DE10044353A1 - Unkompetitive Inhibitoren der Helikase-Primase - Google Patents
Unkompetitive Inhibitoren der Helikase-PrimaseInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase-Enzymkomplexes mit anti-Herpes-Aktivität sowie Medikamente, die diese Verbindungen in geeigneter Formulierung enthalten. Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von anti-viral wirksamen Substanzen, um Herpes-Infektionen bei Mensch und Tier zu behandeln.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase Enzym
komplexes mit anti-Herpes Aktivität sowie Medikamente, die diese Verbindungen in
geeigneter Formulierung enthalten. Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren
zur Identifizierung von anti-viral wirksamen Substanzen, um herpes Infektionen bei
Mensch und Tier zu behandeln.
Die Wirkung der Verbindungen beruht im wesentlichen auf der unkompetitiven
Hemmung der viralen Helikase-Primase, der simultanen Bindung der Substanzen an
die Helikase und die Primase Untereinheit des Enzymkomplexes, der Inhibition der
Virusreplikation in vitro und in vivo sowie nicht zuletzt auf den sehr guten
pharmakokinetischen und pharamakodynamischen Eigenschaften, die zu einer
bislang nicht erreichten Wirkung im Tiermodell führen.
Im folgenden werden die einzelnen Aspekte wie der virale Replikationsassay in
Zellkultur, die Bindung eines Moleküls an zwei Targets, die Herpes Viren sowie das
Forschungsumfeld, der Stand der Technik und die Erfindung selbst beschrieben.
In dieser Anmeldung ist ein viraler Replikationsassay beschrieben, der es erlaubt,
wirksame und verträgliche antivirale Verbindungen zu identifizieren. Die Strategie
basiert auf der simultanen Auswahl von Molekülen nach 2 wesentlichen Kriterien
und zwar erstens mit Bezug zur anti-mikrobiellen Wirkung (das Molekül bindet
funktionell an ein relevantes Target (Positivselektion)) und zweitens müssen die
Verbindungen verträglich sein, d. h. die Moleküle binden oder modulieren dann keine
unerwünschten (Wirts-)Targets (Negativselektion).
Zahlreiche Medikationen und Therapien wurden erfunden und in der jüngeren
Vergangenheit werden diese Methoden zunehmend kombiniert, um die therapeu
tische Wirksamkeit zu erhöhen, weil Monotherapien in einigen Fällen nicht den
gewünschten profunden Nutzen bei der Applikation am Patienten gezeigt haben.
Leider werden bei der Anwendung der Kombinationstherapie in einigen Fällen neben
der erwünschten Potenzierung des Therapieeffektes auch verstärkt Nebenwirkungen
beobachtet, die auf eine geringe Verträglichkeit zurückzuführen sind. Als ein klassi
sches Beispiel der Kombinationtherapie kann hier die Behandlung der HIV-Infizier
ten bzw. das Therapieschema der AIDS Patienten aufgeführt werden.
Im Bereich der Antiinfektiva Forschung zum Beispiel, kann ein Wirkstoff, der
simultan zwei essentielle Targets im Vermehrungszyklus eines Pathogens inhibiert,
einen verstärkten Therapieeffekt entfalten. Diese Wirkungsverstärkung basiert auf
kumulativen, inhibitorischen Effekten wie das in der Vergangenheit für den analogen
Fall der Kombinationstherapie, die häufig der (ein Molekül Chemo-)Monotherapie,
bei welcher der Wirkstoff des Therapeutikums in der Regel nur eine relevante
Bindungstasche eines Proteins oder einer Untereinheit eines Proteinkomplexes
moduliert, überlegen ist, gezeigt wurde. Bindet der Wirkstoff im Bereich der Kon
taktstelle von zwei Targets so kann häufig eine stärkere Bindung aufgrund von
Aviditätseffekten festgestellt werden. Die besseren Bindungseigenschaften und oder
die kummulativen inhibitorischen Effekte resultieren in einer überlegenen therapeu
tischen Wirkung, die sich idealerweise ohne Nebenwirkungen entfaltet, d. h. durch
eine sehr gute Verträglichkeit auszeichnet. Für den Patienten bedeutet das erfreu
licherweise in der Konsequenz niedrigere Dosen.
Die Herpesviridae entwickelten sich in der Evolution über Millionen von Jahren und
sind in der Natur sehr weit verbreitet. Mitglieder dieser Familie wurden im Men
schen, nicht-humanoiden Primaten und den meisten anderen Säugetieren und Verte
braten nachgewiesen (Virology, 1996, Fields et al. Lippincott-Raven Publishers,
Philadelphia, PA 19106, USA). Bei den Herpesviren handelt es sich um umhüllte,
doppelsträngige DNA Viren, die permissive Zellen infizieren, welche auf ihrer
Zelloberfläche neben negativen Ladungen des Heparansulfates und oder der
Glykosaminoglycane zusätzlich noch den sogenannten herpes viral entry mediator
tragen. Eine bemerkenswerte Eigenschaft der Viren ist ihre Fähigkeit, eine
lebenslange Latenz im infizierten Wirt auszubilden und bei endogenen oder externen
Stimuli aus dem Pool der latent infizierten Zellen mehr oder weniger häufig zu
reaktivieren und rekurrente Infektionen auszulösen.
Acht humane Herpesvirusen (HHV1 to HHV8) wurden bislang beschrieben. Die
viralen Genome (~ 125-230 kbp Information) wurden sequenziert und in den
gängigen Datenbanken, die auch über das Internet verfügbar sind, hinterlegt
(GeneBank, EMBL database etc.). Hohe Sequenzhomologien wurden beim Vergleich
der Genome identifiziert. Im besonderen trifft dieses auf die für die Helikase und
Primase kodierenden Gene zu; das bedeutet, daß die Replikationsmaschinerie unter
den Herpes Viren hochkonserviert ist aber beim Vergleich mit eukaryontischen
Genen klar von der DNA Replikation des Wirtes abgegrenzt werden kann. Die
Genome kodieren für mehr als 50 Leserahmen, die für den Vermehrungszyklus der
Viren in vitro und oder in vivo essentiell sind. Zahlreiche Publikationen diskutieren
die Relevanz oder die Eignung dieser potentiellen Targets für eine erfolgreiche
antivirale Therapie. Die Funktion des Helikase-Primase Enzymkomplexes im
Replikationszyklus und dessen Eignung als Target für eine effiziente antivirale
(Chemo) Therapy einer Herpes-viralen Infektion ist bereits veröffentlicht (Herpes
Simplex Virus Replication, 1997, Annual review of Biochemistry, Boehmer PE &
Lehmann IR, 66, 347-384; The Structure and function of the HSV DNA replication
proteins: defining novel antiviral targets, 1993, Antiviral Research, Matthews JT,
Terry BJ, Field AK, 20, 89-114).
Aufgrund von ähnlichen biologischen Eigenschaften wurden die Herpesviren in 3
Subfamilien, und zwar in α-(HHV1 bis 3), β-(HHV5 bis 7), und γ-(HHV4 und
HHV8) Herpesviren, eingeteilt. Trivialnamen wurden auf Grundlage der klinischen
Symptome des Krankheitsbildes oder einfach aus historischen Gründen wie folgt
abgeleitet: Herpes simplex virus 1 und 2 (HSV-1 und -2 verursachen Herpes labialis
und genitalis) stehen auch für HHV1 und 2, das Varicella Zoster Virus (VZV ist der
Erreger der Windpocken und der Gürtelrose) wird synonym mit HHV3 und das
Epstein-Barr-Virus (EBV) und das Cytomegalievirus (HCMV) werden synonym mit
der Bezeichnung HHV4 und 5 benutzt.
