DE10013600A1 - Reaktive Monomere für die Oligonucleotid- und Polynucleotidsynthese, modifizierte Oligonucleotide und Polynucleotiden und ein Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents
Reaktive Monomere für die Oligonucleotid- und Polynucleotidsynthese, modifizierte Oligonucleotide und Polynucleotiden und ein Verfahren zu deren HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Oligonucleotide und Polynucleotide, die mit mindestens einer
Acetal- oder Aldehydgruppe modifiziert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung
solcher modifizierter Oligonucleotide und Polynucleotide und die dazu nötigten
neuartigen monomeren Bausteine.
Aldehyde sind reaktive Gruppen, die für die Konjugation von Biomolekülen mit z. B.
Fluorophoren, Reporter-Gruppen, Proteinen, Nucleinsäuren und anderen
Biomolekülen, kleinen Molekülen (wie Biotin) aber auch für die Immobilisation von
Biomolekülen auf Oberflächen verwendet werden (dazu exemplarisch: Hermanson,
G. T.; Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego 1996; Timofeev, E. N.;
Kochetkova, S. V.; Mirzabekov, A. D.; Florentiev, V. L., Nucleic Acids Res. 24 (1996)
3142). Da weder Proteine noch Nucleinsäuren in ihrer natürlichen Form Aldehyde
tragen sind diese für eine gezielte Modifikation der Biomoleküle besonders geeignet.
Kohlenhydrate, welche zwar ihrer Natur nach Aldehyde sind, liegen meist als
(cyclische) Acetale oder Halbacetale vor und weisen in dieser Form auch nicht die
typische Aldehyd-Reaktivität auf. Sie lassen sich deshalb ebenfalls für gerichtete
Konjugationen mit Aldehyden verwenden. Beispiele für Reaktionen von Aldehyden
aus dem Stand der Technik, die zur Konjugation von Biomolekülen verwendet
werden können sind in Fig. 1 Reaktionen A und B aufgeführt.
Gegenwärtig stehen zur Einführung von Aldehyden in Oligonucleotide
unterschiedliche Wege zur Verfügung, die allesamt auf einer Oxidation eines
vicinalen Diols mit Natriumperiodat zum Aldehyd bzw. zu einem bis-Aldehyd
beruhen.
Als erstes ist die Oxidation von Oligonucleotiden mit 3' terminalem Ribonucleotiden
zu erwähnen (siehe dazu Timofeev, E. N.; Kochetkova, S. V.; Mirzabekov, A. D.;
Florentiev, V. L., Nucleic Acids Res. 24 (1996) 3142; Lemaitre, M.; Bayard, B.;
Lebleu, B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (1987) 648). Bei diesem Weg wird ein
Ribonucleotid welches das 3' Ende eines Oligonucleotis bilded durch Periodat zu
einem bis-Aldehyd oxidiert. Dieser Aldehyd bildet dann mit Aminen oder Hydraziden
cyclische Addukte (Morpholin Struktur) die zur Konjugation verwendet werden
können.
Entscheidender Nachteil dieser Methode ist, daß immer ein Nucleotid des 3'-Endes
eines Oligonucleotids für die Konjugation geopfert werden muß. Außerdem bietet
dieser Ansatz nicht die Möglichkeit den Abstand des Oligonucleotids zum
Konjugationspartner zu verändern.
Die zweite Möglichkeit liegt in der Kopplung eines Phosphoramidits eines
geschützten vicinalen Diols an das 5' Ende eines Oligonucleotids (Lemaitre, M.;
Bayard, B.; Lebleu, B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (1987) 648). Hier wird ein
speziell hergestellter Baustein welcher eine maskierte vicinale Diolgruppe trägt an
das 5' Ende eines Oligonucleotids gekoppelt. Nach der Synthese, Entschützung und
Aufarbeitung des Oligonucleotids liegt dann eine vicinale Diolgruppe vor, die
ebenfalls mit Periodat zum Aldehyd oxidiert wird.
Weiterhin ist die Verwendung eines modifizierten Nucleotids oder Nucleotid-
Analogons welches in einer Seitenkette ein geschütztes vicinales Diol trägt zur
Einführung einer Aldehydgruppe in ein Oligonucleotid Stand der Technik
(Dechamps, M.; Sonveaux, E., Nucleosides Nucleotides 14 (1995) 867; Dechamps,
M.; Sonveaux, E., Nucleosides Nucleotides 17 (1998) 697; Trevisiol, E.; Renard, A.;
Defrancq, E.; Lhomme, J., Tetrahedron Lett. 38 (1997) 8687). Dieser Weg erfordert
allerdings einen erheblichen synthetischen Aufwand.
Allen drei Wegen gemeinsam ist, daß die Erzeugung des Aldehyds durch Oxidation
eines vicinalen Diols mit Natriumperiodat erfolgen muß. Dieses Reagenz muß dann
vor der Konjugationsreaktion entfernt werden. Weiterhin ist dieser Weg inkompatibel
für Moleküle welche andere durch Periodat oxidierbare Gruppen tragen. So ist es
beispielsweise unmöglich gezielt das 5'-Ende eines RNA Stranges zu modifizieren,
ohne daß auch das 3' Ende des Oligonucleotids oxidiert wird.
Hieraus ergibt sich der Bedarf für einen alternativen Zugang zu Aldehyd-
Modifizierten Oligonucleotiden ohne Periodat-Oxidation.
Weiterhin ist zu beachten, daß Aldehyde als reaktive Spezies nicht unbegrenzt
lagerstabil sind. Insbesondere die spontane Oxidation an der Luft führt zu ihrer
Zersetzung. Daher ist es zweckmäßig, Aldehyde erst unmittelbar vor ihrer
Verwendung herzustellen. In diesem Zusammenhang wäre ein möglichst einfaches
Verfahren zu ihrer Herstellung vorteilhaft, welches sich leicht und ohne großen
Aufwand aus lagerstabilen Edukten durchführen läßt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung von reaktiven
Monomeren, die kompatibel zu den Bedingungen der Oligonucleotid- und
Polynucleotidsynthese sind, sowie die Herstellung und die Bereitstellung von
modifizierten Oligo- und Polynucleotiden, die leicht handhabbar und einfach in ihre
entsprechenden Aldehydgruppen enthaltenden Derivate umwandelbar sind.
Die Aufgabe wird durch neuartige monomere Acetale und acetal-modifizierte
Oligonucleotide und Polynucleotide gelöst, die sehr gut lagerbar sind und einen
einfachen Zugang zu aldehyd modifizierten Oligo- und Polynucleotiden bieten.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen monomere Acetale, sowie die acetal-
modifizierten Oligonucleotide und Polynucleotide stabil gegenüber den Bedingungen
der Standardmethoden zur Oligo- und Polynucleotid-Synthese oder -Vervielfältigung,
wie z. B. der Phosphoramiditmethode oder der PCR, und den
Reaktionsbedingungen bei der Einbringung und Entfernung von gängigen
Schutzgruppen.
