DE10057853A1 - Identifying agents that inhibit the function of specific RNA, useful e.g. for treating human or feline immune deficiency virus, comprises using a target-reporter construct prepared from a reporter ribozyme domain - Google Patents

Abstract

Identifying compounds (A1) that bind specifically to a particular RNA target motif (II) so as to inhibit or eliminate its function. Identifying compounds (A1) that bind specifically to a particular RNA target motif (II) so as to inhibit or eliminate its function comprises that a target-reporter construct (TRK) is prepared from a reporter ribozyme domain (I) and (II), connected through an RNA linker, so that, after binding of (A1) to (II), the catalytic activity of (I) is altered. TRK is contacted with: (i) a signal-generating ribozyme substrate (RS), able to bind specifically to (I); and (ii) a test compound, and any binding to (II) is detected. Independent claims are also included for the following: (1) a similar method for identifying compounds (A2) that can displace a compound associated with (II), so as to inhibit or eliminate its function; (2) a kit for the new process comprising TRK and RS; (3) a polynucleotide (PN) comprising a hammerhead ribozyme (hhR) and an adaptor (Ap) for a target molecule, in which the binding site of the catalytic domain of hhR for a substrate is blocked in the absence of target molecule; (4) a biosensor comprising PN; (5) identifying compounds (A3) that bind a target molecule, using PN; (6) a kit for method (5); and (7) use of coumermycin, nosiheptide and patulin for treatment of human/feline immune deficiency virus (H/FIV).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen (Leitstrukturen), die (a) an ein gewünschtes RNA-Target-Motiv spezifisch binden und dadurch dessen Funktion hemmen oder eliminieren können oder die (b) eine mit einem gewünschten RNA-Target-Motiv assoziierte Verbindung verdrängen und dadurch deren oder dessen Funktion hemmen oder eliminieren können. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Anlagerung eines Liganden (= zu identifizierende Verbindung) an ein mit einem modifizierten Ribozym gekoppeltes RNA-Target-Motiv, so daß das Ribozym in eine aktive oder inaktive (bzw. aktivere oder inaktivere) Konformation überführt wird, wodurch ein meßbares Signal erzeugt wird, z. B. durch Spaltung eines signalgebenden Ribozym-Substrats. Die so identifizierten Verbindungen dienen als pharmazeutische Leitsubstanzen für die Herstellung von Arzneimitteln, da sie die zelluläre Funktion eines RNA-Target-Motivs bzw. einer mit dem RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung spezifisch beeinflussen können.The present invention relates to a method for identifying compounds (Lead structures) which (a) specifically bind to a desired RNA target motif and thereby inhibiting or eliminating its function or (b) one with displace a compound associated with a desired RNA target motif and thereby inhibiting or eliminating their function. The The method according to the invention is based on the addition of a ligand (= to identifying compound) to a coupled with a modified ribozyme RNA target motif, so that the ribozyme into an active or inactive (or more active or more inactive) conformation is transferred, producing a measurable signal will, e.g. B. by cleaving a signaling ribozyme substrate. The so identified compounds serve as pharmaceutical lead substances for the Manufacture of drugs because they have the cellular function of an RNA target motif or a compound specifically associated with the RNA target motif can influence.

Ribonucleinsäuren übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie beispielsweise der Proteinsynthese, der Regulation der Genexpression oder der Prozessierung von mRNAs. Darüber hinaus sind RNA- Moleküle entscheidend an der Replikation von Retroviren und somit maßgeblich an der Manifestation bestimmter viraler Infektionen beteiligt. Auf Grund dieser Tatsachen bilden funktionelle RNAs in der pharmazeutischen Forschung eine wichtige Klasse von therapeutischen Zielmolekülen ("drug targets") [D. S. Eggleston, C. D. Prescott & N. D. Pearson (Hrsg.), The Many Faces of RNA, Academic Press (1998) 83-96; Y. Tor et al., Chem. Biol. 5 (1998), R277-R283; N. D. Pearson & C. D. Prescott, Chem. Biol. 4 (1997), 409-414; T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998), 66-73; M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63].Ribonucleic acids perform essential functions in a variety of cellular processes, such as protein synthesis, regulation of Gene expression or processing of mRNAs. In addition, RNA Molecules are crucial to the replication of retroviruses and thus significantly involved in the manifestation of certain viral infections. Based on these Facts form functional RNAs in pharmaceutical research important class of therapeutic target molecules ("drug targets") [D. S. Eggleston, C. D. Prescott & N. D. Pearson (ed.), The Many Faces of RNA, Academic Press (1998) 83-96; Y. Tor et al., Chem. Biol. 5 (1998), R277-R283; N. D. Pearson & C. D. Prescott, Chem. Biol. 4 (1997), 409-414; T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 1998, 9: 66-73; Afshar, M. et al., Curr. Opin. Biotech. 10: 59-63 (1999)].

Bereits seit Jahrzehnten werden kleine RNA-bindende Moleküle zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen eingesetzt [W. D. Wilson & K. Li, Curr. Med. Chem. 7 (2000), 73-98; Siegenthaler et al., Am. J. Med. 80 (1986), 2-14]. Durch Bindung an ribosomale RNA sind beispielsweise Aminoglycoside, wie Neomycin B, Paromomycin oder Streptomycin in der Lage, die bakterielle Translation zu inhibieren und somit antibiotische Wirkung zu entfalten [J. Woodcock et al., EMBO J. 10 (1991), 3099- 3103; D. Moazed & H. F. Noller, Nature 327 (1987), 389-394]. Eine Reihe von Aminoglycosiden der 2-Desoxystreptamin-Familie ist darüber hinaus imstande, spezifisch an das RNA-Strukturmotiv "RRE" des HIV-Genoms zu binden und dadurch die Vermehrung des HI-Virus zu verhindern [M. L. Zapp et al., Cell 74 (1993), 969-­ 978; W. K. C. Park, et al., JACS 118 (1996), 10150-10155]. Obgleich diese und andere Antibiotika seit langem von therapeutischem Nutzen sind, haben sie mittlerweile viel von ihrer Wirksamkeit eingebüßt. Eine stetig wachsende Zahl von pathogenen Organismen hat nämlich Resistenz-Gene gegen die etablierten Wirkstoffe erworben, wodurch heute massive Probleme im Gesundheitswesen entstehen [J. Davies, Science 264 (1994), 375-382; H. C. Neu, Science 257 (1992), 1064-1073; J. Davies & G. D. Wright, Trends Microbiol. 5 (1997), 234-240].For decades, small RNA-binding molecules have been used to combat bacterial infections [W. D. Wilson & K. Li, Curr. Med. Chem. 7 (2000), 73-98; Siegenthaler et al., Am. J. Med. 80 (1986), 2-14]. By binding to  Ribosomal RNA are, for example, aminoglycosides, such as neomycin B, paromomycin or streptomycin able to inhibit bacterial translation and thus to have antibiotic effects [J. Woodcock et al., 1991, EMBO J. 10: 3099- 3103; D. Moazed & H.F. Noller, 1987, Nature 327: 389-394]. A row of Aminoglycosides of the 2-deoxystreptamine family are also able to bind specifically to the RNA structural motif "RRE" of the HIV genome and thereby prevent the reproduction of the HI virus [M. L. Zapp et al., Cell 74 (1993), 969- 978; W.K.C. Park, et al. (1996) JACS 118: 10150-10155]. Although this and other antibiotics have long been of therapeutic use, they have now lost much of its effectiveness. A steadily growing number of pathogenic organisms have resistance genes against the established ones Active ingredients acquired, causing massive health care problems today arise [J. Davies, Science 264: 375-382 (1994); H.C. Neu, Science 257 (1992), 1064-1073; J. Davies & G. D. Wright, Trends Microbiol. 5: 234-240 (1997)].

Funktionelle RNA-Strukturen sind aus verschiedenen Gründen hervorragend als Zielmoleküle für pharmazeutische Wirkstoffe geeignet. Ebenso wie Proteine können Ribonucleinsäuren definierte räumliche Strukturen und Bindungsstellen ausbilden, um spezifisch mit anderen Molekülen zu interagieren [O. C. Uhlenbeck et al., Cell 90 (1997), 833-840; S. M. Hecht, Bioorg. Med. Chem. 5 (1997), 1001-1248; C. S. Chow, Chem. Rev. 97 (1997), 1489-1513]. Auch ist die Gefahr der Resistenzbildung bei Retroviren gegen RNA-Therapeutika wenig stark ausgeprägt, da die RNA- Zielmoleküle hoch konserviert und zunächst undupliziert im Genom der Wirtszelle vorliegen [F. Hamy et al., PNAS USA 94 (1997), 3548-3553; M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63]. Darüber hinaus sind zelluläre Mechanismen zur Reparatur von RNA-Schäden bis heute gänzlich unbekannt [T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998)].Functional RNA structures are excellent for various reasons Target molecules suitable for active pharmaceutical ingredients. Just like proteins can Form ribonucleic acids defined spatial structures and binding sites, to interact specifically with other molecules [O. C. Uhlenbeck et al., Cell 90 (1997), 833-840; S. M. Hecht, Bioorg. Med. Chem. 5 (1997), 1001-1248; C. S. Chow, Chem. Rev. 97 (1997), 1489-1513]. There is also a risk of developing resistance Retroviruses against RNA therapeutics are not very pronounced because the RNA Target molecules are highly conserved and initially unduplicated in the genome of the host cell available [F. Hamy et al., PNAS USA 94: 3548-3553 (1997); Afshar, M. et al., Curr. Opin. Biotech. 10: 59-63 (1999)]. In addition, cellular mechanisms for Repair of RNA damage completely unknown to date [T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998)].

Obgleich verschiedenste Gründe dafür sprechen, RNAs als therapeutische Zielmoleküle zu nutzen, sind Medikamente, die auf RNA-Strukturen zielen bei weitem nicht so etabliert, wie Therapeutika, die auf DNA- oder Protein-Ebene wirken. In der modernen Biotechnologie werden daher große Anstrengungen unternommen, Antibiotika und antivirale Wirkstoffe zu entwickeln, die gegen bestimmte RNA-Motive gerichtet sind [D. J. Ecker & R. H. Griffey, Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429]. Prinzipiell unterscheidet man dabei zwei unterschiedliche Strategien: (a) das rationale Wirkstoff-Design und (b) die kombinatorische Wirkstoffsuche.Although there are various reasons for this, RNAs as therapeutic Using target molecules are drugs that target RNA structures by far not as established as therapeutics that work at the DNA or protein level. In the modern biotechnology, great efforts are therefore made Develop antibiotics and antiviral agents that work against certain RNA motifs  are directed [D. J. Ecker & R.H. Griffey, Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429]. In principle, there are two different strategies: (a) that rational drug design and (b) the combinatorial drug search.

Im rationalen Wirkstoff-Design versucht man Vorhersagen über die Konformation eines RNA-Wirkstoff-Komplexes aus experimentell ermittelten Struktur- und Funktionsdaten zu treffen. Insbesondere die Strukturaufklärung mittels NMR- Spektroskopie hat dazu beigetragen, die RNA-Erkennung von antibiotischen Wirkstoffen auf molekularer Ebene aufzuklären [L. Jiang, et al., Chem. Biol. 4 (1997), 35-50; D. Fourmy, et al., Science 274 (1996), 1367-1371]. Um die gewonnenen Daten für das rationale Wirkstoff-Design zu nutzten, kommen verschiedenste Computerprogramme der Bioinformatik zum Einsatz, mit deren Hilfe RNA-Wirkstoff- Strukturmodelle berechnet werden können [z. B. "Monte Carlo": R. Rosenfeld et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 24 (1995), 677-700; "DOCK": Q. Chen et al., Biochemistry 36 (1997), 11402-11407; "Molecular Modeling": T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998), 66-73]. Im Vergleich dazu gibt es nur wenige Ansätze, um die Spezifität der RNA-Wirkstoff-Wechselwirkung experimentell zu bestimmen [M. Hendrix et al., J. Am. Chem. Soc. 119 (1997), 3641-3648; Y. Wang et al., Biochemistry 35 (1996), 12338-12346].In rational drug design, attempts are made to predict the conformation of an RNA-drug complex from experimentally determined structure and To meet functional data. In particular the structure elucidation by means of NMR Spectroscopy has contributed to the antibiotic RNA detection Elucidate drugs at the molecular level [L. Jiang, et al., Chem. Biol. 4 (1997), 35-50; D. Fourmy, et al. (1996) Science 274: 1367-1371]. To the won There are many different ways to use data for rational drug design Computer programs of bioinformatics are used, with the help of RNA active ingredient Structural models can be calculated [e.g. B. "Monte Carlo": R. Rosenfeld et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 24: 677-700 (1995); "DOCK": Q. Chen et al., Biochemistry 36: 11402-11407 (1997); "Molecular Modeling": T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998), 66-73]. In comparison, there are only a few Approaches to experimentally investigate the specificity of the RNA-drug interaction determine [M. Hendrix et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 3641-3648 (1997); Y. Wang et al., 1996 Biochemistry 35: 12338-12346].

Obgleich jüngste Studien zu interessanten Ergebnissen führten, ist das gezielte Design RNA-bindender Wirkstoffe beim gegenwärtigen Stand der Technik nur sehr eingeschränkt möglich. Zur Berechnung der RNA-Wirkstoff-Modelle ist es unabdingbar, die funktionellen und strukturellen Prinzipien der RNA-Wirkstoff- Erkennung genau zu verstehen, da die Interaktionen auf der Ebene von RNA-Primär-, Sekundär- oder komplexer Tertiärstrukturen stattfinden [R. Schroeder et al., EMBO J. 19 (2000), 1-9; T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998), 66-73]. Wertvolle Informationen über die Prinzipien der RNA-Wechselwirkung mit kleinen organischen Molekülen lieferten in diesem Zusammenhang die NMR-Strukturen von Aminoglycosid-RNA-Komplexen [Übersicht: M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63]. So gelang es beispielsweise aus der Struktur des Komplexes von ribosomaler RNA mit Paromomycin die Bindungseigenschaften des Antibiotikums sowie seine Spezifität gegenüber prokaryontischen Organismen und die Entstehung von Resistenzen zu erklären [D. Fourmy et al., Science 274 (1996), 1367-1371; S. C. Blanchard et al., Biochemistry 37 (1998), 7716-7724]. Neben den strukturellen Untersuchungen trugen auch gezielte Funktionsanalysen dazu bei, Einblicke in die molekulare Erkennung von RNA-bindenden Molekülen zu erhalten. Da jedoch viele der bekannten RNA-bindenden Moleküle komplexe, schwer zu modifizierende Naturstoffe sind, widmen sich nur wenige Arbeitsgruppen dieser Herausforderung. [W. K. C. Park et al., JACS 118 (1996), 10150-10155; H. Wang & Y. Tor, JACS 119 (1997), 8734-8735; J. H.-H. Tok & R. R. Rando, JACS 120 (1998), 8279-8280]Although recent studies have produced interesting results, this is targeted Design of RNA-binding agents only very much in the current state of the art limited possible. It is for calculating the RNA drug models indispensable, the functional and structural principles of the RNA active ingredient Understand detection precisely because the interactions at the level of RNA primary, Secondary or complex tertiary structures take place [R. Schroeder et al., EMBO J. 19 (2000), 1-9; T. Herrmann & E. Westhof, Curr. Opin. Biotech. 9 (1998), 66-73]. Valuable information on the principles of RNA interaction with small In this context, organic molecules provided the NMR structures of Aminoglycoside-RNA complexes [Overview: M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63]. For example, the structure of the ribosomal RNA with paromomycin the binding properties of the antibiotic as well as its specificity towards prokaryotic organisms and its emergence  to explain resistance [D. Fourmy et al. (1996) Science 274: 1367-1371; S. C. Blanchard et al., 1998 Biochemistry 37: 7716-7724]. In addition to the structural Investigations also contributed to targeted functional analyzes, insights into the to obtain molecular recognition of RNA-binding molecules. However, since many of the known RNA-binding molecules complex, difficult to modify Only a few working groups are dedicated to this challenge as natural substances. [W. K.C. Park et al., 1996 JACS 118: 10150-10155; H. Wang & Y. Tor, JACS 119 (1997), 8734-8735; J. H.-H. Tok & R. R. Rando, JACS 120 (1998), 8279-8280]

