DE10028186A1

DE10028186A1 - Method for determining the amount of ligands bound to target molecules

Info

Publication number: DE10028186A1
Application number: DE2000128186
Authority: DE
Inventors: Wolf Bertling; Klaus Theodor Wanner; Georg Hoefner
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2002-09-19
Also published as: AU2001268944A1; EP1325328A2; WO2001094943A2; WO2001094943A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase, DOLLAR A b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen, DOLLAR A c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Bedingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt, DOLLAR A d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischphase und DOLLAR A e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenzbildung zwischen der Menge der Liganden gemäß lit. a und der gemäß lit. d ermittelten Liganden-Menge.The invention relates to a method for determining the amount of ligands bound to target molecules comprising the following steps: DOLLAR A a) providing the target molecules and a mixed phase containing the ligands in a predetermined amount, DOLLAR A b) contacting and incubating the mixed phase with the target molecules, DOLLAR A c) separating bound ligands from the mixed phase under conditions under which the amount of unbound ligand remains constant, DOLLAR A d) determining the amount of unbound ligands in the mixed phase and DOLLAR A e) determining the amount of bound ligands Difference between the amount of ligands according to lit. a and the according to lit. d determined ligand amount.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden sowie eine Kombina tion von Liganden zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren.The invention relates to a method for determining the amount of ligands bound to target molecules and a combo tion of ligands for use in a invention Method.

In der US 5,891,742 A werden Verfahren zum schnellen und ein fachen Auffinden von Liganden aus einer Mischung von Testsub stanzen beschrieben. Dabei wird diese Mischung mit einer Zielstruktur inkubiert. Die Zielstruktur kann sowohl in Lö sung als auch immobilisiert vorliegen. Nach der Inkubation werden die Zielstrukturen mit gebundenen Testsubstanzen abge trennt. Die gebundenen Testsubstanzen werden direkt massen spektrometrisch analysiert und identifiziert.In US 5,891,742 A are methods for fast and a fold, finding ligands from a mixture of testub described punching. This mixture is with a Target structure incubated. The target structure can be found both in Lö solution as well as immobilized. After the incubation the target structures with bound test substances are abge separates. The bound test substances will be massed directly analyzed and identified spectrometrically.

Die üblichen Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel- Molekülen gebundenen Liganden umfassen folgende Schritte:
The usual methods for determining the amount of ligand bound to target molecules include the following steps:

a) Bereitstellen von Ziel-Molekülen und einer Lösung von mit einer Markierungssubstanz versehenen Ligandena) Provision of target molecules and a solution of ligands provided with a tag
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Lösung mit den Ziel- Molekülen,b) contacting and incubating the solution with the target molecules
c) Trennen der an Ziel-Moleküle gebundenen von nicht gebun den Liganden,c) separating the bound to target molecules from unbound the ligand,
d) ggf. Waschen der abgetrennten an Ziel-Moleküle gebunde nen Liganden und d) optionally washing the separated bound to target molecules nen ligands and
e) Quantifizieren gebundener Liganden durch Messen der Men ge der Markierungssubstanz der gebundenen Liganden.e) quantifying bound ligands by measuring the men ge the labeling substance of the bound ligands.

Die Markierungssubstanz kann beispielsweise ein Fluorophor, eine radioaktive Verbindung oder ein Enzym sein. Die Markie rungssubstanzen verändern häufig die Bindungseigenschaften der Liganden. Dann ist es bei der hier beschriebenen direkten Quantifizierung nicht möglich, exakt die Menge nativer Ligan den zu bestimmen, welche unter den gleichen Bedingungen bin den würden.The labeling substance may be, for example, a fluorophore, a radioactive compound or an enzyme. The markie Substances often alter the binding properties the ligands. Then it is with the direct described here Quantification not possible, exactly the amount of native ligand to determine who is under the same conditions that would.

Bei einer indirekten Quantifizierung enthält die Lösung beim Schritt lit. a zusätzlich native Liganden. Die mit einer Mar kierungssubstanz versehenen Liganden weisen eine definierte Affinität und Selektivität zu den Ziel-Molekülen auf. Beim Schritt lit. b konkurrieren sie mit den nativen Liganden um die Bindung an den Ziel-Molekülen. Die Menge der gebundenen nativen Liganden wird durch Quantifizieren der gebundenen mit einer Markierungssubstanz versehenen Liganden indirekt ermit telt. Werden Liganden eingesetzt, die durch ihre Masse ein deutig identifizierbar sind, können gebundene Liganden mas senspektrometrisch quantifiziert werden. Es ist nicht erfor derlich markierte Liganden einzusetzen.In an indirect quantification, the solution contains Step lit. a additional native ligands. The with a Mar cationsubstanz provided ligands have a defined Affinity and selectivity to the target molecules. At the Step lit. b they compete with the native ligands the binding to the target molecules. The amount of bound Native ligands are made by quantifying the bound ones a ligand provided ligands indirectly ermit telt. Are ligands used by their mass are clearly identifiable, bound ligands can mas be quantitated by spectrophotometry. It is not required to use ligands markedly labeled.

Schritt lit. b erlaubt das Binden der Liganden an die Ziel- Moleküle. Dabei bilden sich Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe. Das Trennen gebundener von nicht gebundenen Liganden kann beispielsweise mittels Filtration oder Größenausschlußchroma tographie erfolgen. Es können auch an einem Träger immobili sierte Ziel-Moleküle bereitgestellt werden. In diesem Fall sondern sich die Liganden beim Binden von der Lösung ab. Falls der Träger, wie beispielsweise Mikrokügelchen, in Sus pension vorliegt, kann dieser durch Zentrifugation abgeson dert werden. Nach dem Entfernen der Lösung haften an den gebildeten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen noch ungebundene Li ganden. Diese werden durch Waschen entfernt.Step lit. b allows binding of the ligands to the target Molecules. This forms ligand-target molecule complexes. The separation of bound unbound ligands can be for example by filtration or size exclusion chroma tography. It can also immobili on a carrier be provided target molecules. In this case but the ligands bind off from the solution. If the carrier, such as microspheres, in Sus pension is present, this can be done by centrifugation be changed. After removal of the solution adhere to the formed Ligand-target-molecule complexes still unbound Li ligands. These are removed by washing.

Sämtliche Trennverfahren einschließlich des Waschens haben das Ziel, ungebundene Liganden möglichst vollständig von ge bildeten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen zu trennen. Die Men ge der in den abgetrennten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen vorhandenen Liganden wird, insbesondere durch Quantifizieren der Markierungssubstanz, ermittelt. Die ermittelte Menge ge bundener Liganden wird der Liganden-Menge gleichgesetzt, wel che ursprünglich im Bindungsgleichgewicht an die Ziel- Moleküle gebunden war. Die Menge der nach einer unvollständi gen Trennung an den Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen noch an haftenden ungebundenen Liganden würde die Quantifizierung ge bundener Liganden verfälschen.All separation processes including washing have the goal, unbound ligands as completely as possible of ge formed ligand-target-molecule complexes to separate. The men ge in the separated ligand-target molecule complexes existing ligands, in particular by quantification the marker substance, determined. The determined amount ge bound ligand is equated to the amount of ligand, wel originally in the binding equilibrium to the target Molecules was bound. The amount of after an incomplete gene separation on the ligand-target-molecule complexes still on adherent unbound ligand would quantify ge falsify bound ligand.