Somit ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein reaktives Monomer der
Formel (I), worin I, v unabhängig voneinander gleich 0 oder 1 und a gleich einer
ganzen Zahl zwischen 1 und 5, bevorzugt 1 bis 3 ist
X-Ll-Vv-(A)a (I)
und worin
X eine reaktive phosphorhaltige Gruppe für die Oligonucleotid-Synthese wie z. B. ein Phosphoramidit (II) oder wie ein Phosphonat (III)
X eine reaktive phosphorhaltige Gruppe für die Oligonucleotid-Synthese wie z. B. ein Phosphoramidit (II) oder wie ein Phosphonat (III)
mit R2 und R3 unabhängig voneinander gleich Alkyl, wobei Alkyl für einen
verzweigt oder unverzweigten C1 bis C5-Rest, vorzugsweise einen iso-
Propyl und R1 für Methyl, Allyl (-CH2-CH=CH2) oder bevorzugt β-Cyanoethyl
(-CH2-OH2-CN) steht.
und worin
V eine Verzweigungseinheit mit mindestens drei Bindungspartnern, beispielsweise ein Atom oder eine Atomgruppe, bevorzugt ein Stickstoffatom, Kohlenstoffatom oder ein Phenylring ist
und worin A ein Acetal der Formel (IV) ist,
und worin
V eine Verzweigungseinheit mit mindestens drei Bindungspartnern, beispielsweise ein Atom oder eine Atomgruppe, bevorzugt ein Stickstoffatom, Kohlenstoffatom oder ein Phenylring ist
und worin A ein Acetal der Formel (IV) ist,
wobei Y und Z unabhängig voneinander gleiche oder verschiedene
verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls
cyclische, C1 bis C18 Kohlenwasserstoffe, bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl,
Iso-Propyl, n-Butyl, 2-Butyl, tert-Butyl, insbesondere bevorzugt Ethyl,
darstellen, oder worin Y und Z gemeinsam ein Rest der Struktur (V) oder (VI)
wobei R4 unabhängig voneinander gleich oder verschieden H, Methyl,
Phenyl, ein verzweigter oder unverzweigter gesättigter oder ungesättigter,
gegebenenfalls cyclischer C1 bis C18 Kohlenwasserstoff oder ein Rest der
Struktur (VII) ist, mit R5 gleich oder verschieden H, Methyl, Alkyl, O-Methyl,
O-Alkyl, oder Alkyl, wobei Alkyl für einen verzweigten oder unverzweigten,
gesättigten oder ungesättigten, gegebenenfalls cyclischen C1 bis C18
Kohlenwasserstoff steht
und worin
L Linker sind, die geeignet sind X mit A zu verknüpfen oder X mit V und V mit A zu verknüpfen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls cyclische C1 bis C18 Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Alkyl-(CnH2n)- mit n gleich einer ganze Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 3 bis 8, oder gleich einem Polyether (CH2)k-[O-(CH2)m]o-O-(CH2)p- mit k, m, p unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise 2, und o gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 8, vorzugsweise 2 bis 4, oder gleich einem Amin- (CH2)w-NH-(CH2)u- mit w und u unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 3 bis 6, oder gleich einem Amid (CH2)q-C(O)-N-(CH2)r- oder -(CH2)q-N-C(O)-(CH2)r- mit q und r unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 1 bis 5. Die Linker L können dabei über Sauerstoffatome an die Verzweigungseinheit V geknüpft sein.
L Linker sind, die geeignet sind X mit A zu verknüpfen oder X mit V und V mit A zu verknüpfen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, gegebenenfalls cyclische C1 bis C18 Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Alkyl-(CnH2n)- mit n gleich einer ganze Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 3 bis 8, oder gleich einem Polyether (CH2)k-[O-(CH2)m]o-O-(CH2)p- mit k, m, p unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise 2, und o gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 8, vorzugsweise 2 bis 4, oder gleich einem Amin- (CH2)w-NH-(CH2)u- mit w und u unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 3 bis 6, oder gleich einem Amid (CH2)q-C(O)-N-(CH2)r- oder -(CH2)q-N-C(O)-(CH2)r- mit q und r unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise 1 bis 5. Die Linker L können dabei über Sauerstoffatome an die Verzweigungseinheit V geknüpft sein.
Einzelne bevorzugte Beispiele für derartige reaktive Monomere sind:
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mono-, Oligo- und Polynucleotide
beliebiger Sequenz, die mit mindestens einer Acetalgruppe modifiziert sind.
Bevorzugt sind vor allem Mono-, Oligo- und Polynucleotide, die unter Verwendung
mindestens eines erfindungsgemäßen reaktiven Monomeren der Formel (I) erhältlich
sind.
Erhältlich sind z. B. Substanzen der Formel VIII mit beliebiger Sequenz, die mit
mindestens einer Acetalgruppe modifiziert sind,
(M)s[-X'-LlVv(A)a]z (VIII)
wobei (M)s s miteinander verknüpfte Monomereinheiten, mit s größer oder gleich 1
darstellen, X' eine phosphorhaltige Gruppe der Formel (IX) ist
wobei, U für O oder S, W für OH, SH oder H und Q für O oder NH steht und z größer
oder gleich 1 ist
und I, v, a, L, V und A die oben genannte Bedeutung haben.
und I, v, a, L, V und A die oben genannte Bedeutung haben.
Wobei die Verknüpfung der erfindungsgemäßen reaktiven Monomere mit dem
Mono-, Oligo- oder Polynucleotid bevorzugt über Phosphordiester-, H-Phosphonat-,
Phosphorothioat-, Phosphorodithioat- oder Phosphoroamidatgruppen der X'-Formen
erfolgt.
Dabei kann das reaktive Monomer der Formei (I) gezielt endständig angehängt
werden. Damit hängt z vom Verzweigungsgrad der Nucleotidkette ab, bevorzugt liegt
z zwischen 1 und 10, besonders bevorzugt ist z 1 oder 2. Ein Vorteil der Erfindung
ist darüber hinaus die Möglichkeit ein reaktives Monomer selektiv an das 3'-
und/oder 5'-Ende eines DNA- oder RNA Oligon- oder Polynucleotids oder an das
2' und/oder 4'-Ende eines p-DNA oder p-RNA Oligo- oder Polynucleotids
anzuhängen. Im Gegensatz dazu werden freie Diolgruppen bei der Reaktion mit
Periodat vollständig oxidiert.
