DE10102823A1

DE10102823A1 - Process for the fermentative production of L-threonine

Info

Publication number: DE10102823A1
Application number: DE10102823A
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-05-27
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2001-11-29
Also published as: KR20030036199A

Abstract

The invention provides a process for the fermentative preparation of L-threonine using Enterobacteriaceae which in particular already produce L-threonine and in which the nucleotide sequence(s) of coryneform bacteria which code(s) for the thrE gene are enhanced, in particular over-expressed.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Enterobacteriaceae, in denen das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt wird.This invention relates to a method of fermentative Preparation of L-threonine using Enterobacteriaceae, in which the thrE gene is coryneformer Bacteria is amplified.

Stand der TechnikState of the art

L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung. Es ist bekannt, daß L-Threonin durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli und Serratia marcescens, hergestellt werden kann. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet, Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.L-threonine is found in animal nutrition, in human medicine and in the pharmaceutical industry application. It is known that L-threonine by fermentation of strains of Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli and Serratia marcescens, can be produced. Because of the great importance is constantly being given to the improvement of Manufacturing process worked, process improvements can fermentation-related measures, such as. B. agitation and Supply of oxygen, or the composition of the Culture media such as B. the sugar concentration during the Fermentation, or processing to product form, by e.g. B. ion exchange chromatography, or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Aminosäuren sind und L-Threonin produzieren.To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. This way you get Strains resistant to antimetabolites such as B. that Threonine analog α-amino-β-hydroxyvaleric acid (AHV) or are auxotrophic for regulatory amino acids and Produce L-threonine.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Threonin produzierender Stämme der Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Threonin-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Threonin-Produktion untersucht. Methods of recombinant DNA technology for strain improvement L-threonine producing strains of Enterobacteriaceae used, by amplifying individual threonine biosynthetic genes and the impact on L-threonine production examined.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Threonin bereitzustellen.The inventors set themselves the task of creating new ones Measures to improve the fermentative production of L- Provide threonine.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Threonin produzieren und in denen die für das thrE-Gen codierende(n) Nukleotidsequenz(en) coryneformer Bakterien verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.The invention relates to a method for fermentative production of L-threonine using from Enterobacteriaceae, which in particular already contains L-threonine produce and in which the coding for the thrE gene (s) Nucleotide sequence (s) of coryneform bacteria enhanced, especially overexpressed.

Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
In particular, it is a process for the production of L-threonine, characterized in that the following steps are carried out:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae in denen zumindest das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,a) Fermentation of family microorganisms Enterobacteriaceae in which at least the thrE gene coryneform bacteria increased (overexpressed) is, possibly in combination with other genes,
b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, undb) Enrichment of L-threonine in the medium or in the Cells of the family microorganisms Enterobacteriaceae, and
c) Isolieren des L-Threonins.c) isolating the L-threonine.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "reinforcement" describes in this context the increase in the intracellular activity of one or several enzymes or proteins in a microorganism that can be encoded by the appropriate DNA by using for example the number of copies of the gene or genes increases, uses a strong promoter or a gene that for a corresponding enzyme or protein with a high Activity encodes and, if necessary, these measures combined.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattungen Escherichia und Serratia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.The microorganisms that are the subject of the present Invention, L-threonine can be derived from glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerin and ethanol. It is a matter of Representatives of Enterobacteriaceae, especially the Genera Escherichia and Serratia. In the genus Escherichia is particularly the species Escherichia coli and in the genus Serratia in particular the species Serratia to call marcescens.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG-442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132Suitable L-threonine-producing strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, are for example
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNII genetics MG-442
Escherichia coli VNIIgenetics M1
Escherichia coli VNIIgenetics 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000Suitable strains of the genus Serratia, in particular of the species Serratia marcescens, which produce L-threonine are, for example
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000

Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Überexpression des für den Threoninexport kodierenden thrE- Gens coryneformer Bakterien in verbesserter Weise L- Threonin produzieren.It has been found that Enterobacteriaceae after Overexpression of the thrE- coding for threonine export Gene coryneform bacteria in an improved way L- Produce threonine.

Nukleotidsequenzen des thrE-Gens coryneformer Bakterien sind in der SEQ ID No 1 und SEQ ID No 3 und die sich daraus ergebenden Aminosäuresequenzen der Exportproteine in SEQ ID No 2 und SEQ ID No 4 dargestellt.Nucleotide sequences of the thrE gene of coryneform bacteria are in the SEQ ID No 1 and SEQ ID No 3 and those resulting from it resulting amino acid sequences of the export proteins in SEQ ID No 2 and SEQ ID No 4.