Die zunehmende Erkenntnis, daß RNA-Moleküle eine entscheidende Rolle in der Entstehung von Krankheitsbildern spielen können, geht mit verstärkten Bemühungen einher, empirische Verfahren zur Identifizierung von RNA-bindenden Wirkstoffen zu entwickeln [M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63]. Am aussichtsreichsten erscheinen zur Zeit Technologien der kombinatorischen Chemie, bei denen Bibliotheken von Kandidatenmolekülen im Hochdurchsatz-Verfahren auf aktive Substanzen durchsucht werden. Heute besteht mehr denn je ein Bedarf an Hochdurchsatz-Verfahren, um mit deren Hilfe neue Leitstrukturen gegen therapeutisch relevante RNA-Strukturen - insbesondere solche, deren Tertiärstrukturen und regulatorische Bedeutung bekannt sind - identifizieren zu können. Solche Leitstrukturen sind von hohem Nutzen, da sie direkt oder indirekt zur Entwicklung neuer therapeutischer, Wirkstoffe führen können. Darüber hinaus wäre es für die Erstellung von RNA-Struktur- und RNA-Funktions-Datenbanken von höchstem Wert, möglichst viele niedermolekulare Substanzen mit spezifischen Bindungseigenschaften für definierte RNA-Strukturen zu identifizieren [P. Brion & E. Westhof, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997), 113-137].The increasing awareness that RNA molecules play a crucial role in the The development of clinical pictures can be done with increased efforts along with empirical methods for the identification of RNA-binding agents develop [M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10: 59-63 (1999)]. At the Combinatorial chemistry technologies currently appear to be the most promising, where libraries of candidate molecules are based on high throughput active substances are searched. Today there is a need more than ever High-throughput process to counteract new lead structures therapeutically relevant RNA structures - especially those whose Tertiary structures and regulatory importance are known - identify too can. Such lead structures are very useful because they are used directly or indirectly Development of new therapeutic, active ingredients can lead. Beyond that it for the creation of RNA structure and RNA function databases from highest value, as many low-molecular substances as possible with specific Identify binding properties for defined RNA structures [P. Brion & E. Westhof, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 113-137 (1997)].

Konventionelle Standardmethoden zur RNA-Analyse, wie beispielsweise Gel- Retardations- oder Filterbindungs-Experimente setzten kinetisch stabile RNA-Ligand- Komplexe zu deren Detektion voraus und sind allein schon deshalb ungeeignet für das Screening von großen Verbindungsbibliotheken im industriellen Maßstab. Vielmehr wäre ein robuster, nicht-radioaktiver und breit anwendbarer Assay wünschenswert, der die schnelle, verlässliche Identifizierung von neuen RNA- bindenden Molekülen ermöglicht. Conventional standard methods for RNA analysis, such as gel Retardation or filter binding experiments set kinetically stable RNA ligand Complexes for their detection ahead and are therefore unsuitable for the screening of large compound libraries on an industrial scale. Rather, it would be a robust, non-radioactive and widely applicable assay desirable for the rapid, reliable identification of new RNA binding molecules.  

Wie die folgende Zusammenstellung der derzeit zu diesem Zweck eingesetzten Verfahren zeigt, ist ein solcher Assay nach dem heutigen Stand der Technik noch nicht bekannt.Like the following compilation of those currently used for this purpose Method shows, such an assay is still state of the art not known.

H.-Y. Mei et al. beschreiben ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren gegen das Gruppe I selbstspleißende Intron aus Pneumocystis carinii [H.-Y. Mei et al., NAR 24 (1996), 5051-5053]. Inhibitoren der Gruppe I Intron-Spleißreaktion gelten als potentielle antibiotische Wirkstoffe in der Bekämpfung von Lungeninfektionen, die durch den Pilz Pneumocystis carinii ausgelöst werden und für immunsupprimierte Patienten lebensbedrohlich verlaufen können. In einem von Mei et al. durchgeführten Hochdurchsatz-Screening gelang es mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens, neue inhibitorische Leitstrukturen aus einer Verbindungsbibliothek von ca. 300 000 niedermolekularen Substanzen zu identifizieren. [H-Y Mei et al., Bioorg. Med. Chem. 5 (1997), 1185-1195]. Auf Grund des Gruppe I Intron-spezifischen Spaltungsmechanismus, ist das Verfahren von Mei et al. jedoch nicht auf andere Ribozym-Reaktionen oder RNA-Zielstrukturen übertragbar und ist damit nur sehr begrenzt einsetzbar. Außerdem basiert das Verfahren auf radioaktiven Nachweismethoden und hat zudem den Nachteil, methodisch aufwendig zu sein.H.-Y. Mei et al. describe a method for identifying inhibitors against the Group I self-splicing intron from Pneumocystis carinii [H.-Y. Mei et al., NAR 24: 5051-5053 (1996)]. Group I intron splicing inhibitors are considered potential antibiotic agents in the fight against lung infections triggered by the fungus Pneumocystis carinii and for immunosuppressed Patients can be life-threatening. In one of Mei et al. conducted Using the described method, high-throughput screening succeeded in creating new ones inhibitory lead structures from a compound library of approx. 300,000 identify low molecular weight substances. [H-Y Mei et al., Bioorg. Med. Chem. 5: 1185-1195 (1997)]. Due to the Group I intron-specific Cleavage mechanism, is the method of Mei et al. but not to others Ribozyme reactions or RNA target structures are transferable and is therefore only very limited use. The process is also based on radioactive Detection methods and also has the disadvantage of being methodically complex.

J. E. Arenas et al. haben ein Screening-Verfahren ("SCAN") entwickelt, das die schnelle Identifizierung von niedermolekularen Liganden gegen verschieden RNA- Zielsequenzen ermöglicht [J. E. Arenas et al., Nucleic Acids Symp. Series 41 (1999), 13-16]. Mit Hilfe des Verfahrens gelang es, Substanzen zu isolieren, die an eine bestimmte regulatorische RNA-Sequenz, die sogenannte "Epsilon-RNA" des Hepatitis B Virus (HBV), binden. Einige der, isolierten Substanzen zeigten vielversprechende antivirale Eigenschaften in einem Zell-basierendem HBV- Replikations-Modell. Das von J. E. Arenas et al. beschriebene Verfahren nutzt die unterschiedlichen Hybridisierungs-Eigenschaften von freier bzw. Ligand-gebundener RNA an komplementäre Nucleinsäure-Sonden. Obwohl diese Technik zur Identifizierung von spezifischen RNA-bindenden Substanzen führte, ist sie doch methodisch relativ aufwendig, da quantitative Filtrationsschritte zur Detektion der RNA-Ligand-Komplexe durchgeführt werden müssen. Außerdem wurden bei dem von Arenas et al. durchgeführten Hochdurchsatz-Screening radioaktiv markierte RNAs verwendet, offensichtlich deshalb, weil andere Detektionsmethoden nicht ausreichend sensitiv waren.J.E. Arenas et al. have developed a screening process ("SCAN") that the rapid identification of low molecular weight ligands against different RNA Target sequences enabled [J. E. Arenas et al., Nucleic Acids Symp. Series 41 (1999), 13-16]. With the help of the method it was possible to isolate substances that are attached to a certain regulatory RNA sequence, the so-called "epsilon RNA" of Bind hepatitis B virus (HBV). Some of the, isolated substances showed promising antiviral properties in a cell-based HBV Replication model. The method described by J.E. Arenas et al. described method uses the different hybridization properties of free or ligand-bound RNA to complementary nucleic acid probes. Although this technique is used for Identification of specific RNA-binding substances, it is Methodologically relatively complex, since quantitative filtration steps to detect the RNA ligand complexes need to be performed. In addition, the  by Arenas et al. radioactively labeled high throughput screening RNAs are used, obviously because other detection methods do not were sufficiently sensitive.

In der WO 9818947A1 wird ein Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von RNA-Zielmolekülen beschrieben, die an Substanzen von therapeutischem Interesse binden. Die beschriebene Methode eignet sich ferner zur Identifizierung von neuen Wirkstoffen mit möglicher pharmakologischer Wirksamkeit. Zu diesem Zweck werden in lebenden Zellen RNA-Bibliotheken exprimiert und mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht. Da die Identifizierung eines RNA-Zielmolekülpaars auf der phänotypischen Analyse von lebenden Zellen beruht, eignet sich das Verfahren allerdings nicht zum schnellen Hochdurchsatz-Screening von großen Substanzbiliotheken in vitro.WO 9818947A1 describes a method for the characterization and selection of RNA target molecules are described that are of substances of therapeutic interest tie. The described method is also suitable for the identification of new ones Active substances with possible pharmacological activity. For this purpose RNA libraries expressed in living cells and with a substance to be tested brought into contact. Because the identification of an RNA target molecule pair on the based on phenotypic analysis of living cells, the method is suitable but not for the rapid high-throughput screening of large ones Substance libraries in vitro.

In PCT/GB 99/01761 wird ein Fluoreszenz-basierendes Verfahren zur Identifizierung von RNA-bindenden Substanzen in vitro beschrieben. In diesem Verfahren ist es notwendig, die zu untersuchende RNA-Zielstruktur sowie einen bereits bekannten RNA-Liganden dieser Zielstruktur jeweils mit einer fluorophoren Farbstoffgruppe zu markieren. Sind RNA und Ligand räumlich voneinander getrennt, so kann die Fluoreszenz der fluorophoren Gruppen gemessen werden. Bei Ausbildung eines 1 : 1- Komplexes von RNA und Ligand kommt es hingegen zur Löschung der Fluoreszenz. Die Identifizierung einer neuen RNA-bindenden Substanz beruht darauf, daß die Fluoreszenz-Löschung in Gegenwart eines um die RNA-Bindung konkurrierenden Kompetitors aufgehoben und ein meßbares Signal detektiert wird. Obwohl sich das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Substanzbibliotheken eignet, ist es nicht generell anwendbar, da es in jedem Fall die Kenntnis eines bereits zuvor identifizierten RNA-Liganden voraus setzt.PCT / GB 99/01761 describes a fluorescence-based method for identification of RNA-binding substances described in vitro. In this process it is necessary, the RNA target structure to be examined and an already known RNA ligands to this target structure each with a fluorophore dye group to mark. If the RNA and ligand are spatially separated from one another, then the Fluorescence of the fluorophoric groups can be measured. When training a 1: 1- In contrast, complexes of RNA and ligand lead to quenching of the fluorescence. The identification of a new RNA-binding substance is based on the fact that the Fluorescence quenching in the presence of a competitor for RNA binding Competitor canceled and a measurable signal is detected. Although that It is suitable for high-throughput screening of substance libraries not generally applicable as it is in any case knowledge of one previously identified RNA ligands.

K. Hamasaki und R. Rando beschreiben einen Fluoreszenz-basierenden Assay, mit dessen Hilfe spezifische Interaktionen von RNA-bindenden Substanzen mit bestimmten RNA-Strukturmotiven untersucht werden können [Anal. Biochem. 261 (1998), 183-190]. Die prinzipielle Anwendbarkeit wurde an Hand von Bindungsstudien mit Pyren-markierten Aminoglycosiden und 16S ribosomaler RNA gezeigt. Für das Hochdurchsatz-Screening von großen Substanzbibliotheken ist das Verfahren jedoch ungeeignet, da jede einzelne der zu testenden Substanzen mit einer fluoreszenzaktiven Markierung versehen werden müsste.K. Hamasaki and R. Rando describe a fluorescence-based assay with whose help with specific interactions of RNA binding substances certain RNA structural motifs can be investigated [Anal. Biochem. 261 (1998), 183-190]. The basic applicability was based on Binding studies with pyrene-labeled aminoglycosides and 16S ribosomal RNA  shown. This is for high-throughput screening of large substance libraries The method is unsuitable, however, because each of the substances to be tested has would have to be provided with a fluorescence-active label.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das es ermöglicht, Wechselwirkungen zwischen RNA-Strukturen und RNA-bindenden Molekülen schnell, einfach und zuverlässig zu charakterisieren. Dabei soll das Verfahren nicht die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen vorstehend kurz diskutierten Verfahren aufweisen und die Konstruktion eines robusten, nicht-radioaktiven und automatisierbaren Assays zur Identifizierung von Substanzen mit möglicher pharmakologischer Wirksamkeit erlauben, die (a) direkt an RNA-Strukturen binden oder (b) die Wechselwirkung zwischen einer RNA-Struktur und einer assoziierten Verbindung unterbinden.The present invention is therefore based on the object of a method to provide interactions between RNA structures and Characterize RNA-binding molecules quickly, easily and reliably. The method should not have the disadvantages of those described in the prior art Have briefly discussed methods above and the construction of a robust, non-radioactive and automatable assays for the identification of Allow substances with possible pharmacological activity that (a) directly RNA structures bind or (b) the interaction between an RNA structure and prevent an associated connection.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung eines Verfahrens mit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Merkmalen. Wie in Beispiel 2 dargelegt, kann das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere dazu genutzt werden, um pharmazeutische Leitsubstanzen gegen RNA-bindende Peptide oder Proteine zu suchen.This problem is solved by providing a method with the features characterized in the claims. As set out in Example 2, the method according to the invention can be used in particular to: leading pharmaceutical substances against RNA-binding peptides or proteins search.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Substanzen mit spezifischen Bindungseigenschaften für kurze RNA-Strukturmotive oder RNA-bindende Moleküle unter Verwendung von Reporter-Ribozymen identifiziert und charakterisiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt dabei die Tatsache, daß (a) die Bindung eines Moleküls an ein bestimmtes RNA-Target-Motiv, oder (b) die Verdrängung eines Moleküls von einem bestimmten RNA-Target-Motiv direkt gemessen werden kann, da das RNA-Target-Motiv mit einer Reporter-Ribozym-Domäne strukturell verknüpft ist. Ein solches im Assay verwendetes RNA-Konstrukt wird im folgenden als Target- Reporter-Konstrukt (TRK) bezeichnet. Gemäß der gewählten Ausführungsform (a) oder (b), können zwei Fälle unterschieden werden:
Fall (a): Liegt das RNA-Target-Motiv ungebunden vor, kann ein Signal mit einer bestimmten Intensität detektiert werden. Infolge eines Bindungsereignisses (z. B. der Bindung einer niedermolekularen Substanz an das Target-Motiv) verändert sich das gemessene Signal. Infolge dessen ist es möglich, die Bindung der Substanz an die RNA zu detektieren und quantitativ zu erfassen.
Fall (b): Liegt das RNA-Target-Motiv gebunden vor (z. B. an ein RNA-bindendes Protein), ist ebenfalls ein Signal mit einer bestimmten Intensität detektierbar. Wird das RNA-bindende Molekül von der Bindungsstelle an der RNA verdrängt, so verändert sich das gemessene Signal und ermöglicht damit die Detektion des Verdrängungsereignisses. Auf diese Weise kann also eine Substanz mit den gewünschten Bindungseigenschaften für das ursprüngliche RNA-bindende Molekül identifiziert werden.With the method according to the invention, substances with specific binding properties for short RNA structural motifs or RNA-binding molecules can be identified and characterized using reporter ribozymes. The method according to the invention takes advantage of the fact that (a) the binding of a molecule to a specific RNA target motif, or (b) the displacement of a molecule from a specific RNA target motif can be measured directly, since the RNA Target motif is structurally linked to a reporter ribozyme domain. Such an RNA construct used in the assay is referred to below as the target reporter construct (TRK). According to the chosen embodiment (a) or (b), two cases can be distinguished:
Case (a): If the RNA target motif is unbound, a signal with a certain intensity can be detected. The measured signal changes as a result of a binding event (e.g. the binding of a low molecular weight substance to the target motif). As a result, it is possible to detect and quantify the binding of the substance to the RNA.
Case (b): If the RNA target motif is bound (e.g. to an RNA-binding protein), a signal with a certain intensity can also be detected. If the RNA-binding molecule is displaced from the binding site on the RNA, the measured signal changes and thus enables the displacement event to be detected. In this way, a substance with the desired binding properties for the original RNA-binding molecule can be identified.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an ein gewünschtes RNA-Target-Motiv spezifisch binden und dadurch dessen Funktion hemmen oder eliminieren können, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
The present invention thus relates to a method for identifying compounds which specifically bind to a desired RNA target motif and can thereby inhibit or eliminate its function, which is characterized by the following steps:

• a) Herstellung eines Konstrukts (Target-Reporter-Konstrukt; TRK) aus einer Reporter-Ribozym-Domäne (I) und dem RNA-Target-Motiv (II), wobei (I) und (II) durch einen RNA-Linker miteinander verbunden sind und wobei die Reporter-Ribozym-Domäne (I) nach spezifischer Bindung einer Verbindung an das RNA-Target-Motiv (II) ihre katalytische Aktivität ändert;a) Production of a construct (target reporter construct; TRK) from one Reporter ribozyme domain (I) and the RNA target motif (II), where (I) and (II) are connected to one another by an RNA linker and the Reporter ribozyme domain (I) after specific binding of a compound changes its catalytic activity to the RNA target motif (II);
• b) Herstellung eines signalgebenden Ribozym-Substrats, das an die Reporter- Ribozym-Domäne (I) spezifisch binden und, vorzugsweise, von dieser gespalten werden kann;b) Preparation of a signaling ribozyme substrate that is attached to the reporter Specifically bind and, preferably, ribozyme domain (I) can be split;
• c) Inkontaktbringen des TRK aus Schritt (a) und des Ribozym-Substrats aus Schritt (b) mit der zu, beispielsweise mit einem Kanditaten aus einer Substanzbibliothek identifizierenden Verbindung oder eines diese Verbindung enthaltenden Gemischs; undc) contacting the TRK from step (a) and the ribozyme substrate Step (b) with the, for example with a candidate from a Compound library identifying compound or one of these Compound containing mixture; and
• d) Bestimmung der Bindung der Verbindung an das RNA-Target-Motiv, vorzugsweise anhand der Spaltung des Ribozym-Substrats.d) determining the binding of the compound to the RNA target motif, preferably based on the cleavage of the ribozyme substrate.

Andererseits betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die eine mit einem gewünschten RNA-Target-Motiv assoziierte Verbindung (z. B. eine in der Zelle natürlicherweise mit dieser RNA assoziierte Verbindung) verdrängen und dadurch deren oder dessen Funktion hemmen oder eliminieren können. Dieses Verfahren ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:
On the other hand, the present invention also relates to a method for identifying compounds which displace a compound associated with a desired RNA target motif (for example a compound naturally associated with this RNA in the cell) and thereby inhibit its or its function can eliminate. This process is characterized by the following steps:

• a) Herstellung eines Konstrukts (Target-Reporter-Konstrukt; TRK) aus einer Reporter-Ribozym-Domäne (I) und dem RNA-Target-Motiv (II), wobei (I) und (II) durch einen RNA-Linker miteinander verbunden sind und wobei die Reporter-Ribozym-Domäne (I) nach Verdrängung der mit dem gewünschten RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung von dem RNA-Target-Motiv (II) ihre biologische Aktivität ändert;a) Production of a construct (target reporter construct; TRK) from one Reporter ribozyme domain (I) and the RNA target motif (II), where (I) and (II) are connected to one another by an RNA linker and the Reporter ribozyme domain (I) after displacement of the desired one RNA target motif-associated compound of the RNA target motif (II) their biological activity changes;
• b) Herstellung eines signalgebenden Ribozym-Substrats, das an die Reporter- Ribozym-Domäne (I) spezifisch binden und, vorzugsweise, von dieser gespalten werden kann;b) Preparation of a signaling ribozyme substrate that is attached to the reporter Specifically bind and, preferably, ribozyme domain (I) can be split;
• c) Inkontaktbringen des TRK aus Schritt (a) mit der mit dem RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung;c) contacting the TRK from step (a) with that with the RNA target motif associated connection;
• d) Inkontaktbringen des Komplexes aus Schritt (c) und des Ribozym-Substrats aus Schritt (b) mit der zu identifizierenden Verbindung oder eines diese Verbindung enthaltenden Gemischs, beispielsweise mit einem Kandidaten aus einer Substanzbibliothek; undd) contacting the complex from step (c) and the ribozyme substrate from step (b) with the compound to be identified or one of these Compound containing mixture, for example with a candidate from a substance library; and
• e) Bestimmung der Verdrängung der mit dem RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung, vorzugsweise anhand der Spaltung des Ribozym-Substrats.e) Determination of the displacement of those associated with the RNA target motif Compound, preferably based on the cleavage of the ribozyme substrate.

Der hier verwendete Ausdruck "Reporter-Ribozym-Domäne" bezieht sich auf ein Ribozym, das so modifiziert ist, dass es beispielsweise, eine geeignete Substrat-RNA spezifisch spalten kann, was ein messbares Signal ergibt. Ribozyme, z. B. Hammerhead-Ribozyme (HHR) sind katalytische RNA-Moleküle mit der Fähigkeit, andere RNA-Moleküle an Phosphordiesterbindungen sequenzspezifisch zu spalten. Die Hammerhead-Ribozym-Struktur umfaßt drei doppelsträngige Bereiche (Helices I, II, und III), welche die spaltbare Phosphordiesterbindung flankieren, sowie zwei hochkonservierte einzelsträngige Sequenzen [O. Uhlenbeck, Nature 328 (1987) 596-­ 600]. Für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen sich prinzipiell alle Ribozyme, die Phosphodiester-Bindungen in trans, d. h. intermolekular spalten können. Abgesehen von Ribonuclease P [C. Guerrier-Takada et al., Cell 44 (1983), 849-857] sind die bekannten natürlicherweise vorkommenden Ribozyme (Hammerhead-Ribozym, Hairpin-Ribozym, Hepatitis Delta Virus Ribozym, Neurospora mitochondriales VS Ribozym, Gruppe I und Gruppe II Introns) allerdings sich selbst spaltende bzw. selbst spleißende Katalysatoren, die in cis (intramolekular) wirken [Übersichtsartikel in P. Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 1-9]. Durch Separieren der katalytischen Einheit von der die Spaltstelle enthaltenden Sequenz, gelang es in allen Fällen, in trans spaltende Ribozym-Varianten herzustellen: Hammerhead- Ribozym [J. Haselhoff und W. Gerlach. Nature 334 (1988), 585-591]; Hairpin- Ribozym [A. Hampel und R. Tritz, Biochemistry 28 (1989), 4929-4933]; Hepatitis Delta Ribozym [M. Been, Trends Biochem. Sci. 19 (1994) 251-256]; Neurospora mitochondriales VS Ribozym [H. Guo et al., J. Mol. Biol. 232 (1993) 351-361]; Gruppe I Intron aus Tetrahymena [Zaug et al., Nature 324 (1986), 429-433]; Gruppe II Intron [S. Augustin et al., Nature 34 (1990) 383-386]. Durch Trennung der katalytischen Kernsequenz von einer die Spaltstelle enthaltenden Substrat-Sequenz können somit Ribozym-Varianten erhalten werden (entsprechend dem Begriff "Reporter-Ribozym-Domäne"), die unter physiologischen Bedingungen nahezu jede Ziel-RNA intermolekular spalten können [J. Haselhoff, W. Gerlach, Nature 334 (1988) 585-591]. Die Hydrolyse der zu spaltenden Zielsequenz wird dabei stets eingeleitet durch Ausbildung eines katalytisch aktiven Komplexes, bestehend aus Ribozym und Substrat-RNA. Nach erfolgter Spaltung dissoziiert das hydrolysierte Substrat- Oligonucleotid vom Ribozym ab, wobei letzteres dann für weitere Umsetzungen verfügbar ist. Trans-spaltende Ribozyme können auf Grundlage der Ribozym- Sequenz entwickelt werden. Das Ribozym wird dazu in zwei Bereiche unterteilt, wovon der eine die Spaltstelle (Substrat) und der andere die katalytische Domäne (in trans Ribozym) enthält. Durch experimentelle Testung, d. h. Messung der Spaltungsaktivität von verschiedenen Ribozym-Substrat-Konstrukten, können besonders aktive in trans Ribozyme ermittelt werden. Die synthetische und enzymatische Herstellung von Ribozymen sowie die Herstellung sind dem Fachmann bekannt [Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997) 51-111]. In jüngster Zeit gelang es, Hammerhead-Ribozyme hinsichtlich der kinetischen Eigenschaften (hohe Umsatzraten), der Sequenzlänge (Minimalmotive) sowie Substrat-Spezifitäten zu optimieren. Übersichtsartikel zu diesem Thema sind z. B. Birikh, Eur. J. Biochem. 245 (1997), 1-16; Burke, Nature Biotech. 15 (1997), 414-415 und Eckstein, Lilley (Hrsg.), Nucleic Acids and Molecular Biology 10, Springer Verlag (1996), 173-329.The term "reporter ribozyme domain" as used herein refers to Ribozyme that is modified to be, for example, a suitable substrate RNA can specifically split what gives a measurable signal. Ribozymes, e.g. B. Hammerhead ribozymes (HHR) are catalytic RNA molecules with the ability to cleave other RNA molecules on phosphorus diester bonds in a sequence-specific manner. The hammerhead ribozyme structure comprises three double-stranded regions (helices I, II, and III), which flank the cleavable phosphorus diester bond, and two highly conserved single-stranded sequences [O. Uhlenbeck, Nature 328 (1987) 596- 600]. In principle, all ribozymes which are suitable for the purposes of the invention are: Phosphodiester bonds in trans, i.e. H. can split intermolecularly. apart  from Ribonuclease P [C. Guerrier-Takada et al., Cell 44 (1983), 849-857] are these known naturally occurring ribozymes (hammerhead ribozyme, Hairpin ribozyme, hepatitis delta virus ribozyme, neurospora mitochondrial VS Ribozyme, Group I and Group II introns), however, self-splitting or self splicing catalysts that act in cis (intramolecular) [review article in P. Turner (ed.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 1-9]. By separating the catalytic unit from the sequence containing the cleavage site succeeded in all cases to produce trans-cleaving ribozyme variants: Hammerhead Ribozyme [J. Haselhoff and W. Gerlach. Nature 334: 585-591 (1988)]; hairpin Ribozyme [A. Hampel and R. Tritz, 1989 Biochemistry 28: 4929-4933]; hepatitis Delta Ribozyme [M. Been, Trends Biochem. Sci. 19 (1994) 251-256]; Neurospora mitochondrial VS ribozyme [H. Guo et al., J. Mol. Biol. 232 (1993) 351-361]; Group I intron from Tetrahymena [Zaug et al., Nature 324 (1986), 429-433]; group II Intron [p. Augustin et al., Nature 34 (1990) 383-386]. By separating the catalytic core sequence from a substrate sequence containing the cleavage site can thus be obtained ribozyme variants (according to the term "Reporter Ribozyme Domain"), which under physiological conditions almost any Intermolecularly cleave target RNA [J. Haselhoff, W. Gerlach, Nature 334 (1988) 585-591]. The hydrolysis of the target sequence to be cleaved is always initiated by forming a catalytically active complex consisting of ribozyme and Substrate RNA. After cleavage, the hydrolyzed substrate dissociates Oligonucleotide from the ribozyme, the latter then for further reactions is available. Trans-cleaving ribozymes can be based on the ribozyme Sequence to be developed. The ribozyme is divided into two areas, of which one is the cleavage site (substrate) and the other is the catalytic domain (in trans ribozyme) contains. Through experimental testing, i.e. H. measurement of Cleavage activity of various ribozyme-substrate constructs can particularly active in trans ribozymes can be determined. The synthetic and enzymatic production of ribozymes and the production are known to the person skilled in the art known [Turner (ed.), Ribozyme protocols, Humana press (1997) 51-111]. In Most recently, Hammerhead ribozymes have succeeded in terms of kinetic Properties (high turnover rates), the sequence length (minimal motifs) as well Optimize substrate specificities. Review articles on this topic are e.g. B.  Birikh, Eur. J. Biochem. 245: 1-16; Burke, Nature Biotech. 15: 414-415 (1997) and Eckstein, Lilley (ed.), Nucleic Acids and Molecular Biology 10, Springer Verlag (1996), 173-329.

Durch die katalytische Aktivität des Ribozym-Teils wird also ein meßbares Signal erhalten, welches die Bindung eines Moleküls an die RNA-Target-Domäne oder dessen Ablösung anzeigt, wobei der Begriff "Ribozym" dabei sowohl natürliche und modifizierte Ribozyme als auch DNA-Enzyme, sogenannte Desoxyribozyme (R. Breaker, Chem. Rev. 97 (1997), 371-390; A. Jenne & M. Famulok, Top. Curr. Chem. 202 (1999), 102-131] umfaßt. Alternativ zu Nukleinsäure-spaltenden Ribozymen können in der vorliegenden Erfindung aber auch andere geeignete Ribozyme zur Signalgebung, beispielsweise Ribozyme mit RNA-Ligase-Aktivität verwendet werden. Im Falle eines Ligase-Ribozyms kann das Bindungsereignis durch PCR detektiert werden [M. P. Robertson & A. D. Ellington, Nat. Biotechnol. 17 (1999), 62-66]. Bevorzugt kann die Detektion in diesem Fall auch durch Fluoreszenzmessung unter Verwendung sogenannter "Taq-man"-Sonden erfolgen (K. J. Livak et al., PCR Methods Appl. 4 (1995), 357-362].The catalytic activity of the ribozyme part thus turns into a measurable signal obtained which the binding of a molecule to the RNA target domain or its replacement indicates, the term "ribozyme" both natural and modified ribozymes as well as DNA enzymes, so-called deoxyribozymes (R. Breaker, Chem. Rev. 97 (1997) 371-390; A. Jenne & M. Famulok, Top. Curr. Chem. 202 (1999), 102-131]. As an alternative to nucleic acid cleaving ribozymes However, other suitable ribozymes can also be used in the present invention Signaling, for example ribozymes with RNA ligase activity can be used. In the case of a ligase ribozyme, the binding event can be detected by PCR become [M. P. Robertson & A.D. Ellington, Nat. Biotechnol. 17: 62-66 (1999)]. In this case, the detection can preferably also be carried out by fluorescence measurement So-called "Taq-man" probes are used (K. J. Livak et al., PCR Methods Appl. 4: 357-362 (1995)].