Als Oligonucleotide bzw. Polynucleotide gelten alle natürlich vorkommenden aber
auch synthetisch hergestellten Polymere, die die Fähigkeit einer molekularen
Erkennung oder Paarung besitzen und einen repetitiven Aufbau meist unter
Beteiligung von Phosphorsäurediester Brücken aufweisen. Kennzeichen dieser
molekularen Erkennung oder Paarung ist, daß sie selektiv, stabil und reversibel ist
und daß sie z. B. durch Temperatur, pH-Wert und Konzentration beeinflußt werden
kann. Die molekulare Erkennung wird beispielsweise, aber nicht ausschließlich,
durch die Paarung von Purin- und Pyrimidin Basen nach den Watson Crick Regeln
erreicht. Beispiele für natürlich vorkommende Nucleotidketten sind DNA, cDNA und
RNA in welchen Nucleoside, bestehend aus 2-Desoxy-D-ribose bzw. D-Ribose mit
N-glycosidisch verknüpften hetrocyclischen Basen, über Phosphorsäurediester
verknüpft sind. Bevorzugte Beispiele für nicht natürliche Oligo- und Polynucleotide
sind die chemisch modifizierten Abkömmlinge der DNA, cDNA und RNA wie z. B.
deren Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Methylphosphonate, 2'-O-Methy-RNA,
2'-O-Allyl-RNA, 2'-Fluoro-RNA, LNA oder solche Moleküle, die wie PNA eine
Paarung mit DNA und RNA eingehen können (Sanghivi, Y. S., Cook, D. P.,
Carbohydrate Modification in Antisense Research, American Chemical Society,
Washington 1994) aber auch solche Moleküle, welche wie beispielsweise p-RNA,
Homo DNA, p-DNA, CNA (DE 197 41 715, DE 198 37 387 und WO 97/43232), die zu
einer molekularen Erkennung über spezifische Paarungseigenschaften fähig sind.
Die Kettenlänge reicht bevorzugt, inklusive einem monomeren Baustein gemäß
Anspruch 1, von 2 bis 10000 Monomereinheiten, besonders bevorzugt sind
Kettenlängen von 5 bis 30 Monomereinheiten.
Als Monomereinheiten, die zur Herstellung der Oligo- oder Polynucleotide verwendet
werden können, kommen vor allem natürlich vorkommende Nucleotide, wie
Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide, in Frage. Aber auch nicht natürlich
vorkommende, synthetische Nucleotide können verwendet werden.
Bevorzugte Beispiel synthetischer Monomereinheiten sind 2'-
Desoxyribofuranosylnucleotide, Ribofuranoslynucleoside, 2'-Desoxy-2'-flouro
ribofuranosylnucleoside, 2'-O-Methyl-ribofuranosylnuceoside,
pentopyranosylnucleotide, 3'-Desoxypentopyranosylnucleotide.
Als heterocyclische Basen für diese Nucleotide kommen unter anderem in Frage:
Purin, 2,6-Piaminopurin, 6-Purinthiol, Pyridin, Pyrimidin, Adenosin, Guanosin,
Isoguanosin, 6-Thioguanosin, Xanthin, Hypoxanthin, Thymidin, Cytosin, Isocytosin,
Indol, Tryptamin, N-Phthaloyltryptamin, Uracil, Coffein, Theobromin, Theophyllin,
Benzotriazol oder Acridin sowie derivate dieser Heterocyclen welche weitere
kovalent verknüpfte funktionelle Gruppe tragen.
Auch andere monomere Einheiten, wie natürliche und nicht natürliche Aminosäuren,
PNA-Monomere und CNA-Monomere, können ebenfalls eingesetzt werden.
Zu Oligo- und Polynucleotiden im Sinne dieser Erfindung gehören auch solche
Moleküle, welche neben den zur molekularen Erkennung notwendigen Einheiten
weitere molekulare Teile enthalten, die zu anderen Zwecken, wie beispielsweise der
Detektion, der Konjugation mit anderen molekularen Einheiten, der Immobilisation
auf Oberflächen oder auf anderen Polymeren, der Abstandshaltung oder der
Verzweigung der Nucleotidkette dienen. Insbesondere sind hierunter die kovalenten
oder stabil nichtkovalenten Konjugate von Oligonucleotiden mit
Fluoreszenzfarbstoffen, chemolumineszierenden Molekülen, Peptiden, Proteinen,
Antikörpern, Aptameren, organischen und anorganischen Molekülen zu verstehen
sowie Konjugate aus zwei oder mehr Paarungsystemen welche unterschiedliche
Paarungsmodi aufweisen wie p-RNA konjugiert mit DNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge, p-RNA konjugiert mit RNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge, p-DNA konjugiert mit DNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge, p-DNA konjugiert mit RNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge, CNA konjugiert mit DNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge, CNA konjugiert mit RNA oder deren chemisch
modifizierten Abkömmlinge. Aber auch die Immobilisation auf Trägeroberflächen, wie
z. B. Glas, Silicium, Kunststoff Gold oder Platin, ist von großem Interesse. Die
Oberflächen können wiederum ein oder mehrere Lagen von Beschichtungen
enthalten, bevorzugt sind polymere Beschichtungen, wie Poly-Lysin, Agarose oder
Polyacrylamid. Die Beschichtung kann mehrere gestaffelte Schichten oder auch
ungeordnete Schichten enthalten. Dabei können die einzelnen Schichten in Form
monomolekularer Lagen ausgestaltet sein.
Unter Konjugation wird bezüglich der vorliegenden Erfindung die kovalente oder
nicht kovalente Verknüpfung von Komponenten wie Molekülen, Oligo-, oder
Polynucleotiden, supramolekularen Komplexen oder Polymeren mit einer oder
mehreren anderen unterschiedlichen oder gleichen Komponenten verstanden, so
daß diese unter den für ihre Verwendung notwendigen Bedingungen eine stabile
Einheit, ein Konjugat, bilden. Dabei muß die Konjugation nicht unbedingt kovalent
sein, sie kann auch über supramolekulare Kräfte, wie von der Waals
Wechselwirkungen, Dipol-Wechselwirkungen, insbesondere
Wasserstoffbrückenbindungen, oder ionische Wechselwirkungen erfolgen.
Von besonderem Interesse sind weiterhin Konjugate mit organischen oder
anorganischen Molekülen die eine biologische Aktivität besitzen.
