DE10016527A1 - Verfahren zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder neurodegenerativen Krankheitszuständen sowie Produkte dafür - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder neurodegenerativen Krankheitszuständen beschrieben, bei dem Proteine mit Glutaminsäure/Arginin-reichen oder Asparaginsäure/Arginin-reichen Domänen (ER-Proteine bzw. DR-Proteine) bestimmt werden. Das Konzept der Bestimmung von ER-Proteinen bzw. DR-Proteinen eignet sich auch zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität, des Differenzierungsstadiums und/oder des Zellzyklusstadiums einer Zelle sowie zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen. Nützliche Produkte zum Einsatz für diese Verfahren werden ebenfalls beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Untersuchung von Krebserkrankungen und/oder neurodegenerativen Krankheits­ zuständen. Hierzu gehören insbesondere diagnostische Verfahren sowie Verfahren zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen gegen die vorstehend genannten Erkrankungen. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die zum Einsatz in den vorstehend genannten Untersuchungen bzw. Verfahren besonders geeignet sind.

Bisher bekannte Untersuchungen, Verfahren und Produkte für die eingangs genannten Krankheitszustände sind sehr heterogen und komplex. Für den Bereich der Krebserkrankungen wurden im Laufe der Zeit eine Vielzahl von so genannten Tumor-Markern entdeckt und für diagnostische Zwecke eingesetzt (siehe z. B. die Übersichtsliteratur in J. Natl. Cancer Inst., Bd. 80, S. 722-727 (1988) sowie Cimono (Hrsg.), Human Tumor Markers, De Kreuther Verlag (Berlin) (1987)). Dabei werden in erster Linie Tumor-spezifische bzw. Tumorassoziierte Antigene über immunologische Methoden nachgewiesen.

In jüngster Zeit wurde im Bereich von Tumor-Erkrankungen sowohl in diagnostischer als auch in therapeutischer Hinsicht besondere Aufmerksamkeit gelenkt auf die Struktur des Zellkerns und möglicherweise damit im Zusammenhang stehende, relevante Zellkernbestandteile (s. J. A. Nickerson in Journal of Cellular Biochemistry, Bd. 70, S. 172-180 (1998)). Zwei fundamentale Charakteristika maligner Veränderungen scheinen dort besonders deutlich hervorzutreten, nämlich Veränderungen in der Architektur von Zellen und Geweben sowie die genetische Instabilität. Die Beobachtung Zelltyp-spezifischer nukleärer Matrixproteine führte zu den US-Patentschriften 4 885 236 und 4 882 268, die den Einsatz solcher nukleärer Matrixproteine zur Krebsdiagnose beschreiben. Die dort beschriebenen Verfahren sind jedoch kompliziert und arbeitsaufwendig. Sie erfordern die Isolierung von internen nukleären Matrixproteinen und deren Auftrennung, üblicherweise über zweidimensionale Gelelektrophorese, wonach das dadurch erhaltene Analysebild gegenüber normalen Standards verglichen wird, um maligne Zustände identifizieren zu können. Für routinemäßige Einsätze, beispielsweise als Screening Assays, sind solche Verfahren daher nicht geeignet.

Diagnostik-Konzepte, die sich auf die nukleäre Matrix stützen, haben daher keinen Eingang in die klinische Praxis gefunden. J. A. Nickerson (s. o.) führt dies auf das bisherige Unvermögen zurück, Tumor-spezifische bzw. -assoziierte Polypeptide des Zellkerns identifizieren zu können. Auch die relativ niedrigen exprimierten Mengen solcher Polypeptide wird als problematisch angesehen. Ferner wird von J. A. Nickerson berichtet, dass ein auf dem NMP22-Antigen beruhender Test gegen nukleäre Matrixproteine neben cytologischen und endoskopischen Untersuchungen begleitend zur Verlaufskontrolle nach der Behandlung von Patienten mit Blasenkarzinomen einen Wert haben könnte. Das Zielantigen NMP22 wird jedoch nicht als spezifisch für einen malignen oder Übergangs-Zustand von Zellen angesehen. Neben dieser fehlenden Spezifität von bestehenden Verfahren wird ferner ein Problem darin gesehen, dass normalerweise durchgeführte Assay-Formate wie immun-cytochemische und Serum-basierte Assays dort nicht anwendbar sind.

Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, die Möglichkeiten zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere bei Krebserkrankungen zu erweitern und zu verbessern.

Die Erfinder haben überraschender Weise festgestellt, dass Proteine mit Glutaminsäure/Arginin-reichen Domänen (so genannte ER-Proteine) oder mit Asparginsäure/Arginin-reichen Domänen (so genannte DR-Proteine) neue und aussagekräftige Marker für die Entwicklung krankhafter Zustände darstellen. Ferner wurde festgestellt, dass es sich bei den betroffenen krankhaften Zuständen nicht nur um Krebserkrankungen, sondern auch um neurodegenerative Krankheiten handeln kann, wodurch die diagnostische Aussagekraft des gefundenen Markers sogar noch erweitert wird. Gleichzeitig wurde überraschender Weise erkannt, dass Veränderungen an den vorstehend genannten ER- Proteinen bzw. DR-Proteinen nach Einwirkung bestimmter Substanzen eine Indikation dafür sein können, dass die eingesetzten Substanzen gegenüber Erkrankungen, insbesondere gegen Krebserkrankungen und/oder neurogenerativen Krankheitszuständen, therapeutisch wirksam sind.

