DE10065217A1 - Transfection complexes (TransoPlex) with reduced toxicity, high physical stability and high transfection efficiency as well as processes for their production - Google Patents

Transfection complexes (TransoPlex) with reduced toxicity, high physical stability and high transfection efficiency as well as processes for their production

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DE10065217A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft Komplexe zur Transfektion, die zu transfizierendes Material und Lipidpartikel, die aus bei Raumtemperatur festen Lipiden oder Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden bestehen, umfassen, wobei die Lipidpartikel an ihrer Oberfläche Modifizierungsmittel aufweisen.The invention relates to complexes for transfection which comprise material to be transfected and lipid particles which consist of lipids which are solid at room temperature or lipid mixtures of lipids which are solid at room temperature and lipids which are semi-solid or liquid at room temperature, the surface of the lipid particles having modifying agents.

Description

Die Erfindung betrifft neue Komplexe zur Transfektion die durch Zusammenlagerung von zu transfizierendem Material mit ober­ flächenmodifizierten Partikeln aus bei Raumzustand festen Lipiden oder aus Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden hergestellt werden.The invention relates to new complexes for transfection Storage of material to be transfected with upper surface-modified particles from lipids that are solid when in space or from lipid mixtures of lipids solid at room temperature with semi-solid or liquid lipids at room temperature getting produced.

In der rekombinanten Gentechnologie und in der Gentherapie führt man Erbinformation (z. B. Polynukleotide) effizienter in Zellen ein, wenn man sie in einen Träger einarbeitet oder an ihn bindet. Leads in recombinant genetic engineering and in gene therapy genetic information (e.g. polynucleotides) is made more efficient in cells if you incorporate it into a carrier or bind it to it.  

Für solche Zwecks eingesetzte Trägersysteme sind beispielsweise:
Carrier systems used for such purposes are, for example:

  • 1. Viren1. viruses
  • 2. Adenoviren2. adenoviruses
  • 3. Liposomen3. liposomes
  • 4. Polymerpartikel4. The polymer particles
  • 5. Makromoleküle5. macromolecules

Ein Vorteil von Viren ist die hohe Effektivität, da die Infektiö­ sität von Viren ja gerade darauf beruht, virale DNA in Zellen einzuschleusen. Die Erbinformation wird zwar in das eukaryon­ tische Genom integriert, jedoch besteht dabei die Gefahr einer Mutation durch Integration des Gens in das Genom. Zusätzlich bedeutet die Verwendung von Viren ein hohes Sicherheitsrisiko für den Patienten.An advantage of viruses is their high effectiveness, because the infectious Virusity is based on viral DNA in cells infiltrate. The genetic information is indeed in the eukaryon integrated genome, but there is a risk of Mutation through integration of the gene into the genome. additionally the use of viruses means a high security risk for the patient.

Ein Vorteil von Adenoviren ist wiederum die hohe Effektivität. Ein Nachteil ist jedoch, daß sie nicht in das eukaryontische Genom integriert werden sondern als extrachromosomale DNA im Zellkern vorliegen, so daß nur eine transiente Transfektion stattfindet. Dies erfordert eine wiederholte Applikation des viralen Gentransfersystems über die gesamte Dauer der Erkrankung, d. h. in der Regel lebenslang, da nicht ursächlich einmal abschließend therapiert wird.Another advantage of adenoviruses is its high effectiveness. A disadvantage, however, is that they are not in the eukaryotic Be integrated into the genome but as extrachromosomal DNA in the Cell nucleus are present so that only transient transfection takes place. This requires repeated application of the viral gene transfer system for the entire duration of the disease, d. H. usually lifelong, because not once is finally treated.

Nichtvirale Infektionssysteme wie Liposomen haben den Vorteil, daß sie die Gefahren viraler Systeme vermeiden. Sie haben jedoch den Nachteil, daß die Transfektionseffizienz deutlich geringer ist. Zusätzlich gibt es bei Liposomen - wie bereits bekannt von liposomalen Arzneimitteln - Probleme mit der physikalischen Stabilität. Zusätzlich sind sie relativ teuer. "Billige" Liposomen für pharmazeutische Zwecke gibt es noch nicht.Non-viral infection systems such as liposomes have the advantage that they avoid the dangers of viral systems. However, you have the disadvantage that the transfection efficiency is significantly lower is. In addition, with liposomes - as already known from liposomal drugs - problems with physical Stability. In addition, they are relatively expensive. "Cheap" Liposomes for pharmaceutical purposes do not yet exist.

Polymerpartikel werden intensiv untersucht, haben bisher aus diversen Gründen nicht den Weg zum Markt gefunden. Viele der eingesetzten Polymere sind toxikologisch problematisch und sind von den zuständigen Behörden daher nicht zugelassen worden. So setzen beispielsweise Polyalkylcyanoacrylate beim Abbau in vivo potentiell kanzerogenes Formaldehyd frei, Polymethacrylate haben eine zu lange Abbauzeit (Jahre). Auch für in vivo als Implantat­ material zugelassene Polymere wie Polymilchsäure (PLA) und das Copolymer aus Milch- und Glykolsäure (PLA/GA) haben Toxizitäts­ probleme auf zellulärer Ebene. So zeigten PLA-Partikel nach Aufnahme in Zellen Zytotoxizität (siehe A. Smith and I. A. Hunneyball, Evaluation of poly(lactic acid) as a biodegradable drug delivery System for parenteral administration, Int. J. Pharm. 30, 215-220 (1986)).Polymer particles are being examined intensively and have not yet found their way to the market for various reasons. Many of the polymers used are toxicologically problematic and have therefore not been approved by the responsible authorities. For example, polyalkylcyanoacrylates release potentially carcinogenic formaldehyde when broken down in vivo, polymethacrylates have a too long breakdown time (years). Polymers that have been approved as implant material in vivo, such as polylactic acid (PLA) and the copolymer of lactic and glycolic acid (PLA / GA), also have toxicity problems at the cellular level. For example, PLA particles showed cytotoxicity after uptake in cells (see A. Smith and IA Hunneyball, Evaluation of poly (lactic acid) as a biodegradable drug delivery System for parenteral administration, Int. J. Pharm. 30, 215-220 ( 1986 ) ).

Polymere werden auch in molekularer Form als Transfektionsagens eingesetzt, z. B. Polyethylenimin (pEI) (siehe Rudolph, C., Lausier, J., Naundorf, S., Müller, R. H., Rosenecker, J., In vivo gene delivery to the lung using polyethylenimine and fractured polyamidoamine dendrimers, The Journal of Gene Medicine 2, 269- 278, 2000). Die Problematik ändert sich wenig, wenn Polymere nicht in partikulärer Form vorliegen sondern als einzelne Makromoleküle. Im Gegenteil, erhöht sich bei gleicher Dosis teilweise die Toxizität, da das gesamte Polymer bereits gelöst vorliegt und nicht in kleineren Mengen verzögert durch Abbau der Partikel in Lösung geht.Polymers are also used in molecular form as a transfection agent used, e.g. B. polyethyleneimine (pEI) (see Rudolph, C., Lausier, J., Naundorf, S., Müller, R.H., Rosenecker, J., In vivo gene delivery to the lung using polyethyleneimine and fractured polyamidoamine dendrimers, The Journal of Gene Medicine 2, 269- 278, 2000). The problem changes little when polymers not in particulate form but as individual Macromolecules. On the contrary, increases at the same dose partly the toxicity, since the entire polymer is already dissolved is present and not delayed in smaller quantities by breaking down the Particle goes into solution.

Zur Umgehung der oben geschilderten Probleme wie Toxizität, Sicherheit, mangelnder physikalischer Stabilität und relativ hoher Kosten war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Transfektionssystem zu schaffen, daß diese Probleme minimiert oder vermeidet.To work around the issues outlined above, such as toxicity, Security, lack of physical stability and relative high cost, it was an object of the present invention To create a transfection system that minimizes these problems or avoids.

Diese Aufgabe wurde durch den erfindungsgemäß Transfektionskom­ plex "TransoPlex" auf der Basis einer Kombination von
This object was achieved by the transfection complex "TransoPlex" based on a combination of

  • 1. Lipidpartikeln1. lipid particles
  • 2. Oberflächenmodifizierer für diese Lipidpartikel2. Surface modifier for these lipid particles
  • 3. zu transfizierendem Material und3. material to be transfected and
  • 4. gegebenenfalls Verstärker (Enhancer) der transfizierenden Wirkung (z. B. Chloroquin) sowie4. if necessary, enhancer of the transfecting Effect (e.g. chloroquine) as well
  • 5. gegebenenfalls Elektrolyt (insbesondere CaCl2)5. optionally electrolyte (in particular CaCl 2 )

gelöst.solved.

Die Lipidpartikel in einer Größe von etwa 10 nm bis zu etwa 30 µm werden mit konventionellen Methoden der Lehrbücher und Literatur hergestellt. Sie bestehen - im Gegensatz zu Liposomen - aus Lipiden, die bei Raumtemperatur fest sind, bzw. Mischungen von bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden.The lipid particles in a size of about 10 nm up to about 30 microns are using conventional methods of textbooks and Literature produced. They exist - in contrast to liposomes - from lipids that are solid at room temperature, or mixtures of lipids solid at room temperature with at room temperature semi-solid or liquid lipids.

