DE10047528A1 - New conjugate of silicate particles and biomolecule, useful as diagnostic reagent, e.g. in immunoassays, is uniformly dyed throughout its mass - Google Patents

Abstract

Conjugate (A) of silicate particles (I) and biomolecules (II) in which (I) are homogeneously colored throughout. Independent claims are also included for the following: (a) method for producing (A); (b) method for detecting an analyte using (A); and (c) diagnostic reagent, test kit or test strip containing (A).

Description

Die Erfindung betrifft Konjugate aus Silikatpartikeln und Biomolekülen. Die Konjugate sind dadurch gekennzeichnet, dass die Silikatpartikel homogen durchgefärbt sind. Die Er­ findung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung der Konjugate, deren Verwendung in diagnostischen Verfahren, ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe mittels der Konjugate, ein diagnostisches Reagenz, sowie Testkits und Test­ streifen, die die erfindungsgemäßen Konjugate enthalten.The invention relates to conjugates of silicate particles and biomolecules. The conjugates are characterized in that the silicate particles are homogeneously colored. The he The invention also relates to processes for the preparation of the conjugates, their use in diagnostic method, a diagnostic method for the detection of an analyte in a sample using the conjugates, a diagnostic reagent, as well as test kits and test strips that contain the conjugates of the invention.

Gefärbte Partikel auf Silikatbasis sind im Stand der Technik seit langem bekannt. Sie wer­ den in Form von Pigmenten beispielsweise als Färbemittel für Toner und Tinten, für Pla­ stikmaterialien und auch als Markierungs- und Trägermaterialen im medizinisch-techni­ schen Bereich eingesetzt.Colored silicate-based particles have long been known in the art. You who in the form of pigments, for example as colorants for toners and inks, for pla Plastic materials and also as marking and carrier materials in medical technology used area.

In der medizinischen Diagnostik werden häufig Verfahren eingesetzt, in denen ein Analyt in einer vom Körper isolierten Probe nachgewiesen wird. Am Ende aller dieser Testverfah­ ren steht die Detektion des Analyten. Hierzu werden häufig Partikel eingesetzt, die mit einer oder mehreren Substanzen beschichtet sind, die für den Analyten spezifisch sind oder für Substanzen spezifisch sind, die selbst an den Analyten binden. Damit ein Nachweis der erfolgten Bindung an den Analyten beispielsweise durch spektrometrische Messung oder rein optische Wahrnehmung durch die den Test durchführende Person erfolgen kann, be­ sitzen die Partikel eine Färbung. Üblicherweise werden hierfür häufig Goldpartikel einge­ setzt, die in dispergierter Form (Gold-Sol) eine rötliche Färbung besitzen. Auch Latexpar­ tikel werden als gefärbte Partikel eingesetzt.In medical diagnostics, methods are often used in which an analyte is detected in a sample isolated from the body. At the end of all of these test procedures detection of the analyte. Particles are often used for this purpose one or more substances are coated which are specific for the analyte or are specific for substances that bind themselves to the analyte. So that proof of binding to the analyte, for example by spectrometric measurement or purely visual perception by the person performing the test, be the particles sit a color. Gold particles are usually used for this purpose sets that have a reddish color in dispersed form (gold sol). Also latex par particles are used as colored particles.

Für den Einsatz in diagnostischen Testverfahren haben sich in der Vergangenheit auch Partikel auf Silikatbasis als geeignet herausgestellt. In der EP-A-0 250 700 werden zusammengesetzte Partikel beschrieben, die aus mindestens drei Teilen bestehen: einem nicht gefärbten Kern, einer farbstoffhaltigen Schicht und einer nicht gefärbten Ummantelung. Sie werden als immunologisch-diagnostisches Reagenz eingesetzt, wobei sie zuvor mit einem Oberflächenbehandlungsmittel, ausgewählt aus Silankupplungsmitteln und Titan­ kupplungsmitteln, behandelt werden können. Die Anbindung der immunologisch aktiven Substanzen erfolgt physikalisch durch Adsorption oder durch chemische Anbindung über funktionelle Gruppen an der Oberfläche. Die Partikelgröße beträgt 100 nm bis 10 µm. Der Kern und die äußere Hülle besteht aus einem anorganischen Metalloxid der III., IV., VIII. Hauptgruppe oder entsprechenden Mischoxiden mit Elementen der I., II., III., IV. und VIII. Hauptgruppe.In the past, they have also been used in diagnostic test procedures Silicate-based particles were found to be suitable. In EP-A-0 250 700, compositions are described  Particles described that consist of at least three parts: one not colored core, a dye-containing layer and a non-colored coating. They are used as an immunological-diagnostic reagent a surface treatment agent selected from silane coupling agents and titanium coupling agents, can be treated. Linking the immunologically active Substances occur physically through adsorption or through chemical bonding functional groups on the surface. The particle size is 100 nm to 10 µm. The The core and the outer shell consist of an inorganic metal oxide of III., IV., VIII. Main group or corresponding mixed oxides with elements of I., II., III., IV. And VIII. Main group.

Die in der EP-A-0 250 700 beschriebenen Konjugate haben den Nachteil, dass der Farb­ stoff nur in einer dünnen Schicht vorhanden ist. Die Farbstoffmenge kann unter Umstän­ den nicht ausreichend sein, um bei der Detektion eines Analyten eine ausreichend hohe Farbintensität zu erreichen. Außerdem ist der Mehrschicht-Aufbau aufwendig bei der Synthese der Partikel.The conjugates described in EP-A-0 250 700 have the disadvantage that the color fabric is only present in a thin layer. The amount of dye may change which are not sufficient to achieve a sufficiently high level when an analyte is detected Achieve color intensity. In addition, the multi-layer structure is expensive Synthesis of the particles.

Im Patent US 5,102,763 wird die Verwendung von hydrophilen, gefärbten SiO₂-Partikeln für den Einsatz als Toner beschrieben. Diese Partikel werden durch Umsetzung von vorak­ tivierten Silikatpartikeln mit diversen Farbstoffen an der Oberfläche kovalent gefärbt.US Pat. No. 5,102,763 describes the use of hydrophilic, colored SiO ₂ particles for use as a toner. These particles are covalently colored by reacting pre-activated silicate particles with various dyes on the surface.

In der WO 93/10190 wird die Herstellung von gefärbten Partikeln durch eine kovalente Anbindung eines Farbstoffes an die Oberfläche von Partikeln beschrieben.WO 93/10190 describes the production of colored particles by a covalent one Connection of a dye to the surface of particles described.

Die nur an der Oberfläche gefärbten Partikel neigen dazu, durch Abbluten Farbe zu verlie­ ren und somit nicht mehr die gewünschte Farbintensität bzw. keine gleichmäßige Farbin­ tensität mehr zu besitzen. Die Anwendung dieser Partikel für die Herstellung von Konju­ gaten, die für die Diagnostik geeignet sind, wird nicht beschrieben.The particles colored only on the surface tend to give color by bleeding Ren and therefore no longer the desired color intensity or no uniform color to have more intensity. The application of these particles for the production of Konju data that are suitable for diagnostics is not described.

Im US-Patent 5,209,998 wird ein Verfahren zur Herstellung von gefärbten Partikeln mit Silikatoberfläche beschrieben. Das Herstellverfahren basiert auf dem Beschichten farbiger Pigmente mit einer Silikat-Hülle. Diese Partikel sind also nur in ihrem Kern gefärbt. Als Anwendung wird der Einsatz der Partikel in elektrostatischen Tonern, Plastikmaterialien und Tinten beschrieben; eine diagnostische Anwendung wird nicht offenbart.US Pat. No. 5,209,998 describes a process for the production of colored particles Silicate surface described. The manufacturing process is based on coating colored ones Pigments with a silicate coating. These particles are only colored in their core. As  Application is the use of particles in electrostatic toners, plastic materials and inks described; a diagnostic application is not disclosed.