Unter diesem Gesichtspunkt sind Arzneistoffe, Pflanzenschutzwirkstoffe,
Komplexbildener, Redoxsysteme, Ferrocenderivate, Reportergruppen, radioaktive
Isotope, Steroide, Phosphate, Triphosphate, Nucleosid-Triphosphate, Derivate von
Leitstrukturen, Übergangszustandsanaloge, Lipide, Heterocyclen, insbesondere
Stickstoffheterocyclen, Saccharide, verzweigte oder unverzweigte Oligo- oder
Polysaccharide, Glycoproteine, Glycopeptide, Rezeptoren oder funktionelle Teile
davon wie die extrazelluläre Domäne eines membrangebundenen Rezeptors,
Metaboliten, Botenstoffe, Substanzen, die im menschlichen oder Tierischen Körper
im Fall von krankhaften Veränderungen produziert werden, Antikörper oder
funktionelle Teile davon wie beispielsweise Fv-Fragmente, einzelkettige Fv-
Fragmente, oder Fab-Fragmente, Enzyme, Filamentbestandteile, Viren,
Virenbestandteile wie Kapside, Viroide, und deren Derivate wie z. B. Acetate,
Substanzbibliotheken wie Ensembles von sich strukturell unterscheidenden
Verbindungen, vorzugsweise oligomere oder polymere Peptide, Peptidoide,
Saccharide, Nucleinsäuren, Ester, Acetale oder Monomere wie Heterocyclen, Lipide,
Steroide oder Angriffsstruktuen von Pharmaka, vorzugsweise
Arzneimittelrezeptoren, Ionenkanäle, insbesondere spannungsabhängige
Ionenkanäle, Transporter, Enzyme oder Biosyntheseeinheiten von Mikroorganismen
erwähnenswert.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind die aus dem jeweiligen Acetal leicht, z. B.
mittels wäßriger Säuren oder photochemisch, herstellbaren aldehyd modifizierten p-
RNA- und p-DNA- Oligo- und -Polynucleotide.
Bei der Herstellung von Acetal-Oligo- oder Polynucleotiden wird von Acetalen der
Formel (I) ausgegangen. Beispielhaft können herkömmliche Phosphoramidite, die
ein oder mehrere Acetalgruppen tragen, verwendet werden. Diese können über die
Standardmethoden der Festphasensynthese in die Oligo- oder Polynucleotide
integriert werden (schematische Darstellung dazu in Fig. 2).
Die Synthese von solchen Acetalgruppen tragenden reaktiven Monomerbausteinen
erfolgt z. B. durch die Umsetzung von Amino-Acetalen (2a, 2b, 6) (Fig. 3) mit
Caprolacton (wie z. B. in Zhang, J.; Yergey, A.; Kowalak, J.; Kovac, P., Tetrahedron
54 (1998) 11783 beschrieben). Die dabei erhaltenen Hydroxy-Acetale 3a, 3b, oder 7
werden dann durch Umsetzung mit einem entsprechendem Phosphorreagenz in das
reaktive Monomer für die Oligonucleotidsynthese umgewandelt (dazu exemplarisch:
I. Beaucage, S. L., Iyer, R. P., Tetrahederon 49 (1993).
Alternativ lassen sich entsprechende Hydroxy-Acetale durch Finkelstein-Reaktion
aus deren Halogeniden herstellen oder durch Acetalisierung aus einem Hydroxy-
Aldehyd und einer Alkohol Komponente erhalten. Die Umwandlung in die reaktive
Form erfolgt dann wiederum durch Umsetzung mit dem entsprechendem
Phosphorreagenz.
Von besonderem Interesse sind auch cyclische Acetale welche eine o-Nitrophenyl-
Gruppe tragen, da diese nicht nur durch Säuren sondern auch durch Bestrahlung mit
Licht in den Aldehyd umgewandelt werden können.
Der Einbau der Acetale in Oligonucleotide erfolgt dann nach den Standardmethoden
der Oligonucleotid-Festphasensynthese (Beaucage, S. L.; Iyer, R. P., Tetrahederon
49 (1993) 6123; Caruthers, M. H., Barone, A. D.; Beaucage, S. L.; Dodds, D. R.;
Fisher, E. F.; McBride, L. J.; Matteucci, M.; Stabinsky, Z.; Tang, J. Y., Methods
Enzymol. 154 (1987) 287; Caruthers M. H.; Beaton, G.; Wu, J. V.; Wiesler, W.,
Methods Enzymol. 211 (1992) 3).
Acetale sind inert gegen alle Rektionsbedingungen der gängigen
Oligonucleotidsynthese-Methoden wie beispielsweise der Phosphoramiditmethode.
So sind die Acetale z. B. inert gegenüber der Aktivierung mit Tetrazol,
Benzylthiotetrazol, Pyridiniumhydrochlorid etc. Capping mit Acetanhydrid und N-
Methylimidazol, Oxidation z. B. mit Iod/Wasser. Sie sind ebenfalls inert gegen die
Reaktionsbedingungen der H-Phosphonat Methode wie der Aktivierung mit
Pivaloylchlorid.
Weiterhin sind Acetale stabil gegen die basischen Reaktionsbedingungen bei der
Oligonucleotid-Entschützung. Sie überstehen die üblicherweise verwendete
konzentrierte wäßrige Ammoniaklösung (55°C, 2-10 h) unbeschadet und werden
auch nicht durch alternative Reagenzien wie sie in besonderen Fällen eingesetzt
werden (Ethylendiamin, Methylamin, Hydrazin) (Hogrefe, R. I.; Vghefi, M. M.;
Reynolds, M. A.; Young, K. M.; Arnold, L. J. Jr., Nucleic Acids Res. 21(1993) 2031)
angegriffen.
Die Freisetzung der Aldehyd-Funktionalität aus den Acetalen (wie z. B. in den
Beispiele 8-11) erfolgt leicht durch die Behandlung der Acetal-Oligonucleotide mit
wäßrigen Säuren (Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure etc.) oder durch
Bestrahlung mit Licht (siehe dazu auch die schematische Darstellung in Fig. 2). In
beiden Fällen ist es nicht notwendig das Aldehyd-Oligonucleotid von Reagenzien wie
Natrium Periodat abzutrennen. Es genügt, ist aber nicht immer notwendig, die Säure
zu neutralisieren. Sollte der durch die neutralisation der Säure bedingte Salzgehalt
bei der Umsetzung des Aldehyds stören, so kann es auch über gängige Verfahren,
wie z. B. Gelfitration, Dialyse, Umkehrphasen Extraktion entfernt werden.
Die so erhaltenen Aldehyd-Oligo- oder Polynucleotide können für alle in der Literatur
(z. B. in Hermanson, G. T., Bioconjugate Technigues, Academic Press, San Diego
1996; Timofeev, E. N.; Kochetkova, S. V.; Mirzabekov, A. D.; Florentiev, V. L.,
Nucleic Acids Res. 24 (1996) 3142) beschriebenen Verknüpfungsreaktionen
verwendet werden. Von besonderem Intresse sind dabei die Konjugation von Oligo-
oder Polynucleotiden mit Proteinen und Peptiden, Fluoreszenzfarbstoffen, andere
Oligonucleotiden und die Immobilisation von Oligo- oder Polynucleotiden auf
Oberflächen und an anderen Polymeren.
Aldehyd modifizierte Oligo- oder Polynucleotide bieten weiterhin die Möglichkeit die
in Fig. 1C dargestellte Reaktion für die Konjugation mit Peptiden, Proteinen oder
anderen organischen oder anorganischen Molekülen zu verwenden, welche an
ihrem N-Terminus ein Cystein tragen. Dabei wird ein Thiazolidin Derivat gebildet,
welches sich bei gegebener Konstitution des Aldehyds noch umlagern kann
(Lemieux, G. A.; Bertozzi, C. R., Trends in Biotechnology 16(1998) 506; Liu, C.-F.;
Rao, C.; Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 118(1996) 307). Vorteil dieser Reaktion ist,
daß sie bei niedrigen Eduktkonzentrationen und pH-Werten abläuft.
