DE10042451A1 - High-Throughput Verfahren zur Bestimmung der Enantiomereneinheit von chiralen Verbindungen - Google Patents
High-Throughput Verfahren zur Bestimmung der Enantiomereneinheit von chiralen VerbindungenInfo
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Abstract
Verfahren zur High-Throughput-Bestimmung der Enantiomereneinheit von chiralen Verbindungen durch Anwendung der elektrophoretischen Trennung mit Hilfe von parallelen CE-Kapillaren oder von mikrofluidischen Systemen, wobei dem Elektrolyten chirale Selektoren zugesetzt oder die zu bestimmenden Enantiomere vor der elektrophoretischen Trennung in elektrophoretisch unterscheidbare Diastereomere überführt werden.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die High-Throughput-Bestimmung der
Enantiomerenreinheit von chiralen Verbindungen durch elektrophoretische
Trennung mit Hilfe von parallelen CE-Kapillaren oder mit mikrofluidischen
Systemen.
Die Entwicklung effektiver Verfahren zur Generierung umfangreicher
Bibliotheken chiraler Chemie-Katalysatoren durch Methoden der
kombinatorischen Chemie [Übersichten: B. Jandeleit, D. J. Schaefer, T. S.
Powers, H. W. Turner, W. H. Weinberg, Angew. Chem. 1999, 111, 2648-2689;
Angew. Chem., Int. Ed. 1999, 38, 2494-2532; b) P. P. Pescarmona, J. C. van der
Waal, T. E. Maxwell, T. Maschmeyer, Catal. Lett. 1999, 63, 1-11] oder zur
Herstellung von Bibliotheken enantioselektiver Biokatalysatoren durch in vitro-
Evolution [a) M. T. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K.-E. Jaeger,
Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36,
2830-2932; b) M. T. Reetz, K.-E. Jaeger, Chem.-Eur. J. 2000, 6, 407-412] ist
Gegenstand der aktuellen Forschung. Entscheidend für den Erfolg dieser neuen
Technologien ist das Vorhandensein von effektiven, raschen Methoden zum
Durchsuchen und Auffinden der enantioselektivsten Katalysatoren oder
Biokatalysatoren aus den jeweiligen Katalysator-Bibliotheken. Während in der
kombinatorischen Wirkstoffchemie viele effektive Methoden zum Durchsuchen
großer Bibliotheken von biologisch aktiven Verbindungen zur Verfügung stehen
[F. Balkenhohl, C. von dem Bussche-Hünnefeld, A. Lansky, C. Zechel, Angew.
Chem. 1996, 108, 2436-2488; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2288-2337],
existieren nur wenige Methoden zum High-Throughput-Screening von
enantioselektiven Katalysatoren, Biokatalysatoren oder optisch aktiven Agenzien.
Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses (engl. enantiomeric excess, ee)
der Produkte stereoselektiver Stoffumwandlungen erfolgt normalerweise
konventionell mit Hilfe der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie an chiralen
stationären Phasen [W. A. König, Gas Chromatographic Enantiomer Separation
with Modified Cyclodextrins, Hüthig, Heidelberg, 1992; Chiral Separation by
HPLC (Hrsg.: A. M. Krstulovic), Ellis Horwood, Chichester, 1989]. Obwohl
hierbei genaue ee-Werte ermittelt werden können, haben solche herkömmlichen
Verfahren den Nachteil, dass nur eine begrenzte Zahl von Proben pro Zeiteinheit
untersucht werden kann, typischerweise weniger als einige Dutzend ee-
Bestimmungen pro Tag. In der kombinatorischen Katalyse fallen jedoch Tausende
von Proben pro Tag an.
Um analytische Probleme dieser Art zu lösen, wurden kürzlich die ersten Assays
entwickelt. So wurde z. B. im Rahmen einer Untersuchung zur in vitro Evolution
von enantioselektiven Lipasen ein relativ grobes Testverfahren entwickelt,
wonach der Verlauf enantioselektiver Hydrolysen von chiralen Carbonsäureestern
ermittelt werden kann [M. T. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K.-E.
Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997,
36, 2830-2932]. Dabei werden die von Lipase-Mutanten katalysierten Hydrolysen
von (R)- und (S)-konfigurierten Carbonsäure p-nitrophenolestern auf
Mikrotiterplatten spektrophotometrisch zeitlich verfolgt, wodurch die
enantioselektivsten Mutanten rasch identifiziert werden können. Abgesehen
davon, dass keine exakten ee-Werte zugänglich sind, ist dieses Verfahren auf die
Stoffklasse der chiralen Carbonsäuren beschränkt. Gleiches gilt für ein
verwandtes Testverfahren [L. E. Janes, R. J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1997, 62,
4560-4561]. Diese Einschränkung gilt auch für verwandte Verfahren, die auf
Farbänderung von pH-Indikatoren während einer Esterhydrolyse beruhen [L. E.
Janes, A. C. Löwendahl, R. J. Kazlauskas, Chem.-Eur. J. 1998, 4, 2324-2331].
Ein völlig anderer Ansatz zur Identifizierung chiraler Katalysatoren bezieht sich
auf IR-Thermographie [M. T. Reetz, M. H. Becker, K. M. Kühling, A. Holzwarth,
Angew. Chem. 1998, 110, 2792-2795; Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 2547-2650].
Eine Quantifizierung der Enantioselektivität bzw. Enantiomerenreinheit
eines chiralen Produkts konnte jedoch bislang nicht erreicht werden. Ein weiteres
analytisches Verfahren bezieht sich auf die Massenspektrometrie von
isotopenmarkierten pseudo-enantiomeren und pseudo-prochiralen Substraten [M.
T. Reetz, M. H. Becker, H.-W. Klein, D. Stöckigt, Angew. Chem. 1999, 111,
1872; Angew. Chem., Int. Ed. 1999, 38, 1758-1761]. Damit können erstmals etwa
1000 ee-Bestimmungen pro Tag durchgeführt werden. Allerdings ist die Methode
auf die Analyse von kinetischen Racematspaltungen und Reaktionen von
prochiralen Substraten mit enantiotopen Gruppen beschränkt.
Wir fanden nun, daß eine allgemeine Lösung des geschilderten Analysenproblems
möglich ist, wenn zur High-Throughput-Bestimmung der Enantiomerenreinheit
von chiralen Verbindungen die elektrophoretische Trennung mit Hilfe von
parallelen CE-Kapillaren (Variante 1) oder von Kanälen in mikrofluidischen
Systemen (Variante 2) verwendet wird, wobei dem Elektrolyten chirale Selektoren
zugesetzt oder die zu bestimmenden Enantiomere vor der elektrophoretischen
Trennung in elektrophoretisch unterscheidbare Diastereomere überführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die ee-Bestimmung von Tausenden von
Proben pro Tag, typischerweise 7000 bis 50 000.
Die Grundlage der Erfindung ist die herkömmliche Kapillarelektrophorese (CE),
mit der elektrophoretische Trennungen von Enantiomeren durch den Zusatz
geeigneter chiraler Selektoren zum Elektrolyten möglich sind [B. Chankvetadze,
Capillary Electrophoresis in Chiral Analysis, Wiley, Chichester, 1997]. Die
bisher beschriebenen Ansätze in sequentieller Arbeitsweise erlauben jedoch
wegen der relativ langen Analysenzeiten kein Hochdurchsatzscreening. Als chirale
Selektoren werden bekannterweise bevorzugt gelöste Cyclodextrine (CD) als
sogenannte pseudostationäre Phasen in der CE eingesetzt. Auch Derivate von
Cyclodextrinen, weitere Kohlehydrate, chirale Kronenether, Peptide, chirale
Calixerene oder chirale Detergenzien dienen als Selektoren.