Die Erfindung stellt demnach in einem ersten Gegenstand ein Verfahren zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder neurogenerativen Krankheitszuständen zur Verfügung, bei dem Proteine mit Glutaminsäure/Arginin-reichen Domänen (im folgenden kurz ER-Proteine) oder mit Asparginsäure-/Arginin-reichen Domänen (im folgenden kurz: DR-Proteine) bestimmt werden.

Dieses Bestimmungsverfahren eignet sich ferner zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität, des Differenzierungsstadiums und/oder des Zellzyklusstadiums einer Zelle.

In einem weiteren Gegenstand stellt die Erfindung ein Verfahren zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen gegen Krebserkrankungen und/oder neurodegenerativen Krankheitszuständen zur Verfügung, welches die Untersuchung einer Veränderung an ER-Proteinen oder DR-Proteinen infolge einer Einwirkung durch solche, potentiell therapeutisch wirksamen Substanzen umfasst.

Die Erfindung stellt ferner nützliche Produkte zur Verfügung, die zum Einsatz in dem vorstehend bezeichneten Verfahren besonders gut geeignet sind. Hierzu gehören insbesondere gegen ein ER-Protein oder ein DR-Protein spezifischer Antikörper, sowie eine Säugetierzelle, die durch eine DNA transformiert ist, die für ein ER-Protein oder DR-Protein kodiert. In weiteren Gegenständen der vorliegenden Erfindung werden diese speziellen Produkte in den vorstehend genannten Verfahren verwendet.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt Beispiele einiger ER- oder DR-Proteine, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, wobei A eine schematische Liniendarstellung der jeweiligen Proteinstruktur (mit der ER- bzw. DR-Domäne in Form eines schwarzen Kästchens) und B das Sequenz-Alignment in Bezug auf die konservierte ER- bzw. DR-Domänenregion mit der Konsensussequenz zeigt.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer immunhistochemischen Anfärbung eines ER-Proteins als Marker für normale Zellen (A), für Tumorzellen (B, linke Spalte) und für behandelte Tumorzellen (B, mittlere und rechte Spalten).

Fig. 3 zeigt die Gesamt-Domänenstruktur eines ER-Proteins am Beispiel von YT521-B.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von immuncytometrischen Untersuchungen an einer Säugetierzelle (COS7-Zellen), die gemäß vorliegender Erfindung mit einer ER- bzw. DR-Protein­ kodierenden DNA transformiert ist und mit unterschiedlichen Transskriptions- bzw. Transplantations-Inhibitoren behandelt wurde.

ER- und DR-Proteine mit ihren jeweiligen ER- bzw. DR- Wiederholungs-Einheiten werden in einer Reihe von Körpergeweben, einschließlich des Gehirns, exprimiert. Dabei scheinen die ER- bzw. DR-reichen Domänen für die nukleäre Lokalisation dieser Proteine verantwortlich zu sein. Einige Mitglieder der Familie, wie z. B. YT 521-B, werden dort in erster Linie in Zellen neuronalen Ursprungs gefunden.

Fig. 1 zeigt eine beispielhafte Reihe von ER- und DR- Proteinen, die für die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden können. Die entsprechenden DNA- bzw. Polypeptid-Sequenzen können über die in der Fig. 1 angegebenen Bezeichnungen der Proteine aus bekannten Genbanken (z. B. "GenBank") entnommen werden.

In Fig. 1A sind die Proteine als Linien dargestellt, wobei die ER- bzw. DR-reichen Bereiche als schwarze Box angezeigt sind. Der Skalierungsstrich steht für 100 Aminosäuren Länge. In Fig. 1B ist die Abgleichung der ER- bzw. DR-reichen Bereiche (Domänen) aus A) angegeben. Die Bezeichnungen der jeweiligen Proteine stehen für: KIA 0182 = hypothetisches Protein (T. Nagase et al. in DNA Res. Vol. 3, S. 17-24 (1996); Disc = drosophila disconnected gene (J. S. Heilig et al., EMBO J. Vol. 10, S. 809-815 (1991)); RD-Protein = Humanes RD-Protein (C. S. Surovi et al., Gene vol. 90, S. 299-301 (1990)); RNA-Helicase I = RNA Helicase-isolo aus Arabidopsis taliana (Genbank-Zugangsnummer U78721); IK-Faktor = humaner IK-Faktor (P. Greve et al., Onkogene Vol. 9, S. 3449-3456 (1994)); U2AF = U2-Auxiliary Factor aus Tabak (C. Domon et al., J. Biol. Chem. Vol. 273, S. 34603-34610 (1998)); Shuttle Craft = "Shuttle Craft"- Protein aus Drosophila (N. D. Stroumbakis, Mol. Cell Biol. Vol. 16, S. 192-201 (1996)); U170K = humanes U170K-Protein (R. A. Spritz et al., Genomics Vol. 8, S. 371-379 (1990)); YT521-B = Splicing-assoziierter Faktor (A. M. Hartmann et al., Mol. Biol. Cell, Vol. 10, S. 3909-3926 (1999); Genbank Zugangsnr. AF 144731); SRP20 = SRP20-ähnliches Protein aus C. elegans (R. Wilson et al., Nature Vol. 368, S. 32-38 (1994)); RNA Helicase-II = RNA Helicase ATP-abhängige RNA Helicase HRH1 (M. Ono und Y. Shimura, Genes Dev. Vol. 10, S. 997-1007 (1996)); Hel 117 = Ratten-RNA-Helicase (J. Sukigawa und G. Blobel, J. Biol. Chem. Vol. 270, 15702-15706 (1995)) Octapep- Prot. = Octapeptid-Protein aus Maus (N. Di Carlo et al., J. Submicrosk. Cytol. Pathol. Vol. 24, S. 467-472 (1992)); SAF-B = "Scaffold Attachment Factor B" aus Ratte (O. Nayler et al., Genomics Vol. 53, S. 191-202 (1998)). Die Proteine wurden ermittelt unter Verwendung der 60 letzten Aminosäuren von YT521-B sowie durch die Sequenz (ER)₁₅ unter Verwendung des BLAST Algorithmus. Ähnliche Sequenzen wurden unter Verwendung des PILEUP-Programms zusammengestellt. Der Ausdruck "Consensus" bedeutet die mittels LINE UP ermittelte Konsensussequenz dieser Abgleichung.