Das in der SEQ ID No 1 und SEQ ID No 3 dargestellte thrE- Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des thrE-Gens coryneformer Bakterien verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.The thrE- shown in SEQ ID No 1 and SEQ ID No 3 Gen can be used in the present invention. Farther can alleles of the thrE gene coryneform bacteria be used, resulting from the degeneracy of the genetic codes or through functionally neutral Sense mutations result.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.To achieve overexpression, the number of copies of the corresponding genes can be increased, or it can Promoter and regulatory region or the Ribosome binding site located upstream of the Structural gene located to be mutated. In the same way expression cassettes act upstream of the Structural gene can be installed. By inducible It is also possible for promoters to express in History of fermentative L-threonine production increase. Through measures to extend the lifespan expression of the m-RNA is also improved. Furthermore, by preventing the degradation of the Enzyme protein also increases enzyme activity. The Genes or gene constructs can either be found in plasmids different number of copies are present or in the chromosome be integrated and amplified. Alternatively, you can continue to overexpress the genes in question Change in media composition and culture management can be achieved.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.The specialist can find instructions on this among others Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), by Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), in Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), in de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), at LaVallie et al. (BIO / TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT / US97 / 13359, by Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), by Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), by Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989, at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) beschriebenen wird, oder pSC201-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor die für das thrE-Gen coryneformer Bakterien codierende Nucleotidsequenz trägt.Plasmids vectors replicable in Enterobacteriaceae such as e.g. B. cloning vectors derived from pACYC184 (Bartolome et al .; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al .; Gene 69: 301-315 (1988)), or pSC201 derivatives (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) can be used become. In a method according to the invention, one can a strain transformed with a plasmid vector use, the plasmid vector for the thrE gene nucleotide sequence coding for coryneform bacteria.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein neben dem thrE-Gen coryneformer Bakterien ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat zu überexprimieren. So können beispielsweise
In addition, it may be advantageous for the production of L-threonine with strains of the Enterobacteriaceae family in addition to the thrE gene of coryneform bacteria, one or more enzymes from the known threonine biosynthetic pathway or enzymes from the anaplerotic metabolism or enzymes for the production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide - Overexpress phosphate. For example

- gleichzeitig das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A- 4,278,765), oder- at the same time that for the aspartate kinase, the homoserine Dehydrogenase, the homoserine kinase and the ThrABC operon encoding threonine synthase (US-A- 4,278,765), or
- gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609), oder- At the same time that coding for the pyruvate carboxylase pyc gene (DE-A-198 31 609), or
- gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)), oder- at the same time that for the phosphoenolpyruvate synthase encoding pps gene (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)), or
- gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)), oder - At the same time that for the phosphoenolpyruvate carboxylase encoding ppc gene (Gene 31: 279-283 (1984)), or
- gleichzeitig die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), oder- At the same time those coding for the transhydrogenase Gene pntA and pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), or
- gleichzeitig das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Gene 27: 193-199 (1984)), oder- at the same time that for glutamate dehydrogenase encoding gdhA gene (Gene 27: 193-199 (1984)), or
- gleichzeitig das L-Homoserinresistenz vermittelnde rhtB- Gen (EP-A-0994190)- at the same time the rhtB- mediating L-homoserine resistance Gene (EP-A-0994190)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, especially overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein neben der Überexpression des thrE-Gens unerwünschte Nebenreaktionen wie z. B. die Threonin- Dehydrogenase auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982 und Bell und Turner, Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Threonins verringern.It can also be used for the production of L-threonine be advantageous in addition to overexpression of the thrE gene unwanted side reactions such. B. the threonine Turn off dehydrogenase (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms ", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982 and Bell and Turner, Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)). By doing Bacteria can be used in the method of the invention in which the metabolic pathways are at least partially are switched off, which the formation of L-threonine reduce.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention can in batch process (set cultivation) or in fed batch (Feed process) can be cultivated. A summary about well-known cultivation methods are in the textbook of Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.The culture medium to be used must be in a suitable manner The requirements of the respective tribes meet. Descriptions of culture media of various microorganisms are in "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included. Sugar and Carbohydrates such as B. glucose, sucrose, lactose, Fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and Fats such as B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and Coconut fat, fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as e.g. B. glycerin and ethanol and organic acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture become. Organic nitrogen can be used as the nitrogen source containing compounds such as peptones, yeast extract, Meat extract, malt extract, corn steep liquor, Soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The Nitrogen sources can be used individually or as a mixture be used. Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must also contain salts of metals such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, for the Growth are necessary. After all, essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition to above substances are used. The culture medium Suitable precursors can also be added. The The feedstocks mentioned can be used for culture in the form of a one-off approach or appropriately to be fed during cultivation.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an L- Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. For Antifoam agents such as e.g. B. fatty acid polyglycol esters. For Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics to be added. To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. Air into culture registered. The temperature of the culture is usually at 25 ° C to 45 ° C and preferably at 30 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of L- Has formed threonine. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.

Die Analyse von L-Threonin kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.The analysis of L-threonine can by Anion exchange chromatography with subsequent Ninhydrin derivatization takes place as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), or it can be done by reversed phase HPLC as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) described.

Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
The following microorganism was deposited with the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) in accordance with the Budapest Treaty:

- Brevibacterium flavum Stamm DM368-2 pZlthrE als DSM 12840- Brevibacterium flavum strain DM368-2 pZlthrE as DSM 12840

Das Plasmid pZ1thrE enthält das thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032.The plasmid pZ1thrE contains the thrE gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention is described below with reference to Exemplary embodiments explained in more detail.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.The isolation of plasmid DNA from Escherichia coli as well all restriction, Klenow and alkaline techniques Phosphatase treatment was carried out according to Sambrook et al. (Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). The transformation of Escherichia coli, unless otherwise stated, according to Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von E. coli Stämmen und Transformanten war 37°C. Bei dem Genaustauschververfahren nach Hamilton et. al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622) wurden Temperaturen von 30°C und 44°C verwendet.The incubation temperature in the production of E. coli Strains and transformants was 37 ° C. In which Gene exchange method according to Hamilton et. al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622) temperatures of 30 ° C and 44 ° C used.

