DE10101501A1

DE10101501A1 - Process for the fermentative production of pantothenic acid

Info

Publication number: DE10101501A1
Application number: DE10101501A
Authority: DE
Inventors: Lothar Eggeling; Hermann Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2002-08-01
Also published as: WO2002055711A3; WO2002055711A2

Abstract

Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird durch eine Abschwächung oder Ausschaltung der Transaminase eine erhöhte Pantothensäurebildung möglich. Dies kann durch Deletion oder eine geringere Expression der für Transaminase codierenden Gensequenzen erreicht werden. Beispielsweise konnte durch Deletion oder Reduzierung des Expression des neu isolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum in verbesserter Weise Panthotenat produziert werden. DOLLAR A Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz und dem Verfahren wird es möglich, durch Reduzierung der Transaminaseaktivität, eine verstärkte Pantothensäureproduktion zu erreichen.The invention relates to microorganisms of the genus Corynebacterium which are replicable and optionally recombinant DNA. It also relates to a process for the fermentative production of pantothenic acid. DOLLAR A According to the invention, an increased pantothenic acid formation is possible by weakening or switching off the transaminase. This can be achieved by deletion or a lower expression of the gene sequences coding for transaminase. For example, by deleting or reducing the expression of the newly isolated D-pantothenate biosynthetic gene brnA from Corynebacterium glutamicum, panthotenate could be produced in an improved manner. DOLLAR A With the aid of the nucleotide sequence according to the invention and the method, it is possible to achieve increased pantothenic acid production by reducing the transaminase activity.

Description

Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekom binante DNA. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure.The invention relates to microorganisms of the genus Corynebacterium replicable, possibly recom binant DNA. It also concerns a procedure for fermentative production of pantothenic acid.

Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der Hu manernährung und in der Tierernährung Anwendung findet. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, ver besserte Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure bereitzustellen.Pantothenic acid is a commercially important one Vitamin, which in cosmetics, medicine, Hu man nutrition and animal nutrition. There is therefore a general interest in ver improved process for the production of pantothenic acid provide.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder bio technologisch durch Fermentation geeigneter Mikroorga nismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Der Vorteil der biotechnologischen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der Bildung der korrekten ste reoisomeren Form, nämlich der D-Form von Pantothen säure, die frei von L-Pantothensäure ist.Pantothenic acid can be obtained by chemical synthesis or bio technologically through fermentation of suitable microorganisms nisms are prepared in suitable nutrient solutions. The advantage of biotechnological manufacturing through Microorganisms lie in the formation of the correct ste reoisomeric form, namely the D-form of pantothes acid that is free of L-pantothenic acid.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EPA 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei Escherichia coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen mit tels der Plasmide pFV3 und pFV5 die Bildung von D-Pan tothensäure verbessert wird.Different types of bacteria, such as B. Escherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes and also yeasts, such as. B. Debaromyces castellii can, as shown in EPA 0 493 060, in a Nutrient solution, the glucose, DL-pantoic acid and β-alanine contains, produce D-pantothenic acid. EP 0 493 060 further shows that in Escherichia coli Amplification of pantothenic acid biosynthesis genes with plasmids pFV3 and pFV5 the formation of D-Pan dead acid is improved.

EP 0 590 857 beschreibt Stämme von Escherichia coli, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite, wie z. B. Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyaspara ginsäure etc. tragen und in einer Nährlösung, die Glu cose und β-Alanin enthält, D-Pantoinsäure und D-Panto thensäure produzieren. In EPA 0 590 857 wird weiterhin gezeigt, daß durch Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sind, die Produktion von D-Pantoinsäure und D-Panto thensäure verbessert werden kann.EP 0 590 857 describes strains of Escherichia coli, resistance to various antimetabolites, such as z. B. salicylic acid, α-keto butyric acid, β-hydroxyaspara ginic acid etc. and in a nutrient solution, the Glu contains cose and β-alanine, D-pantoic acid and D-panto produce thenic acid. EPA 0 590 857 continues demonstrated that amplification of pantothenic acid Biosynthetic genes containing plasmid pFV31 are, the production of D-pantoic acid and D-Panto thenic acid can be improved.

In WO 97/10340 wird darüber hinaus gezeigt, daß in Pan tothensäure bildenden Mutanten von Escherichia coli durch Erhöhung der Aktivität des Enzyms Acetohydroxy säure-Synthase II, einem Enzym der Valin Biosynthese, die Pantothensäureproduktion weiter gesteigert werden kann.In WO 97/10340 it is also shown that in Pan dead acid forming mutants of Escherichia coli by increasing the activity of the enzyme acetohydroxy acid synthase II, an enzyme of valine biosynthesis, pantothenic acid production can be further increased can.

Durch stoffwechselbedingte Nebenreaktionen werden neben der Pantothensäure noch andere Aminosäuren, wie z. B. Isoleucin, Valin und Leucin gebildet. Um eine hohe Pro duktausbeute an Pantothensäure zu erzielen, muß die Bildung dieser Stoffwechselprodukte unterdrückt oder reduziert werden.Due to metabolic side reactions, in addition to the pantothenic acid still other amino acids, such as. B. Isoleucine, valine and leucine are formed. To be a high pro To achieve product yield of pantothenic acid, the Suppresses formation of these metabolites or be reduced.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine DNA bzw. einen Plasmidvektor bereitzustellen, mit der bzw. dem eine gesteigerte Pantothensäurebildung erreicht werden kann. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem eine hohe Pantothensäureproduktion mit Mikroorganismen möglich wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Mikroor ganismen, mit denen eine erhöhte Pantothensäureproduk tion möglich ist.It is therefore an object of the invention, a DNA or a Provide plasmid vector with which one increased pantothenic acid formation can be achieved. It is also an object of the invention to provide a method to create with a high pantothenic acid production with microorganisms. Another job the invention resides in the provision of microor mechanisms with which an increased pantothenic acid product tion is possible.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die re kombinanten DNA-Sequenzen, wie sie in den Ansprüchen niedergelegt sind. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch die Verwendung der gemäß Anspruch 6 hergestell ten, verbesserten, Pantothensäure erzeugenden Mikro organismen sowie die Verwendung des gemäß Anspruch 7 hergestellten Plasmidvektors. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstel lung von Pantothensäure unter Verwendung von Mikroor ganismen, die insbesondere bereits Pantothensäure pro duzieren und in denen das für die Transaminase codie rende brnA-Gen deletiert wurde oder in seiner Expres sion abgeschwächt wird oder gar nicht exprimiert wird.The object is achieved by the re combined DNA sequences as in the claims are laid down. The task continues to be solved by using the manufactured according to claim 6 th, improved, pantothenic acid-producing micro organisms and the use of the according to claim 7 prepared plasmid vector. Subject of the invention is still a process for fermentative production treatment of pantothenic acid using Mikroor ganisms, in particular already pantothenic acid per induce and in which that for the Transaminase codie rende brnA gene was deleted or in its express sion is weakened or is not expressed at all.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous developments of the inventions are in specified in the subclaims.