Innerhalb einer Population liegt der Anteil der mit einem oder mehreren Herpes
Viren Infizierten zwischen weniger als 10 und mehr als 90% abhängig von der
Altersgruppe, dem Geschlecht, dem sozialen Status, geographischen Aspekten und
natürlich davon welches Herpesvirus untersucht wird. Gerade weil es sich bei einigen
Herpesviren um ubiquitär vorkommende Pathogene handelt, die eine Reihe von
Krankheiten auslösen, welche von leichten Symptomen, die nur die normalen
Tagesaktivitäten beeinträchtigen, bis hin zu Visus oder lebensbedrohlichen
Erkrankungen reichen kann; insbesondere seien hier die bei immunsupprimierten
Patienten die Keratitis, eine generalisierte Virämie oder bei AIDS Patienten eine
Retinitis, bei Schwangeren der Abort und bei Neugeborenen eine Hepatitis,
Enczephalitis oder Taubheit genannt; ist ein starker medizinischer Bedarf an einer
sicheren und wirksamen Medikation vorhanden und es wurden umfangreiche
Forschungsprogramme aufgelegt, um neue, effektivere Virustherapeutika zu finden.
Zovirax™ (Acyclovir), ein selektiver und spezifischer Inhibitor der Herpes Virus
Replikation, war Ende der 70iger Jahre des 20. Jahrhunderts der erste Meilenstein in
der Entwicklung antiviraler Wirkstoffe. Neue Abkömmlinge dieses kommerziell sehr
erfolgreichen Nukleosids sind Penciclovir oder die or pharmakokinetisch optimierten
Pro-drugs Valacyclovir und Famciclovir, die dem Patienten bequemere Dosis oder
Therpieregime eröffnen, wurden Mitte bis Ende der 90iger Jahre ausgeboten.
Nukleoside sind heute in Ermangelung einer Alternative in der Tat die Therapeutika
der Wahl bei Herpes Infektionen. Bei den Nukleosiden handelt es sich jedoch um
sogenannte Pro-drugs, die zuerst durch die virale Thymidin-Kinase (TK)
phosphoryliert und dann nachfolgend von zellulären Kinasen umgesetzt werden
müssen, damit der eigentliche Wirkstoff das Nukleosidtriphosphat die Aktivität der
viralen DNA-polymerase hemmen kann. Weist der Virus keine funktionell aktive TK
auf, wie das zum Beispiel bei resistenten HHV1 Mutanten, bei TK negativen Viren
wie HCMV oder Viren, die nicht über eine optimale Primärstruktur mit Bezug zur
viralen DNA-Polymerase aufweisen, der Fall ist, so kann der Wirkstoff nicht sein
volles Potenital entfalten, der Selektivitätsindex ist deutlich reduziert und höhere
Dosen müssen appliziert werden, die wiederum zu vermehrten Nebenwirkungen
führen können. Da es sich bei den Nucleosiden und Nukelotiden um obligate oder
nicht-obligate Terminatoren der DNA-Polymerization handelt, besitzen sie
mutagenes Potential was für das Nucleosid Cymevene™ (Ganciclovir) umfangreich
dokumentiert ist. Zusammengefast kann man feststellen, daß eine mögliche
Breitbandspektrum anti-Herpes Aktivität, die Wirksamkeit der Medikamente
besonders bei spät einsetzender Therapie, die Arzneimittelsicherheit und das
Auftreten von Nukleosid-resistenten Viren, die anvisierten Ziele für die nächste
Generation von Therapeutika, die auf neuen Wirkmechanismen beruhen, klar
umreissen.
Eine neue Option, der ternäre Herpes Helikase Primase Komplex bestehend aus UL5,
UL8 und UL52, ist bekannt (Ann. Ref. Biochem. 1990, 59, 289-329), ebenso wie
seine Eignung als Anti-Herpes-Target (Antiviral Research 20, 1993, 89-114.
Inhibitoren der Herpes-Helicase-Primase sind ebenfalls bekannt aus J. Med. Chem.
1995, 38, 1811-1819.
Die Patentanmeldung WO 97/24343 beschreibt eine Methode, um Inhibitoren mit
anti-herpes Eigenschaften zu identifizieren, die dadurch gekennzeichnet ist das
Verbindungen ausgewählt werden, die, sofern sie and den DNA-Helikase-Primase
Komplex binden, den DNA-Enzymkomplex stabilisieren. Es wird angenommen, daß
diese Inhibitoren an allosterische Bindungsstellen auf dem UL5 oder UL52
Genprodukt der HSV Helikase-Primase oder homologer herpes viraler Enzym
komplexe binden, und somit den Stabilisierungseffekt auslösen. Diese allosterische
Bindungstasche soll im Bereich der A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit
lokalisiert sein und die Inhibition wird durch Blockierung eines terminalen
Zinkfingers auf einer katalytischen Untereinheit des Herpes Helikase-Primase
vermittelt. Ein entscheidender Nachteil dieser Methode ist es, daß häufig
Verbindungen identifiziert werden, die nicht den notwendigen Selektivitätsindex in
vitro oder die gewünschte Verträglichkeit in vivo aufweisen, und in der Konsequenz
in der Regel nicht für die Behandlung von Herpes Infektionen aufgrund der nicht
gewährleisteten Arzneimittelsicherheit eingesetzt werden können.
Die Anmeldung WO 99/42455 und die Veröffentlichung von Spector, F. C., Journal
of Virology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 beschreibt Verbindungen die
exklusiv an die UL5 Untereinheit des Helikase-Primase Enzymkomplexes binden,
was durch umfangreiche Mutationsanalyse von mindestens 25 unterschiedlichen UL5
Mutanten nachgewiesen wird. Es wird weiterhin festgestellt, daß z. B T157602 als
Verteter dieser Verbindungsklasse weder ATP noch DNA kompetitiv vom
Enzymkomplex verdrängt. Substituierte Thiazolylphenylderivate sind bemerkens
werterweise auch als essentielles und zentrales Strukturmotiv für die Verbindungen
der oben zitierten Anmeldung WO 97/24343 beschrieben.
Obwohl der Helicase-Primase-Komplex schon geraume Zeit bekannt ist und ein
dringendes Bedürfnis nach neuen antiviralen Targets vorherrscht (Antiviral Research,
20, 1993, 89-114), konnte trotz diverser Patentanmeldungen auf diesem Gebiet bisher
keine Klasse von geeigneten Verbindungen identifiziert werden, die es bis zur
Marktreife geschafft hätte. Dies ist neben mangelnder Aktivität zum großen Teil auf
das Auftreten starker Nebenwirkungen zurückzuführen.