Einige dieser Proteine, wie das RD-Protein, U170K, SAF-B, das "Shuttle Craft"-Protein, SRP 20, U2-Auxiliary Factor und mehrere RNA Helicasen sind am Prä-mRNA Spleiß-Vorgang bzw. bei der Bildung des transkriptosomalen Komplexes beteiligt. Es wird angenommen, dass die ER bzw. DR-Proteine wichtige Funktionen übernehmen. Bestimmte Proteine davon interagieren miteinander. Dies wurde von A. M. Hartmann et al. in Molecular Biology of the Cell 10, S. 3909-3926 (1999) beschrieben am Beispiel des YT521-B-Proteins, das mit der nukleären transkriptosomalen Komponente SAF-B interagiert, während eine weitere Interaktion von YT521-B mit dem p62/SAM 68-Protein ebenfalls für seine biologische Funktion eine Rolle zu spielen scheint. Die ER- bzw. DR-reiche Region scheint für die biologische Funktion bedeutend zu sein, da Deletions- Varianten ohne diese Regionen die nachweisbare Bindung an andere interagierende Proteine aufhebt. Indizien sprechen ferner dafür, dass diese charakteristische Domäne für das subnukleare Auftreten und das Spleiß-Muster von Reportergenen von Bedeutung ist.

Als markantes Erkennungszeichen von Krankheitszuständen hat sich nunmehr die Lokalisierung der ER- bzw. DR-Proteine in konzentrierten Bereichen (Punkte, "Dots" oder "Bodies") oder der Veränderung eines solchen Zustandes herausgestellt. Als besonders aussagekräftig für das Diagnose-Verfahren bzw. das Testverfahren gemäß vorliegender Erfindung hat sich die Untersuchung danach herausgestellt, ob oder inwieweit die ER- bzw. DR-Proteine in solchen zellulären, nukleären Bereichen lokalisierbar sind. So wurde gefunden, dass Zellen im normalen Zustand mehrere solcher lokalisierbarer Bereiche aufwiesen, wie in Fig. 2A gezeigt. Demgegenüber traten solche konzentrierten Bereiche überraschender Weise in Tumorzellen nicht auf, wie in Fig. 2B für die humanen Tumor- Zelllinie MCF7 gezeigt. Vielmehr ist dort das ER- bzw. DR- Protein diffus im Zellkern verteilt.

Für neurodegenerative Zustände bzw. Krankheiten wurden andererseits überraschender Weise eine Erhöhung der Anzahl von lokalisierbaren, nukleären Bereichen in Bezug auf ER- bzw. DR-Proteine beobachtet.

Eine Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wird durch Expansion von Triplet-repeats ausgelöst. Hierzu gehören zum Beispiel spinocerebellar ataxia type 1 und Huntingtonsche Krankheit (MIM/OMIM Nummern 164400 und 143100). Die hierzu gehörenden Genprodukte, sca-1 und Huntingtin weisen eine Ausbildung von nukleären Punkten auf (P. J. Skinner et al. Nature 389, S. 971-974 (1997) [veröffentlichtes Erratum in Nature 391, S. 307 (1998)], L. Roizin et al. Adv. Neurol. 23, S. 95-122 (1979)), die den Strukturen, die von ER-Proteinen ausgebildet werden, sehr ähnlich sind (E. Assier et al. Gene 230, S. 145-154 (1999)). Ein mit YT521-B interagierendes Protein, DAN26 (Genbank Referenznummer U94836) interagiert ebenfalls mit sca-1 und führt zu einer Translokation des sca- 1 Genproduktes in YT521-B enthaltenden Kernstrukturen. Ein Nachweis von Kernstrukturen, die im Hinblick auf ER- oder DR- Proteine wie YT521-B positiv detektierbar sind, können somit also auch für die Genese und Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen wie spinocerebellar ataxia type 1 und Huntingtonsche Krankheit von Vorteil sein.

Somit liefert die Bestimmung der ER- bzw. DR-Proteine in Bezug auf Verteilung, Lokalisierung in nukleären Bereichen des Zellkerns sowie Quantifizierung sehr nützliche Informationen und diagnostische Aussagen. Im erfindungsgemäßen Verfahren können einzelne oder mehrere ER- bzw. DR-Proteine bestimmt werden. Als besonders aussagekräftig hat sich die Untersuchung auf das DR-Protein YT521, insbesondere dessen Spleißvariante YT 521-B erwiesen.

Desweiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass das Auftreten der ER- bzw. DR-Proteine in lokalisierten nukleären Bereichen im Verlauf des Zellzyklusses reguliert ist und sich verändert. Das Auftreten der lokalisierten Bereiche korreliert dabei sehr gut mit dem Beginn während der mittleren bis späten G1-Phase und der anschließenden Fortsetzung während der S-Phase in Bezug auf die transkriptionale Aktivität, während solche lokalisierbare Bereiche während der Mitose, speziell der G2/M-Phase und der frühen G1-Phase, undetektierbar waren und somit das Fehlen transkriptionaler Aktivität anzeigte. Die Bestimmung der ER- bzw. DR-Proteine, insbesondere das lokalisierbare Auftreten in zellulären, nukleären Bereichen, kann daher vorteilhafter Weise auch zur Bestimmung der Transkriptions-Aktivität, des Differenzierungs-Stadiums und/oder des Zyklus-Stadiums einer zu untersuchenden Zelle eingesetzt werden.

Eine weitere, erfindungsgemäß gefundene Verwendungs­ möglichkeit des vorstehend beschriebenen Markers, d. h. des bzw. der oben beschriebenen ER- bzw. DR-Protein(e), besteht darin, ggf. therapeutisch wirksame Substanzen, insbesondere solche gegen Krebserkrankungen und/oder neurogenerative Krankheitszustände, zu testen. Eine therapeutische Wirksamkeit zeigt sich dadurch, dass das wie oben beschriebene Erscheinungsbild der ER- bzw. DR-Proteine in Folge der Einwirkung der untersuchten, potentiell therapeutisch wirksamen Substanz ändert. Aussagekräftige Kriterien für eine solche Veränderung sind wiederum eine diffuse Verteilung, eine Sichtbarmachung in definierten nukleären Bereichen oder eine Vermehrung solcher nukleärer Bereiche an ER- bzw. DR-Proteinen. Dies wurde am Beispiel der bekannten Brustkrebs-Zelllinie MCF7 experimentell belegt. Während die unbehandelte Krebs-Zelllinien eine lediglich diffuse Verteilung von ER- bzw. DR-Proteinen und kein Auftreten von nukleären Bereichen zeigten, konnten solche nukleäre Bereiche lokalisiert werden nach 48 Stunden Inkubationszeit mit dem bekannten Anti-Brustkrebs-Mittel Tamoxifen (s. Fig. 2B, linke und rechte Spalte). Auch die Einwirkung durch bekannte Differenzierungsagentien wie Natriumbutyrat oder Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), veränderten das Erscheinungsbild unter Auftreten der lokalisierbaren, nukleären Bereiche nach der Behandlung (s. Fig. 2B, die beiden mittleren Spalten).

Zur Detektion im Rahmen der Bestimmung der ER- bzw. DR- Proteine in den erfindungsgemäßen Verfahren kommen in erster Linie immunocytische und verwandte Verfahren in Frage, wie dies bei den oben beschriebenen Experimenten der Fall war.

Immunocytische Verfahren sind vorteilhafter Weise mit den in Screening-Verfahren üblichen Assay-Formaten vereinbar. Jedoch kommen auch andere typische, spezifische Protein- Nachweisverfahren in Frage, beispielsweise ein Enzym­ gebundener Immunosorbensassay (ELISA). Solche Methoden sind dem Fachmann geläufig.

Als besonders nützliche Produkte zum Einsatz in solche immunocytische Verfahren oder dergleichen sind Antikörper, die gegenüber einzelnen oder mehrere der oben beschriebenen ER- bzw. DR-Proteine gerichtet sind, zu nennen. Die Antikörper können gegen das gesamte ER- bzw. DR-Protein oder aber gegen ein Oligopeptid, das einen Sequenzausschnitt aus dem ER- bzw. DR-Protein definiert, gerichtet werden. Je nach gewünschter Anwendung können die Antikörper gegen die ER- oder DR-Region gerichtet sein, so dass ER- bzw. DR-Proteine generell erfasst werden können. Als Antigen kann hierfür die in Fig. 1B dargestellte Konsensus-Sequenz herangezogen werden. Andererseits kann es, falls gewünscht, vorteilhaft sein, wenn die Antikörper spezifisch gegen einzelne ER- bzw. DR-Proteine gerichtet sind, um differenziertere Aussagen zu ermöglichen. Dies ist in Beispiel 2 für einen Antikörper gegen YT521-B gezeigt. Die Antikörper der Erfindung können monoklonal oder polyklonal sein.

Als weiteres hilfreiches Produkt wird erfindungsgemäß eine Säugetierzelle zur Verfügung gestellt, die durch eine DNA transformiert ist, welche für ein wie oben beschriebenes ER- Protein oder DR-Protein kodiert. Die Säugetierzelle ist dabei vorzugsweise menschlichen Ursprungs. Eine solche transformierte Zelle kann vorteilhafter Weise für das oben beschriebene Verfahren zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen, insbesondere solche gegen Krebserkrankungen und/oder neurodegenerative Krankheitszustände, verwendet werden. Die Transformation der Säugetierzelle mit der ER- bzw. DR-Protein kodierenden DNA kann mit an sich bekannten Methoden durchgeführt werden (s. z. B. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Dafür geeignete Vektoren, einschließlich expressionsfördernder Sequenzen, sind bekannt und bei J. Sambrook et al. beschrieben. Die für das ER-Protein oder DR- Protein kodierende DNA ist vorzugsweise stabil in das Genom der Säugetierzelle integriert.

Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren können ohne weiteres in vitro, beispielsweise nach Entnahme eines geeigneten Zellmaterials aus dem zu untersuchenden Patienten oder durch Verwendung von in Kultur gebrachten Zellen, durchgeführt werden. Insbesondere für das erfindungsgemäße Testverfahren zum Screenen potentiell therapeutisch wirksamer Substanzen sind bevorzugt etablierte Zelllinien, die für den jeweiligen Krankheitszustand spezifisch sind, in geeigneter Weise einzusetzen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von erläuternden, jedoch nicht einschränkenden Beispielen näher beschrieben.