Die Oberfläche dieser Lipidpartikel wird zur Erhöhung der physi­ kalischen Stabilität sowie der Komplexbildungsfähigkeit mit dem zu transfizierenden Material, mit Modifizierungsmittel, insbe­ sondere Tensiden oder Polymeren oder Mischungen derselben modifiziert.The surface of these lipid particles is used to increase the physi calic stability and the ability to form complexes with the material to be transfected, with modifiers, esp special surfactants or polymers or mixtures thereof modified.

Diese Lipidpartikel werden dann in einem geeigneten Verhältnis mit dem zu transfizierendem Material (z. B. Polynukleotide) gemischt, eine Zeitlang zur Ausbildung des Komplexes inkubiert und dann den Zellen zur Transfektion zugemischt.These lipid particles are then in an appropriate ratio with the material to be transfected (e.g. polynucleotides) mixed, incubated for a while to form the complex and then mixed into the cells for transfection.

Die Transfektionseffizienz kann durch Zumischung von sogenannten Enhancern verstärkt werden. Hierfür sind Arzneistoffe wie Chloro­ quin (CQ) oder Substanzen geeignet, die stark mit Membranen interagieren, z. B. Poly-L-Lysin.The transfection efficiency can be increased by adding so-called Enhancers. Medicines such as chloro are used for this quin (CQ) or substances that are strong with membranes interact, e.g. B. Poly-L-Lysine.

Die Tendenz Komplexe über einen Aggregationsmechanismus zu bilden kann bei einigen Mischungen von oberflächenmodifizierten Lipid­ partikeln mit zu transfizierendem Material gering ausgeprägt sein, insbesondere bei Lipidpartikeln mit geringer positiver Ladung (< +20 mV) bzw. negativ geladenen Partikeln. Hier kann die Aggregation durch Zusatz von Elektrolyten wie 1 : 1 Elektrolyte (z. B. NaCl), 1 : 2 Elektrolyte (z. B. CaCl2) oder 1 : 3 Elektrolyte gefördert werden, wobei die komplexfördernde Wirkung der Elektrolyte in der genannten Reihenfolge zunimmt.The tendency to form complexes via an aggregation mechanism can be slight in some mixtures of surface-modified lipid particles with material to be transfected, in particular in lipid particles with a low positive charge (<+20 mV) or negatively charged particles. Here, the aggregation can be promoted by adding electrolytes such as 1: 1 electrolytes (e.g. NaCl), 1: 2 electrolytes (e.g. CaCl 2 ) or 1: 3 electrolytes, the complex-promoting effect of the electrolytes being mentioned in the above Order increases.

Die Komplexbildung führt zu einer Kondensation der Polynukleo­ tide. Die Kondensation ist notwendig, damit die Erfolgswahr­ scheinlichkeit einer Transfektion steigt. Das Ausmaß der Kondensation im Komplex kann über Partikelgrößenmessung verfolgt werden. Ist die Kondensation nicht ausreichend oder ist für bestimmte Zwecke eine höhere Kondensation erforderlich, so kann diese ebenfalls in der oben beschriebenen Weise durch Elek­ trolytzusatz erzielt werden.The complex formation leads to condensation of the polynucleo tide. The condensation is necessary so that the success is true Probability of a transfection increases. The extent of Condensation in the complex can be tracked via particle size measurement become. Is the condensation insufficient or is for higher condensation may be required for certain purposes this also in the manner described above by Elek trolyte addition can be achieved.

Optional wird Komplex daher durch lysosomotrope oder endosomoly­ tische Substanzen und Elektrolyt ergänzt.Complex is therefore optional through lysosomotropic or endosomoly table substances and electrolyte added.

Lipide sind natürliche Bausteine des Körpers, somit ist die Toxizität der Lipidpartikel um ein mehrfaches geringer als die bisher eingesetzten Transfektionspromotoren - sowohl partikuläre als auch molekulare. Insbesondere trifft dies zu wenn Lipide aus Glyceriden von im Organismus bzw. der Zielzelle vorkommenden Fettsäuren verwendet werden.Lipids are natural building blocks of the body, so that is Toxicity of the lipid particles several times less than that Transfection promoters used to date - both particulate as well as molecular. This is especially true when lipids are out Glycerides from those occurring in the organism or the target cell Fatty acids are used.

Im Gegensatz zu Liposomen zeigen die erfindungsgemäßen Lipid­ partikel eine hohe physikalische Stabilität. Sie können sogar bei Temperaturen von etwa 121°C ohne Stabilitätsbeeinträchtigung durch Autoklavieren sterilisiert werden.In contrast to liposomes, the lipid according to the invention shows particles high physical stability. You can even go to Temperatures of around 121 ° C without impairing stability can be sterilized by autoclaving.

Die Transfektionseffizienz ist bei geeigneter Auswahl des Komplexes den bisherigen Systemen in der Regel überlegen, oder zumindest gleichwertig wobei TransoPlex gleichzeitig jedoch die oben erwähnten Vorteile aufzuweisen hat.The transfection efficiency is with a suitable selection of the Complex complexes generally superior to previous systems, or at least equivalent, but at the same time TransoPlex has the advantages mentioned above.

Der resultierende Transfektionskomplex zeichnet sich im Vergleich zu bisherigen Gentransfersystemen durch gute Transfektions­ effizienz bei gleichzeitig reduzierter Toxizität und hoher physikalischer Stabilität sowie der Möglichkeit zur Inkorporation von Hilfsstoffen aus.The resulting transfection complex stands out in comparison to previous gene transfer systems through good transfection efficiency with reduced toxicity and high  physical stability and the possibility of incorporation from auxiliaries.

Erklärungen zu den AbbildungenExplanations to the pictures

Abb. 1: AFM-Aufnahmen der Komplexe (Beispiel 2).
A: Übersichtsaufnahme 50 × 50 µm.
B-D sind vergrößerte Detailaufnahmen.
B: Aufnahme der 2 verschiedenen Komplextypen.
C. Komplexstruktur - Komplex bestehend aus fusionier­ ten 100 nm Untereinheiten.
D. Momentaufnahme aus Komplexbildungsprozeß. Fig. 1: AFM images of the complexes (example 2).
A: Overview image 50 × 50 µm.
BD are enlarged detail shots.
B: Inclusion of the 2 different types of complex.
C. Complex structure - complex consisting of fused 100 nm subunits.
D. Snapshot from complex formation process.

Abb. 2: Bindung von Plasmid in den Komplex, Untersuchung mit Gelelektrophorese (Linien von links: Molekularge­ wichtsmarker, Mischungen Lipidpartikel : Plasmid (w/w) = 200, 100, 50, 30, 20, 10, 5, Plasmid allein). Fig. 2: Binding of plasmid in the complex, examination with gel electrophoresis (lines from left: molecular weight markers, mixtures of lipid particles: plasmid (w / w) = 200, 100, 50, 30, 20, 10, 5, plasmid alone).

Abb. 3: DNA-Bindung im Komplex mit ansteigendem Verhältnis Lipidpartikel zu DNA: Bestimmung der Abnahme an freier DNA durch Zunahme der Bindung im Komplex mit Gelelek­ trophorese (offene Rauten, Beispiel 2), Bestimmung der Abnahme der EB-Interkalation infolge Zunahme der Bindung (volle Kreise). Fig. 3: DNA binding in the complex with increasing ratio of lipid particles to DNA: determination of the decrease in free DNA by increasing the binding in the complex with gel electrophoresis (open diamonds, example 2), determination of the decrease in EB intercalation due to increasing binding (full circles).

Abb. 4: Transfektionseffizienz von Komplexen ohne Chloroquin (DMEM) und von Komplexen mit Chloroquin (DMEM + CQ) hergestellt aus verschiedenen Gewichtsverhältnissen von Lipidpartikeln zu Plasmid (10 bis 200, 0 ist Plasmid alleine). Die Komplexe wurden den Cos-1 Zellen dispergiert in DME Medium (DMEM) zugesetzt. Quantifi­ zierung der Effizienz über Lumineszenzeinheiten (LCPS - Luminescence Counts Per Second). Fig. 4: Transfection efficiency of complexes without chloroquine (DMEM) and complexes with chloroquine (DMEM + CQ) made from different weight ratios of lipid particles to plasmid (10 to 200, 0 is plasmid alone). The complexes were added to the Cos-1 cells dispersed in DME medium (DMEM). Quantification of efficiency via luminescence units (LCPS - Luminescence Counts Per Second).

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

Die Herstellung der Lipidpartikel erfolgt durch gängige Methoden. Im Rahmen der Kaltherstellung können Lipidpartikel - vor allem in einer Größe im unteren Mikrometerbereich - durch Flüssigmah­ lung (Kolloidmühle) oder durch Gasstrahlmahlung hergestellt werden. Bei der Heißherstellung wird das Lipid geschmolzen, in einer wäßrigen Lösung des Oberflächenmodifizierers (z. B. Tween 80) dispergiert und durch hochtouriges Rühren beispielsweise mit einem Propellerrührer, Blattrührer, einer Zahnscheibe oder einen Rotor-Stator-Dispergator in eine feinteilige Emulsion überführt.The lipid particles are produced by common methods. In the course of cold production, lipid particles - especially in the size in the lower micrometer range - can be produced by liquid grinding (colloid mill) or by gas jet grinding. During hot production, the lipid is melted, dispersed in an aqueous solution of the surface modifier (e.g. Tween 80 ) and converted into a fine-particle emulsion by high-speed stirring, for example with a propeller stirrer, blade stirrer, a toothed disk or a rotor-stator disperser.