Ziel dieser Erfindung ist es deshalb ein Verfahren bereitzustellen, mit dem nicht nur
alternative oder wirksamere Verbindungen identifiziert werden können, sondern vor
allem Wirkstoffe mit einem verbesserten Selektivitätsindex in vitro und einer
überlegenden Verträglichkeit mit Bezug zum Stand der Technik gefunden werden
können. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist es Wirkstoffe zu identifizieren und
bereitzustellen, die zur Therapie von Infektionen eingesetzt werden können, die
durch Nukleosid/Nukleotid resistente Herpes Viren ausgelöst werden.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich Arzneimittel, die die nachfolgend
aufgeführten Merkmale bzw. Eigenschaften aufweisen und den Herpes-Helikase-
Primase Komplex in einer hier beschriebenen neu gefundenen Art und Weise
inhibiieren zur Behandlung von Herpes-Infektionen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung löst die oben beschriebene Problemstellung indem
Arzneimittel, die unkompetitive Inhibitoren der Herpes-Helicase-Primase enthalten,
zur Verfügung gestellt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel nach dadurch
gekennzeichnet, daß die Helicase-Primase mindestens 50% homolog sind zur
Helicase-Primase des Herpes-Simplex-Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz
oder die Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Virus um Herpes-
Simplex-Virus 1 handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen
ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, gleichzeitig an die Helikase und die
Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes zu binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen
ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die DNA-abhängige NTPase Aktivität
der Helikase-Primase zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen
ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus zu
inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen
ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus in
Zellkultur bei einer Konzentration von 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen
ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Herpes Virus in
Zellkultur bei einer Konzentration von ≦ 500 nM um mindestens 50% zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Viren um PRV
oder BHV handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren zum Identifizieren von
Verbindungen mit Anti-Herpes-Aktivität beschrieben, daß dadurch gekennzeichnet
ist, daß die Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Helikase-Primase zu inhibieren,
getestet werden und solche Verbindungen ausgewählt werden, die den Helikase-
Primase Enzymkomplexes unkompetitiv inhibieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen, die nach
irgendeiner hier beanspruchten Methode oder Verfahren identifiziert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung dadurch gekenn
zeichnet, daß die Verbindung kein Nukleosid oder Nukleotid ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbin
dungen, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von
Herpes Infektionen verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel
oder pharmazeutische Formulierungen, die Verbindungen entsprechend den oben
aufgeführten Methoden oder Verfahren enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beschreibt die Erfindung ein
Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen in Säugern, daß
dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt,
eine therapeutisch wirksame Menge des hier beanspruchten Arzneimittels oder der
pharmazeutischen Formulierung verabreicht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Verbindungen enthalten, die folgende
allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,
Y-A-X-SO2NR1R2 (I)
worin
Y für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen ge sättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4'R5'-C(O)-CR4R5-, -CR4'R5'-C(O)-NR9-, -NR9'-C(O)-CR4R5- oder -NR9'-C(O)-NR9- steht,
worin
R4, R4', R5, R5', R9 und R9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Hetero cyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebunde nen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aroma tischen Heterocyclus steht,
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl oder (C3-C8)-Cycloallcyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° +- 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
Y für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen ge sättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4'R5'-C(O)-CR4R5-, -CR4'R5'-C(O)-NR9-, -NR9'-C(O)-CR4R5- oder -NR9'-C(O)-NR9- steht,
worin
R4, R4', R5, R5', R9 und R9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Hetero cyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebunde nen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aroma tischen Heterocyclus steht,
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl oder (C3-C8)-Cycloallcyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° +- 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
Die hier dargelegte Erfindung löst die oben aufgeführten Probleme bzw. erfüllt die
gesteckten Ziele für neue Therapeutika, indem Verfahren zur Identifizierung neuer
(nicht-nukleosidischer) Wirkstoffe, die direkt die enzymatische Aktivität des Herpes
Helikases Primase Komplexes auf eine neue hier erstmalig beschriebene Art und
Weise inhibieren, beschrieben werden. Die Inhibition dieses essentiellen Enzym
komplexes führt bei geeigneter Struktur der Verbindung, die hier durch ein gene
risches Pharmakophormodel neben Beispielhaft konkret aufgeführten Wirkstoffen
offenbart wird, nicht nur zur Inhibition der DNA replication sondern auch
insbesondere zur Inhibition der Herpesvirus Replikation in vitro und in vivo. Darüber
hinaus, gerade weil der Enzymkomplex der Helikase-Primase bei der Familie der
Herpes viridae hoch konserviert ist, konnten mit der vorliegenden Erfindung eine
Breitbandspektrum anti-Herpesvirus Aktivität der Verbindungen zeigen (Tabelle 1).
Die selektive Wirkung der Inhibitoren auf Mitglieder der Familie der Herpesviren
und insbesondere gegen Acyclovir-resistente Herpesvirusen, in Kombination mit
einem geeigneten Sicherheitsprofil machen diese Wirkstoffe zu einem seit Jahren
gewünschten Agens, um Herpes Infectionen zu behandeln.
Der Begriff "Herpes", sofern er im Kontext dieser Erfindung gebraucht wird, schließt
alle Viren der Familie der Herpes Viren ein und umfaßt insbesondere die
Herpesviren, die für Helikase-Primase Proteine kodieren. Dies gilt besonders für
Proteine, die homolog sind mit Bezug zur Herpes Helikase-Primase des HSV Virus.
Insbesondere gilt dies für solche, bei denen die Helikase oder Primase mindestens 50%
homolog zur Helikase oder Primase des Herpes simplex Virus 1 ist, basierend auf
der Nukleotid oder Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist. Zur Familie der
Herpesviren gehören zum Beispiel HHV-1 bis HHV-8, EHV, BHV, PRV usw.
Die Herpes simplex Viren 1 and 2 werden entsprechend ihrem Serotyp bezeichnet die
auf Basis spezifischer monoklonaler Antikörperreaktionen charakterisiert sind.
Der Begriff Helikase-Primase bezieht sich auf den Helikase-Primase Enzymkomplex,
der zur Replikation der viralen DNA notwendig ist. Im Falle der Herpes simplex
Viren besteht dieser Enzymkomplex aus den Proteinen der Gene UL5, UL8 und
UL52 oder zumindest den (notwendigen oder essentiellen) UL5 und UL52 Gen
produkten; handelt es sich um weitere Mitglieder der Herpesfamilie, so wird Bezug
auf die korrespondierenden Homologe genommen.
Der Begriff Helikase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der
an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Herpes simplex Viren
handelt es sich hierbei um das UL5 Genprodukt; handelt es sich um weitere Mit
glieder der Herpesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe
genommen.
Der Begriff Primase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der
an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Herpes simplex Viren
handelt es sich hierbei um das UL52 Genprodukt; handelt es sich um weitere
Mitglieder der Herpesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe
genommen.
Die Abkürzung moi steht für "multiplicity of infection" und ist der Quotient der
Zahl der infektiösen Partikel oder Zellen des Pathogens dividiert durch die Zellzahl
der zu infizierenden Zellen.
(MOI = Zellzahl oder Zahl der infektiösen Partikel des Erregers/Zahl der Zellen, die infiziert werden).
(MOI = Zellzahl oder Zahl der infektiösen Partikel des Erregers/Zahl der Zellen, die infiziert werden).
Der Begriff IC50 oder EC50 beschreibt die Konzentration oder die Menge an
Wirkstoff, die benötigt wird um eine 50%ige Inhibition in einem gegebenen Tes
tsystem zu erreichen oder die effektive Konzentration, die benötigt wird um ein
halbmaximales Signal in einem Assay zu erreichen.