Ein Verfahren zur Herstellung monodisperser Silikatpartikel, d. h. Silikatpartikeln, die von einheitlicher Größe sind, wurde erstmals von Stöber et al. beschrieben (J. Colloid Interface Sci. 26 (1968) 62-69). Die Herstellung der sogenannten Stöber-Partikel und ihre Eigen­ schaften wurden in der Folgezeit durch eine Vielzahl von Arbeitsgruppen eingehend unter­ sucht. Hierzu gehören die Festlegung der Synthesebedingungen zum Erhalt bestimmter Partikelgrößen (Van Helden et al. J. Colloid Interface Sci. 81 (1981) 354-68, H. Giesche, J. European Ceramic Soc. 14 (1994) 189-204, A. von Blaaderen, A. Vrij, Adv. Chem. Ser. 234 (1994) 83-111) sowie Untersuchungen zum Partikelwachstum und der chemischen Zusammensetzung (C. H. Byers et al. Ind. Eng. Chem. Res. 26 (1987) 1916-23; T. Matsoukas, E. Goulari, J. Colloid Interface Sci. 124 (1988) 252--61; T. Harris et al. J. Non- Cryst. Solids 121 (1990) 307-403; T. Matsoukas, E. Gulari, J. Colloid Interface Sci. 132 (1989) 13-21; R. D. Badley et al., Langmuir 6 (1990) 792-801).A method for producing monodisperse silicate particles, i.e. H. Silicate particles by uniform size, was first described by Stöber et al. (J. Colloid Interface Sci. 26 (1968) 62-69). The production of the so-called Stöber particles and their own Subsequently, a large number of working groups were responsible for examined. This includes defining the synthesis conditions for obtaining certain ones Particle sizes (Van Helden et al. J. Colloid Interface Sci. 81 (1981) 354-68, H. Giesche, J. European Ceramic Soc. 14 (1994) 189-204, A. von Blaaderen, A. Vrij, Adv. Chem. Ser. 234 (1994) 83-111) and studies on particle growth and chemical Composition (C.H. Byers et al. Ind. Eng. Chem. Res. 26 (1987) 1916-23; T. Matsoukas, E. Goulari, J. Colloid Interface Sci. 124: 252-61 (1988); T. Harris et al. J. Non- Cryst. Solids 121 (1990) 307-403; T. Matsoukas, E. Gulari, J. Colloid Interface Sci. 132 (1989) 13-21; Badley, R. D. et al., 1990 (Langmuir 6: 792-801).

Für die Dotierung der Silikatpartikel mit Farbstoffen sind im Stand der Technik unter­ schiedliche Möglichkeiten beschrieben. Van Blaaderen et al. (Langmuir 8 (1992) 2921-31) sowie Quellet et al. (J. Coll. Interf. Sci. 159 (1993) 150-7) stellten Stöber-Partikel her, die mit Fluoresceinisothiocyanat oder Rhodaminisothiocyanat (Verhaegh, A. von Blaaderen, Langmuir 10 (1994) 1427-38) gefärbt wurden; die Farbstoffe wurden zuvor mit 3-Amino­ propyltriethoxysilan (AMEO) umgesetzt. Der Farbstoff wurde hier oberflächlich aufge­ bracht oder schichtförmig in die Partikel eingebaut. Die homogene Einfärbung spielte in diesen Untersuchungen eine untergeordnete Rolle und führte in der Regel zu relativ großen Partikeln im Größenbereich von etwa 500 nm Durchmesser. Die durchgeführte Oberflä­ chenmodifizierung diente der sterischen Stabilisierung der Partikel und erfolgte mittels Octadecanol. Die erhaltenen Partikel wurden als Modellsysteme für die Grundlagenfor­ schung verwendet. Aufgrund der hohen Partikelgröße sind die hier hergestellten Silikat­ partikel für diagnostische Anwendungen weniger geeignet.For doping the silicate particles with dyes, the state of the art includes different possibilities described. Van Blaaderen et al. (Langmuir 8 (1992) 2921-31) as well as Quellet et al. (J. Coll. Interf. Sci. 159 (1993) 150-7) produced Stöber particles which with fluorescein isothiocyanate or rhodamine isothiocyanate (Verhaegh, A. von Blaaderen, Langmuir 10 (1994) 1427-38); the dyes were previously with 3-amino propyltriethoxysilane (AMEO) implemented. The dye was superficially applied here brings or built into the particles in layers. The homogeneous coloring played into These investigations played a subordinate role and usually led to relatively large ones Particles in the size range of approximately 500 nm in diameter. The carried out surface Chen modification served to sterically stabilize the particles and was carried out by means of Octadecanol. The particles obtained were used as model systems for the basic research used. Due to the large particle size, the silicate produced here are particles less suitable for diagnostic applications.

S. Shibata et al. (J. Sol-Gel Sci. and Techn. 10 (1997) 263-268) dotierten Stöber-Partikel physikalisch mit diversen Farbstoffen wie Rhodamin 6G, wasserlöslichen Porphyrinen, Nil Blau, etc. Von Matijevic et al. (Dyes and Pigments 17 (1991) 323-40) wurden auf der Oberfläche mit 3-Aminopropyl-triethoxysilanen modifizierte Stöber-Partikel vorgestellt, welche über die Aminogruppe mit Farbstoffen in einem aufwendigen Verfahren verbunden wurden.S. Shibata et al. (J. Sol-Gel Sci. And Techn. 10 (1997) 263-268) doped Stöber particles physically with various dyes such as rhodamine 6G, water-soluble porphyrins, Nile  Blue, etc. By Matijevic et al. (Dyes and Pigments 17 (1991) 323-40) were published on the Surface presented with 3-aminopropyl-triethoxysilanes modified Stöber particles, which are linked via the amino group with dyes in a complex process were.

Stöber-Partikel wurden auch auf verschiedene Arten an der Oberfläche modifiziert. Hierzu gehören Reaktionen mit 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan (MEMO), Octadecyl-tri­ methoxysilan (ODS) und 3-Aminopropyl-triethoxysilan (AMEO) (H. Giesche, E. Matije­ vic, Dyes and Pigments 17 (1991) 323-40; A. von Blaaderen, A. Vrij, J. Coll. Interf Sci., 156 (1993) 1-18; R. D. Badley et al., Langmuir 6 (1990) 792-801; A. P. Philipse, A. Vrij, J. Coll. Interf. Sci. 12 (1989) 121-36; A. K. von Helden, A. Vrij, J. Coll. Interf. Sci. 81 (1981) 354-68).Stöber particles were also modified on the surface in various ways. For this include reactions with 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane (MEMO), octadecyl-tri methoxysilane (ODS) and 3-aminopropyl-triethoxysilane (AMEO) (H. Giesche, E. Matije vic, Dyes and Pigments 17 (1991) 323-40; A. von Blaaderen, A. Vrij, J. Coll. Interf Sci., 156 (1993) 1-18; Badley, R. D. et al., 1990, Langmuir 6: 792-801; A.P. Philipse, A. Vrij, J. Coll. Interf. Sci. 12 (1989) 121-36; A. K. von Helden, A. Vrij, J. Coll. Interf. Sci. 81 (1981) 354-68).

Die im Stand der Technik beschriebenen gefärbten Silikatpartikel haben den Nachteil, daß der Farbstoffeinbau lediglich in einer dünnen Schale oder Schicht erfolgt und daher die Farbstoffmenge nur proportional zur verfügbaren Oberfläche ist. Dies führt dazu, dass nur eine geringe Farbintensität erreicht werden kann, die für diagnostische Anwendungen oft­ mals nicht ausreicht. Wenn eine höhere Farbintensität erforderlich ist, kann die gewünschte Farbintensität daher nicht mit einer geringen Zahl bzw. Konzentration an Partikeln erreicht werden. Wenn sich der Farbstoff nur in der äußeren Hülle des Partikels befindet, kann es bei Fluoreszenzfarbstoffen bei lokal zu hohen Farbstoffkonzentrationen zum Intensitäts­ quenching kommen. Außerdem können die nur in einer Schicht vorhandenen Farbstoff­ moleküle in unkontrollierter Weise durch den Partikel wandern, d. h. die Farbstoffmoleküle sind nicht migrationsstabil eingebaut. Oftmals neigen die gefärbten Partikel des Standes der Technik zum Verlust der Farbmoleküle durch Abbluten.The colored silicate particles described in the prior art have the disadvantage that the dye is only incorporated in a thin shell or layer and therefore the The amount of dye is only proportional to the available surface. This just means that a low color intensity can be achieved, which is often for diagnostic applications sometimes not enough. If a higher color intensity is required, the desired one Color intensity is therefore not achieved with a small number or concentration of particles become. If the dye is only in the outer shell of the particle, it can with fluorescent dyes with locally too high dye concentrations to the intensity come quenching. In addition, the dye can only be present in one layer molecules move through the particle in an uncontrolled manner, d. H. the dye molecules are not installed stable to migration. Often, the colored particles of the stand tend the technique of losing color molecules through bleeding.

Aufgabe war es daher, ein Reagenz auf Basis von Silikatpartikeln bereitzustellen, mit Hilfe dessen die Nachweisreaktion in diagnostischen Testverfahren vorteilhaft erfolgen kann. Insbesondere sollten die Nachteile des Standes der Technik wie beispielsweise inhomo­ gene Färbung der Partikel weitgehend vermieden werden. Insbesondere sollte gewährlei­ stet sein, dass die Größe dieser Partikel in einem Bereich liegt, der eine Anwendung in diagnostischen Verfahren ermöglicht. The task was therefore to provide a reagent based on silicate particles with the help the detection reaction of which can advantageously take place in diagnostic test methods. In particular, the disadvantages of the prior art, such as inhomo gene coloring of the particles can be largely avoided. In particular, guarantee be sure that the size of these particles is in a range that an application in enables diagnostic procedures.  