Der hier verwendete Ausdruck "RNA-Target-Motiv" betrifft RNA-Moleküle bzw. Teile davon, die auf Grund ihrer Sequenz oder Struktur eine bestimmte Funktion innerhalb der Zelle erfüllen. Die Motive können dabei sowohl natürlicherweise in der Zelle vorkommen oder synthetischer Natur sein (z. B. intrazellulär exprimierte RNA- Aptamere, sog. "Intramere" siehe nachstehend; M. Blind, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 3603-3610).The term “RNA target motif” used here relates to RNA molecules or parts of which, due to their sequence or structure, perform a specific function within of the cell. The motifs can both be natural in the cell occur or be of a synthetic nature (e.g. intracellularly expressed RNA Aptamers, so-called "intramers" see below; M. Blind, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3603-3610 (1999)).

Im einfachsten Fall ist das RNA-Target-Motiv mit dem Reporter-Ribozym identisch, d. h. ist das Ribozym selbst das Target. Beispiele für therapeutisch relevante Ribozym-gesteuerte Prozesse sind das Selbstspleißen in pathogenen Mikroorganismen, das Misspleißen in menschlichen Zellen (z. B. Sichelzellanämie), die tRNA-Prozessierung durch RNaseP, oder die RNA-Prozessierung des Hepatitis Delta Virus Genoms [P. C. Turner (Hrsg.), Methods in Molecular Biology: Ribozyme Protocols, Vol. 74 (1997), Humana Press, Totowa, NJ, USA]. In the simplest case, the RNA target motif is identical to the reporter ribozyme, d. H. the ribozyme itself is the target. Examples of therapeutically relevant Ribozyme-controlled processes are self-splicing in pathogenic ones Microorganisms, splicing in human cells (e.g. sickle cell anemia), the tRNA processing by RNaseP, or the RNA processing of hepatitis Delta Virus Genome [P. C. Turner (ed.), Methods in Molecular Biology: Ribozyme Protocols, Vol. 74 (1997), Humana Press, Totowa, NJ, USA].  

Eine wichtige Klasse von RNA-Target-Motiven bilden strukturell einzigartige und hoch konservierte RNA-Strukturelemente, denen eine wichtige biologische Funktion zugeordnet werden kann [A. S. Brodsky & J. R. Williamson, J. Mol. Biol. 267 (1997), 624-639; M. Afshar et al., Curr. Opin. Biotech. 10 (1999), 59-63]. Bekannte Beispiele hierfür sind die Strukturelemente "TAR" und "RRE" in der mRNA des HI-Virus oder die IRES-Sequenz, die für die gezielte Translation von bestimmten Proteinen verantwortlich ist. In einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel von D. J. Ecker & R. H. Griffey [Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429] werden Bedeutung und Strategien zur Auswahl von geeigneten RNA-Strukturelementen ausführlich besprochen. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es jedoch unerheblich, auf welchem Wege das zu untersuchende Strukturelement gefunden wurde. Für eine möglichst eindeutige Signaldetektion sollte das gewählte RNA-Target-Motiv jedoch nicht zu lang sein und vorzugsweise eine Länge von 60 Nucleotiden, mehr bevorzugt eine Länge von 40 Nucleotiden nicht überschreiten.An important class of RNA target motifs form structurally unique and highly conserved RNA structural elements that have an important biological function can be assigned [A. S. Brodsky & J.R. Williamson, J. Mol. Biol. 267 (1997), 624-639; Afshar, M. et al., Curr. Opin. Biotech. 10: 59-63 (1999)]. Known examples for this are the structural elements "TAR" and "RRE" in the mRNA of the HI virus or the IRES sequence, which is used for the targeted translation of certain proteins responsible for. In a recent review by D. J. Ecker & R. H. Griffey [Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429] become meaning and strategies discussed in detail for the selection of suitable RNA structural elements. For the method according to the invention, however, is irrelevant in which way that structural element to be examined was found. For the clearest possible However, the selected RNA target motif should not be too long for signal detection preferably a length of 60 nucleotides, more preferably a length of 40 Do not exceed nucleotides.

Im Himblick auf die Identifizierung von Substanzen, die gegen RNA-bindende Proteine gerichtet sind, kommt RNA- oder DNA-Aptameren eine besondere Bedeutung zu. [A. D. Ellington & J. Szostak, Nature 346 (1990), 818-822; C. Tuerk & L. Gold, Science 249 (1990), 505-510]. Aptamere sind künstlich selektierte Nukleinsäuren mit spezifischen und teilweise hoch-affinen Bindungseigenschaften gegenüber einer Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen [M. Famulok & A. Jenne, Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998), 320-327; M. Famulok, Curr. Opin. Struc. Biol. 9 (1999), 324-329; S. E. Osborne & A. Ellington, Chem. Rev. 97 (1997), 349-370]. Wie in Beispiel 2 beschrieben, können mit Hilfe des beanspruchten Verfahrens Leitsubstanzen gegen Aptamer-bindende Moleküle identifiziert werden. In diesem Zusammenhang sind insbesondere solche Aptamere von Interesse, die gegen krankheitsrelevante (intrazelluläre) Proteine gerichtet sind (P. D. Good et al., Gene Ther. 4 (1997), 45-54; K. Konopka et al., Drug Target 5 (1998), 247-259; C. Tuerk & S. MacDougal-Waugh, Gene 137 (1993), 33-39; K. B. Jensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19 (1995),12220-12224; M. Blind, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 3603-3610). Looking at the identification of substances against RNA binding When proteins are targeted, RNA or DNA aptamers come in a special way Meaning too. [A. D. Ellington & J. Szostak, Nature 346: 818-822 (1990); C. Tuerk & L. Gold, Science 249: 505-510 (1990)]. Aptamers are artificially selected Nucleic acids with specific and sometimes high affinity binding properties against a multitude of different molecules [M. Famulok & A. Jenne, Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998), 320-327; M. Famulok, Curr. Opin. Struc. Biol. 9 (1999), 324-329; S. E. Osborne & A. Ellington, Chem. Rev. 97 (1997), 349-370]. How described in Example 2, using the claimed method Lead substances against aptamer-binding molecules can be identified. In this In particular, those aptamers that are against disease-related (intracellular) proteins are directed (P. D. Good et al., Gene Ther. 4: 45-54 (1997); K. Konopka et al., Drug Target 5 (1998), 247-259; C. Tuerk & S. MacDougal-Waugh, Gene 137 (1993), 33-39; K. B. Jensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19: 12220-12224 (1995); M. Blind, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 3603-3610).  

Aptamere und ihre intrazellulären Äquivalente, die Intramere, sind Target-spezifische makromolekulare Leitsubstanzen, die wichtige pharmakologische Eigenschaften des späteren therapeutisch aktiven Produktes aufweisen. Aptamere sind daher hervorragend zur Entwicklung von niedermolekularen Therapeutika geeignet, da die im Aptamer gespeicherte "therapeutische Information" durch das hier beanspruchte Verfahren nutzbar gemacht werden kann. Prinzipiell wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein messbares Signal dadurch erzeugt, daß das makromolekulare Aptamer durch eine andere Substanz von der Bindungsstelle auf dem Target-Protein verdrängt wird. Es kann daher mit hoher Wahrscheinlichkeit angenommen werden, daß die identifizierte Substanz, ähnliche Eigenschaften, wie das Aptamer aufweist (z. B. Inhibition der Funktion des Target-Proteins). Im Gegensatz zu vielen anderen konventionellen Screening-Assays, kann das native Target-Protein ohne möglicherweise störende Modifikationen, wie beispielsweise Farbstoff- oder Isotopenmarkierung, eingesetzt werden.Aptamers and their intracellular equivalents, the intramers, are target-specific macromolecular lead substances, the important pharmacological properties of exhibit later therapeutically active product. Aptamers are therefore excellent for the development of low molecular weight therapeutic agents, because the "therapeutic information" stored in the aptamer by what is claimed here Procedure can be used. In principle, in the invention Process produces a measurable signal in that the macromolecular Aptamer through another substance from the binding site on the target protein is ousted. It can therefore be assumed with a high degree of probability that that the identified substance has properties similar to those of the aptamer (e.g. inhibition of the function of the target protein). Unlike many others conventional screening assays that can target the native protein without potentially disturbing modifications such as dye or Isotope labeling can be used.

Der hier verwendete Ausdruck "Target-Reporter-Konstrukt" bezieht sich auf die Verknüpfung aus Reporter-Ribozym-Domäne und dem RNA-Target-Motiv über einen RNA-Linker (siehe nachstehende Definition), wobei die Verknüpfung so erfolgt, daß die Reporter-Ribozym-Domäne nach spezifischer Bindung eines spezifischen Liganden (die zu identifizierende Verbindung) an das RNA-Target-Motiv die Reporter-Ribozym-Domäne ihre biologisch aktive Konformation ändert, erhält oder verliert. Der Fachmann kann mittels inzwischen etablierten Techniken geeignete Target-Reporter-Konstrukte herstellen (Soukup und Breaker, Current Opinions in Structural Biology 10 (2000), 318-325). Die vorstehende Definition umfaßt auch TRK, bei denen die Reporter-Ribozym-Domäne und das RNA-Target-Motiv identisch sind, hierbei entfällt auch die Gegenwart eines RNA-Linkers.The term "target reporter construct" as used herein refers to Linking of reporter ribozyme domain and the RNA target motif via a RNA linker (see definition below), the linkage being such that the reporter ribozyme domain after specific binding of a specific Ligands (the compound to be identified) to the RNA target motif Reporter ribozyme domain changes, maintains or maintains its biologically active conformation loses. The person skilled in the art can use suitable techniques which have now been established Create target reporter constructs (Soukup and Breaker, Current Opinions in Structural Biology 10 (2000), 318-325). The above definition also includes TRK, where the reporter ribozyme domain and the RNA target motif are identical, the presence of an RNA linker is also eliminated.

In Zusammenhang mit dem Target-Repoter-Konstrukt (TRK) wird hier kurz auf Aptazyme (Aptamer-Ribozyme) eingegangen. In vielen zellulären Prozessen spielen RNA-Moleküle, deren Funktionen durch Bindung an Proteine regulierbar sind, eine wichtige Rolle [K. J. Addess et al., J. Mol. Biol. 274 (1997), 72-83; M. J. Gait & J. Kam, Trends Biochem. Sci. 18 (1993), 255-259]. Kürzlich konnte gezeigt werden, daß regulierbare RNAs - in diesem Fall allosterische Ribozyme - durch rationales Design oder durch in vitro-Selektion erhalten werden können. Man machte sich dabei die Tatsache zu nutze, daß dis räumliche Struktur eines Ribozyms durch strukturelle Veränderungen stabilisiert oder destabilisiert werden kann, und daß gravierende strukturelle Änderungen in den meisten Fällen Auswirkungen auf die katalytische Aktivität des Ribozyms haben.In connection with the target repoter construct (TRK) is briefly mentioned here Aptazyme (aptamer ribozymes) received. Play in many cellular processes RNA molecules whose functions can be regulated by binding to proteins, one important role [K. J. Addess et al., J. Mol. Biol. 274 (1997), 72-83; M. J. Gait & J. Kam, Trends biochem. Sci. 18: 255-259 (1993)]. It has recently been shown that controllable RNAs - in this case allosteric ribozymes - through rational design  or can be obtained by in vitro selection. You made it yourself To take advantage of the fact that the spatial structure of a ribozyme is replaced by structural Changes can be stabilized or destabilized, and that serious structural changes in most cases affect the catalytic Have activity of the ribozyme.

Darüber hinaus nutzte man die Tatsache, daß die strukturelle Veränderung in RNA- Molekülen an die Bindung eines Liganden gekoppelt werden kann. Breaker und Mitarbeitern gelang es, Hammerhead-Ribozyme durch evolutive Methoden oder aber durch rationales Design strukturell so zu verändern, daß deren katalytische Aktivität durch Bindung eines niedermolekularen Liganden allosterisch regulierbar ist [J. Tang & R. R. Breaker, Chem. Biol. 4 (1997), 453-459; J. Tang & R. R. Breaker, RNA 3 (1997), 914-925; J. Tang & R. R. Breaker, NAR 26 (1998), 4214-4221; G. A. Soukup & R. R. Breaker, PNAS 96 (1999), 3584-3589]. Von Ellington und Mitarbeitern wurde das Prinzip der allosterischen Regulation auf Ligase-Ribozyme angewandt [M. P. Robertson & A. D. Ellington, Nat. Biotechnol. 17 (1999), 62-66].The fact that the structural change in RNA Molecules can be coupled to the binding of a ligand. Breaker and Staff managed to use hammerhead ribozymes through evolutive methods or else to change structurally by rational design so that their catalytic activity can be allosterically regulated by binding a low molecular weight ligand [J. seaweed & R.R. Breaker, Chem. Biol. 4 (1997), 453-459; J. Tang & R. R. Breaker, RNA 3 (1997), 914-925; J. Tang & R.R. Breaker, NAR 26 (1998), 4214-4221; G. A. Soukup & R.R. Breaker, PNAS 96 (1999), 3584-3589]. From Ellington and co-workers the principle of allosteric regulation applied to ligase ribozymes [M. P. Robertson & A. D. Ellington, Nat. Biotechnol. 17: 62-66 (1999)].

In der Literatur hat sich mittlerweile der Begriff "Aptazyme" für diese allosterisch regulierbaren Ribozyme durchgesetzt. Ein Aptazym ist durch zwei voneinander unabhängige strukturelle Domänen charakterisiert, nämlich ein katalytisch aktives RNA-Motiv ("Ribozym") und ein Liganden-bindendes RNA-Motiv ("Aptamer"). Durch die Bindung eines Liganden an die Rezeptordomäne kommt es auf Grund von strukturellen Veränderungen zur Steigerung oder Reduktion der katalytischen Aktivität. Aptazyme eignen sich daher beispielsweise als molekulare Schalter zur Detektion von niedermolekularen Substanzen oder auch als steuerbare Einheiten zur konditionellen Kontrolle der Genexpression [siehe z. B. WO 94/13791 und PCT 98/08974].In the literature, the term "aptazyme" has become allosteric for this adjustable ribozymes enforced. An aptazyme is separated by two characterized independent structural domains, namely a catalytically active one RNA motif ("ribozyme") and a ligand-binding RNA motif ("aptamer"). By the binding of a ligand to the receptor domain is due to structural changes to increase or decrease the catalytic Activity. Aptazymes are therefore suitable, for example, as molecular switches Detection of low molecular weight substances or as controllable units for conditional control of gene expression [see e.g. B. WO 94/13791 and PCT 98/08974].

Bei dem erfindungsgemäßen Target-Reporter-Konstrukt muß das RNA-Target-Motiv in bestimmter Weise mit der Ribozym-Domäne verknüpft sein. Das Target-Ribozym- Konstrukt basiert auf dem vorstehend beschriebenen allgemeinen Prinzip allosterisch regulierbarer Ribozyme und muß prinzipiell die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften aufweisen. In the target reporter construct according to the invention, the RNA target motif be linked in a certain way to the ribozyme domain. The target ribozyme Construct is allosteric based on the general principle described above controllable ribozymes and must in principle be those described below Have properties.  

Der hier verwendete Ausdruck "RNA-Linker" betrifft eine RNA-Sequenz, die die Reporter-Ribozym-Domäne und das RNA-Target-Motiv so miteinander verbindet, daß die Signalgebung über konformelle Änderungen in der RNA-Struktur vermittelt wir. Diesem "RNA-Bindeglied" kommt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine besondere Bedeutung zu [G. A. Soukup & R. R. Breaker, Structure 7 (1999), 783-791; G. A. Soukup & R. R. Breaker, Trends Biotech. 17 (1999), 469-476]. Die Auswahl geeigneter Bindeglieder kann dabei entweder durch empirische Testung verschiedener bekannter Sequenzen oder durch in vitro-Selektion erfolgen [G. A. Soukup & R. R. Breaker, PNAS USA 96 (1999) 3584-3589].The term "RNA linker" used here refers to an RNA sequence that the Reporter ribozyme domain and the RNA target motif that the signaling conveys conformal changes in the RNA structure we. This "RNA link" comes in the process of the invention special meaning to [G. A. Soukup & R.R. Breaker, Structure 7 (1999), 783-791; G. A. Soukup & R. R. Breaker, Trends Biotech. 17: 469-476 (1999)]. The selection Suitable links can be found either through empirical testing various known sequences or by in vitro selection [G. A. Soukup & R.R. Breaker, PNAS USA 96 (1999) 3584-3589].