Der Begriff Selektivitätsindex (SI) bezieht sich auf den Quotient der Konzen
trationen, bei der die Zellvitalität auf 50% gegenüber der Zellkontrolle reduziert ist,
dividiert durch die Konzentration, bei der die anti-mikrobielle Wirkung mindestens
50% einer maximal möglichen Inhibition der Erregervermehrung erreicht, d. h. SI =
(CC50/IC50). Je größer diese Zahl ist, um so größer ist die Verträglichkeit der Ver
bindung. Bevorzugt werden Verbindungen mit SI-Werten größer 10.
Der Begriff therapeutischer Index (TI; Verträglichkeit) bezieht sich auf einen
Quotient der lethalen Dosis (LD; lethal dose) bei der 50% der Versuchstiere auf
grund der Substanzwirkungen sterben und der effektiven Dosis (ED; effective dose)
bei der 50% der Versuchtiere die Infektion überleben TI = (LD50/ED50).
Der Begriff Formulierung mit Bezug zu Wirkstoffen beschreibt eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die aus nicht-toxischen, generell inerten Hilfsstoffen und
Trägermaterialen, die keinen negativen Effekt auf die Wirkung des aktiven
Bestandteil verursachen, besteht, sondern vielmehr eine optimale Applikation des
Wirkstoffes mit Bezug zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik erlauben.
Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit der enzymatischen
Aktivität Verwendnung findet, die Inhibition der maximal möglichen Enzymaktivität
um mindestens 50% bei einer Konzentration von etwa IC50 = 100 µM oder weniger
und bevorzugt bei einer Konzentration die so niedrig wie möglich ist in einem
entsprechenden in vitro Assay der zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität
eingesetzt wird.
Der Begriff unkompetitive Hemmung beschreibt einen seltenen Hemmtyp, bei
welchem der Hemmstoff an den Enzym-Substrat-Komplex bindet Bei diesem
Hemmtyp ändert sich die Maximalgeschwindigkeit, Km bleibt im Rahmen der
experimentellen Unsicherheit unverändert. Der Begriff unkompetitiv schließt aus
drücklich die partiell unkompetitiven Hemmtypen mit ein.
Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit dem in vitro
viralen Replikationassay gebraucht wird, generell die Inhibition des Mikrobenwachs
tums um ca. 50% bei einer Konzentration von IC50 = 100 µM oder geringer und
bevorzugt eine Konzentration, die so niedrig ist wie möglich, um den Wert zu
erreichen.
Der Begriff Target bezieht sich hier in der Regel auf das Zielmolekül, welches
gegebenenfalls durch Wirkstoffe in seiner Aktivität moduliert wird. Das Target ist
allgemeiner gesprochen häufig ein Genprodukt, das essentiell an der Entstehung
eines Krankheitsbildes beteiligt ist.
Der Begriff der Mutation in einem Target beschreibt eine Mutation in einem Gen, die
zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des entsprechenden Protein führt.
Der Begriff Reduktion mit Bezug zum Verlust der Erhöhung oder Erniedrigung der
Aktivität wird verwendet, wenn die Änderung der Aktivität signifikant ist, besser den
Faktor 2 erreicht und bevorzugt sich um eine Größenordnung ändert.
(C1-C6)-Alkyl steht zweckmäßig für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter
Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (C1-C4). Beispielsweise seien genannt:
Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-
Hexyl. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis
3 Kohlenstoffatomen ((C1-C3)Alkyl).
(C6-C10)-Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlen
stoffatomen. Bevorzugte Arylreste sind Phenyl und Naphthyl.
(C3-C8)-Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopropyl, Cyclopentyl,
Cyclobutyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Bevorzugt seien genannt:
Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Die Bedeutung von (C3-C6)Cycloalkyl
steht entsprechend zweckmäßig für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclo
hexyl.
Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der
Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Pyridyl, Pyrimidyl, Thienyl, Furyl,
Pyrrolyl, Thiazolyl, N-Triazolyl, Oxazolyl oder Imidazolyl. Bevorzugt sind Pyridyl,
Furyl, Thiazolyl und N-Triazolyl.
Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer benzokondensierter Heterocyclus mit bis zu 3
Heteroatomen aus der Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Benz
imidazolyl.
Ein gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundener 3- bis 8- gliedriger ge
sättigter oder ungesättigter, nicht aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Hetero
atomen aus der Reihe S, N und/oder O schließt z. B. Morpholinyl, Piperidinyl,
Piperazinyl, Methylpiperazinyl, Thiomorpholinyl oder Pyrrolidinyl ein sowie 3-, 7-
und 8-gliedrige Heterocyclen, wie z. B. Aziridine (z. B. 1-Azacyclopropan-1-yl),
Azetidine (z. B. 1-Azacyclobutan-1-yl) und Azepine (z. B. 1-Azepan-1-yl) ein. Die
ungesättigten Vertreter können 1 bis 2 Doppelbindungen im Ring enthalten.
Die in dieser Patentanmeldung beschriebenen Verbindungen bzw. die Pharma
kophorformel sowie der Wirkmechanismus der Substanzen ist neu und kann klar
insbesondere gegen die Anmeldungen WO 97/24343, WO 99/42455 sowie alle bis
zur Priorität veröffentlichten Publikationen abgegrenzt werden. Während die in der
Anmeldung WO 97/24343 offengelegten Substanzen an eine allosterische Bindungsstelle
auf dem UL5 oder dem UL52 Genprodukt der HSV Helikase Primase binden,
und somit die Bindung Enzymkomplexes an das DNA-Substrat verstärken bzw.
stabilisieren (den Autoren zufolge liegt diese allosterische Bindungsstelle innerhalb
der sogenannten A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit und der inhibitorische
Effekt wird durch Modulation eines terminalen Zinkfingermotivs auf einer
katalytischen Untereinheit des Herpes Helikase-Primase Komplexes verursacht),
binden die in der Anmeldung WO 99/42455 veröffentlichten Substanzen exklusiv an
die UL5 Untereinheit des Komplexes, was explizit in der Veröffentlichung von
Spector, F. C., Journal of Virology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 festgestellt
wird.
Geeignete Verbindungen, die entsprechend dem oben genannten Mechanismus den
Helikase-Primase Komplex inhibieren, können identifiziert werden, indem die
Fähigkeit der Substanzen auf Bindung an die Helikase (Untereinheit) und oder die
Primase (Untereinheit) des Helikase-Primase Komplexes geprüft wird. Bevorzugt
wird die Fähigkeit der Wirkstoffe die Enzymassoziierte DNA-abhängige NTPase
Aktivität der Herpes Helikase-Primase (wie zum Beispiel Helikase-Primase des
Herpes simplex virus) zu inhibieren geprüft, was vorteilhafterweise technisch mittels
eines Hochdurchsatzscreenings (HTS, high throughput screening) durchgeführt wird.
Alternativ kann auch die Fähigkeit der Substanzen die virale Replikation in einem in
vitro Zellkultursystem zu inhibieren getestet werden und anschließend die
Substanzen ausgewählt werden, die die DNA-abhängige Hydrolyse relevanter
Nukleotide unkompetitiv inhibieren.