Oberflächenmodifizierer können auch alternativ im geschmolzenen Lipid gelöst oder dispergiert werden. Beim Abkühlen kristalli­ siert das Lipid teilweise oder vollständig und es entstehen die für den Komplex notwendigen Lipidpartikel. Zur Herstellung sehr feiner Partikel im Nanometerbereich kann auch Hochdruckhomogeni­ sation eingesetzt werden, sowohl zur Heißzerkleinerung als auch Kaltzerkleinerung.Alternatively, surface modifiers can be melted Lipid can be dissolved or dispersed. Crystalline on cooling the lipid partially or completely and the result lipid particles necessary for the complex. Very much to manufacture Fine particles in the nanometer range can also be used for high-pressure homogeneity tion are used, both for hot grinding and Cold crushing.

Als Matrixmaterial können Lipide im weitesten Sinne eingesetzt werden, das heißt sämtliche lipophilen Substanzen einschließlich Wachse. Bevorzugt werden Lipide aus körpereigenen/zelleigenen Substanzen eingesetzt, wie beispielsweise Glyceride mit körper­ eigenen Fettsäuren.Lipids can be used in the broadest sense as matrix material be, that means all lipophilic substances including Waxes. Lipids from the body's own / cell's own are preferred Substances used, such as body glycerides own fatty acids.

Eine Vielzahl unterschiedlicher Lipide kann zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzt werden. Dies sind sowohl chemisch einheitliche Lipide als auch ihre Mischungen. Bei eingesetzten Lipidmischungen können auch flüssige Lipide (z. B. Öle, lipophile Kohlenwasserstoffe, lipophile organische Flüssigkeiten wie Oleylalkohol) den festen Lipiden (z. B. Glyceride, lipophile Kohlenwasserstoffe wie Hartparaffin) zugemischt werden (sogenann­ te "lipid blends").A variety of different lipids can be used to make the Lipid particles are used. These are both chemical uniform lipids as well as their mixtures. When used Lipid mixtures can also be liquid lipids (e.g. oils, lipophilic Hydrocarbons, lipophilic organic liquids such as Oleyl alcohol) the solid lipids (e.g. glycerides, lipophilic Hydrocarbons such as hard paraffin) are added (so-called "lipid blends").

Einsatz finden beispielsweise folgende Lipide als dispergierte Phase. Sie können als individuelle Komponente oder als Mischung angewendet werden. Geeignet sind: natürliche oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Monoglyceride und Diglyceride, allein oder Mischungen derselben oder mit beispiels­ weise Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natürliche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschließlich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen derselben. Besonders geeignet sind synthetische Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z. B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z. B. Glyceroltrilaurat, Glyce­ rolmyristat, Glycerolpalmitat, Glycerolstearat und Glyce­ rolbehenat) und Wachse wie z. B. Cetylpalmitat und weißes Wachs (DAB).For example, the following lipids are used as the dispersed phase. They can be used as individual components or as a mixture. Suitable are: natural or synthetic triglycerides or mixtures thereof, monoglycerides and diglycerides, alone or mixtures thereof or with, for example, triglycerides, self-emulsifying modified lipids, natural and synthetic waxes, fatty alcohols, including their esters and ethers, and in the form of lipid peptides, or any mixtures thereof. Synthetic monoglycerides, diglycerides and triglycerides are particularly suitable as individual substances or as a mixture (e.g. hard fat), Imwitor 900 , triglycerides (e.g. glycerol trilaurate, glycerol myristate, glycerol palmitate, glycerol stearate and glycerol behenate) and waxes such as. B. cetyl palmitate and white wax (DAB).

Zur Oberflächenmodifikation werden insbesondere Tenside und/oder Polymere eingesetzt, wobei diese teilweise auch sterisch stabilisierende Wirkung haben.Surfactants and / or Polymers used, some of which are also steric have a stabilizing effect.

Beispiele für zum Einsatz kommende Tenside sind:
Geladene ionische Stabilisatoren so wie Diacetylphosphate, Phos­ phatidylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z. B. Ei­ lecithin oder Sojalecithin), chemisch modifizierte Lecithine (z. B. hydrierte Lecithine), genauso wie Phospholipide und Sphin­ golipide, Mischung von Lecithinen mit Phospholipiden, Sterolen (z. B. Cholesterol und Cholesterol-Derivate, genauso wie Stigma­ sterin) und ebenfalls gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat, Natriumde­ oxycholat oder ihre Mischungen Aminosäuren oder Anti-Flokkulan­ tien, wie z. B. Natriumcitrat, Natriumpyrophosphat, Natriumsorbat [Lucks, J. S. et al. Int. J. Pharm., 1990, 58, 229-235].Examples of surfactants used are:
Charged ionic stabilizers such as diacetyl phosphates, phosphatidylglycerol, lecithins of various origins (e.g. egg lecithin or soy lecithin), chemically modified lecithins (e.g. hydrogenated lecithins), as well as phospholipids and sphinolipids, mixture of lecithins with phospholipids, sterols (e.g. cholesterol and cholesterol derivatives, as well as stigma sterol) and also saturated and unsaturated fatty acids, sodium cholate, sodium glycocholate, sodium taurocholate, sodium deoxycholate or their mixtures of amino acids or anti-flocculants, such as e.g. B. sodium citrate, sodium pyrophosphate, sodium sorbate [Lucks, JS et al. Int. J. Pharm., 1990, 58, 229-235].

Zwitterionische Tenside wie beispielsweise (3-[(3-cholamido­ propyl)-dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propansulfonate) [CHAPSO], (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonate) [CHAPS] und N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat. Zwitterionic surfactants such as (3 - [(3-cholamido propyl) dimethylammonio) -2-hydroxy-1-propanesulfonate) [CHAPSO], (3 - [( 3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate) [CHAPS] and N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.

Kationische Tenside, z. B. Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Cetylpyridinium­ chlorid.Cationic surfactants, e.g. B. benzyldimethylhexadecylammonium chloride, Methylbenzethonium chloride, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride.

Weitere kationische Tenside sind beispielsweise DOTMA (N-[1-(2,3- Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid), DDAB (Didode­ cyldimethylammoniumbromid), DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermidin­ carboxamid)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propylammoniumtrifluoroacetat), DC-Chol (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-choleste­ rol), Esterquats (Esterverbindungen, die mindestens ein quartäres Stickstoffatom enthalten), z. B. EQ1, DDA (Dimethyldioctadecylam­ moniumbromid).Other cationic surfactants are, for example, DOTMA (N- [1- (2,3- Dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DDAB (Didode cyldimethylammonium bromide), DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (spermidine carboxamide) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propylammoniumtrifluoroacetat) TLC-chol (3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol rol), ester quats (ester compounds containing at least one quaternary Contain nitrogen atom), e.g. B. EQ1, DDA (dimethyldioctadecylam ammonium bromide).

Beispiele für verwendbare sterische Stabilisatoren bzw. Polymere sind:
Poloxamere und Poloxamine (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block- Copolymere), ethoxylierte Sorbitanfettsäure-Ester, besonders Polysorbate (z. B. Polysorbat 80 bzw. Tween 80®), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z. B. Saccharose-Monostearat);Examples of usable steric stabilizers or polymers are:
Poloxamers and poloxamines (polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers), ethoxylated sorbitan fatty acid esters, especially polysorbates (e.g. Polysorbate 80 or Tween 80 ®), ethoxylated mono- and diglycerides, ethoxylated lipids, ethoxylated fatty alcohols or fatty acids, and esters and ethers of sugars or of sugar alcohols with fatty acids or fatty alcohols (e.g. sucrose monostearate);

Ebenfalls verwendet werden können viskositätserhöhende Substanzen wie z. B. Cellulose-Ether und Cellulose-Ester (z. B. Methylcellulo­ se, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Natriumcarb­ oxymethylcellulose), Polyvinylderivate sowie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylacetat, Alginate, Polyacrylate (z. B. Carbopol), Xanthane und Pektine.Viscosity-increasing substances can also be used such as B. cellulose ethers and cellulose esters (z. B. Methylcellulo se, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, sodium carb oxymethyl cellulose), polyvinyl derivatives and polyvinyl alcohol, Polyvinylpyrrolidone, polyvinyl acetate, alginates, polyacrylates (e.g. Carbopol), xanthans and pectins.

Es ist anzumerken, daß auch Mischungen von Tensiden und Polymeren zur Oberflächenmodifikation eingesetzt werden können.It should be noted that mixtures of surfactants and polymers can be used for surface modification.