Beispiel 1example 1 Klonierung und Sequenzierung des thrE-Gens von Corynebacterium glutamicum ATCC14752Cloning and sequencing of the thrE gene from Corynebacterium glutamicum ATCC14752 1. Transposonmutagenese und Mutantenauswahl1. Transposon mutagenesis and mutant selection

Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wurde einer Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 unterworfen, dessen Sequenz unter der Accession-Nummer U53587 in der Nukleotid-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) hinterlegt ist. Der Einbau einer Deletion in das ilvA-Gen von Corynebacterium glutamicum ATC14752 wurde mit dem bei Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) beschriebenen System zum Genaustausch durchgeführt. Dazu wurde der von Sahm et al. konstruierte Inaktivierungsvektor pKl9mobsacBΔilvA (Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979) zur Deletion verwendet. Zunächst wurde der Methylase-defekte Escherichia coli Stamm SCS110 (Jerpseth und Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) der Firma Stratagene (Heidelberg, Deutschland) mit 200 ng des Vektors pK19mobsacBΔilvA transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus einer der Transformanten wurde das Plasmid pK19mobsacBΔilvA präpariert. Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) wurden dieses Inaktivierungsplasmid dann in den Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752 eingebracht. Klone, bei denen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Um auf die Excision des Vektors zu selektieren, wurden Kanamycin resistente Klone auf Saccharose-haltigem LBG-Medium (LB- Medium mit 15 g/L Agar, 2% Glukose und 10% Saccharose) ausplattiert. Dabei wurden Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al.; Journal of Bacteriology (1992) 174: 5462-5465). Durch Überimpfen auf Minimalmediumplatten (CGXII-Medium mit 15 g/L Agar (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)) mit und ohne 300 mg/L L-Isoleucin, bzw. mit und ohne 50 µg/mL Kanamycin wurden sechs Klone isoliert, die durch Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin auxotroph waren und bei denen nun das unvollständige ilvA- Gen (ΔilvA-Allel) im Genom vorlag. Einer dieser Klone wurde als Stamm ATCC1475ΔilvA bezeichnet und zur Transposonmutagenese eingesetzt.The strain Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA was subjected to mutagenesis with the transposon Tn5531, its sequence under the accession number U53587 in the National Center for Biotechnology nucleotide database Information (Bethesda, USA) is deposited. The installation a deletion in the ilvA gene from Corynebacterium glutamicum ATC14752 was compared with the Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) described system for Gene exchange carried out. For this purpose, the Sahm et al. constructed inactivation vector pKl9mobsacBΔilvA (Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979) Deletion used. First, the methylase became defective Escherichia coli strain SCS110 (Jerpseth and Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) by the company Stratagene (Heidelberg, Germany) with 200ng of the vector pK19mobsacBΔilvA transformed. Were transformants based on their kanamycin resistance to 50 µg / mL kanamycin containing LB agar plates identified. From one of the The plasmid pK19mobsacBΔilvA became transformants prepared. Using electroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) became this Inactivating plasmid then in the strain Corynebacterium glutamicum ATCC14752 introduced. Clones where the Inactivation vector was integrated in the genome based on their kanamycin resistance to 15 µg / mL kanamycin containing LBHIS agar plates (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). To on the Excision of the vector to select were kanamycin resistant clones on sucrose-containing LBG medium (LB- Medium with 15 g / L agar, 2% glucose and 10% sucrose) plated out. Colonies were obtained, which the Vector again by a second recombination event have lost (Jäger et al .; Journal of Bacteriology (1992) 174: 5462-5465). By inoculating on Minimal medium plates (CGXII medium with 15 g / L agar (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)) with and without 300 mg / L L-isoleucine, or with and without 50 µg / mL kanamycin, six clones were isolated that by excision of the vector kanamycin sensitive and isoleucine were auxotrophic and where the incomplete ilvA Gene (ΔilvA allele) was present in the genome. One of those clones was designated as strain ATCC1475ΔilvA and for Transposon mutagenesis used.

Aus dem Methylase-defekten E. coli-Stamm GM2929pCGL0040 (E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) wurde das Plasmid pCGL0040 (Fig. 1) isoliert, welches das zusammengesetzte Transposon Tn5531 enthält (Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752AilvA wurde mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) mit dem Plasmid pCGL0040 transformiert. Klone, bei denen das Transposon Tn5531 ins Genom integriert war, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese Weise wurden 2000 Klone erhalten, welche auf verzögertes Wachstum in Anwesenheit von Threonyl threonyl-threonin überprüft wurden. Dazu wurden alle Klone einzeln auf CGXII-Minimalmedium-Agarplatten mit und ohne 2 mM Threonyl-threonyl-threonin übertragen. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), enthielt aber zusätzlich 25 µg/mL Kanamycin, 300 mg/L L- Isoleucin und 15 g/L Agar. Die Zusammensetzung des von Keilhauer et al. beschriebenen Mediums ist in Tabelle 1 dargestellt. The plasmid pCGL0040 ( FIG. 1) was isolated from the methylase-defective E. coli strain GM2929pCGL0040 (E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12), which contains the composite transposon Tn5531 ( Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). The strain Corynebacterium glutamicum ATCC14752AilvA was transformed by means of electroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) with the plasmid pCGL0040. Clones in which the transposon Tn5531 was integrated into the genome were identified on the basis of their kanamycin resistance on LBHIS agar plates containing 15 μg / ml kanamycin (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). In this way, 2000 clones were obtained, which were checked for delayed growth in the presence of threonyl threonyl-threonine. For this purpose, all clones were transferred individually to CGXII minimal medium agar plates with and without 2 mM threonyl-threonyl-threonine. The medium was identical to that in Keilhauer et al. medium described CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), but additionally contained 25 μg / ml kanamycin, 300 mg / L L-isoleucine and 15 g / L agar. The composition of the by Keilhauer et al. described medium is shown in Table 1.