Zahlreiche Methoden sind beschrieben, um direkt die Bindung von Molekülen an
Proteine zu messen, jedoch erfordern viele dieser Testsysteme, um zu quantitativen
Ergebnissen zu gelangen, gereinigtes Protein oder zumindest eine angereicherte
Fraktion. Es sollte an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, daß nicht alle an das
Protein oder Enzym bindenden Moleküle die Funktion des Targets in der ge
wünschten Art und Weise modulieren.
Der enzymatische Assay kann einfach durchgeführt werden, aber das Enzym muß
funktionell aus einer Herpes infizierten Zellkultur gereinigt werden. Alternativ kön
nen die Gene des Enzymkomplexes mit gentechnologischen Methoden in ein ent
sprechendes Expressionssystem kloniert und dann exprimiert werden. Wird das
Enzym funktionell produziert, so muß es mit den gängigen Aufreinigungstechniken
angereichert oder bevorzugt rein dargestellt werden.
Ein viraler Replikationsassay kann sehr einfach wie in dieser Anmeldung be
schrieben in einem Zellkultursystem durchgeführt werden. Dieser Assay ist mög
licherweise sensitiver als die genannten enzymatischen Testsysteme, weil die Virus
vermehrung in Zellkultur das reale Infektionsgeschehen am besten simuliert und
gegebenenfalls die Zahl der Enzymmoleküle niedriger ist mit Bezug zum Inhibitor
als im Enzymassay. Werden Inhibitoren der Virusreplikation identifiziert, so müssen
jedoch weitere Methoden wie z. B das Herstellen von Mutanten mit anschließender
Genomsequenzierung in Kombination mit einer Komplementationsanalyse ange
wendet werden, um den Wirkmechanismus aufzuklären bzw. das zugrundeliegende
Target (im vorliegenden Beipiel die virale Helikase-Primase) zu identifizieren.
Wirkstoffe, die einen Effekt im Enzymassay zeigen oder die Virusreplikation im
Zellkultursystem hemmen, können näher in einem Test charakterisiert werden, der
Rückschlüsse auf die Bindungseigenschaften des Moleküls an den Helikase-Primase
Komplex erlaubt. Andererseits können Verbindungen die einen Effekt im Bindungs
test hervorrufen nachfolgend mittels eines Enzymtestes funktionell genauer unter
sucht oder auf Hemmung der Virusreplikation in Zellkultur geprüft werden. Auch
wenn die nachfolgend beschriebenen Testsyteme in einer möglichen Reihenfolge
aufgeführt werden, so ist darunter nicht zu verstehen, daß alle Tests für eine erfolg
reiche Identifizierung von Herpes Helikase-Primase Inhibitoren in exakt dieser
Reihenfolge durchgeführt werden müssen, sondern daß vielmehr die Zahl der ver
schiedenen Tests wie auch deren Reihenfolge im Ermessensbereich des Fachmannes
liegt, um effizient zum Ziel zu gelangen.
Wiederum andere Testsysteme erlauben es festzustellen, ob ein gegebener Wirkstoff
die Enzym-vermittelte RNA Primer Biosynthese inhibiert oder ob die Substanz die
Helikaseaktivität des Komplexes moduliert.
DNA und zwar bevorzugt Einzelstrang-DNA mit einer entsprechenden Primase
Konsensus Sequenz im Falle des Primase Assays oder ein DNA Substrat das eine
Replikationgabel ähnliche Struktur ausbildet kann im Helikase Assay eingesetzt
werden. Zahlreiche Optionen sind beschrieben und an dieser Stelle sei auf die Über
sichtsliteratur (Boehmer PE & Lehmann IR 1997) oder die speziellen Publikationen
(High-Throughput Screening Assay for Helicase Enzymes, 1998, Analytical Bio
chemistry, M Sivaraja, H Giordano, MG Peterson, 265, 22-27) verwiesen
Bevorzugte oder geeignete Verbindungen, die in dieser Anmeldung beschrieben
werden, interkalieren nicht in noch binden sie auf andere Weise direkt an
doppelsträngige DNA.
In all den oben beschriebenen Verfahren kann die (nicht-nucleosidische) Verbindung
auch auf die Fähigkeit geprüft werden, die Herpes Helikase-Primase vermittelte RNA
Primer Biosynthese oder die or Helikase Aktivität zu inhibieren. Entscheidend ist
jedoch, daß die in dieser Erfindung beschriebenen (nicht-nukleosidischen) Wirkstoffe
auf ihre Fähigkeit geprüft werden, die Virusreplikation in Zellkultur bei einer
Konzentration von weniger als 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren. Bevorzugt
werden die Verbindungen ausgewählt, die bei so niedrigen Konzentrationen wie
möglich die Virusreplikation hemmen. Es muß jedoch hierbei beachtet werden, daß
diese Verbindungen auch die gewünschten pharmakokinetischen pharmakodyna
mischen Eigenschaften aufweisen.
Es sollte nicht unerwähnt bleiben, daß die Verbindungen, die formulierten Wirkstoffe
und die offenbarten Verfahren geeignet sind, um erfolgreich Herpesinfektionen, die
nicht auf eine Nukleosidtherapie ansprechen und in der Regel durch Nukleosid
resistente Herpesviren ausgelöst werden, zu behandeln.
Dieser Aspekt der Erfindung schließt natürlich das Verfahren ein, Acyclovir
resistente Herpesinfektionen dadurch zu behandeln, daß dem infizierten Säugetier
wirksame Dosen einer der offenbarten Verbindungen, die gegebenenfalls entspre
chend formuliert sein kann, verabreicht werden.
Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konnten Inhibitoren der Herpes
Helikase-Primase erfolgreich identifiziert werden. Die spezifische und selektive
Wirkung der Verbindungen gegen Herpesviren in Kombination mit einem entspre
chendem Sicherheitsprofil machen die Wirkstoffe zu dem gewünschten Agens um
zukünftig Herpesinfektionen zu behandeln.
Die antivirale Aktivität der Verbindungen kann mit biochemischen, microbiologi
schen und biologischen Verfahren gezeigt werden.
Diese Erfindung offenbart die Inhibition der viralen Replikation der Herpes Viren in
Zellkultur, was exemplarisch für Mitglieder der Herpesfamilie wie HSV, BHV und
PRV gezeigt wird (siehe Tabelle 1).
Der in Zellkultur durchzuführende HTS fähige virale Replikationstest liefert auf
effizientere Art und Weise analoge Daten wie der sogenannte Plaque Reduction
Assay und ist nachfolgend beschrieben.
Ein biochemisches Verfahren, um die Wirksamkeit der Verbindung gegen das virale
Target Helikase-Primase zu demonstrieren, wird im Abschnitt biochemische Assay
beschrieben. Dieser ATPase Assay ist nur eine der zahlreichen Optionen die dem
Fachmann zur Verfügung stehen und Beispielsweise in "High-Throughput Screening
Assay for Helicase Enzymes, 1998, M. Sivaraja, H. Giordano and M. G. Peterson,
Analytical Biochemistry, 265, 22-27" aufgeführt sind. Weitere Testsysteme die dort
in diversen Konfigurationen aufgeführt sind, eignen sich um festzustellen, ob
gegebenenfalls Verbindungen direkt die Helikase oder die Primase Aktivität des
Helikase-Primase Komplexes hemmen.