Die Aufgabe wird gelöst durch die in den unabhängigen Ansprüchen näher definierte Er­ findung. Die abhängigen Ansprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen dar.The object is achieved by the Er defined in more detail in the independent claims making. The dependent claims represent preferred embodiments.

Die Erfindung betrifft Konjugate aus Silikatpartikeln und Biomolekülen, die dadurch ge­ kennzeichnet sind, dass die Silikatpartikel homogen durchgefärbt sind. Es war überra­ schenderweise möglich, ein einfaches Verfahren zu entwickeln, mit dem die erfindungs­ gemäßen Konjugate aus Silikatpartikeln und Biomolekülen hergestellt werden können.The invention relates to conjugates of silicate particles and biomolecules, which ge indicates that the silicate particles are homogeneously colored. It was amazing schenderenden possible to develop a simple process with which the Invention Conjugates can be made from silicate particles and biomolecules.

Ein wesentlicher Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate sind die homogen durch­ gefärbten Silikatpartikel insbesondere mit einem Durchmesser im Größenbereich von etwa 10 bis 800 nm, bevorzugt von 80 bis 400 nm. Der bevorzugte Durchmesser der Konjugate liegt bei 100 bis 250 nm.An integral part of the conjugates according to the invention are homogeneous colored silicate particles in particular with a diameter in the size range of about 10 to 800 nm, preferably from 80 to 400 nm. The preferred diameter of the conjugates is 100 to 250 nm.

Bei der Herstellung der Silikatpartikel werden bereits während der Partikelsynthese die gewünschten Farbstoffe im Silikatmaterial verankert, was bevorzugt kovalent erfolgt. Der Farbstoff ist somit innerhalb des Silikat-Netzwerks gleichmäßig im gesamten Partikel ver­ teilt. Bei den homogen durchgefärbten Partikeln wird somit in wenig Volumen eine gleichmäßig hohe Farbstoffkonzentration erreicht, da der Einbau der Farbstoffmoleküle proportional zum Volumen des Partikels ist. Im Vergleich zu einer Färbung, die nur in ei­ ner dünnen Schicht erfolgt, heißt das, dass erfindungsgemäß kleinere Partikel verwendet werden können, um dieselbe Farbintensität zu erzielen.In the manufacture of the silicate particles, the desired dyes anchored in the silicate material, which is preferably done covalently. The The dye is thus evenly distributed throughout the particle within the silicate network Splits. In the case of the homogeneously colored particles, a volume is thus obtained in a small volume achieved uniformly high dye concentration because of the incorporation of the dye molecules is proportional to the volume of the particle. Compared to a coloring that only in egg takes place in a thin layer, this means that smaller particles are used according to the invention to achieve the same color intensity.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Partikel ist, dass das bei Fluoreszenzfarb­ stoffen bekannte Intensitätsquenching bei zu hohen Farbstoffkonzentrationen aus densel­ ben Gründen durch ein Verdünnen des Farbstoffs in der Silikat-Matrix bei identischer An­ zahl von Farbstoffmolekülen vermieden wird. Es ist also erfindungsgemäß möglich, durch eine entsprechende Wahl an Farbstoffkonzentration in der Synthese der Partikel stärker oder schwächer homogen gefärbte Silikatpartikel zu erhalten.Another advantage of the particles according to the invention is that this is the case with fluorescent paint substances known intensity quenching at too high dye concentrations from densel ben reasons by diluting the dye in the silicate matrix with identical An number of dye molecules is avoided. It is therefore possible according to the invention by a corresponding choice of dye concentration in the synthesis of the particles stronger or to obtain weakly homogeneously colored silicate particles.

Außerdem ist die sterische Behinderung der Partikel untereinander bei der Diffusion in Lösung, wie sie für diagnostische Anwendungen und Testführungen erforderlich ist, bei kleinen Partikeln geringer als bei größeren Partikeln. Mit kleinen Partikeln lässt sich außerdem eine im Verhältnis zu ihrem Volumen höhere Beladung mit Biomolekülen errei­ chen als mit großen Partikeln.In addition, the steric hindrance of the particles to one another during diffusion is in Solution, as required for diagnostic applications and test runs, at small particles less than larger particles. Small particles can also be used  achieve a higher loading of biomolecules in relation to their volume than with large particles.

Bei der Herstellung der Silikatpartikel beziehungsweise der erfindungsgemäßen Konjugate mit Biomolekülen muss zunächst der Farbstoff in silanisierter Form bereitgestellt werden, bevor die Herstellung der gefärbten Silikatpartikel erfolgt. Das heißt, der Farbstoff wird mit einer reaktiven Silanolgruppe aktiviert. Dazu wird der Farbstoff mit einer geeigneten Silankomponente umgesetzt. Die dabei entstehende Verbindung wird als silanisierte Farb­ stoffkomponente bezeichnet.In the production of the silicate particles or the conjugates according to the invention with biomolecules, the dye must first be provided in silanized form, before the colored silicate particles are produced. That is, the dye will activated with a reactive silanol group. For this, the dye is used with a suitable Silane component implemented. The resulting compound is called a silanized color called component.

Die Molverhältnisse von Farbstoff zu Silankomponente liegen bei der Herstellung der sila­ nisierten Farbstoffkomponente bevorzugt zwischen ungefähr 1 : 2 bis 2 : 1. Falls die Silan­ komponente über eine entsprechende Anzahl an Anknüpfungsgruppen verfügt, ist auch ein Molverhältnis von mehr als 2 : 1 denkbar. Sinnvoll ist es, die Molverhältnisse so zu wählen, dass eine quantitative Umsetzung des Farbstoffs erfolgt. Beachtet werden sollte dabei, dass die Konzentration an Farbstoff-, insbesondere Fluoreszenz-Farbstoffmolekülen nicht so hoch wird, dass die Gefahr des Intensitätquenchings besteht, wie bereits in einem oberen Abschnitt erläutert wurde. Sollte nach Abschluss der Silanisierung des Farbstoffs noch überschüssige Silankomponente im Ansatz vorliegen, so stört dies die nachfolgende Herstellung der Silikatpartikel jedoch nicht.The molar ratios of dye to silane component lie in the manufacture of the sila nized dye component preferably between about 1: 2 to 2: 1. If the silane component has a corresponding number of connecting groups is also a Molar ratio of more than 2: 1 is conceivable. It makes sense to choose the molar ratios so that a quantitative conversion of the dye takes place. It should be noted that the concentration of dye, especially fluorescent dye molecules is not so it becomes high that there is a risk of intensity quenching, as in an upper one Section has been explained. Should still after the silanization of the dye Excess silane component are present in the batch, this disturbs the following However, the manufacture of the silicate particles is not.

Als Silankomponente zur Silanisierung der Farbstoffe kommen Verbindungen in Frage, die neben der Silanolgruppe oder einem Derivat davon auch eine funktionelle Gruppe zur An­ knüpfung an das Farbstoffmolekül enthalten. Ein Beispiel für eine zur Silanisierung von bestimmten aktivierten Farbstoffen geeignete Silankomponente ist das Aminopropyl­ triethoxysilan (AMEO). Aber auch andere, dem Fachmann geläufige, Silankomponenten kommen zur Silanisierung von Farbstoffmolekülen in Frage.Compounds that can be used as silane components for silanizing the dyes are: in addition to the silanol group or a derivative thereof, also a functional group for the preparation contain linkage to the dye molecule. An example of one for silanization of A suitable silane component for certain activated dyes is aminopropyl triethoxysilane (AMEO). But also other silane components familiar to the person skilled in the art are suitable for the silanization of dye molecules.

Als Farbstoffe können prinzipiell alle Farbstoffe verwendet werden, die sich mit Silan­ komponenten konjugieren lassen. Der Chromophor sollte während der Silanisierung er­ halten bleiben und er sollte möglichst stabil gegenüber Alkalien sein. In principle, all dyes that deal with silane can be used as dyes conjugate components. The chromophore should he during silanization hold and it should be as stable as possible to alkalis.  

Bevorzugt werden als Farbstoffe Fluoreszenzfarbstoffe wie beispielsweise Fluorescein­ isothiocyanat oder die in der DE 195 21 231 beschriebenen Oxazinfarbstoffe oder Farb­ stoffe auf Rhodaminbasis wie die in der EP 0 567 622 beschriebenen pentacyclischen Farbstoffe eingesetzt. Denkbar ist auch der Einbau verschiedener Farbstoffmoleküle in einem Partikel.Preferred dyes are fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate or the oxazine dyes or dyes described in DE 195 21 231 Rhodamine-based substances such as those described in EP 0 567 622 Dyes used. It is also conceivable to incorporate different dye molecules in a particle.