Die bekannten Verfahren zur Quantifizierung gebundener Ligan den weisen einen systemimmanenten Fehler auf: Die Abtrennung der gebundenen von den nicht gebundenen Liganden einschließ lich des Waschens führt zu einer Aufhebung des Bindungs gleichgewichts. Das bewirkt eine Verringerung der Anzahl ge bildeter Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe. Diese beginnen zu dissoziieren, sobald sich die Liganden-Konzentration in der die Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe umgebenden Lösung verrin gert. Die beim Schritt lit. e ermittelte Menge gebundener Li ganden ist nicht identisch mit der Menge der ursprünglich ge bundenen Liganden.The known methods for quantifying bound ligands the wise have a systemic error: The separation which bound from unbound ligands Lich of washing leads to a lifting of the bond balance. This causes a reduction in the number ge formed ligand-target molecule complexes. These start too dissociate as soon as the ligand concentration in the the ligand-target-molecule complexes surrounding solution siege. The lit. e determined amount of bound Li Ganden is not identical to the original amount bound ligands.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein Ver fahren zur genauen Bestimmung der Menge von nativen an Ziel- Molekülen gebundenen Liganden angegeben werden. Das Verfahren soll schnell und einfach ausführbar sein. Weiterhin soll es zum Auffinden von Liganden aus einer Lösung mit einer Mi schung potentieller Liganden geeignet sein. Weiteres Ziel ist es, den genannten systemimmanenten Fehler zu vermeiden.Object of the present invention is to overcome the disadvantages of To eliminate state of the art. In particular, an Ver drive to accurately determine the amount of native to target Molecules bound ligands can be given. The procedure should be fast and easy executable. It should continue for finding ligands from a solution with a Mi be suitable for potential ligands. Another goal is it to avoid the mentioned systemic error.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 21 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2-20.This object is achieved by the features of claims 1 and 21 solved. Advantageous embodiments will be apparent from the Features of claims 2-20.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten vorgesehen:
According to the invention, a method for determining the amount of ligands bound to target molecules is provided with the following steps:

a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase,a) Provide the target molecules and one of the ligands in a mixed amount containing a predetermined amount,
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen,b) contacting and incubating the mixed phase with the Target molecules,
c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Be dingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt,c) separating bound ligands from the mixed phase under Be conditions under which the amount of unbound ligands remains constant,
d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischpha se undd) Determining the amount of unbound ligands in the mixed phase and
e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenz bildung zwischen der Menge der Liganden gemäß lit. a und der gemäß lit. d ermittelten Liganden-Menge.e) Determining the amount of bound ligands by difference formation between the amount of ligands according to lit. a and the according to lit. d determined ligand amount.

Es versteht sich, daß statt einer Menge auch eine Konzentra tion ermittelt werden kann. Wird nur eine Art von Ziel- Molekülen mit einheitlichen Bindungsstellen bereitgestellt und ist die Zahl der Bindungsstellen bekannt, kann aus den gemäß lit. d und lit. e ermittelten Mengen auch die Affinität der Liganden zu den Bindungsstellen errechnet werden. Der Be griff Mischphase umfaßt sowohl eine reine Lösung als auch ei ne Suspension oder eine Lösung mit Membranstrukturen, wie Ve sikel. Die Ziel-Moleküle können in Lösung, in Suspension oder immobilisiert vorliegen. Immobilisierte Ziel-Moleküle können z. B. an einer Wand eines die Mischphase mit den Liganden ent haltenden Gefäßes oder an Partikeln immobilisiert sein. Zur Durchführung des Schritts lit. c ist jedes beliebige Verfah ren geeignet, bei dem das Absondern gebundener Liganden unter Bindungsbedingungen erfolgt. Dabei ändert sich die Konzentra tion der ungebundenen Liganden in der die Liganden-Ziel- Molekül-Komplexe kontaktierenden Mischphase nicht. Die Menge der gebildeten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe bleibt kon stant. Als ein solches Verfahren kommt z. B. ein Absondern ge bildeter Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe mittels Zentrifugie ren in Betracht. Danach kann die Liganden-Konzentration und/oder -Menge in der Mischphase ermittelt werden, welche das beim Zentrifugieren gebildete Pellet überschichtet. Das Absondern gebundener Liganden umfaßt auch das durch das Bin den an immobilisierte Ziel-Moleküle stattfindende Absondern von Liganden aus der Mischphase. Zum Ermitteln der Liganden- Konzentration und/oder -Menge ist beispielsweise die Massen spektrometrie geeignet.It goes without saying that instead of a crowd, a concentra tion can be determined. Will only one type of target Molecules provided with uniform binding sites and is the number of binding sites known, can from the according to lit. d and lit. The calculated quantities also show the affinity the ligands are calculated to the binding sites. The Be handle mixed phase includes both a pure solution and egg a suspension or a solution with membrane structures, such as Ve Sikel. The target molecules can be in solution, in suspension or immobilized present. Immobilized target molecules can z. B. on a wall of the mixed phase with the ligands ent holding vessel or immobilized on particles. to Implementation of step lit. c is any method in which the separation of bound ligands under Bonding conditions occurs. This changes the Konzentra tion of the unbound ligands in which the ligands target Molecule complexes not contacting mixed phase. The amount The formed ligand-target-molecule complexes remain con constant. As such a method is z. B. a segregation ge formed ligand-target molecule complexes by centrifugation into consideration. Thereafter, the ligand concentration and / or amount are determined in the mixing phase, which the pellet formed during centrifugation is overcoated. The Separating bound ligands also includes that through the bin the secreting of immobilized target molecules of ligands from the mixed phase. To determine the ligand Concentration and / or amount is for example the masses spectrometry suitable.

Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht in der Ver meidung des oben genannten systemimmanenten Fehlers. Die Men ge von an Ziel-Molekülen gebunden Liganden ist exakt bestimm bar. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert einen geringe ren Aufwand. Es ist lediglich das Absondern gebundener Ligan den erforderlich. Die Isolation gebildeter Liganden-Ziel- Molekül-Komplexe entfällt. Ein Waschschritt ist beim erfin dungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich. Durch die geringere Zahl der Arbeitsschritte verringert sich gegenüber dem Stand der Technik das Risiko, Fehler einzuschleppen. Die beim Schritt lit. a bereitgestellte Mischphase kann die Liganden in einer Mischung mit verschiedenen anderen Substanzen ent halten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, schnell und einfach an die Ziel-Moleküle gebundene Liganden aus der Mischung zu identifizieren.An essential advantage of the method is the Ver avoidance of the above-mentioned systemic error. The men of ligands bound to target molecules is exactly determinate bar. The inventive method requires a small ren effort. It is merely the secretion of bound ligand the required. The isolation of formed ligand targets Molecule complexes are eliminated. A washing step is invented not required according to the invention. By the lower Number of steps is reduced compared to The prior art, the risk of introducing errors. The at Step lit. a provided mixed phase can be the ligands in a mixture with various other substances ent hold. The inventive method is suitable, fast and ligands bound simply to the target molecules from the Identify mixture.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung werden zur Bestimmung der Affinität der Liganden zu den Ziel-Molekülen die Schritte lit. a bis lit. e mit Liganden und Ziel-Molekülen in einem ersten Mengen-Verhältnis durchgeführt und dann mit Liganden und Ziel-Molekülen in mindestens einem weiteren Mengen- Verhältnis wiederholt. Vorteilhafterweise erfolgt dabei das Inkubieren bis zum Erreichen des Bindungsgleichgewichts. Aus den Mengen der bei den unterschiedlichen Mengen-Verhältnissen gebundenen Liganden kann, beispielsweise mittels einer nicht linearen Regressionsanalyse der Sättigungsisotherme, die Af finität ermittelt werden. Die Sättigungsisotherme stellt die Menge der an die Ziel-Moleküle gebundenen Liganden in Abhän gigkeit von der Konzentration ungebundener Liganden dar.In a preferred embodiment, the determination of the Affinity of the ligands to the target molecules the steps lit. a to lit. e with ligands and target molecules in one performed first quantity ratio and then with ligands and target molecules in at least one other quantity Ratio repeated. Advantageously, this is done Incubate until binding equilibrium is reached. Out the amounts of the different amounts ratios bound ligand can, for example by means of a not linear regression analysis of the saturation isotherm, the Af be determined. The saturation isotherm represents the Amount of bound to the target molecules ligands in dependence the concentration of unbound ligands.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren die Liganden und/oder die Ziel-Moleküle in nativer, insbesondere in nicht markierter oder nicht immobilisierter, Form bereitgestellt werden. Dadurch ist es möglich, Ergebnis se zu erhalten, die nicht durch ein die Bindungseigenschaften beeinflussendes Immobilisieren oder Markieren verfälscht sind. Es ist auch möglich, die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere mittels eines Fluorophors, zu markieren. Dabei werden ungebundene Li ganden markiert, nachdem eine Bindung von Liganden an die Ziel-Moleküle stattgefunden hat. Das Ergebnis kann nicht dadurch verfälscht werden, daß das Markieren eine Veränderung der Bindungseigenschaften der Liganden bewirkt. Die Markie rung ermöglicht das Ermitteln der Menge ungebundener Liganden mittels empfindlicher Nachweismethoden. Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann durch diese Maßnahme gesteigert werden.It is particularly advantageous when the inventive Method the ligands and / or the target molecules in native, especially in unlabelled or not immobilized, Be provided form. This makes it possible to result to get that, not by one's binding properties influencing immobilizing or marking falsified are. It is also possible to use the ligands in the mixed phase after completion of step lit. c, in particular by means of of a fluorophore. This unbound Li After binding of ligands to the Target molecules has taken place. The result can not be to be falsified that marking a change causes the binding properties of the ligands. The markie allows the determination of the amount of unbound ligands using sensitive detection methods. The sensitivity of the method can be increased by this measure.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Mischphase gemäß Schritt lit. a, vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden enthält. Das ermöglicht es, die Mengen verschiedener an Ziel-Moleküle gebundener Liganden oder deren Affinitäten zu Ziel-Molekülen gleichzeitig zu be stimmen. Die Liganden können teilweise eine bekannte Affini tät zu den Ziel-Molekülen aufweisen und als Referenz zur Be stimmung einer unbekannten Affinität dienen.Furthermore, it is advantageous if the mixing phase according to Step lit. a, preferably more than 10, in particular more as 100 contains different ligands. That makes it possible the amounts of different ligands bound to target molecules or their affinities to target molecules simultaneously vote. Some of the ligands may be a known affini having reference to the target molecules and as reference to Be mood of an unknown affinity.

Nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d kann ein Trennschritt, insbesondere unter Verwendung von Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC®, Um kehrphasenchromatographie oder Affinitätschromatographie, er folgen. Der Trennschritt kann beispielsweise einer Massen spektrometrie direkt vorgeschaltet sein. Das ermöglicht das Differenzieren zwischen Liganden, die bei sich direkt an den Schritt lit. c anschließender Durchführung des Schritts lit. d nicht unterscheidbar sind. Beispielsweise kann zwischen Isomeren unterschieden werden. Nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d können die Liganden in der Mischphase konzentriert werden. Das erhöht die Empfindlichkeit des Verfahrens und ermöglicht den Einsatz von weiteren, weniger sensitiven Nachweismethoden.After completion of step lit. c and before implementation of the step lit. d may be a separation step, in particular under Use of gas chromatography, capillary electrophoresis, Liquid chromatography, preferably HPLC, FPLC®, Um reverse phase chromatography or affinity chromatography, he consequences. The separation step may be, for example, a mass spectrometry directly upstream. That allows that Differentiate between ligands that are directly attached to the Step lit. c subsequent implementation of step lit. d are indistinguishable. For example, between Isomers can be distinguished. After completion of the step lit. c and before the implementation of step lit. d can the Concentrated ligands in the mixed phase. That increases the sensitivity of the process and allows the use of other, less sensitive detection methods.

Bevorzugt sind die Liganden derart zusammengestellt, daß die Menge aller Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann. Ein vorhergehender Trennschritt ist dabei nicht erforderlich. Beispielsweise werden Liganden unterschiedlicher Molmasse zusammengestellt, wenn die Detektion massenspektrometrisch erfolgen soll. So ist es möglich, die Affinitäten oder gebundenen Mengen einer großen Zahl von Liganden gleichzeitig zu ermitteln.Preferably, the ligands are assembled in such a way that the Amount of all ligands when performing step lit. d in can be determined in one operation. A previous one Separation step is not required. For example ligands of different molecular mass are assembled, if the detection is to be mass spectrometry. So is it possible to have the affinities or bound amounts of one to detect large numbers of ligands simultaneously.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung werden beim Schritt lit. a verschiedene Ziel-Moleküle bereitgestellt. Dadurch ist es möglich, die Menge von an verschiedenen Ziel-Molekülen gebun denen Liganden gleichzeitig zu bestimmen. Auch die Affinitä ten der Liganden zu verschiedenen Ziel-Molekülen können gleichzeitig bestimmt werden. Vorzugsweise liegen die Ziel- Moleküle in einer Konzentration größer als 1 nM, insbesondere größer als 100 nM, vorzugsweise größer als 1 µM, vor. Durch den Einsatz der Ziel-Moleküle in hoher Konzentration kann ei ne große Menge gebundener Liganden erreicht werden. Das er höht die Empfindlichkeit des Verfahrens. Vorteilhaft ist der Einsatz der Ziel-Moleküle in hoher Konzentration auch dann, wenn die Mischphase gemäß Schritt lit. a verschiedene Ligan den mit unterschiedlichen Affinitäten zu den Ziel-Molekülen enthält. Große Mengen gebundener Liganden bewirken auch große Unterschiede zwischen den Mengen der verschiedenen gebundenen Liganden. Dadurch kann besser zwischen diesen Mengen unter schieden werden.In a preferred embodiment, in step lit. a different target molecules provided. That's it possible, the amount of bound to different target molecules which ligands to determine simultaneously. Also the affinity th the ligands to different target molecules can be determined simultaneously. Preferably, the target Molecules in a concentration greater than 1 nM, in particular greater than 100 nM, preferably greater than 1 μM, before. By the use of the target molecules in high concentration can egg a large amount of bound ligands can be achieved. That he increases the sensitivity of the procedure. It is advantageous Use of the target molecules in high concentration even then, if the mixing phase according to step lit. a different ligand those with different affinities to the target molecules contains. Large amounts of bound ligands also cause large Differences between the amounts of different bound Ligands. This can better between these amounts below to be divorced.

Zusätzlich kann die Mischphase Inhibitoren einer Bindung der Liganden an die Ziel-Moleküle enthalten. Bei Ziel-Molekülen mit verschiedenen Bindungsstellen können Inhibitoren einge setzt werden, die eine Spezifität für eine oder mehrere die ser Bindungsstellen aufweisen. Beim Bereitstellen von ver schiedenen Ziel-Molekülen und/oder Ziel-Molekülen mit ver schiedenen Bindungsstellen kann ein Bindungsansatz ohne einen Inhibitor mit jeweils einem Bindungsansatz verglichen werden, der einen Inhibitor mit einer Spezifität für ein Ziel-Molekül oder eine Bindungsstelle enthält. So können Bindungen selek tiv untersucht werden. Inhibitoren mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen können als Referenzsubstanzen zur Bestim mung einer unbekannten Affinität dienen.In addition, the mixed phase inhibitors of binding of the Ligands to the target molecules. At target molecules with different binding sites inhibitors can be which have a specificity for one or more of the have these binding sites. When deploying ver different target molecules and / or target molecules with ver different binding sites can be a binding approach without a Inhibitor are each compared with a binding approach, the one inhibitor with specificity for a target molecule or a binding site. So bonds can selek be examined. Inhibitors with known affinity to The target molecules can be used as reference substances for the purpose serve an unknown affinity.

Vorteilhafterweise erfolgt das Ermitteln der Liganden-Menge mittels eines Verfahrens, mit dem weniger als 10 ng, insbe sondere weniger als 100 pg, vorzugsweise weniger als 100 fg, der Liganden detektierbar sind. Die Liganden-Menge kann mit tels Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC oder FPLC®, insbesondere unter Verwendung von Umkehrphasenchroma tographie, ermittelt werden. Die Detektion nach der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie kann mittels Massenspektrometrie, Spektralphotometrie, insbesondere mittels UV-Detektion oder Diodenfeld-Detektion, Kapillarelektrophorese, Fluoreszenzde tektion, Lumineszenzdetektion, elektrochemischer Oxidation oder Reduktion oder Flammenionisationsdetektion erfolgen.Advantageously, the determination of the amount of ligand takes place by means of a process with which less than 10 ng, esp especially less than 100 pg, preferably less than 100 fg, the ligands are detectable. The amount of ligands can with mass spectrometry, capillary electrophoresis or gas or liquid chromatography, preferably HPLC or FPLC®, especially using reverse phase chromatography tography. Detection after gas or Liquid chromatography can be carried out by mass spectrometry, Spectral photometry, in particular by means of UV detection or Diode field detection, capillary electrophoresis, fluorescence dec detection, luminescence detection, electrochemical oxidation or reduction or flame ionization detection.

Vorzugsweise wird die Liganden-Menge in der Mischphase vor Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere vor Durchfüh rung des Schritts lit. b, mit einem Messverfahren gemessen, welches bei Durchführung des Schritts lit. d zum Ermitteln der Liganden-Menge eingesetzt wird. Das ermöglicht eine bes sere Vergleichbarkeit der eingesetzten mit der beim Schritt lit. d ermittelten Liganden-Menge. Ferner kann dadurch das Messverfahren für das Ermitteln der Liganden-Menge geeicht werden.Preferably, the amount of ligand will be in the mixed phase Implementation of step lit. c, in particular before implementation tion of step lit. b, measured by a measuring method, which when lit. d for determining the amount of ligand is used. This allows a bes Comparability of used with that at the step lit. d determined ligand amount. Furthermore, this can be the Measuring method for determining the amount of ligands calibrated become.

