DE10019252A1 - Polydeoxyribonucleotides to inhibit ICAM-1 gene expression - Google Patents

Polydeoxyribonucleotides to inhibit ICAM-1 gene expression

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Abstract

The invention relates to triple-helix oligo nucleotides which become attached to double-stranded genomic ICAM-1-DNA sequences and thus inhibit transcription. The invention also relates to polydesoxyribonucleotides as therapeutic agents in the therapy or prophylaxis of ICAM-1 associated diseases.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Triplehelix-Oligonukleotide, die sich an doppelsträngige genomische ICAM-1-DNA-Sequenzen anlagern und so die Transkription hemmen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polydesoxyribonukleotide als therapeutischen Mittels zur Therapie oder Prophylaxe von ICAM-1 assoziierten Erkrankungen.The present invention relates to triple helix oligonucleotides which are double-stranded Add genomic ICAM-1 DNA sequences and thus inhibit transcription. Further The present invention relates to the use of the polydesoxyribonucleotides as therapeutic agent for the therapy or prophylaxis of ICAM-1 associated diseases.

Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analoga z. B. Protein-Oligonukleotid-Hybride können die Expression von Genen hemmen, indem sie hochaffin an bestimmte Nukleinsäuresequenzen binden. Die besterforschte Strategie ist der Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden. Antisense- Oligonukleotide hemmen durch Sequenzspezifische Hybridisierung mit mRNA-Molekülen die mRNA-Translation. Die Expression zahlreicher Gene konnte durch Antisense-Oligonukleotide gehemmt werden. Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung von Genen, die bei verschiedenen Erkrankungen eine Rolle spielen, befinden sich bereits als pharmakologische Substanzen in der klinischen Erprobung [15, 21].Oligonucleotides or oligonucleotide analogs e.g. B. Protein-oligonucleotide hybrids can Inhibit expression of genes by affecting specific nucleic acid sequences tie. The best researched strategy is the use of antisense oligonucleotides. Antisense Oligonucleotides inhibit the by sequence-specific hybridization with mRNA molecules mRNA translation. The expression of numerous genes was possible using antisense oligonucleotides be inhibited. Antisense oligonucleotides for the inhibition of genes in different Diseases play a role, are already found as pharmacological substances in the clinical trials [15, 21].

Eine weitere molekulare Hemmstrategie stellen Triplehelix-Oligonukleotide dar. Triplehelix- Oligonukleotide binden an bestimmten Abschnitten an die geschlossene DNA-Doppelhelix und erzeugen so eine Triplehelixstruktur [17, 18]. Während Antisense-Oligonukleotide Wechselwirkungen mit einzelsträngiger RNA über basenspezifische Hybridisierung (Watson- Crick-Basenpaarungen) eingehen, lagern sich Triplehelix-Oligonukleotide in der großen Furche der geschlossenen DNA-Doppelhelix an. Die Bindung erfolgt durch Wasserstoffbrückenverbindungen zwischen bestimmten Basen des Triplehelix-Oligonukleotids und Purinbasen im Strang der DNA-Doppelhelix (Van-Hoogsteen-Wechselwirkungen).Triplehelix oligonucleotides represent another molecular inhibition strategy. Oligonucleotides bind to the closed DNA double helix and at certain sections generate a triple helix structure [17, 18]. During antisense oligonucleotides Interactions with single-stranded RNA via base-specific hybridization (Watson Crick base pairings), Triplehelix oligonucleotides are stored in the large groove the closed DNA double helix. The binding takes place through Hydrogen bonds between certain bases of the triplehelix oligonucleotide and purine bases in the strand of the DNA double helix (Van Hoogsteen interactions).

Aus Gründen der Bindungsaffinität erfolgt die Anlagerung bevorzugt an Stellen, an denen einer der beiden Doppelhelix-Stränge eine purinreiche Passage und der komplementäre Strang folglich eine pyrimidinreiche Passage besitzt (Homopurin-Homopyrimidin-Abschnitte) [17, 18]. Das Interesse an Triplehelixstrukturen ist stark gewachsen, nachdem man erkannt hat, daß sie sowohl DNA-Replikation als auch Genexpression hemmen können. Im Gegensatz zu Antisense- Oligonukleotiden, die über RNA-Hybridisierung auf eine Hemmung der Translation abzielen, hemmen Triplehelix-Oligonukleotide die Transkription über Bildung von Triplehelixstrukturen an gezielten Stellen im Gen in der genomischen DNA. Es konnte gezeigt werden, daß es intrazellulär tatsächlich zur Triplehelixbildung im Genom kommen kann [3]. Triplehelix­ bedingte Hemmung der Genexpression konnte unter zellfreien in-vitro- Transkriptionsbedingungen [1], aber auch intrazellulär an transfizierten Reportergenen [4, 6, 10, 13] gezeigt werden. In weiteren Studien wurde ein transkriptionsinhibierender Effekt dadurch dokumentiert, daß Triplehelix-Oligonukleotide die mRNA-Synthese durch Bindung ans Zielgen verhinderten [9, 11].For reasons of binding affinity, the attachment occurs preferably at locations where one of the two double helix strands is a purine-rich passage and the complementary strand is consequently has a passage rich in pyrimidine (homopurine-homopyrimidine sections) [17, 18]. The Interest in triple helix structures has grown rapidly after realizing that they both  Can inhibit DNA replication as well as gene expression. Unlike antisense Oligonucleotides which are aimed at inhibiting translation via RNA hybridization, triplehelix oligonucleotides inhibit transcription by forming triplehelix structures at targeted locations in the gene in genomic DNA. It could be shown that it was triplehelix formation in the genome can actually occur intracellularly [3]. Triplehelix Inhibition of gene expression could occur under cell-free in vitro Transcription conditions [1], but also intracellularly on transfected reporter genes [4, 6, 10, 13]. In other studies, a transcription-inhibiting effect was found documented in that Triplehelix oligonucleotides mRNA synthesis by binding to Target genes prevented [9, 11].

Zur Erhöhung der Bindungs-Effektivität kann die im Prinzip reversible Triplehelix-Bildung durch kovalente Verbindung der Triplehelix-Oligonukleotide mit ihren Zielstrukturen dauerhaft gemacht werden. Zur kovalenten Vernetzung kommen verschiedene chemische Oligonukleotid- Modifikationen in Betracht [17]. Beispielsweise können Psoralen-konjugierte Triplehelix- Oligonukleotide durch UVA-Bestrahlung kovalent an ihre Zielsequenzen gebunden werden [16]. An ihre Zielsequenz gebundene Psoralen-konjugierte Triplehelix-Oligonukleotide bewirkten nach UVA-Bestrahlung eine effektive Transkriptionshemmung an einem transient transfizierten Reportergen [4].The principle of reversible triple helix formation can be used to increase the binding effectiveness through covalent connection of the triplehelix oligonucleotides with their target structures be made. Various chemical oligonucleotide Modifications considered [17]. For example, psoralen-conjugated triplehelix Oligonucleotides are covalently bound to their target sequences by UVA radiation [16]. Psoralen-conjugated triplehelix oligonucleotides bound to their target sequence caused after UVA irradiation, an effective transcription inhibition on a transiently transfected Reporter gene [4].

Die Kombination von frei vorliegenden Psoralenmolekülen, d. h. nicht an Polydesoxyribonukleotide gekoppelte Psoralenmoleküle, mit langwelliger UVA-Strahlung (PUVA) ist andererseits eine etablierte und häufig eingesetzte Therapieform für Hauterkrankungen [5]. Diese Therapie wird als PUVA-Therapie bezeichnet. Psoralene werden als Tablette verabreicht oder durch ein Bad auf die Haut gebracht. Nach Aufnahme in Hautzellen lagern sich Psoralene an einer beliebigen Stelle in die DNA-Doppelhelix ein. Die durch UVA- Aktivierung entstehenden Photobisaddukte (Quervernetzung der DNA) hemmen die DNA- Replikation und damit die Zellvermehrung, ein Effekt, der therapeutisch bei entzündlichen (Psoriasis) und neoplastischen (kutanes T-Zell-Lymphom) Hautkrankheiten genutzt wird. Da die Psoralene im Gegensatz zu psoralengekoppelten Triplehelix-Oligonukleotiden wahllos und nicht sequenzspezifisch an die genomische DNA binden, besitzt diese Therapieform zum Teil erhebliche Nebenwirkungen. The combination of free P soralenmolekülen present, that is not coupled to polydeoxyribonucleotides Psoralenmoleküle, with long-wave UV-A radiation (PUVA) on the other hand, a well-established and frequently used form of treatment for skin conditions [5]. This therapy is called PUVA therapy. Psoralens are given as tablets or applied to the skin by a bath. After being absorbed into skin cells, psoralens are stored anywhere in the DNA double helix. The photobis adducts (cross-linking of DNA) created by UVA activation inhibit DNA replication and thus cell proliferation, an effect that is used therapeutically for inflammatory (psoriasis) and neoplastic (cutaneous T-cell lymphoma) skin diseases. Since the psoralens, unlike psoraline-linked triplehelix oligonucleotides, bind indiscriminately and not sequence-specifically to the genomic DNA, this form of therapy sometimes has considerable side effects.

Ein Schlüsselmolekül bei vielen Entzündungsvorgängen, unter anderem bei verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen (Psoriasis, Neurodermitis), aber auch beim allergischen Asthma und bei Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen ist das "intercellular adhesion molecule-1" (ICAM-1). ICAM-1 ist ein Glykoprotein aus der Immunglobulin- Superfamilie und vermittelt bei immunologischen Vorgängen Kontakt zwischen Zellen [2, 18]. In der Haut ist ICAM-1 bei der Einleitung einer Immunantwort gegen Erreger und bei der Ausbildung von allergischen Ekzemen wichtig, weil es am Kontakt zwischen Antigen­ präsentierenden epidermalen Langerhanszellen und den die Immunantwort koordinierenden T- Lymphozyten beteiligt ist. ICAM-1 steuert auch die Migration von Leukozyten aus dem Blutkreislauf in entzündlich verändertes Gewebe (vermittelt Kontakt zwischen Gefäßendothelzellen und Leukozyten). Im Gewebe müssen Leukozyten an ortsständige Zellen binden, um ihre Überwachungsfunktion ausüben zu können. Zytotoxische T-Lymphozyten eliminieren viral transformierte oder maligne entartete Körperzellen, beispielsweise Oberhautzellen (Keratinozyten). Die T-Lymphozyten benötigen zur Bindung an ihre Zielzellen ICAM-1. In ähnlicher Form wie in der Haut ist ICAM-1 auch an Entzündungsreaktionen anderer Organe (Lunge, Magen-Darm-Trakt, Leber) beteiligt [18]. Eine Therapie von Erkrankungen, an denen ICAM-1 beteiligt ist, besteht zur Zeit in der Verabreichung von gegen ICAM-1 gerichteten monoklonalen Antikörpern [14] und von ICAM-1-Antisense-Oligonukleotiden [21]. Antisense- Oligonukleotide besitzen jedoch den Nachteil, daß sie lediglich eine Interferenz mit bereits abgelesener Geninformation, d. h. hnRNA oder mRNA, eingehen und eine gesteigerte Transkription den Hemmeffekt kompensieren kann.A key molecule in many inflammatory processes, including several inflammatory skin diseases (psoriasis, neurodermatitis), but also with allergic ones Asthma and rejection after organ transplantation is the "intercellular adhesion molecule-1 "(ICAM-1). ICAM-1 is a glycoprotein from the immunoglobulin Superfamily and mediates contact between cells in immunological processes [2, 18]. In The skin is ICAM-1 in initiating an immune response against pathogens and in the Training of allergic eczema is important because of the contact between antigen presenting epidermal Langerhans cells and the T- coordinating the immune response Lymphocyte is involved. ICAM-1 also controls the migration of leukocytes from the Blood circulation in inflammatory tissue (mediates contact between Vascular endothelial cells and leukocytes). In the tissue, leukocytes have to be attached to local cells bind to be able to exercise their monitoring function. Cytotoxic T lymphocytes eliminate virally transformed or malignant body cells, for example Skin cells (keratinocytes). The T lymphocytes need to bind to their target cells ICAM-1. In a form similar to that in the skin, ICAM-1 is also involved in other people's inflammatory reactions Organs (lungs, gastrointestinal tract, liver) involved [18]. A therapy for diseases, at in which ICAM-1 is involved is currently the administration of anti-ICAM-1 monoclonal antibodies [14] and ICAM-1 antisense oligonucleotides [21]. Antisense However, oligonucleotides have the disadvantage that they only interfere with one another read genetic information, d. H. hnRNA or mRNA, and an increased Transcription can compensate for the inhibitory effect.

Daher ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polydesoxyribonukleotide bereitzustellen, die die Transkription von ICAM-1 hemmen.It is therefore the object of the present invention to provide polydeoxyribonucleotides which inhibit ICAM-1 transcription.

Die Aufgaben werden durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The tasks are solved by the subject defined in the patent claims.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.The invention is illustrated by the following figures.