Ein wichtiges Einsatzgebiet der Kapillarelektrophorese ist die DNA-Analyse und
Sequenzierung. Insbesondere für die Anwendung im Human-Genom-Projekt sind
unterschiedliche technische Realisierungen umgesetzt worden, um den
Probendurchsatz in der CE deutlich zu erhöhen. Dazu zählt die Kapillar Array
Elektrophorese (CAE), bei der eine Vielzahl von Kapillaren parallel betrieben
wird, um DNA-Trennungen bzw. Sequenzierungen mit hohem Durchsatz
automatisiert zu ermöglichen [a) X. C. Huang, M. A. Quesada, R. A. Mathies,
Anal. Chem. 1992, 64, 2149-2154; b) H. Kambahara, S. Takahashi, Nature 1993,
361, 565-566; c) N. J. Dovichi, Electrophoresis 1997, 18, 2393-2399; d) G. Xue,
H. Pang, E. S. Yeung, Anal. Chem. 1999, 71, 2642-2649; e) S. Behr, M. Mätzig,
A. Levin, H. Eickhoff, C. Heller, Electrophoresis 1999, 20, 1492-1507]. Spezielle,
auf die DNA-Analytik abgestimmte Geräte dieser Art sind inzwischen
kommerziell erhältlich, so z. B. das MegaBACE® System [das Gerät MegaBACE®
ist bei der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland)
kommerziell erhältlich], bestehend aus 6 Bündeln von je 16 Kapillaren zur
Bearbeitung von Standard 96er Mikrotiterplatten.
Variante 1 der Erfindung für das High-Throughput-Screening von
Enantiomerenreinheit von chiralen Verbindungen macht Gebrauch von dieser
CAE-Technologie.
Variante 2 macht von der Mikrochip-Technologie Gebrauch.
Zur Illustration der ersten Variante der Erfindung sei die Super-High-Throughput
ee-Bestimmung von chiralen Aminen beschrieben, obgleich das Verfahren
keineswegs auf diese Substanzklasse beschränkt ist. Chirale Amine des Typs 3
stellen wichtige Zwischenstufen bei der Synthese von Pharmazeutika und
Pflanzenschutzmitteln dar [a) Chirality in Industry: The Commercial Manufacture
and Applications of Optically Active Compounds (Hrsg.: A. N. Collins, G. N.
Sheldrake, J. Crosby), Wiley, Chichester, 1992; b) Chirality in Industry II:
Developments in the Comrnercial Manufacture and Applications of Optically
Active Compounds (Hrsg.: A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby), Wiley,
Chichester, 1997; c) R. A. Sheldon, Chirotechnology: Industrial Synthesis of
Optically Active Compounds, Dekker, New York, 1993, d) F. Balkenhohl, K.
Ditrich, B. Hauer, W. Ladner, J. Prakt. Chem./Chem.-Ztg. 1997, 339, 381-384].
Sie können u. a. durch katalytische reduktive Aminierung von Ketonen 1,
Markovnikov-Addition von NH3 an Olefinen 2 oder hydrolytische Enzym
katalysierte kinetische Racematspaltung von Amiden 4 (oder Rückreaktion)
hergestellt werden.
Im Rahmen der Erfindung werden zunächst mit einem herkömmlichen
Einkapillar-CE-System die elektrophoretischen Bedingungen für die
Enantiomerentrennungen der chiralen Amine 3 variiert. Um die parallele
Detektion in Kapillararraysystemen mittels Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion
(LIF) zu ermöglichen (siehe unten), werden die Amine 3 mit
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) 4 unter Bildung der Derivate 5 umgesetzt. Durch
den Einsatz unterschiedlicher kommerziell erhältlicher Cyclodextrinderivate (CD)
als chirale Selektoren lassen sich ausreichende Antipodentrennungen der Substrate
realisieren.