Der hier verwendete Ausdruck "signalgebendes Ribozym-Substrat" betrifft jedes RNA-Molekül, das an die Reporter-Ribozym-Domäne spezifisch binden kann, von dieser, wenn sie ihre biologisch aktive Konformation besitzt, gespalten werden kann und auch einen Nachweis der Spaltung erlaubt. Dies setzt auch voraus, daß das gespaltene Ribozym-Substrat von dem ungespaltenen Ribozym-Substrat unterscheidbar ist und ein unmittelbar meßbares Signal erzeugt wird.The term "signaling ribozyme substrate" used here refers to each RNA molecule that can specifically bind to the reporter ribozyme domain from this, if it has its biologically active conformation, can be split and also allows evidence of the split. This also presupposes that cleaved ribozyme substrate from the uncleaved ribozyme substrate is distinguishable and an immediately measurable signal is generated.

Beispielsweise trägt das Ribozym-Substrat an einem Ende eine Ankergruppe, die seine Immobilisierung an eine geeignete Matrix erlaubt und an seinem anderen Ende eine Reportergruppe, die zum. Nachweis des immobilisierten (ungespaltenen) Ribozym-Substrates dient. Bei inaktivem TRK (d. h. bei Fehlen eines passenden Liganden für das RNA-Target-Motiv) bleibt das Ribozym-Substrat intakt und kann nach seiner Immobilisierung auf der Matrix einfach nachgewiesen werden, da die Ankergruppe mit der Reportergruppe nach wie vor verbunden ist. Bei aktivem TRK hingegen (d. h. nach Anlagerung des zu identifizierenden Liganden an das RNA- Target-Motiv) ist das Reporter-spezifische Signal nicht nachweisbar, da die Reportergruppe von der Ankergruppe infolge der Spaltung des Substrates getrennt wurde. Alternativ zur Ankergruppe (z. B. Biotin) kann die Immobilisierung des Ribozym-Substrats auch über komplementäre Sequenzhybridisierung erfolgen, sofern Spaltstelle und Reportergruppe jenseits der Hybridisierungsstelle liegen. Einfach nachweisbare Reportergruppen, die leicht an Nucleinsäure-Enden zu koppeln sind, sind beispielsweise ³²P, Farbstoff-Moleküle und Moleküle, die mit markierten Antikörpern nachweisbar sind. Das gespaltene Ribozym-Substrat kann aber auch durch eine Reihe von weiteren Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen werden und dazu zählen z. B. auch Gelelektrophorese und PCR.For example, the ribozyme substrate carries at one end an anchor group which allows it to be immobilized on a suitable matrix and at its other end a reporter group which is used for. Detection of the immobilized (uncleaved) ribozyme substrate is used. In the case of inactive TRK (ie in the absence of a suitable ligand for the RNA target motif) the ribozyme substrate remains intact and can be easily detected after its immobilization on the matrix, since the anchor group is still connected to the reporter group. In contrast, when TRK is active (ie after the ligand to be identified has been attached to the RNA target motif), the reporter-specific signal cannot be detected, since the reporter group was separated from the anchor group as a result of the cleavage of the substrate. As an alternative to the anchor group (eg biotin), the ribozyme substrate can also be immobilized via complementary sequence hybridization, provided the cleavage site and reporter group are located beyond the hybridization site. Easily detectable reporter groups that are easy to couple to nucleic acid ends are, for example, ³² P, dye molecules and molecules that can be detected with labeled antibodies. The cleaved ribozyme substrate can also be detected by a number of other methods known to those skilled in the art, and include, for example: B. also gel electrophoresis and PCR.

Das signalgebende Ribozym-Substrat ist zu der(n) Sequenz(en) der Reporter- Ribozym-Domäne, die für die Substratbindung verantwortlich ist (sind), im wesentlichen komplementär, d. h. es weist eine Komplementarität auf, die eine Anlagerung an das Ribozym auf eine Art und Weise erlaubt, daß eine wirksame und spezifische Spaltung des Ribozym-Substrats gewährleistet ist. Vorzugsweise ist das Ribozym-Substrat zu den für die Substratbindung verantwortlichen Sequenzen der Reporter-Ribozym-Domäne vollständig komplementär. Die Länge des sich anlagernden Bereichs des Ribozym-Substrats beträgt vorzugsweise 8 bis 14 Nucleotide [P. Turner Hrsg., Ribozyme protocols, Humana press (1997), 151-159, 253-264]. Das Ribozym-Substrat kann an seinem 5'- und/oder 3'-Ende zusätzliche Sequenzen enthalten, die nicht an der Anlagerung an das Ribozym beteiligt sind.The signaling ribozyme substrate is related to the sequence (s) of the reporter Ribozyme domain, which is (are) responsible for substrate binding, im essentially complementary, d. H. it has complementarity, one Attachment to the ribozyme in a manner that allows an effective and specific cleavage of the ribozyme substrate is ensured. Preferably that is Ribozyme substrate to the sequences responsible for substrate binding Reporter ribozyme domain completely complementary. The length of yourself adjacent region of the ribozyme substrate is preferably 8 to 14 Nucleotides [P. Turner ed., Ribozyme protocols, Humana press (1997), 151-159, 253-264]. The ribozyme substrate may have additional 5 'and / or 3' ends Contain sequences that are not involved in the attachment to the ribozyme.

Bei den zu identifizierenden Verbindungen kann es sich prinzipiell um jede beliebige Verbindung handeln, wobei diese zu den unterschiedlichsten Verbindungstypen zählen können, und der Fachmann kennt auch eine Vielzahl von Quellen, die für das erfindungsgemäße Screening-Verfahren geeignete Verbindungen enthalten. Prinzipiell eignen sich z. B. alle denkbaren Substanz-Bibliotheken, inklusive Antisense-Nucleinsäuren; bevorzugt sind jedoch Bibliotheken mit niedermolekularen Molekülen, die bestimmte Voraussetzungen erfüllen, beispielsweise hinsichtlich ihrer geringen Toxizität [D. J. Ecker & R. H. Griffey, Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429].In principle, the connections to be identified can be any Trade connection, these for the most different connection types can count, and those skilled in the art also know a variety of sources for the screening methods according to the invention contain suitable compounds. In principle, z. B. including all conceivable substance libraries Antisense nucleic acids; however, libraries with low molecular weight are preferred Molecules that meet certain requirements, for example with regard to their low toxicity [D. J. Ecker & R.H. Griffey, Drug Disc. Today 4 (1999), 420-429].

Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Konstrukte (TRK, Ribozym- Substrat) werden vorzugsweise durch in vitro-Transkription der entsprechenden DNA-Sequenzen in größeren Mengen hergestellt. Dazu werden diese DNA- Sequenzen in einen Vektor insertiert, der die Vermehrung der insertierten DNA in einem geeigneten Wirt erlaubt, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, vorzugsweise des T7-Promotors. Geeignete Vektoren für die Vermehrung in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen sind dabei z. B. pBR322, pNEB193, pUC18, pUC19 (Biolabs, USA.) [J. Sampson und O. Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 1033-1037]. Anschließend werden die Plasmide isoliert, gereinigt und die in vitro-Transkription wird gemäß Standardverfahren durchgeführt. Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Konstrukte können aber auch durch automatisierte Festphasensynthese gemäß Standardverfahren hergestellt werden.The constructs required for the process according to the invention (TRK, ribozyme Substrate) are preferably obtained by in vitro transcription of the corresponding DNA sequences are produced in large quantities. For this, these DNA Sequences inserted into a vector, the reproduction of the inserted DNA in allowed to a suitable host, under the control of a suitable promoter, preferably the T7 promoter. Suitable vectors for propagation in prokaryotic or eukaryotic systems are e.g. B. pBR322, pNEB193, pUC18, pUC19 (Biolabs, USA.) [J. Sampson and O. Uhlenbeck, Proc.  Natl. Acad. Sci. USA 85: 1033-1037 (1988)]. Then the plasmids isolated, purified and in vitro transcription is performed according to standard procedures carried out. The constructs used for the method according to the invention but can also by automated solid phase synthesis Standard procedures are made.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt die Reporter-Ribozym-Domäne von einem Hammerhead-Ribozym. Bezüglich Hammerhead-Ribozymen und die Herstellung von intermolekular spaltenden Varianten wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen.In a preferred embodiment of the method according to the invention the reporter ribozyme domain from a hammerhead ribozyme. In terms of Hammerhead ribozymes and the production of intermolecularly cleaving Variants is referred to the above explanations.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorstehende Ribozym-Substrat doppelt markiert, wobei das gespaltene Substrat leicht vom intakten Substrat unterscheidbar ist. Zum Beispiel kann ein endständig biotinyliertes Ribozym-Substrat verwendet werden, das an seinem anderen Ende mit Fluorescein markiert ist. Nach erfolgter Reaktion wird anschließend mit einer Streptavidin-beschichteten Festphase (z. B. mit einer kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatte) inkubiert, um die Kopplung des biotinylierten Substrat-Endes an die Streptavidin-Matrix zu ermöglichen. Nach Waschen der Matrix wird diese vermessen. Bei Anwesenheit eines spezifisch an das RNA-Target-Motiv bindenden Liganden (Reporter-Ribozym-Domäne ist aktiviert) ist keine Fluorescein-spezifische Fluoreszenz bzw. nur eine schwache unspezifische Hintergrund-Fluoreszenz meßbar, da das Fluorescein-markierte Spaltstück nicht immobilisiert werden konnte. Erfolgte dagegen keine Aktivierung des Reporter- Ribozym-Konstrukts durch das Fehlen eines spezifisch an das RNA-Target-Motiv bindenden Liganden, kann der Anteil an ungespaltenem, immobilisiertem Ribozym- Substrat durch Messung der Fluorescein-spezifischen Fluoreszenz quantifiziert werden.In a preferred embodiment, the above ribozyme substrate is double marked, the cleaved substrate easily distinguishable from the intact substrate is. For example, a terminally biotinylated ribozyme substrate can be used labeled with fluorescein at its other end. After done The reaction is then carried out with a streptavidin-coated solid phase (e.g. with a commercially available microtiter plate) incubated to couple the to enable biotinylated substrate end to the streptavidin matrix. To Washing the matrix will measure it. In the presence of a specific to the RNA target motif binding ligand (reporter ribozyme domain is activated) no fluorescein-specific fluorescence or only a weak non-specific one Background fluorescence is measurable because the fluorescein-labeled slit is not could be immobilized. However, if the reporter was not activated Ribozyme construct due to the lack of a specific to the RNA target motif binding ligands, the proportion of uncleaved, immobilized ribozyme Substrate quantified by measuring fluorescein-specific fluorescence become.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das doppelt markierte Ribozym-Substrat eine fluorophore Gruppe und eine fluoreszenzlöschende Gruppe, wobei nach Spaltung durch die Reporter- Ribozym-Domäne die Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors durch die fluoreszenzlöschende Gruppe unterbunden ist. Solchermaßen markierte Ribozym- Substrate können z. B. in dem FRET-Verfahren [FRET = Fluoreszenzresonanz- Energietransfer (J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescent Spectroscopy; Plenum Press, New York (1983)] verwendet werden. FRET-Oligonucleotide sind z. B. in K. J. Livak, S. J. A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, PCR Meth. Appln. 4 (1995), 357-362 beschrieben.In a particularly preferred embodiment of the invention The double-labeled ribozyme substrate contains a fluorophore group and a fluorescence quenching group, which after cleavage by the reporter Ribozyme domain quenching the fluorescence of the fluorophore through the fluorescence quenching group is prevented. Ribozyme labeled in this way  Substrates can e.g. B. in the FRET method [FRET = fluorescence resonance Energy transfer (J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescent Spectroscopy; Plenum Press, New York (1983)] can be used. FRET oligonucleotides are e.g. B. in K. J. Livak, S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, PCR Meth. Appln. 4 (1995), 357-362.