Als nächstes wird die silanisierte Farbstoffkomponente mit einer weiteren Silankompo­ nente umgesetzt, um die homogen durchgefärbten Silikatpartikel zu erhalten. Dabei wer­ den die silanisierten Farbstoffmoleküle durch die Silanolgruppen mit der weiteren Silan­ komponente vernetzt. Als Ausgangsmaterial für den Silikatanteil bei der Herstellung der homogen gefärbten Partikel können beliebige vernetzende tri- und tetrafunktionelle Silan­ verbindungen (z. B. Halogensilane, Alkoxysilane, etc.) eingesetzt werden. Bevorzugt wer­ den Tetraalkoxysilane wie beispielsweise Tetraethoxysilan eingesetzt. Wichtig ist, dass diese Silanverbindungen den Aufbau eines dreidimensionalen Netzwerks im Partikel er­ möglichen, so dass der Farbstoff fest darin verankert werden kann. Wie bereits zuvor er­ läutert, stören geringe Mengen der weniger stark vernetzenden Silanverbindung aus der Farbstoff-Silanisierungsreaktion jedoch die nachfolgende Herstellung der homogen durch­ gefärbten Silikatpartikel nicht.Next, the silanized dye component with another silane compo nente implemented to maintain the homogeneously colored silicate particles. Here who the silanized dye molecules through the silanol groups with the other silane component networked. As the starting material for the silicate component in the manufacture of homogeneously colored particles can be any cross-linking tri- and tetrafunctional silane compounds (e.g. halosilanes, alkoxysilanes, etc.) are used. Preferred who the tetraalkoxysilanes such as tetraethoxysilane used. It's important, that these silane compounds build a three-dimensional network in the particle possible so that the dye can be firmly anchored in it. Like he did before refines, small amounts of the less strongly crosslinking silane compound from the Dye silanization reaction, however, the subsequent preparation of the homogeneous not colored silicate particles.

Die silanisierte Farbstoffkomponente und die Silankomponente werden bei der Herstellung der Silikatpartikel in einem Molverhältnis von bevorzugt 1 : 500 bis 1 : 100 000, besonders bevorzugt 1 : 500 bis 1 : 20 000 eingesetzt.The silanized dye component and the silane component are used in the manufacture the silicate particles in a molar ratio of preferably 1: 500 to 1: 100,000, particularly preferably 1: 500 to 1: 20,000 used.

Die Herstellung der Silikatpartikel erfolgt nach dem eingangs erwähnten sogenannten Stö­ ber-Verfahren und ist in Beispiel 1 erläutert.The silicate particles are produced according to the so-called Stö method and is explained in Example 1.

Dass der erfindungsgemäße Silikatpartikel homogen durchgefärbt ist, kann beispielsweise anhand der Messung des Tiefenprofils des Partikels mittels der ESCA-Analyse (ESCA: Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) beurteilt werden. Ein homogen durchge­ färbter Partikel weist beispielsweise einen hinsichtlich der Elementzusammensetzung in jeder Schicht identischen Aufbau auf, der lediglich den methodischen Schwankungen un­ terliegt, während ein nur in einer Schicht gefärbter Partikel stark unterschiedliche Profile aufweist und für den Farbstoff charakteristische Elemente in tieferen Schichten gänzlich fehlen können. Charakteristischerweise werden bei der ESCA-Analyse bevorzugt solche Elemente für den Nachweis ausgewählt, die allein dem Farbstoff zugeordnet werden kön­ nen.For example, the silicate particle according to the invention is colored through homogeneously based on the measurement of the depth profile of the particle using the ESCA analysis (ESCA: Electron Spectroscopy for Chemical Analysis). A homogeneous colored particle has, for example, an element composition in each layer has an identical structure, only the methodological fluctuations un underlying, while a particle colored only in one layer has very different profiles  has and completely characteristic elements for the dye in deeper layers may be missing. Characteristically, those are preferred in the ESCA analysis Elements selected for detection that can only be assigned to the dye NEN.

Erfindungsgemäß können die homogen durchgefärbten Silikatpartikel nachträglich modifi­ ziert werden. Die Kernpartikel können beispielsweise mit einer oder mehreren weiteren, bevorzugt farblosen Schichten ummantelt werden, um den Partikel chemisch zu schützen. Zweck dieser Ummantelung ist es, eine möglichst gleichmäßige silikatartige Oberfläche zu erhalten, aus der keine Farbstoffmoleküle mehr herausragen. Somit werden weitere Kopp­ lungen mit funktionellen Gruppen und Biomolekülen erleichtert und die Gefahr der Neben­ reaktionen mit Farbstoffmolekülen an der Oberfläche wird minimiert. Bevorzugt wird eine weitere ungefärbte Silikatschicht um den homogen gefärbten Silikatpartikel mit einer Dicke von 1 bis 30 nm, bevorzugt 2 bis 20 nm aufgebracht.According to the invention, the homogeneously colored silicate particles can subsequently be modified be decorated. The core particles can, for example, with one or more other preferably colorless layers are coated in order to chemically protect the particle. The purpose of this sheathing is to provide the most uniform possible silicate-like surface obtained from which no dye molecules protrude. Thus, further Kopp with functional groups and biomolecules and the risk of side effects reactions with dye molecules on the surface are minimized. One is preferred another undyed silicate layer around the homogeneously colored silicate particle with a Thickness of 1 to 30 nm, preferably 2 to 20 nm applied.

Die Silikatpartikel können entweder direkt an der Oberfläche des homogen durchgefärbten Partikels oder an der Oberfläche der zusätzlichen Ummantelungsschicht mit funktionellen Gruppen versehen werden, um weitere Moleküle, erfindungsgemäß Biomoleküle, an die Partikel zu koppeln.The silicate particles can either be directly on the surface of the homogeneously colored Particles or on the surface of the additional coating layer with functional Groups are provided to which further molecules, according to the invention biomolecules, are attached To couple particles.

Die funktionellen Gruppen können wiederum über Spacer- oder Linkermoleküle an den Silikatpartikeln aufgebracht sein. Wichtig ist, dass die einzuführende funktionelle Gruppe im Netzwerk des Silikatpartikels verankert ist, um eine stabile Verbindung zu gewährlei­ sten. Bevorzugt werden die gefärbten Silikatpartikel daher mit einer Verbindung umge­ setzt, die neben der funktionellen Gruppe eine oder mehrere Silanolgruppen oder Derivate davon, bevorzugt Alkoxy oder Halogen, zur Verankerung im Partikel enthält.The functional groups can in turn be attached to the via spacer or linker molecules Silicate particles can be applied. It is important that the functional group to be introduced is anchored in the network of the silicate particle in order to ensure a stable connection sten. The colored silicate particles are therefore preferably reversed with a compound sets, in addition to the functional group one or more silanol groups or derivatives contains, preferably alkoxy or halogen, for anchoring in the particle.

Bevorzugte Modifikationsgruppen sind funktionelle Gruppen wie beispielsweise Carbo­ xylgruppen, Aminogruppen, Epoxygruppen, Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen. Dem Fachmann ist die Einführung solcher Gruppen geläufig und braucht daher hier nicht ge­ sondert erläutert zu werden. Preferred modification groups are functional groups such as carbo xyl groups, amino groups, epoxy groups, hydroxyl groups or thiol groups. the Experts are familiar with the introduction of such groups and therefore do not need ge here but to be explained.  

Bevorzugt ist die Einführung von Carboxylgruppen, die beispielsweise durch Umsetzung des gefärbten Silikatpartikels mit einem Disäureanhydrid, das die besagte Silanolgruppe zur Verankerung im Partikel enthält, erfolgt. Zur Aktivierung der funktionellen Gruppen können diese vor Reaktion mit den zu koppelnden Biomolekülen beispielsweise mit N- Hydroxysuccinimid in Aktivester überführt werden. All diese Schritte sind dem Fachmann geläufig.The introduction of carboxyl groups, for example by reaction, is preferred of the colored silicate particle with a diacid anhydride that the said silanol group contains for anchoring in the particle. To activate the functional groups before reaction with the biomolecules to be coupled, for example with N- Hydroxysuccinimide be converted into active esters. All of these steps are known to the skilled person common.

Die erfindungsgemäßen Konjugate bestehen aus homogen durchgefärbten Silikatpartikeln und Biomolekülen. Die Kopplung der Biomoleküle erfolgt bevorzugt über die funktionel­ len Gruppen, die an der Oberfläche eingeführt wurden. Im allgemeinen erfolgt die An­ knüpfung der Biomoleküle an die Oberfläche des Partikels über freie Amino- oder Car­ boxylgruppen oder Thiolgruppen, so dass die kovalente Verknüpfung bevorzugt über Amid- oder Thioetherbindungen erfolgt.The conjugates according to the invention consist of homogeneously colored silicate particles and biomolecules. The biomolecules are preferably coupled via the functional len groups introduced on the surface. In general, the An linking the biomolecules to the surface of the particle via free amino or car boxyl groups or thiol groups, so that the covalent linkage is preferred via Amide or thioether bonds are made.