Die im Rahmen solcher Vorversuche in herkömmlichen Einkapillar-CE-Systemen
erhaltenen Parameter werden nun auf ein geeignetes Kapillar Array
Elektrophorese System übertragen. Solche Multikapillarsysteme sind kommerziell
erhältlich, so z. B. das MegaBACE®-Gerät der Firma Amersham Pharmacia
Biotech (Freiburg. Deutschland), ferner sind CAE-Instrumente auch von den
Firmen Beckmann Coulter (Fullerton, CA, USA) und PE Apllied Biosystems
(Foster City, CA, USA) erhältlich. Entscheidend für den Erfolg ist dabei die
richtige Adaptierung der experimentellen Parameter. Wegen der speziellen, auf
DNA-Analytik zugeschnittenen Konfiguration solcher Geräte (nur
elektrokinetische Injektion und Detektion ausschließlich an der Anode möglich),
muss das Elektrolytsystem angepasst werden. Elektrolyte, mit denen in
Einkapillar-CE-Systemen sehr gute Ergebnisse erhalten wurden, liefern nur sehr
instabile elektrophoretische Läufe mit für einzelne Kapillaren stark
schwankendem elektrischen Strom. Die erhaltenen wenig reproduzierbaren
Resultate können zum Teil damit erklärt werden, dass eine elektrokinetische
Injektion der anionischen Analyte auch bei nur schwach vorhandenem
kathodischem EOF, wie in den verwendeten mit Polyacrylamid beschichteten
Kapillaren, problematisch ist. Im Rahmen der Erfindung werden dagegen
reproduzierbare Ergebnisse hoher Qualität erhalten, wenn mit einem viskosen
Elektrolyten, z. B. nach Zusatz von linearem Polyacrylamid (LPA) oder einem
Cellulose-Derivat oder einem anderen Polymer, gearbeitet wird, so dass der
elektroosmotische Fluss unterdrückt wird. Mit dem so adaptierten CAE-Gerät
lassen sich (+)/(-)-Gemische aus Aminen 5 effizient analysieren. Die parallel
erhaltenen Elektropherogramme werden automatisch ausgewertet und liefern so
ee-Werte. Kontrolliert man die CAE-bestimmten ee-Werte mit denen der
entsprechenden nicht derivatisierten Amine (+)/(-)-3, die gaschromatographisch
unter Verwendung einer chiralen stationären Phase bestimmt werden, so ist die
Übereinstimmung sehr gut. Damit wird die Zuverlässigkeit der CAE-Methode
unter Beweis gestellt.
Mit dieser Analysenmethode können 7000 bis 50 000 ee-Bestimmungen pro Tag
durchgeführt werden. Ein solches Super-High-Throughput-Screening der
Enantioselektivität ist mit keinem anderen zurzeit verfügbaren System möglich
[B. Jandeleit, D. J. Schaefer, T. S. Powers, H. W. Turner, W. H. Weinberg,
Angew. Chem. 1999, 111, 2648-2689; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2494-2532].
Angesichts der Tatsache, dass mit der CAE viele Vorteile verbunden sind,
so z. B. kleinste Probenmengen, nahezu kein Solvensverbrauch, Abwesenheit von
Hochdruckpumpen und Ventilen, sehr variabler Einsatz unterschiedlicher, relativ
kostengünstiger chiraler Phasen, ist der hier beschriebene Assay industriell
besonders attraktiv.
Variante 2 der Erfindung zur drastischen Erhöhung des Analysendurchsatzes bei
der Anwendung der Kapillar-Elektrophorese zur Bestimmung der
Enantiomerenreinheit (% ee) macht von der Mikrochip-Technologie Gebrauch [D.
