DE10053519A1

DE10053519A1 - Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der pflanzlichen embryonalen Epidermis und der Blüte

Info

Publication number: DE10053519A1
Application number: DE2000153519
Authority: DE
Inventors: Andreas Reindl; Friedrich Bischoff; Chiara Tonelli; Katia Petroni
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-05-02
Also published as: WO2002034924A2; AU2002224803A1; WO2002034924A3

Abstract

Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der embryonalen Epidermis und/oder der Blüte, enthaltend den Promotor des myb11 Gens aus Arabidopsis thaliana oder funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente desselben, die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten besitzen, wobei der Promotor funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft ist. Die Erfindung betrifft ferner von diesen Expressionskassetten abgeleitete Vektoren. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte oder funktionell äquiva lente Teile derselben enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in transgenen Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressions kassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futter mitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Halford NG, Shewry PR, Br Med Bull 2000; 56(1): 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteil haften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der land wirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nah rungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96). Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Bei spiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in Ta bak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Ex pression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al., Science 1991, 254, 1194-1197). Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizidresistenz er zielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverlu ste verringert (Ott KH et al., J Mol Biol. 1996; 263(2): 359-368). Auch kann die Qualität der Erzeugnisse verbessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Bei spiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al.,Curr Top Microbiol Im munol 1995; 197: 77-89).

Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Pro motoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmals der Pflanze zu erzie len. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt.

Bekannt sind zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promo tor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) (Odell et al., Nature 313 (1985),810-812), der OCS (Octo pin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf 5 et al., Plant Mol Biol 1995, 29: 637-646), die Promoto ren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von Genen in be stimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunk ten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.

Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen sind beschrieben. Die Strin genz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Pro motor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosp hatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D In hibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungspezifische Promotoren, wie bei spielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

Eine Variation der Aktivität eines Promotors abhängig vom Ent wicklungsstadium der Pflanze ist unter anderem bei Baerson et al. beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK. Plant Mol Biol. 1993; 22(2): 255-67).

Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. So wurden beispielsweise die Pro motoren von Genen identifiziert, die für Speicherproteine ver schiedener Dicotyledonen kodieren. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos mm et al., Plant Cell. 1989; 1(9): 839-53), des 25 Albumin gens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989; 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3): 459-67) des Napin Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128). Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen.

Die Höhe einer transgenen Expression von heterologen Genen unter Kontrolle dieser Promotoren ist jedoch oft stark von der Art der Wirtspflanze abhängig. Ferner wurde festgestellt, dass die Expression selten zelltypspezifisch ist. Unterschiede im Expres sionsmuster und der Expressionsstärke eines bestimmten Promotors können durch unterschiedliche Wirtspflanzen oder durch unter schiedliche Insertionsorte in das Genom der Wirtspflanze bedingt sein (Goossens A et al., Plant Phys 1999, 120: 1095-1104).

Eine Promotoraktivität mit einer Spezifität für bestimmte Zellen innerhalb des Samens ist lediglich für die Samenhülle beschrieben worden: Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Samen hülle wurde durch "T-DNA tagging" in Tabak identifiziert (Fobert PR et al., Plant Journal 19946(4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067). Kryptische Promotoren oder Pseudopromotoren sind an sich inaktive Sequenzen innerhalb des Genoms, die jedoch eine expressionregulierende Funktionalität bekommen, wenn sie in der Nähe von Genen positioniert werden.

Die pflanzliche Epidermis stellt sowohl die primäre Barriere als auch die wesentliche Kontaktfläche des pflanzlichen Organismus zu seiner Umwelt dar. Sie hat eine bedeutende Funktion beim Schutz der Pflanze gegen biotische und ablotische Stressfaktoren, aber auch bei der Aufnahme von Nährstoffen.

Die epidermisspezifische Expression bestimmter Gene ist bekannt. So ist ein Lektin-ähnliches Protein, das sich in der Sprossspit zenepidermis der Gartenerbse (Pisum sativum) anreichert, be schrieben (Maiti et al., Planta 1993, 190, 241-246). Sterk et al. beschreiben ein Lipidtransferprotein, dass stark in den epiderma len Zellen von Sprossspitzen der Karotte exprimiert wird (Sterk et al., Plant Cell 1991, 3, 907-921). Clark et al. (Clark et al., Plant Cell 1992, 4, 1189-1198) beschreiben ein Lipidtransferpro tein, dass in der Epidermis von Pachyphytum exprimiert wird. Wei tere Beispiele für epidermisspezifisch exprimierte Gene, wie die Chalconsynthase- und Phenylalaninammonialyase-Genfamilien, sind berichtet (Schmelzer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 2989-2993; Schmelzer et al., Plant Cell 1989, 1, 993-1001). Goo drich et al. beschreibt Enzyme der Anthocyaninbiosynthese in der Löwenmaul-Blume, die in spezialisierten, epidermalen Zellen für einen begrenzten Zeitraum während der Entwicklung der Blütenk nospe exprimiert werden (Goodrich et al., Cell 1992, 68, 955-964). Watt et al. beschreibt die prolinreichen Zellwandpro teine SbPRP1, SbPRP2, und SbPRP2 aus Soja, die zu bestimmten Ent wicklungstadien in der Epidermis, zu anderen Zeiten aber auch im Gefässgewebe exprimiert werden (Wyatt et al., Plant Cell 1992, 4, 99-110).

Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das Meso phyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al., Science 1984, 234, 838-845), den sich teilenden Spross und das Wurzelmeristem (Atanassova et al., Plant J. 1992, 2, 291-300), Pollen (Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 1990, 224, 161-168), Sa menendosperm (Stalberg et al., Plant Mol. Biol. 1993, 23, 671-683), Wurzelepidermis (Suzuki et al., Plant Mol. Biol 1993, 21, 109-229), sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefässgewebe und Wurzelknötchen (Bogusz et al., Plant Cell 1990, 2, 633-641).

Es sind ferner epidermisspezifische Promotoren bekannt mit Akti vität in Blüten (Koes et al., Plant Cell 1990, 2, 379-392) oder nach Wundverletzungen (Liang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 9284-9288). US 5,744,334 beschreibt einen pflanzlichen Promotor (Blec-Promotor) mit Spezifität für die Epidermis der Sprossspitze. Hingegen wurde noch kein Promoter beschrieben, der spezifisch die Expression in der pflanzlichen, embryonalen Epi dermis gewährleistet.

Die Expression von Genen wird in allen Organismen über Transkrip tionsfaktoren reguliert. Auch diese zeigen entwicklungs- und ortsabhängige Expressionsmuster. Von besonderem Interesse ist die Familie der R2R3-MYB Transkriptionsfaktoren, die konservierte DNA-Bindungsdomänen vergleichbar der des Transkriptionsfaktors c-myb aufweisen und in nahezu allen Eukaryoten identifiziert wur den. Es wird gemutmasst, dass Arabidopsis thaliana mehr als 90 R2R3-MYB Gene hat (Meissner RC et al.,Plant Cell 1999; 11(10): 1827-1840).

Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, wurde bis lang kein Promotor mit einer Spezifität für die Epidermis des pflanzlichen Embryos identifiziert. Auch sind keine Promotoren bekannt, die eine Expression in der Blüte und in der Epidermis des pflanzlichen Embryos bedingen.

Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identi fizieren. Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung des Promotors für das myb11 Gen aus Arabidopsis thaliana gelöst. Der Promotor des myb11-Gens aus Arabidopsis thaliana hat eine expressionsregu lierende Spezifität, die eine Expression in der Blütenknospe, der Blüte, der welkenden Blüte, den grünen Samenschoten und in der embryonalen Epidermis am Tag 4 der Keimung zeigt (vergleiche Fig. 1 bis 6).