Tabelle 1 Table 1

Zusammensetzung des Mediums CGXII Composition of the medium CGXII

Die Agarplatten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum nach 12, 18 und 24 Stunden untersucht. Es wurde eine Transposonmutante erhalten, die ohne Threonyl-threonyl threonin vergleichbar mit dem Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wuchs, in Anwesenheit von 2 mM Threonyl-threonyl-threonin aber verzögertes Wachstum zeigte. Diese wurde als ATCC14752ΔilvAthrE: :Tn5531 bezeichnet.The agar plates were incubated at 30 ° C and growth examined after 12, 18 and 24 hours. there has been a Transposon mutant obtained without threonyl-threonyl threonine comparable to the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA grew in the presence of 2 mM Threonyl-threonyl-threonine but delayed growth showed. This was called ATCC14752ΔilvAthrE:: Tn5531 designated.

2. Klonierung und Sequenzierung des Insertionsortes von Tn5531 in ATCC14752ΔilvAthrE: :Tn55312. Cloning and sequencing of the insertion site of Tn5531 in ATCC14752ΔilvAthrE:: Tn5531

Um den stromaufwärts des Transposons Tn5531 gelegenen Insertionsort in der in Beispiel 1.1 beschriebenen Mutante zu klonieren, wurde zunächst die chromosomale DNA dieses Mutantenstammes wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben isoliert und 400 ng davon mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten. Der vollständige Restriktionsansatz wurde in den ebenfalls mit EcoRI linearisierten Vektor pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformanten, bei denen auf dem Vektor pUC18 die Insertionsorte des Transposons Tn5531 kloniert vorlagen, wurden anhand ihrer Carbenicillin- und Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin und 25 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus drei der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse die Größen der klonierten Inserts bestimmt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf einem der Plasmide mit einem ca. 5,7 kb großen Insert wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden 2,2 kb des Inserts ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'.Around the upstream of the transposon Tn5531 Insertion site in the mutant described in Example 1.1 to clone was first the chromosomal DNA of this Mutant strain as in Schwarzer et al. (Bio / Technology (1990) 9: 84-87) described in isolation and 400 ng thereof restriction endonuclease EcoRI cut. The complete restriction approach was also in the EcoRI linearized vector pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany) ligated. With the entire ligation approach the E. coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) by means of electroporation transformed (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformants, based on the vector pUC18 cloned the insertion sites of the transposon Tn5531 were based on their carbenicillin and Kanamycin resistance to 50 µg / mL carbenicillin and 25 µg / mL LB agar plates containing kanamycin were identified. Out three of the transformants were prepared and the plasmids the sizes of the cloned inserts by restriction analysis certainly. The nucleotide sequence of the insertion site one of the plasmids with an approximately 5.7 kb insert using the dideoxy chain termination method of Sanger et al. determined (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). For this purpose, 2.2 kb of the insert was made based on the following Oligonucleotide primers sequenced: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3 '.

Zur Identifizierung des stromabwärts des Transposons gelegenen Insertionsortes wurde die chromosomale DNA der Mutante mit der Restriktionsendonuklease XbaI geschnitten und in den mit XbaI linearisierten Vektor pUC18 ligiert. Die weitere Klonierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf einem der Plasmide mit einem ca. 8,5 kb großen Insert wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden 0,65 kb des Inserts ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'. To identify the downstream of the transposon the insertion site was the chromosomal DNA of the Mutant cut with restriction endonuclease XbaI and ligated into the vector pUC18 linearized with XbaI. The further cloning was as described above carried out. The nucleotide sequence of the insertion site one of the plasmids with an approximately 8.5 kb insert using the dideoxy chain termination method of Sanger et al. determined (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). For this purpose, 0.65 kb of the insert was based on the following Oligonucleotide primers sequenced: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3 '.

Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurde mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert und zusammengefügt. Diese Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO 1 wiedergegeben. Die Analyse ergab die Identifizierung eines offenen Leserasters von 1467 bp Länge. Das entsprechende Gen wurde als thrE-Gen bezeichnet. Das dazugehörige Genprodukt umfasst 489 Aminosäuren und ist als SEQ ID NO 2 wiedergegeben.The nucleotide sequences obtained were compared with the Lasergene program package (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analyzed and combined. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO 1. The analysis revealed the identification of an open one Reading frame of 1467 bp length. The corresponding gene was referred to as the thrE gene. The associated gene product comprises 489 amino acids and is as SEQ ID NO 2 reproduced.

Beispiel 2Example 2 Klonierung und Sequenzierung des Gens thrE aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032Cloning and sequencing of the thrE gene Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Das Gen thrE wurde in den E. coli Klonierungsvektor pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) kloniert. Die Klonierung wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) das Gen aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 mittels folgender aus SEQ ID NO 1 abgeleiteter Oligonukleotid-Primer amplifiziert.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3'
thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'The thrE gene was cloned into the E. coli cloning vector pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). The cloning was carried out in two steps. First, the gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was amplified by a polymerase chain reaction (PCR) using the following oligonucleotide primers derived from SEQ ID NO 1.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3 '
thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3 '

Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM Deoxynukleotid-triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM des entsprechenden Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten.The PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 µM Deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), each 1 µM of the corresponding oligonucleotide, 100 ng chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 volume 10-fold reaction buffer and 2.6 units of one heat-stable Taq / Pwo DNA polymerase mixture (Expand High Fidelity PCR system from Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) in a thermal cycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) under the following conditions performed: 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes.

Das amplifizierte etwa 1,9 kb große Fragment wurde dann im folgenden mit Hilfe des SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pUC18 ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Carbenicillinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus 8 der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1,9 kb PCR-Fragments als Insert überprüft. Das so entstandene rekombinante Plasmid wird im folgenden mit pUC18thrE bezeichnet.The amplified approximately 1.9 kb fragment was then in the using the SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) according to the Manufacturer in the SmaI interface of the vector pUC18 ligated. With the entire ligation approach, the E. coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649). Transformants were identified based on their carbenicillin resistance on LB agar plates containing 50 µg / mL carbenicillin identified. 8 of the transformants became the Plasmids prepared and by restriction analysis on the Presence of the 1.9 kb PCR fragment as an insert checked. The resulting recombinant plasmid is in the hereinafter referred to as pUC18thrE.