J. Harrison, K. Fluri, K. Seiler, Z. Fan, C. S. Effenhauser, A. Manz, Science
(Washington, D. C., 1883) 1993, 261, 895-897; S. C. Jacobson, R. Hergenroder,
L. B. Koutny, R. J. Warmack, J. M. Ramsey, Anal. Chem. 1994, 66, 1107-1113; L.
D. Hutt, D. P. Glavin, J. L. Bada, R. A. Mathies, Anal. Chem. 1999, 71, 4000-4006;
I. Rodriguez, L. J. Jin, S. F. Y. Li, Electrophoresis 2000, 21, 211-219].
Hierbei werden bevorzugt photolithographische Techniken zur Herstellung von
ein oder mehreren Kapillaren auf Mikrochips angewandt. Solche aus Kunststoff
oder Glas hergestellten CE-Mikrochips sind bisher zur Analyse von
Oligonucleotiden, DNA-Sequenzfragmenten, Aminosäuren, DNA-
Restriktionsfragmenten sowie PCR-Produkten eingesetzt worden. In diesen hoch
miniaturisierten System können extrem schnelle Trennungen innerhalb von
Sekunden bis Minuten erhalten werden. Während bei der Trennung von
Biomolekülen in wässrigen Elektrolyten sowohl Kunststoff- als auch Glas-Chips
genutzt werden können, sind Mikrochips aus Kunststoff bei der Trennung von
herkömmlichen organischen Verbindungen in Elektrolyten, die organische
Solventien enthalten, nicht beständig genug sind. Da geeignete Geräte zum
Betrieb von CE-Chips noch nicht kommerziell erhältlich sind, wird im Rahmen
der Erfindung ein Instrument, ausgestattet mit 2 Hochspannungsgeräten,
Hochspannungsumschaltern und mit LIF-Detektion (Argon-Ionenlaser)
angefertigt. Damit können unter Verwendung von CE-Glaschips der Fa. Micralyne
(Edmonton, Canada) chirale Trennungen der HTC-derivatisierten Amine 5
durchgeführt werden. Dazu werden ähnliche Elektrolytsysteme wie bei der ersten
Version, jedoch ohne Zusatz von LPA, verwendet. Damit können Trennungen von
Enantiomeren, wie in der oben beschriebenen CAE, erreicht werden, jedoch mit
deutlich geringeren Analysenzeiten pro Trennkanal. Durch Anwendung höherer
Feldstärken, welches den Einsatz spezieller Hochspannungsumschalter nötig
macht, werden Enantiomerentrennungen in wenigen Sekunden möglich. Da
mikrofluide Strukturen in Mikrochips leicht parallelisiert werden können, ist ein
noch höherer Durchsatz von Analysen, bei paralleler statt sequentieller
Arbeitsweise, leicht zu realisieren. Automatisierte Instrumente, die dies
ermöglichen werden zur Zeit entwickelt und ermöglichen dann bei Anwendung
unseres Verfahrens ein Probendurchsatz von < 50 000 ee-Bestimmungen pro Tag.
Als analytische Methoden zur Detektion der Enantiomere können z. B. verwendet
werden: Fluoreszenz, UV/VIS, IR, elektrische Leitfähigkeit, elektrochemische
Methoden, Refraktometrie, Circulardichroismus oder Massenspektrometrie.
Sofern mit Hilfe der Laserinduzierten Fluoreszenzdetektion gearbeitet wird, ist oft
eine Fluoreszenzmarkierung notwendig. Amine können z. B. mit folgenden
Verbindungen derivatisiert werden: mit Isothiocyanatderivaten, wie
Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC),
Phenylisothiocyanat (PITC), S-1-(1-Naphtyl)ethylisothiocyanat (SNEIT), S-
Phenylethylisothiocyanat (SAMBI); Succinimidesterderivate wie z. B. 7-
(Diethylamino)cumarin-3-carboxylsuccinimidester (DCCS), mit Chlororformat
derivaten, wie 9-Fluorenylmethylchloroformat (FMOC), 2-(9-Anthryl)ethyl
chloroformat (AEOC), (+)/(-) 1-(9-Fluorenyl)ethylchloroformat (FLEC);
Isoindolderivate wie o-Phtaldialdehyd (OPA), Naphtalene-2,3-dicarboxyaldehyd
(NDA), 3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxaldehyd (CBQCA) und mit
anderen Reganzien wie Fluorescamin, 4-Phenylspiro[furan-2(3H)-1'-phtalan]-3,3'-
dion, 4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol.