Bei einem Ausführungsbeispiel liegen die Ziel-Moleküle gelöst oder suspendiert vor. Die Bindungseigenschaften der Ziel- Moleküle sind nicht durch Immobilisieren verändert. Die Ziel- Moleküle können in Membranstrukturen eingebettet vorliegen. Die Membranstrukturen können nativ oder künstlich sein. Die Ziel-Moleküle sind dabei nicht immobilisiert. Sie können durch einfache Verfahren, wie Zentrifugation, abgesondert werden.In one embodiment, the target molecules are dissolved or suspended before. The binding properties of the target Molecules are not altered by immobilization. The goal- Molecules can be embedded in membrane structures. The membrane structures can be native or artificial. The Target molecules are not immobilized. You can separated by simple methods, such as centrifugation become.

Das Absondern gemäß lit. c kann durch Dialyse, Präzipitation, Adsorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer Af finität zu gebildeten Ligand-Ziel-Molekül-Komplexen, Zentri fugation oder Filtration, insbesondere Ultrafiltration, er folgen. Die Moleküle mit einer Affinität zu gebildeten Li gand-Ziel-Molekül-Komplexen können an, insbesondere magne tisch, abzusondernden Partikeln immobilisiert sein. Vorteil hafterweise werden die Ziel-Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. c regeneriert. Dies ermöglicht deren Wiederver wendung. Das ist besonders bei kostbaren Ziel-Molekülen sinn voll, z. B. bei Ziel-Molekülen auf Zellen, an denen mehrere Untersuchungen durchgeführt werden sollen.The separation according to lit. c can be obtained by dialysis, precipitation, Adsorption, binding to immobilized molecules with an Af to form ligand-target-molecule complexes, centri Fugation or filtration, in particular ultrafiltration, he consequences. The molecules with an affinity for formed Li gand-target-molecule complexes can, in particular, be magne be immobilized table to be separated particles. benefit Properly enough, the target molecules after performing the Step lit. c regenerated. This allows their Wiederver turn. This is especially useful for precious target molecules full, z. For example, in target molecules on cells where several Investigations are to be carried out.

Die Ziel-Moleküle oder Liganden können aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren, Enzyme, Transportproteine, Ionenkanäle oder Antikörper, Hor mone, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten, Zellhomogenaten, Synaptosomen, Li posomen, synaptischen Plasmamembran-Vesikeln, Gewebeschnit ten, Viren, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Be standteile, Kapsiden, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile und Naturstoffgemischen.The target molecules or ligands can be selected from the following group be selected: peptides, proteins, in particular receptors, Enzymes, transport proteins, ion channels or antibodies, Hor mone, nucleic acids, sugars, polymers and structures on or in cells, cell fragments, cell homogenates, synaptosomes, Li posomen, synaptic plasma membrane vesicles, tissue cut th, viruses, their components or fragments of these Be constituents, capsids, their components or fragments of these ingredients and natural product mixtures.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus eine Kombination von Liganden zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Liganden derart zusammengestellt sind, daß die Menge aller Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in ei nem Arbeitsgang ermittelt werden kann.The invention also relates to a combination of Ligands for use in a method according to the invention, wherein the ligands are assembled such that the amount all ligands when performing step lit. d in egg nem operation can be determined.

Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnung und anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigenHereinafter, the invention by the drawing and based of exemplary embodiments explained in more detail. Show it

Fig. 1a, 1b, 1c eine schematische Darstellung eines Bin dungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC sowie den Ziel-Molekülen TA, Fig. 1a, 1b, 1c is a schematic representation of a Bin-making approach with the ligands LA, LB and LC, and the target molecules TA,

Fig. 2a, 2b, 2c eine schematische Darstellung eine s Bin dungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC, den Ziel-Molekülen TA und TC und Fig. 2a, 2b, 2c is a schematic representation of a s ing approach with the ligands LA, LB and LC, the target molecules TA and TC and

Fig. 3a, 3b, 3c eine schematische Darstellung eines Bin dungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC, den Ziel-Molekülen TA und TC sowie den Inhibitoren IA. Fig. 3a, 3b, 3c is a schematic representation of a binding approach with the ligands LA, LB and LC, the target molecules TA and TC and the inhibitors IA.

Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1

Fig. 1a zeigt schematisch einen Bindungsansatz mit den Ligan den LA, LB und LC sowie einer einzigen Sorte von Ziel- Molekülen TA. Dabei weist LA zu TA eine hohe, LB zu TA eine geringe und LC zu TA eine sehr geringe Affinität auf. Im An schluß an die in Fig. 1b dargestellte Inkubation erfolgt das Absondern gebundener Liganden von der Mischphase. Das kann durch Zentrifugation erfolgen. Fig. 1c zeigt die Situation nach dem Absondern. Die Menge von LC in der Mischphase ist unverändert geblieben. Die Mengen von LA und LB in der Misch phase haben sich um die an TA gebundenen Mengen verringert. Fig. 1a shows schematically a binding approach with the ligands LA, LB and LC as well as a single kind of target molecule TA. In this case LA has a high TA, a low TA to TA and a low TA to TA a very low affinity. In connection to the incubation shown in Fig. 1b, the separation of bound ligands of the mixed phase takes place. This can be done by centrifugation. Fig. 1c shows the situation after the separation. The amount of LC in the mixing phase has remained unchanged. The amounts of LA and LB in the mixing phase have decreased by the amounts bound to TA.

Für einen schematisch in den Fig. 1a bis 1c dargestellten Bindungsansatz wird eine Membranpräparation transfizierter CHO-K1 Zellen, die als Ziel-Moleküle humane µ-opioid Rezepto ren exprimieren (Biotrend GmbH, Köln, Deutschland), verwen det. Die in einer Konzentration von 50 nM bzw. einer Menge von 12,5 µmol vorliegenden µ-opioid Rezeptoren werden mit 100 nM, entsprechend 25 µmol Morphin, 100 nM, entsprechend 25 pmol Codein, und 100 nM, entsprechend 25 µmol Tramadol als Liganden sowie 5 mM MgCl₂ und 50 mM Tris HCl, pH 7,4 in einem Geamtvolumen von 250 µl 150 Minuten bei 25°C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Anschließend werden die Membran partikel bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Vom Überstand Ü1 werden 150 µl abgenommen.For a binding approach shown schematically in FIGS. 1a to 1c, a membrane preparation of transfected CHO-K1 cells expressing human μ-opioid receptors as target molecules (Biotrend GmbH, Cologne, Germany) is used. The present at a concentration of 50 nM or 12.5 μmol μ-opioid receptors are with 100 nM, corresponding to 25 .mu.mol morphine, 100 nM, corresponding to 25 pmol codeine, and 100 nM, corresponding to 25 .mu.mol tramadol as ligands and 5 mM MgCl ₂ and 50 mM Tris HCl, pH 7.4 in a total volume of 250 μl for 150 minutes at 25 ° C in a 1.5 ml PP reaction tube incubated. Subsequently, the membrane particles are centrifuged off at 50,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. From the supernatant Ü1 150 μl are removed.

In Ü1 werden Morphin, Codein und Tramadol mittels HPLC ge trennt. Dabei wird eine LiChrospher 60 RP select B-Trennsäule verwendet. Als Laufmittel A wird 0,1% Ameisensäure und als Laufmittel B Methanol verwendet. Zur Chromatographie wird ein Gradient eingesetzt, bei dem sich die Konzentrationen der Laufmittel von 100% A und 0% B zu 0% A und 100% B bei ei ner Flußrate von 0,8 ml pro Minute ändern. Anschließend er folgt eine massenspektrometrische Quantifizierung im MS/MS- Modus mittels eines Finnigan LCQ Deca-Massenspektrometers. Dieses Massenspektrometer ist ein Ion-Trap-Massenspektro meter, das ein API-Interface mit Elektro-Spray-Ionisation nutzt.In Ü1 morphine, codeine and tramadol are ge by HPLC ge separates. This will be a LiChrospher 60 RP select B separation column used. As eluant A is 0.1% formic acid and as Eluent B used methanol. For chromatography is a Gradient used, in which the concentrations of Eluent from 100% A and 0% B to 0% A and 100% B at egg ner flow rate of 0.8 ml per minute change. He then follows a mass spectrometric quantification in the MS / MS Mode using a Finnigan LCQ Deca mass spectrometer. This mass spectrometer is an ion trap mass spectrometer meter, which has an API interface with electro-spray ionization uses.