Wenn im folgenden Text D-Pantothensäure oder Pantothen säure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freie Säure sondern auch die Salze der D-Panto thensäure, wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint. If in the following text D-pantothenic acid or pantothen acid or pantothenate are not mentioned only the free acid but also the salts of D-Panto thenic acid such as B. the calcium, sodium, ammonium or potassium salt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der DNA sowie den Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pantothensäure zu produzieren. Die Erfinder fanden her aus, daß nach Deletion oder Reduzierung der Expression des neu isolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum, das für das Enzym Tran saminase codiert, in verbesserter Weise D-Pantothenat produziert werden kann, da stoffwechselbedingte Neben reaktionen abgeschwächt oder komplett ausgeschaltet werden. Durch die Reduktion der Transaminase Aktivität wird die durch dieses Enzym katalysierte Produktion von L-Isoleucin, L-Valin und L-Leucin entweder abgeschwächt oder völlig blockiert. So können die für die Pantothen säurebildung benötigten Vorstufen nur noch in Richtung der Pantothensäure umgesetzt werden. Die Erfinder haben weiter festgestellt, daß in Kombination mit einer Ver stärkung bzw. Überexpression folgender Gene eine ver stärkte Pantothenatbildung bewirkt wird: ilvBN-Gene, die für das Enzym Acetohydroxysäuresynthase codieren, ilvC-Gen, das für das Enzym Isomeroreduktase codiert, ilvD-Gen, das für das Enzym Dihydroxysäuredehydratase codiert, sowie Verstärkung bzw. Überexpression des Gens panB, das für das Enzym Ketopantoathydroxymethyltrans ferase codiert und des Gens panC, das für das Enzym Pantothenatligase codiert sowie des Gens panD, welches für das Enzym Aspartatdecarboxylase codiert. Durch Ak tivierung eines, mehrerer oder aller dieser Enzyme wer den auch verstärkt die für die Pantothensäurebildung benötigten Vorstufen gebildet. With the method according to the invention and the DNA as well it is now possible to counteract the microorganisms conventional processes an increased concentration To produce pantothenic acid. The inventors found it from that after deletion or reduction in expression of the newly isolated D-pantothenate biosynthetic gene brnA from Corynebacterium glutamicum, which is responsible for the enzyme Tran encoded saminase, in an improved manner D-pantothenate can be produced because of metabolic secondary reactions weakened or completely switched off become. By reducing the transaminase activity the production of catalyzed by this enzyme L-isoleucine, L-valine and L-leucine are either attenuated or completely blocked. So they can for the pantothes Acid formation only requires precursors in the direction of pantothenic acid are implemented. The inventors have further found that in combination with a ver Strengthening or overexpression of the following genes a ver increased pantothenate formation is brought about: ilvBN genes, which code for the enzyme acetohydroxy acid synthase, ilvC gene coding for the enzyme isomeroreductase, ilvD gene responsible for the enzyme dihydroxy acid dehydratase encoded, as well as amplification or overexpression of the gene panB, which is responsible for the enzyme ketopantoate hydroxymethyltrans ferase encodes and the gene panC, which is responsible for the enzyme Coded pantothenate ligase and the gene panD, which encoded for the enzyme aspartate decarboxylase. By Ak activation of one, several or all of these enzymes which also reinforces that for pantothenic acid formation required preliminary stages.

Der Begriff Verstärkung beschreibt in diesem Zusammen hang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man z. B. die Kopienzahl des Gens/der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term reinforcement describes this together the increase in intracellular activity or several enzymes in a microorganism that can be encoded by the appropriate DNA by z. B. increases the number of copies of the gene / genes, one strong promoter or uses a gene that for a corresponding enzyme with a high activity coded and combined these measures if necessary.

Der Begriff "geringer exprimiert" beinhaltet die Ab schwächung der Synthese der Transaminase bzw. die voll ständige Deletion des Transaminase brnA-Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Ak tivität der Transaminase. Dies kann beispielsweise durch Verwendung eines schwachen Promotors oder Ver wendung eines Gens bzw. Allels, das für ein entspre chendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert, bzw. durch Inaktivierung des entsprechenden Enzyms (Protein) und gegebenenfalls Kombination dieser Maß nahmen erfolgen.The term "less expressed" includes the Ab weakening the synthesis of transaminase or the full permanent deletion of the transaminase brnA gene or the Reduction or elimination of the intracellular AK activity of transaminase. For example by using a weak promoter or ver use of a gene or allele that corresponds to a encoding enzyme with a low activity, or by inactivating the corresponding enzyme (Protein) and possibly a combination of these measures took place.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen umfassen in Mikroorganismen der Gattung Corynbacterium replizier bare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die entweder keine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequenz enthalten oder eine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequen enthalten, die nicht oder gegenüber na türlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer expri miert werden. Der Begriff "natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstämmen, iso liert werden können. The nucleotide sequences according to the invention comprise in Microorganisms of the genus Corynbacterium replizier bare, possibly recombinant DNA, which either no nucleotide sequence coding for a transaminase contain or a coding for a transaminase Contain nucleotide sequences that are not or opposite na naturally occurring nucleotide sequences of lower expri be lubricated. The term "natural" is intended to mean such Nucleotide sequences do not include genetically modified microorganisms, the wild type strains, iso can be lated.

Weiterhin sollen die Nukleotidsequenzen Sequenzen um fassen, die
Furthermore, the nucleotide sequences should include sequences that

a) eine Sequenz, dargestellt in Seq.-ID-Nr. 1, die für brnA codiert, umfaßt odera) a sequence shown in SEQ ID NO. 1 that encoded, encompassed or encoded for brnA
b) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) inner halb des Bereichs der Degeneration des geneti schen Codes entspricht oderb) comprises a sequence which is internal to sequence (i) half the range of degeneration of the geneti codes or or
c) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz (i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfallsc) comprises a sequence which with one to the sequence (i) or (ii) hybridizes complementary sequence, and if necessary
d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfaßt.d) includes functionally neutral meaning mutations in (i).

Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmuta tionen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threo nin.The term means functionally neutral meaning muta the exchange of chemically similar amino acids, such as B. glycine by alanine or serine by threo nin.

Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine Transaminase codierende Nukleotid sequenzen entfernt oder in ihrer Expression redu ziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel das für die Transaminase codierende brnA-Gen im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch können nur Teile des Gens deletiert werden oder auch mutierte Fragmente des Transaminase-Gens ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der Transa minaseaktivität erreicht (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842; Morbach et al., (1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45: 612-620). Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der erfindungsgemäße C. glutamicum Stamm 13032ΔbrnA, der eine Deletion im brnA-Gen trägt.With the help of directed recombinant DNA techniques can nucleotide coding for a transaminase sequences removed or reduced in their expression be decorated. With the help of these methods can Example that coding for the transaminase brnA gene can be deleted in the chromosome. suitable Methods for this are described in Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Only parts of the gene can also be deleted or mutated fragments of the transaminase gene be replaced. By deletion or exchange becomes a loss or a reduction in the transa minase activity reached (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842; Morbach et al., (1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45: 612-620). An example of such a mutant is the C. glutamicum strain according to the invention 13032ΔbrnA, which carries a deletion in the brnA gene.

Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität der Transa minase abzuschwächen oder auszuschalten, sind Muta geneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Ver fahren, die chemische Reagenzien, wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV- Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit an schließender Suche der gewünschten Mikroorganismen auf Bedürftigkeit für L-Valin, L-Leucin und L-Iso leucin. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutan tensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.Another way to see the activity of the transa Attenuating or eliminating minase are muta genesis process. These include undirected ver drive the chemical reagents, such as. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV Use radiation for mutagenesis, with on closing search for the desired microorganisms on need for L-valine, L-leucine and L-iso leucine. Mutation triggering method and mutan Searches are well known and can be found at others at Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) or in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).