Zum Derivatisieren reduzierender Gruppen wie Aldehyde oder Ketofunktio
nalitäten in Zuckern können z. B. folgende Reagenzien eingesetzt werden: 2-
Aminopyridin (AP), p-Aminobenzoesäure (PABA), Ethyl-p-aminobenzoat
(EPAB), 2-Aminoacridon (AC), p-Aminobenzonitril, 9-Aminopyrene-1,4-trisulfat
(APTS), 5-Aminonaphtyl-2-sulfonsäure (5-ANSA), R/S-1-Phenylethylamin
(SPEA).
Zur Derivatisierung von Alkoholen können zum Beispiel [1-(9-Fluorenyl)-
ethyl]chloroformat (FLEC) oder auch 9-Fluorenylmethylchloroformat (FMOC)
eingesetzt werden. Es ist eine Vielzahl von weiteren Fluoreszenzmarkern
einsetzbar zur Derivatisierung unterschiedlicher Funktionalitäten wie z. B.
Diethyldithiocarbamic acid (DDTC) für die Alkylchloridfunktionalität;
Dansylhydrazin (DNSH), 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH), 4-Methoxy-1,2-
phenyldiamin (MPD), o-Phenyldiamin (OPD) für Dicarbonyle; 7-Aminonaphtyl-
1,3-Disulfonsäure (7-ANDA), 5-(Aminoacetoamido)fluorescein (AAF), 1-
Pyrendiazomethan (PDAM) für die Carbonylfunktionalität.
Mit den zwei erfindungsgemäßen Versionen der chiralen Hochdurchsatz-Kapillar-
Elektrophorese ist die Analyse auch anderer chiraler Substanzklassen möglich.
Dazu zählen chirale Alkohole, Diole, Thioalkohole, Aminoalkohole,
Aminosäuren, Cyanhydrine, Halogenhydrine sowie andere organische
Verbindungen mit funktionellen Gruppen.
Zunächst wurden die Amine mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) derivatisiert, um
die entsprechenden fluoreszierenden Derivate herzustellen. Dazu wurden 100 µL
der Aminlösung der Konzentration 6,7 µMol/L in Aceton, mit 12,7 µL einer
FITC-Lösung der Konzentration 26 µMol/L in Aceton zu 50 µL eines 20 mMol/L
Boratpuffers bei pH 9 gegeben und danach 1 : 10 mit Methanol verdünnt.
Für die so hergestellten chiralen FITC-Derivate wurden geeignete Methoden zur
kapillarelektrophoretischen Antipodentrennung mit Hilfe eines automatisierten
klassischen Einkapillar-CE-Systems mit UV-Detektion (HP 3D-CE, Agilent,
Waldbronn, Deutschland) entwickelt. Dazu wurden Elektrolytsysteme mit
Cylodextrinen (CD) als chiralen Additiven versetzt. Durch gezielte Variation
folgender Parameter: 1) Art und Derivat des Cyclodextrins, 2) Konzentration des
CD, 3) pH-Wert des Elektrolyten, wurden schließlich Elektrolytsysteme
entwickelt, bei denen eine Trennung der Enantiomere der unterschiedlichen
Substrate erhalten wurde. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Eine ausreichende chirale Trennungen von FITC-Cyclohexylethylamin (5c)
konnte zum Beispiel mit folgender Elektrolytzusammensetzung erhalten werden:
40 mM CHES Puffer bei pH 9 mit 6,25 mM γ-CD. In Fig. 1 ist eine so erhaltene
chirale CE Trennung der FITC-markierten Verbindungen dargestellt, welche mit
folgenden experimentellen Parametern erhalten wurde: Spannung: 30 kV, 60 µA;
Injektion 40 mbar, 2 sec; Detektion: UV bei 200 nm; Polyvinylalkohol
beschichtete Kapillare: 40 cm eff. Länge, 50 µm Innendurchmesser.