Ebenso wird ein Überstand Ü1* hergestellt, der sich vom Über stand Ü1 dadurch unterscheidet, daß er aus einer Membranprä paration ohne Zusatz von Liganden gewonnen wird. Es wird eine Lösung L1 hergestellt, die Morphin, Codein und Tramadol je weils in einer Konzentration von 100 nM in Ü1* enthält. Die Lösung L1 wird ebenso analysiert, wie für Ü1 beschrieben. Mit den aus L1 ermittelten Ansprechfaktoren für die Liganden sind die folgenden Mengen der jeweiligen Liganden berechnet wor den, die insgesamt in ungebundener Form in Ü1 vorhanden sind:
Likewise, a supernatant Ü1 * is produced which differs from the supernatant Ü1 in that it is obtained from a membrane preparation without the addition of ligands. A solution L1 is prepared which contains morphine, codeine and tramadol in each case at a concentration of 100 nM in Ü1 *. Solution L1 is also analyzed as described for Ü1. With the response factors for the ligands determined from L1, the following quantities of the respective ligands have been calculated, which are present overall in unbound form in Ü1:

Morphinmorphine 13,2 pmol,13.2 pmol, Codeincodeine 24,1 pmol24.1 pmol AL=L<undAL = L "and Tramadoltramadol 24,3 pmol.24.3 pmol.

Aus der jeweiligen Differenz der eingesetzten und in L1 be stimmten Menge an Ligand und der für Ü1 ermittelten Menge an nicht gebundenem Ligand sind die folgenden Mengen gebundener Liganden ermittelt worden:
The following amounts of bound ligands have been determined from the respective difference between the amount of ligand used and that determined in L1 and the amount of unbound ligand determined for Ü1:

Morphinmorphine 11,8 pmol,11.8 pmol, Codeincodeine 0,9 pmol0.9 pmol AL=L<undAL = L "and Tramadoltramadol 0,7 pmol.0.7 pmol.

Je größer der Anteil des an Ziel-Moleküle gebundenen Liganden ist, desto größer ist die Affinität des Liganden zum Ziel- Molekül. Für die relativen Affinitäten der untersuchten Li ganden zu den Ziel-Molekülen ergibt sich somit, daß Morphin eine deutlich höhere Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweist als Codein und Tramadol. Gegebenenfalls läßt sich der K_d-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden zum Ziel-Molekül für die zu untersuchenden Liganden, wie hier z. B. Morphin, mit Hilfe mindestens einer dem Bindungsansatz zugesetzten Refe renzsubstanz mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen aus den gewonnenen Daten gut abschätzen.The greater the proportion of ligand bound to target molecules, the greater the affinity of the ligand for the target molecule. For the relative affinities of the ligands investigated to the target molecules, it follows that morphine has a significantly higher affinity for the target molecules than codeine and tramadol. Optionally, the K _d value can be used as a measure of the affinity of a ligand for the target molecule for the ligand to be examined, as here z. B. morphine, with the help of at least one binding compound added to the reference substance with a known affinity for the target molecules from the data obtained well.

Wenn nur eine Art von Ziel-Molekülen vorliegt, die Liganden in einem geeigneten Konzentrationsbereich vorliegen und ein Binden der Liganden an andere Bindungsstellen als die Zielmo leküle weitgehend ausgeschlossen werden kann, läßt sich der K_d-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden LA zu einem Ziel-Molekül TA wie folgt berechnen:
If only one type of target molecule is present, the ligands are in a suitable concentration range and binding of the ligands to binding sites other than the Zielmo molecules can be largely excluded, the K _d value can be used as a measure of the affinity of a ligand LA calculate a target molecule TA as follows:

K_d = [TA-frei] × [LA-frei]/[LA-gebunden]K _d = [TA-free] × [LA-free] / [LA-bound]

Dabei ist
It is

- [TA-frei] die Konzentration der freien Ziel-Moleküle TA,- [TA-free] the concentration of free target molecules TA,
- [LA-frei] die Konzentration der freien Liganden LA und- [LA-free] the concentration of the free ligands LA and
- [LA-gebunden] die Konzentration der an die Ziel-Moleküle TA spezifisch gebundenen Liganden LA- [LA-bound] the concentration of the target molecules TA specifically bound ligands LA

im Bindungsansatz nach der Inkubation.in the binding approach after incubation.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Zur exakten Ermittlung der Affinität von Liganden zu Ziel- Molekülen sind Daten aus mindestens zwei Bindungsansätzen er forderlich. In den Bindungsansätzen müssen die Liganden und die Ziel-Moleküle in unterschiedlichen Mengen-Verhältnissen vorliegen. Aus den Mengen der bei den unterschiedlichen Men gen-Verhältnissen gebundenen Liganden kann die Affinität er mittelt werden.For the exact determination of the affinity of ligands to target Molecules are data from at least two binding approaches he conducive. In the binding approaches, the ligands and the target molecules in different proportions available. From the quantities of the different men Genes bound ligand, the affinity he can be averaged.

In den Bindungsansätzen B1 bis B6 werden humane µ-opioid Re zeptoren als Ziel-Moleküle in einer Konzentration von 50 nM, die einer Menge von 12,5 pmol entspricht, mit jeweils einer Konzentration Codein in Gegenwart von 5 mM MgCl₂, 50 mM Tris HCl pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 µl 150 Minuten bei 25°C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Die Bin dungsansätze weisen dabei die folgenden Codein- Konzentrationen und -Mengen auf: B1 - 20 nM - 5 pmol, B2 - 60 nM - 15 pmol, B3 - 200 nM - 50 pmol, B4 - 600 nM - 150 pmol, B5 - 2 µM - 500 pmol und B6 - 20 µM - 5000 pmol. Anschließend werden die Membranpartikel bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Von den Überständen Ü1 bis Ü6 der Bindungs ansätze B1 bis B6 werden jeweils 150 µl abgenommen und wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben mittels HPLC und anschlie ßender Massenspektrometrie quantifiziert.In the binding mixtures B1 to B6 are human μ-opioid Re acceptors as target molecules in a concentration of 50 nM, which corresponds to an amount of 12.5 pmol, each with a concentration of codeine in the presence of 5 mM MgCl ₂ , 50 mM Tris HCl pH 7.4 in a total volume of 250 .mu.l for 150 minutes at 25.degree. C. in a 1.5 ml PP reaction vessel. Binding reactions have the following codeine concentrations and amounts: B1-20 nM-5 pmol, B2-60 nM-15 pmol, B3-200 nM-50 pmol, B4-600 nM-150 pmol, B5-2 μM - 500 pmol and B6 - 20 μM - 5000 pmol. Subsequently, the membrane particles are centrifuged off at 50,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. From the supernatants Ü1 to Ü6 of the binding approaches B1 to B6 are each 150 ul removed and quantified as described in Example 1 by HPLC and then sequent mass spectrometry.

Wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wird ein Überstand Ü1* erzeugt. Es werden Lösungen L1 bis L6 hergestellt, in de nen Codein in Ü1* in den folgenden Konzentration und Mengen vorliegt: L1 - 20 nM - 5 pmol, L2 - 60 nM - 15 pmol, L3 - 200 nM - 50 pmol, L4 - 600 nM - 150 pmol, L5 - 2 µM - 500 pmol und L6 - 20 µM - 5000 pmol. Die Lösungen L1 bis L6 werden analysiert wie es für Ü1 bis Ü6 beschrieben worden ist.As described in Embodiment 1, a supernatant Ü1 * generated. Solutions L1 to L6 are prepared, in de Codeine in Ü1 * in the following concentrations and quantities present: L1 - 20 nM - 5 pmol, L2 - 60 nM - 15 pmol, L3 - 200 nM - 50 pmol, L4 - 600 nM - 150 pmol, L5 - 2 μM - 500 pmol and L6 - 20 μM - 5000 pmol. The solutions L1 to L6 become analyzed as described for Ü1 to Ü6.

Mit dem aus L1 bis L6 ermittelten Ansprechfaktor für den Li ganden sind die folgenden Mengen der insgesamt in ungebunde ner Form in Ü1 bis Ü6 vorliegenden Liganden berechnet worden:
With the response factor for the ligand determined from L1 to L6, the following quantities of the total unbound form in Ü1 to Ü6 have been calculated:

Ü1U1 4,0 pmol,4.0 pmol, Ü2U2 10,9 pmol,10.9 pmol, Ü3U3 41,7 pmol,41.7 pmol, Ü4U4 134,5 pmol,134.5 pmol, Ü5E5 463,1 pmol463.1 pmol AL=L<undAL = L "and Ü6E6 4737 pmol.4737 pmol.