Beispiel 1 Klonierung einer ER- bzw. DR-Protein kodierenden DNA

Die molekulare Klonierung wurde am Beispiel von YT521-B unter Verwendung von Standard-Protokollen (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) durchgeführt. Reverse Transkriptase (RT)-PCR wurde wie von A. M. Hartmann und S. Stamm (Biochem. Biophys. Res. Com. Vol. 1353, S. 224-230 (1997)) durchgeführt. Genbanken aus Rattenhirn, und zwar zum einen postnatal (5. Tag) und zum anderen im embryonischen Zustand nach 16 Tagen, wurde einem Doppelhybrid-Screening unter Verwendung einer htra2-β pGBT9- Sonde (B. Beil et al., DNA and Cell Biol., Vol. 16, S. 679-690 (1997)) als Köder. Der Hefe-Gal4-Doppelhybrid-Screen wurde gemäß S. Fields und O. Song. (Nature Vol. 340, S. 245-247 (1989)) unter Verwendung des Stamms HF7c durchgeführt. Für jeden Screen wurden etwa 6 × 10⁶ Transformanten mit 100 µg Köder(bait)-DNA und 50 µg Beute(prey)-DNA gescreent. Um eine Wechselwirkung von YT521-B mit anderen Proteinen zu testen, wurde 1 µg der mit der Gal4-Aktivierungsdomäne fusionierten YT521-B und 1 µg von SAF-B, htra2-beta, hnRNP-G, p62/SAM68 sowie mit der Gal4-Bindungsdomäne fusioniertes YT521-B wurden cotransformiert und auf Dreifach-Dropout- Platten, denen Leucin, Tryptophan und Hystidin fehlten, plattiert. Überlebende Kolonien wurden wiederholt auf Dreifach-Dropout-Platten abgestreift, welche mit 10 mM 3-Aminotriazol supplementiert waren.

DNA wurde aus His-autotrophen und lacZ-positiven Kolonien (C. S. Hoffmann und F. Winston, Gene, Vol. 57, S. 267-272 (1987)) isoliert, mittels Elektroporation in HB101-Zellen eingebracht, wonach auf Ampicillin-Platten selektiert wurde. Resistente Kolonien wurden auf M9-Platten ohne Leucin rück­ abgestrichen, um Köder-Plasmid zu entfernen (S. M. Hollenberg et al., Mol. Cell Biol., Vol. 15, S. 3813-3822 (1995)). DNA aus den autotrophen Bakterien wurde isoliert und unter Verwendung eines automatischen Sequenzierers (ABI-Sequencer) sequenziert. Die DNA-Sequenzen wurden mit dem GCG-Wisconsin Software-Paket (Genetics Computer Group, Program Manual for Wisconsin Package, Version 8, Medicine, Wisconsin (1994)) analysiert.

Zwei cDNA-Klone, YT521TH-pADgal4 und YT521ΔN10-pADGal4, wurden erhalten. Da keine der Klone eine komplette cDNA enthielt, wurde eine Schnell-Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) zur Amplifizierung der fehlenden 5'-Enden (Marathon cDNA amplification kit; Clontech) durchgeführt. Ein Vergleich mit den vollständigen RACE-Klonen zeigte, dass dem erstgenannten Klon die ersten 253 Aminosäuren und dem zweitgenannten Klon die ersten 10 Aminosäuren fehlten. YT521TH-B und YT521ΔN10 wurden in Form eines EcoRI/SacII- Fragments in pEGFP-C2 (Clontech) und in Form eines EcoRI/PstI-Fragments in pGBT9 (Clontech) geklont. Restriktions-Schnittstellen wurden eingeführt mittels PCR- Amplifikation mit den Oligonukleotiden yt521eco-f1: CCGAATTCTATGAACAGGATGAGAGAGATC (SEQ ID Nr. 1), yt521-sacII-r: CCCCGCGGACATTATCTTCGATAACGACCTCTTTCC (SEQ ID Nr. 2) und yt521pstI-r: TCTGCAGGGTTTTTCTGGTTGACT (SEQ ID Nr. 3).

Eine ähnlich zu der obigen Prozedur durchgeführte Klonierung durch Y. Imai, et al., Mol. Brain Res. Vol. 53, S. 33-40 (1998)) führte kürzlich zur Isolierung einer ähnlichen cDNA, YT521.

Die Gesamt-Domänenstruktur des gefundenen ER-Proteins YT521-B ist in Fig. 3A gezeigt. Die aminoterminale, Glutaminsäure- reiche Region, die carboxyterminale Prolin-reiche Region und die charakteristische Glutaminsäure/Amin-reiche Region sind durch schattierte Kästchen angezeigt. Die Kästchen mit arabischen Nummern bezeichnen die vier nukleären Lokalisierungssignal-Sequenzen. Die Buchstaben "A" und "B" bezeichnen die Insertionen, die wahrscheinlich mittels alternativem Spleißen generiert sind. Die detaillierten Sequenzen der Insertionen A und B sind unterhalb der Darstellung der Gesamtdomänen-Struktur angegeben (sowohl DNA- als auch Einbuchstaben-Aminosäuresequenz). Das Protein YT521-B unterscheidet sich von YT521 durch diese Insertionen A und B. Die Gesamtsequenz von YT521-B wurde in der Genbank unter der Zugangsnummer AF144731 abgelegt.