Darüber hinaus kann auch die Expression des Transa minase (brnA)-Gens reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich strom aufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothenatbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation mög lich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Desweiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit gerin ger Aktivität codieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression des Transaminase-Gens durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.In addition, the expression of the Transa minase (brnA) gene can be reduced. So it can Promoter and regulatory region that is streaming located upstream of the structural gene. Expression cassettes act in the same way be installed upstream of the structural gene. It is additional through adjustable promoters possible expression in the course of fermentative To reduce D-pantothenate formation. Besides regulation of translation is also possible Lich, for example, by the stability of the m-RNA is reduced. Genes can also be used be that for the corresponding enzyme with clot encode activity. Alternatively, you can continue a reduced expression of the transaminase gene by changing the media composition and Culture tour can be achieved. Find instructions the expert among others in Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), from Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in the European Patent Specification EPS 0 472 869, in the U.S. Patent 4,601,893, by Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991), Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), at LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) and in the patent application WO 96/15246.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegen den Erfindung sind, können Pantothensäure aus Glu cose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Me lasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Et hanol herstellen. Es kann sich um Gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, oder Gram positive Bakterien, z. B. der Gattung Bacillus oder um coryneforme Bakterien der Gattungen Coryne bacterium oder Arthrobacter handeln. Bei der Gat tung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fach welt für ihre Fähigkeit bekannt ist, nieder molekulare Metabolite wie D-Pantothensäure oder Aminosäuren zu bilden. Zu dieser Art gehören Wild typstämme, wie z. B. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Cory nebacterium melassecola ATCC17965 und andere.The microorganisms that are the subject of According to the invention, pantothenic acid from Glu cose, sucrose, lactose, fructose, maltose, me let, starch, cellulose or from glycerin and Et produce hanol. It can be grief-negative Bacteria, such as B. Escherichia coli, or grief positive bacteria, e.g. B. the genus Bacillus or coryneform bacteria of the genus Coryne act bacterium or arthrobacter. At the Gat tung Corynebacterium is especially the species Corynebacterium to call glutamicum that in the subject world is known for its ability molecular metabolites such as D-pantothenic acid or To form amino acids. Game belongs to this species type strains, such as B. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Cory nebacterium melassecola ATCC17965 and others.

Zur Isolierung des Gens brnA von C. glutamicum oder anderer Gene wird zunächst eine Genbank angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekann ten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine bekannte Gen bank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)), die in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecu lar and General Genetics, 252: 255-265, 1996) be schreiben eine Genbank von C. glutamicum 13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Als Wirte eignen sich besonders solche C. glutamicum Stämme, die restrik tions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm R127, der von Liebl et al. (FEMS Microbiol. Lett. 65: 269-304) beschrieben wurde.For isolation of the gene brnA from C. glutamicum or other genes, a gene bank is first created. The creation of gene banks is generally known textbooks and manuals. An example is the textbook by Winnacker: Gene and clones, an introduction to genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) or the Sambrook et al. handbook: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A well known gene bank is that of the E. coli K-12 strain W3110, the by Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)), the was created in λ vectors. Bathe et al. (Molecu Lar and General Genetics, 252: 255-265, 1996) write a gene bank of C. glutamicum 13032, the with the help of the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) in E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). Are suitable as hosts especially those C. glutamicum strains that restrict tion and recombination defect. An example for this is the strain R127, which was developed by Liebl et al. (FEMS Microbiol. Lett. 65: 269-304) has been.

Die Genbank wird anschließend in einen Indikator stamm durch Transformation (Hanahan, Journal of Mo lecular Biology 166, 557-580, 1983) oder Elektro poration (Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) eingebaut. Der Indikatorstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er eine Mutation in dem interessierenden Gen besitzt, die einen detek tierbaren Phänotyp, z. B. eine Auxotrophie hervor ruft. Die Indikatorstämme bzw. Mutanten sind aus publizierten Quellen oder Stammsammlungen erhält lich oder müssen gegebenenfalls selbst hergestellt werden. Ein Beispiel hierfür ist die im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierte C. glutamicum Mutante R127/12, die in dem für die Transaminase codierendem brnA-Gen defekt ist. Nach erfolgreicher Transformation des Indikatorstammes, wie z. B. der brnA-Mutante mit einem rekombinanten Plasmid, kom pensiert das Plasmid die Eigenschaft des Indi katorstammes, wie z. B. die Bedürftigkeit für die verzweigtkettigen Aminosäuren L-Isoleucin, L-Valin, L-Leucin. Das Plasmid komplementiert den geneti schen Funktionsdefekt des Indikatorstammes.The gene bank is then turned into an indicator stem from transformation (Hanahan, Journal of Mo lecular Biology 166, 557-580, 1983) or Elektro poration (Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347). The indicator root is characterized by the fact that it has a mutation in the gene of interest that detec animal phenotype, e.g. B. an auxotrophy calls. The indicator strains or mutants are off published sources or master collections Lich or may have to be self-made become. An example of this is that in the context of present invention isolated C. glutamicum Mutant R127 / 12, which in the for the transaminase coding brnA gene is defective. After successful Transformation of the indicator base, such as B. the brnA mutant with a recombinant plasmid, com the plasmid pens the property of the indi kator strain, such as. B. the need for branched chain amino acids L-isoleucine, L-valine, L-leucine. The plasmid complements the geneti working defect of the indicator master.

Das dergestalt isolierte Gen bzw. DNA-Fragment kann durch Bestimmung der Sequenz, wie z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben und charakterisiert werden. An schließend kann der Grad an Identität zu bekannten Genen, die in Datenbanken wie z. B. der GenBank (Benson et el., 1998, Nuleic Acids Research, 26: 1- 7) enthalten sind, mit publizierten Methoden (Alt schul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410) analysiert werden.The gene or DNA fragment isolated in this way can by determining the sequence, e.g. B. at Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977) are described and characterized. to in conclusion the degree of identity can be known to Genes that are in databases such as. B. the GenBank (Benson et el., 1998, Nuleic Acids Research, 26: 1- 7) are included, using published methods (Alt Schul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410).

