DE10104025B4

DE10104025B4 - Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA

Info

Publication number: DE10104025B4
Application number: DE10104025A
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Dr. PLÜSTER; Peter Dr. Kunze; Thomas Dr. Kolzau
Original assignee: Qiagen North American Holdings Inc
Current assignee: Qiagen North American Holdings Inc
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: DE10104025A1; US20030022193A1

Abstract

Verfahren zur Aufreinigung und anschließender Amplifikation von Doppelstrang-DNA aus einer Probenflüssigkeit, das folgende Schritte umfasst:
a) Pipettieren der Probe in ein Reaktionsgefäß, wobei die Oberfläche des Reaktionsgefäßes Sonden mit einem Doppelstrang DNA-affinen Rest umfasst, der unspezifisch Doppelstrang-DNA bindet, so dass die in der Probe enthaltene Doppelstrang-DNA an der Oberfläche des Reaktionsgefäßes immobilisiert wird,
b) Entfernen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß,
c) Amplifizieren der an der Oberfläche gebundenen Doppelstrang-DNA im Reaktionsgefäß mittels PCR, ohne vorgeschaltete Elution,
dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden Verbindungen mit ionischen Gruppen umfassen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA gemäß Oberbegriff des Anspruches 1.
Herkömmliche Aufarbeitungsprotokolle für Doppelstrang-DNA, insbesondere Plasmid-DNA sehen mehrere Arbeitsschritte vor.
Zunächst werden die Zellen, aus denen die DNA isoliert werden soll, durch z. B. Zentrifugation angereichert. Das resuspendierte Zell-Pellet wird dann einer meistens mehrere Schritte umfassenden Lyse (z. B. alkalische Lyse) unterzogen. Das Lysat wird erneut zentrifugiert, um Zelltrümmer oder dergleichen zu entfernen.
Das geklärte Lysat wird dann in Kontakt gebracht mit speziellen oberflächenbehandelten Trägern (z. B. Beads oder dergleichen), die die DNA binden.
In einem weiteren Schritt werden die Träger von dem Lysat abgetrennt und ggf. gewaschen.
Zur Bestimmung z. B. mittels PCR oder sonstiger Methoden muss die DNA bei allen bekannten Protokollen von den Trägern eluiert werden und das Eluat wird dann in andere Reaktionsgefäße überführt und entsprechend weiter aufgearbeitet (z. B. mittels PCR oder direkter Detektion etc.).
Die meisten Aufarbeitungen verlaufen im Wesentlichen nach dem obigen Schema. Das europäische Patent EP 0389063 B1 beschreibt ein Aufreinigungsverfahren, bei dem das die DNA enthaltende Ausgangsmaterial mit einem chaotropen Puffer lysiert und das Lysat direkt mit einer Silica-Matrix in Kontakt gebracht wird, wobei die DNA an die Matrix bindet. Dieses Verfahren verzichtet auf einige Schritte, bedingt aber auch, dass die gebundene DNA zur weiteren Aufarbeitung eluiert und überführt werden muss. Die WO 99/38962 A2 offenbart ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, in dem ein Träger als Festphase, bei dem es sich um chemisch unmodifizierte Membranen handelt, zur DNA Aufreinigung und anschließender Analyse der an die Festphase gebunden DNA von einem Reaktionsgefäß in ein anderes Reaktionsgefäß überführt werden muss. Die US 5 234 809 A und die EP 0 819 692 A2 beschreiben jeweils Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, bei denen die unspezifisch einzelsträngige wie auch doppelsträngige Nukleinsäuren in Anwesenheit von chaotrophen Salzen an eine feste Phase gebunden werden. Die US 5,591,841 A und die US 5,998,140 A beschreiben Verfahren bei dem die gereinigte Target-DNA in Lösung geht und dann gegebenenfalls zu ihrer Bestimmung weiter aufgearbeitet werden kann. In ADESSI et al., Nucleic Acids Res. (15.10.2000) 28 (20) E87, S. 2–8 wird ferner ein Verfahren beschrieben bei dem Primer unter kovalenter Fixierung an eine Substratoberfläche synthetisiert werden, um anschließend spezifische DNA im Wege einer Festphasen-PCR zu amplifizieren.
Die bekannten Verfahren sind damit relativ arbeitsaufwendig und als Konsequenz daraus z. B. schlecht automatisierbar. In einigen Fällen kommt noch hinzu, dass die Reaktionsbedingungen relativ aggressiv sind, was eine Durchführung zusätzlich erschwert.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation von Doppelstrang-DNA zu schaffen, das in einfacher Weise durchführbar ist.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren, das die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die DNA während der Aufreinigung an eine Sonde mit einem DNA-affinen Rest gebunden. Die Sonde ihrerseits ist bereits an einer Festphase gekoppelt, die durch einen Oberflächenbereich eines Reaktionsgefäßes bereitgestellt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, dass die an der modifizieren Festphase gebundene Doppelstrang-DNA direkt weiter zu ihrer Amplifikation aufgearbeitet wird. Es ist also kein Gefäßwechsel bzw. Überführen der isolierten DNA erforderlich.