Die Verwendung von Acetalen als Schutzgruppen für Aldehyde erlaubt weiterhin ein
besonders einfaches Verfahren zur Konjugation von Oligo- oder Polynucleotiden:
Die Konjugation auf dem Träger.
Hierzu wird das noch voll oder teilweise geschützte, noch auf dem Trägermaterial
der Oligonucleotid-Festphasensynthese immobilisierte Acetal-Oligo- oder
Polynucleotid in das entsprechende Aldehyd-Oligo- oder Polynucleotid
umgewandelt. Wichtig ist, daß diese durch wäßrige Säuren oder durch Bestrahlung
mit Licht mögliche Reaktion nicht zur Abspaltung des Oligo- oder Polynucleotids vom
Trägermaterial führt. Die Trägergebundene Aldehyd-Nucleotidkette wird dann mit
einem entsprechenden Reaktionspartner (beispielhaft dazu Fig. 1) umgesetzt.
Anschließend wird das Oligo- oder Polynucleotid-Konjugat durch wäßrigen
Ammoniak oder alternative Reagenzien (z. B. Ethylendiamin, Methylamin, Hydrazin)
vom Träger abgespalten und von den restlichen Schutzguppen, bei DNA
beispielsweise den Benzoyl und Isobutyryl Schutzgruppen an den exocyclischen
Amminogruppen der Basen, befreit. Voraussetzung ist, daß die bei der Konjugation
gebildete Verknüpfung stabil gegen diese Entschützungsbedingungen ist, was bei
den in Fig. 1 beispielhaft beschriebenen Produkten gegeben ist. Der Vorteil dieser
Konjugatiuon von trägergebundenen Oligo- oder Polynucleotiden ist, daß die
Überschüsse der zu konjugierenden Komponenten und weiterer Reagenzien, wie
etwa des Reduktionsmittels, durch einfaches Waschen von dem Trägergebundenen
Konjugat abzutrennen sind. So lassen sich auch Konjugate von Oligo- oder
Polynucleotiden mit Molekülen erhalten die aufgrund von spezifischen Labilitäten
nicht durch direkte Oligonucleotid-Festphasensynthese zugänglich sind.
Wenn nicht anders angegeben wurden Reagenzien von Aldrich und Lösungsmittel
von Riedel (p. a.) verwendet. Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Platten
mit Kieselgel 60 F254 (Merck) durchgeführt. Säulenchromatographische Trennungen
wurden an Kieselgel 60 (Merck, 230-400 Mesh) durchgeführt. 1H-NMR-Spektren
wurden bei 400 MHz auf einem Bruker DRX 400 Spektrometer gemessen und die
Chemischen Verschiebungen als δ Werte gegen Tetramethysilan (TMS) angegeben.
IR Spektren wurden auf einem mit einer Graseby Specac 10500 ATR Einheit
ausgestatteten Perkin Eimer Paragon 1000 FT-IR Spektrometer gemessen. DNA
Oligonucleotide wurden auf einem Expedite 8905 der Firma PE Biosystems nach der
Phosphoramiditmethode hergestellt. Acetal Phosphoramidite wurden ebenso wie die
DNA Amidite als 0.1 M Lösung in Trockenem Acetonitril verwendet. Die Kopplung
erfolgte mit Tetrazol als Aktivator. Für p-RNA Oligonucleotide wurden die zuvor
beschriebenen Synthesebedingungen verwendet (DE 197 41 715) Electrospray
Massenspektren (ESI-MS) wurden auf einem Finnigan LCQ Gerät im negativen
Ionisierungsmodus aufgenommen.
Die angegebenen Nummerierung der einzelnen Substanzen bezieht sich auf die in
den Fig. 3 bis 5 verwendeten Ziffern.
Fig. 3 beschreibt beispielhaft die Synthese von Acetal-Phosphoramiditen, in Fig. 4
sind Beispiele für DNA-Acetale und DNA-Aldehyde gezeigt, in Figur sind Beispiele für
p-RNA-Acetale und p-RNA-Aldehyde gezeigt.
2.19 g (10 mmol, [219.28]) N-(2,2-Dimethoxyethyl)-6-hydroxyhexamid 3a werden mit
5.17 g (40 mmol, 4 eq., [129.25]) N-Ethyl-diisopropylamin (Hünigs Base) in 40 ml
trocknem Dichlormethan gelöst. 2.6 g (11 mmol, 1.1 eq., [236.68]) Phosphorigsäure
mono-(2-cyanethylester)-diisopropylamid-chlorid 4 werden während 15 min
zugetropft. Nach 1 Stunde zeigt das DG (Essigsäureethylester/n-Heptan 2 : 1)
vollständige Umsetzung. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer
abgezogen und der Rückstand direkt auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen.
Elution mit Essigsäureethylester/n-Heptan (2 : 1) mit wenigen Tropfen Triethylamin
ergibt 2.48 g (59%) der Verbindung 5a als farbloses Öl (C19H38N3O5P; [419.51]). 1H-
NMR (CDCl3; 400 MHZ): δ = 5.71 [b, 1H, N-H), 4.37 (t, 1H, J = 5.4 Hz, C-H), 3.89-
3.67 (m, 2H, CH2 cyanoethyl), 3.66-3.54 (m, 4H, CH2, C-H i-Pr), 3.45-3.38 (m, 8H,
CH3, CH2), 2.64 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2), 2.19 (t, 2H, J = 7.25 Hz, CH2), 1.77-1.59
(m, 4H, CH2), 1.44-1,36 (m, 2H, CH2), 1.19-1.16 (m, 12H, CH3 i-Pr); 31P-NMR
(CDCl3): δ = 148.0
2.47 g (10 mmol, [247.34]) N-(2,2-Diethoxyethyl)-6-hydroxyhexamid 3b werden mit
5.17 g (40 mmol, 4 eq., [129.25]) N-Ethyl-diisopropylamin (Hünigs Base) in 40 ml
trocknem Dichlormethan gelöst. 2.6 g (11 mmol, 1.1 eq., [236.68]) Phosphorigsäure
mono-(2-cyanethylester)-diisopropylamid-chlorid 4 gelöst in 5 ml Dichlormethan
werden während 30 min zugetropft. Nach weiteren 30 min zeigt das DC
(Essigsäureethylester/n-Heptan 2 : 1) vollständige Umsetzung. Das Lösungsmittel
wird am Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand in Essigsäureethylester
/n-Heptan (2 : 3) aufgenommen. Es wird vom ausgefallenen Hydrochlorid abgesaugt
und das Filtrat direkt auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen. Elution mit
Essigsäureethylester/ n-Heptan (1 : 1) mit wenigen Tropfen Triethylamin ergibt 2.96 g
(66%) der Verbindung 5b als farbloses Öl (C21H42N3O5P; [419.51]). 1H-NMR (CDCl3;
400 MHZ): δ = 5.72 [b, 1H, N-H), 4.49 (t, 1H, J = 5.4 Hz, C-H), 3.89-3.50 (m, 10H,
2 × CH2, CH3, C-H i-Pr), 3.38 (t, 2H, J = 5.64 Hz, CH2), 2.64 (t, 2H, J = 5.9 Hz, CH2),
2.19 (t, 2H, J = 7.52 Hz, CH2), 1.68-1.59 (m, 4H, CH2), 1.44-1,38 (m, 2H, CH2),
1.23-1.16 (m, 18H, CH3 i-Pr, CH3 Et); 31P-NMR (CDCl3): δ = 148.0
1.75 g (6.35 mmol, [275.39]) N-(2,2-Diethoxybutyl)-6-hydroxyhexamid 7 werden mit
1.64 g (12.7 mmol, 4 eq., [129.25]) N-Ethyl-diisopropylamin (Hünigs Base) in 30 ml
trocknem Dichlormethan gelöst. 1.65 g (6.99 mmol, 1.1 eq., [236.68])
Phosphorigsäure-mono-(2-cyanethylester)-diisopropylamid-chlorid 4 gelöst in 2 ml
Dichlormethan werden während 40 min zugetropft. Nach weiteren 30 min zeigt das
DC (Essigsäureethylester/n-Heptan 10 : 1) den vollständigen Verbrauch des Edukts.