Hergestellte Partikel und der damit produzierte Komplex wurden bezüglich Partikelgröße und Ladung (Quantifiziert als Zetapoten­ tial) charakterisiert. Bestimmung der Partikelgröße erfolgte mit Photonenkorrelationsspektroskopie (PC5, Malvern Zetasizer 4, Malvern, UK), die Bestimmung des Zetapotentials in Leitfähig­ keitswasser (Leitfähigkeit eingestellt auf 50 µS/cm durch NaCl- Zusatz) mit Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) (Zetasizer 4). Umrechnung der Mobilität in das Zetapotential wurde mit der Helmholtz-Smoluchowski-Gleichung vorgenommen.Particles produced and the complex produced with them were characterized in terms of particle size and charge (quantified as zeta potential). The particle size was determined using photon correlation spectroscopy (PC5, Malvern Zetasizer 4 , Malvern, UK), the determination of the zeta potential in conductivity water (conductivity adjusted to 50 µS / cm by adding NaCl) with laser Doppler anemometry (LDA) (Zetasizer 4 ). Conversion of mobility into zeta potential was carried out using the Helmholtz-Smoluchowski equation.

In Abhängigkeit vom eingesetzten Herstellungsverfahren entstehen Lipidpartikel in unterschiedlichen Größenbereichen. Eingesetzt für die Herstellung des erfindungsgemäßen Transfektionskomplexes TransoPlex werden sowohl Mikrometerpartikel (ca. 1-30 µm) als auch Submikrometerpartikel (< 1 µm).Depending on the manufacturing process used Lipid particles in different size ranges. used for the production of the transfection complex according to the invention TransoPlex are both micrometer particles (approx. 1-30 µm) as also submicron particles (<1 µm).

In der Regel besitzen die Lipidmikropartikel einen mittleren Durchmesser von 1 µm bis 20 µm, vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 1 µm bis 10 µm, insbesondere von 1 µm bis 5 µm.As a rule, the lipid microparticles have a medium one Diameter from 1 micron to 20 microns, preferably an average Diameters from 1 µm to 10 µm, especially from 1 µm to 5 µm.

In der Regel besitzen die eingesetzten Lipidnanopartikel einen mittleren Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm, vorzugsweise 10 nm bis 500 nm, und insbesondere 10 nm bis 200 nm.As a rule, the lipid nanoparticles used have one average diameter from 10 nm to 1000 nm, preferably 10 nm up to 500 nm, and in particular 10 nm to 200 nm.

In Abhängigkeit von den jeweils verwendeten Partikeln resultieren auch unterschiedliche Größen des gebildeten Komplexes. Bei Lipidmikrometerpartikeln hat der resultierende erfindungsgemäße Komplex eine Größe < 1 µm bis 30 µm, vorzugsweise < 1 µm bis 10 µm, insbesondere < 1 µm bis 5 µm. Bei Lipidnanopartikeln hat der resultierende Komplex eine Größe < 1000 nm, vorzugsweise 100 bis 800 nm, und insbesondere 300 nm bis 800 nm.Depending on the particles used result also different sizes of the complex formed. at Lipid micrometer particles have the resulting invention Complex a size <1 µm to 30 µm, preferably <1 µm to 10 µm, in particular <1 µm to 5 µm. For lipid nanoparticles, the resulting complex a size <1000 nm, preferably 100 to 800 nm, and in particular 300 nm to 800 nm.

Die Ladung der Lipidpartikel ist in Abhängigkeit der verwendeten Oberflächenmodifikatoren unterschiedlich. Generell können drei Gruppen unterschieden werden, d. h. Lipidpartikel bei denen das Zetapotential:
The charge of the lipid particles differs depending on the surface modifiers used. In general, three groups can be distinguished, ie lipid particles in which the zeta potential:

  • a) positiv ist, vorzugsweise < 0 mV bis +100 mV, insbesondere +20 mV bis 60 mV,a) is positive, preferably <0 mV to +100 mV, in particular +20 mV to 60 mV,
  • b) im Bereich von -20 mV bis +20 mV liegt (d. h. ungeladene bzw. sehr schwach geladene Lipidpartikel),b) is in the range of -20 mV to +20 mV (i.e. uncharged or very weakly charged lipid particles),
  • c) negativ ist, vorzugsweise < 0 mV bis -100 mV, insbesonde­ re -20 mV bis -60 mV.c) is negative, preferably <0 mV to -100 mV, in particular right -20 mV to -60 mV.

Zur Herstellung der Komplexe werden die oberflächenmodifizierten Lipidpartikel mit dem zu transfizierendem Material gemischt, z. B. Polynukleotide wie DNA, rekombinante DNA, insbesondere zirkuläre oder linearisierte Plasmide zur Expression therapeutischer Proteine, RNA, insbesondere mRNA, Polynukleotidanaloga, Anti­ sensenukleotide, und in der Regel für 15 Minuten inkubiert.To produce the complexes, the surface-modified ones are used Lipid particles mixed with the material to be transfected, e.g. B. Polynucleotides such as DNA, recombinant DNA, especially circular or linearized plasmids for the expression of therapeutic Proteins, RNA, especially mRNA, polynucleotide analogs, anti sensenucleotides, and usually incubated for 15 minutes.

Positive Partikel zeigen oft - aber nicht immer - ein gutes Komplexierungsverhalten, es nimmt ab bei ungeladenen Partikeln und ist gering ausgeprägt bei negativ geladenen Lipidpartikeln. Die Komplexierung kann durch gezielten Elektrolytzusatz gefördert werden bzw. bei nicht komplexierenden Lipidpartikeln ausgelöst werden. Bei Förderung der Komplexierung erhält man dichter kondensierte Komplexe, in der Regel vorteilhaft für die Trans­ fektion. Hierzu reichen schwach aggregierende 1 : 1 Elektrolyte aus. Elektrolyte können eine Komplexbildung über Aggregation auch erst auslösen, wobei mit zunehmender Verschiebung der Partikel­ ladung aus dem positiven über den ungeladenen Bereich zum negativen Bereich stärker aggregationsfördernde Elektrolyte in unterschiedlicher Konzentration eingesetzt werden müssen, d. h. analog zu a)-c) oben vorzugsweise:
Positive particles often - but not always - show good complexation behavior, it decreases with uncharged particles and is less pronounced with negatively charged lipid particles. The complexation can be promoted by targeted addition of electrolyte or triggered in the case of non-complexing lipid particles. If the complexation is promoted, denser condensed complexes are obtained, generally advantageous for the trans fection. For this, weakly aggregating 1: 1 electrolytes are sufficient. Electrolytes can only initiate complex formation via aggregation, whereby with increasing displacement of the particle charge from the positive over the uncharged area to the negative area, more aggregation-promoting electrolytes must be used in different concentrations, ie preferably analogously to a) -c) above:

  • a) 1 : 1 Elektrolyte wie NaCl und KCL, vorzugsweise in isoto­ nischer Konzentration oder geringer konzentriert,a) 1: 1 electrolytes such as NaCl and KCL, preferably in isoto concentrated or less concentrated,
  • b) 1 : 2 Elektrolyte wie CaCl2 oder 2 : 1 Elektrolyte, vorzugsweise in isotonischer Konzentration,b) 1: 2 electrolytes such as CaCl 2 or 2: 1 electrolytes, preferably in isotonic concentration,
  • c) 1 : 3 Elektrolyte wie AlCl3 oder 3 : 1 Elektrolyte, vorzugsweise in isotonischer Konzentration.c) 1: 3 electrolytes such as AlCl 3 or 3: 1 electrolytes, preferably in isotonic concentration.

Nach Herstellung des Komplexes mit Elektrolytzusatz kann der Elektrolyt in der Suspension verbleiben oder - falls erforder­ lich - auch der überschüssige Elektrolyt wieder entfernt werden (z. B. durch. Dialyse), der Aggregationsvorgang zum Komplex ist meistens irreversibel.After preparation of the complex with the addition of electrolyte, the Electrolyte remain in the suspension or - if required Lich - the excess electrolyte can also be removed (e.g. by dialysis), the aggregation process to form a complex mostly irreversible.

Zur Verstärkung der Transfektion können auch bestimmte Arznei­ stoffe - insbesondere Substanzen, die geeignet sind, den lysosomalen Abbau der Polynukleotide zu vermeiden, - wie Chloroquin, Monensin, schwach basische Stickstoffverbindungen oder andere schwache Basen zugesetzt werden. Alternativ kann man Substanzen verwenden, die eine Wechselwirkung mit Membranen zeigen und ihre Struktur sowie Fusionseigenschaften beeinflussen, z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Azone und membrandestabilisierende Peptide wie beispielsweise Aminosäuresequenzen aus dem In­ fluenzavirus Haemagglutinin oder dem Bienengift Mellitin.Certain drugs can also be used to enhance transfection substances - in particular substances that are suitable to avoid lysosomal degradation of the polynucleotides - like Chloroquine, monensin, weakly basic nitrogen compounds or other weak bases can be added. Alternatively you can Use substances that interact with membranes show and influence their structure and fusion properties, z. As dimethyl sulfoxide (DMSO), azones and membrane destabilizing Peptides such as amino acid sequences from the In fluenzavirus haemagglutinin or the bee venom mellitin.