Aus der jeweiligen Differenz der in L1 bis L6 eingesetzten Menge an Ligand und der in Ü1 bis Ü6 ermittelten Menge an nicht gebundenem Ligand sind für B1 bis B6 die folgenden Men gen insgesamt gebundener Liganden ermittelt worden:
From the respective difference between the amount of ligand used in L1 to L6 and the amount of unbound ligand determined in Ü1 to Ü6, the following quantities of total bound ligands have been determined for B1 to B6:

B1B1 1,0 pmol,1.0 pmol, B2B2 4,1 pmol,4.1 pmol, B3B3 8,3 pmol,8.3 pmol, B4B4 15,5 pmol,15.5 pmol, B5B5 36,9 pmol36.9 pmol AL=L<undAL = L "and B6B6 263 pmol.263 pmol.

Falls in dem Bindungsansatz zusätzlich zu den Ziel-Molekülen auch noch andere Bindungsstellen enthalten sind, an welche der Ligand unspezifisch bindet, muß dies für eine exakte Er mittlung der Affinität berücksichtigt werden. Durch Wahl ge eigneter Konzentrationsverhältnisse in einem Sättigungsver such, wie in diesem Ausführungsbeispiel beschrieben, können die jeweiligen Mengen des unspezifisch gebundenen Liganden aus der in B1 bis B6 ermittelten Gesamtbindung durch nicht lineare Regressionsanalyse mittels des Programms Prism 2.01 der Firma GraphPad, Software, Inc., San Diego berechnet wer den. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die folgenden Mengen unspezifisch gebundener Liganden ermittelt worden:
If, in addition to the target molecules, other binding sites to which the ligand nonspecifically binds are included in the binding approach, this must be taken into account for an exact determination of the affinity. By selecting suitable concentration ratios in a saturation test, as described in this exemplary embodiment, the respective amounts of unspecifically bound ligand can be determined from the total binding determined in B1 to B6 by nonlinear regression analysis using the program Prism 2.01 from GraphPad, Software, Inc. San Diego calculates who. In the present exemplary embodiment, the following amounts of non-specifically bound ligands have been determined:

B1B1 0,25 pmol0.25 pmol B2B2 0,75 pmol0.75 pmol B3B3 2,5 pmol2.5 pmol B4B4 7,5 pmol7.5 pmol B5B5 25 pmol25 pmol B6B6 250 pmol250 pmol

Wird die für B1 bis B6 berechnete Menge unspezifischer Bin dung jeweils von der Menge des insgesamt gebundenen Liganden subtrahiert, wird die folgende spezifische, d. h. ausschließ lich an Ziel-Moleküle erfolgte, Bindung erhalten:
If the amount of non-specific binding calculated for B1 to B6 is in each case subtracted from the amount of the total bound ligand, the following specific binding, ie exclusively to target molecules, is obtained:

B1B1 0,75 pmol0.75 pmol B2B2 3,3 pmol3.3 pmol B3B3 5,8 pmol5.8 pmol B4B4 8,0 pmol8.0 pmol B5B5 11,9 pmol11.9 pmol B6B6 13,0 pmol13.0 pmol

Es ist bis zum Erreichen eines Bindungsgleichgewichts inku biert worden. Zur Berechnung der Affinität eines Liganden zu den Ziel-Molekülen ist es erforderlich, für B1 bis B6 die Konzentrationen des nicht gebundenen, d. h. freien Liganden, und der gebildeten Liganden-Ziel-Moleküle-Komplexe zu kennen. Die Konzentration der Ziel-Moleküle insgesamt sowie die Kon zentration der nicht gebundenen, d. h. freien Ziel-Moleküle, ist bekannt.It is inku until a binding equilibrium is reached been brewed. To calculate the affinity of a ligand to the target molecules, it is necessary for B1 to B6 the Concentrations of unbound, d. H. free ligands, and to know the ligand-target-molecule complexes formed. The concentration of the target molecules overall as well as the con concentration of unbound, d. H. free target molecules, is known.

Aus der entsprechenden Sättigungsisotherme für B1 bis B6 läßt sich durch nicht lineare Regressionsanalyse mittels des Pro gramms Prism 2.01 der Firma GraphPad, Software, Inc., San Diego der K_d-Wert berechnen.From the corresponding saturation isotherm for B1 to B6, the K _d value can be calculated by non-linear regression analysis using the program Prism 2.01 from GraphPad, Software, Inc., San Diego.

Aus den in B1 bis B6 erhaltenen Daten ergibt sich für Codein ein K_d-Wert von 2,2 × 10^-7 mol/l bei einer Gesamtkonzentration der Ziel-Moleküle von 5,2 × 10^-8 mol/l.From the data obtained in B1 to B6, a K _d value of 2.2 × 10 ^-7 mol / l results for codeine at a total concentration of the target molecules of 5.2 × 10 ^-8 mol / l.

Gegebenenfalls kann zur Bestimmung der nicht spezifischen Bindung auch die Durchführung eines weiteren Bindungsansatzes in Gegenwart eines spezifischen Liganden, welche eine Bindung an die Ziel-Moleküle selektiv unterdrückt, erforderlich sein. Es wird auf Ausführungsbeispiel 3 verwiesen.Optionally, to determine the non-specific Binding also the implementation of another binding approach in the presence of a specific ligand, which is a bond to the target molecules selectively suppressed, may be required. Reference is made to exemplary embodiment 3.

Analog können auch die K_d-Werte für mehrere Liganden gleich zeitig bestimmt werden. Dafür können die einzelnen Liganden nebeneinander in jeweils gleicher Konzentration in einem Bin dungsansatz eingesetzt werden. Similarly, the K _d values for several ligands can be determined simultaneously. For this, the individual ligands can be used side by side in the same concentration in a binding approach.

Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3

Fig. 2a zeigt schematisch einen Bindungsansatz mit den Ligan den LA, LB und LC sowie den Ziel-Molekülen TA und TC. Dabei weist LA zu TA und LC zu TC eine Affinität auf. LB besitzt keine Affinität zu den im Ansatz vorhandenen Ziel-Molekülen. Im Anschluß an die in Fig. 2b dargestellte Inkubation erfolgt das Absondern gebundener Liganden von der Mischphase. Das kann durch Zentrifugation geschehen. Fig. 2c zeigt die Situa tion nach dem Absondern. Die Menge von LB in der Mischphase ist unverändert geblieben. Die Mengen von LA und LC in der Mischphase haben sich um die an TA und TC gebundenen Mengen verringert. Es sollen Liganden identifiziert werden, die Af finität zu TA, nicht aber zu TC besitzen. Dazu wird zu einem zweiten Bindungsansatz, wie er in Fig. 3a dargestellt ist, ein spezifischer Inhibitor IA im Überschuß gegenüber TA zuge setzt. Fig. 3a zeigt den Bindungsansatz schematisch. Der In hibitor bindet spezifisch an TA und verhindert die Bindung von LA an TA. In Fig. 3b ist der Zustand am Ende der Inkuba tion dargestellt. Fig. 3c zeigt die Situation nach dem Abson dern gebundener Liganden einschließlich des gebundenen Inhi bitors IA. Es befinden sich unveränderte Mengen von LB und LA in der Mischphase. Die Menge an LC in der Mischphase hat sich verringert. Aus dem Vergleich der Zusammensetzungen der in Fig. 2c und der in Fig. 3c dargestellten Mischphasen ergibt sich, welche Liganden eine Affinität zu dem Ziel-Molekül TA aufweisen. Fig. 2a shows schematically a binding approach with the ligands LA, LB and LC and the target molecules TA and TC. In this case, LA has an affinity for TA and LC for TC. LB has no affinity for the target molecules present in the batch. Following the incubation shown in Fig. 2b, the separation of bound ligands from the mixed phase. This can be done by centrifugation. Fig. 2c shows the situation tion after segregation. The amount of LB in the mixed phase has remained unchanged. The amounts of LA and LC in the mixed phase have decreased by the amounts bound to TA and TC. Ligands are to be identified that have affinity to TA, but not to TC. For this purpose, a specific inhibitor IA is added in excess to TA to a second binding approach, as shown in Fig. 3a. Fig. 3a shows the binding approach schematically. The inhibitor binds specifically to TA and prevents the binding of LA to TA. In Fig. 3b, the state at the end of Inkuba tion is shown. Fig. 3c shows the situation after the absorption of the bound ligands including the bound Inhi bitors IA. There are unchanged amounts of LB and LA in the mixed phase. The amount of LC in the mixing phase has decreased. From the comparison of the compositions of the mixed phases shown in Fig. 2c and in Fig. 3c, it can be seen which ligands have an affinity for the target molecule TA.