Zum High-Throughput-Screening von Bibliotheken von R/S-
Cyclohexylethylamin die in Standard 96er Mikrotiterplatten vorlagen, wurde
zunächst jede Probe wie in Beispiel 1 beschrieben mit FITC- derivatisiert und mit
Wasser im Verhältnis 1 : 5000 verdünnt. Die Proben wurden dann mit den
Microtiterplatten in das kommerziell erhältliche CAE-System MegaBACE
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) überführt und dort parallel
analysiert. Als Elektrolyt wurde das zuvor im Einkapillarsystem entwickelte
Elektrolytsystem eingesetzt, welches mit linearem Polyacrylamid (LPA) versetzt
wurde. Durch den Zusatz von LPA welches die Viskosität erhöht und den
elektroosmotischen Fluß reduziert, konnte eine hohe Reproduzierbarkeit und
Robustheit der Methode erhalten werden. Dazu wurde der oben beschriebene
Elektrolyt 5 : 1 mit dem hoch viskosen LPA-Puffer (long read matrix) der Fa.
Amersham Pharmacia versetzt. In Fig. 2 sind die erhaltenen
Elektropherogramme einer Analyse einer Bibliothek bestehend aus 12 Lösungen
von +/- Gemischen von Cyclohexylethylamin mittels CAE dargestellt, die mit
folgenden experimentellen Parametern erhalten wurden: Spannung: -10 kV/8 µA,
elektrokinetische Injektion: -2 kV/9 s, Kapillararray der Fa. Amersham Pharmacia
Biotech. Die erhaltenen Signale wurden Software gestützt ausgewertet und so die
ee-Werte ermittelt. Zur Kontrolle wurde die Enantiomerenreinheit der
entsprechenden nicht derivatisierten Proben gaschromatographisch unter
Verwendung einer chiralen stationären Phase (Ivadex-1/PS086 df: 0,15 µm, i. D.:
250 µm, 1 : 25 m) bestimmt. Die mittels CAE und GC bestimmten ee-Werte sind in
Tabelle 2 gegenübergestellt, die Numerierung der Proben entspricht denen der
Signale in Fig. 2.
Zum High-Throughput-Screening von R/S-2-Heptylamin-Lösung die in Standard
96er Microtiterplatten vorlagen, wurde zunächst jede Probe analog zu Beispiel 2
mit FITC derivatisiert. Die Proben wurden dann mit den Microtiterplatten in ein
CAE-System mit 96 parallel arbeitenden Kapillaren überführt und dort analysiert.
Als Elektrolyt wurde ein 40 mM CHES-Puffer bei pH 9 mit 15% Acetonitril und
40 mM γ-CD eingesetzt. Bei einer im Vergleich zu Beispiel 2 erhöhten
Trennspannung von 20 kV konnten die 96 in einer Microtiterplatte vorliegenden
Substrate in weniger als 8 Minuten analysiert werden. Ein exemplarisches
Elektropherogramm ist in Fig. 3 gezeigt. Damit gelang es in Verbindung mit
einer automatischen computergestützten Datenauswertung 15 000 ee-
Bestimmungen pro Tag durchzuführen.
Zum Highthroughput-Screening von R/S-1-(para-Tolyl)ethylamin wurde zunächst
jede Probe analog zu Beispiel 2 mit FITC derivatisiert. Die Proben wurden dann
mit den Microtiterplatten in ein CAE-System mit 96 parallel arbeitenden
Kapillaren überführt und dort analysiert. Als Elektrolyt wurde ein 40 mM CHES-
Puffer mit 5 mM HE-β-CD eingesetzt. Bei Anwendung einer Trenn-Spannung
von 25 kV und bei Verwendung von unbelegten Kapillaren mit dominantem
hohen elektroosmotischen Fluß konnten die 96 in einer Mikrotiterplatte
vorliegenden Substrate in weniger als 4 Minuten analysiert werden. Damit gelang
es, in Verbindung mit einer automatischen computergestützten Datenauswertung,
34 000 ee-Bestimmungen pro Tag durchzuführen.