Die Nukleotidsequenz des 1,9 kb PCR-Fragments in Plasmid pUClBthrE wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurde das vollständige Insert von pUClBthrE mit Hilfe folgender Primer der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) sequenziert.
Universalprimer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverseprimer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'The nucleotide sequence of the 1.9 kb PCR fragment in plasmid pUClBthrE was determined by the dideoxy chain termination method of Sanger et al. determined (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). For this, the complete insert of pUClBthrE was sequenced using the following primers from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany).
Universal primer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3 '
Reverse primer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3 '

Die Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO 3 wiedergegeben. Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert. Die Analyse ergab die Identifizierung eines offenen Leserasters von 1467 bp Länge, das als thrE-Gen bezeichnet wurde. Dieses kodiert für ein Polypeptid von 489 Aminosäuren, welches als SEQ ID NO 4 wiedergegeben ist.The nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO 3. The nucleotide sequence obtained was included in the program package Laser genes (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). The analysis showed that Identification of an open reading frame of 1467 bp Length called the thrE gene. This encodes for a polypeptide of 489 amino acids, which as SEQ ID NO 4 is reproduced.

Beispiel 3Example 3 Expression des Gens thrE in Corynebacterium glutamicumExpression of the thrE gene in Corynebacterium glutamicum

Das unter Beispiel 2 beschriebene Gen thrE aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zur Expression in den Vektor pZ1 kloniert (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Dazu wurde aus dem Plasmid pUC18thrE mit den Restriktionsenzymen SacI und XbaI ein 1881 bp großes, das Gen thrE enthaltendes DNA- Fragment ausgeschnitten. Die 5'- und 3'-Enden dieses Fragments wurden mit Klenow-Enzym behandelt. Das resultierende DNA-Fragment wurde in den zuvor mit ScaI linearisierten und dephosphorylierten Vektor pZl ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus 2 Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1881 bp ScaI/XbaI-Fragments als Insert überprüft. Das auf diese Weise entstandene rekombinante Plasmid wurde als pZ1thrE bezeichnet (Fig. 2)The gene thrE from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 described in Example 2 was cloned into the vector pZ1 for expression (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). For this purpose, an 1881 bp DNA fragment containing the thrE gene was excised from the plasmid pUC18thrE with the restriction enzymes SacI and XbaI. The 5 'and 3' ends of this fragment were treated with Klenow enzyme. The resulting DNA fragment was ligated into the vector pZ1 linearized and dephosphorylated with ScaI. With the entire ligation approach, the E. coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) was transformed. Transformants were identified by their kanamycin resistance on LB agar plates containing 50 µg / mL kanamycin. The plasmids were prepared from 2 transformants and checked for the presence of the 1881 bp ScaI / XbaI fragment as an insert by restriction analysis. The resulting recombinant plasmid was named pZ1thrE ( Fig. 2)

Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) wurden das Plasmid pZ1thrE in den threoninbildenden Stamm Brevibacterium flavum DM368-2 eingebracht. Der Stamm DM368-2 ist in der EP-B-0 385 940 beschrieben und als DSM5399 hinterlegt. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese Weise entstanden der Stamm Brevibacterium flavum DM3EB-2 pZ1thrE. Using electroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) the plasmid pZ1thrE in the threonine-forming strain Brevibacterium flavum DM368-2 brought in. The strain DM368-2 is in EP-B-0 385 940 described and deposited as DSM5399. Transformants were based on their kanamycin resistance to 15 µg / mL LBHIS agar plates containing kanamycin were identified (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). The Brevibacterium strain was created in this way flavum DM3EB-2 pZ1thrE.

Beispiel 4Example 4 Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AthrEConstruction of the expression plasmid pTrc99AthrE

Das unter Beispiel 2 beschriebene thrE-Gen aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zur Expression in Escherichia coli in den Vektor pTrc99A kloniert, der von der Firma Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen wurde. Dazu wurde das Plasmid pUC18thrE mit dem Enzym SalI gespalten und die überstehenden 3'-Enden mit dem Klenow- Enzym behandelt. Nach der Restriktion mit dem Enzym KpnI wurde der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 1,9 kbp große thrE-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A wurde mit dem Enzym EcoRI gespalten, die 3'-Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt, mit dem Enzym KpnI gespalten und mit dem isolierten thrE-Fragment ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert. Die Selektion pTrc99A tragender Zellen erfolgte auf LB Agar (Lennox, Virology 1: 190 (1955)), der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Die erfolgreiche Klonierung des thrE-Gens konnte nach der Plasmid-DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit XbaI, BamHI, EcoRI, HindIII und SspI nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde als pTrc99AthrE (Fig. 3) bezeichnet.The thrE gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 described in Example 2 was cloned for expression in Escherichia coli into the vector pTrc99A, which was obtained from Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). For this, the plasmid pUC18thrE was cleaved with the enzyme SalI and the protruding 3 'ends were treated with the Klenow enzyme. After the restriction with the enzyme KpnI, the cleavage mixture was separated in a 0.8% agarose gel and the 1.9 kbp thrE fragment was isolated using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). The vector pTrc99A was digested with the EcoRI enzyme, the 3 'ends treated with the Klenow enzyme, digested with the KpnI enzyme and ligated to the isolated thrE fragment. The ligation mixture was transformed into the E. coli strain DH5α. The selection of cells carrying pTrc99A was carried out on LB agar (Lennox, Virology 1: 190 (1955)) to which 50 μg / ml ampicillin had been added. The successful cloning of the thrE gene could be demonstrated after plasmid DNA isolation and control cleavage with XbaI, BamHI, EcoRI, HindIII and SspI. The plasmid was named pTrc99AthrE ( Fig. 3).