Als FRET-Ribozym-Substrat besonders bevorzugt sind RNA-Oligonucleotide oder DNA-RNA-Hybride in denen eine fluorophore Gruppe (z. B. FAM = 6-Carboxy- Fluorescein, TET = Tetrachloro-6-Carboxy-Fluorescein oder HEX = Hexachloro-6- Carboxy-Fluorescein) und eine entsprechende fluoreszenzlöschende Gruppe, ein sog. "Quencher" (z. B. Sulforhodamin 101 oder TAMRA = 6-Carboxy-Tetramethyl- Rhodamin), in räumlicher Nähe so angebracht sind, daß es zur effektiven Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors kommt [Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York (1983), 303-339; V. Förster, Annals of Physics (Leipzig) 2 (1948), 55-75]. Nach Spaltung des Ribozym-Substrates durch Ribozym-katalysierte Hydrolyse einer bestimmten Phosphodiester-Bindung können sich die Spaltstücke in Lösung voneinander entfernen: Die Fluoreszenz des Fluorophors wird nun nicht mehr intramolekular gelöscht. Lagert sich also ein geeigneter Ligand an das RNA-Target-Motiv an, was zu einer biologisch aktiven Reporter-Ribozym-Domäne führt, so kann dies dadurch bestimmt werden, daß mit Spaltung des Substrates ein messbares Fluoreszenz-Signal erzeugt wird. Das auf der FRET-Technologie basierende erfindungsgemäße Verfahren ist für das industrielle Hochdurchsatz-Screening von Substanzbibliotheken besonders geeignet, da es einfach durchführbar und leicht auf verschiedene Microtiterplatten-Formate adaptierbar ist [X. Chen et al., Genome Res. 8 (1998), 549-556; K. P. Bjornson et al., Biochemistry 33 (1994), 14306-14316; A. R. Gelsthorpe et al., Tissue Antigens 54 (1999), 603-614; J. E. Gonzalez et al., Drug Discov. Today 4 (1999), 431-439]. Insbesondere werden radioaktive Abfälle vermieden, die ansonsten kostenintensiv entsorgt werden müßten. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat darüber hinaus den Vorteil, die Bindung eines Liganden sehr sensitiv zu erfassen, da die katalytische Spaltung des FRET-Substrats zu einer deutlichen Signalverstärkung führt [bezüglich der Bestimmung der Spaltungsaktivität von Hammerhead-Ribozymen in sehr kurzer Zeit durch Fluoreszenzmessung im Microtiterplatten-Format siehe auch Jenne et al., Angew. Chem. 111 (1999), 1383- 1386.]. Vorzugsweise ist die auf der FRET-Technologie basierende Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens so konzipiert, daß anfänglich, also vor dem zu messenden Bindungs- bzw. Verdrängungsereignis, kein oder nur ein sehr kleines Signal gemessen wird und erst infolge der Bindung bzw. Verdrängung eine deutliche Veränderung des Fluoreszenzsignals eintritt. Dies kann vor allem durch die Wahl eines geeigneten RNA-Linkers, der die RNA-Target-Sequenz mit der Ribozym- Domäne verbindet, erreicht werden (siehe oben). Methoden zur Markierung von Ribonucleinsäuren mit fluorophoren bzw. fluoreszenzlöschenden Gruppen sowie Techniken zur Messung des Energietransfers (Quenching) wurden bereits detailliert beschrieben [Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 241-251]. 5'-Fluorophor- und 3'-Quencher-markierte RNA-Oligonucleotide sind kommerziell erhältlich (z. B. 5'-FAM- und 3'-TAMRA-markierte RNA bei Eurogentec, Belgien). Die Markierung erfolgt günstigerweise an den RNA-Enden, um die Hybridisierung an die Reporter-Ribozym-Domäne nicht zu beeinflussen.RNA oligonucleotides or are particularly preferred as FRET ribozyme substrate DNA-RNA hybrids in which a fluorophoric group (e.g. FAM = 6-carboxy- Fluorescein, TET = tetrachloro-6-carboxy-fluorescein or HEX = hexachloro-6- Carboxy-fluorescein) and a corresponding fluorescence quenching group so-called "quenchers" (e.g. sulforhodamine 101 or TAMRA = 6-carboxy-tetramethyl Rhodamine), are placed in close proximity so that it is effective for extinguishing the fluorescence of the fluorophore comes [Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York (1983), 303-339; V. Förster, Annals of Physics (Leipzig) 2 (1948), 55-75]. After cleavage of the ribozyme substrate Ribozyme-catalyzed hydrolysis of a particular phosphodiester bond can the slit pieces move away from each other in solution: the fluorescence of the Fluorophors is no longer deleted intramolecularly. So put it away suitable ligand to the RNA target motif, resulting in a biologically active Reporter ribozyme domain leads, this can be determined by using Cleavage of the substrate generates a measurable fluorescence signal. That on the method according to the invention which is based on FRET technology is for the industrial high-throughput screening of substance libraries particularly suitable, as it is easy to carry out and easy on different microtiter plate formats is adaptable [X. Chen et al., 1998 Genome Res. 8: 549-556; K.P. Bjornson et al., Biochemistry 33: 14306-14316 (1994); A.R. Gelsthorpe et al., Tissue Antigens 54 (1999), 603-614; J.E. Gonzalez et al., Drug Discov. Today 4 (1999), 431-439]. In particular, radioactive waste is avoided, which is otherwise costly should be disposed of. This embodiment of the invention The method also has the advantage that the binding of a ligand is very sensitive to be recorded since the catalytic cleavage of the FRET substrate leads to a clear Signal amplification leads [to the determination of the cleavage activity of Hammerhead ribozymes in a very short time by fluorescence measurement in the  Microtiter plate format see also Jenne et al., Angew. Chem. 111 (1999), 1383- 1386.]. The embodiment based on FRET technology is preferred of the inventive method designed so that initially, before measuring binding or displacement event, no or only a very small one Signal is measured and only as a result of the binding or displacement a clear one Change in the fluorescence signal occurs. This can be done primarily through choice of a suitable RNA linker that binds the RNA target sequence with the ribozyme Domain connects, can be achieved (see above). Methods for marking Ribonucleic acids with fluorophoric or fluorescence quenching groups as well Techniques for measuring energy transfer (quenching) have already been detailed described [Turner (ed.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 241-251]. 5'-fluorophore and 3'-quencher labeled RNA oligonucleotides are commercial available (e.g. 5'-FAM and 3'-TAMRA-labeled RNA from Eurogentec, Belgium). The Labeling is conveniently done at the RNA ends to hybridize to the Reporter ribozyme domain not to be affected.

Um die mit unerwünschter Spaltung (z. B. durch Nucleasen im Transkriptionssystem) einhergehende Fluoreszenz-Emission zu vermeiden, ist insbesondere der Einsatz Nuclease-resistenter Ribozym-Substrate von Vorteil (Eaton und Pieken, Annu. Rev. Biochem. 64 (1995), 837-863 und Shimayama et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2605-2611). Dies ist vor allem im Hinblick auf in vivo-Anwendungen von Vorteil, bei denen das doppelt markierte Substrat durch geeignete Techniken (z. B. Mikroinjektion, Liposomentransport, etc.) exogen in Zellen eingeschleust wird (P. Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 417-451). Somit handelt es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei den doppelt markierten Substraten um modifizierte RNA-Oligonucleotide. Solange die Spaltstelle im Substrat NUH↓, (nach IUB Code.: N = jede Base, H = A, U oder C) lautet, kann das Substrat Desoxyribonucleotide oder/und modifizierte Basen oder/und 2'-modifizierte Riboseeinheiten enthalten. Dadurch wird die Stabilität des Substrates im Zellextrakt erhöht (N. Taylor et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 4559-4565). Auch kann die Verwendung von intern-markierten, statt end-markierten Oligonucleotid-Substraten zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis beitragen, da die Fluoreszenzlöschung u. a. mit kürzeren Abständen zwischen den beiden Gruppen (Fluorophor und Quencher) verstärkt wird.To avoid unwanted cleavage (e.g. by nucleases in the transcription system) The use in particular is to avoid accompanying fluorescence emission Nuclease-resistant ribozyme substrates are an advantage (Eaton and Pieken, Annu. Rev. Biochem. 64 (1995), 837-863 and Shimayama et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2605-2611). This is particularly advantageous with regard to in vivo applications to whom the double-labeled substrate can be obtained using suitable techniques (e.g. Microinjection, liposome transport, etc.) is introduced exogenously into cells (P. Turner (ed.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 417-451). Thus acts it is in a particularly preferred embodiment in the double marked Modified RNA oligonucleotide substrates. As long as the gap in the substrate NUH ↓, (according to IUB code: N = each base, H = A, U or C), the substrate can Deoxyribonucleotides or / and modified bases or / and 2'-modified Ribose units included. This ensures the stability of the substrate in the cell extract (N. Taylor et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 4559-4565). It can also Use of internally-labeled, instead of end-labeled oligonucleotide substrates contribute to an improved signal-to-noise ratio since the  Fluorescence quenching a. with shorter distances between the two groups (Fluorophore and quencher) is amplified.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindung enthält. Dazu zählt auch eine davon abgeleitete Verbindung, die ebenfalls an das RNA-Target-Motiv binden kann, wobei diese Verbindung z. B. nur den Anteil oder die Teilsequenz der ursprünglich identifizierten Verbindung enthält oder einen davon abweichenden Anteil oder abweichende Teilsequenz, deren Affinität zu dem RNA-Target-Motiv gegenüber der ursprünglichen Verbindung verändert, vorzugsweise erhöht ist. Vorzugsweise ist das Arzneimittel mit einem geeigneten Träger kombiniert. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung.The present invention also relates to a medicament, which according to the Contains identified compound of the invention. This also includes one derived compound, which can also bind to the RNA target motif, this connection z. B. only the part or the partial sequence of the original contains identified compound or a different portion or different partial sequence, the affinity for the RNA target motif against the original connection changed, preferably increased. Preferably that is Medicines combined with a suitable carrier. Suitable carriers and the Formulations of such drugs are known to the person skilled in the art. To suitable Carriers include, for example, phosphate-buffered saline, water, Emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions etc. The drugs can be administered orally or parenterally. To the Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration.

Schließlich betrifft die vorligende Erfindung einen Kit (bzw. Assay) zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei der Kit folgende vorstehend beschriebenen Verbindungen umfaßt: (a) ein Target-Reporter-Konstrukt (TRK) und (b) ein signalgebendes Ribozym-Substrat.Finally, the present invention relates to a kit (or assay) for implementation of the method according to the invention, the kit following the above Compounds described include: (a) a target reporter construct (TRK) and (b) a signaling ribozyme substrate.

Fig. 1: Sekundärstrukturen von Konstrukt TRK1 und Substrat SK1. Fig. 1: Secondary structures of construct TRK1 and substrate SK1.

Fig. 2: Prinzip der Fluoreszenzmessung: Als Substrat für das Reporter-Ribozym TRK-1 wurde ein sogenanntes FRET-Oligonucleotid (SK1) gewählt. In diesem speziellen Substrat befindet sich eine fluorophore Gruppe (FAM = 6-Carboxy- Fluorescein) in räumlicher Nähe zu einem fluoreszenzlöschenden Quenchermolekül (TAMRA = 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin), so daß es zur effektiven Löschung der Fluoreszenzemission der fluorophoren Gruppe kommt. Die Bindung des doppelt markierten FRET-Substrates führt zur Ausbildung des katalytischen Komplexes. Fig. 2: Principle of fluorescence measurement: A so-called FRET oligonucleotide (SK1) was chosen as the substrate for the reporter ribozyme TRK-1. In this special substrate there is a fluorophoric group (FAM = 6-carboxy-fluorescein) in close proximity to a fluorescence quenching molecule (TAMRA = 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), so that the fluorescence emission of the fluorophoric group is effectively quenched. The binding of the double-labeled FRET substrate leads to the formation of the catalytic complex.

Nach Hydrolyse des FRET-Substrates durch das Ribozym können sich die Spaltstücke in Lösung voneinander entfernen. Die Fluoreszenz des Fluorophors ist nun nicht mehr intramolekular gelöscht, und das Ribozym steht für einen nächsten Katalysezyklus zur Verfügung. Die Aufhebung des FRET-Effektes bewirkt einen meßbaren Anstieg der FAM-spezifischen Fluoreszenz in der Probe. Da der Anstieg der Fluoreszenz direkt proportional zur Spaltungsaktivität des Ribozyms ist, können aus den gemessenen Daten die Reaktionsgeschwindigkeiten ermittelt werden.After hydrolysis of the FRET substrate by the ribozyme, the Remove splitting pieces from each other in solution. The fluorescence of the fluorophore is no longer deleted intramolecularly, and the ribozyme stands for another Catalysis cycle available. The cancellation of the FRET effect causes one measurable increase in FAM-specific fluorescence in the sample. Because the rise the fluorescence is directly proportional to the cleavage activity of the ribozyme the reaction rates are determined from the measured data.

Fig. 3: Prinzip der Identifikation von RNA-bindenden Substanzen aus kombinatorischen Verbindungsbibliotheken. Dargestellt ist der Fall, daß die Bindung einer Substanz zur Reduktion der gemessenen Fluoreszenz führt. Zur Auswertung wird die gemessene Fluoreszenz gegen die initiale Reaktionszeit aufgetragen. Durch Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten (= Steigung der Gerade) kann die Wechselwirkung zwischen RNA-Binder und RNA detektiert werden. Im abgebildeten Beispiel ist die Steigung für (B) signifikant geringer als für (A). FIG. 3 shows the principle of identification of RNA-binding substances from combinatorial compound libraries. The case is shown that the binding of a substance leads to a reduction in the measured fluorescence. The measured fluorescence is plotted against the initial reaction time for evaluation. The interaction between the RNA binder and RNA can be detected by comparing the reaction speeds (= slope of the straight line). In the example shown, the slope for (B) is significantly less than for (A).

Fig. 4: Fluoreszenzmessungen mit TRK1/SL1 die beim Screening der Substanzbibliothek erhalten wurden. Zeitabhängiger Anstieg des Fluoreszenzsignals für (a) die nicht-inhibierte TRK1-Reaktion, (b) die TRK1-Reaktion in Gegenwart von Substanz #332 und (c) die TRK1-Reaktion in Gegenwart von Substanz #425. Es sind jeweils die Meßpunkte und Regressionsgeraden für den nicht-korrigierten Reaktionsverlauf, den entsprechenden Kontrollansatz ohne TRK1 und die korrigierte Reaktion gezeigt. Die Werte für die Anfangsgeschwindigkeiten der Reaktionen (= Steigung der jeweiligen Regressionsgerade) sind ebenfalls angegeben. Fig. 4: Fluorescence measurements with TRK1 / SL1, which were obtained when screening the substance library. Time-dependent increase in the fluorescence signal for (a) the uninhibited TRK1 reaction, (b) the TRK1 reaction in the presence of substance # 332 and (c) the TRK1 reaction in the presence of substance # 425. The measuring points and regression lines for the uncorrected reaction course, the corresponding control approach without TRK1 and the corrected reaction are shown in each case. The values for the initial rates of the reactions (= slope of the respective regression line) are also given.

Fig. 5: Prinzip des Screening Assays. Jede Microtiterplatte enthält (i) das zu untersuchende Target-Protein (ii) eine Substanz aus der Verbindungsbibliothek (iii) und ein geeignetes Reporter-Ribozym-Konstrukt, beispielsweise ein Intramer- Ribozym-Konstrukt (siehe Anmeldungstext). Durch Fluoreszenzmessung können Substanzen identifiziert werden, die in der Lage sind, an das zu untersuchende Target-Protein zu binden. Da infolge dessen das RNA-Ribozym-Konstrukt von der Protein-Bindungsdomäne verdrängt wird, kommt es zu einer messbaren Veränderung der Fluoreszenzemmission. Im abgebildeten Beispiel wird das Fluoreszenzsignal verstärkt. In der Abbildung enthalten die Microtitervertiefungen A und C keine Target-Protein-bindenden Substanz und daher wird nur ein schwaches Signal detektiert. In Vertiefung B wird hingegen ein stark ansteigendes Fluoreszenzsignal gemessen, da diese Vertiefung eine Substanz mit den gewünschten Target-spezifischen Eigenschaften enthält. Fig. 5: Principle of the screening assay. Each microtiter plate contains (i) the target protein to be investigated (ii) a substance from the compound library (iii) and a suitable reporter ribozyme construct, for example an intramer ribozyme construct (see application text). Fluorescence measurement can identify substances that are able to bind to the target protein to be examined. As a result, the RNA-ribozyme construct is displaced by the protein-binding domain, which leads to a measurable change in the fluorescence emission. In the example shown, the fluorescence signal is amplified. In the figure, microtiter wells A and C contain no target protein-binding substance and therefore only a weak signal is detected. In contrast, a strongly increasing fluorescence signal is measured in recess B, since this recess contains a substance with the desired target-specific properties.

Fig. 6: Sekundärstrukturen von Reporter-Ribozym-Konstrukt IRK1 und Ribozym- Substrat SK1. Als Rev-bindende Sequenz wurde das von D. P. Bartel et al. isolierte wt RBE-Motiv gewählt [Gell 67 (1991), 529-536]. Fig. 6: secondary structures of ribozyme construct reporter IRK1 and ribozyme substrate SK1. The Rev-binding sequence was that of DP Bartel et al. isolated wt RBE motif selected [Gell 67 (1991), 529-536].

Fig. 7: Sekundärstrukturen der Bibliothek (A) und der isolierten Rev-bindenden Sequenz (Seq 5) (B) [L. Giver et at., NAR 23 (1993), 5509-5516]. FIG. 7 shows the secondary structures of the library (A) and the insulated Rev-binding sequence (Seq 5) (B) [L. Giver et at., 1993, NAR 23, 5509-5516].

Die folgenden Beispiele erläutern die ErfindungThe following examples illustrate the invention

Beispiel 1example 1 Screening von Bindern für die A-site Subdomäne der 16S RNAScreening of binders for the A-site subdomain of 16S RNA

Mit Hilfe des Assays wurde eine Bibliothek von 500 nicht-charakterisierten niedermolekularen Substanzgemischen (Molekulargewicht kleiner 3000 g/mol) im Microtiterplatten Format hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften gegenüber einem Target-Ribozym-Konstrukt TRK1 getestet. Die Substanzgemische erhielt man durch Filtration von bakteriellen Extrakten (Actinomycetenstämme). Die TRK1-RNA und das Substrat SK1 wurden durch automatisierte Festphasensynthese hergestellt (Sequenzen siehe Fig. 1).With the help of the assay, a library of 500 non-characterized, low molecular weight substance mixtures (molecular weight less than 3000 g / mol) in microtiter plate format was tested with regard to their binding properties against a target ribozyme construct TRK1. The substance mixtures were obtained by filtration of bacterial extracts (Actinomycetes strains). The TRK1-RNA and the substrate SK1 were produced by automated solid phase synthesis (sequences see FIG. 1).