Der Nachweis eines therapeutischen Effektes der Verbindungen wird mittels eines in
vivo Modells geführt. Das so bezeichnete lethal challenge Tiermodel sowie die
Applikationsdosen und Therapieregime sind unten detailiert zusammengefaßt.
Tabelle 1 faßt die Hemmdaten des Helikase-Primase Enzymkomplexes (Ki Werte),
Ergebnisse zum Wirkmechanismus, die IC50 und EC50 Hemmdaten der Virus
replikation der Wildtyp und Therapie-resistenten HSV Stämme, die ED50 Werte vom
Wildtypvirus im Tiermodel und die relevanten Mutations- sowie Kreuzresistenz
muster zusammen.
Ein direkter Vergleich der in Zellkultur gewonnenen IC50 Werte zeigt, daß einige
ausgewählte Verbindungen um mindestens eine Größenordnung potenter sind als der
Marktstandard Acyclovir (Zovirax™). Die in vivo erzielten Daten zeigen klar, daß
sich diese in vitro gefundene Wirkung der Verbindungen in einer überlegenden
Potenz und Wirksamkeit im Tiermodel wiederspiegelt. Die Beispielverbindungen
hemmen Acyclovir resistente HSV-1 (F) Mutanten und Wildtyp HSV-1 (F) mit
nahezu identischen IC50 Werten. Breitbandspektrum anti-Herpes Aktivität wird mit
den ausgewählten Verbindungen Beispiel 1, 4, 5, 6 und 7, die so unterschiedliche
Herpes Viren wie z. B. das humane Herpes simplex Virus genauso wie das schweine
(PRV) und Rinder (BHV) Tierherpesvirus hemmen, gezeigt. Diese Verbindungen
sind auch gegen alle bislang getesteten klinischen Isolate wirksam (geprüft wurden
39 HSV-1 und 19 HSV-2 Isolate). Erstmalig wird offenbart, daß Verbindungen, die
die Kriterien der oben aufgeführten Merkmale erfüllen oder mit anderem Worten
ausgedrückt unter die nachfolgend aufgeführten Ansprüche fallen, neu sind mit
Bezug zum Stand der Technik und den Therapiestandard im Tiermodel um mindes
tens eine Größenordnung übertreffen.
Der HSV-1 Helikase-Primase Heterodimer Enzymkomplex wurde mit Hilfe des
rekombinanten Baculovirus Expressionssystems in doppelinfizierten Sf9 (Spodoptera
frugiperda) Zellen. Ein rekombinantes Baculovirus codiert für das Helicasegen UL5
und das zweite Virus für das manipulierte Primasegen UL52-6xHis.
Die Gene wurden mittels PCR aus dem HSV-1 (F) Genom amplifiziert (American
Tissue Culture Collection ATCC VR-733) und in das Baculovirus kloniert (UL5 →
pFASTBAC1; UL52 → pFASTHTb) wie dieses im Instruction Manual BAC-TO-
BAC Baculovirus Expression Systems, Life-Technologies ausführlich beschrieben
ist. Der Heterodimere Enzymkomplex wurde mit der sogenannten IMAC-Chromato
graphy, wie in "Inhibition of Herpes Simplex Virus Replication by a 2-Amino
Thiazole via interactions with the Helicase Component of the UL-5-UL8-UL52
Complex", 1998, Journal of Virology, F. C. Spector, L. Liang, H. Giordano, M.
Sivaraja and M. G. Peterson, 74: 6979-6987 publiziert, aufgereinigt.
Der aufgereinigte heterodimere Helikase-Primase Komplex (200 ng) wurde mit 1 µg
DNA (Sigma D3287 oder D8681) in 20 mM HEPES (pH 7.6; 4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineethanesulfonic acid), 5 mM MgCl2, 0,2-5 mM ATP, 100 µg BSA (bovine
serum albumin) per ml, 10% Glycerin, 1 mM DTT (DL-dithiothreitiol) und
gegebenenfalls Inhibitor in der entsprechenden Konzentration für 60 min bei 37°C
inkubiert. Das freigesetzte anorganische Phosphat wurde colorimetrisch bestimmt,
wie dieses in "An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate",
1979, P. A. Lanzetta, I. J. Alvarez, P. S. Reinach and O. A. Candia, Analytical
Biochemistry, 100: 95-97 veröffentlicht wurde.
Die Inhibition der DNA-abhängigen ATPase Aktivität wurde aus der Änderung der
Absorption in Gegenwart und Abwesenheit von Inhibitor berechnet.
Die enzymkinetischen Auswertungen wurden entsprechend den Standardwerken der
Literatur wie z. B. Enzymkinetik by Hans Bisswanger, Theorie und Methoden, VCH
Verlagsgesellschaft, 1994 vorgenommen. Die Berechnung der Ki Werte erfolgte
unter Zuhilfenahme der Sigma Plot Software 4.0 und der Methode der nicht-linearen
Kurvenregression.
Die Tabelle 2 zeigt die Dosis abhängige Inhibition/Titration der ATPase Aktivität
des HSV-1 Helikase-Primase Enzymkomplexes mit dem representativen Beispiel 6.
Zu diesem Zweck, wurde die ATPase Aktivität des Helikase-Primase Heterodimers
(Nachweis durch Bildung von anorganischem Phosphat (Pi)) in Gegenwart von
gesättigten DNA Konzentrationen und variierenden ATP und Inhibitorkonzentra
tionen, wie unter dem Punkt ATPase Assay erläutert, gemessen. Die Hemmung der
ATPase Aktivität durch die Beispielverbindung 6 ist dosisabhängig und wird darüber
hinaus von der ATP Konzentration beeinflußt.
(Die ATP Kontrolle wird ohne Enzym und ohne DNA durchgeführt).
(Die ATP Kontrolle wird ohne Enzym und ohne DNA durchgeführt).
Dieses läßt sich natürlich besser durch den Vergleich der mathematischen Modelle
für diverse Inhibitionsmechanismen belegen. Die experimentellen Hemmdaten mit
Bezug zum Hemmtyp werden am besten durch die nicht-lineare Regression
basierend auf der Formeln für das unkompetitive Hemmverhalten abgebildet.
HSV (HSV-1 Walki, HSV-1F oder HSV-2G) wurde auf Vero-Zellen (ATCC CCL-
81) unter folgenden Bedingungen vermehrt: Die Zellen wurden in M199 Medium
(5% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml strepto
mycin) in Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden
zweimal pro Woche jeweils 1 : 4 gesplittet. Für die Infektion wurde das Medium
abgenommen, die Zellen mit "Hank's solution" gewaschen, mit 0.05%Trypsin,
0.02%EDTA (Seromed L2143) abgelöst und mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro
ml unter den oben genannten Bedingungen für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das
Medium abgenommen und die Viruslösung mit einer m. o. i von < 0.05 in einem
Volumen von 2 ml pro 175 cm2 Oberfläche dazugegeben. Nach einstündiger
Inkubation unter den genannten Bedingungen wurde das Medium auf ein Volumen
von 50 ml pro 175 cm2-Flasche aufgefüllt. 3 Tage nach Infektion zeigten die
Kulturen deutliche Zeichen eines zytopathischen Effektes. Das Virus wurde durch
zweimaliges Frieren (-80°C) und Tauen (37°C) freigesetzt. Der Zelldebris wurde
durch Zentrifugation (300 g, 10 min, 4°C) abgetrennt und der Überstand in Aliquots
bei -80°C weggefroren.