Beispiel 5Example 5 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AthrEProduction of L-threonine with the strain MG442 / pTrc99AthrE

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A- 4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.The L-threonine producing E. coli strain MG442 is in the Patent US-A-4,278,765 and in the Russian National Industrial Collection Microorganisms (VKPM, Moscow, Russia) as CMIM B-1628 deposited.

Der Stamm MG442 wurde mit dem Plasmid pTrc99AthrE transformiert und auf LB Agar mit 50 µg/ml Ampicillin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Ausgewählte Einzelkolonien wurden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PC₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin, weiter vermehrt. Die Bildung von L-Threonin wurde in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten waren, überprüft. Dazu wurde 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 250 µl dieser Vorkultur wurden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄. 1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur Induktion der Expression des thrE-Gens wurde in Parallelansätzen 200 mg/l Isopropyl-β-D thiogalaktosid (IPTG) hinzugefügt. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2 W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.The strain MG442 was transformed with the plasmid pTrc99AthrE and selected on LB agar with 50 µg / ml ampicillin plasmid-carrying cells. Selected individual colonies were then on minimal medium with the following composition: 3.5 g / l Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O, 1.5 g / l KH ₂ PC ₄ , 1 g / l NH ₄ Cl, 0.1 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O, 2 g / l glucose, 20 g / l agar, 50 mg / l ampicillin, further increased. The formation of L-threonine was checked in batch cultures of 10 ml contained in 100 ml Erlenmeier flasks. 10 ml of preculture medium of the following composition were added: 2 g / l yeast extract, 10 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 1 g / l KH ₂ PO ₄ , 0.5 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O, 15 g / l CaCO ₃ , 20 g / l glucose, 50 mg / l ampicillin, inoculated and incubated for 16 hours at 37 ° C. and 180 rpm on an ESR incubator from Kühner AG (Birsfelden, Switzerland). Each 250 ul of this preculture were in 10 ml of production medium (25 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.03 g / l FeSO ₄ .7H ₂ O, 0.018 g / l MnSO ₄ .1H ₂ O, 30 g / l CaCO ₃ , 20 g / l glucose) and inoculated at 37 ° C for 48 hours. To induce expression of the thrE gene, 200 mg / l isopropyl-β-D thiogalactoside (IPTG) was added in parallel. After the incubation, the optical density (OD) of the culture suspension was checked using an LP2 W photometer from Dr. Lange (Berlin, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm.

Anschließend wurde die Konzentration an gebildetem L- Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.Then the concentration of L- Threonine in a sterile filtered culture supernatant with a Amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column reaction with ninhydrin detection.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.Table 2 shows the result of the test.

Tabelle 2 Table 2

Beispiel 6Example 6 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrEProduction of L-threonine with the strain B-3996kurΔtdh / pVIC40, pMW218thrE

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm B-3996 ist in US-A- 5,175,107 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.The L-threonine-producing E. coli strain B-3996 is in US-A-5,175,107 and the Russian National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moscow, Russia).

6.1 Klonierung des thrE-Gens in den Plasmidvektor pMW2186.1 Cloning of the thrE gene in the plasmid vector pMW218

Das unter Beispiel 4 beschriebene Plasmid pTrc99AthrE wurde mit dem Enzym Sspl gespalten, der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 2,5 kbp große DNA- Fragment, das neben dem thrE-Gen die trc-Promotorregion und die rRNA-Terminator-Region enthält, mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wurde mit dem Enzym SmaI gespalten und mit dem thrE-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW218 tragende Zellen durch Ausplattieren auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Kanamycin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung des thrE-Gens konnte nach Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit HindIII und ClaI nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde als pMW21BthrE (Fig. 4) bezeichnet.The plasmid pTrc99AthrE described in Example 4 was cleaved with the enzyme Sspl, the cleavage mixture was separated in a 0.8% agarose gel and the 2.5 kbp DNA fragment which, in addition to the thrE gene, the trc promoter region and the rRNA terminator Region contains isolated using the "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Germany). The plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) was cleaved with the enzyme SmaI and ligated with the thrE fragment. The E. coli strain DH5α was transformed with the ligation batch and cells carrying pMW218 were selected by plating out on LB agar to which 20 μg / ml kanamycin had been added. The successful cloning of the thrE gene could be demonstrated after plasmid DNA isolation and control cleavage with HindIII and ClaI. The plasmid was named pMW21BthrE ( Fig. 4).

6.2 Herstellung des Stammes B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE6.2 production of the strain B-3996kurΔtdh / pVIC40, pMW218thrE

Von Stamm B-3996 wurde, nach Kultur im Antibiotika-freien Vollmedium für ungefähr zehn Generationen, ein Derivat isoliert, das das Plasmid pVIC40 nicht mehr enthielt. Der entstandene Stamm ist Streptomycin-sensitiv und wurde als B-3996kur bezeichnet.From strain B-3996 was after antibiotic-free culture Full medium for about ten generations, a derivative isolated, which no longer contained the plasmid pVIC40. The The resulting strain is sensitive to streptomycin and was identified as B-3996kur designated.