Es wird mit Methynol gestoppt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer
abgezogen. der Rückstand wird direkt auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen.
Elution mit Essigsäureethylester/n-Heptan (10 : 1) mit wenigen Tropfen Triethylamin
ergibt 1.87 g (62%) der Verbindung 8 als farbloses Öl (C23H46N3O5P; [475.61]). 1H-
NMR (CDCl3; 400 MHZ): δ = 5.74 [b, 1H, N-H), 4.48 (t, 1H, J = 5.1 Hz, C-H), 3.88-
3.76 (m, 2H), 3.69-3.45 (m, 8H), 3.26 (q, 2H, J = 6.72 Hz, CH2), 2.64 (t, 2H,
J = 6.45 Hz, CH2), 2.16 (t, 2H, J = 7.25 Hz, CH2), 1.69-1.56 (m, 8H, CH2), 1.43-1,37
(m, 2H, CH2), 1.22-1.16 (m, 18H, CH3 i-Pr, CH3 Et); 31P-NMR (CDCl3): δ = 148.0
Die Einführung von Aldehyden über Acetale wird sowohl an DNA als auch an p-RNA
Oligonucleotiden gezeigt. Die Sequenzen der Beispiel-Oligonucleotide sind in Fig.
4 und 5 gezeigt.
Die Oligonucleotid-Synthese wird nach den vom Gerätehersteller vorgegebenen
Vorschriften im 1 µmol Maßstab durchgeführt. Als letztes Monomer wird eine 0.1 M
Lösung des Posphoramidits 5b unter den Standardbedingungen gekoppelt. Zur
Abspaltung und Entschützung wird das trägergebundene Oligonucleotid für 10 h bei
80°C mit 25% wäßriger Ammoniaklösung behandelt. Nach Entfernung des Trägers
wird die Lösung im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Wasser gelöst.
Reinigung des Oligonucleotids wird über RP-HPLC durchgeführt. Säule: Merck
LiChrospher RP 18, 10 µM, analytisch: 4 × 250 mm, Fluß = 1.0 ml/min; semi
preparativ: 10 × 250, Fluß = 3.0 ml/min; Puffer: A: 0.1 M Triethylammoniumacetate
(TEAA) pH = 7.0 in Wasser, B: 0.1 M TEAA pH = 7.0 in Acetonitril/Wasser (95 : 5);
Gradient: 0% B bis 100% B in 100 min für analytische und preparative
Trennungen). Retentionszeit DNA Acetal 9: 22.8 min; MS: ber.: [6193], obs.: [6195]
Die Oligonucleotid-Synthese und Aufarbeitung wird wie in Beispiel 4 beschrieben
durchgeführt. Retentionszeit DNA Acetal 11: 23.4 min; MS: ber.: [6222], obs.: [6221]
Die Oligonucleotid-Synthese wird wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Für p-
RNA wurden abweichend zu dieser Vorschrift eine länger Kopplungszeit und
Pyridiniumhydrochlorid als Aktivator verwendet. Die Acetal Phosphoramidite werden
in diesem Fall auch mit Pyridiniumhydrochlorid als Aktivator gekoppelt. Der Träger
wird zunächst mit einer 1,5% (w/v) Lösung von Diethylamin in Dichlormethan
versetzt und unter Lichtausschluß über Nacht (15 h) bei RT geschüttelt. Die Lösung
wird verworfen und der Träger mit je 3 Portionen der folgenden Lösungsmittel
gewaschen: CH2Cl2, Aceton, Wasser. Die p-RNA wird dann zur Abspaltung vom
CPG-Träger und zur Entschützung für 18 h bei 4°C mit 24% wäßrigem
Hydrazinhydrat behandelt. Die Entfernung vom Hydrazin erfolgt durch
Festphasenextraktion mit Sep-Pak C18 Kartuschen (0.5 g Waters, No. 20515;
Aktivierung mit 10 ml Acetonitril, Binden der mit dem fünffachen Volumen
Triethylammonium Bicarbonat Puffer (TEAB) pH 7.0 verdünnten Hydrazinlösung,
Waschen mit TEAB und Elution des Oligonucleotids mit TEAB/Acetonitril (1 : 2)).
Oligonucleotid enthaltende Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne
eingeengt. Die Analytik und preparative Reinigung erfolgt über RP-HPLC wie in
Beispiel 4 beschrieben. Retentionszeit DNA Acetal 13: 22.0 min; MS: ber.: [2719],
obs. [2718]
Die Oligonucleotid-Synthese und Aufarbeitung wird wie in Beispiel 6 beschrieben
durchgeführt. Retentionszeit p-RNA Acetal 15: 24.0 min; MS: ber.: [2747], obs.:
[2747]
Das Acetal-Oligonucleotid wird in Wasser gelöst und mit einem Überschuß an
wäßriger Säure (z. B. HCl) versetzt. Die Oligonucleotidkonzentration in der so
erhaltenen Reaktionslösung liegt üblicherweise zwischen 20 und 60 µM, es wird ein
großer Überschuß Säure eingesetzt (bis zu 5 × 104 Molequivalente). Die Lösung wird
bei Raumtemperatur inkubiert und der Fortgang der Reaktion über HPLC überwacht.