Auf diese Weise wurde die neue für das Gen brnA co dierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ-ID-NR. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurden aus der vorliegen den DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der Transaminase abgeleitet. In SEQ-ID-NR. 2 ist die sich ergebende Aminosäure sequenz des brnA-Genproduktes dargestellt.In this way, the new gene for the brnA co obtained DNA sequence from C. glutamicum, which as SEQ ID NO. 1 part of the present Invention is. Furthermore, from the present the DNA sequence using the methods described above derived the amino acid sequence of the transaminase. In SEQ ID NO. 2 is the resulting amino acid sequence of the brnA gene product is shown.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch- Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pantothensäureproduktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsme thoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstech nik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gu stav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesba den, (1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention can continuously or discontinuously in batch process (set cultivation) or in fed batch (feed process) or repeated fed batch Process (repetitive feed process) for the purpose production of pantothenic acid. A summary of known cultivation methods thoden is in the textbook by Chmiel (Bioprozesstech nik 1. Introduction to bioprocess engineering (Gu stav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in Textbook by Storhas (bioreactors and peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesba den, (1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zuc ker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnen blumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und orga nische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet wer den. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können orga nische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Mais quellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder an organische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoni umchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoff quellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogen phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet wer den. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Me tallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Ami nosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben ge nannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der Pantothensäure, wie z. B. β-Alanin oder L-Valin, zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in ge eigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.The culture medium to be used must be suitable Way the demands of the respective microorganisms suffice. Descriptions of cultural media from various Microorganisms are described in the manual "Manual of American Methods for General Bacteriology Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included. Zuc ker and carbohydrates, such as. B. glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch and Cellulose, oils and fats such as B. Soybean oil, sunbathing flower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as z. B. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such as B. glycerin and ethanol and orga African acids, such as. B. acetic acid, who used the. These substances can be used individually or as a mixture be used. Orga niche nitrogenous compounds such as peptones, Yeast extract, meat extract, malt extract, corn spring water, soybean meal and urea or organic compounds such as ammonium sulfate, ammoni umchloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture become. Potassium dihydrogen can be used as a source of phosphorus phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or die corresponding sodium-containing salts are used the. The culture medium must continue to salts of Me contain tallen such. B. magnesium sulfate or Iron sulfate, which are necessary for growth. After all, essential growth substances like Ami noacids and vitamins in addition to the above mentioned substances are used. The culture medium can also precursors of pantothenic acid, such as z. B. β-alanine or L-valine can be added. The The starting materials mentioned can be used for culture in the form added a one-off approach or in ge appropriately fed during cultivation become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbin dungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoni ak oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaum mittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, einge setzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt wer den. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten wer den Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischun gen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 50°C und vorzugsweise bei 25°C bis 45°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maxi mum an Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht.Basic verbin are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia ak or acidic compounds such as phosphoric acid or Sulfuric acid used in a suitable manner. to Control of foam development can be anti-foam medium, such as B. fatty acid polyglycol ester be set. To maintain stability of plasmids can selectively select the appropriate medium acting substances, e.g. B. antibiotics, who added the. To maintain aerobic conditions the oxygen or gas mixture containing oxygen conditions such. B. air, entered in the culture. The The temperature of the culture is usually 20 ° C up to 50 ° C and preferably at 25 ° C to 45 ° C. The Culture continues until a maxi mum of pantothenic acid. That goal will usually be within 10 to 160 hours reached.

Die Konzentration an gebildeter Pantothensäure kann mit bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) bestimmt werden. Zur mikrobiologischen Bestimmung von Pantothensäure wird gebräuchlicherweise der Stamm Lactobacillus plantarum ATCC8014 eingesetzt (U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980). Darüber hinaus werden auch andere Testorganismen, wie z. B. Pediococcus acidilactici NCIB6990 zur mikrobiologischen Bestimmung von Pantothenatkonzentrationen eingesetzt (Sollberg and Hegna; Methods in Enzymo logy 62, 201-204 (1979)).The concentration of pantothenic acid formed can with known methods (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)). to microbiological determination of pantothenic acid the strain Lactobacillus is commonly used plantarum ATCC8014 used (U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980). Furthermore other test organisms, such as. B. Pediococcus acidilactici NCIB6990 for microbiological Determination of pantothenate concentrations used (Sollberg and Hegna; Methods in Enzymo logy 62, 201-204 (1979)).

Folgende Mikroorganismen wurden am 22.12.2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Ver trag hinterlegt:
Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA als DSM 13971
Corynebacterium glutamicum R127/12 als DSM 13970The following microorganisms were deposited on December 22, 2000 with the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) in accordance with the Budapest Treaty:
Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA as DSM 13971
Corynebacterium glutamicum R127 / 12 as DSM 13970

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü chen angegeben.Advantageous further developments are in the dependent claims Chen specified.

Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens:The drawings show an exemplary embodiment form of the method according to the invention:

Es zeigt:It shows:

Fig. 1 Plasmidvektor pJC1brnA Fig. 1 plasmid vector pJC1brnA

Fig. 2 Plasmidvektor pK19mobsacΔbrnA Fig. 2 plasmid vector pK19mobsacΔbrnA

Bei den Angaben der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca. -Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhal ten werden. Die in den Figuren verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
aminopep: Kodierbereich des Aminopeptidasegens
ApaLI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ApaLI
ApoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ApoI
Asp7181: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Asp7181
AvaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms AvaI
BalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BalI
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
BclI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BclI
BgII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BgII
BglII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII
brnA: Kodierbereich des Transaminasegens
bsp: Basenpaare
BspH:I Schnittstelle des Restriktionsenzyms BspHI
BsrDi: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrDi
BsrGI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrGI
Bsu36I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bsu36I
dbrnA: Deletiertes brnA Gen
DraIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DraIII
DsaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DsaI
Eco47III: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Eco47III
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Kan: Kodierbereich des Kanamycinresistenzgens
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NaeI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NaeI
NcoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI
NheI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NheI
OriT: Origin of transfer
OriV: Origin der vegetativen Replikation
oxred': Kodierbereich des Oxidoreduktasegens
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
PvuI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PvuI
RsrII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms RsrII
SacB: Kodierbereich des Sucroseresistenzgens
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SexAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SexAI
SgrAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SgrAI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
Sse8387I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sse8387I
Tth111I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Tth111I
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
XhoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
XmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XmaI The base pair numbers are approximate values that are obtained within the scope of reproducibility. The abbreviations used in the figures have the following meaning:
aminopep: coding region of the aminopeptidase gene
ApaLI: Interface of the restriction enzyme ApaLI
ApoI: Interface of the restriction enzyme ApoI
Asp7181: Interface of the restriction enzyme Asp7181
AvaI: Interface of the restriction enzyme AvaI
BalI: Interface of the restriction enzyme BalI
BamHI: interface of the restriction enzyme BamHI
BclI: interface of the restriction enzyme BclI
BgII: interface of the restriction enzyme BgII
BglII: interface of the restriction enzyme BglII
brnA: coding region of the transaminase gene
Example: base pairs
BspH: I interface of the restriction enzyme BspHI
BsrDi: Interface of the restriction enzyme BsrDi
BsrGI: Interface of the restriction enzyme BsrGI
Bsu36I: Interface of the restriction enzyme Bsu36I
dbrnA: deleted brnA gene
DraIII: Interface of the restriction enzyme DraIII
DsaI: interface of the restriction enzyme DsaI
Eco47III: interface of the restriction enzyme Eco47III
EcoRI: Interface of the restriction enzyme EcoRI
HindIII: Interface of the restriction enzyme HindIII
Kan: coding region of the kanamycin resistance gene
KpnI: interface of the restriction enzyme KpnI
NaeI: Interface of the restriction enzyme NaeI
NcoI: Interface of the restriction enzyme NcoI
NheI: interface of the restriction enzyme NheI
OriT: Origin of transfer
OriV: Origin of vegetative replication
oxred ': coding region of the oxidoreductase gene
PstI: interface of the restriction enzyme PstI
PvuI: interface of the restriction enzyme PvuI
RsrII: interface of the restriction enzyme RsrII
SacB: coding region of the sucrose resistance gene
SalI: Interface of the restriction enzyme SalI
SexAI: Interface of the restriction enzyme SexAI
SgrAI: interface of the restriction enzyme SgrAI
SmaI: interface of the restriction enzyme SmaI
SphI: interface of the restriction enzyme SphI
Sse8387I: cleavage site of the restriction enzyme Sse8387I
Tth111I: interface of the restriction enzyme Tth111I
XbaI: interface of the restriction enzyme XbaI
XhoI: interface of the restriction enzyme XhoI
XmaI: interface of the restriction enzyme XmaI

BeispieleExamples

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention will hereinafter be described with reference to Exemplary embodiments explained in more detail.