Fig. 1 zeigt schematisch einen doppelsträngigen Abschnitt des ICAM-1-Gens mit dessen Zielsequenz (Sinn- und Gegensinn-Strang) und beispielhaft Sequenzen von für die Triplehelix- Bildung geeigneten erfindungsgemäßen Triplehelix-Oligonukleotiden. G bedeutet Guanin, T Thymin, A Adenin, C Cytsoin, I Inosin und U Uracil. Fig. 1 shows schematically a double stranded portion of the ICAM-1 gene with its target sequence (sense and antisense strand) and exemplary sequences suitable for the formation Triplehelix- invention Triple helix oligonucleotides. G means guanine, T thymine, A adenine, C cytsoin, I inosine and U uracil.

Fig. 2 zeigt schematisch zwei doppelsträngige Abschnitte (Sinn- und Gegensinn-Strang) des ICAM-1-Gens und jeweils ein erfindungsgemäßes Triplehelix-Oligonukleotid (THO GT 13ap in Fig. 2A beziehungsweise THO GT 17ap in Fig. 2B). Der Abschnitt, an den das Triplehelix- Oligonukleotid bindet, ist unterstrichen. CO GT sc1 und CO GT sc2 sind Kontrolloligonukleotide. FIG. 2 shows schematically two double-stranded sections (sense and counter-sense strand) of the ICAM-1 gene and in each case a triplehelix oligonucleotide according to the invention (THO GT 13ap in FIG. 2A or THO GT 17ap in FIG. 2B). The section to which the triple helix oligonucleotide binds is underlined. CO GT sc1 and CO GT sc2 are control oligonucleotides.

Fig. 3 zeigt in einer schematischen Darstellung die transkribierte Region des ICAM-1-Gens, wobei Exons als Kästchen und Introns als Striche oder gestrichelte Linie dargestellt sind. Die 3'- und 5'- untranslatierten Abschnitte sind weiß, die translatierten Bereiche schraffiert dargestellt. Fig. 3 shows a schematic representation of the transcribed region of the ICAM-1 gene, wherein exons and introns are shown as dashes or broken line as boxes. The 3'- and 5'- untranslated sections are white, the translated areas are hatched.

Fig. 4 zeigt schematisch einen experimentellen Ansatz zum Nachweis eines an ICAM-1- Sequenzen bindenden Triplehelix-Oligonukleotides. Das Plasmid pRB55 (Fig. 4A) enthält die Triplehelix-ICAM-1-Zielsequenz in Nachbarschaft zu einer Eco NI Erkennungssequenz, die mit dem Triplehelix-Bindungsbereich überlappt. Durch Spaltung des Plasmids mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Eco NI ergeben sich in der Agarose-Gelelektrophorese Fragmente von 270 und 450 Basenpaaren Länge. Triplehelix-Bildung durch THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) überdeckt die Erkennungsstelle des Enzyms Eco NI teilweise und behindert dadurch die Aktivität des Enzyms. Hieraus resultiert ein größeres Fragment von 720 Basenpaaren Länge. Nach Reaktion des Plasmides mit dem Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 13ap (Fig. 4B) zeigt sich eine durch Triplehelixbildung inhibierte Eco NI Aktivität schon ab einem 3fachen molaren Überschuß von THO GT 13ap zur Zielsequenz und eine vollständige Hemmung ab einem 30fachen molaren Überschuß. Die Zugabe einer 300fachen Überschußmenge an Kontrolloligonukleotid CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35), das die gleiche Basenkomposition wie THO GT 13ap, jedoch in zufällig verteilter Reihenfolge enthält (scrambled control) aufweist, behinderten die Spaltung durch Eco NI nicht. Fig. 4 schematically illustrates an experimental approach for the detection of binding to ICAM-1 sequences triple helix oligonucleotide. Plasmid pRB55 ( Fig. 4A) contains the triplehelix ICAM-1 target sequence adjacent to an Eco NI recognition sequence that overlaps the triplehelix binding region. By cleaving the plasmid with the restriction enzymes Eco RI and Eco NI, fragments of 270 and 450 base pairs in length are obtained in agarose gel electrophoresis. Triplehelix formation by THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) partially covers the recognition site of the enzyme Eco NI and thereby hinders the activity of the enzyme. This results in a larger fragment of 720 base pairs in length. After reaction of the plasmid with the triplehelix oligonucleotide THO GT 13ap ( FIG. 4B), an Eco NI activity inhibited by triplehelix formation is evident even from a 3-fold molar excess of THO GT 13ap to the target sequence and complete inhibition from a 30-fold molar excess. The addition of a 300-fold excess amount of control oligonucleotide CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35), which has the same base composition as THO GT 13ap but contains in a randomly distributed order (scrambled control), did not hinder the cleavage by Eco NI.

Fig. 5 zeigt eine Darstellung der Ergebnisse einer durchflußzytometrischen Analyse von der epidermalen Stachelzellkrebs-Zellinie A431. Die durchgezogenen Linien bedeuten Färbungen mit einem FITC-markierten Anti-ICAM-1-Antikörper. Die gestrichelten Linien bedeuten Kontrollfärbungen mit einem isotypgleichen FITC-markierten Antikörper mit irrelevanter Antigenspezifität. Die Zellen wurden in einem Durchflußzytometer (FACScan II, Becton Dickinson, Heidelberg) mittels des CellQuest-Analyseprogramms (Becton Dickinson) untersucht. In Fig. 5A ist die geringe basale ICAM-1-Expression von A431-Zellen dargestellt. Fig. 5B zeigt die ICAM-1-Expression nach 18 h Inkubation mit dem ICAM-1-induzierenden Zytokin Interferon-gamma (500 U/ml). Fig. 5C zeigt Zellen, die wie in Fig. 5B mit Interferon­ gamma behandelt wurden, aber 3 h vorher das Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 13ap (SEQ ID No: 27) erhielten. Fig. 5D zeigt Zellen, bei denen statt THO GT 13ap (SEQ ID No: 27) das Kontroll-Oligonukleotid CO GT sc2 (SEQ ID No: 35) eingesetzt wurde. FIG. 5 shows the results of a flow cytometric analysis of the epidermal spiked cell cancer cell line A431. The solid lines indicate staining with a FITC-labeled anti-ICAM-1 antibody. The dashed lines indicate control staining with an isotype-identical FITC-labeled antibody with irrelevant antigen specificity. The cells were examined in a flow cytometer (FACScan II, Becton Dickinson, Heidelberg) using the CellQuest analysis program (Becton Dickinson). Figure 5A shows the low basal ICAM-1 expression of A431 cells. FIG. 5B shows the ICAM-1 expression by 18 h incubation with the ICAM-1 inducing cytokine interferon-gamma (500 U / ml). FIG. 5C shows cells that were treated with interferon gamma as in FIG. 5B, but received the triplehelix oligonucleotide THO GT 13ap (SEQ ID No: 27) 3 hours beforehand. Fig. 5D shows cells in which instead of THO GT 13ap: the control oligonucleotide CO GT SC2 (SEQ ID No: 35) was used (SEQ ID No 27).

Fig. 6A zeigt eine schematische Darstellung des Ablaufs der photochemische Modifikation. Nach UVA-Anregung des Psoralens (P im Kreis) kommt es zu einer Psoralen-DNA-Konjugation zunächst mit einem DNA-Strang (Photo-Monoaddukt) und anschließend mit dem zweiten Strang (Photo-Bisaddukt), woraus eine Vernetzung der Doppelhelix resultiert. THO bedeutet Triplehelix-Oligonukleotid. dig bedeutet Digoxygenin. Fig. 6B zeigt schematisch das Ergebnis einer denaturierenden 16%igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit den in Fig. 6A dargestellten DNA-Strängen. Fig. 6A shows a schematic representation of the course of the photochemical modification. After UVA excitation of the psoralens (P in a circle), psoralen-DNA conjugation occurs first with a DNA strand (photo monoadduct) and then with the second strand (photo bisadduct), which results in cross-linking of the double helix. THO means triplehelix oligonucleotide. dig means digoxygenin. FIG. 6B schematically shows the result of a denaturing 16% polyacrylamide gel electrophoresis with the DNA strands shown in FIG. 6A.

Fig. 7A zeigt schematisch das Plasmid pCM52. Es handelt sich um ein Expressionsplasmid (abgeleitet von pCAT Promoter, Promega), bei dem das bakterielle Reportergen Chloramphenicol-Acetyltransferase unter Kontrolle des viralen SV40-Promotors exprimiert wird. Zwischen SV40-Promotor und CAT-Reportergen wurde das in Fig. 2B dargestellte doppelsträngige Oligonukleotid (mit einem nach oben gerichteten Pfeil in Fig. 7A markiert), das die ICAM-1-Zielsequenz für das Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 17ap enthält, einkloniert. Fig. 7B zeigt schematisch die Ergebnisse eines CAT-ELISAs. Bei den angegebenen Zahlen handelt es sich um Mittelwerte und SEM aus 4 unabhängigen Experimenten mit Doppelbestimmungen. Fig. 7A shows schematically the plasmid pCM52. It is an expression plasmid (derived from pCAT promoter, Promega) in which the bacterial reporter gene chloramphenicol acetyltransferase is expressed under the control of the viral SV40 promoter. The SV40 promoter and CAT reporter gene were cloned into the double-stranded oligonucleotide shown in FIG. 2B (marked with an upward arrow in FIG. 7A), which contains the ICAM-1 target sequence for the triplehelix oligonucleotide THO GT 17ap. Figure 7B schematically shows the results of a CAT ELISA. The figures given are mean values and SEM from 4 independent experiments with double determinations.

Der hier verwendete Ausdruck "Modifikationen" bezeichnet die Veränderung der Internukleosid- Phosphodiesterbindung, der Basen, der Desoxyribose und/oder die Kopplung von Molekülresten an das 3'- und/oder 5'-Ende des Polydesoxyribonukleotids.The term "modifications" used here denotes the change in the internucleoside Phosphodiester bond, the bases, the deoxyribose and / or the coupling of molecular residues at the 3 'and / or 5' end of the polydeoxyribonucleotide.

Der hier verwendete Ausdruck "Triplehelix" bezeichnet eine DNA-Struktur, die durch Bindung eines einzelsträngigen Polydesoxyribonukleotids an einen doppelsträngigen genomischen DNA- Abschnitt gebildet wird. The term "triplehelix" as used herein denotes a DNA structure that is generated by binding a single-stranded polydesoxyribonucleotide to a double-stranded genomic DNA Section is formed.  

Der hier verwendete Ausdruck "Triplehelix-Oligonukleotid" bezeichnet ein Polydesoxyribonukleotid, das aufgrund seiner Nukleinsäuresequenz zur Triplehelixbildung am Purinstrang des doppelsträngigen genomischen DNA-Abschnitts in der Lage ist.The term "triplehelix oligonucleotide" used here denotes one Polydeoxyribonucleotide, which due to its nucleic acid sequence for the formation of triple helix on Purine strand of the double-stranded genomic DNA section is able.

Der hier verwendete Ausdruck "Nukleinsäuresequenz spezifisch für" bedeutet, daß ein Polydesoxyribonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mit Homopurin-Abschnitten der DNA-Sequenz des Zielgens, hier dem ICAM-1-Gen, oder des Promotorbereichs, identisch oder komplementär ist, wobei die transkribierte DNA-Sequenz die Introns und Exons umfaßt, und wobei die Nukleinsäuresequenz in paralleler oder antiparalleler Orientierung bezogen auf den Homopurin-Abschnitt vorliegt. Das Polydesoxyribonukleotid kann ferner eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die von der identischen oder komplementären Sequenz abweicht, wobei das Polydesoxyribonukleotid jedoch aufgrund seiner Nukleinsäuresequenz zur Triplehelixbildung am Purinstrang des doppelsträngigen genomischen DNA-Abschnitts in der Lage ist. Beispielhafte von der identischen oder komplementären Sequenz abweichende erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind in der nachfolgenden Beschreibung aufgeführt.The term "nucleic acid sequence specific for" as used herein means that a Polydeoxyribonucleotide has a nucleic acid sequence that is homopurin with sections the DNA sequence of the target gene, here the ICAM-1 gene, or the promoter region or is complementary, the transcribed DNA sequence comprising the introns and exons, and wherein the nucleic acid sequence is in parallel or anti-parallel orientation with respect to the homopurine section is present. The polydeoxyribonucleotide can also be a Have nucleic acid sequence that is of the identical or complementary sequence deviates, but the polydesoxyribonucleotide due to its nucleic acid sequence Triple helix formation on the purine strand of the double-stranded genomic DNA section in the Location is. Exemplary ones that differ from the identical or complementary sequence Nucleic acid sequences according to the invention are listed in the description below.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Polydesoxyribonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz spezifisch für den transkribierten DNA-Abschnitt oder dem Promotorbereich des ICAM-1-Gens. Das Polydesoxyribonukleotid lagert sich mittels Van- Hoogsteen-Bindungen als dritter DNA-Strang an doppelsträngige genomische ICAM-1- Sequenzen an. Polydesoxyribonukleotide, im folgenden auch Triplehelix-Oligonukleotide genannt, haben eine bevorzugte Länge von 10 bis 35, vorzugsweise 12 bis 30, besonders bevorzugt 15 bis 25 Oligonukleotiden, mit einer Nukleinsäuresequenz, die eine spezifische Bindung an genomische Homopurin-Zielsequenzen erlaubt. Bevorzugte Polydesoxyribonukleotide der vorliegenden Erfindung sind in den SEQ ID NO: 1 bis 20 aufgeführt. Besonders bevorzugt sind Polydesoxyribonukleotide gemäß SEQ ID NO: 21 bis 34 und 37. Für die Gestaltung der ICAM-1-Triplehelix-Oligonukleotide wurden die bekannten Bereiche der ICAM-1-Gensequenz [2, 19, 20] nach Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen durchmustert.One aspect of the present invention relates to polydeoxyribonucleotides with a Nucleic acid sequence specific for the transcribed DNA section or the Promoter area of the ICAM-1 gene. The polydeoxyribonucleotide is stored by means of van Hoogsteen bindings as third strand of DNA to double-stranded genomic ICAM-1 Sequences. Polydeoxyribonucleotides, hereinafter also Triplehelix oligonucleotides have a preferred length of 10 to 35, preferably 12 to 30, particularly preferably 15 to 25 oligonucleotides, with a nucleic acid sequence that has a specific Binding to genomic homopurin target sequences allowed. Preferred Polydeoxyribonucleotides of the present invention are in SEQ ID NO: 1 to 20 listed. Polydeoxyribonucleotides according to SEQ ID NO: 21 to 34 are particularly preferred and 37. For the design of the ICAM-1 triple helix oligonucleotides, the known ones Areas of the ICAM-1 gene sequence [2, 19, 20] after homopurine-homopyrimidine sequences screened.