Nach Vollständiger Umsetzung des Acetal-Oligonucleotids wird mit wäßriger NaOH
neutralisiert. Die so erhaltene Lösung des Aldehyd-Oligonucleotids kann direkt für
Konjugationsreaktionen verwendet werden oder über die üblichen Verfahren wie
Gelfiltration oder Festphasenextraktion (vgl. Beispiel 6) entsalzt werden.
26 nmol Acetal 10 werden mit 1 ml 1 M wäßriger HCl versetzt und 6.5 h bei RT
inkubiert. Der Verlauf der Reaktion kann mittels RP-HPLC unter den in Beispiel 4
angegebenen Bedingungen verfolgt werden. Die Säure wird durch Zugabe von 1 N
wäßriger NaOH neutralisiert. Die so erhaltenen Lösung des DNA Aldehyds kann
direkt für Konjugationen eingesetzt werden oder über RP-HPLC gereinigt werden.
Retentioszeit DNA Aldehyd 10 : 20,6 min;
120 nmol Acetal 11 werden mit 2 ml 1 M wäßriger HCl wie in Beispiel 8 beschrieben
zum DNA Aldehyd 12 umgesetzt. Retentionszeit: 21.5 min; MS: ber.: [6148], obs.:
[6147]
16 nmol Acetal 13 werden mit 400 µl 0.5 M wäßriger HCl wie in Beispiel 8
beschrieben zum DNA Aldehyd 14 umgesetzt. Retentionszeit: 19.2 min; MS: ber.:
[2645], obs.: [2645]
50 nmol Acetal 15 werden mit 1 ml 1 M wäßriger HCl wie in Beispiel 8 beschrieben
zum DNA Aldehyd 16 umgesetzt. Retentionszeit: 20.0 min; MS: ber.: [2673], obs.:
[2672]
- A) 10 µL einer Lösung eines Hydrazids oder Amins (5 bis 20 mM) und 10 µL einer 100 mM wäßriger NaCNBH4 Lösung wird mit Acetat Puffer (pH 5) auf 500 µL verdünnt. Dazu werden 1-5 nmol des in wenigen µL Wasser gelösten Aldehyd Oligonucleotids gegeben. Nach 2H bei RT wird durch Gelitration entsalzt und das Konjugat über HPLC gereinigt.
- B) Alternativ kann die durch Neutralisation der Säure erhaltene Lösung des Aldehyd Oligonucleotides (Vgl. 3.1.3) mit 100 Moleqiuvalenten Hydrazid oder Amin und 1000 Moleqiuvalenten NaCNBH4 versetzt werden. Bei Bedarf wird mit Acetat Puffer pH 5 verdünnt. Nach 2H bei RT wird durch Gelfiltration entsalzt und das Konjugat über HPLC gereinigt.
Zunächst wird wie in Beispiel 4 und Beispiel 6 beschrieben ein Acetal Oligonucleotid
durch Festphasensynthese hergestellt. Das trägergebundene Oligonucleotid wird
dann zunächst mit einer 1,5% (w/v) Lösung von Diethylamin in Dichlormethan
versetzt und unter Lichtausschluß über Nacht (15 h) bei RT geschüttelt. Die Lösung
wird verworfen und der Träger mit je 3 Portionen der folgenden Lösungsmittel
gewaschen: CH2Cl2, Aceton, Wasser. Zur Umwandlung des trägergebundenen
Acetal-Oligonucleotids in einen trägergebundenes Aldehyd-Oligonucleotid wird der
Träger für 2 h bei RT mit einer 0.1 bis 1 M wäßriger Säurelösung (z. B. HCl)
behandelt. Anschließend wird mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutralen pH-
Wert zeigt. Zur Konjugation wird mit einer Lösung eines Hydrazids oder Amins und
NaCNBH4 in Acetat Puffer für mehrere Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.
Anschließend wird das Konjugat durch Behandlung mit Hydrazin oder Ammoniak
(Vgl. Beispiel 4 und 6) vom Träger abgespalten und entschützt. Die Aufarbeitung
und Reinigung erfolgt wie in Beispiel 6 beschrieben.
Claims (19)
1. Reaktives Monomer der Formel (I), worin I, v unabhängig voneinander gleich 0
oder 1 und a gleich einer ganzen Zahl zwischen 1 und 5 ist
X-Ll-Vv-(A)a (I)
wobei
X eine reaktive phosphorhaltige Gruppe, die für die Oligonucleotid- Synthese geeignet ist,
V eine Verzweigungseinheit aus einem Atom oder einem Molekül mit mindestens drei Bindungspartnern ist,
A ein Acetal der Formel (IV) ist,
wobei die Reste Y und Z unabhängig voneinander gleiche oder verschiedene verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe mit ein bis 18 Kohlenstoffatomen darstellen, wobei die Reste Y und Z auch miteinander verknüpft sein können.
und worin
L Linker sind, die geeignet sind X mit A zu verknüpfen oder X mit V und V mit A zu verknüpfen.
X-Ll-Vv-(A)a (I)
wobei
X eine reaktive phosphorhaltige Gruppe, die für die Oligonucleotid- Synthese geeignet ist,
V eine Verzweigungseinheit aus einem Atom oder einem Molekül mit mindestens drei Bindungspartnern ist,
A ein Acetal der Formel (IV) ist,
wobei die Reste Y und Z unabhängig voneinander gleiche oder verschiedene verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe mit ein bis 18 Kohlenstoffatomen darstellen, wobei die Reste Y und Z auch miteinander verknüpft sein können.
und worin
L Linker sind, die geeignet sind X mit A zu verknüpfen oder X mit V und V mit A zu verknüpfen.
2. Reaktives Monomer nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die
phosprhaltige Gruppe X ein Phosphoramidit (II) oder ein Phosphonat (III)
mit R2 und R3 unabhängig voneinander für einen Alkylrest steht, wobei Alkyl für einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C5-Rest, vorzugsweise für iso-Propyl steht und R1 gleich Methyl, Allyl (-CH2-CH=CH2) oder bevorzugt β- Cyanoethyl (-CH2-CH2-CN) steht.
mit R2 und R3 unabhängig voneinander für einen Alkylrest steht, wobei Alkyl für einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C5-Rest, vorzugsweise für iso-Propyl steht und R1 gleich Methyl, Allyl (-CH2-CH=CH2) oder bevorzugt β- Cyanoethyl (-CH2-CH2-CN) steht.
3. Reaktives Monomer nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß die
Verzweigungseinheit V ein Stickstoffatom, Kohlenstoffatom oder ein Phenylring
ist.
4. Reaktives Monomer nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch
gekennzeichnet, daß die Reste Y und Z unabhängig voneinander Methyl, Ethyl,
n-Propyl, Iso-Propyl, n-Butyl, 2-Butyl, tert-Butyl, insbesondere bevorzugt Ethyl,
darstellen.