Beispiel 1example 1 Klonierung, Sequenzierung und Expression des für die Transaminase codierenden brnA-Gens aus Corynebacterium glutamicumCloning, sequencing and expression of the for the Corynebacterium brnA gene encoding transaminase glutamicum 1. Isolierung einer brnA Mutante von Corynebacterium glutamicum1. Isolation of a brnA mutant from Corynebacterium glutamicum

Der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) wurde mit N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin mutagenisiert (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Dazu wurden 5 ml einer über Nacht angezogenen Coryne bacterium glutamicum Kultur mit 250 µl N-methyl-N- nitro-N-nitrosoguanidin (5 mg/ml Dimethylformamid) versetzt und 30 Minuten bei 30°C und 200 Upm inkubiert (Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: 326). Die Zellen wurden anschließend zweimal mit steriler NaCl- Lösung (0,9%) gewaschen. Durch Replikaplattierung auf Minimalmediumplatten CGXII mit 15 g/l Agar (Keilhauer et al Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), wurden Mutanten isoliert, die bei Zugabe von L-Valin, L-Iso leucin und L-Leucin (je 0,1 g/l) wuchsen, aber nicht bei Zugabe von Keto-Valin, Keto-Isoleucin und Keto- Leucin (je 0,1 g/l). The strain Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) was published with N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine mutagenized (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). To this were added 5 ml of a Coryne which had been put on overnight bacterium glutamicum culture with 250 µl N-methyl-N- nitro-N-nitrosoguanidine (5 mg / ml dimethylformamide) added and incubated for 30 minutes at 30 ° C and 200 rpm (Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: 326). The Cells were then washed twice with sterile NaCl Solution (0.9%) washed. By replica plating on Minimal medium plates CGXII with 15 g / l agar (Keilhauer et al Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) Mutants isolated when L-valine, L-iso leucine and L-leucine (0.1 g / l each) grew, but not when adding keto-valine, keto-isoleucine and keto- Leucine (0.1 g / l each).

Die Enzymaktivität der Transaminase wurde im Rohextrakt dieser Mutanten bestimmt. Dazu wurden die Klone in 60 ml LB-Medium kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte mittels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest ein gesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat, 0,1 ml 40 mM Ketoiso caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat. Die Testansätze wurden bei 30°C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 µl Proben genommen und deren Leucinkon zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, weist der Stamm R127/12 keine Transaminase Ak tivität auf.The enzyme activity of the transaminase was in the crude extract of these mutants. To do this, the clones in 60 ml LB medium cultured and in the exponential Centrifuged growth phase. The cell pellet was washed once with 0.05 M potassium phosphate buffer and in resuspended in the same buffer. The cell disruption took place using a 10 minute ultrasound treatment (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). The cell debris was then passed through a 30 min centrifugation at 13000 rpm and 4 ° C separated and the supernatant as a crude extract in the enzyme test set. The reaction batch of the enzyme test contained 0.2 ml 0.25 M Tris / HCl, pH 8, 0.05 ml crude extract, and 0.1 ml 2.5 mM pyridoxal phosphate, 0.1 ml 40 mM ketoiso caproat and 0.1 ml 0.5 M Na glutamate. The test approaches were incubated at 30 ° C after 10, 20 and 30 minutes 200 µl samples were taken and their leucine concentrations concentration determined using HPLC analysis (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Like table 1 shows, the strain R127 / 12 has no Transaminase Ak activity.

Tabelle 1 Table 1

Spezifische Aktivität (µmol/min und mg Protein) der Transaminase in Corynebacterium glutamicum Stämmen Specific activity (µmol / min and mg protein) of transaminase in Corynebacterium glutamicum strains

2. Klonierung des brnA-Gens von Corynebacterium gluta micum2. Cloning of the brnA gene from Corynebacterium gluta Micum

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum 13032 wurde wie bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9 (1990) 84-87) beschrieben isoliert. Diese wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A (Boehringer Mannheim) gespalten und durch Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory man ual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) auf getrennt. Die Fraktion mit dem Fragmentgrößenbereich von etwa 6-10 kb wurde zur Ligation mit dem Vektor pJC1 (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220 (1990) 478-480) eingesetzt. Der Vektor pJC1 wurde hier zu mit BamHI linearisiert und dephosphoryliert. Fünf ng davon wurden mit 20 ng der genannten Fraktion der chro mosomalen DNA ligiert und damit die Mutante R127/12 durch Elektroporation (Haynes und Britz, FEMS Microbio logy Letters 61 (1989) 329-334) transformiert. Die Transformanten wurden auf die Fähigkeit getestet auf CGXII Agarplatten ohne Zugabe der verzweigtkettigen Aminosäuren wachsen zu können. Von über 5000 getesteten Transformanden wuchsen nach Replicaplattierung und zweitägiger Inkubation bei 30°C 8 Klone auf Minimalme diumplatten. Von diesen Klonen wurden Plasmidpräpara tionen, wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben, durchgeführt. Restriktionsanaly sen der Plasmid-DNA ergaben, daß in allen 8 Klonen das selbe Plasmid, im folgenden pJC1brnA genannt, enthalten war. Das Plasmid trägt ein Insert von 6,1 kb und wurde durch Retransformation auf seine Fähigkeit, die brnA- Mutante R127/12 zu komplementieren, getestet. Durch Subklonierung wurde der für die Komplementation der Mutante R127/12 verantwortliche Bereich auf ein 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment eingegrenzt.Chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum 13032 as with Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9 (1990) 84-87). This was with the Restriction enzyme Sau3A (Boehringer Mannheim) cleaved and by sucrose density gradient centrifugation (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory man ual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) Cut. The fraction with the fragment size range of about 6-10 kb was used for ligation with the vector pJC1 (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220 (1990) 478-480). The vector pJC1 was here linearized with BamHI and dephosphorylated. Five ng of these, the chro ligated mosomal DNA and thus the mutant R127 / 12 by electroporation (Haynes and Britz, FEMS Microbio logy Letters 61 (1989) 329-334). The Transformants were tested for ability CGXII agar plates without adding the branched chain To be able to grow amino acids. Of over 5000 tested Transformants grew after replica plating and two days incubation at 30 ° C 8 clones on Minimalme diumplatten. From these clones, plasmid preparations were made ions, as in Schwarzer et al. (Bio / Technology (1990) 9: 84-87). Restriktionsanaly of the plasmid DNA showed that in all 8 clones same plasmid, hereinafter called pJC1brnA, included was. The plasmid carries an insert of 6.1 kb and was by re-transforming its ability to Complement mutant R127 / 12, tested. By Subcloning was used to complement the Mutant R127 / 12 responsible area to a 1.5 kb BglI / NaeI fragment limited.