Tabelle 1 zeigt im ICAM-1-Gen identifizierte Zielsequenzen, die für eine Triplehelix-Bildung geeignet sind. Die dargestellten Sequenzen entsprechen der Basenkomposition des kodierenden Stranges der genomischen DNA in 5'- nach 3'-Orientierung, wie sie in [21] und [22] angeben sind. Der kodierende Strang enthält entweder die für das Triplehelix-Oligonukleotid als Bindungspartner fungierende Homopurin-Sequenz oder, falls sich die Homopurin-Zielsequenz im nichtkodierenden DNA-Strang befindet, die komplementäre Homopyrimidin-Sequenz. Die Triplehelix-Bildung kann sowohl an den in Tabelle 1 angegebenen Positionen erfolgen, als auch an weiteren Sequenzen im ICAM-1-Promotor oder im transkribierten Bereich des ICAM-1-Gens. Die Positionen zweier Triplehelix-Zielsequenzen innerhalb des ICAM-1-Gens sind in Fig. 2 und 3 dargestellt.Table 1 shows target sequences identified in the ICAM-1 gene which are suitable for triplehelix formation. The sequences shown correspond to the base composition of the coding strand of the genomic DNA in 5 'to 3' orientation, as specified in [21] and [22]. The coding strand contains either the homopurin sequence which acts as a binding partner for the triplehelix oligonucleotide or, if the homopurin target sequence is in the non-coding DNA strand, the complementary homopyrimidine sequence. The triple helix formation can take place both at the positions indicated in Table 1 and at further sequences in the ICAM-1 promoter or in the transcribed region of the ICAM-1 gene. The positions of two triplehelix target sequences within the ICAM-1 gene are shown in FIGS. 2 and 3.

Tabelle 1 Table 1

Die Sequenz eines an eine Zielsequenz bindenden Triplehelix-Oligonukleotids ist nicht beliebig, sondern folgt Gesetzmäßigkeiten, die im folgenden näher erläutert sind und das Triplehelix- Oligonukleotid spezifisch für die transkribierte DNA-Sequenz oder den Promotorbereich des ICAM-1-Gens machen. Die Basen des Triplehelix-Oligonukleotides binden spezifisch über zwei Wasserstoffbrücken (Van Hoogsteen Wechselwirkung) an die Purinbasen Adenin oder Guanin eines der beiden DNA-Doppelhelix-Stränge. Abhängig von der Konformation der Triplehelix- Basen kann die Bindung auf zwei Arten erfolgen, die als Hoogsteen- oder reverser Hoogsteen- Modus bezeichnet werden. Bindungen im Hoogsteen-Modus resultieren in einer parallelen (5'- 3'), reverse-Hoogsteen-Bindungen in einer antiparallelen (3'-5') Anlagerung des Triplehelix- Oligonukleotides an den (5'-3')-Purinstrang der Doppelhelix [18].The sequence of a triple helix oligonucleotide binding to a target sequence is not arbitrary, but follows regularities, which are explained in more detail below and which  Oligonucleotide specific for the transcribed DNA sequence or the promoter region of the Make ICAM-1 gene. The bases of the triplehelix oligonucleotide bind specifically via two Hydrogen bonds (Van Hoogsteen interaction) to the purine bases adenine or guanine one of the two DNA double helix strands. Depending on the conformation of the Triplehelix Bases can be bound in two ways, as hoogsteen or reverse hoogsteen Mode. Bindings in Hoogsteen mode result in a parallel (5'- 3 '), reverse hoogsteen bonds in an antiparallel (3'-5') attachment of the triple helix Oligonucleotides on the (5'-3 ') purine strand of the double helix [18].

Im einzelnen sind folgende Bindungen von Basen des Triplehelix-Oligonukleotides an Purinbasen der Doppelhelix möglich. An Guanin im Zielstrang der Dopplehelix können sich folgende Basen des Triplehelix-Oligonukleotides anlagern: a) Guanin im Hoogsteen und reverse Hoogsteen - Modus, b) Cytosin im Hoogsteen und reversen Hoogsteen - Modus. An Adenin im Zielstrang der Dopplehelix können sich folgende Basen des Triplehelix-Oligonukleotides anlagern: a) Adenin nur im reversen Hoogsteen - Modus, b) Thymin im Hoogsteen und reversen Hoogsteen - Modus, c) Uracil im Hoogsteen und reversen Hoogsteen - Modus, d) Inosin im Hoogsteen und reversen Hoogsteen - Modus.The following are the individual bonds of bases of the triplehelix oligonucleotide Purine bases of the double helix possible. Can guanine in the finish line of the double lixix add the following bases of the triplehelix oligonucleotide: a) guanine in hoogsteen and reverse Hoogsteen mode, b) cytosine in Hoogsteen and reverse Hoogsteen mode. To Adenine in The following bases of the triplehelix oligonucleotide can be the target strand of the double helix attach: a) adenine only in reverse Hoogsteen mode, b) thymine in Hoogsteen and reverse Hoogsteen mode, c) uracil in Hoogsteen and reverse Hoogsteen mode, d) inosine in Hoogsteen and reverse hoogsteen mode.

Für eine stabile Anlagerung des Triplehelix-Oligonukleotides sind zusätzlich folgende Aspekte zu berücksichtigen:
For a stable attachment of the triplehelix oligonucleotide, the following aspects must also be taken into account:

  • - Triplehelix-Oligonukleotide, die Adenin enthalten, können sich nur antiparallel anlagern, da Adenin nur in reverser Hoogsteen-Orientierung binden kann. Alle anderen Triplehelix- Oligonukleotide können sich sowohl parallel als auch antiparallel an den Purinstrang der Doppelhelix anlagern.- Triplehelix oligonucleotides that contain adenine can only attach antiparallel because Can only bind adenine in reverse Hoogsteen orientation. All other triplehelix Oligonucleotides can attach themselves to the purine strand of both parallel and antiparallel Attach double helix.
  • - Aus sterischen Gründen sind Triplehelix-Oligonukleotide, die ausschließlich aus Purinen oder auschließlich Pyrimidinen bestehen, besonders geeignet.- For steric reasons, triplehelix oligonucleotides are made exclusively from purines or consist exclusively of pyrimidines, particularly suitable.
  • - Alle Anlagerungen von Basen eines Triplehelix-Oligonukleotides an ihre Homopurin- Zielbasen sollen vorzugsweise in der gleichen Orientierung, also entweder parallel oder antiparallel erfolgen. Alternativ kann das Triplehelix-Oligonukleotid auch abschnittsweise so gestaltet werden, daß ein Sequenzabschnitt parallel, ein anderer antiparallel bindet.- All additions of bases of a triplehelix oligonucleotide to their homopurine Target bases should preferably be in the same orientation, i.e. either parallel or antiparallel. Alternatively, the triple helix oligonucleotide can also be used in sections be designed so that a sequence section binds parallel, another antiparallel.
  • - Die Anlagerung von Cytosin an Guanin erfolgt nur im protonierten Zustand und damit im sauren Milieu. Deshalb ist es für die Oligonukleotidkonstruktion von Vorteil, pH- unabhängige Modifikationen von Cytosin (z. B. 5-Methyl-Cytosin) zu wählen oder aber Cytosin durch Guanin zu ersetzen, um eine Bindung bei physiologischem pH-Wert zu ermöglichen.- The addition of cytosine to guanine takes place only in the protonated state and thus in the acidic environment. It is therefore advantageous for oligonucleotide construction to to choose independent modifications of cytosine (e.g. 5-methyl-cytosine) or  Replace cytosine with guanine to bind at physiological pH enable.
  • - Die Anlagerung von guaninhaltigen Triplehelix-Oligonukleotiden kann durch monovalente Kationen (zum Beispiel Kalium) behindert werden. Durch Modifikationen des Triplehelix- Oligonukleotides (zum Beispiel Ersatz von Adenin durch 7-Deazaxanthin) kann die Bindung verbessert werden.- The addition of guanine-containing Triplehelix oligonucleotides can by monovalent Cations (for example potassium). By modifications of the Triplehelix Oligonucleotides (for example replacing adenine with 7-deazaxanthin) can bind be improved.
  • - Triplehelix-Oligonukleotide können auch so aufgebaut sein, daß es teils den einen, teils den anderen DNA-Strang der Doppelhelix bindet. Vorraussetzung dafür ist, daß auf beiden DNA-Strängen der geschlossenen Doppelhelix Homopurin-Homopyrimidinabschnitte in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander lokalisiert sind. Beispiele für solche Sequenzen im ICAM-1-Gen sind in Tabelle 1 aufgeführt (Seq ID No: 1, 2, 7, 15, 16, 18, 19 und 20). Diese an wechselnden Strängen der Doppelhelix bindenden Triplehelix-Oligonukleotide werden auch "alternate"- oder "switch"-Triplehelix-Oligonukleotide genannt.- Triplehelix oligonucleotides can also be constructed in such a way that some of them, some of them another strand of DNA that binds the double helix. The prerequisite for this is that on both DNA strands of the closed double helix homopurin homopyrimidine sections in in the immediate vicinity of each other. Examples of such sequences in ICAM-1 genes are listed in Table 1 (Seq ID No: 1, 2, 7, 15, 16, 18, 19 and 20). This on alternating strands of the double helix binding triple helix oligonucleotides also called "alternate" or "switch" triple helix oligonucleotides.
  • - Einzelne für eine Triplehelixbindung ungeeignete Basen im Homopurinstrang (Mismatch- Basen) der Doppelhelix können mit geeigneten Modifikationen im Triplehelix- Oligonukleotid (zum Beispiel Ersatz von Basen durch Akridine) überbrückt werden. Beispiele für solche "Mismatch"-Sequenzen im ICAM-1-Gen sind in Tabelle 1 aufgeführt (Seq ID No: 3, 6, 9, 11, 12 und 14).- Individual bases in the homopurine strand which are unsuitable for a triplehelix bond (mismatch) Bases) of the double helix can be modified with suitable modifications in the triple helix. Oligonucleotide (e.g. replacement of bases with acridines) can be bridged. Examples of such "mismatch" sequences in the ICAM-1 gene are listed in Table 1 (Seq ID No: 3, 6, 9, 11, 12 and 14).

In Fig. 1 ist beispielhaft die Gestaltung geeigneter Triplehelix-Oligonukleotide für eine genomische ICAM-1-Zielsequenz (Seq ID NO: 13 aus Tabelle 1) dargestellt. Die ICAM-1- Zielsequenz ist ein Homopurin-Abschnitt im nichtkodierenden Strang. Es kommen sowohl Homopurin- als auch Homopyrimidin-Ausgestaltungen des Triplehelix-Oligonukleotides in Frage.In Fig. 1, the design of appropriate oligonucleotides for triple helix is a genomic example ICAM-1 target sequence (SEQ ID NO: 1 in Table 13) is shown. The ICAM-1 target sequence is a homopurin segment in the non-coding strand. Both homopurine and homopyrimidine configurations of the triplehelix oligonucleotide are possible.

Eine Möglichkeit der Gestaltung ist der Aufbau eines aus Guanin und Adenin bestehenden Homopurin-Triplehelix-Oligonukleotides (Seq ID NO: 21), das wegen der oben genannten beschränkten Anlagerungsmöglichkeiten für Adenin nur in antiparalleler Orientierung zum Zielstrang gestaltet werden kann. Mögliche Modifikationen ergeben sich aus dem Ersatz von Adenin durch die Basen Uracil, Inosin oder Thymin, wobei sowohl parallele als auch antiparallele Orientierungen für Uracil (Seq ID NO: 22 und Seq ID NO: 23), Inosin (Seq ID NO: 24 und Seq ID NO: 25) und Thymin (Seq ID NO: 26 und Seq ID NO: 27) möglich sind. One way of designing is to build a guanine and adenine Homopurin triplehelix oligonucleotides (Seq ID NO: 21), because of the above limited attachment possibilities for adenine only in antiparallel orientation to Target strand can be designed. Possible modifications result from the replacement of Adenine through the bases uracil, inosine or thymine, being both parallel and antiparallel orientations for uracil (Seq ID NO: 22 and Seq ID NO: 23), inosine (Seq ID NO: 24 and Seq ID NO: 25) and thymine (Seq ID NO: 26 and Seq ID NO: 27) are possible.  