Die Erfindung stellt damit ein besonders bequemes Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation von Doppelstrang-DNA bereit. Ein solches so genanntes "All-in-One"-Verfahren erfordert sehr wenige Pipettier- und sonstige Arbeitsschritte. Im einfachsten Fall wird die Probe, aus der die enthaltene Doppelstrang-DNA aufgearbeitet werden soll, in ein erfindungsgemäß modifiziertes Reaktionsgefäß pipettiert. Nach Inkubationszeit wird die Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt, wobei dann zumindest ein Teil der ursprünglich in der Probe enthaltenen Doppelstrang-DNA an der Gefäßwand isoliert/immobilisiert ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die an dem Festphasenträger immobilisierte Doppelstrang-DNA so vor, dass an ihr ohne weiteres eine Hybridisierungsreaktion vorgenommen werden kann.
Aus dem Stand der Technik sind "All-In-One"-Verfahren zur Aufreinigung bzw. Bestimmung von mRNA bekannt. Die Aufreinigung bei den z. B. in der WO 99/32654 A1 oder der EP 0754764 B1 beschriebenen Verfahren beruht auf einer Hybridisierung des mRNA Einzelstranges an einer mit Oligo-dT-Sonden modifizierten Oberfläche, was bei der erfindungsgemäßen Reinigung von Doppelstrang-DNA naturgemäß nicht möglich ist, Insofern sind die bekannten Verfahren auch auf z. B. die Reinigung von mRNA beschränkt geblieben.
Die erfindungsgemäß z. B. in einem Reaktionsgefäß isolierte DNA kann im Rahmen einer weiteren Aufarbeitung problemlos mittels PCR amplifiziert und dann bestimmt werden. Denkbar ist z. B. im Rahmen der Erfindung auch eine Aufarbeitung nach dem Cycle Sequencing-Prinzip. Es ist aber auch möglich, dass die gebundene DNA ohne vorherige Amplifizierung direkt über z. B. geeignete Sonden detektiert wird.
Wenn die weitere Aufarbeitung mittels PCR erfolgt, so müssen die erfindungsgemäß eingesetzten modifizieren Reaktionsgefäße eine entsprechende Hitzestabilität aufweisen.
Die zur DNA-Isolierung verwendeten, an die Oberfläche des Festphasenträgers gekoppelten Sonden müssen dagegen nicht zwingend hitzestabile bzw. dauerhafte Bindungen mit der DNA und/oder der Oberfläche eingehen. Dauerhafte, z. B. eine PCR überdauernde Bindungen sind nur dann erforderlich, wenn das Reaktionsgefäß mit der gebundenen DNA z. B. zu Archivierungszwecken (um unter Umständen später noch einmal eine PCR durchführen zu können) archiviert werden soll. Grundsätzlich ist es aber nicht erforderlich, dass die DNA nach Isolierung und Beginn der weiteren sich anschließenden Aufarbeitung bis zum Ende dieser Aufarbeitung an die Festphase gebunden bleibt.
Die Sonden ihrerseits können erfindungsgemäß unterschiedliche Reste mit Affinität für Doppelstrang-DNA aufweisen.
Eine nicht beanspruchte Möglichkeit ist, an den Sonden so genannte Zinkfinger vorzusehen, die an spezifischen Abschnitten von Doppelstrang-DNA (minor grooves) binden.
Weitere nicht beanspruchte Möglichkeiten sind einsetzbare, spezifisch an bestimmte Bereiche von Doppelstrang-DNA bindende Verbindungen sind so genannte "sequence seekers". Es handelt sich dabei um selektive Polyamide, die an spezifische Nukleotidsequenzen von Doppelstrang-DNA binden. Zu Einzelheiten wird auf die WO 98/37067 A1 und WO 98/49142 A1 verwiesen, die eine ganze Reihe von im Rahmen der Erfindung geeigneten Polyamiden beschreiben.
Weiterhin kann man an den Sonden als affine Reste auch Triple-Helix bildende Verbindungen vorsehen. Auch diese Sonden binden an bestimmte Sequenzbereiche der zu isolierenden Doppelstrang-DNA durch Anlagerung eines weiteren komplementären dritten Stranges. Zu Einzelheiten hierzu wird z. B. auf die US 5,401,632 A und US 5,482,836 A verwiesen.
Die bis jetzt besprochenen affinen Reste binden spezifisch an bestimmte Sequenzabschnitte der Doppelstrang-DNA, bzw. an Bereiche mit spezifischer Konformität.
Erfindungsgemäß sind Reste vorzusehen, die unspezifisch Doppelstrang-DNA binden. In diesem Zusammenhang wird als affiner Rest eine Verbindung vorgesehen werden, die ionische Kopplungsstellen bereitstellt, an die sich Doppelstrang-DNA unspezifisch anlagern kann, d. h. mit beliebigen Sequenzabschnitten.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispieles näher erläutert werden. Aufreinigung und Amplifikation von ionisch immobilisierter gDNA
Als Probenmaterial wurden Rohlysate von Rattenleber eingesetzt. Die Lysate wurden in Eppendorf-Zentrifugationsgefäße überführt, deren Oberfläche chemisch mit geeigneten ionischen Kopplungsstellen modifiziert war, an die sich Doppelstrang-DNA unspezifisch anlagern kann.
Die Inkubation erfolgte für 10 bis 20 Minuten in Gegenwart unterschiedlicher Puffer.
Die Puffer hatten folgende Zusammensetzungen:
A