3. Sequenzierung des brnA-Gens3. Sequencing of the brnA gene

Die Nukleinsäuresequenz des 1,5 kb BglI/NaeI-Fragments wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. durchgeführt (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Dabei wurde der Auto-Read Sequencing kit verwendet (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schwe den). Die gelelektrophoretische Analyse erfolgte mit dem automatischen Laser-Fluoreszenz Sequenziergerät (A.L.F.) von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden). Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB) analysiert. Die Nukleotidsequenz mit den flankierenden Bereichen BglI/NaeI ist als SEQ-ID-Nr. 1 wiedergegeben. Die Analyse ergab ein offenes Leseraster von 1573 Ba senpaaren, das als brnA-Gen identifiziert wurde und für ein Polypeptid von 367 Aminosäuren codiert, das als SEQ-ID-NR. 2 wiedergegeben ist.The nucleic acid sequence of the 1.5 kb BglI / NaeI fragment was based on the Sanger dideoxy chain termination method et al. carried out (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). The Auto-Read Sequencing kit used (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schwe the). The gel electrophoretic analysis was carried out with the automatic laser fluorescence sequencer (A.L.F.) from Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). The nucleotide sequence obtained was compared with the Program package HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB) analyzed. The nucleotide sequence with the flanking Areas BglI / NaeI is listed as SEQ ID no. 1 reproduced. The analysis showed an open reading frame of 1573 Ba pairs, which was identified as the brnA gene and for encodes a 367 amino acid polypeptide that is recognized as SEQ ID NO. 2 is reproduced.

4. Expression des brnA-Gens4. Expression of the brnA gene

Das Plasmid pJC1 wurde mit den Restriktionsenzymen BglI und NaeI entsprechend den Angaben des Herstellers des Restriktionsenzyms verdaut (Roche, Boehringer Mann heim). Anschließend wurde das 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment mittels Ionenaustauschersäulchen isoliert (Quiagen, Hilden). Der überhängende BglI Schnitt des isolierten Fragmentes wurde mit Klenow Polymerase aufgefüllt. Der Vektor pJC1 (Cremer et al., Mol. Gen. Genet (1990) 220: 478-480) wurde PstI-geschnitten, ebenfalls mit Klenow Polymerase behandelt, und anschließend Fragment und Vektor ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) transformiert (Hanahan, Jour nal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580). Durch Plasmidpräparationen (Sambrook et al., Molecular clon ing. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) von Klonen wurde ein Klon identi fiziert, der das rekombinante Plasmid pJC1brnA enthielt. Mit diesem Plasmid wurde Corynebacterium glutamicum R127 mittels Elektroporation transformiert wie bei Haynes et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329-334) beschrieben. Von Corynebacterium glutamicum R127 pJC1 und Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA wurde anschließend die durch brnA codierte Transamina se-Aktivität bestimmt. Dazu wurden die Klone in 60 ml LB-Medium kultiviert und in der exponentiellen Wachs tumsphase abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspensiert. Der Zellaufschluß erfolgte mit tels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest ein gesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat, 0,1 ml 40 mM Ketoiso caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat. Die Testansätze wurden bei 30°C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 µl Proben genommen und deren Leucinkon zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Wie Tabelle 2 zeigt, weist der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA eine gesteigerte Transaminase-Aktivität gegenüber dem Kontrollstamm auf.The plasmid pJC1 was with the restriction enzymes BglI and NaeI according to the manufacturer 's instructions Restriction enzyme digested (Roche, Boehringer Mann home). Then the 1.5 kb BglI / NaeI fragment isolated by means of ion exchange columns (Quiagen, Hilden). The overhanging BglI section of the isolated The fragment was filled in with Klenow polymerase. The Vector pJC1 (Cremer et al., Mol. Gen. Genet (1990) 220: 478-480) was PstI cut, also with Klenow treated polymerase, and then fragment and vector ligated. With the ligation approach, the E. coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) (Hanahan, Jour nal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580). By Plasmid preparations (Sambrook et al., Molecular clon ing. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) of clones was identified as a clone fected, the recombinant plasmid pJC1brnA contained. With this plasmid, Corynebacterium glutamicum R127 transformed by electroporation as in Haynes et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329-334). From Corynebacterium glutamicum R127 pJC1 and Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA then became the transamina encoded by brnA se activity determined. For this, the clones were placed in 60 ml LB medium cultured and in the exponential wax centrifuged. The cell pellet was once washed with 0.05 M potassium phosphate buffer and in the same Buffer resuspended. The cell disruption took place with 10 minutes of ultrasound treatment (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). The cell debris was then passed through a 30 min centrifugation at 13000 rpm and 4 ° C separated and the supernatant as a crude extract in the enzyme test set. The reaction batch of the enzyme test contained 0.2 ml 0.25 M Tris / HCl, pH 8, 0.05 ml crude extract, and 0.1 ml 2.5 mM pyridoxal phosphate, 0.1 ml 40 mM ketoiso caproat and 0.1 ml 0.5 M Na glutamate. The test approaches were incubated at 30 ° C after 10, 20 and 30 minutes 200 µl samples were taken and their leucine concentrations concentration determined using HPLC analysis (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Like table 2 shows the strain Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA an increased transaminase activity towards the control strain.

Tabelle 2 Table 2

Spezifische Aktivität (µmol/min und mg Protein) der Transaminase in Corynebacterium glutamicum R127 Specific activity (µmol / min and mg protein) of the transaminase in Corynebacterium glutamicum R127

Beispiel 2Example 2 Konstruktion einer brnA Deletionsmutante von Corynebac terium glutamicumConstruction of a brnA deletion mutant from Corynebac terium glutamicum

Die interne Deletion des brnA-Gens von Corynebacterium glutamicum 13032 wurde mit dem bei Schäfer et al. (Gene 145: 69-73 (1994)) beschriebenen System zum Genaus tausch durchgeführt. Zur Konstruktion des Inaktivie rungsvektors pK19mobsacBΔbrnA wurde zunächst das 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment in die SmaI Schnittstelle des Vek tors pUC18 kloniert. Aus dem resultierenden Vektor pUC18brnA wurde ein internes 770 bp DraIII-Fragment entfernt. Hierzu wurde der Vektor mit DraIII geschnit ten und, nach Abtrennung des brnA internen DraIII- Fragmentes, mittels Agarosegelelektrophorese religiert. Anschließend wurde aus dem Vektor das unvollständige Gen als XhoI/SalI-Fragment isoliert und in den mit XhoI/SalI linearisierten Vektor pK19mobsacB (Schäfer 1994, Gene 145: 69-73) ligiert. Der erhaltene Inakti vierungsvektor pK19mobsacBΔbrnA wurde durch Transforma tion in den E. coli Stamm S 17-1 eingebracht (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) und per Konjugation nach Corynebacterium glutamicum 13032 transferiert (Schäfer et al. 1990, Journal of Bacterio logy 172: 1663-1666). Es wurden Kanamycin-resistente Klone von Corynebacterium glutamicum erhalten, bei de nen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vor lag. Um auf die Excision des Vektors zu selektionieren, wurden Kanamycin-resistente Klone auf Saccharose haltigem LB-Medium ((Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)) mit 15 g/l Agar, 2% Glucose/10% Saccharose) ausplattiert und Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Durch Überimpfen auf Mi nimalmediumplatten (Medium CGXII mit 15 g/l Agar (Keil hauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595- 5603)) mit und ohne 2 mM L-Isoleucin, 2 mM L-Valin, 2 mM L-Leucin, bzw. mit und ohne 50 µg/ml Kanamycin wurden 36 Klone isoliert, welche durch die Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin-Leucin-Valin auxotroph waren und bei denen nun das unvollständige brnA-Gen (ΔbrnA-Allel) im Genom vorlag. Der Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA bezeichnet und weiter verwendet.The internal deletion of the Corynebacterium brnA gene glutamicum 13032 was compared with the Schäfer et al. (Gene 145: 69-73 (1994)) exchanged. To construct the inactivity pK19mobsacBΔbrnA, the 1.5 kb BglI / NaeI fragment in the SmaI interface of the Vek tors pUC18 cloned. From the resulting vector pUC18brnA became an internal 770 bp DraIII fragment away. For this, the vector was cut with DraIII ten and, after the brnA internal DraIII- Fragment, religated using agarose gel electrophoresis. The vector then became the incomplete one Gen isolated as XhoI / SalI fragment and in the XhoI / SalI linearized vector pK19mobsacB (Schäfer 1994, Gene 145: 69-73). The received Inakti Crossing vector pK19mobsacBΔbrnA was transformed by Transforma tion introduced into the E. coli strain S 17-1 (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) and by conjugation according to Corynebacterium glutamicum 13032 transferred (Schäfer et al. 1990, Journal of Bacterio logy 172: 1663-1666). Kanamycin resistant Obtained clones from Corynebacterium glutamicum, de The inactivation vector is integrated into the genome was. To select on the excision of the vector, became kanamycin-resistant clones on sucrose containing LB medium ((Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)) with 15 g / l agar, 2% glucose / 10% Sucrose) and colonies obtained, which the vector by a second recombination event have lost again (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). By vaccinating on Wed. nimal medium plates (medium CGXII with 15 g / l agar (wedge hauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595- 5603)) with and without 2 mM L-isoleucine, 2 mM L-valine, 2 mM L-leucine, or with and without 50 µg / ml kanamycin 36 clones were isolated, which by excision of the Vector kanamycin sensitive and isoleucine-leucine-valine were auxotrophic and now incomplete brnA gene (ΔbrnA allele) was present in the genome. The tribe was referred to as Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA and used further.