Eine weitere Gestaltungsmöglichkeit ist der Aufbau von aus Cytosin und Thymin bestehenden Homopyrimidin-Triplehelix-Oligonukleotiden, die in paralleler (Seq ID NO: 28) oder antiparalleler (Seq ID NO: 29) Orientierung gestaltet werden können. Mögliche Modifikationen ergeben sich aus dem Ersatz von Thymin durch die Basen Uracil, Inosin oder Adenin, wobei sowohl parallele als auch antiparallele Orientierungen für Uracil (Seq ID NO: 30 und Seq ID NO: 31) und Inosin (Seq ID NO: 32 und Seq ID NO: 33), aber lediglich antiparallele Orientierungen bei Einsatz von Adenin (Seq ID NO: 34) möglich sind. Die Bindungsfähigkeit der Triplehelix-Oligonukleotid-Varianten an ihren ICAM-1-Zielabschnitt kann durch Mobility-Shift- Assays in nichtdenaturierenden Polyacrylamidgelen überprüft werden.Another design option is the construction of cytosine and thymine Homopyrimidine triplehelix oligonucleotides that are in parallel (Seq ID NO: 28) or antiparallel (Seq ID NO: 29) orientation can be designed. Possible modifications result from the replacement of thymine by the bases uracil, inosine or adenine, where both parallel and anti-parallel orientations for uracil (Seq ID NO: 30 and Seq ID NO: 31) and inosine (Seq ID NO: 32 and Seq ID NO: 33), but only antiparallel Orientations are possible when using adenine (Seq ID NO: 34). The binding ability of the Triplehelix oligonucleotide variants at their ICAM-1 target section can be obtained by mobility shift Assays in non-denaturing polyacrylamide gels can be checked.

Besonders betrifft die Erfindung Polydesoxyribonukleotide, die mindestens eine modifizierte Internukleosid-Phosphodiesterbindung umfassen. Oligonukleotide können zur Beeinflussung der Bindungsaffinität, zur Steigerung der biologischen Effektivität und/oder gegen Nucleaseabbau strukturell modifiziert sein. Die Modifikationen der Triplehelix-Oligonukleotide umfassen die Modifikation mindestens einer Phosphodiesterbindung durch eine Phosphotriester-, Methylphosphonat-, Phosphoamidat-, R,S-Methoxyethylphosphoamidat-, Phosphorothioat-, Formacetal-, Thioformacetal-, kationische Guaninderivat-Bindung (DNG-Oligomere) oder die Modifikation des Oligonukleotid-Rückgrates durch Polyamide (PNAs).In particular, the invention relates to polydesoxyribonucleotides which have at least one modified Internucleoside-phosphodiester linkage include. Oligonucleotides can be used to influence the Binding affinity, to increase biological effectiveness and / or against nuclease degradation be structurally modified. The modifications of the Triplehelix oligonucleotides include the Modification of at least one phosphodiester bond by a phosphotriester, Methylphosphonate, phosphoamidate, R, S-methoxyethylphosphoamidate, phosphorothioate, Formacetal, thioformacetal, cationic guanine derivative binding (DNG oligomers) or die Modification of the oligonucleotide backbone by polyamides (PNAs).

Weitere bevorzugte Ausführungsformen betreffen Polydesoxyribonukleotide mit Modifikationen des Desoxyriboserestes durch verschiedene Anomere der Desoxyribose (insbesondere deren α- Anomere), Ersatz des Desoxyriboserestes durch andere Zucker wie Ribose oder deren Derivate, insbesondere 2'-O-Methylribose.Further preferred embodiments relate to polydesoxyribonucleotides with modifications of the deoxyribose residue by various anomers of deoxyribose (especially their α- Anomers), replacement of the deoxyribose residue by other sugars such as ribose or their derivatives, especially 2'-O-methylribose.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen betreffen Polydesoxyribonukleotide mit Modifikationen mindestens einer Base beziehungsweise deren Ersatz z. B. durch N6-Methoxy-2,6-diaminopurin, N4-Oxycytosin, Azolderivate wie Imidazol, 1,2,4-Triazol und Tetrazol, 7-Deazaxanthin, 6- Thioguanin, 2-Amino-5-(2'-desoxy-beta-D-ribofuranosyl)pyridin und dessen α-Anomer, 6- Oxocytosin, N7-glycosyliertes Guanin, N7-glycosyliertes, 8-aza, 9-deazamethylguanin, 5- Methylcytosin, N6-Methyl-8-oxo-adenin, 8-Oxoadenin, N4-(3-Acetamidopropyl)cytidin, 5- Propynylcytosin und 5-Propynylthymin.Further preferred embodiments relate to polydesoxyribonucleotides with modifications at least one base or its replacement z. B. by N6-methoxy-2,6-diaminopurine, N4-oxycytosine, azole derivatives such as imidazole, 1,2,4-triazole and tetrazole, 7-deazaxanthin, 6- Thioguanine, 2-amino-5- (2'-deoxy-beta-D-ribofuranosyl) pyridine and its α-anomer, 6- Oxocytosine, N7-glycosylated guanine, N7-glycosylated, 8-aza, 9-deazamethylguanine, 5- Methylcytosine, N6-methyl-8-oxo-adenine, 8-oxoadenine, N4- (3-acetamidopropyl) cytidine, 5- Propynylcytosine and 5-propynylthymine.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polydesoxyribonukleotide mit einer Modifikation eines oder beider Triplehelix-Oligonukleotidenden durch Kopplung über geeignete Kohlenhydratbrücken (z. B. Hexan-Derivate) an z. B. Psoralene wie 8-Methoxypsoralen oder Trimethoxypsoralen, Akridinderivate wie 9-Amino-6-chloro-2-methoxyAkridin, Coralyn-, Ethidium-, Eosinderivate, Chelatbildner wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) oder DPTA (Diethylentriaminopentaessigsäure), Orthophenanthrolinderivate, Pyridocarbazol, Proflavin, Azidophenacylreste, Ellipticin, Chlorethylaminderivate, Daunorubicinderivate, Methylpyrroporphyrin und Cholesterol.The present invention further relates to polydesoxyribonucleotides with a modification of a  or both triplehelix oligonucleotide ends by coupling via suitable Carbohydrate bridges (e.g. hexane derivatives) on e.g. B. psoralens such as 8-methoxypsoralen or Trimethoxypsoralen, acridine derivatives such as 9-amino-6-chloro-2-methoxy-acridine, Coralyn-, Ethidium, eosin derivatives, chelating agents such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or DPTA (Diethylene triaminopentaacetic acid), orthophenanthroline derivatives, pyridocarbazole, proflavin, Azidophenacyl residues, ellipticin, chloroethylamine derivatives, daunorubicin derivatives, Methylpyrroporphyrin and cholesterol.

Die erfindungsgemäßen Polydesoxyribonukleotide können eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Modifikationen umfassen. Beispiele für modifizierte Triplehelix-Oligonukleotide sind:
The polydesoxyribonucleotides according to the invention can comprise one or more of the modifications listed above. Examples of modified triplehelix oligonucleotides are:

  • - Antiparallel zum Purinstrang der Doppelhelix bindende, guaninhaltige Triplehelix- Oligonukleotide deren Nicht-Guanin-Basen (Adenin, Thymin, Uracil oder Inosin) durch 7- Deazaxanthin ersetzt werden, um die Triplehelixbildung in Anwesenheit von Kalium zu verbessern.- Antiparallel to the purine strand of the double helix binding, guanine-containing triple helix - Oligonucleotides whose non-guanine bases (adenine, thymine, uracil or inosine) by 7- Deazaxanthin can be replaced to increase the triple helix formation in the presence of potassium improve.
  • - Teilweiser oder vollständiger Ersatz von Guanin durch 6-Thioguanin in guaninreichen Abschnitten von Triplehelix-Oligonukleotiden, um Ausbildung von die Triplehelixbildung störenden Sequenzmotiven (z. B. G-Quartett) im Triplehelix-Oligonukleotid zu vermeiden.- Partial or complete replacement of guanine with 6-thioguanine in guanine-rich Sections of triple helix oligonucleotides to form the triple helix formation to avoid disturbing sequence motifs (e.g. G-quartet) in the triplehelix oligonucleotide.
  • - Verwendung von Azolderivaten wie Imidazol, 1,2,4-Triazol und Tetrazol oder von Akridinderivaten, um Mismatchbasen (Pyrimidinbasen) im Purinstrang der Doppelhelix zu überbrücken.- Use of azole derivatives such as imidazole, 1,2,4-triazole and tetrazole or of Acridine derivatives to add mismatch bases (pyrimidine bases) in the purine strand of the double helix bridge.
  • - Verwendung von 5-Methylcytosin statt Cytosin, um die Bindung von pyrimidinhaltigen Triplehelix-Oligonukleotiden bei neutralem pH-Wert zu verbessern.- Use of 5-methylcytosine instead of cytosine to bind pyrimidine-containing To improve triplehelix oligonucleotides at neutral pH.
  • - Teilweiser oder vollständiger Ersatz der Phosphodiesterbindung im Oligonukleotidrückgrat durch Phosphorothioat-, Formacetal- oder Thioformacetalbindung, um Stabilität und Bindungsfähigkeit des Triplehelix-Oligonukleotides zu verbessern.- Partial or complete replacement of the phosphodiester bond in the oligonucleotide backbone by phosphorothioate, formacetal or thioformacetal linkage for stability and To improve the binding ability of the triplehelix oligonucleotide.
  • - Teilweiser oder vollständiger Ersatz der Phosphodiesterbindungen im Oligonukleotidrückgrat durch Phosphoamidat- oder R,S-Methoxyethylphosphoamidat-bindungen, um die Bindung von parallel zum Purinstrang der Doppelhelix angelagerten Triplehelix-Oligonukleotiden zu verbessern.- Partial or complete replacement of the phosphodiester bonds in the oligonucleotide backbone by phosphoamidate or R, S-methoxyethylphosphoamidate bonds to the bond of triple helix oligonucleotides attached parallel to the purine strand of the double helix improve.
  • - Teilweiser oder vollständiger Ersatz des Desoxyribosebestandteils im Triplehelix- Oligonukleotid durch dessen α-Anomere oder durch 2'-O-Methylribose, um die Stabilität und Bindungsfähigkeit des Triplehelix-Oligonukleotides zu verbessern. - Partial or complete replacement of the deoxyribose component in the Triplehelix Oligonucleotide through its α-anomer or through 2'-O-methylribose for stability and to improve the binding ability of the triplehelix oligonucleotide.  
  • - Teilweise oder vollständige Verwendung von 5-Propynylcytosin statt Cytosin oder von 5- Propynylthymin statt Thymin, um die Bindung von pyrimidinhaltigen Triplehelix- Oligonukleotiden, die sich parallel zum Purinstrang der Doppelhelix anlagern, bei neutralem pH-Wert zu verbessern.- Partial or complete use of 5-propynylcytosine instead of cytosine or of 5- Propynylthymine instead of thymine to bind pyrimidine-containing triplehelix Oligonucleotides that attach parallel to the purine strand of the double helix with neutral improve pH.
  • - Teilweiser oder vollständiger Ersatz von Cytosin durch Guanin, 6-Thioguanin, 8-Oxoadenin oder N6-methyl-8-oxo-adenin in cytosinreichen Abschnitten des Triplehelix- Oligonukleotides, um die Bindung von pyrimidinhaltigen Triplehelix-Oligonukleotiden bei neutralem pH-Wert zu verbessern.- Partial or complete replacement of cytosine with guanine, 6-thioguanine, 8-oxoadenine or N6-methyl-8-oxo-adenine in cytosine-rich sections of the triplehelix Oligonucleotides to help bind pyrimidine-containing triplehelix oligonucleotides improve neutral pH.
  • - Koppelung von interkalierenden Molekülen an das 3'- oder 5'-Ende von Triplehelix- Oligonukleotiden, die dadurch Triplehelices stabilisieren. Interkalierende Moleküle sind z. B. Psoralene wie 8-Methoxypsoralen oder Trimethylpsoralen, Akridinderivate wie 9-Amino-6- chloro-2-methoxyAkridin, Coralyn-, Ethidium-, Eosinderivate, Chelatbildner wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) oder DPTA(Diethylentriaminopentaessigsäure), Orthophenanthrolinderivate, Pyridocarbazole, Proflavine, Azidophenacylreste, Ellipticine, Chlorethylaminderivate, Daunorubicinderivate und Methylpyrroporphyrine.Coupling of intercalating molecules to the 3 'or 5' end of triplehelix Oligonucleotides, which thereby stabilize triple helices. Intercalating molecules are e.g. B. Psoralens such as 8-methoxypsoralen or trimethylpsoralen, acridine derivatives such as 9-amino-6- chloro-2-methoxy acridine, coralyn, ethidium, eosin derivatives, chelating agents such as EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) or DPTA (diethylenetriamineopentaacetic acid), Orthophenanthroline derivatives, pyridocarbazoles, proflavines, azidophenacyl residues, ellipticins, Chloroethylamine derivatives, daunorubicin derivatives and methylpyrroporphyrins.
  • - Kopplung von Molekülen an das 3'-Ende, die ein Triplehelix-Oligonukleotid gegen den Abbau durch intrazelluläre Exonukleasen schützen z. B. Triethylenglykol oder Propanolamin.- Coupling of molecules at the 3'-end, which are a triple helix oligonucleotide against the Protect degradation by intracellular exonucleases z. B. triethylene glycol or propanolamine.
  • - Kopplung von Molekülen, die die Aufnahme des Triplehelix-Oligonukleotides in die Zelle verbessern z. B. von Cholesterol.- Coupling of molecules that take up the triplehelix oligonucleotide into the cell improve z. B. of cholesterol.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polydesoxyribonukleotide als therapeutisches Mittel. Ein Vorteil der Hemmung der ICAM-1- Genexpression durch Triplehelix-Oligonukleotide gegenüber der Verwendung von Antisense- Oligonukleotiden ist die nachhaltigere Wirkung, die durch Van-Hoogsteen-Bindungen bewirkte direkte Anlagerungen am Gen in der genomischen DNA bewirkt wird. Bei Antisense- Oligonukleotiden erfolgt über Watson-Crick-Wechselwirkungen lediglich eine Interferenz mit bereits abgelesener Geninformation (mRNA), eine gesteigerte Transkription kann den Hemmeffekt jedoch kompensieren. Beim Triplehelix-Ansatz ist eine solche kompensatorische Transkriptionssteigerung ausgeschlossen.Another aspect of the present invention relates to the use of the invention Polydeoxyribonucleotides as a therapeutic agent. An advantage of inhibiting ICAM-1 Gene expression by triplehelix oligonucleotides compared to the use of antisense Oligonucleotides are the more sustainable effect that Van Hoogsteen bonds have direct attachment to the gene in the genomic DNA is effected. With antisense Oligonucleotides only interfere with Watson-Crick interactions already read gene information (mRNA), an increased transcription can However, compensate for the inhibiting effect. With the Triplehelix approach, this is compensatory Increased transcription excluded.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Polydesoxyribonukleotide zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Therapie oder Prophylaxe von ICAM-1-assoziierten Erkrankungen z. B. von Psoriasis, Neurodermitis, allergischem Asthma, Morbus Crohn, Autoimmunerkrankungen oder Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen mittels Inhibition der ICAM-1 Transkription.The present invention further relates to the use of the invention Polydeoxyribonucleotides for the production of a therapeutic agent for therapy or Prophylaxis of ICAM-1-associated diseases e.g. B. of psoriasis, neurodermatitis,  allergic asthma, Crohn's disease, autoimmune diseases or rejection after organ transplantation by inhibition of ICAM-1 transcription.