Zum Einbau einer Deletion in das tdh-Gen wurde die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-9622) beschriebene Methode eingesetzt, die auf der Verwendung des Plasmids pMAK705 mit einem temperatursensitiven Replikon beruht. Das Plasmid pDR121 (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169: 4716-4721) enthält ein 3,7 Kilo-Basenpaare (kbp) großes DNA-Fragment aus E. coli, auf dem das tdh-Gen kodiert ist. Zur Erzeugung einer Deletion des tdh- Genbereiches wurde pDR121 mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRV gespalten und das isolierte 5 kbp große DNA- Fragment nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert.To insert a deletion into the tdh gene, the by Hamilton et al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-9622) described method used on the Use of plasmid pMAK705 with a temperature-sensitive replicon. The plasmid pDR121 (Ravnikar and Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169: 4716-4721) contains a 3.7 kilo base pair (kbp) large DNA fragment from E. coli on which the tdh gene is encoded. To create a deletion of the tdh- The gene region was pDR121 with the restriction enzymes ClaI and EcoRV cleaved and the isolated 5 kbp DNA Fragment ligated after treatment with the Klenow enzyme. The Ligation approach was in the E. coli strain DH5α transformed and plasmid-bearing cells on LB agar, which 50 µg / ml ampicillin is added.

Die erfolgreiche Deletion des tdh-Gens konnte nach der Plasmid-DNA Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI nachgewiesen werden. Das 1,7 kbp große EcoRI-Fragment wurde isoliert und mit dem Plasmid pMAK705, das partiell mit EcoRI verdaut wurde, ligiert. Der Ligationsansatz wurde in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt war, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wurde nach Plasmid-DNA Isolierung und Spaltung mit EcoRI nachgewiesen. Das entstandene pMAK705 Derivat wurde als pDM32 bezeichnet.The successful deletion of the tdh gene was not possible after the Plasmid DNA isolation and control cleavage with EcoRI be detected. The 1.7 kbp EcoRI fragment was isolated and with the plasmid pMAK705, the partial was digested with EcoRI. The ligation approach was transformed into DH5α and plasmid-bearing cells LB agar mixed with 20 µg / ml chloramphenicol, selected. The successful cloning was made after Plasmid DNA isolation and cleavage demonstrated with EcoRI. The resulting pMAK705 derivative was named pDM32.

Für den Genaustausch wurde B-3996kur mit dem Plasmid pDM32 transformiert. Der Austausch des chromosomalen tdh-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt erfolgte mit dem von Hamilton et al. beschriebenen Selektionsverfahren und wurde durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
For the gene exchange, B-3996kur was transformed with the plasmid pDM32. The exchange of the chromosomal tdh gene for the plasmid-encoded deletion construct was carried out with that of Hamilton et al. described selection method and was verified by standard PCR methods (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) with the following oligonucleotide primers:

Der entstandene Stamm wurde auf Kanamycin-Sensitivität getestet und als B-3996kurΔtdh bezeichnet. The resulting strain was sensitive to kanamycin tested and designated as B-3996kurΔtdh.

B-3996kurΔtdh wurde mit dem aus B-3996 isolierten Plasmid pVIC40 transformiert und auf LB-Agar supplementiert mit 20 µg/ml Streptomycin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Eine ausgewählte Einzelkolonie wurde als B- 3996kurΔtdh/pVIC40 bezeichnet und mit dem Plasmid pMW218thrE transformiert. Die Selektion erfolgt auf LB- Agar, der mit 20 µg/ml Streptomycin und mit 50 µg/ml Kanamycin versetzt ist. Der so entstandene Stamm wurde als B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE bezeichnet.B-3996kurΔtdh was generated with the plasmid isolated from B-3996 pVIC40 transformed and supplemented with 20 on LB agar µg / ml streptomycin plasmid-carrying cells selected. A selected single colony was named B- 3996kurΔtdh / pVIC40 and with the plasmid pMW218thrE transformed. The selection is made on LB- Agar containing 20 µg / ml streptomycin and 50 µg / ml Kanamycin is added. The resulting strain was called B-3996kurΔtdh / pVIC40, pMW218thrE.

6.3 Herstellung von L-Threonin6.3 Production of L-threonine

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme B-3996kurΔtdh/pVIC40 und B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE wurde wie im Beispiel 5 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium, das Vorkulturmedium und das Produktionsmedium wurden für B-3996kurΔtdh/pVIC40 mit 20 µg/ml Streptomycin und für B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE mit 20 µg/ml Streptomycin und 50 µg/ml Kanamycin supplementiert.The production of L-threonine by the strains B-3996kurΔtdh / pVIC40 and B-3996kurΔtdh / pVIC40, pMW218thrE was tested as described in Example 5. The Minimal medium, the pre-culture medium and that Production media were used for B-3996kurΔtdh / pVIC40 with 20 µg / ml streptomycin and for B-3996kurΔtdh / pVIC40, pMW218thrE with 20 µg / ml streptomycin and 50 µg / ml kanamycin supplemented.

In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.Table 3 shows the result of the experiment summarized.

Tabelle 3 Table 3

Folgende Figuren sind beigefügt:The following figures are attached:

Fig. 1 Karte des das Transposon Tn5531 enthaltenden Plasmids pCGL0040. Das Transposon ist als nicht schraffierter Pfeil gekennzeichnet. Fig. 1: Map of the transposon Tn5531 plasmid containing pCGL0040. The transposon is marked as an unshaded arrow.

Fig. 2 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pZ1thrE. Fig. 2 Map of the thrE gene containing plasmid pZ1thrE.

Fig. 3 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AthrE. Fig. 3: Map of the thrE gene containing plasmid pTrc99AthrE.