Das myb11 Gen zählt zu der R2R3-MYB Familie von Transkriptionfak toren. Das Gen von MYB11 ist bekannt (Genbank Acc.-No: AL162651). Weder seine Funktion noch sein Expressionsmuster sind jedoch be schrieben. Bislang ist kein MYB-Transkriptionsfaktor beschrieben oder identifiziert worden, der sowohl in Blüten als auch in der embryonalen Epidermis oder allein in der embryonalen Epidermis exprimiert wird.

Die Expressionsspezifität von Expressionskassetten, die von die sem Promotor abgeleitet sind, in der Blüte und der embryonalen Epidermis ist besonders vorteilhaft, weil

a) die Blütenknospe und die Blüte der Pflanze ein empfindliches Organ, besonders gegen Stressfaktoren wie Kälte, ist und
b) der pflanzliche Embryo vor allem in den ersten Tagen der Em bryogenese besonders empfindlich und anfällig gegen biotische und ablotische Stressfaktoren ist.

Der Epidermis des pflanzlichen Embryos kommt eine besonders Funk tion zu, da sie die unmittelbare Barriere und Kontaktstelle zur Umwelt darstellt.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressions kassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der em bryonalen Epidermis und/oder der Blüte enthaltend

a) den Promotor des mybll Gens aus Arabidopsis thaliana gemäss SEQ ID NO: 1, oder
b) ein funktionelle Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzen,

wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.

Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren meint alle solche durch gentechnische Methoden zustandengekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) der Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/ oder die Blüte oder ein von ihm abgeleitetes funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
c) (a) und (b)

sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d. h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gen technische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inver sion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann.

Im Rahmen der erfindungsgemässen Expressionskassette kann die Ex pression einer bestimmten Nukleinsäure durch einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte zu Bildung von sense-RNA oder anti-sense RNA führen. Die sense-RNA kann infolge in bestimmte Polypeptide translatiert werden. Mit der anti-sense-RNA kann die Expression bestimmter Gene herrunter reguliert werden.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung von dem Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte, der transgen zu ex primierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäurese quenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüfung im chemischen Sinne er forderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhan cer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Ziel sequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fun gierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Ab stand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimie rende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gän giger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sam brook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrie ben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Se quenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.

Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfin dungsgemässen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassettete erfolgt beispiels weise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor mit Spe zifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte fungie renden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleotid sequenz. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonie rungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) so wie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Inter science (1987) beschrieben sind. Bevorzugt kann die Expressions kassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu ex primierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem erfindungs gemässen Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruk tionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell ver knüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombina tion oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Ex pression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein be stimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine er findungsgemässe Expressionskassette, die die Expression des be stimmten Polypeptides selektiv in der embryonalen Epidermis und/ oder der Blüte steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimm tes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expression des bestimmten Polypeptides in der embryonalen Epidermis und/oder der Blüte herrunterreguliert oder ausgeschaltet.

Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäurese quenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen myb11-Promotor platziert werden, wodurch man eine erfindungsgemässe Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäureseuquenz in der embryonalen Epidermis und/oder der Blüte steuert.

Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeich net, wenn die Transkription eines beliebigen zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO: 1 abgeleite ten Promotors in mindestens einem der beiden Zielkompartimente der Expression (Blüte oder embryonales Epiderm) stattfindet. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, un ter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50%, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% von einem Ver gleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Pro motor unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unverän derten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% einen Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichswert die Expres sionshöhe der natürlichen myb11 mRNA oder des natürlichen MYB11 Proteins aus Arabidopsis thaliana. Bevorzugt ist ferner als Ver gleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nuklein säuresequezen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).

Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten in itiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen geneti schen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifi ziert wird.

Erfindungsgemäss sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten.

Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben dem Promotor mit Spezifität für die em bryonale Epidermis und/oder die Blüte funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu ver stehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expres sionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfin dungsgemässen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der je weiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäureseuenz den Promo tor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Gentische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteu ernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch geneti sche Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expres sion zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Absci sinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3): 246-53, 1989) beschrieben.

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu expri mierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine bestimmte Nukleinsäurese quenz durch einen Promotor (zum Beispiel den Promotor mit Spezi fität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA transkribiert und in das entspre chende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäu resequenz durch einen anderen Promotor mit einen anderen Spezifi tät in einem anderen Gewebe zu anti-sense-RNA transkibiert und das entsprechende Protein herrunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungsgemässe Expressionskassette realisiert wer den, indem der eine Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz positioniert wird und der andere Promotor da hinter.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans latierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt des mybll-Gens aus Arabidopsis thaliana. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression hete rologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspe zifität fördern (Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435-440.). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al., Plant Cell 1993, 5: 65-73). Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäu resequenz enthält den Abschnitt des mybll-Gens, der den Promotor und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des MYB11-Transkriptionsfaktors repräsentiert.

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nu kleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil hafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Ele mente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nuklein säuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkon strukt enthalten sein.

Zusätzliche zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere, von den Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedene, Targeting-Sequenzen zur Ge währleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Re tikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Komparti menten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom er lauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der na türliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte ausge tauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankie rende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen plaziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Ziel gens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem ent sprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die Pro motorsequenz nun in funktioneller Verknüfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemässe Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten rezi proken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz ver wendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist ge eignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen den Promotor mit Spezifität für die embryo nale Epidermis und/oder die Blüte auszutauschen und so den Ex pressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemässe Expres sionskassette dar.

Die erfindungsgemässen Expressionskassetten und die von ihnen ab geleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassetten, Vekto ren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolis musinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Bei spiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphi notricin etc. verleihen.
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodie ren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind da bei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Bio technol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence pro tein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Lef fel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chlo ramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414), die β-Galactosidase, ganz be sonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907)
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsge mässen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sam brook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzen transformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch trans formierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selek tionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Bei spiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglu cose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).

Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höhe ren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig inte grierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer kor rekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Ver wendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spe zifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifi schen DNA-Sequenzen wird ausserhalb der zu integrierenden DNA-Se quenz, d. h. ausserhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokali siert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombi nase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezi fischen Sequenzen können die zufällg insertierten Sequenzen her ausgeschnitten oder durch Inversion inaktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekom binationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E.coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletie ren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesy stem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.)

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tu mefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octo pin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Termina tor.

Die erfindungsgemässen Expressionskassetten oder von ihnen abge leitete Vektoren können funktionelle Äquivalente zu der unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen Sequenz des Promotors des MYB11-Trans kriptionsfaktors aus Arabidopsis thaliana enthalten. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang der durch SEQ ID NO: 1 definierten Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promoto raktivität aufweisen.

Funktionelle Äquivalente meint zunächst DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz oder der zu ihr komplementären Nukleinsäure sequenz hybridisieren und die im wesentlichen die gleichen Promo toraktivitäten wie durch SEQ ID NO: 1 beschriebene Nukleinsäure sequenz haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybri disierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von sol chen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevor zugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3M Natriumcitrat, 3M NaCl, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parame ter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausge führt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4X SSC bei 65°C, oder
- b) 6X SSC bei 45°C, oder
- c) 6X SSC bei 68°C, 100 µg/ml denaturierter Fischsperma- DNA, oder
- d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
- e) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C.
- f) 50% Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder
- g) 50% (vol/vol) Formamid, 0.1% Rinderserumalbumin, 0.1% Ficoll, 0.1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrate bei 42°C, oder
- h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedin gung), oder
- i) 30 bis 40% Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
2. Waschschritte mit zum Beispiel
- a) 0.015 M NaCl/O.0015 M Natriumcitrat/0.1% SDS bei 50°C; oder
- b) 0,1X SSC bei 65°C, oder
- c) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
- d) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
- e) 0,2X SSC, 0.1% SDS bei 42°C, oder
- f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Erfindungsgemäss bevorzugt ist der Einsatz solcher Nukleinsäuren in den Expressionskassetten oder von ihnen abgeleiteten Vektoren, die mit der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen doppelsträngigen DNA- Sequenz oder Fragmenten derselben, wie zum Beispiel den mit SEQ ID NO: 2 und 15 bis 19 beschriebenen doppelsträngigen DNA-Sequen zen, unter den oben definierten Bedingungen hybridisieren und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie aufweisen.

Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man ferner insbeson dere auch natürliche oder künstliche Mutationen des unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen mybll-Promotors sowie seine Homologen aus an deren Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin eine Expres sion in der pflanzlichen embryonalen Epidermis und/oder Blüten initiieren können. Mutationen umfassen Substitutionen, Additio nen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleo tidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der mybll-Promotor-Nukleotidsequenz erhält gemäss SEG ID NO: 1. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz auf be stimmte regulatorische Elemente oder z. B. auch die Einfügung wei terer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssi ger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel wei terer regulatorischer Sequenzen, sein.

Die Eingrenzung der Sequenz auf bestimmte, essentielle regulato rische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promoterelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Compu terprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regula tory DNA Elements") vorgenommen werden (K. Higo et al., (1999) Nu cleic Acids Research 27: 1, 297-300).

Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Trans itionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich be kannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Re striktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhän gen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnis sen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Ge netics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung fol gender Parameter berechnet wird:

Gap Weight:	12
Length Weight:	4
Average Match:	2,912
Average Mismatch:	-2,003

Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 20% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obi gem Parametersatz eine Homologie von mindestens 20% aufweist.

Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer der in den erfin dungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kom menden Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Inser tion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von min destens 20%, bevorzugt 40%, vorzugsweise mindestens 60%, be sonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt min destens 90%, und zeichnen sich durch eine im wesentlichen glei che Transkriptionsaktivität im Vergleich zu der myb11-Promotorse quenz gemäss SEQ-ID NO: 1 aus.

Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemässen Expressions kassetten oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden Promo torsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Orga nismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, So lanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Da tenbanken leicht auffinden.

Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangspromotor, abgeschwächt oder verstärkt ist.

Als weitere geeignete funktionell äquivalente Expressionskasset ten sind Sequenzen zu nennen, die unter Kontrolle der Promotorse quenz ein Fusionsprotein exprimieren, wobei ein Bestandteil des Fusionsproteins die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, der an dere eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Genprodukt an den gewünschten Wirkort lei tet, ist.

Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette er folgt beispielsweise durch Fusion des myb11-Promotors gemäss SEQ-ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalentes mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloropla stenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, so wie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwen det man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrie ben sind.

Die Spezifität der erfindungsgemässen Expressionskonstrukte und Vektoren für die pflanzliche, embryonale Epidermis und die Blüte ist besonders vorteilhaft. Die pflanzliche Epidermis stellt so wohl die primäre Barriere als auch die wesentliche Kontaktfläche des pflanzlichen Organismus zu seiner Umwelt dar. Sie hat eine bedeutende Funktion beim Schutz der Pflanze gegen biotische und ablotische Stressfaktoren. Biotische Stressfaktoren können Patho gene, Verbiss durch Tiere etc. sein, ablotischer Stress kann Hitze, Kälte, Trockenheit, UV-Licht etc. sein. Die Epidermis hat ferner eine Funktion im Anlocken von Nutzinsekten durch Pigmen teinlagerung oder Synthese flüchtiger Chemikalien, sie gewährt mechanische Stabilität und verhindert den Wasserverlust. Die Epi dermis hat im Samenembryo darüber hinaus eine essentielle Rolle bei der Aufnahme von Wasser, Gasen und Nährstoffen.

Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Bei spiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren, oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kon trolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expres sion einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Pro motors (Broglie et al., Science 1991, 254, 1194-1197).

Kälteeinbrüche in der Blütezeit führen jedes Jahr zu erheblichen Ernteverlusten. Eine gezielte Expression schützender Proteine ge zielt in der Blüteperiode kann einen Schutz gewähren.

Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu exprimie renden Nukleinsäuresequenz vor allem in der äussersten Hülle der Pflanze, der Epidermis, oder der Blüte vorteilhaft. Eine konsti tutive Expression in der gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Verdünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw. die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchti gen. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression ver stärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing"). Hierzu sind Promotoren mit Spezifität für die embryonale Epider mis und/oder die Blüte vorteilhaft.

Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren re kombinante Expression in der embryonalen Epidermis oder der Blüte vorteilhaft sind. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Ge nen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteil hafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen: Das Er zielen einer Resistenz gegen ablotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV-Strah lung) und biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten), die Verbesserung von Nahrungs- oder Futterei genschaften, die Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertra ges, das Erzielen einer längeren oder früheren Blütezeit, die Veränderung oder Verstärkung des Duftes oder des Farbgebung der Blüten. Für die in diesen Anwendungen einsetzbaren Nukleinsäure sequenzen oder Polypeptide seien beispielhaft aber nicht ein schränkend zu nennen:

1. Verbesserter UV-Schutz des pflanzlichen Embryos durch Verän derung der Pigmentierung durch Expression bestimmer Polypep tide wie Enyzme der Flavonoidbiosynthese wie die Chalconsynt hase oder die Phenylalaninammonialyase oder bestimmter Enyzme der DNA-Reparatur wie der Photolyase (Sakamoto A et al., DNA Seq. 1998; 9(5-6): 335-40). Besonders bevorzugt sind Nuklein säuren, die für die Chalconsynthase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: M20308), die 6-4 Photolyase aus Arabidop sis thaliana (GenBank Acc.-No.: BAB00748) oder den Blaulicht- Photorezeptor/Photolyase Homolog (PHH1) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U62549) oder funktionelle Äquiva lente derselben kodieren.
2. Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos oder der Blüte gegen ablotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxo cephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Trans kriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinasege nen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyl transferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotech nology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREBIA-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Manni tol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den trans kriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myo xocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
3. Modifikation der Speicherreserven, zum Beispiel Stärke- oder Lipidmodifikation, durch Expression von bestimmten Enzymen zur Initiierung von Fermentationsprozessen nach dem Maischen des Saatgutes. Vorteilhaft ist hier besonders die in dem in takten Saatkorn unterschiedliche Kompartimentierung der Spei cherreserven im Samenkorn und der zu exprimierenden Enzyme in der Epidermis, die erst durch einen Prozess wie das Maischen miteinander in Kontakt gebracht werden. Beispiele sind eine verbesserte Mobilisierung der Stärke durch Expression einer Stärkeinvertase aus Hefe oder die Modifikation des Lipidge haltes durch Expression von Lipasen, bevorzugt von Triacyl glycerol-Lipasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren die für das tglA Gen der Triacylglycerol-Lipase aus Aspergillus oryzae (GenBank Acc.-No.: AB039325) oder die SUC2 Invertase aus Saccharomyces cerevisiae (GenBank Acc.-No.: V01311) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
4. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von- Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäu ren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodie rende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äqui valente derselben.
5. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der Epi dermis des Embryos. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Nematodenabwehr), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-in aktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanz lichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellen Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Bei spiel T4 Lysozym oder Lysozm aus verschiedenen Säugern, in sektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsi ninhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.- No.: S78423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktio nelle Cytochrom P-450 (CYP79) aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
6. Erreichen einer Insektenabwehr oder -anlockung zum Beispiel durch erhöhte Freisetzung flüchtiger Duft- oder Botenstoffe durch zum Beispiel Enzyme der Terpenbiosynthese.
7. Erreichen einer Speicherfähigkeit in den Epidermiszellen, die normalerweise keine Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevor zugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
8. Expression von Transportproteinen, die die Aufnahme von Meta boliten, Nährstoffen oder Wasser in den Embryo verbessern und so das Embryonenwachstum, die Metabolitenzusammensetzung oder den Ertrag optimieren, zum Beispiel durch Expression eines Aminosäuretransporters, der die Aufnahme von Aminosäuren beschleunigt, oder eines Monosaccharid-Transporters, der die Aufnahme von Zuckern fördert. Bevorzugt bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den kationische Aminosäure-Transporter aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X92657) oder für den Monosaccharid-Transporter aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc.-No.: AJ002399) oder funktionelle Äquivalente der selben kodieren.
9. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemika lien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotiniden in der Epidermis des Samens bewirken. Beispielhaft sei die Phy toendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus(GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben ko dieren.
10. Modifikation der Wachsesterbildung oder der Zusammensetzung der eingelagerten Oligosaccharide zur Verbesserung des Schut zes gegen Umwelteinflüsse oder zur Verbesserung der Verdau barkeit beim Einsatz in Futter- oder Nahrungsmitteln. Bei spielhaft sein die Überexpression der Endoxyloglucantransfe rase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Endo xyloglucantransferase (EXGT-A1)aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc.-No.: AF163819) oder funktionelle Äquivalente dersel ben kodieren.
11. Verlängern oder Aufheben der Ruhephase durch Expression von Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von Dormanz-re levanten Genen eingreifen. Beispielhaft sei die Überexpres sion des ABI3 Proteins (abscisic acid insensitive gene) oder des Viviparous-1 Protein (VP-1) zu nennen. Die Keimzeitverän derung kann eine Ertragserhöhung und eine verkürzte Embryo nalentwicklung bedingen. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das Viviparous-1 Protein aus Zea mays (GenBank Acc.-No.: M60214) oder das ABI3 Protein (abscisic acid insensitive gene) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X68141) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
12. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Be fruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe der Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins in Blüten und im Samen.
13. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel polyungesät tigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäu ren (z. B. das methioninreiche 25 Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 25 Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakura dani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5-Desaturase aus Cae norhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäuredesaturase (des-5) aus Caenor habditis elegans (GenBank Acc.-No.: AF078796), die Δ5-Desatu rase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beau doin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente der selben kodieren.
14. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92.
15. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln auf Samenba sis durch zum Beispiel Expression von antisense-Transkripten der Coffeinsäure-O-methyltransferase oder des Cinnamoylalko holdehydrogenase Gens.
16. Inhibition der Reifung der Samenhülle durch Expression von zum Beispiel Ribonukleasegenen oder Transkriptionsfaktoren zum Erzielen einer erhöhten Samengrösse, zur Reduktion der relativen Biomasse der Samenhülle und zur Erleichterung der Enthüllung des Samens. Beispielhaft sei hier eine Überexpres sion des ANT (AINTEGUMENTA) Gens genannt. Bevorzugt sind Nu kleinsäuren, die für das AINTEGUMENTA Gen aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U40256) oder funktionelle Äquiva lente desselben kodieren.

Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.

Funktionelle Äquivalente meint hier - analog zu der Definition der funktionellen Äquivalente des Promotors mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte - all die Sequenzen, die die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signal transduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Äquivalent sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine hö here oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funk tionalitäten verfügen.

Funktionelle Äquivalente meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren.

Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch anti sense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(4): 1495-500). Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organis men, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen Ex pressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungs gut abgeleitet von solchen Organismen.

Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryo tische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroor ganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mi kroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.

Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Er winia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobak terien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.

Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacte rium tumefaciens.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu rospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 be schriebene Pilze.

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganis men sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflan zen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgelei tete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkultu ren. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwick lungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen in der embryonalen Epidermis und vor allem der Blüte ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuck pflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträu chern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.

Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.

Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja; Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz beson ders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; die Fa milie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz be sonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr; die Familie der Leguminosae, be sonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Soja bohne) und andere mehr; und die Familie der Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art Sativa (Salat) und andere mehr.

Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere aus gewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Ge treidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungs gemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter diko tylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Ka rotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Wein species.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin wei tere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Bei- spiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.

Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.

Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtzelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA bespielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfol gen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Ein führung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elek trischen Impuls permeabilisert werden.

Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation ge nutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentrans formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trocke ner Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.

Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Trans formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Ge nom der Pflanzenzelle integriert.

Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.

Die Einführung einer erfindungsgemässen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. Vektoren können bei spielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacte rien sein.

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expres sionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzli che Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transfor mierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen ver schiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikati onsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.

Die Expressionskassete kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transfor mierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombi nante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen.

Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.

Transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA inte griert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untrans formierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Mar ker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann bei spielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibio tika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Her bizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21(5): 871-884), das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.

Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrie ren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or in termediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flan kierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette ver bunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vekto ren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizie ren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transfor miert werden (Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion trans formierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertra gung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzli cher Zellen verwendet werden.

Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U. S. A.).

Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanz liche Explantate mit Agz-obacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert, Ausgehend von infiziertem Pflanzenmate rial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protopla sten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel An tibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen ent halten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsge mässen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herizid) oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Der Se lektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen soll ten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) be schrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefa ciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermeh rung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsme thoden ermittelt werden.

Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transge nen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermit tel verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressions kassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinche mikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüch tet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsme dium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Toco trienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Ver fahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Anti körpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92.

Sequenzen

1. SEQ ID NO: 1 Promotor and 5'-untranslatierte Region des Ara bidopsis thaliana myb11 Gens.
2. SEQ ID NO: 2 203Sbp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens.
3. SEQ ID NO: 3 Oligonukleotid-Primer, oligo-(dT) Primer
4. SEQ ID NO: 4 Oligonukleotid-Primer
5. SEQ ID NO: 5 Oligonukleotid-Primer
6. SEQ ID NO: 6 Oligonukleotid-Primer
7. SEQ ID NO: 7 Oligonukleotid-Primer
8. SEQ ID NO: 8 Oligonukleotid-Primer, Vorwärts-Primer Z17F2
9. SEQ ID NO: 9 Oligonukleotid-Primer, Rückwärts-Primer Z17R3
10. SEQ ID NO: 10 Oligonukleotid-Primer, PCR-Adaptorprimer 1
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotid-Primer, myb11-Vorwärts-Primer
12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotid-Primer, myb11-Rückwärts-Primer
13. SEQ ID NO: 13 Oligonukleotid-Primer
14. SEQ ID NO: 14 Oligonukleotid-Primer
15. SEQ ID NO: 15 888bp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens.
16. SEQ ID NO: 16 282bp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens
17. SEQ ID NO: 17 1394bp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens
18. SEQ ID NO: 18 1191bp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens
19. SEQ ID NO: 19 665bp-Fragment von Promotor and 5'-untransla tierter Region des Arabidopsis thaliana myb11 Gens

Abbildungen

Die folgenden Abbildungen zeigen in-situ Hybridisierungen von un terschiedlichen pflanzlichen Organen zu unterschiedlichen Ent wicklungszeitpunkten:

1. Fig. 1 (I und II) zeigen einen Schnitt durch ein Samenkorn und damit durch den pflanzlichen Embryo (Arabidopsis tha liana). "in" bezeichnet das Integument, "h" das Hypokotyl, "c" das Keimblatt und "r" die Wurzel. Fig. 1 (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig. 1 (II) verdeutlicht die Expressionsregion des myb11-Promotors, die entlang der weissen, gestrichelten Linie (markiert durch den weissen Pfeil) verläuft. Diese Region entspricht der embryo nalen Epidermis.
2. Fig. 2 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die pflanzliche Blütenknospe (Arabidopsis thaliana). "sp" bezeichnet die Nar benpapillen (englisch: stigmatic papilla), "w" die Ovarien wand, "st" das Stigma, "pl" die Placentae (Nährgewebe) und "ov" das Ei. Fig. 2 (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig. 2 (II) verdeutlicht die Expres sionsregion des myb11-Promotors, die stark in den schraffier ten Regionen, weniger stark in den punktierten Regionen zu finden ist. Diese Regionen entsprechen zum einen der Ovarien wand, zum anderen den Ovarien selber.
3. Fig. 3 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die Ovarienanla gen von Arabidopsis thaliana. "al" bezeichnet den Pollensack (englisch: anther locules), "g" das Gynoecium, "op" die Eian lagen (englisch: ovule primordia) und "sp" ein Blütenblatt (Sepale). Fig. 3 (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig. 3 (II) verdeutlicht die Expressionsre gion des myb11-Promotors, die in den weiss-schraffierten Re gionen (markiert durch weisse Pfeile) zu finden ist. Diese Regionen entsprechen den Eianlagen.
4. Fig. 4 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die pflanzlichen Blütenanlagen (Arabidopsis thaliana). "im" bezeichnet das Blütenmeristem (tunica). Die Zahlen 2 und 6 beschreiben Blüten im Blütenentwicklungsstadium 2 bzw. 6 (Arabidopsis At las of Morphology, Bowman J ed., Springer Verlag, New York, USA, 1995). Fig. 4 (II) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig. 4 (I) verdeutlicht die Expres sionsregion des myb11-Promotors, die in den weiss-schraffier ten Regionen zu finden ist. Diese Regionen entsprechen dem Blütenmeristem und der Blütenspitze (Entwicklungsstadium 2) bzw. der Staubblattanlage und den Blütenblattprimordien (Ent wicklungsstadium 6).
5. Fig. 5 (I) zeigt eine schematische Darstellung der Expression im Blütenstadium 2. "fa" bezeichnet die Blütenspitze (floral apex). Die Expressionsregion des mybll-Promotor ist in der schraffierten Region zu finden. Fig. 5 (II) zeigt eine sche matische Darstellung der Expression im Blütenstadium 6. "p" bezeichnet das Blütenblattprimordium, "ms" bezeichnet die Staubblattanalge), "g" das Gynoecium. Die Expressionsregion des myb11-Promotor ist in der schraffierten Region zu finden
6. Fig. 6: Gezeigt ist das Ergebnis einer RT-PCR unter Verwen dung verschiedener Gewebe zur Bestimmung des Expressionsmu sters des mybll Promotors. Die Expression ist im Sämling (Tag 4), der Blütenknospe, Blüte und welkenden Blüte, sowie den grünen Schoten nachzuweisen.
7. Fig. 7: Schematische Darstellung der Vektoren pCR-TOPO-myb11 (I), pGPTV-myb11::GUS (II), pGPTV1-myb11::GUS (III) und pGPTV2-myb11::GUS (IV). Die Pfeilrichtung gibt die Orientie rung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
myb11: Promotor oder Promotorfragment des myb11 Promotors
NOS-T: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS)
GUS: Reportergen (bakterielle β-Glucuronidase)
8. Fig. 8: Schematische Darstellung der Vektoren pGPTV3- myb11::GUS (V), pGPTV4-myb11::GUS (VI), pGPTVS-myb11::GUS (VII) und pGPTV6-myb11::GUS (VIII). Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben fol gende Bedeutung:
myb11: Promotor oder Promotorfragment des myb11 Promotors
NOS-T: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS)
GUS: Reportergen (bakterielle β-Glucuronidase)
9. Fig. 9: Schematische Darstellung der Vektoren pBSK-myb11 (IX) und pBM-myb11 (X). Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
myb11: Promotor oder Promotorfragment des myb11 Promotors

Beispiele Allgemeine Methoden

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektropho rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Frag menten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequen zierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluo reszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von San ger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Wachstumsbedingungen der Pflanzen für gewebsspezifi sche RT-PCR Analyse

Um 4 bzw. 7 Tage alte Keimlinge zu erhalten, werden jeweils unge fähr 400 Samen (Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia) oberflächig mit einer 80%igen Ethanollösung für 2 Minuten sterilisiert, mit einer Natriumhypochloritlösung (0.5% v/v) 5 Minuten behandelt, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4°C für 4 Tage inkubiert, um eine gleichmässige Keimung sicherzustellen. Anschliessend werden die Samen auf Petrischalen mit MS Medium (Sigma M5519) unter Zusatz von 1% Saccharose, 0.5 g/l MES (Sigma M8652), 0.8% Difco-BactoAgar (Difco 0140-01), pH 5.7 inkubiert. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht/8-stündigen Dunkelheitszyklus (Philips 58W/33 Weisslichtlampen) bei 22°C gezüchtet und nach 4 bzw. 7 Tagen nach Beginn der Keimphase geerntet.

Für die Gewinnung von Wurzeln werden 100 Samen wie oben beschrie ben sterilisiert, bei 4°C 4 Tage inkubiert und dann in 250 ml Fla schen mit MS Medium (Sigma M5519) unter Zusatz von weiteren 3% Saccharose und 0.5 g/l MES (Sigma M8652), pH 5.7 gezüchtet. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht-/8-stündigen Dun kelheitszyklus (Philips 58 W/33 Weisslichtlampen) bei 22°C, 120 U/min gezüchtet und nach 3 Wochen geerntet. Für alle anderen verwendeten pflanzlichen Organe werden die Samen auf Einheitserde (Typ VM, Manna-Italia, Via S. Giacomo 42, 39050 San Giacomo/ Laives, Bolzano, Italien) ausgesäht, 4 Tage bei 4°C inkubiert um eine gleichmässige Keimung zu gewährleisten und dann in einem 16-stündigen Licht-/8-stündigen Dunkelheitszyklus (OSRAM Lumi lux Daylight 36 W/12 Leuchtstoffröhren) bei 22°C gezüchtet. Junge Rosettenblätter werden im 8-Blattstadium (nach 3 Wochen) geern tet, reife Rosettenblätter werden nach 8-Wochen kurz vor der Stengelbildung geerntet. Blütenstände (Apices) der ausschießenden Stengel werden kurz nach dem Ausschießen geerntet. Stengel, Sten gelblätter und Blütenknospen werden in der Entwicklungsstufe 12 (Bowmann J (ed.), Arabidopsis, Atlas of Morphology, Springer New York, 1995) vor der Staubblattentwicklung geerntet. Geöffnete Blüten werden in Stadium 14 sofort nach der Staubblattentwicklung geerntet. Welkende Blüten werden in Stadium 15 bis 16 geerntet. Die verwendeten grünen und gelben Schoten hatten eine Länge von 10 bis 13 mm.