Mit den erfindungsgemäßen Polydesoxyribonukleotiden kann über die Hemmung der ICAM-1- Transkription eine Entzündungshemmung erzielt werden, z. B. zur Behandlung oder Prophylaxe von zahlreichen die Haut betreffenden und inneren entzündlichen Erkrankungen. Hierzu zählen unter anderem die Hauterkrankungen Psoriasis (etwa 2% der Bevölkerung betroffen) und Neurodermitis (bis zu 10% der Bevölkerung), aber auch zahlreiche andere Erkrankungen wie das allergische Asthma, entzündliche Darmerkrankungen (Morbus Crohn), Autoimmunerkrankungen oder Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen.With the polydeoxyribonucleotides according to the invention, the inhibition of ICAM-1 Anti-inflammatory transcription can be achieved, e.g. B. for treatment or prophylaxis of numerous skin-related and internal inflammatory diseases. Which includes among others the skin diseases psoriasis (about 2% of the population affected) and Neurodermatitis (up to 10% of the population), but also numerous other diseases like that allergic asthma, inflammatory bowel diseases (Crohn's disease), autoimmune diseases or rejection after organ transplants.

Sequenzspezifische Triplehelix-Oligonukleotide werden in geeigneter Konzentration (10 nM bis 5 µM, vorzugsweise 500 nM bis 5 µM, besonders bevorzugt 1 µM bis 3 µM) unter Verwendung aktivierter Dendrimere (SuperfectTM, Qiagen, Hilden), alternativ unter Verwendung liposomaler Zubereitungen (z. B. LipofectinTM oder LipofectaminTM, jeweils Gibco BRL, Karlsruhe; DOTAP oder DOSPER, jeweils Roche, Mannheim) oder nichtliposomaler Lipidzubereitungen (FuGENETM, Roche, Mannheim), ferner polymerer Nanopartikel, z. B. Polyalkylzyanoakrylate Calciumphosphat-Präzipitation und Elektroporation in Zellen eingebracht. Diese Konzentrationen und Überführungsverfahren beziehen sich auf Zellkulturen. Für die pharmazeutischen Präparationen werden entsprechende Konzentrationen an Triplehelix- Oligonukleotiden, die der Fachmann leicht und ohne großen experimentellen Aufwand festlegen kann, eingesetzt. Die Triplehelix-Oligonukleotide können in verschiedene pharmazeutische Präparationen eingearbeitet werden, unter anderem, aber nicht ausschließlich in injizierbare oder oral applizierbare Lösungen, Salben, Lotionen oder Tabletten. Eine beispielhaft bevorzugte Konzentration eines Triplehelix-Oligonukleotids in injizierbaren Lösungen beträgt 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt 1 bis 15 mg/kg Körpergewicht, insbesondere bevorzugt 5 bis 10 mg/kg Körpergewicht. Therapeutisch geeignete Zellen sind z. B. menschliche epidermale Keratinozyten, Bronchial- und Darmepithelien.Sequence-specific triplehelix oligonucleotides are used in a suitable concentration (10 nM to 5 µM, preferably 500 nM to 5 µM, particularly preferably 1 µM to 3 µM) using activated dendrimers (Superfect TM , Qiagen, Hilden), alternatively using liposomal preparations (e.g. B. Lipofectin TM or Lipofectamin TM , each Gibco BRL, Karlsruhe; DOTAP or DOSPER, each Roche, Mannheim) or non-liposomal lipid preparations (FuGENE TM , Roche, Mannheim), furthermore polymeric nanoparticles, e.g. B. Polyalkylzyanoakrylate calcium phosphate precipitation and electroporation introduced into cells. These concentrations and transfer procedures relate to cell cultures. Corresponding concentrations of triplehelix oligonucleotides, which the person skilled in the art can determine easily and without great experimental effort, are used for the pharmaceutical preparations. The Triplehelix oligonucleotides can be incorporated into various pharmaceutical preparations, including but not limited to injectable or oral solutions, ointments, lotions or tablets. An exemplary preferred concentration of a triplehelix oligonucleotide in injectable solutions is 1 to 20 mg / kg body weight, particularly preferably 1 to 15 mg / kg body weight, particularly preferably 5 to 10 mg / kg body weight. Therapeutically suitable cells are e.g. B. human epidermal keratinocytes, bronchial and intestinal epithelia.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß durch den Einsatz von Psoralen und UVA- Aktivierung Triplehelix-Oligonukleotide effektiver und dauerhafter an ihre Zielabschnitte im ICAM-1-Gen angelagert werden können. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit einer lichtgesteuerten sequenzspezifischen Genabschaltung, die auch im Rahmen einer Lichtbehandlung zur Heilung entzündlicher und anderer Hauterkrankungen eingesetzt werden könnte. Die ausgewählten Triplehelix-Oligonukleotide können mit 3-Methoxypsoralen (MOP) (Firma Oncor Appligene), aber potentiell auch mit anderen Psoralenen wie 8-MOP oder Tri- Methoxypsoralen konjugiert werden [17]. Die Aktivierung durch UVA könnte mit einer UVA- Bestrahlungseinrichtung (z. B. PUVA 800 der Firma Waldmann, Villingen-Schwenningen) erfolgen, bei der die mit der kovalenten Psoralen-DNA-Verbindung interferierende UVB- Strahlung durch Glasplatten abgeschirmt wird.Another aspect of the invention is that the use of psoralen and UVA Activation of triplehelix oligonucleotides more effectively and more permanently to their target sections in the ICAM-1 gene can be attached. This gives the possibility of one light-controlled sequence-specific gene shutdown, which is also part of a  Light treatment can be used to heal inflammatory and other skin diseases could. The selected triplehelix oligonucleotides can be treated with 3-methoxypsoralen (MOP) (Oncor Appligene), but potentially also with other psoralens such as 8-MOP or Tri Methoxypsoralen be conjugated [17]. Activation by UVA could be Irradiation facility (e.g. PUVA 800 from Waldmann, Villingen-Schwenningen) in which the UVB interfering with the covalent psoralen-DNA connection Radiation is shielded by glass plates.

Triplehelix-Oligonukleotide können am 5'- oder 3'-Ende mit Psoralenmolekülen modifiziert werden. Psoralene lagern sich in die DNA-Doppelhelix ein. Nach Absorption von Photonen im UVA-Bereich entstehen kovalente Psoralen-DNA-Verbindungen über 3,4- oder 4',5'- Cyclobutan-Addition der Psoralene an Pyrimidinbasen in der DNA-Doppelhelix. Die photochemische Reaktion führt zunächst zu einer kovalenten Verbindung mit einer Pyrimidinbase eines DNA-Strangs (Photo-Monoaddukt). Die Absorption eines zweiten Photons durch das Psoralen ermöglicht anschließend die kovalente Verbindung mit einer Pyrimidinbase des zweiten DNA-Strangs (Photo-Bisaddukt), woraus eine Vernetzung der Doppelhelix resultiert. Für die Photo-Bisaddukt-Bildung ist es förderlich, wenn in der Doppelhelix in Nachbarschaft zum Psoralen ein 5' TpA-Sequenzmotiv vorhanden ist. Das Sequenzmotiv stellt die für die Photo-Bisadduktbindung benötigten Pyrirnidinbasen (Thymine) zur Verfügung. Psoralen-konjugierte Triplehelix-Oligonukleotide können für eine molekularbiologisch modifizierte Phototherapie (PUVA-Therapie) von entzündlichen oder malignen Hautkrankheiten verwendet werden.Triplehelix oligonucleotides can be modified at the 5 'or 3' end with psoralen molecules become. Psoralens are embedded in the DNA double helix. After absorption of photons in the UVA range creates covalent psoralen-DNA connections via 3,4- or 4 ', 5'- Cyclobutane addition of psoralens to pyrimidine bases in the DNA double helix. The photochemical reaction initially leads to a covalent bond with a Pyrimidine base of a DNA strand (photo monoadduct). The absorption of a second photon The psoralen then enables covalent connection with a pyrimidine base of the second strand of DNA (photo-bisadduct), resulting in a cross-linking of the double helix results. For the photo bisadduct formation, it is beneficial if in the double helix in A 5 'TpA sequence motif is present in the vicinity of the psoralen. The sequence motif poses the pyrirnidine bases (thymines) required for the photo-bisadduct binding are available. Psoralen-conjugated triplehelix oligonucleotides can be used for a molecular biology Modified phototherapy (PUVA therapy) of inflammatory or malignant skin diseases be used.

Bei der konventionellen PUVA-Therapie, d. h. mit nicht an Polydesoxyribonukleotide gekoppelten Psoralenmolekülen, bewirken die an zufälligen, nicht sequenzspezifischen Stellen im Genom eingelagerten Psoralenmoleküle eine Hemmung der Replikation und somit der Zellproliferation, können aber nicht die Transkription einzelner, gewünschter Gene abschalten [7]. Durch Psoralen-konjugierte Triplehelix-Oligonukleotide kann bei geeigneter Auswahl der DNA-Zielsequenz zusätzlich zur Replikation auch die Transkription von Genen, z. B. von proinflammatorischen Genen oder von Onkogenen, gehemmt und so zusätzliche therapeutische Effekte erzielt werden.In conventional PUVA therapy, i.e. H. with not on polydesoxyribonucleotides coupled psoralen molecules, cause the at random, non-sequence-specific locations inhibited replication and thus the inhibition of replication in the genome Cell proliferation, however, cannot switch off the transcription of individual, desired genes [7]. With Psoralen-conjugated triplehelix oligonucleotides, the DNA target sequence in addition to replication also the transcription of genes, e.g. B. from pro-inflammatory genes or inhibited by oncogenes and so additional therapeutic Effects are achieved.

Da die bei der konventionellen PUVA-Therapie entstehenden Sequenz-unspezifischen DNA- Einlagerungen für die phototoxischen Nebenwirkungen verantwortlich gemacht werden [12], kann die zielgerichtete Anlieferung der Psoralene an einer bestimmten Stelle im Erbgut die Anzahl der Psoralen-DNA-Wechselwirkungen auf ein Mindestmaß reduzieren und somit auch die Nebenwirkungsrate senken.Since the sequence-unspecific DNA  Inclusions are responsible for the phototoxic side effects [12], can the targeted delivery of psoralens to a specific place in the genome Reduce the number of psoralen-DNA interactions to a minimum and thus also reduce the side effect rate.