Die Struktur der gebildeten Komplexe wird in Beispiel 2 und Abb. 2 beschrieben. Primär sind die Komplexe dadurch gekennzeichnet, daß DNA nicht alleinig auf der Oberfläche komplexiert eines Partikels ist sondern sich primär Aggregate bilden, bei denen Lipidpartikel über DNA Stränge verbunden sind.The structure of the complexes formed is described in Example 2 and Fig. 2. The complexes are primarily characterized in that DNA is not solely complexed on the surface of a particle, but rather aggregates are formed in which lipid particles are connected via DNA strands.

Es handelt sich bei den Komplexen um Aggregate, wobei die Aggregatstruktur aus Strängen von Transfektionsmaterial besteht, das Lipidpartikel miteinander verknüpft. Die Aggregate bestehen dabei aus zusammengelagerten Untereinheiten. Kleinste Unterein­ heiten, die gleichzeitig auch einen eigenen Komplex (Aggregat) darstellen, bestehen teilweise aus nur wenigen Lipidpartikeln plus verknüpfendes Transfektionsmaterial (z. B. DNA-Stränge). Es kommt auch vor, daß lediglich ein oder zwei Lipidpartikel einen Komplex mit dem zu transferierendem Material bilden, vorzugsweise haben dabei die Lipidpartikel eine Größe < 500 nm, insbesondere < 1 µm.The complexes are aggregates, the Aggregate structure consists of strands of transfection material, the lipid particle is linked. The aggregates exist thereby from subunits assembled. Smallest sub units that also have their own complex (aggregate) represent, sometimes consist of only a few lipid particles plus linking transfection material (e.g. DNA strands). It also happens that only one or two lipid particles one Form complex with the material to be transferred, preferably the lipid particles have a size of <500 nm, in particular <1 µm.

Die gebildeten Komplexe können sowohl in vitro (z. B. Zellkultur) als auch in vivo eingesetzt werden. Beim in vivo-Einsatz kann die Applikation auf vielfältigen Wegen erfolgen, z. B. oral über den Gastrointestinaltrakt (GIT) oder parenteral auf verschiedenen Wegen, von intravenöser Injektion bis zur lymphatischen Absorp­ tion nach Injektion in der Nähe von Lymphgefäßen. Um eine ver­ besserte Aufnahme aus bestimmten Organen (vom GIT, Erhöhung der Bioverfügbarkeit) oder in bestimmte Organe (z. B. Gehirn, Herz, Knochenmark, Niere nach intravenöser Injektion) zu erreichen, können die hergestellten Komplexe selbst wieder mit Oberflächen­ modifikatoren versehen werden. Dies reicht von Lektinen zur verbesserten Aufnahme aus dem GIT bis hin zu Polymeren (Poloxamer 407 für Knochenmarktargeting, Poloxamine für Bluttargeting) und nichtionischen Tensiden (Tween 80, Gehirntargeting) einschließ­ lich Antikörpern.The complexes formed can be used both in vitro (e.g. cell culture) and in vivo. When used in vivo, the application can be done in a variety of ways, e.g. B. orally via the gastrointestinal tract (GIT) or parenterally in various ways, from intravenous injection to lymphatic absorption after injection near lymphatic vessels. In order to achieve an improved uptake from certain organs (from the GIT, increasing bioavailability) or into certain organs (e.g. brain, heart, bone marrow, kidney after intravenous injection), the complexes produced can themselves be provided with surface modifiers , This ranges from lectins for improved uptake from the GIT to polymers (Poloxamer 407 for bone market targeting, Poloxamine for blood targeting) and nonionic surfactants (Tween 80 , brain targeting) including antibodies.

Die erfindungsgemäßen Komplexe können daher beispielsweise zusätzliche Stoffe enthalten, insbesondere Lektine, Antikörper oder Adhäsionsfaktoren, die die Bindung und die Aufnahme durch die zu transfizierenden Zellen verbessern.The complexes according to the invention can therefore, for example contain additional substances, especially lectins, antibodies or adhesion factors that affect binding and uptake improve the cells to be transfected.

Ferner können die erfindungsgemäßen Komplexe zusätzlich Stoffe, insbesondere Peptide, enthalten, die die Fähigkeit haben, eine Translokation der transfizierten DNA in den Zellkern zu induzie­ ren, wobei diese zusätzlichen Stoffe an den Lipidpartikel oder die DNA gekoppelt sind.Furthermore, the complexes according to the invention can additionally contain substances especially peptides, which have the ability to To induce translocation of the transfected DNA into the cell nucleus ren, these additional substances on the lipid particles or the DNA is coupled.

Generell ist die Verwendung der Komplexe vielfältig, beispiels­ weise u. a.:
In general, the use of the complexes is varied, for example:

  • a) für den spezifischen oder unspezifischen Transfer gene­ tischer Information in Zellen,a) for specific or non-specific transfer genes information in cells,
  • b) zur stabilen Lagerung von Polynukleotiden,b) for the stable storage of polynucleotides,
  • c) generell zur Therapie in vivo und ex vivo,c) generally for therapy in vivo and ex vivo,
  • d) zur lokalen, oralen oder systemischen in vivo Therapie von Krankheiten,d) for local, oral or systemic in vivo therapy of Diseases,
  • e) zur Transfektion im Allgemeinen,e) for transfection in general,
  • f) zur Gentherapie.f) for gene therapy.
BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Herstellung des KomplexesProduction of the complex

Das Lipid Compritol wurde geschmolzen, in Wasser mit 4% einer Tensidmischung aus Tween 80/Span 85 (Verhältnis 7 : 3) und 1% EQ1 (N,N-Di(β-stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) durch Rühren bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend die erhaltene Emulsion (Lipidgehalt 4%) bei 85°C hochdruckhomogeni­ siert (LAB 60 Homogenisator, APV Homogenizer GmbH, Lübeck). Homogenisation erfolgte im Zirkulationsmodus über 30 Minuten bei 500 bar am Hauptdruckventil. Der PCS-Durchmesser der Lipid­ partikel betrug 101 nm, die dazugehörige Polydispersität 0,101, das Zetapotential war +42 mV. Zur Herstellung des Komplexes wurde die Lipidpartikeldispersion mit pCMVβ Plasmid in HEPES-Puffer (pH 7,4) gemischt, in der Endmischung betrug die Konzentration an Lipid 600 µg/ml, die an Plasmid 10 µg/ml.The lipid compritol was melted in water with 4% of a surfactant mixture of Tween 80 / Span 85 (ratio 7: 3) and 1% EQ1 (N, N-Di (β-stearoylethyl) -N, N-dimethylammonium chloride) by stirring dispersed at the same temperature and then the emulsion obtained (lipid content 4%) at 85 ° C high pressure homogenized (LAB 60 homogenizer, APV Homogenizer GmbH, Lübeck). Homogenization took place in the circulation mode over 30 minutes at 500 bar at the main pressure valve. The PCS diameter of the lipid particles was 101 nm, the associated polydispersity was 0.101, the zeta potential was +42 mV. To prepare the complex, the lipid particle dispersion was mixed with pCMVβ plasmid in HEPES buffer (pH 7.4), the concentration of lipid in the final mixture was 600 μg / ml, that of plasmid was 10 μg / ml.

Beispiel 2Example 2 Bestimmung der Struktur des KomplexesDetermination of the structure of the complex

Die Struktur des Komplexes kann gezielt durch die Art der Herstellung beeinflußt werden, z. B. Lipidpartikelgröße, Verhält­ nis Lipid : Plasmid, sowie Reihenfolge, Art und Konzentration zugesetzter Elektrolyte. Die Komplex-Produkte aus Beispiel 1 wurde mit Kraftmikroskopie (AFM - Atomic Force Microscopy) untersucht. Die Komplexe wurden an der Oberfläche eines Silicium Wafers adsorbiert und mit AFM im Kontaktmode mit einem Nanoscope lila (Digital Instruments) untersucht. Die Federkonstante des Cantilevers war 34 N/m, die Scan Geschwindigkeit 0,5 Hz mit einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln. Die Übersichtsaufnahme (Abb. 1A) zeigt die Komplexe, zusätzlich sind noch einzelne Lipidpartikel in einer Größe von ca. 100 nm zu sehen. Es gibt zwei Arten von Komplexen, den zahlenmäßig am häufigsten vorkommenden Komplextyp I mit mehr rundlicher Form in einer Größe von ca. 300-800 nm sowie Komplextyp II mit einer Größe von < 1 µm. Die höher auflösenden Aufnahmen (Abb. 1B und 1C) zeigen, daß die Komplexe aus Untereinheiten bestehen, die fusioniert haben, Abb. 1C zeigt den Vergleich von ursprünglichem, einzelnem Lipidpartikel zum hergestellten Komplex. Abb 1D zeigt eine Momentaufnahme aus dem Bildungsprozeß des Komplexes. Freie DNA-Stränge, DNA-Stränge bereits besetzt mit Lipidpartikeln und freie SLN sind im Prozeß zur Fusionierung zu einem großen Komplex (Aggregat in linker unterer Hälfte).The structure of the complex can be influenced by the type of production, z. B. lipid particle size, ratio lipid: plasmid, and order, type and concentration of added electrolytes. The complex products from Example 1 were examined using atomic force microscopy (AFM). The complexes were adsorbed on the surface of a silicon wafer and examined with AFM in contact mode with a purple nanoscope (Digital Instruments). The cantilever's spring constant was 34 N / m, the scan speed 0.5 Hz with a resolution of 512 × 512 pixels. The overview ( Fig. 1A) shows the complexes, in addition individual lipid particles with a size of approx. 100 nm can be seen. There are two types of complexes, the most frequently occurring complex type I with a more rounded shape with a size of approx. 300-800 nm and complex type II with a size of <1 µm. The higher-resolution images ( Figs. 1B and 1C) show that the complexes consist of subunits that have fused, Fig. 1C shows the comparison of the original, individual lipid particle to the complex produced. Fig. 1 D shows a snapshot of the complex's formation process. Free DNA strands, DNA strands already filled with lipid particles and free SLN are in the process of fusing into a large complex (aggregate in the lower left half).

