according to An Proverbs 31

33. Verfahren zur Herstellung von Difructosedian hydriden, wobei Inulin nach Anspruch 28 unter ge eigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobi lisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zel len von Arthrobacter globiformes oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die er zeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsan satz isoliert und aufgereinigt werden.33. Process for making difructosedian hydrides, wherein inulin according to claim 28 under ge suitable conditions simultaneously with an immobi lized or non-immobilized endo-inulinase and immobilized or non-immobilized cell len from Arthrobacter globiformes or Arthrobacter ureafaciens is treated and then he generated difructosedianhydrides from the reaction be isolated and cleaned.

34. Verfahren zur Herstellung von Difructosedian hydriden, wobei eine Saccharoselösung gleichzeitig mit einem immobilisierten oder nicht-immobi lisierten Protein nach Anspruch 19 oder 20 und ei ner immobilisierten oder nicht-immobilisierten En do-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immo bilisierten Zellen von Arthrobacter globiformes oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.34. Process for making difructosedian hydrides, taking a sucrose solution at the same time with an immobilized or non-immobi lized protein according to claim 19 or 20 and egg an immobilized or non-immobilized en do inulinase and immobilized or non-immo bilized cells of Arthrobacter globiformes or Arthrobacter ureafaciens is treated and then the difructosedianhydrides generated isolated from the reaction mixture and purified become.

35. Difructosedianhydride, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 33 oder 34.35. Difructosedianhydride, made after a The method of claim 33 or 34.

36. Verwendung von Inulin nach Anspruch 28 zur Her stellung von Inulinethern und Inulinestern. 36. Use of inulin according to claim 28 for Her provision of inulin ethers and inulin esters.

37. Verwendung der Fructooligosaccharide nach An spruch 31 als Lebensmittelzusatz, diätisches Le bensmittel oder Tierfutterzusatz.37. Use of the fructooligosaccharides according to An Proverb 31 as a food additive, dietary le food or animal feed additive.

38. Verwendung der hydrierten Fructooligosaccharide nach Anspruch 31 als Lebensmittelzusatz, diätisches Lebensmittel oder Tierfutterzusatz.38. Use of the hydrogenated fructooligosaccharides according to claim 31 as a food additive, dietary Food or animal feed additive.

39. Verwendung der Difructosedianhydride nach An spruch 35 als Lebensmittelszusatz, diätisches Le bensmittel oder Tierfutterzusatz.39. Use of the difructosedianhydride according to An Proverb 35 as a food additive, dietary le food or animal feed additive.