Northern-Blot-Analysen in-situ Hybridisierungsstudien an Hirngewebeschnitten zeigten, dass YT521-B in verschiedenen Gewebearten (Herz, Gehirn, Niere, Lunge, Leber, Muskel, Milz und Testis (Hoden) vorkommt, wobei verschiedenen Isoformen aufgrund alternativen Spleißens entdeckt wurden), wobei im Gehirn eine Zelltyp-spezifische Expression charakteristisch war.

Beispiel 2 Herstellung von Antikörpern gegen ER- bzw. DR-Proteine

Antikörper wurden mittels herkömmlicher Methoden gegen antigene Strukturen der ER- bzw. DR-Proteine gewonnen. Beispielsweise wurde ein gegen YT521B spezifischer, polyklonaler Antikörper aus Ratte entwickelt, gegen eine Mischung zweier YT521-B-spezifischer Polypeptide, die jeweils mit dem Keyhole-Limpet-Hemocyanin fusioniert worden waren, und zwar Polypeptid Nr. 1: RSARSVILIFSVRESGKFQCG (SEQ ID Nr. 4), und Polypeptid Nr. 2: KDGELNVLDDILTEVPEQDDECG (SEQ ID Nr. 5).

Beispiel 3 Immunocytologische Bestimmung von ER- bzw. DR-Proteinen 1. Zellkultur

Zellen, wie HEK293, COS7-Zellen oder BHK-Zellen, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), zu dem 10 (v/v)-% fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt war, gehalten. Die humane Brustkrebs-Zelllinie MCF7 wurde in RPMI 1640, welches mit 10% (v/v) FCS supplementiert war, gehalten. Für immunologische Anfärbeexperimente wurden Zellen auf Glas- Abdeckplättchen in 6 cm-Zellkultur-Gefäßen wachsen gelassen.

2. Zellkern-Extraktion

Zellkern-Extraktionen wurden wie beschrieben (s. z. B. M. Patturajan et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 1998, S. 2406-2415) durchgeführt. Kurz gesagt wurden Zellen in Tris-gepuffertem Salz (TBS-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂), welches 0,5% Triton-X 100 und 0,5 mM PMSF enthielt, permeabilisiert. Die Zellen wurden dann in TBS alleine, in TBS mit 20 U/ml Benzonase oder in TBS mit 4 U/ml DNase-freier RNase inkubiert (die Enzyme wurden von Sigma bezogen). Schließlich wurden Zellen mit TBS/0,2 M Ammoniumsulfat extrahiert, in 3,7%- Formaldehyd/Phosphat-gepuffertem Salz (PBS) für 5 Minuten fixiert und ggf. mit dem Farbstoff Hoechst Nr. 33258 in einer Konzentration von 1 µg/ml PBS inkubiert.

3. Zellzyklusanalyse

Zellen wurden auf 60-80% Konfluenz wachsen gelassen und mit 0,5 µg/ml Nocodazol für 4 Stunden in der G2/M-Phase blockiert. Mitose-Zellen wurden dann mittels Auffangen auf dem Zellkulturgefäß entfernt, gewaschen und auf Glas- Abdeckplättchen ausgesät (D. L. Spector et al. in Cells: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)). Die Zellen wurden für 6, 13, 18 und 24 Stunden vor der Fixierung inkubiert.

4. Immunocytische Anfärbung

1 × 10⁵ zu untersuchende Zellen wurden auf einem Glas- Abdeckplättchen in 3,5 cm-Kulturschälchen für 24 h vor der Fixierung und Immuno-Anfärbung wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann in 3,7%-Formaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, dreimal in PBS/0,1% Triton-X100 gewaschen und in PBS/0,1% Triton-X 100/3% Rinder-Serumalbumin für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden dann mit dem entsprechenden Antikörper, hier dem gemäß Beispiel 2 erhaltenen Antikörper gegen YT521-B, über Nacht bei 4°C in PBS/0,1% Triton-X 100/3% Rinder-Serumalbumin inkubiert und dreimal mit PBS/0,1% Triton-X 100 gewaschen. Die Zellen wurden dann mit CY3-konjugiertem Sekundär- Antikörper (Dianova) in PBS/0,1% Triton-X 100 für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dreimal in PBS/0,1% Triton- X 100 gewaschen und auf Glasplättchen in Fluormount (Dianova) angeheftet. Die Zellen wurden entweder durch Laserscanning- Flureszenzmikroskopie (Leica) oder durch herkömmliche Mikroskopie, gefolgt von einem Deconvolutionsvorgang unter Verwendung der Openlab-Software (Improvision), untersucht.

Beispiel 4 Krebsdiagnose am Beispiel von Brustkrebs

1 × 10⁶ der humanen Brustkrebs-Zelllinie MCF7 wurden in 10 cm-Zellkulturschalen, die 4 Glas-Abdeckplättchen enthielten, ausgesät und für 24 h wachsen gelassen. Nach weiteren 48 h wurden die Glas-Abdeckplättchen entfernt und die Zellen wie in Beispiel 3, Punkt 4 beschrieben, fixiert und mittels dem in Beispiel 2 beschriebenen Antikörper angefärbt.

Die Immunfluoreszenz-Untersuchung mittels Laserscanning- Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine diffuse nukleäre Anfärbung des endogenen ER-Proteins in den unbehandelten MCF7-Zellen; es waren keine definierte, nukleäre Bereiche lokalisierbar (s. Fig. 2B links). Im Vergleich zeigten normale Zellen (hier: BHK- und COS-Zellen) die charakteristische punktuelle Anfärbung ("Dots"), die im Zellkern lokalisiert werden konnten (s. Fig. 2A).