Beispiel 3Example 3 Bestimmung der Bindung der Komplexe für DNA durch Gelelektro­ phorese (EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay)Determination of the binding of the complexes for DNA by gel electro phoresis (EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay)

Transfektionskomplexe wurden durch Mischen von Lipidpartikeln und pCMVβ Plasmid in 200 µl HEPES-Puffer (pH 7,4) bei einer Plasmid­ konzentration von 20 µg/ml analog Beispiel 1 hergestellt.Transfection complexes were made by mixing lipid particles and pCMVβ plasmid in 200 ul HEPES buffer (pH 7.4) with a plasmid concentration of 20 µg / ml prepared analogously to Example 1.

Verschiedene Verhältnisse von Lipidpartikeln: pCMVβ DNA (von 200 bis 5) wurden gemischt und mit diesen Mischungen eindimensionale Gelelektrophorese auf Agarosegel durchgeführt (2 Stunden bei 5 V/cm). Das erhaltene Gel wurde mit einem UV Transilluminator und dem Geldoc2000 Gel Dokumentationssystem untersucht (Biorad, München, Deutschland), Integration der Bänder und Hintergrundkor­ rektur erfolgte mit der Molecular Analyst Version 1.1 Software (Bioread). Bindung der DNA in einen Komplex führt zu einer Än­ derung (shift) in der Wanderung im Gel hin zu höheren Molekular­ gewichten bzw. DNA ist so immobilisiert, daß sie an der Auftrag­ stelle (well) im Gel verbleibt. Oberhalb eines Lipidpartikel­ verhältnisses von 50, 100% der DNA war zu höheren Molekularge­ wichten verschoben bzw. komplett immobilisiert (Abb. 2) Different ratios of lipid particles: pCMVβ DNA (from 200 to 5) were mixed and one-dimensional gel electrophoresis on agarose gel was carried out with these mixtures (2 hours at 5 V / cm). The gel obtained was examined with a UV transilluminator and the Geldoc2000 gel documentation system (Biorad, Munich, Germany), the bands and background correction were integrated using the Molecular Analyst Version 1.1 software (Bioread). Binding of the DNA in a complex leads to a change (shift) in the migration in the gel towards higher molecular weights or DNA is immobilized in such a way that it remains in the gel at the application site (well). Above a lipid particle ratio of 50, 100% of the DNA was shifted to higher molecular weights or completely immobilized ( Fig. 2)

Beispiel 4Example 4 Bestimmung der Bindungseffizienz des Komplexes für DNA über die Zugänglichkeit noch freier DNA für Ethidiumbromid (EB)Determination of the binding efficiency of the complex for DNA via the Accessibility of free DNA for ethidium bromide (EB)

Ansteigende Verhältnisse von Lipidpartikeln zu pCMVβ DNA (von 10 : 90 zu 90 : 10) wurden gemischt, um die erfindungsgemäßen Komplexe herzustellen. DNA wurde in 50 mM Hepes Puffer (pH 7,4) auf eine Konzentration von 10 µg/ml verdünnt, dann wurde mit unterschiedlichen Mengen Partikeldispersion gemischt und auf 2 ml aufgefüllt. Nach 3 Minuten Inkubation zur Komplexbildung wurde 1 ml EB-Lösung (800 ng/ml) zur Hälfte der Probe gegeben, 1 ml Wasser zur anderen Hälfte (Hintergrundmessung) und die Fluo­ reszenz bei λ = 366 nm (Exsikkation) und λ = 590 nm (Emmission) in einem F-2000 Fluoreszenzspektrophotometer gemessen.Increasing ratios of lipid particles to pCMVβ DNA (from 10:90 to 90:10) were mixed to give the invention To produce complexes. DNA was in 50 mM Hepes buffer (pH 7.4) diluted to a concentration of 10 µg / ml, then with mixed different amounts of particle dispersion and make up to 2 ml refilled. After 3 minutes of incubation, the complex was formed Add 1 ml EB solution (800 ng / ml) to half the sample, 1 ml Water to the other half (background measurement) and the fluo Resence at λ = 366 nm (desiccation) and λ = 590 nm (emission) in measured on an F-2000 fluorescence spectrophotometer.

Freie (zugängliche) DNA interkaliert mit EB, das Fluoreszenz­ signal von interkalierten EB wird zur Quantifizierung genutzt, d. h. je geringer das Signal um so mehr ist EB ausgeschlossen und DNA gebunden (Abb. 3).Free (accessible) DNA intercalates with EB, the fluorescence signal from intercalated EB is used for quantification, ie the lower the signal, the more EB is excluded and DNA bound ( Fig. 3).

Beispiel 5Example 5 Transfektionseffizienztransfection

Die Transfektionseffizienz wurde an African Green Monkey Kidney Fibroblast-like Cos-1 Zellen untersucht. Komplexe wurden durch Mischen hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, die Lipid­ partikelkonzentrationen variierten, die Endkonzentration an Plasmid in der Mischung betrug 20 µg/ml. Die Komplexe wurden mit Puffer oder doppeltkonzentriertem Zellkulturmedium (Dulbeco's modified eagle's - DME) 1 : 1 verdünnt, und die Monolayer der Cos-1 Zellen im Well der Mikrotiterplatten mit 100 µl dieser Mischung für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden mit Puffer gewaschen, und für weitere 48 Stunden in DME unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert. Das pCMVβ Plasmid bewirkt eine β-Galactosidase Expression. Die Transfektionseffizienz wurde daher anschließend über die Aktivität der β-Galactosidase bestimmt unter Verwendung des Luminescence Galacto-Star assay system (PE Biosystems, CCC). Die Zellen wurde mit Puffer gewaschen, lysiert und mit 100 µl Reaktionslösung über 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert um maximale Lumineszenzsignale zu erreichen. Die Bestimmung der Lumineszenz erfolgte mit einem Wallac beta (PE Biosystems) über eine Integrationszeit von einer Sekunde. Gereinigte rekombinante β-Galactosidase wurde als Standard eingesetzt. Die Transfektionseffizienz war maximal bei einem Verhältnis von ca. 40-60 (Abb. 4).The transfection efficiency was investigated on African Green Monkey Kidney fibroblast-like Cos-1 cells. Complexes were prepared by mixing as described in Example 1, the lipid particle concentrations varied, the final concentration of plasmid in the mixture was 20 μg / ml. The complexes were diluted 1: 1 with buffer or double-concentrated cell culture medium (Dulbeco's modified eagle's - DME), and the monolayers of the Cos-1 cells were incubated in the well of the microtiter plates with 100 μl of this mixture for 4 hours at 37 ° C. The cells were washed with buffer and cultured for a further 48 hours in DME with the addition of 10% fetal calf serum (FCS). The pCMVβ plasmid causes β-galactosidase expression. The transfection efficiency was therefore subsequently determined via the activity of the β-galactosidase using the Luminescence Galacto-Star assay system (PE Biosystems, CCC). The cells were washed with buffer, lysed and incubated with 100 μl reaction solution over 90 minutes at room temperature in order to achieve maximum luminescence signals. The luminescence was determined using a Wallac beta (PE Biosystems) over an integration time of one second. Purified recombinant β-galactosidase was used as the standard. The transfection efficiency was maximal at a ratio of approx. 40-60 ( Fig. 4).

Beispiel 6Example 6 Transfektionseffizienz von Komplexen mit zusätzlichem Chloroquin (CQ)Transfection efficiency of complexes with additional chloroquine (CQ)

Die Herstellung und Testung erfolgte wie in Beispiel 5 beschrie­ ben, zusätzlich enthielt das Komplexsystem 100 µM Chloroquin. Das Komplexsystem aus Lipidpartikeln, Plasmid und Chloroquin hat eine weit höhere Transfektionseffizienz, maximale Transfektion tritt bereits beim kleinsten Gewichtsverhältnis von 10 auf (Abb. 4).The preparation and testing was carried out as described in Example 5, additionally the complex system contained 100 μM chloroquine. The complex system of lipid particles, plasmid and chloroquine has a far higher transfection efficiency, maximum transfection occurs even at the lowest weight ratio of 10 ( Fig. 4).