Unter Biomolekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Moleküle verstand­ en, die für eine Bestimmung eines Analyten in einer Probe, insbesondere für eine immu­ nologische Bestimmung eines Analyten verwendet werden können. Unter den Begriff Biomoleküle fallen beispielsweise Proteine, Glykoproteine, Peptide, Nukleinsäuren, pepti­ dische Nukleinsäuren, Saccharide, Hormone, Haptene, Vitamine und Antigene. Bevorzugt werden als Biomoleküle im erfindungsgemäßen Konjugat Antikörper und deren Fragmente eingesetzt. Unter Antikörpern werden sowohl monoklonale als auch polyklonale und chi­ märe Antikörper und jeweils deren Fragmente wie beispielsweise Fab, Fc, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv verstanden. Auch die Kopplung mit den Biomolekülen Streptavidin oder Avidin oder Biotin gehört zu einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.Biomolecules in the sense of the present invention are understood to mean all molecules which can be used for determining an analyte in a sample, in particular for an immunological determination of an analyte. The term biomolecules includes, for example, proteins, glycoproteins, peptides, nucleic acids, peptic nucleic acids, saccharides, hormones, haptens, vitamins and antigens. Antibodies and their fragments are preferably used as biomolecules in the conjugate according to the invention. Antibodies are understood to mean both monoclonal and polyclonal and chimeric antibodies and their fragments such as, for example, Fab, Fc, Fab ', F (ab') ₂ , Fv, scFv. Coupling with the biomolecules streptavidin or avidin or biotin is also one of the preferred embodiments of the invention.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus ho­ mogen durchgefärbten Silikatpartikeln und Biomolekülen, das folgende Schritte umfasst:
The invention also relates to a method for producing a conjugate from homogeneously colored silicate particles and biomolecules, which comprises the following steps:

• - Herstellung einer silanisierten Farbstoffkomponente- Production of a silanized dye component
• - Umsetzen der silanisierten Farbstoffkomponente und einer Silanverbindung unter ge­ eigneten Bedingungen zu gefärbten Silikatpartikeln- Implementation of the silanized dye component and a silane compound under ge suitable conditions for colored silicate particles
• - Reinigen der entstandenen Dispersion von nicht eingebautem Farbstoff - Cleaning the resulting dispersion of non-built-in dye  
• - gegebenenfalls Ummanteln der dabei entstandenen Silikatpartikel mit einer zusätzli­ chen Silikatschicht- If necessary, sheathing the resulting silicate particles with an additional chen silicate layer
• - Einbau von funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Partikel- Incorporation of functional groups on the surface of the particles
• - Kopplung der Biomoleküle über die funktionellen Gruppen an die Silikatpartikel- Coupling of the biomolecules via the functional groups to the silicate particles

Die einzelnen Verfahrensschritte sind bereits in den vorhergehenden Abschnitten erläutert worden.The individual process steps have already been explained in the previous sections Service.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Konjugate aus Silikatpartikeln und Biomole­ külen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren erhältlich sind.Another object of the invention are conjugates of silicate particles and biomoles cool that are obtainable by the method described above.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch Zusammenbringen der Probe mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindepartnern. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis des Analy­ ten ein erfindungsgemäßes Konjugat aus homogen durchgefärbten Silikatpartikeln und Biomolekülen eingesetzt wird.The invention also relates to a method for the detection of an analyte in a Sample by bringing the sample together with one or more analyte-specific Binding partners. The method is characterized in that for the detection of the analy ten a conjugate according to the invention from homogeneously colored silicate particles and Biomolecules is used.

Das Verfahren wird bevorzugt als Immunoassay durchgeführt. Das heißt, dass mindestens einer der analytspezifischen Bindepartner ein immunologischer Bindepartner ist. In diesem Verfahren wird die Probe, in der der Analyt vermutlich enthalten ist, mit einem immunolo­ gisch spezifischen Bindepartner inkubiert. Dieser immunologisch spezifische Bindepartner ist im Falle eines Antigen-Nachweises wie beispielsweise bei Tumormarkern wie PSA ein Antikörper oder ein Fragment davon, das spezifisch an den Analyten, das heißt das Tumor­ antigen PSA bindet. Bei Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen (z. B. Anti-HCV-Antikörper) kann beispielsweise als immunologisch spezifischer Bindepartner das entsprechende Antigen eingesetzt werden. Der Nachweis der erfolgten spezifischen Bindung erfolgt über das erfindungsgemäße Konjugat, dessen eingebauter Farbstoff als Markierung dient. Die auf den Silikatpartikeln immobilisierten Biomoleküle fungieren als spezifische Bindepartner für den Analyten oder als spezifische Bindepartner für eine Substanz, die ihrerseits spezifisch an den Analyten gebunden ist. The method is preferably carried out as an immunoassay. That means at least one of the analyte-specific binding partners is an immunological binding partner. In this The sample, in which the analyte is presumably contained, is processed with an immunolo incubated specific binding partner. This immunologically specific binding partner is in the case of antigen detection such as tumor markers such as PSA Antibodies or a fragment thereof that is specific to the analyte, i.e. the tumor binds antigen PSA. In methods for the detection of antibodies against a specific Antigen (e.g. anti-HCV antibody) can be, for example, more immunologically specific Binding partner the appropriate antigen can be used. Proof of success specific binding takes place via the conjugate according to the invention, its built-in Dye serves as a marker. The biomolecules immobilized on the silicate particles act as specific binding partners for the analyte or as specific binding partners for a substance that in turn is specifically bound to the analyte.  

Beispielsweise kann in allen diagnostischen Testverfahren als Biomolekül Streptavidin oder Avidin mit dem Silikatpartikel konjugiert sein. Die Bindung des Konjugats erfolgt dann an die Biotingruppe eines Moleküls (beispielsweise ein Peptidantigen oder eine Nu­ kleinsäuresequenz), das selbst biotinyliert ist. Dieses biotinylierte Molekül (das Peptidanti­ gen oder die Nukleinsäure) bindet wiederum spezifisch an den Analyten, beispielsweise einen gegen das Peptid gerichteten Antikörper oder, im Falle der Nukleinsäure, an eine mit dieser Sequenz hybridisierende Nukleinsäure.For example, streptavidin can be used as a biomolecule in all diagnostic test methods or avidin conjugated to the silicate particle. The conjugate is bound then to the biotin group of a molecule (e.g. a peptide antigen or a Nu small acid sequence), which is itself biotinylated. This biotinylated molecule (the peptidanti gene or the nucleic acid) in turn binds specifically to the analyte, for example an antibody directed against the peptide or, in the case of the nucleic acid, to one with this sequence hybridizing nucleic acid.

Testformate zur Durchführung von Immunoassays sind dem Fachmann geläufig. Beispiel­ haft sind hier heterogene Tests im Sandwich-Format oder kompetitiven Format oder im indirekten Format genannt.Test formats for carrying out immunoassays are familiar to the person skilled in the art. example heterogeneous tests in sandwich format or competitive format or in called indirect format.

Eine bevorzugte Ausführungsform bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens ist ein Teststreifen. Im folgenden ist beispielhaft beschrieben, wie ein Teststreifen funktionieren kann.A preferred embodiment when carrying out the inventive method rens is a test strip. The following describes an example of a test strip can work.

Teststreifen bestehen üblicherweise aus einem Trägermaterial, auf das ein Auftragvlies, eine Membran und ein Saugvlies aufgebracht sind. In Chromatographierichtung aufwärts, also über dem Startpunkt der Probenflüssigkeit, ist das erfindungsgemäße Konjugat, dessen Biomoleküle spezifisch für den Analyten sind, und gegebenenfalls weitere spezifische Bin­ departner für den Analyten aufgebracht. Erst durch Kontakt mit einer Flüssigkeit, d. h. mit der Probe, beginnen die spezifischen Bindepartner und das erfindungsgemäße Konjugat chromatographisch zu wandern. Zuvor sind diese Bestandteile in trockener Form auf dem Streifen aufgebracht. Auf der Membran sind außerdem auf zwei in Chromatographierich­ tung nacheinander folgenden Streifen verschiedene Proteine aufgebracht.Test strips usually consist of a carrier material on which an application fleece, a membrane and a absorbent fleece are applied. In the chromatographic direction upwards, So above the starting point of the sample liquid, the conjugate according to the invention is its Biomolecules are specific for the analyte, and possibly further specific bin departner applied for the analyte. Only by contact with a liquid, i.e. H. With of the sample, the specific binding partners and the conjugate according to the invention begin to walk chromatographically. Previously, these components are in dry form on the Strips applied. On the membrane there are also two in chromatography successive strips of different proteins.