Beispiel 2 RNA Extraktion und RT-PCR Analyse

Gesamt-RNA wird aus den in Beispiel 1 beschriebenen Organen der Pflanze zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung wie be schrieben isoliert (Prescott A, Martin C Plant Mol Biol Rep 1987, 4: 219-224). Die Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wird verwendet, um das Atmybll Gentranskript nachzuwei sen. Alle RNA Proben werden mit DNaseI (15 Units, Boehringer, Mannheim) vor der cDNA Synthese behandelt. Die Erststrang cDNA Synthese wird ausgehend von 6 µg Gesamt-RNA mit einem oligo-(dT) Primer und RT Superscript^TMII Enzym (300 Units) nach Angaben des Herstellers in einem Gesamtvolumen von 20 µl (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Zur RNA werden dazu 150 ng oligo-(dT) in einem Endvolumen von 12 µl gegeben. Der Ansatz wird für 10 min bei 70°C erhitzt und anschließend sofort auf Eis ge kühlt. Dann werden 4 µl des 5X Erststrangpuffers, 2 µl 0.1M DTT, 1 µl 10 mM dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und RNase Inhibitor (5 Units, Böhringer Mannheim) zugegeben. Der An satz wird für 2 min auf 42°C erhitzt, RT Superscript™ Enzym (300 Units, Life Technologies) zugegeben und für 50 min bei 42°C inkubiert. Als oligo-(dT)Primer wird ein 35-Basen langes Oligo nukleotid mit 17 dT Resten und einer Adaptorsequenz verwendet (Frohman MA (1990) Academic Press, San Diego, CA. pp. 28-38):

5'-GGGAATTCGTCGACAAGC(T)₁₇-3') (SEQ ID NO: 3)

Die Erststrang-cDNA wird als Matrize für die PCR verwendet. Für die PCR werden die folgenden Primer verwendet:

Vorwärts-Primer Z17F2: 5'-GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3' (SEQ ID No: 8)

Rückwärts-Primer Z17R3: 5'-TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 9)

Der PCR-Reaktionsansatz setzt sich zusammen wie folgt:
2.5 µg Erststrang-cDNA
1X PCR Buffer II Perkin Eimer (Warrington, UK)
2.5 mM mM MgCl₂
200 µM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
0.5 µM von jedem der Oligonukleotid-Primer Z127F2 und Z17F3 (SEQ-ID No.: 8 und 9)
2.5 Units AmpliTaq (Perkin Eimer)
dest. Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 µl.

Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts):
1 Zyklus mit 150 sec bei 94°C
20 Zyklen mit 94°C für 45 sec, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min.
1 Zyklus mit 72°C für 7 min

Um eine Linearität des Amplifikationsprozesses zu gewährleisten, werden lediglich 20 PCR-Zyklen durchgeführt. Die PCR Produkte werden mittels 2% w/v Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Hybond N+ Nylonmembran (Amersham, England) geblottet und mit Fluorescein-markierten Sonden hybridisiert. Die Herstellung der Sonden sowie die Detektionsreaktion erfolgt wie im Herstellerpro tokoll der Firma Amersham angegeben. Die Standardisierung der Methode wird mittels Verwendung von Primern spezifisch für das Arabidopsis ACT1 Gen, das für Actin kodiert (An YQ et al. Plant Cell 1996, 8: 15-30), verifiziert. Für die mRNA Detektion von At MYB11 werden die folgenden Primer verwendet:

Vorwärts-Primer Z17F2: 5'-GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3' (SEQ ID NO: 8)

Rückwärts-Primer Z17R3: 5'-TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 9)

Die Grösse des amplifizierten PCR-Produktes beträgt 562 bp. Die PCR-Reaktion wird nur über 25 Zyklen bei den oben genannten Be dingungen durchgeführt. (EMBL AF062863; Kranz et al., 1998). Das Ergebnis der RT-PCR Analyse ist in Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 3 Analyse der Atmyb11 Expression durch in situ Hybridi sierung

Blüten und Schoten werden zu unterschiedlichen Entwicklungstadien von 7-Wochen alten Pflanzen, die auf Erde wie oben beschrieben gehalten werden, gesammelt. Die Proben werden sofort in frisch bereiteter 4% p-Formaldehydlösung in PBS Puffer (130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄) unter Vakuum für 3 Stunden fixiert. Das fixierte Material wird in 70% Ethanol bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Fixierungs- und Einbettungsarbeiten werden nach der Vorschrift von Dolfini et al durchgeführt (Dolfini S et al., Dev. Genet. 1992, 13, 264-276) mit der Abwandlung, dass je der beschriebene Schritt auf eine Dauer von 1 Stunde verkürzt wurde. Die Matrize für die Probe zur in-situ Hybridisierung wird hergestellt wie in der Anleitung des Lig'nScribe^TM PCR Promoter Addition Kit (Ambion, USA) beschrieben. Dazu werden 20 ng des PCR-Fragments, das mit den Primern Z17F2 und Z17R3 ausgehend von einem partiellen cDNA Klon des AtMYB11 Gens (EMBL AF062863; Kranz et al., 1998 erhalten wird (s. oben), entgegen seiner Leserichtung hinter einen T7 Promotoradapter kloniert (Ambion, USA). Diese Ligationsreaktion enthält 1 µl des 10X Ligationspuffers, 1 µl des Promotoradapters, 1 µl T4 DNA Ligase und destilliertes Wasser in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Die Ligationsreaktion wird für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Matrize für den Antisense Strang der AtMYB11 Sonde wird mittels PCR unter Verwendung eines Teils der Ligationsreaktion und der Primer Z17F2 (SEQ ID NO: 8) sowie Ambion PCR Primer 1 durchgeführt. Dazu werden 2 µl der Ligationsreaktion und die Primer Z17F2 und der PCR-Adaptorprimer 1

PCR-Adaptorprimer 1: 5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG-3' (SEQ ID NO: 10)

gemischt. Die Primer Z17R3 und PCR-Adaptorprimer 1 werden zur Herstellung der Matrize für den Sense-Strang der AtMYB11 Sonde verwendet. Die PCR Bedingungen zur Herstellung der Matrizen für die Antisense und Sense-Stränge der AtMYB11 Sonden sind identisch und werden unter den in Beispiel 2 beschrieben Bedingungen durch geführt. Abweichend davon werden 35 Zyklen durchgeführt und le diglich eine Konzentration von 0.25 mM der eingesetzten Primer verwendet. Sense und Antisense DIG-11-UTP markierte RNA Sonden werden unter Verwendung der T7 RNA Polymerase mit Reagenzien von Roche Diagnostics synthetisiert: Folgende Komponenten werden in einem RNase-freien Eppendorfgefäß, welches auf Eis gehalten wird, in der angegebenen Reihenfolge gemischt. Angegeben ist jeweils die Endkonzentration in einem Reaktionsvolumen von 20 µl. 0,1 µg Ethanol-gefälltes PCR-Produkt, l × Markierungsmischung (als 10 × Mischung mit 10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP; 6.5 mM UTP, 3.5 mM DIG- UTP in Tris-HCl, pH 7,5), 1 × Transkriptionspuffer (als 10 × Puffer mit 400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 60 mM MgCl₂, 100 mM Dithioerythritol, 20m M Spermidin, 100 mM NaCl, 1 unit/ml RNase Inhibitor) und 40 Einheiten T7 RNA Polymerase. Der Ansatz wird kurz schüttelnd ge mischt und wenige Sekunden zentrifugiert. Anschließend wird der Ansatz für mindestens 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zum Verdau des DNA-PCR-Produktes werden 20 Einheiten DNase zugegeben und für 15 min bei 37°C inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion werden 2 µl der mitgelieferten EDTA-Lösung hinzu gegeben.