In Fig. 2 ist das Funktionsprinzip des Assays dargestellt. Ein inhibitorischer/­ aktivatorischer Effekt auf die Spaltungsaktivität der Ribozym-Domäne wurde durch ein reduziertes/gesteigertes Fluoreszenzsignal festgestellt. Ein repräsentatives Ergebnis des Screening-Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt. Eine schematische Darstellung des Assays ist in Fig. 3 abgebildet.In FIG. 2, the operating principle of the assay is shown. An inhibitory / activatory effect on the cleavage activity of the ribozyme domain was determined by a reduced / increased fluorescence signal. A representative result of the screening experiment is shown in Table 1. A schematic representation of the assay is shown in FIG. 3.

Um die Genauigkeit des Assays zu erhöhen, wurden zusätzlich zur jeweiligen Messung, Kontrollansätze ohne Target-Ribozym-Konstrukt TRK1 auf der selben Microtiterplatte vermessen. Durch Subtraktion der in den Kontrollansätzen gemessenen Fluoreszenzsignale war es möglich, Ribozym- oder Target­ unspezifische Einflüsse der jeweiligen Substanz auf das FRET-Substrat weitgehenst zu eliminieren (z. B. RNA-Aggregation, Quenchingeffekte oder RNase Degradation). Wie in den Fig. 4a-c gezeigt, konnten die Meßfehler bei der Bestimmung der jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten durch Korrektur dieser unspezifischen Einflüsse deutlich vermindert werden. Die Inkubation mit Substanz #332 führte beispielsweise zu einer signifikanten Erniedrigung des Fluoreszenzsignals im Kontrollansatz (Fig. 4b). In Gegenwart von Substanz #425 hingegen wurde ein Anstieg der Fluoreszenz nicht nur in der HHR1-Reaktion, sondern auch im Kontrollansatz gemessen (Fig. 4c).In order to increase the accuracy of the assay, control batches without a target ribozyme construct TRK1 were measured on the same microtiter plate in addition to the respective measurement. By subtracting the fluorescence signals measured in the control batches, it was possible to largely eliminate ribozyme- or target-unspecific influences of the respective substance on the FRET substrate (e.g. RNA aggregation, quenching effects or RNase degradation). As shown in FIGS . 4a-c, the measurement errors in determining the respective reaction rates could be significantly reduced by correcting these non-specific influences. Incubation with substance # 332, for example, led to a significant reduction in the fluorescence signal in the control mixture ( FIG. 4b). In contrast, in the presence of substance # 425, an increase in fluorescence was measured not only in the HHR1 reaction but also in the control batch ( FIG. 4c).

Aus der getesteten Bibliothek wurden zwei Substanzen auf Grund ihres deutlich inhibitorischen Effektes auf die Spaltungsrate der Ribozym-Domäne identifiziert: Substanz #122 und Substanz #387. Um auszuschließen, daß die beobachtete Inhibition bzw. Aktivierung eine Folge des Fluoreszenzmessverfahren war, wurden eine Reihe von Kontrollexperimenten durchgeführt, bei denen die Ribozymspaltung auf konventionelle Weise mit einem 5'-³²P markiertem Substrat (SKU1) untersucht wurde. In dieser Analyse wurden die identifizierten Substanzen #122 und #387 bestätigt.Two substances from the tested library were identified on the basis of their markedly inhibitory effect on the cleavage rate of the ribozyme domain: substance # 122 and substance # 387. In order to rule out that the inhibition or activation observed was a result of the fluorescence measurement method, a series of control experiments were carried out in which the ribozyme cleavage was investigated in a conventional manner with a 5'- ³² P-labeled substrate (SKU1). In this analysis, the identified substances # 122 and # 387 were confirmed.

In einem nachfolgenden Kontrollexperiment wurde die Ribozym-Domäne (HHR1) des TRK1 separat, also ohne Bindeglied-Sequenz und 16S-RNA-Domäne, in identisch durchgeführen Experimenten untersucht. Die fehlenden Sequenz wurde dabei durch die Haarnadelstruktur 5'-CCGGAUUGCCGG-3' ersetzt. Es zeigte sich, daß Substanz #122 das Ribozym HHR1 inhibiert, wohingegen Substanz #387 keinen messbaren Effekt auf das Ribozym hat. Durch eine Bindungsstudie mit der in Fig. 1 dargestellten 16S-RNA-Domäne (Biacore-Analyse) wurde die Substanz #122 als hochaffiner und spezifischer Binder für die A-site Subdomäne bestätigt.In a subsequent control experiment, the ribozyme domain (HHR1) of the TRK1 was investigated separately, that is to say without a link sequence and a 16S RNA domain, in experiments carried out identically. The missing sequence was replaced by the 5'-CCGGAUUGCCGG-3 'hairpin structure. Substance # 122 was shown to inhibit the ribozyme HHR1, whereas substance # 387 had no measurable effect on the ribozyme. A binding study with the 16S RNA domain shown in FIG. 1 (biacore analysis) confirmed substance # 122 as a high-affinity and specific binder for the A-site subdomain.

Tabelle 1Table 1

Repräsentatives Ergebnisse des Screening Experiments (Substanzen No97-No192). Aufgelistet ist die relative Aktivität der Reporter-Ribozym-Aktivität in Gegenwart von 100 µM der jeweiligen Substanz. Die Werte erhielt man durch Regressionsanalyse und anschließende Normierung, wobei die Anfangsgeschwindigkeit für die nicht-inhibierte Reaktion gleich "1" gesetzt wurde. Substanzen mit einem deutlichen inhibitorischen Einfluß sind hervorgehoben. Alle Tests wurden bei Substrat-Überschuß mit 8 nM TRK1, 200 nM SK1 in 0.5 × PBS bei 32°C, 8 mM MgCl₂ durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch zeitgleiche Zugabe von MgCl₂ und Substanz gestartet. Representative results of the screening experiment (substances No97-No192). The relative activity of the reporter ribozyme activity in the presence of 100 μM of the respective substance is listed. The values were obtained by regression analysis and subsequent normalization, the initial speed for the uninhibited reaction being set to "1". Substances with a clear inhibitory influence are highlighted. All tests were carried out with excess substrate with 8 nM TRK1, 200 nM SK1 in 0.5 × PBS at 32 ° C., 8 mM MgCl ₂ . The reactions were started by the simultaneous addition of MgCl ₂ and substance.

Tabelle 1Table 1

Repräsentative Ergebnisse des Screening Experiments Representative results of the screening experiment

Substanzen '97-197 Substances '97 -197

Beispiel 2Example 2 Screening von Protein-bindenden Substanzen unter Verwendung eines Intramer-Ribozym-KonstruktesScreening of protein binding substances using of an intramer ribozyme construct

Für das Screening einer an das virale Rev-Protein bindende Substanz wurde eine Bibliothek von 50 kurzen RNA-Sequenzen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gescreent. Die Sequenzen sind nachfolgend dargestellt.
Seq 1: 5'-GGGAGUUGAUAACAGGCUCAAUGAGCCUGCUCGGUCAAC-3'
Seq 2: 5'-GGGAGUUGAUAGCAGGCUCAAUGAGCCUGAGUUCCCAAC-3'
Seq 3: 5'-GGGAGUUGAUAUCAGGCUCAAUGAGCCUGGUCGACCAAC-3'
Seq 4: 5'-GGGAGUUGAUACCAGGCUCAAUGAGCCUGCAAAGUCAAC-3'
Seq 5: 5'-GGGAGGUGGACUCCAGCUUCGGCUGUUGAGAUACACC-3'
Seq 6: 5'-GGGAGUUGGUACCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAGCUCAAC-3'
Seq 7: 5'-GGGAGUUGCUACCAGGCUCAAUGAGCCUGGUUAAACAAC-3'
Seq 8: 5'-GGGAGUUGUUACCAGGCUCAAUGAGCCUGCGCGCGCAAC-3'
Seq 9: 5'-GGGAGUUGUAACCAGGCUCAAUGAGCCUGUAUAUACAAC-3'
Seq 10: 5'-GGGAGUUGUGACCAGGCUCAAUGAGCCUGAGAAUCCAAC-3'
Seq 11: 5'-GGGAGUUGUCACCAGGCUCAAUGAGCCUGCCUGGACAAC-3'
Seq 12: 5'-GGGAGUUGGCAUCAGGCUCAAUGAGCCUGUGGACACAAC-3'
Seq 13: 5'-GGGAGUUGGACUCAGGCUCAAUGAGCCUGGAAAAACAAC-3'
Seq 14: 5'-GGGAGUUGGAAUCAGGCUCAAUGAGCCUGAGGGGACAAC-3'
Seq 15: 5'-GGGAGUUGGCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGCUUUUCCAAC-3'
Seq 16: 5'-GGGAGUUGGAAUCAGGCUCAAUGAGCCUGUCCCCUCAAC-3'
Seq 17: 5'-GGGAGUUGGCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGACCCCACAAC-3'
Seq 18: 5'-GGGAGUUGGGGUCAGGCUCAAUGAGCCUGGUUUUGCAAC-3'
Seq 19: 5'-GGGAGUUGGUUUCAGGCUCAAUGAGCCUGCGGGGGCAAC-3'
Seq 20: 5'-GGGAGUUGAAUUCAGGCUCAAUGAGCCUGUAAAAUCAAC-3'
Seq 21: 5'-GGGAGUUGAACCCAGGCUCAAUGAGCCUGAUAUAUCAAC-3'
Seq 22: 5'-GGGAGUUGAACACAGGCUCAAUGAGCCUGUAUAUACAAC-3'
Seq 23: 5'-GGGAGUUGAAGGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUUUCAAC-3'
Seq 24: 5'-GGGAGUUGAAGUCAGGCUCAAUGAGCCUGUUUAAACAAC-3'
Seq 25: 5'-GGGAGUUGAGUCCAGGCUCAAUGAGCCUGAAUUAACAAC-3'
Seq 26: 5'-GGGAGUUGUUUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUUAAUUCAAC-3'
Seq 27: 5'-GGGAGUUGGGGGCAGGCUCAAUGAGCCUGCCCAAACAAC-3'
Seq 28: 5'-GGGAGUUGGCAACAGGCUCAAUGAGCCUGCACAGUCAAC-3'
Seq 29: 5'-GGGAGUUGACCCCAGGCUCAAUGAGCCUGGUGCAGCAAC-3'
Seq 30: 5'-GGGAGUUGCACACAGGCUCAAUGAGCCUGGUCAGCCAAC-3'
Seq 31: 5'-GGGAGUUGCAUACAGGCUCAAUGAGCCUGCAGUUACAAC-3'
Seq 32: 5'-GGGAGUUGUGAGCAGGCUCAAUGAGCCUGGGCAGUCAAC-3'
Seq 33: 5'-GGGAGUUGGGUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUCAACUCAAC-3'
Seq 34: 5'-GGGAGUUGCGAUCAGGCUCAAUGAGCCUGACUAGGCAAC-3'
Seq 35: 5'-GGGAGUUGAAUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUUGCACCAAC-3'
Seq 36: 5'-GGGAGUUGUCGGCAGGCUCAAUGAGCCUGACGUACCAAC-3'
Seq 37: 5'-GGGAGUUGUCCGCAGGCUCAAUGAGCCUGUGGUAACAAC-3'
Seq 38: 5'-GGGAGUUGAGAACAGGCUCAAUGAGCCUGCUCCGACAAC-3'
Seq 39: 5'-GGGAGUUGCCUCCAGGCUCAAUGAGCCUGACCUCGCAAC-3'
Seq 40: 5'-GGGAGUUGCCCGCAGGCUCAAUGAGCCUGGCAGCCCAAC-3'
Seq 41: 5'-GGGAGUUGGCGCCAGGCUCAAUGAGCCUGUCGAAGCAAC-3'
Seq 42: 5'-GGGAGUUGCGCGCAGGCUCAAUGAGCCUGUCACACCAAC-3'
Seq 43: 5'-GGGAGUUGCGAACAGGCUCAAUGAGCCUGAAAAAACAAC-3'
Seq 44: 5'-GGGAGUUGUCUUCAGGCUCAAUGAGCCUGUUUUUUCAAC-3'
Seq 45: 5'-GGGAGUUGGGAGCAGGCUCAAUGAGCCUGGGGGGGCAAC-3'
Seq 46: 5'-GGGAGUUGGCCUCAQGCUCAAUGAGCCUGCCCCCCCAAC-3'
Seq 47: 5'-GGGAGUUGGAUGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGGCAAC-3'
Seq 48: 5-GGGAGUUGCCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGGCAAC-3'
Seq 49: 5'-GGGAGUUGCUCUCAGGCUCAAUGAGCCUGAUAUGGCAAC-3'
Seq 50: 5'-GGGAGUUGCUCGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGACAAC-3'For the screening of a substance that binds to the viral Rev protein, a library of 50 short RNA sequences was screened using the method according to the invention. The sequences are shown below.
Seq 1: 5'-GGGAGUUGAUAACAGGCUCAAUGAGCCUGCUCGGUCAAC-3 '
Seq 2: 5'-GGGAGUUGAUAGCAGGCUCAAUGAGCCUGAGUUCCCAAC-3 '
Seq 3: 5'-GGGAGUUGAUAUCAGGCUCAAUGAGCCUGGUCGACCAAC-3 '
Seq 4: 5'-GGGAGUUGAUACCAGGCUCAAUGAGCCUGCAAAGUCAAC-3 '
Seq 5: 5'-GGGAGGUGGACUCCAGCUUCGGCUGUUGAGAUACACC-3 '
Seq 6: 5'-GGGAGUUGGUACCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAGCUCAAC-3 '
Seq 7: 5'-GGGAGUUGCUACCAGGCUCAAUGAGCCUGGUUAAACAAC-3 '
Seq 8: 5'-GGGAGUUGUUACCAGGCUCAAUGAGCCUGCGCGCGCAAC-3 '
Seq 9: 5'-GGGAGUUGUAACCAGGCUCAAUGAGCCUGUAUAUACAAC-3 '
Seq 10: 5'-GGGAGUUGUGACCAGGCUCAAUGAGCCUGAGAAUCCAAC-3 '
Seq 11: 5'-GGGAGUUGUCACCAGGCUCAAUGAGCCUGCCUGGACAAC-3 '
Seq 12: 5'-GGGAGUUGGCAUCAGGCUCAAUGAGCCUGUGGACACAAC-3 '
Seq 13: 5'-GGGAGUUGGACUCAGGCUCAAUGAGCCUGGAAAAACAAC-3 '
Seq 14: 5'-GGGAGUUGGAAUCAGGCUCAAUGAGCCUGAGGGGACAAC-3 '
Seq 15: 5'-GGGAGUUGGCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGCUUUUCCAAC-3 '
Seq 16: 5'-GGGAGUUGGAAUCAGGCUCAAUGAGCCUGUCCCCUCAAC-3 '
Seq 17: 5'-GGGAGUUGGCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGACCCCACAAC-3 '
Seq 18: 5'-GGGAGUUGGGGUCAGGCUCAAUGAGCCUGGUUUUGCAAC-3 '
Seq 19: 5'-GGGAGUUGGUUUCAGGCUCAAUGAGCCUGCGGGGGCAAC-3 '
Seq 20: 5'-GGGAGUUGAAUUCAGGCUCAAUGAGCCUGUAAAAUCAAC-3 '
Seq 21: 5'-GGGAGUUGAACCCAGGCUCAAUGAGCCUGAUAUAUCAAC-3 '
Seq 22: 5'-GGGAGUUGAACACAGGCUCAAUGAGCCUGUAUAUACAAC-3 '
Seq 23: 5'-GGGAGUUGAAGGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUUUCAAC-3 '
Seq 24: 5'-GGGAGUUGAAGUCAGGCUCAAUGAGCCUGUUUAAACAAC-3 '
Seq 25: 5'-GGGAGUUGAGUCCAGGCUCAAUGAGCCUGAAUUAACAAC-3 '
Seq 26: 5'-GGGAGUUGUUUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUUAAUUCAAC-3 '
Seq 27: 5'-GGGAGUUGGGGGCAGGCUCAAUGAGCCUGCCCAAACAAC-3 '
Seq 28: 5'-GGGAGUUGGCAACAGGCUCAAUGAGCCUGCACAGUCAAC-3 '
Seq 29: 5'-GGGAGUUGACCCCAGGCUCAAUGAGCCUGGUGCAGCAAC-3 '
Seq 30: 5'-GGGAGUUGCACACAGGCUCAAUGAGCCUGGUCAGCCAAC-3 '
Seq 31: 5'-GGGAGUUGCAUACAGGCUCAAUGAGCCUGCAGUUACAAC-3 '
Seq 32: 5'-GGGAGUUGUGAGCAGGCUCAAUGAGCCUGGGCAGUCAAC-3 '
Seq 33: 5'-GGGAGUUGGGUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUCAACUCAAC-3 '
Seq 34: 5'-GGGAGUUGCGAUCAGGCUCAAUGAGCCUGACUAGGCAAC-3 '
Seq 35: 5'-GGGAGUUGAAUCCAGGCUCAAUGAGCCUGUUGCACCAAC-3 '
Seq 36: 5'-GGGAGUUGUCGGCAGGCUCAAUGAGCCUGACGUACCAAC-3 '
Seq 37: 5'-GGGAGUUGUCCGCAGGCUCAAUGAGCCUGUGGUAACAAC-3 '
Seq 38: 5'-GGGAGUUGAGAACAGGCUCAAUGAGCCUGCUCCGACAAC-3 '
Seq 39: 5'-GGGAGUUGCCUCCAGGCUCAAUGAGCCUGACCUCGCAAC-3 '
Seq 40: 5'-GGGAGUUGCCCGCAGGCUCAAUGAGCCUGGCAGCCCAAC-3 '
Seq 41: 5'-GGGAGUUGGCGCCAGGCUCAAUGAGCCUGUCGAAGCAAC-3 '
Seq 42: 5'-GGGAGUUGCGCGCAGGCUCAAUGAGCCUGUCACACCAAC-3 '
Seq 43: 5'-GGGAGUUGCGAACAGGCUCAAUGAGCCUGAAAAAACAAC-3 '
Seq 44: 5'-GGGAGUUGUCUUCAGGCUCAAUGAGCCUGUUUUUUCAAC-3 '
Seq 45: 5'-GGGAGUUGGGAGCAGGCUCAAUGAGCCUGGGGGGGCAAC-3 '
Seq 46: 5'-GGGAGUUGGCCUCAQGCUCAAUGAGCCUGCCCCCCCAAC-3 '
Seq 47: 5'-GGGAGUUGGAUGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGGCAAC-3 '
Seq 48: 5-GGGAGUUGCCCUCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGGCAAC-3 '
Seq 49: 5'-GGGAGUUGCUCUCAGGCUCAAUGAGCCUGAUAUGGCAAC-3 '
Seq 50: 5'-GGGAGUUGCUCGCAGGCUCAAUGAGCCUGAAAUGACAAC-3 '