Fig. 4 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pMW218thrE Fig. 4: Map of the thrE gene containing plasmid pMW218thrE

Längenangaben sind als ca. -Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
Amp: Ampicillinresistenzgen
Kan: Kanamycinresistenzgen
'amp: 3'-Teil des Ampicillinresistenzgens
oriBR322: Replikationsregion des Plasmides pBR322
lacI: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
Ptrc: trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
5S: 5S rRNA-Region
rrnBT: rRNA-Terminator-RegionLength specifications are to be understood as approx. The abbreviations and designations used have the following meaning:
Amp: Ampicillin resistance gene
Kan: Kanamycin resistance gene
'amp: 3' part of the ampicillin resistance gene
oriBR322: Replication region of the plasmid pBR322
lacI: gene for the repressor protein of the trc promoter
Ptrc: trc promoter region, IPTG inducible
5S: 5S rRNA region
rrnBT: rRNA terminator region

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung
BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebstella pneumoniae
PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola The abbreviations for the restriction enzymes have the following meaning
BamHI: restriction endonuclease from Bacillus amyloliquefaciens
BglII: restriction endonuclease from Bacillus globigii
ClaI: restriction endonuclease from Caryphanon latum
EcoRI: restriction endonuclease from Escherichia coli
EcoRV: restriction endonuclease from Escherichia coli
HindIII: restriction endonuclease from Haemophilus influenzae
KpnI: Restriction endonuclease from Klebstella pneumoniae
PstI: Restriction endonuclease from Providencia stuartii
PvuI: Proteus vulgaris restriction endonuclease
SacI: restriction endonuclease from Streptomyces achromogenes
SalI: restriction endonuclease from Streptomyces albus
SmaI: restriction endonuclease from Serratia marcescens
XbaI: restriction endonuclease from Xanthomonas badrii
XhoI: restriction endonuclease from Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin dadurch gekennzeichnet, daß man Enterobacteriaceae Bakterien einsetzt, insbesondere solche die bereits L- Threonin produzieren und in denen man die für das thrE-Gen codierende(n) Nukleotidsequenz(en) coryneformer Bakterien verstärkt, insbesondere überexprimiert.1. A process for the fermentative production of L-threonine, characterized in that Enterobacteriaceae bacteria are used, in particular those which already produce L-threonine and in which the nucleotide sequence (s) coding for the thrE gene (s) coryneform bacteria are amplified, in particular overexpressed.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu den thrE-Genen, weitere Gene verstärkt.2. The method according to claim 1, characterized in that that in addition to the thrE genes, other genes reinforced.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae aus der Gattung Escheria und Serratia sind.3. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that the microorganisms of the family Enterobacteriaceae from the genus Escheria and Serratia are.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escheria, insbesondere der Art Escheria coli sind.4. The method according to claim 3, characterized in that the microorganisms from the genus Escheria, especially of the type Escheria coli.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon verstärkt.5. The method according to claim 1, characterized in that at the same time that for the aspartate kinase, the Homoserine dehydrogenase, the homoserine kinase and the ThrreC operon encoding threonine synthase enhanced.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen verstärkt.6. The method according to claim 1, characterized in that at the same time that for the pyruvate carboxylase encoding pyc gene amplified.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat- Synthase kodierende pps-Gen verstärkt.7. The method according to claim 1, characterized in that that at the same time that for the phosphoenol pyruvate Synthase-encoding pps gene enhanced.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat- Carboxylase kodierende ppc-Gen verstärkt. 8. The method according to claim 1, characterized in that that at the same time that for the phosphoenol pyruvate Carboxylase-encoding ppc gene enhanced.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB verstärkt.9. The method according to claim 1, characterized in that that at the same time that for transhydrogenase coding genes pntA and pntB amplified.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Threonins verringern.10. The method according to claim 1, characterized in that that you use bacteria in which the Metabolic pathways at least partially switched off that reduce the formation of L-threonine.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das thrE-Gen coryneformer Bakterien codierende Nucleotidsequenz trägt.11. The method according to claim 1, characterized in that that one was transformed with a plasmid vector Strain and the plasmid vector is used for the ThrE gene encoding coryneform bacteria Nucleotide sequence.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Plasmid pZ1thrE transformierte Bakterien einsetzt.12. The method according to claim 1, characterized in that that one transformed with the plasmid pZ1thrE Bacteria.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des thrE-Gens induziert, insbesondere mit Isopropyl-β-D-thiogalaktosid.13. The method according to claim 1, characterized in that one induces the expression of the thrE gene, especially with isopropyl-β-D-thiogalactoside.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Glutamat- Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen verstärkt.14. The method according to claim 1, characterized in that at the same time that for the glutamate GdhA gene encoding dehydrogenase enhanced.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das Homoserinresistenz vermittelnde rhtB-Gen verstärkt.15. The method according to claim 1, characterized in that at the same time the resistance to homoserine mediating rhtB gene amplified.

16. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae in denen zumindest das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,
b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
c) Isolieren des L-Threonins.

16. A process for the preparation of L-threonine, characterized in that the following steps are carried out:

a) fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family in which at least the thrE gene of coryneform bacteria is amplified (overexpressed), possibly in combination with other genes,
b) accumulation of L-threonine in the medium or in the cells of the microorganisms of the Enterobacteriaceae family, and
c) isolating the L-threonine.

17. Plasmid pZ1thrE welches das thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 enthält.17. Plasmid pZ1thrE which contains the thrE gene from Contains Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

18. Brevibacterium flavum Stamm DM368-2 pZ1thrE als DSM 12840 hinterlegt bei der DSMZ, Braunschweig.18. Brevibacterium flavum strain DM368-2 pZ1thrE as DSM 12840 deposited with the DSMZ, Braunschweig.