8 µm dicke Schnitte des fixierten Pflanzenmaterials werden durch ein Mikrotom unter Verwendung von Miktotomklingen Typ S35 (Fea ther, Japan) geschnitten (Minot-Mikrotom Typ 1212; Leitz Wetzlar, Germany), auf poly-L-Lysin-beschicktete Objektträger aufgebracht und behandelt wie bei Coen et al. beschrieben (Coen Es et al., Cell 1990, 63: 1311-1322). Vor der Hybridisierung werden die Schnitte in Xylen eingelegt um das Paraffin zu entfernen und an schliessend mit einer Serie an Ethanolverdünnungen rehydrati siert. Es folgt eine Inkubation mit 1 µg/ml Proteinase K für 30 min bei 37°C in 100 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM EDTA. Anschliessend wird mit Acetanhydrid acetyliert, mit einer Verdünnunsgreihe von Ethanol dehydriert und an der Luft getrocknet. Die DIG-11-UTP markierten RNA-Sonden werden einer milden alkalischen Hydrolyse unter Erwärmen auf 60°C für eine Stunde in 100 mM Carbonatpuffer (pH 10.2) ausgesetzt, um eine durchschnittliche Fragmentlänge von ungefähr 150 Basen zu erreichen.

Ungefähr jeweils 20 ng der DIG-11-UTP markierten RNA-Sonde in 50 µl auf 70°C vorgewärmtem Hybrisierungspuffer (50% Formamid, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1X Denhardts, 10% Dextransulfat, 10 mM DTT, 250 ng/ml tRNA, 100 µg/ml polyA) werden für jeden Objektträger verwendet und mit der Gewebeprobe bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Träger werden 45 min in 2X SSC (20X SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0) bei Raumtempera tur, 45 min in 2X SSC bei 55°C, 45 min in 0.5X SSC bei 55°C gewa schen und dann mit 20 µg/ml RNase A in NTE (0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) bei 37°C für 30 min behandelt. Anschliessend werden die Träger erneut 15 min in 2X SSC bei Raum temperatur und 15 min in 2X SSC bei 50°C gewaschen. Die immunolo gische Detektion der Sonde wird gemäss Anleitung des "digoxige nin-nucleic acid detection kit" (Roche Diagnostics) realisiert: Dazu werden die Träger unter sanfter Bewegung für 1 Stunde in 1%iger Blockierungslösung (Roche Diagnostics) in 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl und anschliessend 30 min in Puffer A (0.5% Rinderserumalbumin, 0.3% Triton-X100, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl) inkubiert. Anschliessend werden die Träger mit dem Antikörperkonjugat in einer 1 12612 00070 552 001000280000000200012000285911250100040 0002010053519 00004 12493 : 1500 Verdünnung in Puffer A inku biert und dreimal für 20 min in 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl gewaschen. Die Träger werden dann für 5 min in 100 mM Tris- HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂ gewaschen und für 48 Stun den in einer Lösung aus 0.34 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz und 0.175 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphattoluidiniumsalz in 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl und 50 mM MgCl₂ inkubiert. Die Farbreaktion wird mit 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA ge stoppt und die Schnitte unter leichten Schütteln in 95% Ethanol, dann mit einer Ethanol-Verdünnungsreihe und abschliessend mit sterilem Wasser gewaschen bevor sie mit Euparal (BDH) gefestigt werden. Anschliessend wird das Gewebe unter einem geeigneten Mikroskop (z. B. Leica DMRB) mit Kamera dokumentiert.

Beispiel 4 Klonierung des AtMYB11 Promotors

Um den vollständigen AtMYBll Promoter zu isolieren, wird genomi sche DNA aus Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) extrahiert wie beschrieben (Galbiati M et al. Funct. Integr Genomics 2000, 1: 25-34). Die isolierte DNA wird als Matrizen-DNA in einer PCR unter Verwendung folgender Primer eingesetzt:

Vorwärts-Primer: 5'-AAGCTTTTGATTTTACAATGAGG-3' (SEQ ID NO: 11)

Rückwärts-Primer: 5'-CCCGGGAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 12)

Die Amplifikation wird wie folgt durchgeführt:
80 ng genomische DNA
1X Expand^TM Long Template PCR Puffer 1
2.5 mM MgCl₂,
je 350 µM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
je 300 nM eines jeden Primers (SEQ ID NO: 11 und 12)
2.5 Units Expand™ Long Template Polymerase (Roche Diagno stics).
in einem Endvolumen von 25 µl.

Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts):
1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C
35 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 55°C für 30 sec und 68°C für 3 min.
1 Zyklus mit 68°C für 30 min

Das PCR-Produkt wird in den Vektor pCR4-TOPO (Invitrogen) nach Herstellerangaben kloniert d. h. das erhaltene PCR-Produkt wird mittels seiner A-Überhänge und einer Topoisomerase in einen Vek tor mit T-Überhängen eingefügt. Das erhaltene Konstrukt ist pCR4-TOPO-myb11 (Fig. 7, I).

Beispiel 5 Deletionsanalyse

Das Verfahren ist von Rouster (Rouster J et al., Plant Journal 11(3): 513-23, 1997) und Sambrook (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben.

Eine Feinkartierung des myb11 Promotors, d. h. eine Einengung der für seine Spezität relevanten Nukleinsäureabschnitte, erfolgt durch Herstellung verschiedenen Reportergen-Expressionsvektoren, die zum einen den gesamten Promotorbereich, zum anderen verschie dene Fragmente desselben enthalten. Kloniert wird einerseits die gesamte Promotorregion bzw. Fragmente davon in den pGPTV-GUS-Kan Vektor (Becker D et al., 1992 Plant Mol Biol 20: 1195-1197). Da für werden einerseits Fragmente eingesetzt, die durch die Verwen dung von Restriktionsenzymen für die internen Restriktions schnittstellen in der Volllängen-Promotorsequenz erhalten werden. Andererseits werden PCR-Fragmente eingesetzt, die mit durch Pri mer eingeführte Schnittstellen versehen sind.

Für die Klonierung des Volllängen-Promotors wird der Vektor pCR4-TOPO-myb11 mit HindIII und SmaI verdaut und das aus einem 1%igen Agarose-Gel isolierte Fragment in den pGPTV-GUS-Kan klo niert. Das erhaltene Konstrukt wird mit pGPTV-myb11::GUS be zeichnet (Fig. 7, Konstrukt II).

Für einen ersten verkürzten Promotor wird pCR4-TOPO-myb11 mit EcoRI verdaut und das aus einem 1%igen Agarosegel isolierte, ca. 2050 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene) subkloniert. Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK myb11 (Fig. 9, Konstrukt IX) durch Verdau mit HindIII und SmaI ge wonnen, über ein 1%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTVI-myb11::GUS (Fig. 7, Konstrukt III).

Für einen zweiten verkürzten Promotor wird pBSK-myb11 mit EcoRV und NcoI verdaut. Überhängende Enden werden mit T4 DNA Polymerase abgedaut und das Plasmid wird mit glatten Enden religiert (wie beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), um pBM-myb11 (Fig. 9, Konstrukt X) zu erhalten. Das ver kürzte Insert wird aus dem Vektor pBM-myb11 durch Verdau mit Hin dlii und SmaI gewonnen, über ein 1%iges Agarose-Gel isoliert und in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Be zeichnung pGPTV2-myb11::GUS (Fig. 7, Konstrukt IV).

Für einen dritten verkürzten Promotor wird pCR4-TOPO-myb11 als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen HindIII und SmaI werden über die folgenden Primer eingeführt

Vorwärtsprimer 5'-AAGCTTAACCAATCAGGATTAAG-3' (SEQ ID NO: 13) und

Rückwärtsprimer 5'-CCCGGGAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 12).

Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV3-myb11::GUS (Fig. 8, Konstrukt V).

Für einen vierten verkürzten Promotor wird pCR4-TOPO-myb11 als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen HindIII und SalI werden über die folgenden Primer eingeführt

Vorwärtsprimer 5'- AAGCTTGCATTATGGATTTTGTA-3' (SEQ ID NO: 14) und

Rückwärtsprimer 5'-GTCGACAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 4).

Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV4-myb11::GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VI).

Für einen fünften verkürzten Promotor wird pCR4-TOPO-myb11 als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen HindIII und XbaI werden über die folgenden Primer eingeführt

Vorwärtsprimer 5'-AAGCTTTGGACAATCATGTCATA-3' (SEQ ID NO: 5) und

Rückwärtsprimer 5'-TCTAGAAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 6).

Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wie derum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTVS-myb11::GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VII).

Für einen sechsten verkürzten Promotor wird pCR4-TOPO-myb11 als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen HindIII und XbaI werden über die folgenden Primer eingeführt.

Vorwärtsprimer 5'-AAGCTTCTAATTAGAGACACTAGG-3' (SEQ ID NO: 7) und

Rückwärtsprimer 5'-TCTAGAAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 6).

Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wie derum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV6-myb11::GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VIII).

Beispiel 6 Transformation und Regeneration transgener Arabidop sis thaliana (Columbia) Pflanzen

Zur Herstellung transgener Arabidopsis Pflanzen wird Agrobacte rium tumefaciens (Stamm C58C1 pGV2260) mit verschiedenen myb11 Promoter-GUS Vektorkonstrukten transformiert. Die Agrobakterien stämme werden anschliessend zur Herstellung transgener Pflanzen verwendet. Dazu wird eine einzelne transformierte Agrobakterium- Kolonie in einer 4 ml Kultur (Medium: YEB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin und 25 µg/ml Rifampicin) über Nacht bei 28°C inkubiert. Mit dieser Kultur wird anschliessend eine 400 ml Kultur in dem selben Medium angeimpft, über Nacht inkubiert (28°C, 220 U/min) und abzentrifugiert (GSA-Rotor, 8.000 U/min. 20 min). Das Pellet wird in Infiltrationsmedium (1/2 MS-Medium; 0,5 g/l MES, pH 5,8; 50 g/l Saccharose) resuspendiert. Die Suspension wird in eine Pflanzenbox (Duchefa) eingebracht und 100 ml SILVET L-77 (mit Polyalkylenoxid modifiziertes Heptamethyltrisiloxan; Osi Special ties Inc., Cat. P030196) wurde zu einer Endkonzentration von 0.02% hinzugegeben. Die Pflanzenbox mit 8 bis 12 Pflanzen wird in einem Exikator für 10 bis 15 Minuten einem Vakuum mit anschlies sender spontaner Belüftung ausgesetzt. Dies wird 2 bis 3 Mal wie derholt. Hernach werden alle Pflanzen in Pflanztöpfe mit Feucht erde gepflanzt und unter Langtagbedingungen gezüchtet (Tagestem peratur 22 bis 24°C, Nachtemperatur 19°C; 65% relative Luft feuchte). Nach 6 Wochen werden die Samen geerntet.

Alternativ können transgene Arabidopsis Pflanzen durch Wurzel transformation erhalten werden. Weisse Wurzelsprossen von maximal 8 Wochen alten Pflanzen werden verwendet. Dazu werden Pflanzen, die unter sterilen Bedingungen in 1 MS-Medium (1% Saccharose; 100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gehalten werden, verwendet. Wurzeln werden auf Kallus-induzierendem Medium für 3 Tage kultiviert (1 × Gambourg's B5 Medium; 2% Glukose; 0,5 g/l Mercaptoethanol; 0,8% Agar; 0,5 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxyes sigsäure); 0,05 mg/l Kinetin). 0,5 cm lange Wurzelabschnitte wer den in 10 bis 20 ml Kallus-induzierendes Flüssigmedium überführt (Zusammensetzung wie oben beschrieben, jedoch ohne Agarzusatz) und mit 1 ml der oben beschriebenen Übernacht-Agrobakterienkultur (gewachsen bei 28°C, 200 U/min in LB) angeimpft und für 2 min ge schüttelt. Die Wurzelexplantate werden nach Entfernen von über schüssigem Medium durch Abtropfen in Kallus-induzierendes Medium mit Agar überführt, anschliessend in Kallus-induzierendes Flüs sigmedium ohne Agar (mit 500 mg/l Betabactyl, SmithKline Beecham Pharma GmbH, München) unter Schütteln inkubiert und abschliessend in Spross-induzierendes Medium (5 mg/l 2-Isopentenyl-Adenin-Phos phat; 0,15 mg/l Indol-3-Essigsäure; 50 mg/l Kanamycin; 500 mg/l Betabactyl) überführt. Nach 5 Wochen und 1 bis 2 maligem Mediums wechsel werden die kleinen, grünen Sprösslinge auf Keimungsmedium (1 MS-medium; 1% Saccharose; 100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gesetzt und zu Pflanzen regeneriert.

Beispiel 7 Nachweis der gewebespezifischen Expression

Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die essen tiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor selbst und verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressionsaktivität ermög licht. Beispielhaft sei die bakterielle β-Glucuronidase genannt (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907). Die β-Glucuroni dase Aktivität kann in-planta mittels eines chromogenen Substra tes wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt werden (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und analysiert wie beschrieben (z. B. Bäum lein H et al., 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128).

Für die quantitative Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die β-Glucuronidase MUG (Methylumbelliferylglucuronid) verwendet, das in MU (Methylumbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird. Unter alkalischen Bedingungen kann diese Spaltung quantitativ fluorometrisch verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei 455 nm; SpectroFluorimeter BMG Polarstar+) wie be schrieben in Bustos M. M. et al., 1989 Plant Cell 1: 839-853.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäu ren enthaltend

a) den Promotor des myb11 Gens aus Arabidopsis thaliana ge mäss SEQ ID NO: 1, oder
b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente von
c) die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzen,

wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimie renden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren ge netischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
c) a) und b) gegeben sind.

3. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 oder 2, da durch gekennzeichnet, dass die zu exprimierende Nukleinsäure sequenz

a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz ko dierten Proteins, oder
b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz ko dierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.

4. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter, Sac charidtransporter, Chalconsynthasen, Photolyasen, Photorezep toren, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol-Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das N-hydroxylierende, multi funktionelle Cytochrom P-450, den transkriptionellen Aktiva tor CBF1, Invertasen, das 2S Albumin aus Bertholletia ex celsa, Endoxylglucantransferasen, Phytoendesaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "antifreeze"-Proteinen, Glu tamatdehydrogenasen, einem späten Embryogenesegen (LEA), Cal cium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Farnesyltrans ferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, DREB1A-Faktor, Trehalose phosphatsynthase, Trehalosephosphatphosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thuringiensis Endotoxin, a-Amy laseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RMAasen, Ribo zyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäureelongasen, Coffeinsäure- O-methyltransferase, Cinnamoylalkoholdehydrogenase, ANT-Gen.

5. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank Ac cession-Nummern X92657, M20308, AJ002399, BAB00748, A19451, U62549, U40256, AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391, AF163819, X78815, AF306348, M60214, X68141, AJ222980, AF078796.

6. Vektoren enthaltend eine Expressionskassette gemäss den An sprüchen 1 bis 5.

7. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressionskas sette gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 oder einem Vekor gemäß An spruch 6.

8. Transgener Organismus nach Anspruch 7 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen.

9. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach den Ansprüchen 7 oder 8.

10. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprü che 7 bis 8 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 9 zur Herstel lung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

11. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemika lien in transgenen Organismen nach einem der Ansprüche 7 oder 8 oder von diesen abgeleiteten Zellkulturen, Teilen oder transgenen Vermehrungsgut nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, dass der transgene Organismus gezüchtet und das ge wünschte Pharmakon oder die gewünschte Feinchemikalie iso liert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürlicher oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.