In dem schematisch in den Fig. 2a bis 2c dargestellten Bindungsansatz wird eine Präparation synaptischer Plasmamem bran-Vesikel (spm-Vesikel) verwendet. Die spm-Vesikel sind aus dem Hippocampus von Schweinen gewonnen (G. Höfner und K. Th. Wanner, Eur. J. Pharmacol. 394, 211-219, 2000) und an schließend 4 × in 5 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen worden (G. Höfner und K. Th. Wanner, J. Recept. Signal Transduct. Res. 16, 297-313, 1996). Neben vielen anderen Ziel-Molekülen ent hält diese spm-Vesikel-Präparation N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptoren, die neben anderen Bindungsstellen Bindungsstellen für Glycin enthalten. In einem ersten Bindungsansatz B1 wer den die spm-Vesikel in einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml, entsprechend einer Konzentration bzw. Menge der Gylcinbindungsstellen von 50 nM bzw. 12,5 pmol, mit 100 nM, entsprechend 25 pmol Aminocyclopropancarbonsäure, 100 nM, entsprechend 25 pmol L-Methionin und 100 nM, entsprechend 25 pmol L-Phenylalanin sowie 10 mM MgCl₂ und 5 mM Tris-HCl- Puffer bei pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 µl 180 Minu ten bei 4°C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. An schließend werden die spm-Vesikel bei 50000 × g 20 Minuten bei 4°C abzentrifugiert. Vom Überstand Ü1 werden 100 µl ab genommen.In the binding approach shown schematically in FIGS. 2a to 2c, a preparation of synaptic plasma membrane vesicles (spm vesicles) is used. The spm vesicles are derived from the hippocampus of pigs (G. Höfner and K. Th. Wanner, Eur. J. Pharmacol., 394, 211-219, 2000) and then 4 × in 5 mM Tris-HCl pH 7, 4 (G. Höfner and K. Th. Wanner, J. Recept., Signal Transduct., Res. 16, 297-313, 1996). In addition to many other target molecules, this spm-vesicle preparation contains N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, which, in addition to other binding sites, contain glycine binding sites. In a first binding approach B1 who the spm vesicles in a protein concentration of 15 mg / ml, corresponding to a concentration or amount of Gylcinbindungsstellen of 50 nM or 12.5 pmol, with 100 nM, corresponding to 25 pmol aminocyclopropanecarboxylic acid, 100 nM, corresponding to 25 pmol of L-methionine and 100 nM, corresponding to 25 pmol of L-phenylalanine and 10 mM MgCl ₂ and 5 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4 in a total volume of 250 μl for 180 min at 4 ° C in a 1 , 5 ml PP reaction tube incubated. At the end, the spm vesicles are centrifuged off at 50,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. From the supernatant Ü1 100 ul are taken from.

In Ü1 werden Aminocyclopropancarbonsäure, L-Methionin und L- Phenylalanin mittels HPLC, wie in ChromCircle Version 1.3, 1997, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland beschrieben, ge trennt. Dazu sind die folgenden Laufmittel verwendet worden: Laufmittel A: Wasser, Laufmittel B: Acetonitril und Laufmit tel C: Ammoniumformiatpuffer pH 4,4. Zur Chromatographie wird ein Gradient eingesetzt, bei dem sich die Konzentrationen der Laufmittel von 100% A, 0% B und 0% C zu 0% A, 50% B und 50% C bei einer Flußrate von 0,8 ml pro Minute ändern. Die Quantifiziering erfolgt wie im Ausführungsbeispiel 1 be schrieben mittels eines Finnigan LCQ Deca-Massenspektrometers im MS/MS-Modus.In Ü1 aminocyclopropanecarboxylic acid, L-methionine and L-methane Phenylalanine by HPLC as in ChromCircle Version 1.3, 1997, Merck KGaA, Darmstadt, Germany, ge separates. For this the following eluents have been used: Eluent A: water, eluent B: acetonitrile and runmit tel C: ammonium formate buffer pH 4.4. For chromatography is a gradient is used in which the concentrations of the Eluent of 100% A, 0% B and 0% C to 0% A, 50% B and Change 50% C at a flow rate of 0.8 ml per minute. The Quantification is carried out as in the embodiment 1 be written using a Finnigan LCQ Deca mass spectrometer in MS / MS mode.

Parallel dazu wird eine zweite Bindung in einem Bindungsan satz B2 durchgeführt. B2 unterscheidet sich vom ersten Bin dungsansatz B1 nur dadurch, daß zusätzlich 10 µM MDL 105,515, ein selektiver Ligand für eine Glycinbindungsstelle am NMDA Rezeptor, enthalten sind. Aus B2 wird ein Überstand Ü2 gewon nen, der wie Ü1 analysiert wird.In parallel, a second bond in a bond sentence B2. B2 is different from the first bin Approach B1 only in that in addition 10 μM MDL 105,515, a selective ligand for a glycine binding site on the NMDA Receptor, are included. From B2 a supernatant Ü2 won which is analyzed like Ü1.

Ebenso wird ein Überstand Ü1* hergestellt, der sich vom Über stand Ü1 dadurch unterscheidet, daß er aus einer spm-Vesikel- Päparation ohne Zusatz von Liganden gewonnen wird. Es wird eine Lösung L1 hergestellt, die 100 nM Aminocyclopropancar bonsäure, 100 nM L-Methionin und 100 nM L-Phenylalanin in Ü1* enthält. Diese Lösung L1 wird ebenso analysiert wie Ü1. Es ergeben sich die folgenden Mengen ungebundener Liganden:
Likewise, a supernatant Ü1 * is produced which differs from the supernatant Ü1 in that it is obtained from an spm vesicle preparation without addition of ligands. A solution L1 is prepared containing 100 nM aminocyclopropanecarboxylic acid, 100 nM L-methionine and 100 nM L-phenylalanine in Ü1 *. This solution L1 is analyzed as well as Ü1. The following quantities of unbound ligands result:

Ü1:U1: Aminocyclopropancarbonsäureaminocyclopropanecarboxylic 17,5 pmol17.5 pmol L-MethioninL-methionine 22,3 pmol22.3 pmol L-PhenylalaninL-phenylalanine 22,2 pmol22.2 pmol

Ü2:U2: Aminocyclopropancarbonsäureaminocyclopropanecarboxylic 22,0 pmol22.0 pmol L-MethioninL-methionine 22,3 pmol22.3 pmol L-PhenylalaninL-phenylalanine 22,1 pmol22.1 pmol

Aus der Differenz der jeweils eingesetzten und in L1 bestimm ten Menge an Liganden und der für Ü1 bzw. Ü2 jeweils ermit telten Menge nicht gebundener Liganden, sind die folgenden Mengen gebundener Liganden ermittelt worden:
From the difference between the amount of ligands used in each case and determined in L1 and the respective amount of unbound ligands determined for each of U1 and U2, the following quantities of bound ligands have been determined:

Ü1:U1: Aminocyclopropancarbonsäureaminocyclopropanecarboxylic 7,5 pmol7.5 pmol L-MethioninL-methionine 2,7 pmol2.7 pmol L-PhenylalaninL-phenylalanine 2,8 pmol2.8 pmol

Ü2:U2: Aminocyclopropancarbonsäureaminocyclopropanecarboxylic 3,0 pmol3.0 pmol L-MethioninL-methionine 2,7 pmol2.7 pmol L-PhenylalaninL-phenylalanine 2,9 pmol2.9 pmol

Aus der Differenz der jeweiligen Menge an Liganden in Ü1 und Ü2 wird die Menge spezifisch an Ziel-Moleküle gebundener Li ganden in B1 wie folgt berechnet:
From the difference in the respective amount of ligands in Ü1 and Ü2, the amount of ligands specifically bound to target molecules in B1 is calculated as follows:

Aminocyclopropancarbonsäureaminocyclopropanecarboxylic 4,5 pmol4.5 pmol L-MethioninL-methionine 0 pmol0 pmol L-PhenylalaninL-phenylalanine ~0 pmol~ 0 pmol

Je größer der Anteil der an Ziel-Moleküle gebundenen Liganden ist, desto größer ist die Affinität des Liganden zum Ziel- Molekül. Für die relativen Affinitäten der drei untersuchten Liganden zu den Ziel-Molekülen ergibt sich somit, daß Ami nocyclopropancarbonsäure eine deutlich höhere Affinität zum Ziel-Molekül besitzt als L-Methionin und L-Phenylalanin. Die Affinitäten von L-Methionin und L-Phenylalanin sind unter diesen Bedingungen nicht meßbar. Gegebenenfalls läßt sich der K_d-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden, in diesem Ausführungsbeispiel von Aminocyclpropancarbonsäure, zum Ziel- Molekül für die zu untersuchenden Liganden mit Hilfe minde stens einer dem Bindungsansatz zugesetzten Referenzsubstanz mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen aus den gewon nenen Daten gut abschätzen.The larger the proportion of ligands bound to target molecules, the greater the affinity of the ligand for the target molecule. For the relative affinities of the three ligands investigated to the target molecules thus results that Ami nocyclopropancarbonsäure a significantly higher affinity for the target molecule than L-methionine and L-phenylalanine. The affinities of L-methionine and L-phenylalanine are not measurable under these conditions. Optionally, the K _d value can be used as a measure of the affinity of a ligand, in this embodiment of Aminocyclpropancarbonsäure, to the target molecule for the ligand to be examined with minde least one of the binding approach added reference substance with known affinity to the target molecules from the well-estimated data.