Racemisches Cyclohexylethylamin welches in einer Konzentration von 0,67 µM/L
vorlag würde zunächst entsprechend Beispiel 1 mit FITC umgesetzt und mit
Wasser im Verhältnis 1 : 10000 verdünnt. Eine chirale Trennung konnte mit CE-
Mikrochips der Firma Micralyne (Edmonton, Canada) mit einem Eigenbau-
Instrument in weniger als 2 Minuten erhalten werden, dies ist in Fig. 4 gezeigt.
Dazu wurde der gleiche Elektrolyt wie für Abb. 1 verwendet, zur Probenaufgabe
wurden an den Elektroden für Probeneinlass, Pufferauslass sowie Puffereinlass
eine Spannung von 1 kV angelegt, während der Probenauslass auf Erdpotential
war. Zur Trennung wurde dann die Spannung so umgeschaltet, daß folgende
Potentiale an den vier Elektroden anlagen: Puffereinlass 1 kV, Probeneinlass 0,6 kV,
Probenauslass 0,6 kV, Pufferauslaß 0 V. Die Detektion erfolgte mit einem
modifizierten Laserinduzierten Fluoreszenzdetektor der Firma Picometrics
(Toulouse, France) ausgestattet mit einem Argonionen-Laser. Der Experimentelle
Aufbau ist schematisch in Fig. 5 dargestellt.
Claims (11)
1. Verfahren zur High-Throughput-Bestimmung der Enantiomerenreinheit von
chiralen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Enantiomere in
parallelen CE-Kapillaren oder in Kanälen von mikrofluidischen Systemen
elektrophoretisch getrennt werden, wobei dem Elektrolyten chirale Selektoren
zugesetzt oder die Enantiomere vor der Trennung in elektrophoretisch
unterscheidbare Diastereomere überführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die parallelen CE-Kapillaren in Form von
Kapillar-Arrays eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Selektoren chirale organische
Verbindungen verwendet werden, die in Wechelwirkung mit den zu
analysierenden Enantiomeren treten.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Cyclodextrine, Derivate von
Cyclodextrinen, weitere Kohlehydrate, chirale Kronenether, Peptide, chirale
Calixerene oder chirale Detergenzien als Selektoren dienen.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4, wobei dem Elektrolyt ein Additiv zur
Erhöhung der Viskosität zugegeben wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Additiv ein lineares Polyacrylamid, ein
Cellulose-Derivat oder ein anderes Polymer ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mikrofluidischen Systeme in Form von
Mikrochips verwendet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als chirale Derivatisierungsreagenzien zur
Überführung der Enantiomere in Diastereomere chirale Fluoreszenzmarker
eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei als chiraler Fluoreszenzmarker eine der
folgenden Verbindungen eingesetzt wird: R/S-[1-(9-Fluorenyl)-ethyl]chloro
format (FLEC), R/S-1-(1-Naphtyl)ethylisothiocyanat (SNEIT) oder R/S-
Phenylethylisothiocyanat (SAMBI)
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Detektion der Enantiomere
Fluoreszenz, UV/VIS, IR, elektrische Leitfähigkeit, elektrochemische
Methoden, Refraktometrie, Circulardichroismus oder Massenspektrometrie
verwendet werden.
11. Verfahren nach Ansprüchen 1-7, wobei zur Detektion mit Fluoreszenz oder
UV/VIS die Enantiomere vor der Trennung mit Verbindungen derivatisiert
werden, die fluorophere bzw. chromophore Gruppen enthalten.
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