Beispiel 3Example 3 Expression der Gene ilvD, ilvBN, ilvC und panBC in Co rynebacterium glutamicumExpression of the genes ilvD, ilvBN, ilvC and panBC in Co rynebacterium glutamicum

Zur Expression der Gene der Acetohydroxysäuresynthase (ilvBN) und der Isomeroreduktase (ilvC) wurde der Vek tor pECM3ilvBNCD benutzt (Sahm und Eggeling, Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) 1973-1979) welcher ein Chloramphenicolresistenzgen trägt. Coryne bacterium glutamicum 13032ΔbrnA wurde mit pECM3ilvBNCD transformiert wie bei Schäfer et al., (Gene (1994) 145: 69-73) beschrieben. Der resultierende Stamm Corynebac terium glutamicum 13032ΔbrnA pECM3ilvBNCD wurde mit dem bei Sahm und Eggeling beschriebenen Vektor pEKEx2panBC transformiert (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979).For the expression of the genes of acetohydroxy acid synthase (ilvBN) and isomeroreductase (ilvC) became the vek tor pECM3ilvBNCD used (Sahm and Eggeling, Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) 1973-1979) which carries a chloramphenicol resistance gene. Corynebacterium bacterium glutamicum 13032ΔbrnA was extracted with pECM3ilvBNCD transformed as in Schäfer et al., (Gene (1994) 145: 69-73). The resulting strain Corynebac terium glutamicum 13032ΔbrnA pECM3ilvBNCD was awarded the the vector pEKEx2panBC described by Sahm and Eggeling transformed (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979).

Beispiel 4Example 4 Produktion von D-Pantothenat mit verschiedenen C. glutamicum StämmenProduction of D-pantothenate with different C. strains of glutamicum

Zur Untersuchung ihrer Pantothenatbildung wurden die in Tabelle 4 angegebenen Stämme in 60 ml Brain Heart Infu sion-Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) für 14 h bei 30°C vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 0,9% NaCl-Lösung (w/v) gewaschen und mit dieser Suspension je 60 ml CgXII-Medium so angeimpft, daß die OD₆₀₀ 0,5 betrug. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603) beschriebenen Medium. Für die Kultivierung der ΔbrnA Stämme enthielt das Medium aber zusätzlich 2 mM L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin. Das Medium ist in Tabelle 3 dargestellt.To examine their pantothenate formation, the strains listed in Table 4 were precultivated in 60 ml of Brain Heart Infusion medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) for 14 h at 30 ° C. The cells were then washed once with 0.9% NaCl solution (w / v) and inoculated with this suspension in each case 60 ml of CgXII medium in such a way that the OD _{600 was} 0.5. The medium was identical to the medium described in Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603). For the cultivation of the ΔbrnA strains, however, the medium additionally contained 2 mM L-valine, L-isoleucine and L-leucine. The medium is shown in Table 3.

Tabelle 3 Table 3

Zusammensetzung des Mediums CGXII Composition of the medium CGXII

Bei der Kultivierung der Stämme wurde das Medium nach 5 Stunden zusätzlich mit 1 mM Isopropylthio-β-D- galactosid versetzt. Nach 48 stündiger Kultivierung wurden Proben genommen, die Zellen abzentrifugiert und der Überstand sterilfiltriert. Die Pantothenatkonzen tration des Überstands wurde wie bei Sahm und Eggeling beschrieben (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Ta belle 4 dargestellt.When the strains were cultivated, the medium after 5 Additional hours with 1 mM isopropylthio-β-D- galactoside added. After 48 hours of cultivation samples were taken, the cells were centrifuged and the supernatant was sterile filtered. The pantothenate concessions The supernatant was treated like Sahm and Eggeling (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979). The results are in Ta belle 4 shown.

Tabelle 4Table 4

D-Pantothenatbildung in verschiedenen C. glutamicum StämmenD-pantothenate formation in various C. glutamicum strains

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. In Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium re plizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die

a) keine für eine Transaminase codierende Nucleo tidsequenz enthält oder
b) eine für eine Transaminase codierende Nucleo tidsequenz enthält, die nicht oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen ge ringer exprimiert wird.

1. In microorganisms of the genus Corynebacterium replicable, optionally recombinant DNA, the

a) does not contain a nucleotide sequence coding for a transaminase, or
b) contains a nucleotide sequence coding for a transaminase which is not expressed at all or is expressed less than with naturally occurring nucleotide sequences.

2. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 1, deren Nucleo tidsequenz

a) keine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält oder
b) eine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält, die nicht oder gegen über natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer exprimiert wird.

2. Replicable DNA according to claim 1, the nucleotide sequence

a) does not contain a nucleotide sequence coding for the brnA gene (transaminase) or
b) contains a nucleotide sequence coding for the brnA gene (transaminase) which is not expressed or is expressed to a lesser extent than naturally occurring nucleotide sequences.

3. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese im Fall b)

a) eine Sequenz, dargestellt in Seq.-ID-Nr. 1, die für brnA codiert, umfaßt oder
b) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) inner halb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht; oder
c) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz (i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) um faßt.

3. Replicable DNA according to one of claims 1 or 2, characterized in that in case b)

a) a sequence shown in SEQ ID NO. 1 encoding, encompassing or brnA
b) comprises a sequence corresponding to sequence (i) within the range of degeneration of the genetic code; or
c) comprises a sequence which hybridizes with a sequence which is complementary to sequence (i) or (ii), and optionally
d) functionally neutral meaning mutations in (i).

4. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromauf wärts des Strukturgens befindet, mutiert ist.4. Replicable DNA according to one of claims 1 to 3, characterized, that to achieve lower expression the Promoter and regulatory region that is upstream is located of the structural gene, is mutated.

5. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die Expression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder der Beschleunigung des Abbaus des zugehörigen Enzymproteins beschleunigt ist.5. Replicable DNA according to one of claims 1 to 3, characterized, that to achieve lower expression, the Expression of the brnA gene in the microorganisms by shortening the lifespan of the corresponding m-RNA and / or accelerating the breakdown of the associated enzyme protein is accelerated.

6. Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleotidsequenz gemäß einem der An sprüche 1 bis 5 enthalten.6. microorganisms, characterized, that they have a nucleotide sequence according to one of the An sayings 1 to 5 included.

7. Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA, gekennzeichnet durch die in Fig. 2 wiedergegebene Restriktionskarte, hinterlegt als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA unter der Bezeichnung DSM 13971. 7. Plasmid vector pK19mobsacBΔbrnA, characterized by the restriction map shown in FIG. 2, deposited as Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA under the name DSM 13971.

8. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Panto thensäure, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transaminase codierende Nukleotidse quenzen in Mikroorganismen deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden und diese Mikroor ganismen zur Fermentation eingesetzt werden.8. Process for the fermentative production of panto then acid, characterized, that nucleotides coding for the transaminase sequences in microorganisms are deleted or compared to naturally occurring sequences or less expressed and this microor mechanisms are used for fermentation.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für das brnA-Gen codierende Nukleotidse quenz in Mikroorganismen deletiert wird oder gegen über natürlich vorkommenden Sequenzen geringer ex primiert wird und diese Mikroorganismen zur Fermen tation einsetzt werden.9. The method according to claim 8, characterized, that the nucleotide coding for the brnA gene is deleted in microorganisms or against over naturally occurring sequences of low ex is primed and these microorganisms to ferment tion can be used.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Pro motor- und Regulationsregion mutiert wird.10. The method according to any one of claims 8 to 9, characterized, that to achieve lower expression, the Pro located upstream of the structural gene motor and regulatory region is mutated.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Ex pression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch eine Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA durchgeführt wird und/oder der Abbau des zu gehörigen Enzymproteins beschleunigt wird. 11. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized, that the Ex pression of the brnA gene in the microorganisms a shortening of the lifespan of the corresponding m-RNA is carried out and / or the degradation of the associated enzyme protein is accelerated.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in Mikroorganismen repliziert und (über)exprimiert, die eine oder mehrere Metabolit- und/oder Antimeta bolit-Resistenzmutationen aufweisen.12. The method according to any one of claims 8 to 11, characterized, that the DNA according to one of claims 1 to 5, replicated and (over) expressed in microorganisms, the one or more metabolite and / or antimeta have bolite resistance mutations.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor pJC1brnA, gekennzeichnet durch die in Fig. 1 wiedergegebene Restriktions karte, in Mikroorganismen mit einer inaktivierten Transaminase eingesetzt wird.13. The method according to any one of claims 8 to 12, characterized in that the plasmid vector pJC1brnA, characterized by the restriction map shown in Fig. 1, is used in microorganisms with an inactivated transaminase.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum R127/12, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 13970, eingesetzt wird.14. The method according to claim 13, characterized, that as a microorganism Corynebacterium glutamicum R127 / 12, deposited under the name DSM 13970, is used.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in Mi kroorganismen gegenüber den in Wildstämmen vorkom menden entsprechenden Genen verstärkt werden, und diese Mikroorganismen zur Fermentation eingesetzt werden.15. The method according to any one of claims 8 to 14, characterized, that at least one component from the group of Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC and panD in Wed. Croorganisms compared to those found in wild tribes appropriate genes are amplified, and these microorganisms used for fermentation become.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die Kopien zahl der Gene bzw. Nukleotidsequenzen durch Transformation von Mikroorganismen mit diesen Gene bzw. Nukleotidsequenzen tragenden Plasmidvektoren oder durch chromosomale Amplifikation erhöht.16. The method according to claim 15, characterized, that you have copies to achieve reinforcement number of genes or nucleotide sequences by transformation of microorganisms with these genes or Plasmid vectors or nucleotide sequences increased by chromosomal amplification.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Promotor- und Regulationsregion mutiert.17. The method according to claim 15, characterized, that to achieve the reinforcement promoter located upstream of the structural gene and regulatory region mutated.

18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung stromaufwärts der Strukturgene Expressionskassetten einbaut.18. The method according to claim 15, characterized, that one can get upstream for gain the structural gene incorporates expression cassettes.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in den Mikroorganismen durch Verlän gerung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder Verhinderung des Abbaus der zugehörigen Enzymproteine verbessert.19. The method according to claim 15, characterized, that the expression of at least one component from the group of the genes ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC and panD in the microorganisms by extension increase the lifespan of the corresponding m-RNA and / or preventing degradation of the associated Enzyme proteins improved.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen zur Verringerung der Expression des brnA-Gens bzw. zur Erzielung der Überexpression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in geänderten Kulturmedien fermentiert und/oder die Fermentationsführung ändert. 20. The method according to any one of claims 8 to 19, characterized, that the microorganisms reduce the Expression of the brnA gene or to achieve the Overexpression of at least one component from the Group of the genes ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC and panD fermented in modified culture media and / or the fermentation control changes.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Pantothenat-(Pantothensäure)-bildung verringern.21. The method according to any one of claims 8 to 20, characterized, that one uses microorganisms in which the Metabolic pathways at least partially switched off which are the pantothenate (pantothenic acid) formation reduce.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man mit verschiedenen kompatiblen, mindestens eine Komonente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC, und panD enthaltenden und das Gen brnA nicht enthaltenden Plasmidvektoren transfor mierte Mikroorganismen einsetzt.22. The method according to any one of claims 8 to 21, characterized, that one is compatible with different, at least a component from the group of the genes ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC, and panD containing and the gene transfor not containing plasmid vectors brnA uses microorganisms.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, die mit einem Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA transformiert sind.23. The method according to claim 22, characterized, that you use microorganisms with a Plasmid vector pK19mobsacBΔbrnA are transformed.

24. Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, in denen das brnA-Gen deletiert oder geringer ex primiert wird und gegebenenfalls mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD verstärkt wird,
b) Anreicherung der Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
c) Isolieren der Pantothensäure.

24. A process for the preparation of pantothenic acid, characterized in that the following steps are carried out:

a) fermentation of microorganisms according to one or more of the preceding claims, in which the brnA gene is deleted or expressed less and optionally at least one component from the group of the genes ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC and panD is amplified,
b) accumulation of pantothenic acid in the medium or in the cells of the microorganisms, and
c) Isolation of pantothenic acid.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die überexprimierten Gene aus Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Escherichia stammen.25. The method according to claim 24, characterized, that the overexpressed genes from microorganisms of the genera Corynebacterium or Escherichia come.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) als Vorstufe β-Alanin oder L- Valin zusetzt.26. The method according to any one of claims 24 to 25, characterized, that in step a) as a precursor β-alanine or L- Valin adds.

27. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorherge henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattungen Escherichia oder Corynebacterium einsetzt.27. Method according to one or more of the preceding existing claims, characterized, that microorganisms of the genus Escherichia or uses Corynebacterium.