Der Virustiter wurde über einen Plaque-Assay bestimmt. Dafür wurden Verozellen in
einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro Vertiefung in 24 well Platten ausgesät und nach 24
Stunden Inkubation (37°C, 5% CO2) mit Verdünnungen des Virusstocks von 10-2 bis
10-12 (100 µl Inokulum) infiziert. 1 Stunde nach Infektion wurde das Medium
abgenommen und die Zellen mit 1 ml Overlay-Medium (0.5% Methylcellulose,
0.225 Natriumbikarbonat, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Strepto
mycin, 5% fötales Kälberserum in MEM-Eagle Medium mit Earl's Salz) über
schichtet und für 3 Tage inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen mit 4% Formalin
für 1 Stunde fixiert, mit Wasser gewaschen, mit Giemsa (Merck) für 30 min gefärbt
und im Anschluß gewaschen und getrocknet. Mit einem Plaque-viewer wurde der
Virustiter bestimmt. Die für die Experimente verwendeten Virusstocks hatten einen
Titer von 1 × 106/ml - 1 × 108/ml.
Die Anti-HSV-Wirkung wurde in einem Screening-Testsystem in 96-Well-Mikro
titerplatten unter Zuhilfenahme von diversen Zellinien neuronalen, lymphoiden und
epithelialen Ursprungs wie zum Beispiel Vero (Nierenzellinie der grünen Meer
katze), MEF (murine embryonale Fibroblasten), HELF (humane embryonale
Fibroblasten), NT2 (humane neuronale Zellinie) oder Jurkat (humane lymphoide T-
Zellinie) bestimmt. Der Einfluß der Substanzen auf die Ausbreitung des cytopatho
genen Effektes wurde im Vergleich zu der Referenzsubstanz Acyclovir-Natrium
(ZoviraxR), einem klinisch zugelassenen anti-Herpes-Chemotherapeutikum,
bestimmt.
Die in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelösten Substanzen (50 mM) werden auf
Mikrotiterplatten (z. B. 96-Well MTP) in Endkonzentrationen von 250-0,5 µM
(mikromolar) in Doppelbestimmungen (4 Substanzen/Platte) untersucht. Bei poten
ten Substanzen werden die Verdünnungen über mehrere Platten bis 0,5 pM
(picomolar) weitergeführt. Toxische und cytostatische Substanzwirkungen werden
dabei miterfaßt. Nach den entsprechenden Substanzverdünnungen (1 : 2) auf der
Mikrotiterplatte in Medium wird eine Suspension von Zellen (1 × 104 Zellen pro
Vertiefung) wie zum Beispiel von Vero-Zellen in M199 (Medium 199) mit 5%
fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin oder MEF-Zellen in EMEM (Eagle's Minimum Essential
Medium) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml
Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, oder HELF-Zellen in EMEM mit 10%
fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin, oder NT2- und Jurkat-Zellen in DMEM (4,5 mg/l Glukose plus
Pyridoxin) mit 10% fötalem Kälberserum 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat,
nicht essentiellen Aminosäuren und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin in jedes Näpfchen gegeben und die Zellen in den relevanten
Vertiefungen mit einer entsprechenden Virusmenge infiziert (HSV-1 F oder HSV-2
G mit einer m. o. i (multiplicity of infection) von 0,0025 für HELF, Vero und MEF
Zellen sowie einer m. o. i von 0,1 für NT2- und Jurkat-Zellen). Die Platten werden
anschließend bei 37°C in einem CO2-Brutschrank (5% CO2) über mehrere Tage
inkubiert. Nach dieser Zeit ist der Zellrasen von z. B. Vero-Zellen in den
substanzfreien Viruskontrollen, ausgehend von 25 infektiösen Zentren, durch den
cytopathogenen Effekt der HSV-Viren völlig lysiert bzw. zerstört (100% CPE). Die
Platten werden zunächst optisch mit Hilfe eines Mikroskopes ausgewertet und dann
mit einem Fluoreszenzfarbstoff analysiert. Hierzu wird der Zellkulturüberstand aller
Näpfchen der MTP abgesaugt und mit 200 µl PBS-Waschlösung befüllt. Das PBS
wird abermals abgesaugt und alle Wells mit 200 µl Fluoreszenzfarbstofflösung
(Fluorescein-diacetate, 10 µg/ml in PBS) befüllt. Nach einer Inkubationszeit von 30-
90 min werden die Testplatten in einem Fluoreszenzmessgerät bei einer Anregungs
wellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm vermessen.
Der IC50 ist die Konzentration des Inhibitors, bei der die virale Replikation in
Zellkultur um 50% gehemmt ist im Vergleich zur nicht infizierten Zellkontrolle oder
alternativ zu einer mit der 20 fachen IC50 Konzentration behandelten Acyclovir
kontrolle. Die Reduktion wird hier dadurch bestimmt, daß das Fluoreszenzsignal des
infizierten Näpfchens einer MTP 50% des Signals der oben aufgeführten Kontrolle
erreicht.
Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 1 in der Zusammenfassung dargestellt.
Natürlich vorkommende, resistente virale Mutanten wurden in Gegenwart von 1 µM
der Beispielsubstanz 7 oder mindestens der 100 fachen IC50 Konzentration der
weiteren Beispiele, wie in Tabelle 1 aufgeführt, mit Hilfe des viralen Replika
tionsassay in Zellkultur selektiert. 10 000 Vero Zellen werden in Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen wie oben beschrieben ausgesäht und über Nacht inkubiert. Die
Substanz wird in der entsprechenden Konzentration hinzugegeben und die Zellen
werden dann mit 1000 PFU (plaque forming units; m. o. i. 0,1) infiziert. Mutanten
traten mit einer Frequenz von 1 × 10-6 bis 5 × 10-6 im Falle des HSV-1 (F) auf. Die
Mutanten wurden durch mikroskopische Beobachtung oder einfach durch Wegfrieren
(-80°c) von 10 µl Aliquots und anschließender Analyse der 20-40 MTP mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeindiacetat wie oben beschrieben ermittelt. Befindet
sich ein resistentes Virus in einer Vertiefung, so sink das korrespondierende Fluor
eszenzsignal um mindestens den Faktor 3 gegenüber einer Mutantenfreien Vertiefung
ab. Die positiv getesteten Überstände oder die eingefrorenen Aliquots wurden
benutzt, um größere Mengen des resistenten Virus anzuziehen und dann den Titer zu
bestimmen. Die Virus-DNA wurde entsprechend den Protokollen die im Metho
denhandbuch "Herpes Simplex Virus Protocols, 1998, Ed. S. M. Brown & A. R.
MacLean, Humana Press, Totowa, New Jersey" zu finden sind präpariert und nach
dem Protokoll "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, 1977, Sanger F,
Nicklen S, Coulson AR, PNAS, 74, 5463-5467" und Verwendung des ABI PRISM
Big Dye Terminator Kit der Firma Applied Biosystems oder unter Verwednung des
DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit der Firma Amersham (apbiotech)
sequenziert. Die Analyse der Proben wurde auf einem der gängigen Sequenzier
automaten ausgeführt.
Die gefundenen Mutationen der resistenten Viren sind beispielhaft in der Tabelle 1
zusammengestellt.