5. Reaktives Monomer nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch
gekennzeichnet, daß Y und Z gemeinsam einen Rest der Struktur (V) oder (VI)
darstellen
wobei die Substituenten R4 unabhängig voneinander für H, Methyl, Phenyl, verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte C1, bis C18-Kohlenwasserstoffe oder einen Rest der Struktur (VII)
stehen und die Substituenten R5 unabhängig voneinander für H, Methyl, Alkyl, O-Methyl, O-Alkyl, oder Alkyl, wobei Alkyl für verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte C1 bis C18-Kohlenwasserstoffreste stehen.
wobei die Substituenten R4 unabhängig voneinander für H, Methyl, Phenyl, verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte C1, bis C18-Kohlenwasserstoffe oder einen Rest der Struktur (VII)
stehen und die Substituenten R5 unabhängig voneinander für H, Methyl, Alkyl, O-Methyl, O-Alkyl, oder Alkyl, wobei Alkyl für verzweigte, unverzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte C1 bis C18-Kohlenwasserstoffreste stehen.
6. Reaktives Monomer nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch
gekennzeichnet, daß die Linker L verzweigte, unverzweigte oder cyclische,
gesättigte oder ungesättigte C1 bis C18 Kohlenwasserstoffe sind, bevorzugt
(CnH2n)-Alkylreste mit n gleich einer ganze Zahl von 0 bis 18 vorzugsweise
zwischen 3 und 8, oder gleich einem Polyether -(CH2)k-[O-(CH2)m]o-O-(CH2)p-
mit k, m, p unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 4,
vorzugsweise 2, und o gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 8, vorzugsweise 2 bis
4, oder gleich einem Amin -(CH2)w-NH-(CH2)u- mit w und u unabhängig
voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18, vorzugsweise 3 bis 6, oder
gleich einem Amid -(CH2)q-C(O)-N-(CH2)r- oder -(CH2)q-N-C(O)-(CH2)r- mit q
und r unabhängig voneinander gleich einer ganzen Zahl von 0 bis 18,
vorzugsweise 1 bis 5, wobei die Linker L auch über eine Sauerstoffbrücke an V
geknüpft sein können.
7. Reaktive Monomere gemäß einem oder mehrerer vorheriger Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Struktur besitzen
8. Mono-, Oligo- oder Polynucleotide dadurch gekennzeichnet, daß sie mit
mindestens einer Acetalgruppe modifiziert sind.
9. Mono-, Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 8 erhältlich durch endständige
Verknüpfung des Mono-, Oligo- oder Polynucleotids mit mindestens einem
reaktiven Monomer der Formel (I).
10. Mono-, Oligo- oder Polynucleotide nach Anspruch 8 oder 9 dadurch
gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel VIII entsprechen,
(M)s[-X'-LlVv(A)a]z (VIII)
wobei (M)s aus s Monomereinheiten beliebiger Sequenz, mit s größer oder gleich 1 darstellen, wobei (M)s verzweigt oder unverzweigt sein kann und X' eine phosphorhaltige Gruppe der Formel (IX) darstellt, die endständig mit dem Mono-, Oligo- oder Polynucleotid verknüpft ist,
wobei, U für O oder S, W für OH, SH oder H und Q für O oder NH steht und worin z größer oder gleich 1 ist und I, v, a, L, V und A die oben genannte Bedeutung haben.
(M)s[-X'-LlVv(A)a]z (VIII)
wobei (M)s aus s Monomereinheiten beliebiger Sequenz, mit s größer oder gleich 1 darstellen, wobei (M)s verzweigt oder unverzweigt sein kann und X' eine phosphorhaltige Gruppe der Formel (IX) darstellt, die endständig mit dem Mono-, Oligo- oder Polynucleotid verknüpft ist,
wobei, U für O oder S, W für OH, SH oder H und Q für O oder NH steht und worin z größer oder gleich 1 ist und I, v, a, L, V und A die oben genannte Bedeutung haben.
11. Mono-, Oligo- oder Polynucleotide nach einem der Ansprüche 8 bis 10
enthaltend natürlich vorkommende Nucleotide in beliebiger Sequenz, bevorzugt
DNA, cDNA oder RNA und/oder nicht natürliche Nucleotide in beliebiger
Sequenz, z. B. chemisch modifizierte DNA, cDNA oder RNA, bevorzugt
Phosphorodithioate, Methylphosphonate, 2'-O-Methyl RNA, 2'-O-Allyl-RNA,
2'-Fluoro RNA, LNA, PNA p-RNA, Homo DNA, p-DNA, CNA.
12. Mono-, Oligo- oder Polynucleotide nach einem der Ansprüche 8 bis 11 dadurch
gekennzeichnet, daß die Kette, inklusive einem monomeren Baustein gemäß
Anspruch 1, aus 2 bis 10000 Monomereinheiten, bevorzugt aus 5 bis 30
Monomereinheiten, besteht.
13. Mono-, Oligo- und Polynucleotide nach einem der Ansprüche 8 bis 12 dadurch
gekennzeichnet, daß sie kovalent oder stabil nichtkovalent konjugierte
Molekülteile, bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, Peptide, Proteine, Antikörper,
Polymere, Aptamere, organische Moleküle, anorganische Moleküle, andere
Oligo- oder Polynucleotide, und/oder kovalent oder stabil nichtkovalent
konjugierte Oberflächen von festen beschichteten oder unbeschichteten
Trägermaterialien enthalten.
14. Mono-, Oligo- und Polynucleotide dadurch gekennzeichnet, daß sie mit
mindestens einer Aldehydgruppe modifiziert sind und die Nucleotidkette aus p-
RNA, Homo DNA, p-DNA oder CNA besteht.
15. Verfahren zur Herstellung von Aldehyd modifizierten Oligo- oder
Polynucleotiden, umfassed
- a) Kopplung eines reaktiven Monomers einer der Ansprüche 1 bis 7 an ein Oligonucleotid und
- b) Behandlung mit Säure oder Licht zur Aldehyderzeugung
16. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß die Aldehyd-
Gruppe(n) weiteren Konjugationsreaktionen, bevorzugt einer Konjugation mit
einem Amin, Hydrazin oder einem Peptid, Protein, organischem Molekül mit
einem endständigen Cystein, unterworfern wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16 dadurch gekennzeichnet, daß die
Herstellung von der Oligo- oder Polynucleotiden ganz oder teilweise unter den
Bedingungen der Festphasenoligonucleotidsynthesen durchgeführt wird.
18. Verwendung von reaktiven Monomeren nach Anspruch 1 bis 7 oder von Mono-,
Oligo- oder Polynucleotiden nach Anspruch 8 bis 13 zur Oligo- oder
Polynucleotidsynthese oder -Verfielfältigung, insbesondere bei der
Phosphoramiditmethode oder der PCR.
19. Verwendung von Mono-, Oligo- oder Polynucleotiden nach Anspruch 14 für
Konjugationsreaktionen gemäß Anspruch 16.
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