Erfindungsgemäß kann ein Psoralen-konjugiertes Triplehelix-Oligonukleotid mit so geringer Bindungsaffinität für seine Zielsequenz ausgewählt werden, daß es per se nicht zu einer Gen- Hemmung befähigt ist und erst durch die PUVA-Aktivierung einen Hemmeffekt erzielt. Triplehelix-Oligonukleotide mit geringer Bindungsaffinität können aufgrund der vorstehend beschriebenen Gesetzmäßigkeiten für eine stabile und spezifische Bindung gestaltet werden. Die geringe Bindungsaffinität kann danach experimentell bestätigt werden, indem das Triplehelix- Oligonukleotid in unterschiedlichen Konzentrationen mit einer festen Konzentration doppelsträngiger Zielsequenz inkubiert wird. Nach Auftrennung des Reaktionsgemisches in einer nichtdenaturierenden Polyakrylamid-Elektrophorese kann die Absättigung der Zielsequenz mit dem Triplehelix-Oligonukleotid beurteilt werden. Der für die Absättigung benötigte Überschuß an Triplehelix-Oligonukleotid ist ein Maß für seine Bindungsaffinität.According to the invention, a psoralen-conjugated triple helix oligonucleotide can be so low Binding affinity can be selected for its target sequence that it does not per se lead to a gene Inhibition is enabled and an inhibitory effect is only achieved through PUVA activation. Triplehelix oligonucleotides with low binding affinity can be due to the above described legalities for a stable and specific bond. The low binding affinity can then be confirmed experimentally by using the triple helix Oligonucleotide in different concentrations with a fixed concentration double-stranded target sequence is incubated. After separation of the reaction mixture in a Non-denaturing polyacrylamide electrophoresis can be used to saturate the target sequence the triple helix oligonucleotide. The excess needed for saturation Triplehelix oligonucleotide is a measure of its binding affinity.

Ein wenig affin bindendes Triplehelix-Oligonukleotid ist bei systemischer Verabreichung nur in solchen Zellen wirksam, die für UVA-Strahlung zugänglich sind. Dadurch kann die Triplehelix- Behandlung auf die Haut beschränkt werden. Da UVA nur bis zur mittleren Hautschicht (Lederhaut) in den Körper eindringt, kommen als Zielzellen in erster Linie epidermale Keratinozyten, aber auch dermale Zellarten wie Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen und in der Haut angesiedelte Lymphozyten in Betracht. In ähnlicher Weise können auch andere Gewebe durch PUVA-aktivierte Triplehelix-Oligonukleotide gezielt behandelt werden, beispielsweise Schleimhäute, Gelenkhäute oder Magen/Darm-Oberflächen.A little affinity binding triple helix oligonucleotide is only in when systemically administered effective cells that are accessible to UVA radiation. The Triplehelix- Treatment can be limited to the skin. Since UVA only up to the middle skin layer (Leather skin) penetrates into the body, the primary target cells are epidermal Keratinocytes, but also dermal cell types such as fibroblasts, microvascular endothelial cells and lymphocytes located in the skin. Similarly, others can Targeted treatment of tissues by PUVA-activated triplehelix oligonucleotides, for example mucous membranes, synovial membranes or gastrointestinal surfaces.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.The invention is illustrated by the following examples, but is not limited to these.

Beispiel 1example 1 Besonders geeignetes Triplehelix-Oligonukleotid zur Hemmung von ICAM-1Particularly suitable triplehelix oligonucleotide for inhibiting ICAM-1

THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) wurde so konstruiert, daß es in antiparalleler Orientierung an eine Zielsequenz im ICAM-1-Gen bindet. Die Zielsequenz befindet sich im 3. Intron (siehe Fig. 3) und entspricht den Basenpositionen 556-572 einer von Vorarberger veröffentlichten ICAM-1- Sequenz [19]. In Fig. 2A ist unmittelbar über THO GT 13ap ein doppelsträngiges Oligonukleotid abgebildet, das die Basenpositionen 554-576 der von Vorarberger veröffentlichten ICAM-1-Sequenz [19] enthält. Zur Überprüfung der Sequenzspezifität dient das Oligonukleotid CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35), das die gleiche Basenkomposition wie THO GT 13ap, jedoch in zufällig verteilter Reihenfolge enthält (scrambled control). Es wurden Oligonukleotide mit Phosphodiester-Internukleosidbindungen verwendet, die zur Verhinderung eines schnellen intrazellulären Abbaus mit Triethylenglykol endmodifiziert wurden.THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) was designed so that it binds in antiparallel orientation to a target sequence in the ICAM-1 gene. The target sequence is located in the 3rd intron (see FIG. 3) and corresponds to base positions 556-572 of an ICAM-1 sequence published by Vorarberger [19]. FIG. 2A shows a double-stranded oligonucleotide directly above THO GT 13ap, which contains the base positions 554-576 of the ICAM-1 sequence published by Vorarberger [19]. To check the sequence specificity, the oligonucleotide CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35) is used, which contains the same base composition as THO GT 13ap, but in a randomly distributed order (scrambled control). Oligonucleotides with phosphodiester internucleoside bonds were used, which were end-modified with triethylene glycol to prevent rapid intracellular degradation.

Das doppelsträngige Oligonukleotid, das die Triplehelix-Zielsequenz enthält wurde in die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pRB55 kloniert. Im Oligonukleotid wurde die Nachbarschaft der ICAM-1-Sequenz so gestaltet, daß eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Eco NI mit dem Triplehelixbindungsbereich überlappt. Durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Eco NI ergibt sich in der Agarose-Gelelektrophorese ein Restriktionsfragmentmuster, das unter anderem Fragmente von 270 und 450 Basenpaaren Länge enthält. Durch Triplexbildung mit THO GT 13ap wird die Erkennungsstelle des Enzyms Eco NI teilweise überdeckt und damit die Aktivität des Enzym behindert. Hieraus resultiert ein größeres Fragment von 720 Basenpaaren Länge.The double-stranded oligonucleotide that contains the triplehelix target sequence was incorporated into the multiple cloning site of plasmid pRB55 cloned. In the oligonucleotide, the Neighborhood of the ICAM-1 sequence designed so that a recognition sequence for the Restriction enzyme Eco NI overlaps with the triple helix binding region. By splitting with the restriction enzymes Eco RI and Eco NI are found in agarose gel electrophoresis Restriction fragment pattern, which includes fragments of 270 and 450 base pairs in length contains. The recognition site of the enzyme Eco NI becomes by triplex formation with THO GT 13ap partially covered and thus hindered the activity of the enzyme. This results in a bigger one Fragment of 720 base pairs in length.

Das Plasmid (0,6 pmol) wurde mit 3 bis 300fachem molaren Überschuß von THO GT 13ap unter Anwesenheit von 10 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM Spermidin bei 37°C inkubiert. Nach Restriktionsenzymbehandlung mit Eco RI und Eco NI wurde eine Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt. Es zeigt sich eine durch Triplehelixbildung inhibierte Eco NI Aktivität schon ab einem 3fachen molaren Überschuß und eine vollständige Hemmung ab einem 30fachen molaren Überschuß. Zugabe von 300fachem Überschußmengen an Kontrolloligonukleotiden CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35) sowie ein weiteres Kontroll-Triplehelix- Oligonukleotid, CO GT sc1 (SEQ ID NO: 36) behinderten Eco NI nicht, das heißt, diese Triplehelix-Oligonukleotide waren nicht zur Triplexbildung befähigt.The plasmid (0.6 pmol) was covered with a 3 to 300-fold molar excess of THO GT 13ap Presence of 10 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM spermidine incubated at 37 ° C. After restriction enzyme treatment with Eco RI and Eco NI, an agarose was Gel electrophoresis performed. An Eco NI inhibited by triple helix formation is shown Activity from a 3-fold molar excess and complete inhibition from one 30-fold molar excess. Add 300 times excess amounts Control oligonucleotides CO GT sc2 (SEQ ID NO: 35) and a further control triple helix Oligonucleotide, CO GT sc1 (SEQ ID NO: 36) did not impede Eco NI, that is, these Triplehelix oligonucleotides were unable to form triplexes.

Beispiel 2Example 2 Hemmung der ICAM-1-Expression in menschlichen Zellen THO GT 13apInhibition of ICAM-1 expression in human cells THO GT 13ap

Die ICAM-1-Oberflächenexpression auf der menschlichen Keratinozyten-Zellinien A431 wurde durch Markierung mit einem murinen monoklonalen Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC)- markierten Anti-ICAM-1-Antikörper und anschließender durchflußzytometrischer Analyse quantifiziert wie beschrieben [7]. Kontrollfärbungen erfolgten mit einem murinen isotypgleichen FITC-markierten Antikörper mit irrelevanter Antigenspezifität. Die Zellen wurden in einem Durchflußzytometer (FACScan II, Becton Dickinson, Heidelberg) mittels des CellQuest- Analyseprogramms (Becton Dickinson) untersucht. In Fig. 5A ist die geringe basale ICAM-1- Expression von A431-Zellen dargestellt. Fig. 53 zeigt die ICAM-1-Expression nach 18 h Inkubation mit dem ICAM-1-induzierenden Zytokin Interferon-gamma (500 U/ml). Fig. 5C zeigt Zellen, die wie in Fig. 5B mit Interferon-gamma behandelt wurden, aber 3 h vorher das Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) erhielten. Die Zugabe von THO GT 13ap (3 µM) verhinderte die ICAM-1-Induktion durch Interferon-gamma weitgehend. Wenn das Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 13ap durch das Kontroll-Oligonukleotid CO GT sc2 ersetzt wurde (Fig. 5D), zeigte sich keine Hemmung der ICAM-1-Induktion, was die Sequenzspezifität des bei THO GT 13ap beobachteten Hemmeffektes belegt. Ein CO GT sc2 entsprechendes Resultat wurde auch für CO GT sc1 erzielt. Zur besseren Aufnahme der Oligonukleotide in A431-Zellen wurden sie vor Zugabe zu den Zellen mit aktiviertem Dendromer (SuperfectTM) versetzt. Kontrollen (Fig. 5A und Fig. 5B) wurden mit Superfect ohne Oligonukleotide versetzt.ICAM-1 surface expression on human keratinocyte cell lines A431 was quantified as described by labeling with a murine monoclonal fluorescein isothiocyanate (FITC) -labelled anti-ICAM-1 antibody and subsequent flow cytometric analysis [7]. Control staining was carried out using a murine FITC-labeled antibody of the same type with irrelevant antigen specificity. The cells were examined in a flow cytometer (FACScan II, Becton Dickinson, Heidelberg) using the CellQuest analysis program (Becton Dickinson). Figure 5A shows the low basal ICAM-1 expression of A431 cells. Fig. 53 shows the ICAM-1 expression by 18 h incubation with the ICAM-1 inducing cytokine interferon-gamma (500 U / ml). FIG. 5C shows cells which were treated with interferon-gamma as in FIG. 5B, but which received the triplehelix oligonucleotide THO GT 13ap (SEQ ID NO: 27) 3 hours beforehand. The addition of THO GT 13ap (3 µM) largely prevented ICAM-1 induction by interferon-gamma. When the triplehelix oligonucleotide THO GT 13ap was replaced by the control oligonucleotide CO GT sc2 ( FIG. 5D), there was no inhibition of ICAM-1 induction, which demonstrates the sequence specificity of the inhibitory effect observed with THO GT 13ap. A result corresponding to CO GT sc2 was also achieved for CO GT sc1. For better absorption of the oligonucleotides in A431 cells, activated dendromer (Superfect ™ ) was added to them before addition to the cells. Controls (Fig. 5A and Fig. 5B) were treated with Superfect without oligonucleotides.