Auf dem ersten Strich (Detektionslinie) befindet sich ein immobilisierter Bindepartner, der für den Analyten spezifisch ist. Auf dem ersten Strich kann auch ein Molekül wie Strept­ avidin gebunden sein, an das dann biotinylierte, analytspezifische Bindepartner binden können. In diesem Fall müssen dann die biotinylierten, analytspezifischen Bindepartner ebenso wie das Konjugat über dem Startpunkt des Teststreifens aufgebracht sein und mit der Probe mit chromatographiert werden. Auf dem zweiten Strich in Chromatographierichtung (Kontroll-Linie) ist ein Bindepartner aufgebracht, der die Biomoleküle des erfin­ dungsgemäßen Konjugats spezifisch bindet.On the first line (detection line) there is an immobilized binding partner, the is specific for the analyte. On the first line, a molecule like Strept can also appear be bound avidin, to which then bind biotinylated, analyte-specific binding partners can. In this case, the biotinylated, analyte-specific binding partners just like the conjugate is applied over the starting point of the test strip and with the sample with be chromatographed. On the second line in the direction of chromatography  (Control line) is a binding partner applied, which inventions the biomolecules specifically binds conjugate according to the invention.

Wenn nun die Probenflüssigkeit vom Startpunkt des Teststreifens durch den Streifen wan­ dert, beginnen das erfindungsgemäße Konjugat und gegebenenfalls die analytspezifischen Bindepartner ebenfalls in Richtung Flüssigkeitsfront zu wandern. Dabei findet die spezifi­ sche Bindung von Analyt aus der Probe an den auf dem ersten Strich immobilisierten Bin­ departner statt. Das erfindungsgemäße Konjugat bindet ebenfalls an den Analyten, so dass ein Sandwich entsteht, der über die Färbung des Silikatpartikels detektiert werden kann. Die chromatographierte Flüssigkeit im Teststreifen läuft bis zum Ende des Teststreifens. Dabei wird auf dem zweiten Strich das erfindungsgemäße Konjugat über den Bindepartner, der spezifisch die Biomoleküle des Konjugats bindet, abgefangen. Anhand der am zweiten Strich auftretenden Färbung kann gesehen werden, dass die Chromatographie des Test­ streifens prinzipiell funktioniert hat.If now the sample liquid from the starting point of the test strip through the strip dert, begin the conjugate according to the invention and optionally the analyte-specific Loyalty partner also to migrate towards the liquid front. The specifi binding of analyte from the sample to the bin immobilized on the first line departner instead. The conjugate according to the invention also binds to the analyte, so that a sandwich is created that can be detected via the coloring of the silicate particle. The chromatographed liquid in the test strip runs until the end of the test strip. On the second line, the conjugate according to the invention is added via the binding partner, which specifically binds the biomolecules of the conjugate. Based on the second Stroke staining can be seen using the chromatography of the test stripes worked in principle.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostischer Teststreifen, der neben dem erfindungsgemäßen Konjugat alle weiteren für den Ablauf des chromatographischen Tests erforderlichen Bestandteile enthält.Another object of the invention is a diagnostic test strip, which in addition to the conjugate according to the invention all further for the course of the chromatographic test contains necessary components.

Erfindungsgemäß können die Konjugate auch in Nukleinsäure-Hybridisierungsassays ein­ gesetzt werden. Hier wird als Biomolekül eine Nukleinsäuresonde, die spezifisch mit einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz hybridisiert, mit den homogen durchgefärbten Si­ likatpartikeln gekoppelt. Durch das Farbstoff bzw. Fluoreszenzsignal kann die Nuklein­ säuresequenz aus der Probe oder aus dem beispielsweise mittels PCR-Amplifizierung er­ haltenen Ansatz spezifisch detektiert werden.According to the invention, the conjugates can also be used in nucleic acid hybridization assays be set. Here, a nucleic acid probe that is specific to a hybridized nucleic acid sequence to be detected, with the homogeneously colored Si likate particles coupled. Due to the dye or fluorescence signal, the nucleus can acid sequence from the sample or from the for example by means of PCR amplification holding approach can be detected specifically.

Erfindungsgemäß können die Konjugate auch in Array- oder Chip-Systemen eingesetzt werden. Dabei handelt es sich um miniaturisierte Testkonzepte mit Festphasen wie bei­ spielsweise Kunststoffe, Glas, Metalle oder Metalloxide, auf deren Oberfläche in kleinsten Abständen, die im Mikrometer-Bereich liegen, räumlich voneinander getrennte Reagen­ zienspots aufgebracht werden. Diese Reagenzienspots enthalten die für die Durchführung des jeweiligen Nachweisverfahrens benötigten Bestandteile. Mit Hilfe solcher Nachweisverfahren ist es möglich, mit wenig Material und wenig Probe auf kleinstem Raum eine Vielzahl verschiedener analytischer Parameter gleichzeitig auf schnelle Art nachzuweisen. Die erfindungsgemäßen Konjugate aus homogen durchgefärbten Silikatpartikeln und Bio­ molekülen können in diesen Arraysystemen als Nachweisreagenzien eingesetzt werden. Als Farbstoffe, mit denen die Silikatpartikel homogen gefärbt sind, kommen hier bevor­ zugt Fluoreszenzfarbstoffe in Betracht. Insbesondere ist es möglich, mittels der erfin­ dungsgemäßen Konjugate unterschiedlich gefärbte und/oder mit verschiedenen Biomole­ külen beladene Konjugate einzusetzen, um gleichzeitig verschiedene Analyten mit ver­ schiedenen (Fluoreszenz-)Farbstoffen nachzuweisen. Insbesondere für Nukleinsäure-Hy­ bridisierungsassays haben sich die Array-Systeme als vorteilhaft erwiesen.According to the invention, the conjugates can also be used in array or chip systems become. These are miniaturized test concepts with solid phases as in for example plastics, glass, metals or metal oxides, on their surface in the smallest Distances that are in the micrometer range, spatially separated reagents cien spots are applied. These reagent spots contain those for the implementation components of the respective detection method. With the help of such verification methods  it is possible, with little material and little sample, in the smallest space Detect a large number of different analytical parameters at the same time in a quick manner. The conjugates according to the invention made of homogeneously colored silicate particles and bio Molecules can be used as detection reagents in these array systems. Dyes with which the silicate particles are homogeneously colored are used here considers fluorescent dyes. In particular, it is possible to use the inventions Conjugates according to the invention differently colored and / or with different biomoles cool loaded conjugates to use different analytes with ver detect different (fluorescent) dyes. Especially for nucleic acid hy The array systems have proven advantageous for bridization assays.

Der gleichzeitige Nachweis mehrerer verschiedener Analyten (beispielsweise HIV- und HCV-spezifische Nukleinsäuren in einer Probe oder HIV- und HCV-spezifische Antikör­ per in einer Probe) mittels der erfindungsgemäßen Konjugate, die jeweils unterschiedlich gefärbt und/oder mit verschiedenen Biomolekülen beladen sind, ist nicht auf die Anwen­ dung in Array-Systemen beschränkt, ist jedoch dort besonders sinnvoll durchzuführen.The simultaneous detection of several different analytes (e.g. HIV and HCV-specific nucleic acids in a sample or HIV- and HCV-specific antibody per in a sample) using the conjugates according to the invention, each different colored and / or loaded with different biomolecules is not for the users limited in array systems, but is particularly useful to perform there.

Als Probenmaterial für alle diagnostischen Testverfahren können alle Körperflüssigkeiten eingesetzt werden. Bevorzugt werden Vollblut, Serum, Plasma. Urin, Schweiß oder Spei­ chel eingesetzt.All body fluids can be used as sample material for all diagnostic test procedures be used. Whole blood, serum, plasma are preferred. Urine, sweat or spit chel used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Konjugate aus homogen durchgefärbten Silikatpartikeln und Biomolekülen in einem diagnostischen, bevorzugt immunologischen Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe.Another object of the invention is the use of the conjugates from homogeneous solid colored silicate particles and biomolecules in one diagnostic, preferred immunological method for the detection of an analyte in a sample.

Ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Reagenz, das die erfin­ dungsgemäßen Konjugate enthält. Das Reagenz kann außerdem die dem Fachmann geläu­ figen Pufferzusätze, Salze oder Detergenzien enthalten.Another object of the invention is a diagnostic reagent that invented the contains conjugates according to the invention. The reagent can also be familiar to those skilled in the art Buffer additives, salts or detergents.

Ein Testkit, in dem die erfindungsgemäßen Konjugate und weitere für die Durchführung eines Tests üblichen, dem Fachmann bekannten Reagenzien, enthalten sind, gehört eben­ falls zur vorliegenden Erfindung. A test kit in which the conjugates according to the invention and others for the implementation of a test that is usual and known to the person skilled in the art just belongs if to the present invention.  

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.