Der K_d-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden, in die sem Anwendungsbeispiel für Aminocyclopropancarbonsäure, zum Ziel-Molekül läßt sich außerdem gemäß der Formel
The K _d value as a measure of the affinity of a ligand, in the application example of aminocyclopropanecarboxylic acid, to the target molecule can also be determined according to the formula

K_d = [TA-frei] × [LA-frei]/[LA-gebunden]
K _d = [TA-free] × [LA-free] / [LA-bound]

berechnen.to calculate.

Aus den ermittelten Ergebnissen ergibt sich für Aminocyclo propancarbonsäure ein K_d-Wert von 1,5 × 10^-7 mol/l.From the results obtained results for Aminocyclo propancarbonsäure a K _d value of 1.5 × 10 ^-7 mol / l.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten:

a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase,
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen,
c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Be dingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt,
d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischpha se und
e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenz bildung zwischen der Menge der Liganden gemäß lit. a und der gemäß lit. d ermittelten Liganden-Menge.

A method of determining the amount of ligand bound to target molecules, comprising the steps of:

a) providing the target molecules and a mixed phase containing the ligands in a predetermined amount,
b) contacting and incubating the mixed phase with the target molecules,
c) separating bound ligands from the mixed phase under conditions under which the amount of unbound ligand remains constant,
d) determining the amount of unbound ligands in the mixed phase and
e) Determining the amount of bound ligands by difference education between the amount of ligands according to lit. a and the according to lit. d determined ligand amount.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Bestimmung der Af finität der Liganden zu den Ziel-Molekülen die Schritte lit. a bis lit. e mit Liganden und Ziel-Molekülen in einem ersten Mengen-Verhältnis durchgeführt und dann mit Liganden und Ziel-Molekülen in mindestens einem weiteren Mengen-Verhältnis wiederholt werden.2. The method according to claim 1, wherein for determining the Af fineness of the ligands to the target molecules, the steps lit. a to lit. e with ligands and target molecules in a first Quantity ratio carried out and then with ligands and Target molecules in at least one other ratio be repeated.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Liganden und/oder die Ziel-Moleküle in nativer Form bereitgestellt werden. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the ligands and / or the target molecules are provided in native form become.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere mittels eines Fluorophors, markiert wer den.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the Ligands in the mixed phase after performing the step lit. c, in particular by means of a fluorophore, marked who the.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischphase gemäß Schritt lit. a, vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden enthält.5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the mixed phase according to step lit. a, preferably more than Contains 10, in particular more than 100, different ligands.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d ein Trennschritt, insbesondere unter Ver wendung von Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Flüs sigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC®, Umkehrpha senchromatographie oder Affinitätschromatographie, erfolgt.6. The method according to any one of the preceding claims, wherein after completion of step lit. c and before implementation of the step lit. d is a separation step, in particular under Ver use of gas chromatography, capillary electrophoresis, flows liquid chromatography, preferably HPLC, FPLC®, reverse phase chromatography or affinity chromatography.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d konzentriert werden.7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the ligands in the mixed phase after performing the step lit. c and before the implementation of step lit. d concentrated become.

8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Liganden derart zu sammengestellt sind, daß die Menge aller Liganden bei Durch führung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann.8. The method of claim 5, wherein the ligands so to are compiled that the amount of all ligands in By leadership of the lit. d determined in one operation can be.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. a verschiedene Ziel-Moleküle bereitgestellt werden.9. The method according to any one of the preceding claims, wherein at step lit. a different target molecules provided become.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle in einer Konzentration größer als 1 nM insbesondere größer als 100 nM, vorzugsweise größer als 1 µM, vorliegen.10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target molecules in a concentration greater than 1 nM in particular greater than 100 nM, preferably greater than 1 μM, available.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischphase zusätzlich Inhibitoren einer Bindung der Li ganden an die Ziel-Moleküle enthält.11. The method according to any one of the preceding claims, wherein the mixed phase additionally inhibitors of Li binding passed to the target molecules.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ermitteln der Liganden-Menge mittels eines Verfahrens er folgt, mit dem weniger als 10 ng, insbesondere weniger als 100 pg, vorzugsweise weniger als 100 fg, der Liganden detek tierbar sind.12. The method according to any one of the preceding claims, wherein determining the amount of ligand by a method with less than 10 ng, in particular less than 100 pg, preferably less than 100 fg, of the ligand detek are animalizable.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ermitteln der Liganden-Menge mittels Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Gas- oder Flüssigkeits chromatographie, vorzugsweise HPLC oder FPLC®, insbesondere unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie, erfolgt.13. The method according to any one of the preceding claims, wherein determining the amount of ligand by mass spectrometry, Capillary electrophoresis or gas or liquid chromatography, preferably HPLC or FPLC®, in particular using reverse phase chromatography.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Detektion nach der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie mittels Massenspektro metrie, Spektralphotometrie, insbesondere mittels UV- Detektion oder Diodenfeld-Detektion, Kapillarelektrophorese, Fluoreszenzdetektion, Lumineszenzdetektion, elektrochemischer Oxidation oder Reduktion oder Flammenionisationsdetektion er folgt.14. The method of claim 13, wherein the detection according to the Gas or liquid chromatography by mass spectrometry metrology, spectrophotometry, in particular by means of UV Detection or diode field detection, capillary electrophoresis, Fluorescence detection, luminescence detection, electrochemical Oxidation or reduction or flame ionization detection follows.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Liganden-Menge in der Mischphase vor Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere vor Durchführung des Schritts lit. b, mit einem Messverfahren gemessen wird, welches bei Durchführung des Schritts lit. d zum Ermitteln der Liganden- Menge eingesetzt wird. 15. The method according to any one of the preceding claims, wherein the amount of ligand in the mixed phase before performing the Step lit. c, in particular before the step lit. b, measured by a measuring method which is at Implementation of step lit. d for determining the ligand Quantity is used.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle gelöst oder suspendiert vorliegen.16. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target molecules are dissolved or suspended.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle in Membranstrukturen eingebettet vorliegen.17. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target molecules are embedded in membrane structures.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Absondern gemäß lit. c durch Dialyse, Präzipitation, Ad sorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer Affi nität zu gebildeten Ligand-Ziel-Molekül-Komplexen, Zentrifu gation oder Filtration, insbesondere Ultrafiltration, er folgt.18. The method according to any one of the preceding claims, wherein the separation according to lit. c by dialysis, precipitation, Ad sorption, binding to immobilized molecules with an affi to form ligand-target-molecule complexes, centrifuge gation or filtration, in particular ultrafiltration, he follows.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. c rege neriert werden.19. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target molecules after performing step lit. c lively be neriert.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle oder Liganden aus folgender Gruppe ausge wählt sind: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren, Enzy me, Transportproteine, Ionenkanäle oder Antikörper, Hormone, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten, Zellhomogenaten, Synaptosomen, Lipo somen, synaptischen Plasmamembran-Vesikeln, Gewebeschnitten, Viren, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandtei le, Kapsiden, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Be standteile und Naturstoffgemischen.20. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target molecules or ligands selected from the following group are selected: peptides, proteins, in particular receptors, Enzy me, transport proteins, ion channels or antibodies, hormones, Nucleic acids, sugars, polymers and structures on or in Cells, cell fragments, cell homogenates, synaptosomes, lipo somen, synaptic plasma membrane vesicles, tissue sections, Viruses, their components or fragments of these components le, capsids, their constituents or fragments of this Be constituents and natural product mixtures.

21. Kombination von Liganden zur Verwendung in einem Verfah ren nach einem der Ansprüche 1-20, wobei die Liganden der art zusammengestellt sind, daß die Menge aller Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermit telt werden kann.21. Combination of ligands for use in a procedure ren according to any one of claims 1-20, wherein the ligands of the are assembled so that the amount of all ligands in Implementation of step lit. d in one operation ermit can be telt.