Beispiel 3Example 3 Verbesserung der Triplehelix-vermittelten Hemmung der Genexpression durch PUVA-TechnologieImprovement of the triplehelix-mediated inhibition of gene expression by PUVA technology

Das Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 17ap (SEQ ID NO: 37) wurde so konstruiert, daß es in antiparalleler Orientierung an eine Zielsequenz im ICAM-1-Gen (Seq ID NO: 17) bindet. Die Zielsequenz befindet sich im 7. Exon und entspricht den Basenpositionen 2621-2637 einer von Vorarberger et al. veröffentlichten ICAM-1-Sequenz [19]. In Fig. 2B ist unmittelbar über THO GT 17ap ein doppelsträngiges Oligonukleotid abgebildet, das den Basenpositionen 2615 bis 2644 der von Vorarberger veröffentlichten ICAM-1-Sequenz entspricht. Der Abschnitt, an den das Triplehelix-Oligonukleotid bindet ist unterstrichen. THO GT 17ap wurde am 5'-Ende mit 3- Methoxypsoralen konjugiert in der Absicht, am benachbarten TpA-Motiv der ICAM-1-Sequenz photochemische Modifikationen vorzunehmen. Der Ablauf der photochemische Modifikation ist schematisch in Fig. 6A erläutert. Nach UVA-Anregung des Psoralens kommt es zu einer Psoralen-DNA-Konjugation zunächst mit einem DNA-Strang (Photomono-Addukt) und anschließend mit dem zweiten Strang (Photobis-Addukt), woraus eine Vernetzung der Doppelhelix resultiert. Fig. 6B zeigt, daß psoralenmodifiziertes THO GT 17ap an die ICAM-1- Zielsequenz binden und durch UVA-Bestrahlung eine kovalente Verbindung mit der Ziel-DNA- Duplex erzeugt wird. Das in Fig. 2B abgebildete doppelsträngige Oligonukleotid, das einen Zielabschnitt in der ICAM-1-Sequenz enthält (Seq ID NO: 17) wurde mit Digoxigenin markiert, in einer Konzentration von 3 nM mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,1 µM-10 µM) von Triplehelix-Oligonukleotiden inkubiert (Reaktionsbedingungen 10 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM Spermidin bei 37°C) und anschließend UVA bestrahlt. In einer anschließenden denaturierenden 16%igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die im Reaktionsprodukte ihrer Länge nach aufgetrennt. Nicht durch photochemische Modifikation kovalent miteinander verbundene Moleküle wurden so voneinander getrennt (denaturiert). Durch PUVA-Behandlung kovalent verbundene Moleküle wurden hingegen nicht voneinander getrennt und wanderten aufgrund der gewachsenen Molekülgröße verlangsamt (Shift). So ließ sich beurteilen, ob an der ICAM-1-Zielsequenz Photoaddukte entstanden sind. Fig. 6B, Spur 2 zeigt das Ergebnis der Zielsequenz mit Zugabe von 1 µm Triplehelix-Oligonukleotid THO GT 17ap ohne UVA- Bestrahlung. Spur 6, 7 und 8 zeigt das Ergebnis nach Zugabe von jeweils 0,1 µM, 1 µM und 10 µM THO GT 17ap und UVA 5 J/cm2. Es zeigte sich eine von der Triplehelix-Konzentration abhängige Photo-Bisaddukt-Bildung. Wenn statt THO GT 17ap ein Kontroll-Oligonukleotid unter sonst identischen Reaktionsbedingungen verwendet wurde, ließ sich keine Photoadduktbildung beobachten (Spur 1). Spur 3 bis 5 ist mit Spur 6 bis 8 identisch bis auf eine geringere UVA-Dosis (1 J/cm2). An der verglichen mit der Dosis 5 J/cm2 höheren Photomono- Addukt-, aber geringeren Photobis-Adduktbildung zeigt sich, daß die Photoadduktbildung auch eine Funktion der applizierten UVA-Dosis ist.The triplehelix oligonucleotide THO GT 17ap (SEQ ID NO: 37) was constructed in such a way that it binds in antiparallel orientation to a target sequence in the ICAM-1 gene (Seq ID NO: 17). The target sequence is in the 7th exon and corresponds to base positions 2621-2637 one of Vorarberger et al. published ICAM-1 sequence [19]. FIG. 2B shows a double-stranded oligonucleotide directly above THO GT 17ap, which corresponds to base positions 2615 to 2644 of the ICAM-1 sequence published by Vorarberger. The section to which the triple helix oligonucleotide binds is underlined. THO GT 17ap was conjugated at the 5 'end with 3-methoxypsoralen with the intention of making photochemical modifications to the neighboring TpA motif of the ICAM-1 sequence. The course of the photochemical modification is schematically illustrated in FIG. 6A. After UVA excitation of psoralens, psoralen-DNA conjugation occurs first with one strand of DNA (photomono adduct) and then with the second strand (photobis adduct), which results in cross-linking of the double helix. FIG. 6B shows that psoralen modified THO GT 17ap bind to the ICAM-1 target sequence and that a covalent connection with the target DNA duplex is generated by UVA irradiation. The double-stranded oligonucleotide shown in FIG. 2B, which contains a target section in the ICAM-1 sequence (Seq ID NO: 17), was labeled with digoxigenin, in a concentration of 3 nM with different concentrations (0.1 μM-10 μM) incubated by triplehelix oligonucleotides (reaction conditions 10 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM spermidine at 37 ° C.) and then irradiated with UVA. In a subsequent denaturing 16% polyacrylamide gel electrophoresis, the length of the reaction products was separated. Molecules that were not covalently linked to one another by photochemical modification were thus separated from one another (denatured). In contrast, molecules covalently linked by PUVA treatment were not separated from one another and migrated slowly due to the increased molecular size (shift). In this way, it was possible to assess whether photoadducts were formed on the ICAM-1 target sequence. FIG. 6B, lane 2 shows the result of the target sequence with the addition of 1 μm triplehelix oligonucleotide THO GT 17ap without UVA radiation. Lanes 6, 7 and 8 show the result after adding 0.1 µM, 1 µM and 10 µM THO GT 17ap and UVA 5 J / cm 2 . A photo-bisadduct formation which was dependent on the triplehelix concentration was found. If a control oligonucleotide was used instead of THO GT 17ap under otherwise identical reaction conditions, no photoadduct formation was observed (lane 1). Lanes 3 to 5 are identical to lanes 6 to 8 except for a lower UVA dose (1 J / cm 2 ). In comparison with the 5 J / cm 2 higher photomono adduct, but lower photobis adduct formation, it can be seen that the photoadduct formation is also a function of the applied UVA dose.

Beispiel 4Example 4 Hemmung der Genexpression in eukaryotischen Zellen durch PUVA-vermittelte, permanente TriplexbildungInhibition of gene expression in eukaryotic cells by PUVA-mediated, permanent triplex formation

Das Plasmid pCM52 wurde mit einem 1000fachen molaren Überschuß von psoralenkonjugiertem Triplehelix-Oligonukleotid inkubiert (Reaktionsbedingungen 10 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM Spermidin bei 37°C), mit 5 J/cm2 UVA bestrahlt und anschließend mit SuperfectTM transient in A431-Zellen transfiziert (2 h Inkubationszeit). Nach weiteren 6 h Inkubation wurden die A431-Zellen lysiert und die CAT-ELISA-Analysen wie beschrieben [8] vorgenommen. Die nach Plasmidtransfektion gemessene CAT-Konzentration in Kontrollkulturen ohne Behandlung mit Triplehelix-Oligonukleotiden wurde als 100% angenommen (Fig. 7B, Säule 1). Bei Inkubation des Plasmides mit dem Triplehelix- Oligonukleotid THO GT 17ap und anschließender UVA-Bestrahlung (hierbei besteht die Gelegenheit für eine in Fig. 6A demonstrierte kovalente Triplehelixbildung) nahm nach Transfektion die CAT-Expression gegenüber den Kontrollen um mehr als 50% ab (Fig. 7B, Säule 3). Das psoralenkonjugierte Kontrolloligonukleotid CO GT sc1 führte hingegen nach UVA-Bestrahlung zu keiner Verminderung der CAT-Expression (Fig. 7B, Säule 2), ebensowenig wie ein zweites psoralenkonjugiertes Kontrolloligonukleotid.The plasmid pCM52 was incubated with a 1000-fold molar excess of psorally conjugated triplehelix oligonucleotide (reaction conditions 10 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM spermidine at 37 ° C.), irradiated with 5 J / cm 2 UVA and then transiently transfected with A431 cells using Superfect ™ (2 h incubation time). After a further 6 h of incubation, the A431 cells were lysed and the CAT-ELISA analyzes were carried out as described [8]. The CAT concentration measured after plasmid transfection in control cultures without treatment with triplehelix oligonucleotides was assumed to be 100% ( FIG. 7B, column 1). Upon incubation of the plasmid with the triplehelix oligonucleotide THO GT 17ap and subsequent UVA irradiation (here there is the opportunity for covalent triplehelix formation shown in FIG. 6A), the CAT expression decreased by more than 50% compared to the controls after transfection ( FIG . 7B, column 3). In contrast, the psoral conjugated control oligonucleotide CO GT sc1 did not lead to a reduction in CAT expression after UVA irradiation ( FIG. 7B, column 2), just as little as a second psoral conjugated control oligonucleotide.

Literaturliterature

1. Cooney M, Czernuszewicz G, Postel EH, Flint SJ, Hogan ME (1988) Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science 241: 456-459
2. Degitz K, Li LJ, Caughman SW (1991) Cloning and characterization of the 5'-transcriptional regulatory region of the human intercellular adhesion molecule 1 gene. J Biol Chem 266: 14024- 14030
3. Giovannangeli C, Diviacco S, Labrousse V, Gryaznov S, Charneau P, Helene C (1997) Accessibility of nuclear DNA to triplex-forming oligonucleotides: the integrated HIV-1 provirus as a target. Proc Natl Acad Sci USA 94: 79-84
4. Grigoriev M, Praseuth D, Guieysse AL, Robin P, Thuong NT, Helene C, Harel-Bellan A (1993) Inhibition of gene expression by triple helix-directed DNA cross-linking at specific sites. Proc Natl Acad Sci USA 90: 3501-3505
5. Hönigsmann H, Fitzpatrick TB, Pathak MA, Wolff K (1993) Oral Photochemotherapy with psoralens and UVA (PUVA): principles and practice. In: Fitzpatrick TB, Eisen AZ, Wolff K, Freedberg IM, Austen KF (eds) Dermatology in general medicine. 4th McGraw Hill, New York, 1728-1754
6. Ing NH, Beekman JM, Kessler DJ, Murphy M, Jayaraman K, Zendegui JG, Hogan ME, O'Malley BW, Tsai MJ (1993) In vivo transcription of a progesterone-responsive gene is specifically inhibited by a triplex-forming oligonucleotide. Nucleic Acids Res 21: 2789-2796
7. Lüftl M, Röcken M, Plewig G, Degitz K (1998) PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages. J Invest Dermatol 111: 399-405
8. Marschall C, Lengyel E, Nobutoh T, Braungart E, Douwes K, Simon A, Magdolen V, Reuning U, Degitz K (1999) UVB increases urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression. J Invest Dermatol 113: 77-81
9. McShan WM, Rossen RD, Laughter AH, Trial J, Kessler DJ, Zendegui JG, Hogan ME, Orson FM (1992) Inhibition of transcription of HIV-1 infected human cells by oligodeoxynucleotides designed to form DNA triple helices. J Biol Chem 267: 5712-5721
10. Nakanishi M, Weber KT, Guntaka RV (1998) Triple helix formation with the promoter of human alpha1(I) procollagen gene by an antiparallel triplex-forming oligodeoxyribonucleotide. Nucleic Acids Res 22: 5218-5222
11. Orson FM, Thomas DW, McShan WM, Kessler DJ, Hogan ME (1991) Oligonucleotide inhibition of IL2R alpha mRNA transcription by promoter region collinear triplex formation in lymphocytes. Nucleic Acids Res 19: 3435-3441
12. Ortel B, Gange RW (1990) An action spectrum for the elicitation of erythema in skin persistently sensitized by photobound 8-methoxypsoralen. J Invest Dermatol 94: 781-785
13. Postel EH, Flint SJ, Kessler DJ, Hogan ME (1991) Evidence that a triplex-forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c-myc promoter in HeLa cells, thereby reducing c-myc mRNA levels. Proc Natl Acad Sci USA 88: 8227-8231
14. Rothlein R, Jaeger JR (1995) Treatment of inflammatory diseases with a monoclonal antibody to intercellular adhesion molecule 1. Ciba Foundation Symposium 189: 200-211
15. Staunton DE, Marlin SD, Stratowa C, Dustin ML, Springer TA (1988) Primary structure of ICAM-1 demonstrates interaction between members of the immunoglobulin and integrin supergene families. Cell 52: 925-933
16. Stein CA (1995) Does antisense exist? Nat Med 1: 1119-1121
17. Takasugi M, Guendouz A, Chassignol M, Decout JL, Lhomme J, Thuong NT, Helene C (1991) Sequence-specific photo-induced cross-linking of the two strands of doublehelical DNA by a psoralen covalently linked to a triple helix-forming oligonucleotide. Proc Natl Acad Sci US A 88: 5602-5606
18. Thoung NT, Helene C (1993) Sequence-specific recognition and modification of double­ helical DNA by oligonucleotides. Angew Chem Int Ed Engl 32: 666-690
19. Van de Stolpe A, Van der Saag PT (1996) Intercellular adhesion molecule-1. J Mol Med 74: 13-33
20. Vorarberger G (1992) H. sapiens gene for intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1). EMBL Nucleotide Sequence Database Accession number X59288
21. Wawryk SO, Cockerill PN, Wicks IP, Boyd AW (1991) Isolation and characterization of the promoter region of the human intercellular adhesion molecule-1 gene. Int Immunol 3: 83-93
22. Yacyshyn BR, Bowen-Yacyshyn MB, Jewell L, Tami JA, Bennett CF, Kisner DL, Shanahan WR (1998) A placebo-controlled trial of ICAM-1 antisense oligonucleotide in the treatment of Crohn's disease. Gastroenterology 114: 1133-1142 1. Cooney M, Czernuszewicz G, Postel EH, Flint SJ, Hogan ME (1988) Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science 241: 456-459
2. Degitz K, Li LJ, Caughman SW (1991) Cloning and characterization of the 5'-transcriptional regulatory region of the human intercellular adhesion molecule 1 gene. J Biol Chem 266: 14024-14030
3. Giovannangeli C, Diviacco S, Labrousse V, Gryaznov S, Charneau P, Helene C (1997) Accessibility of nuclear DNA to triplex-forming oligonucleotides: the integrated HIV-1 provirus as a target. Proc Natl Acad Sci USA 94: 79-84
4. Grigoriev M, Praseuth D, Guieysse AL, Robin P, Thuong NT, Helene C, Harel-Bellan A (1993) Inhibition of gene expression by triple helix-directed DNA cross-linking at specific sites. Proc Natl Acad Sci USA 90: 3501-3505
5. Hönigsmann H, Fitzpatrick TB, Pathak MA, Wolff K (1993) Oral Photochemotherapy with psoralens and UVA (PUVA): principles and practice. In: Fitzpatrick TB, Eisen AZ, Wolff K, Freedberg IM, Austen KF (eds) Dermatology in general medicine. 4th McGraw Hill, New York, 1728-1754
6. Ing NH, Beekman JM, Kessler DJ, Murphy M, Jayaraman K, Zendegui JG, Hogan ME, O'Malley BW, Tsai MJ (1993) In vivo transcription of a progesterone-responsive gene is specifically inhibited by a triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res 21: 2789-2796
7. Lüftl M, Röcken M, Plewig G, Degitz K (1998) PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages. J Invest Dermatol 111: 399-405
8. Marshal C, Lengyel E, Nobutoh T, Braungart E, Douwes K, Simon A, Magdolen V, Reuning U, Degitz K (1999) UVB increases urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression. J Invest Dermatol 113: 77-81
9. McShan WM, Rossen RD, Laughter AH, Trial J, Kessler DJ, Zendegui JG, Hogan ME, Orson FM (1992) Inhibition of transcription of HIV-1 infected human cells by oligodeoxynucleotides designed to form DNA triple helices. J Biol Chem 267: 5712-5721
10. Nakanishi M, Weber KT, Guntaka RV (1998) Triple helix formation with the promoter of human alpha1 (I) procollagen gene by an antiparallel triplex-forming oligodeoxyribonucleotide. Nucleic Acids Res 22: 5218-5222
11. Orson FM, Thomas DW, McShan WM, Kessler DJ, Hogan ME (1991) Oligonucleotide inhibition of IL2R alpha mRNA transcription by promoter region collinear triplex formation in lymphocytes. Nucleic Acids Res 19: 3435-3441
12. Ortel B, Gange RW (1990) An action spectrum for the elicitation of erythema in skin persistently sensitized by photobound 8-methoxypsoralen. J Invest Dermatol 94: 781-785
13. Postel EH, Flint SJ, Kessler DJ, Hogan ME (1991) Evidence that a triplex-forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c-myc promoter in HeLa cells, thereby reducing c-myc mRNA levels. Proc Natl Acad Sci USA 88: 8227-8231
14. Rothlein R, Jaeger JR (1995) Treatment of inflammatory diseases with a monoclonal antibody to intercellular adhesion molecule 1. Ciba Foundation Symposium 189: 200-211
15. Staunton DE, Marlin SD, Stratowa C, Dustin ML, Springer TA (1988) Primary structure of ICAM-1 demonstrates interaction between members of the immunoglobulin and integrin supergene families. Cell 52: 925-933
16. Stein CA (1995) Does antisense exist? Nat Med 1: 1119-1121
17. Takasugi M, Guendouz A, Chassignol M, Decout JL, Lhomme J, Thuong NT, Helene C (1991) Sequence-specific photo-induced cross-linking of the two strands of doublehelical DNA by a psoralen covalently linked to a triple helix -forming oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci US A 88: 5602-5606
18. Thoung NT, Helene C (1993) Sequence-specific recognition and modification of double helical DNA by oligonucleotides. Angew Chem Int Ed Engl 32: 666-690
19. Van de Stolpe A, Van der Saag PT (1996) Intercellular adhesion molecule-1. J Mol Med 74: 13-33
20. Vorarberger G (1992) H. sapiens gene for intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1). EMBL Nucleotide Sequence Database Accession number X59288
21. Wawryk SO, Cockerill PN, Wicks IP, Boyd AW (1991) Isolation and characterization of the promoter region of the human intercellular adhesion molecule-1 gene. Int Immunol 3: 83-93
22. Yacyshyn BR, Bowen-Yacyshyn MB, Jewell L, Tami JA, Bennett CF, Kisner DL, Shanahan WR (1998) A placebo-controlled trial of ICAM-1 antisense oligonucleotide in the treatment of Crohn's disease. Gastroenterology 114: 1133-1142