10 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0)
0,1 mol/l EDTA
20 μg/ml RNAse A
0,5% SDS

B

100 mmol/l NaCl
10 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0)
0,1 mol/l EDTA
0,1 mg/ml Proteinase K
0,5% SDS

C

10 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0)
0,1 mol/l EDTA
150 mmol/l NaCl
0,5% NP 40

Nach Inkubation wurde das Lysat entfernt und das Gefäß gewaschen. Anschließend wurde jeweils mittels PCR in den Gefäßen ein Fragment des GAPDH-Gens amplifiziert.
Aliquots der PCR-Ansätze wurden dann in einem 1%-Agarose Gel elektrophoretisch analysiert. Das Ergebnis ist in der Figur wiedergeben, die ein Agarose-Gel mit sieben unterschiedlich beladenen Spuren (K⁺, 1–5, K^–) zeigt: (K⁺) Kontrolle mit kommerziell erhältlicher gDNA, (1) PCR-Ansatz nach Aufreinigung von Rattenleberrohlysat in chemisch modifizierten Gefäßen in Gegenwart von Puffer A, (2) PCR-Ansatz nach Aufreinigung von Rattenleberrohlysat in chemisch modifizierten Gefäßen in Gegenwart von Puffer B, (3) PCR-Ansatz nach Aufreinigung von Rattenleberrohlysat in chemisch modifizierten Gefäßen in Gegenwart von Puffer C, (4 + 5) PCR-Ansatz nach Aufreinigung von Rattenleberrohlysaten in unbeschichteten Gefäßen in Gegenwart von Puffer A, (K^–) Kontrolle ohne gDNA.
Die interessierende Bande des GAPDH-Gens ist in der Spur K⁺ (Kontrolle) mit einem Pfeil markiert. Man erkennt diese Bande deutlich auch in den Spuren 1 und 3, weniger deutlich in Spur 2, was zeigt, dass erfindungsgemäß abhängig vom eingesetzten Puffer eine Anreicherung von doppelsträngiger DNA erfolgt ist. Keine Anreicherung erfolgte bei Verwendung unbeschichteter Gefäße, was die Spuren 4 und 5 zeigen.

Claims

Verfahren zur Aufreinigung und anschließender Amplifikation von Doppelstrang-DNA aus einer Probenflüssigkeit, das folgende Schritte umfasst: a) Pipettieren der Probe in ein Reaktionsgefäß, wobei die Oberfläche des Reaktionsgefäßes Sonden mit einem Doppelstrang DNA-affinen Rest umfasst, der unspezifisch Doppelstrang-DNA bindet, so dass die in der Probe enthaltene Doppelstrang-DNA an der Oberfläche des Reaktionsgefäßes immobilisiert wird, b) Entfernen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß, c) Amplifizieren der an der Oberfläche gebundenen Doppelstrang-DNA im Reaktionsgefäß mittels PCR, ohne vorgeschaltete Elution, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden Verbindungen mit ionischen Gruppen umfassen.