Beispiel 5 Zelldifferenzierung und therapeutische Behandlung

Um zu zeigen, dass der Nachweis von ER- bzw. DR-Proteinen zum Studium von Zell-Differenziation und zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen geeignet ist, wurden MCF7- Zellen wie im Beispiel 4 beschrieben wachsen gelassen und mit unterschiedlichen Agentien behandelt.

Hierzu wurden nach Aussäen und 24 h-Wachstum die MCF7-Zellen mit Tamoxifen (5 µM), Natriumbutyrat (1 µM) oder Phorbol-12- myristat-13-acetat (PMA, 1 µg/ml) für weitere 48 h inkubiert. Dann wurden die Zellen fixiert und mit dem gegenüber YT521-B spezifischen Antikörper angefärbt, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Fig. 2B (rechte Spalte) zeigt, dass in den Tumorzellen nach Behandlung durch das Antitumormittel Tamoxifen die charakteristischen nukleären Bereiche mittels der ER- bzw. DR-Protein-Anfärbung wieder lokalisierbar waren. Dasselbe geschah nach Behandlung mit den Differenzierungs-Agentien Natriumbutyrat und PMA (Fig. 2B, mittlere Spalten).

Ferner zeigte sich, dass nukleäre ER- bzw. DR-Protein-spe­ zifische Bereiche bei Zellzyklus-Studien während der mittleren bis späten G1-Phase sowie während der S-Phase, jedoch nicht während der G2/M-Phase und der frühen G1-Phase lokalisierbar waren. Zur Kontrolle wurden die Differen­ zierungszustände mit herkömmlicher Anfärbung durch Ölrot O nach Fixierung der Zellen mit 2% Formaldehyd und anschließender Beobachtung mittels Phasenkontrastmikroskopie verifiziert.

Somit konnte gezeigt werden, dass die ER- bzw. DR-Proteine sowie deren Bestimmungen ausgezeichnet als. Marker nutzbar waren. Dies nicht nur zur Diagnose von krankhaften Zuständen, sondern auch zur Identifizierung des Differenzierungs- Zustandes und/oder des Zellzyklus-Zustandes einer Zelle sowie zum Testen von potentiell therapeutisch wirksamen Substanzen oder Agentien.

Beispiel 6 Transfektion bzw. Transformation mit ER- bzw. DR-Protein-ko­ dierender DNA

3 × 10⁵ Zellen (z. B. HEK293-, COS7- oder BHK-Zellen) wurden in einer 3,5 cm-Kulturschale ausgesät und mit einer geeigneten Menge an Plasmid-Konstrukt, welches die ER- bzw. DR-Protein-kodierende DNA enthielt, einer Transfektion bzw. Transformation unterworfen. So wurden HEK293-Zellen mit 0,5 µg-1 µg Plasmid-DNA unter Verwendung der Kalzium- Präzipitations-Methode wie beschrieben (O. Nayler et al., Biochem. J., Vol. 326, S. 693-700 (1997)) transformiert. Die Zellen wurden 24 h nach der Transfektion geerntet. COS7- oder BHK-Zellen wurden mit 10 µl Superfect-Reagens (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Herstellerinstruktionen unter Verwendung von 1,5 µg Plasmid-DNA (0,5 µg des klonierten Konstrukts sowie 1 µg an leerem Carrier-Vektor) transformiert. Als Expressions-Konstrukte wurden z. B. der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pEGFP-YT521-B verwendet.

Beispiel 7 Bestimmung der Transskriptionsaktivität einer Zelle

Cytologische Untersuchungen ergaben, dass die charakteristischen nukleären Bereiche konzentrierter ER- bzw. DR-Proteine mit fokalen Transskriptionsstellen co­ lokalisierten. Um die Transskriptions-Aktivität einer Zelle im Hinblick auf ER- bzw. DR-Proteine als Marker beurteilen zu können, wurde der Einfluss von bekannten Transskriptions- oder Translations-Inhibitoren untersucht.

Zu diesem Zeck wurden COS7-Zellen, die nach dem im Beispiel 6 beschriebenen Verfahren EGFP-YT521-B als Beispiel für ein Protein, welches ER-reiche Domänen enthält, transient exprimierte, eingesetzt und einer Behandlung unterschiedlicher Inhibitoren unterworfen. Zu den einzelnen Behandlungsmitteln gehörten α-Amanitin (blockiert die Transskription durch dessen direkte Inhibition der RNA- Polymerase II; Bedingungen: 50 µg/ml für 5 h), 5,6-Dichloro- 1-β-ribofuranosyl-benzimidazol ("DRB", blockiert die Transskription durch Inhibierung einer Kinase in der oberen Signalkette für die RNA-Polymerase II; Bedingungen: 75 µm DRB für 3 h), Cycloheximid ("Cyclo", blockiert lediglich die RNA- Polymerase I; Bedingungen: 100 µg/ml für 5 h) sowie Akinomycin D ("ActD", bindet an GC-reiche doppelsträngige DNA, erlaubt die RNA-Initiation, blockert jedoch die RNA-Elongation; Bedingungen: (a) 0,04 µg/ml für 3 h ("ActD niedrig"), (b) 50 µg/ml für 3 h ("ActD hoch"), und (c) wie (b), jedoch 2 h Inkubation nach Entfernung der hohen ActD-Konzentration ("ActD hoch + befreit").