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (15)

1. Polydesoxyribonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz spezifisch für den transkribierten Bereich oder den Promotorbereich des ICAM-1-Gens.1. Polydeoxyribonucleotide with a nucleic acid sequence specific for the transcribed Region or promoter region of the ICAM-1 gene. 2. Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 1 mit einer Länge von 10 bis 35 Nukleotiden.2. Polydeoxyribonucleotide according to claim 1 with a length of 10 to 35 nucleotides. 3. Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 1 oder 2 mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis 34 und 37.3. Polydeoxyribonucleotide according to claim 1 or 2 with a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 to 34 and 37. 4. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit mindestens einer modifizierten Internukleosid-Phosphodiesterbindung.4. Polydeoxyribonucleotide according to one of claims 1 to 3 with at least one modified internucleoside-phosphodiester bond. 5. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die modifizierte Internukleosid-Phosphodiesterbindung eine Phosphotriester-, Methylphosphonat-, Phosphoamidat-, R,S-Methoxyethylphosphoamidat-, Phosphorothioat-, Formacetal-, Thioformacetal- oder kationische Guaninderivate- oder Polyaminderivat (PNA)-Bindung ist.5. polydeoxyribonucleotide according to any one of claims 1 to 4, wherein the modified Internucleoside-phosphodiester bond a phosphotriester, methylphosphonate, Phosphoamidate, R, S-methoxyethylphosphoamidate, phosphorothioate, formacetal, Thioformacetal- or cationic guanine derivative or polyamine derivative (PNA) bond. 6. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem an das 3'- und/oder 5'- Ende gekoppelten Molekülrestes.6. polydesoxyribonucleotide according to one of claims 1 to 5 with a to the 3'- and / or 5'- End of coupled molecular residue. 7. Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 6, wobei der Molekülrest ein Psoralen-, Akridin- oder Akridinderivat-Rest oder ein Chelatbildner ist.7. Polydeoxyribonucleotide according to claim 6, wherein the molecular residue is a psoralen, acridine or acridine derivative residue or a chelating agent. 8. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit mindestens einem modifizierten Desoxyriboserest.8. Polydeoxyribonucleotide according to one of claims 1 to 7 with at least one modified deoxyribose residue. 9. Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 8, worin der modifizierte Desoxyriborest ein Anomer der Desoxyribose, Ribose oder 2'-O-Methylribose ist. 9. The polydesoxyribonucleotide of claim 8, wherein the modified deoxyribo residue Anomer of deoxyribose, ribose or 2'-O-methylribose.   10. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit mindestens einer modifizierten Base.10. Polydeoxyribonucleotide according to one of claims 1 to 9 with at least one modified base. 11. Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 10, worin die modifizierte Base N6-Methoxy-2,6- diaminopurin, N4-Oxycytosin, Azolderivate wie Imidazol, 1,2,4-Triazol und Tetrazol, 7- Deazaxanthin, 6-Thioguanin, 2-Amino-5-(2'-desoxy-beta-D-ribofuranosyl)pyridin oder dessen α-Anomer, 6-Oxocytosin, N7-glycosyliertes Guanin, N7-glycosyliertes, 8-aza, 9- deazamethylguanin, 5-Methylcytosin, N6-Methyl-8-oxo-adenin, 8-Oxoadenin, N4-(3- Acetamidopropyl)cytidin, 5-Propynylcytosin oder 5-Propynylthymin ist.11. The polydesoxyribonucleotide according to claim 10, wherein the modified base is N6-methoxy-2,6- diaminopurine, N4-oxycytosine, azole derivatives such as imidazole, 1,2,4-triazole and tetrazole, 7- Deazaxanthin, 6-thioguanine, 2-amino-5- (2'-deoxy-beta-D-ribofuranosyl) pyridine or its α-anomer, 6-oxocytosine, N7-glycosylated guanine, N7-glycosylated, 8-aza, 9- deazamethylguanine, 5-methylcytosine, N6-methyl-8-oxo-adenine, 8-oxoadenine, N4- (3- Acetamidopropyl) cytidine, 5-propynylcytosine or 5-propynylthymine. 12. Polydesoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als therapeutisches Mittel.12. Polydeoxyribonucleotide according to one of claims 1 to 11 as a therapeutic agent. 13. Verwendung der Polydesoxyribonukleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Therapie oder Prophylaxe von ICAM-1- assoziierten Erkrankungen.13. Use of the polydesoxyribonucleotides according to one of claims 1 to 11 for Production of a therapeutic agent for the therapy or prophylaxis of ICAM-1 associated diseases. 14. Verwendung der Polydesoxyribonukleotide nach Anspruch 13, wobei die mit ICAM-1- assoziierten Erkrankungen Psoriasis, Neurodermitis, allergischem Asthma, Morbus Crohn, Autoimmunerkrankung oder der Abstoßungsreaktion nach Organtransplantationen umfassen.14. Use of the polydesoxyribonucleotides according to claim 13, wherein those with ICAM-1- associated diseases psoriasis, neurodermatitis, allergic asthma, Crohn's disease, Autoimmune disease or rejection after organ transplants. 15. Verwendung der Polydesoxyribonukleotide nach Anspruch 13 oder 14 in Kombination mit UVA-Bestrahlung.15. Use of the polydesoxyribonucleotides according to claim 13 or 14 in combination with UVA radiation.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITUB20155754A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-20 Mastelli S R L Composition for the treatment of intestinal inflammatory diseases.

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006702A1 (en) * 1988-01-21 1989-07-27 Chemex Pharmaceuticals, Inc. Selective inhibition of gene expression by photoactivatable oligonucleotides
WO1992003139A1 (en) * 1990-08-14 1992-03-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
WO1994005333A1 (en) * 1992-09-02 1994-03-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
WO1996015780A1 (en) * 1994-11-23 1996-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
US5580969A (en) * 1992-07-24 1996-12-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ICAM-I RNA
WO1997045437A1 (en) * 1996-05-24 1997-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for antisense inhibition of protein translation
WO1998024797A1 (en) * 1996-12-02 1998-06-11 Dyad Pharmaceutical Corporation Antisense inhibition of human adhesion molecules
WO1999054341A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense modulation of icam-1
WO1999061462A1 (en) * 1998-05-27 1999-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of cellular adhesion molecule expression and treatment of cellular adhesion molecule-associated diseases
WO2000003720A1 (en) * 1998-07-14 2000-01-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2'-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
WO2000009525A2 (en) * 1998-08-03 2000-02-24 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide agent, composition, kit and treatments
WO2000034303A1 (en) * 1998-12-10 2000-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF MODULATING TUMOR NECROSIS FACTOR α-INDUCED EXPRESSION OF CELL ADHESION MOLECULES

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ178394A3 (en) * 1992-01-31 1995-03-15 Univ California Process for producing universal donor cells
AU7559894A (en) * 1993-08-05 1995-02-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating metabolic function
US5696248A (en) * 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
AU1085401A (en) * 1999-10-15 2001-04-30 Orchid Biosciences, Inc. Genotyping reagents, kits and methods of use thereof

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006702A1 (en) * 1988-01-21 1989-07-27 Chemex Pharmaceuticals, Inc. Selective inhibition of gene expression by photoactivatable oligonucleotides
WO1992003139A1 (en) * 1990-08-14 1992-03-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5580969A (en) * 1992-07-24 1996-12-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ICAM-I RNA
WO1994005333A1 (en) * 1992-09-02 1994-03-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
WO1996015780A1 (en) * 1994-11-23 1996-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
WO1997045437A1 (en) * 1996-05-24 1997-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for antisense inhibition of protein translation
WO1998024797A1 (en) * 1996-12-02 1998-06-11 Dyad Pharmaceutical Corporation Antisense inhibition of human adhesion molecules
WO1999054341A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense modulation of icam-1
WO1999061462A1 (en) * 1998-05-27 1999-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of cellular adhesion molecule expression and treatment of cellular adhesion molecule-associated diseases
WO2000003720A1 (en) * 1998-07-14 2000-01-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2'-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
WO2000009525A2 (en) * 1998-08-03 2000-02-24 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide agent, composition, kit and treatments
WO2000034303A1 (en) * 1998-12-10 2000-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF MODULATING TUMOR NECROSIS FACTOR α-INDUCED EXPRESSION OF CELL ADHESION MOLECULES

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbank Madline, AN 94194113 (J. Immunol. 152 (1994) 3530-3540 *
Datenbank Medline, AN 1999157100 (Nucleic Acid Research 27 (6) (1999) 1547-1551) *
Datenbank Medline, AN 1999206509 (Antisense and Nucleic Acid Development 9 (1) (1999) 71-80 *
Datenbank Medline, AN 1999443413 (Transplantation 68 (6) (1999) 880-887) *
Datenbank Medline, AN 2000096736 (J.Med. Virology 60 (3) (2000) 313-323 *
Datenbank Medline, AN 2000222863 (Transplantation 69 (6) (2000) 1067-1074 *
Datenbank Medline, AN 92011548 (J.Biol.Chem. 266 (1991) 18162-18171). *
Datenbank Medline, AN 95370210 (J.Biol.Chem. 270 (1995) 18966-18974 *
Datenbank Medline, AN 96311860 (Australasian J. Dermatol. 37 Suppl. 1 S4-6 (1996) *
Datenbank Medline, AN 97277342 (J.Biol.Chem. 272 (1997) 11994-12000 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001079487A3 (en) 2002-06-20
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