Beispiel 1example 1 Darstellung farbstoffdotierter Silikat-Partikel nach einem modifizierten Stöber- VerfahrenRepresentation of dye-doped silicate particles after a modified browsing method Silanisierung des FarbstoffsSilanization of the dye

36 mg (4.29.10^-5 mol) JA133-N-Hydroxysuccinimidester (JA133 ist der Farbstoff Light- Cycler Red 640™, Id.-Nr. 2014718001 der Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wer­ den in 2 ml abs. Dioxan gelöst. Hierzu werden 20 µl (8.5..10^-5 mol) 3-Aminopropyl­ triethoxysilan (AMEO) zugegeben und 5 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Dioxan wird im Ölpumpenvakuum entfernt. Man erhält den silanisierten Farbstoff JA133-Si. Eine weitere Aufarbeitung ist nicht notwendig.36 mg (4.29.10 ^-5 mol) of JA133-N-hydroxysuccinimide ester (JA133 is the dye Light Cycler Red 640 ™, ID no. 2014718001 from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) who are in 2 ml abs. Dioxane dissolved. For this 20 µl (8.5..10 ^-5 mol) 3-aminopropyl triethoxysilane (AMEO) are added and the mixture is stirred for 5 h at room temperature (RT). The dioxane is removed in an oil pump vacuum. The silanized dye JA133-Si is obtained. Further processing is not necessary.

Partikelsyntheseparticle synthesis

41 mg (4.29.10^-5 mol) JA133-Si werden in 330 ml 99%igem Ethanol gelöst. Zu dieser Lösung werden 168 ml demineralisiertes Wasser sowie 11 ml einer 14 molaren Ammoni­ umhydroxydlösung gegeben. Die Lösung wird auf 35°C temperiert. Nachdem sich ein thermisches Gleichgewicht eingestellt hat, werden unter starkem Rühren 24 ml (107 mmol) Tetraethoxysilan (TEOS) zugegeben. Nach 24 h ist die Reaktion vollständig abgeschlos­ sen. Man erhält eine farbige Dispersion mit einem Feststoffgehalt von ca. 2 Gewichts-%. Die Partikel besitzen eine Größe von ca. 135 nm Durchmesser. Diese Partikel werden durch dreimaliges Abzentrifugieren und Redispergieren in frischem Ethanol von nicht ein­ gebautem Farbstoff gereinigt.41 mg (4.29.10 ^-5 mol) of JA133-Si are dissolved in 330 ml of 99% ethanol. 168 ml of demineralized water and 11 ml of a 14 molar ammonium hydroxide solution are added to this solution. The solution is heated to 35 ° C. After a thermal equilibrium has been established, 24 ml (107 mmol) of tetraethoxysilane (TEOS) are added with vigorous stirring. After 24 h the reaction is completely completed. A colored dispersion with a solids content of about 2% by weight is obtained. The particles have a size of approximately 135 nm in diameter. These particles are cleaned of not a built-in dye by centrifuging three times and redispersing in fresh ethanol.

Ummantelung mit einer zusätzlichen SiO₂-SchichtSheathing with an additional SiO ₂ layer

Nach dem Aufreinigen der Partikel werden diese erneut in einer Mischung aus 330 ml Ethanol, 168 ml Wasser und 11 ml NH₄OH resuspendiert. Die Reaktionslösung wird auf 35°C temperiert und anschließend mit 2.13 ml (9.5 mmol) TEOS versetzt. Nach 8 h werden die Partikel abzentrifugiert und in 250 ml 99%igem Ethanol aufgenommen. Der Parti­ keldurchmesser hat um ca. 5 nm zugenommen.After the particles have been purified, they are resuspended in a mixture of 330 ml of ethanol, 168 ml of water and 11 ml of NH ₄ OH. The reaction solution is heated to 35 ° C. and then 2.13 ml (9.5 mmol) TEOS are added. After 8 hours, the particles are centrifuged off and taken up in 250 ml of 99% ethanol. The particle diameter has increased by approximately 5 nm.

Oberflächenmodifizierung mit GF20; Einführung von CarboxylgruppenSurface modification with GF20; Introduction of carboxyl groups

Die aus obiger Prozedur erhaltene Dispersion sollte einen pH-Wert von 9.0 nicht über­ schreiten. Gegebenenfalls sind weitere Waschzyklen durchzuführen (abzentrifugie­ ren/redispergieren). Zu der resultierenden ethanolischen Dispersion mit einem Volumen von 250 ml werden unter starkem Rühren 210 µl (75.4.10^-5 mol) 2-(3-Triethoxysilylpropyl)-Bernsteinsäureanhydrid (GF20) zugegeben. Die Reaktionslö­ sung wird 15 h bei 40°C gerührt. Zur Aufreinigung werden die Partikel abzentrifugiert und in Wasser redispergiert. Dieser Reinigungsschritt wird noch zweimal wiederholt. Man erhält eine wässrige Dispersion oberflächenmodifizierter Partikel mit einem Belegungsgrad von ca. 2 CO₂H-Gruppen/nm² Partikeloberfläche.The dispersion obtained from the above procedure should not exceed a pH of 9.0. If necessary, further washing cycles must be carried out (centrifuging / redispersing). 210 μl (75.4.10 ^-5 mol) of 2- (3-triethoxysilylpropyl) succinic anhydride (GF20) are added to the resulting ethanolic dispersion with a volume of 250 ml with vigorous stirring. The reaction solution is stirred at 40 ° C for 15 h. For purification, the particles are centrifuged off and redispersed in water. This cleaning step is repeated two more times. An aqueous dispersion of surface-modified particles with a degree of coverage of approximately 2 CO ₂ H groups / nm ² particle surface is obtained.

Beispiel 2Example 2 Herstellung von Konjugaten aus homogen durchgefärbten Silikatpartikeln mit Anti- Digogixenin-Antikörpern (<Dig<-Konjugate)Production of conjugates from homogeneously colored silicate particles with anti Digogixenin antibodies (<Dig <conjugates)

10 mg homogen durchgefärbte Silikatpartikel (0,5 ml 2%-ige Suspension, gemäß Beispiel 1 hergestellt) werden 30 min. bei 15000 upm zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet wird in 1 ml 2 mM MES-Puffer pH 6.5 resupendiert. Dieser Waschvorgang wird noch einmal wiederholt. Anschließend werden 100 µl 100 mM MES-Puffer pH 6.5, 100 µl 2% (w/v) Sulfo-N-Hydroxysuccinimid (S-NHS; Pierce No. 24510) in MES-Puffer pH 6.5 und 100 µl 0.2% (w/v) 1-Ethyl-3-(3-diaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDC; Pierce No. 22980ZZ) in MES-Puffer pH 6.5 zugegeben. Der pH-Wert wird kon­ trolliert und durch Zugabe von 0.1 N Natronlauge gegebenenfalls korrigiert. Nach 20 min. Inkubationszeit auf dem Rolleninkubator wird 30 min. bei 15000 upm zentrifugiert und der Überstand abgehoben. Das Pellet wird in 867 µl 2 mM MES-Puffer pH 6.5 redispergiert, 133 µl MAK<Dig<M-IgG-Lösung (monoklonaler Anti-Digoxigenin-IgG-Antikörper aus der Maus; c = 15 mg/ml) werden zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur (RT) im Rolleninkubator werden 30 µl Stopreagenz (1M Lysin) zugegeben und weitere 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wird 1 ml einer 2%igen Lösung von Rinderplasmaalbumin (RPLA) in 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.4 zugegeben und weitere 60 min bei RT in­ kubiert. Die Partikel-Konjugate werden zentrifugiert, der Überstand wird abgenommen und das Pellet wird im 1 ml 5 mM KP-Puffer resuspendiert. Der Waschvorgang wird zweimal wiederholt und nach dem letzten Zentrifugationsschritt werden die Partikel in 0.5 ml 2% RPLA in 5 mM Hepes-Puffer pH 7.4 resuspendiert und über einen 0.8 µm Cellu­ losenitratfilter (Sartorius) filtriert.10 mg homogeneously colored silicate particles (0.5 ml 2% suspension, according to Example 1 manufactured) are 30 min. Centrifuged at 15000 rpm. The supernatant is removed and the pellet is resuspended in 1 ml of 2 mM MES buffer pH 6.5. This washing process is repeated again. Then 100 ul 100 mM MES buffer pH 6.5, 100 µl 2% (w / v) sulfo-N-hydroxysuccinimide (S-NHS; Pierce No. 24510) in MES buffer pH 6.5 and 100 µl 0.2% (w / v) 1-ethyl-3- (3-diaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC; Pierce No. 22980ZZ) in MES buffer pH 6.5 was added. The pH is con trolled and corrected if necessary by adding 0.1 N sodium hydroxide solution. After 20 min. Incubation time on the roller incubator is 30 min. centrifuged at 15000 rpm and the The supernatant is lifted off. The pellet is redispersed in 867 ul 2 mM MES buffer pH 6.5, 133 µl MAK <Dig <M-IgG solution (monoclonal anti-digoxigenin IgG antibody from the mouse; c = 15 mg / ml) are added. After 2 h incubation at room temperature (RT) 30 µl stop reagent (1M lysine) are added in the roller incubator and a further 30 min  incubated at RT. Then 1 ml of a 2% solution of bovine plasma albumin (RPLA) in 5 mM potassium phosphate buffer pH 7.4 and a further 60 min at RT in cubed. The particle conjugates are centrifuged and the supernatant is removed and the pellet is resuspended in 1 ml of 5 mM KP buffer. The washing process will repeated twice and after the last centrifugation step the particles are in 0.5 ml of 2% RPLA in 5 mM Hepes buffer pH 7.4 resuspended and over a 0.8 µm Cellu Loose nitrate filter (Sartorius) filtered.