Die für die 50 RNA-Sequenzen codierenden DNA-Matrizen wurden durch in vitro Transkription von durch Festphasensynthese synthetisierten Oligonucleotiden hergestellt. Nach der Transkription wurden die RNAs über denaturierende Polyacrylamidelektrophorese in denaturierenden Harnstoff/Polyacrylamidgelen nach ihrer Länge aufgetrennt und die entsprechenden Banden durch Fluoreszenzlöschung visualisiert. Hierzu wurden die Gele in Klarsichtfolie verpackt, auf DC-Alufolien (Kieselgel 60 F245, Merck) gelegt und mit einer Handlampe bei 254 nm bestrahlt. The DNA templates coding for the 50 RNA sequences were determined by in vitro Transcription of oligonucleotides synthesized by solid phase synthesis manufactured. After transcription, the RNAs were denatured via Polyacrylamide electrophoresis in denaturing urea / polyacrylamide gels after their length separated and the corresponding bands by fluorescence quenching visualized. For this purpose, the gels were packed in cling film on DC aluminum foil (Kieselgel 60 F245, Merck) and irradiated with a hand lamp at 254 nm.  

Banden der richtigen Länge wurden ausgeschnitten, die Gelstücke zerkleinert und mit 300 mM Natriumacetat (pH 5,2) überschichtet. Nach Inkubation für 1 h bei 65°C und 4 h bei Raumtemperatur wurde die Gelsuspension durch mit Glaswolle gestopfte Spritzen gepreßt. Nach Entfernung der Gelreste wurden die Nucleinsäuren präzipitiert und in sterilem H₂O aufgenommen.Bands of the correct length were cut out, the gel pieces were broken up and covered with 300 mM sodium acetate (pH 5.2). After incubation for 1 h at 65 ° C. and 4 h at room temperature, the gel suspension was pressed through syringes stuffed with glass wool. After removal of the gel residues, the nucleic acids were precipitated and taken up in sterile H ₂ O.

Für das Screeningexperiment wurde aus der Bibliothek von 50 verschiedenen Ribonucleinsäuren eine bindende RNA-Sequenz (vgl. Fig. 7) für das Rev-Protein von HIV isoliert. Die prinzipielle Funktionsweise des Assays ist in Fig. 5 dargestellt. Das Experiment wurde analog Beispiel 1 mit den in Fig. 6 abgebildeten Sequenzen IRK1 und SK1 durchgeführt. Die beiden Sequenzen wurden durch Oligonucleotid- Festphasensynthese hergestellt und von der Firma Eurogentec (Belgien) bezogen. Fig. 7 zeigt eine allgemeine Formel für die nicht an das Rev-Protein bindenden Sequenzen aus der RNA-Bibliothek, sowie die identifizierte Rev-bindende RNA- Sequenz. Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt. Die Sequenzen der Bibliothek und das IRK-1 Reporterkonstrukt wurden separat in Reaktionspuffer (10 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl) für 1,5 min bei 95°C denaturiert und bei Raumtemperatur zur Renaturierung wieder abgekühlt. Das IRK-1 und SK-1 wurden vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde diese Inkubation gleichmäßig auf 50 Einzelreaktionen verteilt. Nach Zugabe des Rev- Proteins zu den Ansätzen wurde für weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die 50 Bibliotheks-RNA-Sequenzen auf die 50 Ansätze verteilt zugegeben wurden. Nach weiteren 30 min wurde die Spaltungsreaktion für das Substrat SK-2 durch Zugabe von Magnesium gestartet. Die Endkonzentrationen der finalen Ansätze setzten sich wie folgt zusammen: 10 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, IRK-1 8 nM, SK-1 200 nM, RNA-Sequenzen der Bibliothek 2 µM, Rev-Protein 200 nM. Alle Komponenten wurden vor dem Vermischen auf 37°C vorgewärmt. Die Auswertung erfolgte wie in Beispiel 1 und identifizierte die Sequenz in Abb. 7 als Rev-bindende Sequenz, die mit dem IRK-1 um die Bindung an das Protein kompetitieren konnte. Die Identifikation erfolgte durch Messung der deutlich veränderten Fluoreszenz gegenüber den Ansätzen mit anderen Mitgliedern der Bibliothek. Durch dieses Experiment konnte belegt werden, daß Kompetitoren einer RNA/Protein-Wechselwirkung durch das erfindungsgemäße Verfahren einfach und durch mit HTS-Verfahren kompatible Fluoreszenzdetektion aus kombinatorischen Bibliotheken isoliert werden können. For the screening experiment, a binding RNA sequence (cf. FIG. 7) for the Rev protein of HIV was isolated from the library of 50 different ribonucleic acids. The basic mode of operation of the assay is shown in FIG. 5. The experiment was carried out analogously to Example 1 with the sequences IRK1 and SK1 shown in FIG. 6. The two sequences were prepared by oligonucleotide solid phase synthesis and obtained from Eurogentec (Belgium). Fig. 7 shows a general formula for the non on the Rev protein binding sequences from the RNA library, as well as the identified Rev-binding RNA sequence. The experiment was carried out as follows. The sequences of the library and the IRK-1 reporter construct were denatured separately in reaction buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl) for 1.5 min at 95 ° C. and cooled again at room temperature for renaturation. The IRK-1 and SK-1 were mixed and incubated for 5 min at room temperature. This incubation was then distributed evenly over 50 individual reactions. After the Rev protein had been added to the batches, the mixture was incubated for a further 15 min at room temperature before the 50 library RNA sequences were added to the 50 batches. After a further 30 minutes, the cleavage reaction for the SK-2 substrate was started by adding magnesium. The final concentrations of the final batches are composed as follows: 10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl ₂ , IRK-1 8 nM, SK-1 200 nM, RNA sequences from the library 2 μM, Rev protein 200 nM. All components were preheated to 37 ° C before mixing. The evaluation was carried out as in Example 1 and identified the sequence in FIG. 7 as a Rev-binding sequence which could compete with the IRK-1 for binding to the protein. The identification was made by measuring the significantly changed fluorescence compared to the approaches with other members of the library. This experiment was able to demonstrate that competitors of an RNA / protein interaction can be isolated from combinatorial libraries simply by the method according to the invention and by fluorescence detection compatible with HTS methods.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (9)

1. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an ein gewünschtes RNA-Target-Motiv spezifisch binden und dadurch dessen Funktion hemmen oder eliminieren können, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Herstellung eines Konstrukts (Target-Reporter-Konstrukt; TRK) aus einer Reporter-Ribozym-Domäne (I) und dem RNA-Target-Motiv (II), wobei (I) und (II) durch einen RNA-Linker miteinander verbunden sind und wobei die Reporter-Ribozym-Domäne (I) nach spezifischer Bindung einer Verbindung an das RNA-Target-Motiv (II) ihre katalytische Aktivität ändert;
• b) Herstellung eines signalgebenden Ribozym-Substrats, das an die Reporter-Ribozym-Domäne (I) spezifisch binden kann;
• c) Inkontaktbringen des TRK aus Schritt (a) und des Ribozym-Substrats aus Schritt (b) mit der zu identifizierenden Verbindung oder eines diese Verbindung enthaltenden Gemischs; und
• d) Bestimmung der Bindung der Verbindung an das RNA-Target-Motiv.

1. A method for identifying compounds which specifically bind to a desired RNA target motif and can thereby inhibit or eliminate its function, which is characterized by the following steps:

• a) Production of a construct (target reporter construct; TRK) from a reporter ribozyme domain (I) and the RNA target motif (II), where (I) and (II) are connected to one another by an RNA linker and wherein the reporter ribozyme domain (I) changes its catalytic activity after specific binding of a compound to the RNA target motif (II);
• b) production of a signaling ribozyme substrate which can bind specifically to the reporter ribozyme domain (I);
• c) contacting the TRK from step (a) and the ribozyme substrate from step (b) with the compound to be identified or a mixture containing this compound; and
• d) determination of the binding of the compound to the RNA target motif.

2. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die eine mit einem gewünschten RNA-Target-Motiv assoziierte Verbindung verdrängen und dadurch deren oder dessen Funktion hemmen oder eliminieren können, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Herstellung eines Konstrukts (Target-Reporter-Konstrukt; TRK) aus einer Reporter-Ribozym-Domäne (I) und dem RNA-Target-Motiv (II), wobei (I) und (II) durch einen RNA-Linker miteinander verbunden sind und wobei die Reporter-Ribozym-Domäne (I) nach Verdrängung der mit dem gewünschten RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung von dem RNA-Target-Motiv (II) ihre katalytische Aktivität ändert;
• b) Herstellung eines signalgebenden Ribozym-Substrats, das an die Reporter-Ribozym-Domäne (I) spezifisch binden;
• c) Inkontaktbringen des TRK aus Schritt (a) mit der natürlicherweise mit dem RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung;
• d) Inkontaktbringen des Komplexes aus Schritt (c) und des Ribozym- Substrats aus Schritt (b) mit der zu identifizierenden Verbindung oder eines diese Verbindung enthaltenden Gemischs; und
• e) Bestimmung der Verdrängung der mit dem RNA-Target-Motiv assoziierten Verbindung.

2. A method for identifying compounds which displace a compound associated with a desired RNA target motif and can thereby inhibit or eliminate its or its function, which is characterized by the following steps:

• a) Production of a construct (target reporter construct; TRK) from a reporter ribozyme domain (I) and the RNA target motif (II), where (I) and (II) are connected to one another by an RNA linker and wherein the reporter ribozyme domain (I) changes its catalytic activity after displacement of the compound associated with the desired RNA target motif from the RNA target motif (II);
• b) production of a signaling ribozyme substrate which bind specifically to the reporter ribozyme domain (I);
• c) contacting the TRK from step (a) with the compound naturally associated with the RNA target motif;
• d) contacting the complex from step (c) and the ribozyme substrate from step (b) with the compound to be identified or a mixture containing this compound; and
• e) Determination of the displacement of the compound associated with the RNA target motif.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (b) das Ribozym-Substrat von der Reporter-Ribozym-Domäne (I) gespalten werden kann und im letzten Schritt die Bestimmung der Bindung anhand der Spaltung des Ribozym- Substrats erfolgt.3. The method according to claim 1 or 2, wherein in step (b) the ribozyme substrate can be cleaved by the reporter ribozyme domain (I) and in the last Step determining the binding by cleavage of the ribozyme Substrate. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Reporter-Ribozym- Domäne von einem Hammerhead-Ribozym stammt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the reporter ribozyme Domain comes from a hammerhead ribozyme. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Ribozym-Substrat ein doppelt markiertes Ribozym-Substrat ist.5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the ribozyme substrate double labeled ribozyme substrate. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das doppelt markierte Ribozym-Substrat eine fluorophore Gruppe und eine fluoreszenzlöschende Gruppe enthält und wobei nach Spaltung durch die Reporter-Ribozym- Domäne die Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors durch die fluoreszenzlöschende Gruppe unterbunden ist.6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the double marked Ribozyme substrate has a fluorophore group and a fluorescence quencher Contains group and after cleavage by the reporter ribozyme The quenching of the fluorescence of the fluorophore by the domain fluorescence quenching group is prevented. 7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die fluorophore Gruppe 6-Carboxy- Fluorescein (FAM) und die fluoreszenzlöschende Gruppe 6-Carboxy- Tetramethyl-Rhodamin (TAMRA) ist.7. The method of claim 6, wherein the fluorophoric group 6-carboxy- Fluorescein (FAM) and the fluorescence quenching group 6-carboxy Is tetramethyl rhodamine (TAMRA). 8. Arzneimittel, das eine nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 identifizierte Verbindung enthält.8. Medicament, which according to the method of any one of claims 1 to 6 contains identified compound. 9. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Kit folgende Verbindungen umfaßt:

• a) ein Target-Reporter-Konstrukt; und
• b) ein signalgebendes Ribozym-Substrat.

9. Kit for carrying out a method according to one of claims 1 to 9, wherein the kit comprises the following compounds:

• a) a target reporter construct; and
• b) a signaling ribozyme substrate.