Bevorzugt sind Verbindungen, die im oben beschriebenen viralen Replikationsassay
basierend auf dem Fluoreszenzsignal einen IC50 (HSV-1 F/Vero Zellen) Wert von
weniger als 50 µM aufweisen, bevorzugter sind natürlich Verbindungen mit einem
IC50 Wert von kleiner als 25 µM und die besten Verbindungen weisen in der Regel
einen IC50 Wert von kleiner als 10 µM auf.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen somit wertvolle Wirkstoffe zur Be
handlung und Prophylaxe von Erkrankungen dar, die durch Herpes-Viren, ins
besondere Herpes Simplex-Viren ausgelöst werden. Als Indikationsgebiete können
beispielsweise genannt werden:
- 1. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei Patienten mit Krankheitsbildern wie Herpes labialis, Herpes genitalis, und HSV bedingter Keratitis, Enzephalitis, Pneumonie, Hepatitis etc.
- 2. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS-Patienten, Krebspatienten, Patienten mit genetisch bedingter Immundefiziens, Transplantationspatienten)
- 3. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei Neugeborenen und Kleinkindern
- 4. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen und Herpes-, insbesondere Herpes Simplex-positiven Patienten zur Unterdrückung der Rekurrenz (Suppressionstherapie)
- 5. In vivo-Aktivität/Tiermodelle
6 Wochen alte weibliche Mäuse, Stamm BALB/cABom, wurden von einem
kommerziellen Züchter (Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd.) bezogen.
Die Tiere wurden in einem dichten Glasgefäß mit Diethylether (Merck) anästhesiert.
50 µl einer Verdünnung des Virusstocks (Infektionsdosis 5 × 104 Pfu) wurden mit einer
Eppendorfpipette in die Nase der anästhesierten Tiere eingebracht. Diese Infektions
dosis führt bei 90-100% der Tiere durch eine generalisierte Infektion mit
prominenten respiratorischen und zentralnervösen Symptomen im Mittel zwischen 5
und 8 Tagen zum Tode.
6 Stunden nach Infektion wurden die Tiere mit Dosen von 0,1-100 mg/kg Körper
masse 3 mal täglich 7.00 Uhr, 14.00 Uhr und 19 Uhr über einen Zeitraum von
5 Tagen behandelt. Die Substanzen wurden in DMSO vorgelöst und in
Tylose/PBS(Hoechst) resuspendiert (Endkonzentration 1,5% DMSO, 0,5% Tylose
in PBS).
Nach der letzten Applikation wurden die Tiere weiter beobachtet und die Todeszeit
punkte festgestellt.
Ein Vergleich der Überlebenskurven erbrachte für die Verbindung des Beispiels 7
z. B eine ED50 von etwa 0,5 mg/kg für HSV-2, wobei ED50 bedeutet, das bei dieser
Dosis 50% der Tiere überleben.
Die aufgeführten Wirkstoffe Beispiel 1 bis 7 wurden entsprechend dem nachfolgend
aufgeführten allgemeinen Schema synthetisiert (Abb. 2 zeigt das Schema zur
Synthese der Thiazolylamide und Abb. 3 zeigt den Syntheseweg zu den
Thiazolylharnstoffderivaten).
Der Wirkstoff kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann er auf
geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal,
sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als
Implantat.
Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen
verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich bekannte, den Wirkstoff schnell und/oder
modifiziert abgebende Applikationsformen, wie z. B. Tabletten (nichtüberzogene
sowie überzogene Tabletten, z. B. magensaftresistente Überzüge), Kapseln, Dragees,
Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes
geschehen (intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder
unter Einschaltung einer Resorption (intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan,
oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als
Applikationsformen u. a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von
Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten und sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z. B. Inhalationsarzneiformen (u. a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen/-lösungen, Sprays; lingual, sublingual
oder buccal zu applizierende Tabletten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- und
Augen-präparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen,
Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten,
Streupuder oder Implantate.
Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten
Applikationsformen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter
nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe. Hierzu zählen u. a.
Trägerstoffe (z. B. mikrokristalline Cellulose), Lösungsmittel (z. B. flüssige
Polyethylenglycole), Emulgatoren (z. B. Natriumdodecylsulfat), Dispergiermittel
(z. B. Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Biopolymere (z. B. Albumin),
Stabilisatoren (z. B. Antioxidantien wie Ascorbinsäure), Farbstoffe (z. B. anorganische
Pigmente wie Eisenoxide) oder Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation
Mengen von etwa 0,01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 mg/kg
Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler
Applikation beträgt die Menge etwa 0,1 bis 50 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,5 bis 15 mg/kg
Körpergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg,
individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und
Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.
Claims (16)
1. Arzneimittel enthaltend unkompetitive Inhibitoren der Herpes-Helicase-
Primase.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Helicase-
Primase mindestens 50% homolog sind zur Helicase-Primase des Herpes-
Simplex-Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz oder die Aminosäure-
Sequenz, je nachdem was höher ist.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der
Virus ein Herpes-Simplex-Virus 1 ist.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verbindungen ausgewählt werden, die gleichzeitig an die Helikase und die
Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes binden.
5. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindungen die DNA-abhängige NTPase Aktivität
der Helikase-Primase inhibieren.
6. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindungen die Fähigkeit besitzen die Replikation
eines Herpes Virus zu inhibieren.
7. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit
besitzen die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer
Konzentration von 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren.
8. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß solche Verbindungen ausgewählt werden, die die
Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer
Konzentration von ≦ 500 nM um mindestens 50% zu inhibieren.
9. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herpes Virus um PRV or BHV handelt.
10. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen mit Anti-Herpes-Aktivität,
dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die
Helikase-Primase zu inhibieren, getestet werden und solche Verbindungen
ausgewählt werden, die die NTP-Bindungstasche des Helikase Primase
Enzymkomplexes kompetitiv inhibieren.
11. Verbindungen, die nach Verfahren nach Anspruch 10 identifiziert werden.
12. Verbindungen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verbindung kein Nukleosid oder Nukleotid ist.
13. Die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 11 oder 12 zur
Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes
Infektionen.
14. Arzneimittel oder pharmazeutische Formulierungen die Verbindungen
entsprechend den Ansprüchen 11 oder 12 enthalten.
15. Ein Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen in
Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß dem Säuger, der eine derartige
Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge des Arzneimittels oder
der pharmazeutischen Formulierung entsprechend Anspruch 14 verabreicht
wird.
16. Arzneimittel irgend einem der Anprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die Verbindungen folgende allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,
Y-A-X-SO2NR1R2 (I)
worin
Y für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4'R5'-C(O)-CR4R5-, -CR4'R5'-C(O)- NR9-, NR9'-C(O)-CR4R5- oder NR9'-C(O)-NR9- steht,
worin
R4, R4', R5, R5', R9 und R9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)- Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° ± 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
Y-A-X-SO2NR1R2 (I)
worin
Y für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4'R5'-C(O)-CR4R5-, -CR4'R5'-C(O)- NR9-, NR9'-C(O)-CR4R5- oder NR9'-C(O)-NR9- steht,
worin
R4, R4', R5, R5', R9 und R9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-C10)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C1-C6)- Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° ± 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
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- 2001-08-27 WO PCT/EP2001/009843 patent/WO2002020014A1/de active Application Filing
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