Beispiel 7Example 7 Bestimmung der Cytotoxizität (Membranschädigung) von Trans­ fektionsagentienDetermination of the cytotoxicity (membrane damage) of trans fektionsagentien

Zur Bestimmung der Membranschädigung wurden die Cos-1 Zellen mit ansteigenden Konzentrationen des Transfektionsagens 4 Stunden inkubiert und anschließend nach Waschen mit Puffer direkt mit dem LDH-Assay (LactatDehydrogenase) untersucht (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany). Mit zunehmender Membranschädigung nimmt die LDH-Freisetzung zu. Untersucht wurden die Transfektionsagentien Lipidpartikel aus Beispiel 1 im Vergleich zu dem konventionellen Agens Polyethylenimin (pEI) (Molekulargewicht 60 kDa) sowie zu Poly-L-Lysin. Die ED50 im LDH-Assay war 3000 µg/ml bei den Lipidpartikeln, jedoch 20 µg/ml bei pEI (d. h. pEI hat ca. 150 fach höhere Membrantoxizität) und 10 µg/ml bei Poly-L-Lysin. To determine the membrane damage, the Cos-1 cells were incubated with increasing concentrations of the transfection agent for 4 hours and then, after washing with buffer, examined directly with the LDH assay (lactate dehydrogenase) (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany). With increasing membrane damage, the LDH release increases. The transfection agents lipid particles from Example 1 were examined in comparison to the conventional agent polyethyleneimine (pEI) (molecular weight 60 kDa) and to poly-L-lysine. The ED50 in the LDH assay was 3000 µg / ml for the lipid particles, but 20 µg / ml for pEI (ie pEI has approximately 150 times higher membrane toxicity) and 10 µg / ml for poly-L-lysine.

Beispiel 8Example 8 Viabilitätstest mit TransfektionsagentienViability test with transfection agents

Die Cos-1 Zellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen des Transfektionsagens 4 Stunden inkubiert, gewaschen und - im Gegensatz zu Beispiel 7 - nicht direkt untersucht sondern nach dem Waschen mit Puffer weitere 48 Stunden in DME Medium unter Zusatz von 10% FCS kultiviert. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde das WST-1 Assay eingesetzt (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany), eine verbesserte Form des MTT-Tests. Bestimmt wurde die Dosis, die zum Absterben von 50% der Zellen führt (LD50).The Cos-1 cells were with increasing concentrations of Transfection agent incubated for 4 hours, washed and - in Contrary to example 7 - not examined directly but after washing with buffer for a further 48 hours in DME medium Addition of 10% FCS cultivated. To determine cell viability the WST-1 assay was used (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany), an improved form of the MTT test. That was determined Dose that causes 50% of the cells to die (LD50).

Untersucht wurden die Transfektionsagentien Lipidpartikel aus Beispiel 1 im Vergleich zu dem konventionellen Agens Poly­ ethylenimin (pEI) sowie zu Poly-L-Lysin als Standard. Die LD50 war 600 µg/ml bei den Lipidpartikeln, jedoch 20 µg/ml bei pEI und 10 µg/ml bei Poly-L-Lysin.The transfection agents lipid particles were examined Example 1 compared to the conventional agent poly ethyleneimine (pEI) and poly-L-lysine as standard. The LD50 was 600 µg / ml for the lipid particles, but 20 µg / ml for pEI and 10 µg / ml for poly-L-lysine.

Beispiel 9Example 9 Membranschädigung und ViabilitätMembrane damage and viability

Lipidpartikel wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch aus 4% festem Paraffin als Lipid. Die Mebranschädigung wurde analog Beispiel 7 bestimmt: ED50 < 5000 µg/ml (pEI 20 µg/ml), die Viabilität analog Beispiel 8 bestimmt: LD50 700 µg/ml (pEI 20 µg/ml).Lipid particles were prepared as in Example 1, but from 4% solid paraffin as lipid. The membrane damage became analogous Example 7 determines: ED50 <5000 ug / ml (pEI 20 ug / ml), the Viability determined analogously to Example 8: LD50 700 µg / ml (pEI 20 µg / ml).

Beispiel 10Example 10 Komplexierungsvermögen von LipidpartikelnComplexation ability of lipid particles

Es wurden Lipidpartikel analog Beispiel 1 hergestellt, als Lipid wurde das Behensäure-Glyceridgemisch Compritol eingesetzt (Firma Gattefossé, Frankreich), als zusätzliches kationisches Tensid 1% Cetylpyridiniumchlorid (CPC). Der PCS-Durchmesser betrug 105 nm, der Polydispersitätsindex 0,112 und das Zetapotential +40 mV (d. h. identische physikalische Kenndaten zu den Lipidpartikeln aus Beispiel 1). Einfache Mischung dieser Lipidpartikel mit HEPES-Puffer ohne Komplex-fördernden Elektrolytzusatz führte zu keiner Komplexbildung, im EMSA wurde keine "mobility shift" detektiert.Lipid particles were produced analogously to Example 1, as lipid the behenic acid-glyceride mixture Compritol was used (company Gattefossé, France), as additional cationic surfactant 1% Cetylpyridinium chloride (CPC). The PCS diameter was 105 nm, the polydispersity index 0.112 and the zeta potential +40 mV  (i.e. identical physical characteristics to the lipid particles from example 1). Simply mix these lipid particles with HEPES buffer without complex-promoting electrolyte addition led to no complex formation, in the EMSA no "mobility shift" detected.

Beispiel 11Example 11 Physikalische Stabilität der zur Herstellung von Komplexen benutzten LipidpartikelPhysical stability of complexes used lipid particles

Die in Beispiel 1 hergestellten Partikel wurden durch Autoklavie­ ren bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Der PCS-Durchmesser vor der Sterilisation betrug 103 nm, der Polydispersitätsindex 0,110, die Werte nach der Sterilisation 101 nm und 0,101.The particles produced in Example 1 were autoclaved sterilized at 121 ° C for 15 minutes. The PCS diameter before sterilization was 103 nm, the polydispersity index 0.110, the values after sterilization 101 nm and 0.101.

Claims (29)