Die Ergebnisse sind in Fig. 4 graphisch dargestellt, wobei der Prozentsatz an Zellen, bei denen ER- bzw. DR-Domänen lokalisierbar waren, aufgetragen sind in Bezug auf die Behandlung der vorstehend genannten Inhibitoren gegenüber einem unbehandelten Standard. Der Anteil positiver Zellen wurde Fluoreszenz-mikroskopisch bestimmt durch Zählen einzelnen Zellen in drei unabhängigen Experimenten pro Standard bzw. Inhibitor-Ansatz. Die Daten zeigen die Durchschnittswerte der drei unabhängigen Experimente (+/- Standardabweichung), wobei jeweils 150 Zellen gezählt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass Actinomycin D die definierten, ER- bzw. DR-Protein-spezifischen Bereiche im Zellkern auflöst. Diese Empfindlichkeit gegenüber Akinomycin D ist jedoch reversibel, da eine Befreiung der Zellen von diesem Inhibitor die nukleären, lokalisierbaren Bereiche wieder ansteigen lässt. Eine niedrige Actinomycin-Konzentration oder eine Cycloheximid-Behandlung zeigte jedoch keine Veränderung in der Zahl der Zellen, in denen nukleäre Bereiche von ER- bzw. DR-Proteinen lokalisierbar waren. α-Amanitin zeigte lediglich eine geringfügige Verminderung des Anteils an Zellen, die in Bezug auf nukleäre, ER- bzw. DR-Protein- spezifische Bereiche positiv warn.

Die erfindungsgemäße Bestimmung der ER- bzw. DR-Protein kann daher auch sehr nützlich zur Bestimmung der Transskriptions­ aktivität einer Zelle eingesetzt werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (25)

1. Verfahren zur Diagnose von Krebserkrankungen und/oder neurodegenerativen Krankheitszuständen, dadurch gekennzeichnet, dass Proteine mit Glutaminssäure/Arginin-reichen oder Asparaginsäure/Arginin-reichen Domänen (ER- Proteine bzw. DR-Proteine) bestimmt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Untersuchung einschließt, ob oder inwieweit ER- oder DR-Proteine in zellulären, nukleären Bereichen lokalisierbar sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der ER- oder DR-Proteine immuncytometrisch erfolgt.

4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Verfahren bestimmten ER- oder DR-Proteine solche sind, die beim pre-mRNA-Spleißvorgang und/oder bei der Bildung des transkriptosomalen Komplexes beteiligt sind.

5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das im Verfahren bestimmte ER- Protein YT521 oder dessen Spleiß-Variante YT521-B ist.

6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Brustkrebs diagnostiziert wird.

7. Verfahren zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität, des Differenzierungsstadiums oder des Zellzyklusstadiums einer Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass Proteine mit Glutaminssäure/Arginin-reichen oder Asparaginsäure/Arginin-reichen Domänen (ER-Proteine bzw. DR-Proteine) bestimmt werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Bestimmung wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 angegeben erfolgt.

9. Verfahren zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen, umfassend die Untersuchung einer Veränderung an Proteinen mit Glutaminssäure/Arginin-reichen oder Asparaginsäure/Arginin-reichen Domänen (ER-Proteine bzw. DR- Proteine) infolge einer Einwirkung durch die gegebenenfalls therapeutisch wirksame Substanz.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass therapeutisch wirksamen Substanzen gegen Krebserkrankungen und/oder neurodegenrative Krankheitszustände getestet werden.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass untersucht wird, ob oder inwieweit sich die Lokalisation der ER- oder DR-Proteine in zellulären, nukleären Bereichen ändert.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die im Verfahren untersuchten ER- oder DR-Proteine solche sind, die beim pre-mRNA-Spleißvorgang und/oder bei der Bildung des transkriptosomalen Komplexes beteiligt sind.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das im Verfahren untersuchte ER-Protein YT521 oder dessen Spleiß-Variante YT521-B ist.

14. Antikörper, welcher spezifisch ist gegen ein Protein mit Glutaminssäure/Arginin-reicher oder Asparaginsäure/Arginin-reicher Domäne (ER-Protein bzw. DR-Protein).

15. Antikörper gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das ER- oder DR-Protein ein solches ist, welches beim pre-mRNA-Spleißvorgang und/oder bei der Bildung des transkriptosomalen Komplexes beteiligt ist.

16. Antikörper gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das ER-Protein YT521 oder dessen Spleiß-Variante YT521-B ist.

17. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, einem Verfahren gemäß Anspruch 7 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 9.

18. Säugetierzelle, die durch eine DNA transformiert ist, die für ein Protein mit Glutaminssäure/Arginin-reicher oder Asparaginsäure/Arginin-reicher Domäne (ER-Protein bzw. DR- Protein) kodiert.

19. Säugetierzelle gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA für ein ER- oder DR-Protein kodiert, welches beim pre-mRNA-Spleißvorgang und/oder bei der Bildung des transkriptosomalen Komplexes beteiligt ist.

20. Säugetierzelle gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA für das ER-Protein YT521 oder dessen Spleiß-Variante YT521-B kodiert.

21. Säugetierzelle gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA zur Transformation in einem zur Transformation geeigneten Vektor insertiert ist.

22. Säugetierzelle gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass in den Vektor zusätzlich eine DNA insertiert ist, die für ein Detektionsmarkerprotein kodiert.

23. Säugetierzelle gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie menschlichen Ursprungs ist.

24. Verwendung einer Säugetierzelle gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23 in einem Verfahren zum Testen von therapeutisch wirksamen Substanzen.

25. Verwendung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die getesteten Substanzen gegen Krebserkrankungen und/oder neurodegenrative Krankheitszustände wirksam sein sollen.