Beispiel 3Example 3 Anwendung von <Dig<-Silikatpartikelkonjugaten für TeststreifenassaysUse of <Dig <-silicate particle conjugates for test strip assays

Die für die Durchführung der Experimente benötigten Prüfteststreifen bestehen aus einer Kunststofffolie, auf die ein Auftragvlies, eine Membran sowie ein Saugvlies aufgeklebt sind. Auf der Membran sind zwei Proteine auf unterschiedlichen Strichen immobilisiert: Poly-Streptavidin (Poly-SA) bzw. Anti-Maus-Antikörper.The test strips required to carry out the experiments consist of one Plastic film on which an application fleece, a membrane and a suction fleece are glued are. Two proteins are immobilized on the membrane on different lines: Poly-streptavidin (poly-SA) or anti-mouse antibody.

Poly-SA ist auf der Target- oder Detektionslinie, das heißt der ersten Linie in Chromato­ graphierichtung immobilisiert, und soll über die Bindung von Biotin spezifisch an digoxi­ genyliertes und biotinyliertes Peptid gebundene Partikel abfangen. Die Anti-Maus-Anti­ körper sind auf der Kontroll-Linie, das heißt der zweiten Linie in Chromatographierich­ tung, immobilisiert und ist gegen Maus-IgG gerichtet. Die Anti-Maus-Antikörper sollen alle überschüssigen, nicht auf der Detektionslinie gebundenen Partikel (Konjugate aus Anti-Digoxigenin-Antikörpern aus der Maus und den Silikatpartikeln) abfangen.Poly-SA is on the target or detection line, i.e. the first line in Chromato immobilized in the graphing direction, and is said to bind biotin specifically to digoxi Catch genylated and biotinylated peptide bound particles. The anti-mouse anti Bodies are on the control line, that is the second line in the chromatograph tion, immobilized and directed against mouse IgG. The anti-mouse antibodies are said to all excess particles not bound on the detection line (conjugates from Catch anti-digoxigenin antibodies from the mouse and the silicate particles).

Das Auftragvlies wird je nach Teststreifenvariante mit der Probe, das heißt 1 µg/ml bzw 0 µg/ml eines biotinylierten und digoxigenylierten Peptids getränkt. Zum Verdünnen der Silikatpartikel bzw. zum Nachwaschen der Teststreifen wird ein 100 mM Hepes-Puffer pH 7.5 (50 mM NaCl, 70 mM Harnstoff, 1 mM EDTA, 2% RPLA) verwendet. Die Silikatparti­ kel werden im Hepes-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 µg/ml verdünnt. Depending on the test strip variant, the application fleece is mixed with the sample, ie 1 µg / ml or 0 µg / ml of a biotinylated and digoxigenylated peptide soaked. To dilute the Silicate particles or for washing the test strips is a 100 mM Hepes buffer pH 7.5 (50mM NaCl, 70mM urea, 1mM EDTA, 2% RPLA) was used. The silicate parties kel are diluted in the Hepes buffer to a final concentration of 100 µg / ml.  

Anschließend werden 60 µl der beschriebenen Probe auf das Reagenzvlies pipettiert und 10 min. chromatographiert. Danach werden 40 µl Hepes-Puffer ohne Probe auf das Rea­ genzvlies pipettiert und weitere 10 min. chromatographiert. Abschließend wird der Test­ streifen ausgewertet. In Abwesenheit des Peptids ist nur die Kontroll-Linie zu erkennen, in Anwesenheit des Peptids zusätzlich die Detektionslinie-Linie.Then 60 µl of the sample described are pipetted onto the reagent fleece and 10 min. Chromatograph. Then 40 µl of Hepes buffer without sample are applied to the Rea pipetted genzvlies and another 10 min. Chromatograph. Finally, the test strip evaluated. In the absence of the peptide, only the control line can be seen in Presence of the peptide additionally the detection line line.

Die erfindungsgemäßen Konjugate aus homogen gefärbten Silikatpartikeln und Biomole­ külen (hier: Anti-Digoxigenin-Antikörpern) sind somit als Nachweisreagenzien in chro­ matographischen Teststreifen geeignet. Als Farbstoffe sind für diese Verwendung sowohl fluoreszierende als auch nicht fluoreszierende Farbstoffe einsetzbar.The conjugates according to the invention from homogeneously colored silicate particles and biomoles cool (here: anti-digoxigenin antibodies) are thus in chro as detection reagents matographic test strips. As dyes for this use are both fluorescent and non-fluorescent dyes can be used.

Claims (12)

1. Konjugate aus Silikatpartikeln und Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass die Silikatpartikel homogen durchgefärbt sind.1. Conjugates of silicate particles and biomolecules, characterized in that the silicate particles are homogeneously colored. 2. Konjugate gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Silikatpartikel mit einer weiteren Schicht ummantelt sind.2. Conjugates according to claim 1, characterized in that the silicate particles with are covered by another layer. 3. Konjugate gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Silikatpartikel an ihrer Oberfläche mit funktionellen Gruppen modifiziert sind.3. Conjugates according to claim 1 or 2, characterized in that the silicate particles are modified on their surface with functional groups. 4. Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Bio­ moleküle kovalent an die Silikatpartikel gebunden sind.4. Conjugates according to one of claims 1 to 3, characterized in that the bio molecules are covalently bound to the silicate particles. 5. Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass die Bio­ moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Glykoproteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, peptidischen Nukleinsäuren, Sacchariden, Hormonen, Hapte­ nen und Antigenen.5. Conjugates according to one of claims 1 to 4, characterized in that the bio molecules are selected from the group consisting of proteins, glycoproteins, Peptides, nucleic acids, peptidic nucleic acids, saccharides, hormones, hapte and antigens. 6. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus homogen durchgefärbten Silikatparti­ keln und Biomolekülen, umfassend die Schritte

• - Herstellung einer silanisierten Farbstoffkomponente
• - Umsetzen der silanisierten Farbstoffkomponente und einer Silanverbindung unter geeigneten Bedingungen zu gefärbten Silikatpartikeln
• - Reinigen der entstandenen Dispersion von nicht eingebautem Farbstoff
• - gegebenenfalls Ummanteln der dabei entstandenen Silikatpartikel mit einer zusätz­ lichen Silikatschicht
• - Einbau von funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Partikel
• - Kopplung der Biomoleküle über die funktionellen Gruppen an die Silikatpartikel

6. A method for producing a conjugate from homogeneously colored silicate particles and biomolecules, comprising the steps

• - Production of a silanized dye component
• - Implementation of the silanized dye component and a silane compound under suitable conditions to colored silicate particles
• - Cleaning the resulting dispersion of non-built-in dye
• - If necessary, sheathing the resulting silicate particles with an additional silicate layer
• - Incorporation of functional groups on the surface of the particles
• - Coupling of the biomolecules via the functional groups to the silicate particles

7. Verwendung von Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Konjugaten erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 in einem diagnostischen Verfahren zum Nachweis eines Analyten.7. Use of conjugates according to one of claims 1 to 5 or conjugates obtainable by a method according to claim 6 in a diagnostic method for the detection of an analyte. 8. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch Zusammenbringen der Probe mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindepartnern, dadurch gekenn­ zeichnet, dass zum Nachweis des Analyten ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Konjugat, das durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 erhältlich ist, eingesetzt wird.8. Method for detecting an analyte in a sample by bringing the Sample with one or more analyte-specific binding partners, characterized records that for the detection of the analyte, a conjugate according to one of the claims 1 to 5 or a conjugate obtainable by a process according to claim 6, is used. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der analytspezifischen Bindepartner ein immunologischer Bindepartner ist.9. The method according to claim 8, characterized in that at least one of the analyte-specific binding partner is an immunological binding partner. 10. Diagnostisches Reagenz enthaltend ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder enthaltend ein Konjugat, das durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 erhältlich ist.10. Diagnostic reagent containing a conjugate according to one of claims 1 to 5 or containing a conjugate obtainable by a method according to claim 6. 11. Testkit enthaltend ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Konjugat, das durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 erhältlich ist und weitere für die Durchfüh­ rung des Tests erforderliche Bestandteile11. Test kit containing a conjugate according to one of claims 1 to 5 or a conjugate, which is obtainable by a method according to claim 6 and others for the implementation Components of the test required 12. Teststreifen enthaltend ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Konjugat, das durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 erhältlich ist, und weitere für den Ablauf des chromatographischen Tests erforderliche Bestandteile.12. Test strips containing a conjugate according to one of claims 1 to 5 or one Conjugate obtainable by a method according to claim 6 and others for components necessary for the sequence of the chromatographic test.