1. Komplexe zur Transfektion dadurch gekennzeichnet, daß sie
  • a) zu transfizierendes Material und
  • b) Lipidpartikel, die aus bei Raumtemperatur festen Lipiden oder Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden bestehen,
umfassen, wobei die Lipidpartikel an ihrer Oberfläche Modifizierungsmittel aufweisen.1. complexes for transfection characterized in that they
  • (a) material to be transfected and
  • b) lipid particles consisting of lipids solid at room temperature or lipid mixtures of lipids solid at room temperature with lipids which are semi-solid or liquid at room temperature,
comprise, wherein the lipid particles have modifying agents on their surface. 2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu transfizierende Material Polynukleotide, insbesondere DNA, und/oder Antisensenukleotide umfaßt.2. Complexes according to claim 1, characterized in that the material to be transfected polynucleotides, in particular DNA, and / or antisense nucleotides. 3. Komplexe zur Transfektion nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Elektrolyt als Bestand­ teil umfassen oder zusätzlich Elektrolyt zu ihrer Herstel­ lung verwendet worden ist, wobei anschließend ungebundener Elektrolyt aus der Komplex-Suspension wieder entfernt worden ist.3. complexes for transfection according to claim 1 or 2, characterized characterized that they additionally electrolyte as a stock Partially include or in addition electrolyte for their manufacture lung has been used, after which unbound Electrolyte removed from the complex suspension has been. 4. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zur Herstellung des Komplexes eingesetz­ ten Lipidpartikel einen mittleren Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben, vorzugsweise 10 nm bis 500 nm, und ins­ besondere 10 nm bis 200 nm.4. Complexes according to one of claims 1 to 3, characterized records that the used for the preparation of the complex ten lipid particles have an average diameter of 10 nm to 1000 nm, preferably 10 nm to 500 nm, and ins special 10 nm to 200 nm. 5. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zur Herstellung des Komplexes eingesetz­ ten Lipidpartikel einen mittleren Durchmesser von 1 µm bis 20 µm, vorzugsweise einen Durchmesser von 1 µm bis 10 µm, insbesondere von 1 µm bis 5 µm haben. 5. Complexes according to one of claims 1 to 3, characterized records that the used for the preparation of the complex lipid particles with an average diameter of 1 µm to 20 µm, preferably a diameter of 1 µm to 10 µm, in particular from 1 µm to 5 µm.   6. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine Größe < 1000 nm haben, vorzugsweise 100 bis 800 nm, und insbesondere 300 nm bis 800 nm.6. Complexes according to one of claims 1 to 5, characterized records that they have a size <1000 nm, preferably 100 to 800 nm, and in particular 300 nm to 800 nm. 7. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine Größe < 1 µm bis 30 µm haben, vorzugsweise < 1 µm bis 10 µm, insbesondere < 1 µm bis 5 µm.7. Complexes according to one of claims 1 to 5, characterized indicates that they have a size <1 µm to 30 µm, preferably <1 µm to 10 µm, in particular <1 µm to 5 µm. 8. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Zetapotential der zur Komplexierung eingesetzten Lipidpartikel positiv ist, vorzugsweise < 0 mV bis +100 mV, insbesondere +20 mV bis 60 mV.8. Complexes according to one of claims 1 to 7, characterized records that the zeta potential of complexation the lipid particle used is positive, preferably <0 mV up to +100 mV, in particular +20 mV to 60 mV. 9. Komplexe nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, vorzugs­ weise 1 : 1 Elektrolyte, insbesondere NaCl und KCL, bevorzugt in isotonischer Konzentration oder geringer konzentriert.9. Complexes according to claim 8, characterized in that too Electrolytes are used in their manufacture, preferably wise 1: 1 electrolytes, especially NaCl and KCL, preferred concentrated in isotonic concentration or less. 10. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Partikel ungeladen oder nur geringfügig geladen sind, wobei das Zetapotential im Bereich von -20 mV bis +20 mV liegt.10. Complexes according to one of claims 1 to 7, characterized records that the particles are uncharged or only slightly are charged, the zeta potential in the range of -20 mV up to +20 mV. 11. Komplexe nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, vorzugs­ weise 1 : 2 Elektrolyte, insbesondere CaCl2, oder 2 : 1 Elek­ trolyte, bevorzugt in isotonischer Konzentration.11. Complexes according to claim 10, characterized in that electrolytes are used for their preparation, preferably 1: 2 electrolytes, in particular CaCl 2 , or 2: 1 electrolytes, preferably in isotonic concentration. 12. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Zetapotential der zur Komplexierung eingesetzten Lipidpartikel negativ ist, vorzugsweise < 0 mV bis -100 mV, insbesondere -20 mV bis -60 mV.12. Complexes according to one of claims 1 to 7, characterized records that the zeta potential of complexation lipid particle used is negative, preferably <0 mV to -100 mV, especially -20 mV to -60 mV. 13. Komplexe nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, vorzugsweise 1 : 3 Elektrolyte, insbesondere AlCl3, oder 3 : 1 Elek­ trolyte, bevorzugt in isotonischer Konzentration.13. Complexes according to claim 10, characterized in that electrolytes are used for their preparation, preferably 1: 3 electrolytes, in particular AlCl 3 , or 3: 1 electrolytes, preferably in isotonic concentration. 14. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die oberflächenmodifizierenden Sub­ stanzen an der Oberfläche der Lipidpartikel Tenside oder Polymere sind.14. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the surface-modifying sub punch surfactants on the surface of the lipid particles or Are polymers. 15. Komplexe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Tenside ionische Tenside sind, insbesondere Natriumlauryl­ sulfat, nichtionische Tenside sind, insbesondere aus den Serien von Tween® und Span® oder Zuckerester), kationische Tenside sind, insbesondere Cetylpyridiniumchlorid, DOTMA (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium­ chlorid), DDAB (Didodecyldimethylammoniumbromid), DOSPA (2,3-dioleyloxy-N-[2(spermidincarboxamid)ethyl]-N,N- dimethyl-1-propylammoniumtrifluoroacetat), DC-Chol (3β -[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterol), Esterquats (Esterverbindungen, die mindestens ein quartäres Stickstoffatom enthalten) sind, insbesondere EQ1, DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), oder amphotere Tenside sind, insbesondere Lecithine, Phospholipide).15. Complexes according to claim 14, characterized in that the surfactants are ionic surfactants, in particular sodium lauryl sulfate, nonionic surfactants, in particular from the series of Tween® and Span® or sugar esters), are cationic surfactants, in particular cetylpyridinium chloride, DOTMA (N- [1- (2, 3, -dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DDAB (didodecyldimethylammonium bromide), DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (spermidincarboxamid) ethyl] -N, N- dimethyl-1-propylammonium trifluoroacetate), DC-chol (3β - [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol), ester quats (ester compounds which contain at least one quaternary nitrogen atom), in particular EQ1, DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide ), or amphoteric surfactants, especially lecithins, phospholipids). 16. Komplexe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol oder Poly­ mere ausgewählt aus den Serien der Poloxamere® oder Polox­ amine® sind.16. Complexes according to claim 14, characterized in that the Polymeric polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol or poly mere selected from the series of Poloxamere® or Polox amine®. 17. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Aggregaten bestehen, wobei die Aggregatstruktur Stränge von Transfektionsmaterial umfaßt, das Lipidpartikel miteinander verknüpft.17. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that they consist of aggregates, the Aggregate structure comprising strands of transfection material, the lipid particle is linked. 18. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregate aus zusammengelagerten Untereinheiten bestehen. 18. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the aggregates from assembled Subunits exist.   19. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß lediglich ein oder zwei Lipidpartikel einen Komplex mit dem zu transferierendem Material bilden, wobei die Lipidpartikel vorzugsweise eine Größe < 500 nm, ins­ besondere < 1 µm haben.19. Complexes according to one of claims 1 to 16, characterized records that only one or two lipid particles one Form complex with the material to be transferred, whereby the lipid particles preferably have a size <500 nm, ins have special <1 µm. 20. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zusätze von Arzneistoffen enthal­ ten, insbesondere lysosomotrope oder endosomolytische Sub­ stanzen, die die Transfektionseffizienz steigern, ins­ besondere Chloroquin, Monensin, oder schwache Basen, bevorzugt basische Stickstoffverbindungen.20. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that they contain additions of drugs ten, especially lysosomotropic or endosomolytic sub punches that increase transfection efficiency, ins special chloroquine, monensin, or weak bases, preferably basic nitrogen compounds. 21. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zusätze von membranschädigenden Substanzen, insbesondere Poly-L-Lysin, oder mit Membranen wechselwirkenden Substanzen, insbesondere Dimethylsulfoxid, Azone oder membrandestabilisierende Peptide, insbesondere Aminosäuresequenzen aus dem Influenzavirus Haemagglutinin oder dem Bienengift Mellitin enthalten, die die Trans­ fektionseffizienz steigern.21. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that they contain additives of membrane-damaging Substances, especially poly-L-lysine, or with membranes interacting substances, especially dimethyl sulfoxide, Azones or membrane-destabilizing peptides, in particular Amino acid sequences from the influenza virus haemagglutinin or the bee venom mellitin, which the Trans increase your efficiency. 22. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Komplexoberfläche Ober­ flächenmodifikatoren enthalten, die die Verteilung im Organismus beeinflussen, insbesondere nach parenteraler Injektion (bevorzugt intravenöser Injektion), oraler oder pulmonaler Applikation.22. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized that they are on the complex surface Ober include surface modifiers that control the distribution in the Affect organism, especially after parenteral Injection (preferably intravenous injection), oral or pulmonary application. 23. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzliche Stoffe enthalten, insbesondere Lektine, Antikörper oder Adhäsionsfaktoren, die die Bindung und die Aufnahme durch die zu transfizie­ renden Zellen verbessern.23. Complexes according to one of the preceding claims, characterized marked that they contain additional substances, especially lectins, antibodies or adhesion factors, which transfizie the binding and the uptake by those cells. 24. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Stoffe, insbesondere Peptide, enthalten, die die Fähigkeit haben, eine Trans­ lokation der transfizierten DNA in den Zellkern zu induzie­ ren, wobei diese zusätzlichen Stoffe an den Lipidpartikel oder die DNA gekoppelt sind.24. Complexes according to one of the preceding claims, characterized characterized in that they additionally contain substances, in particular  Contain peptides that have the ability to trans to induce the location of the transfected DNA in the cell nucleus ren, these additional substances on the lipid particles or the DNA is coupled. 25. Verfahren zur Herstellung von den Komplexen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst die Lipidpartikel mit einem an der Oberfläche befindlichem Oberflächenmodifizierungsmittel, insbesondere einem Tensid oder Polymer oder einer Mischung aus Tensid und Polymer hergestellt werden, und diese oberflächenmodifizierten Partikel dann mit dem Transfektionsmaterial gemischt und inkubiert werden.25. Process for the preparation of the complexes according to one of the Claims 1 to 24, characterized in that first the lipid particles with a surface Surface modifier, especially a surfactant or polymer or a mixture of surfactant and polymer be produced, and these surface modified Particles then mixed with the transfection material and be incubated. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischung aus Lipidpartikeln und Transfektionsmaterial Elek­ trolyte zugesetzt werden, die die Ausbildung des Komplexes fördern oder den bereits gebildeten Komplex verdichten, so daß die Komplexgröße reduziert wird, wobei die Elektrolyte nach beendeter Komplexbildung in der Komplexsuspension verbleiben oder alternativ entfernt werden.26. The method according to claim 25, characterized in that the Mixture of lipid particles and transfection material Elek trolytes are added to the formation of the complex promote or condense the already formed complex, so that the complex size is reduced, the electrolytes after complex formation in the complex suspension remain or alternatively removed. 27. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der An­ sprüche 25 oder 26 für den spezifischen oder unspezifischen Transfer genetischer Information in Zellen sowie zur stabilen Lagerung von Polynukleotiden.27. Use of the complexes according to one of claims 1 to 24 or produced by the method according to one of the An sayings 25 or 26 for the specific or non-specific Transfer of genetic information in cells and to stable storage of polynucleotides. 28. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der An­ sprüche 25 oder 26 zur lokalen, oralen oder systemischen Therapie von Krankheiten in vivo und ex vivo.28. Use of the complexes according to one of claims 1 to 24 or produced by the method according to one of the An sayings 25 or 26 on local, oral or systemic Therapy of diseases in vivo and ex vivo. 29. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der An­ sprüche 25 oder 26 zur Transfektion und zur Gentherapie.29. Use of the complexes according to one of claims 1 to 24 or produced by the method according to one of the An Proverbs 25 or 26 on transfection and gene therapy.
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