DE10009799A1 - Nukleotidsequenzen kodierend für Proteine beteiligt an der Biosynthese von L-Serin und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Nukleotidsequenzen kodierend für Proteine beteiligt an der Biosynthese von L-Serin und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien, kodierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine sowie Verfahren zu deren Isolierung. Ferner ist ein verbessertes Verfahren zur Produktion von L-Serin Gegenstand der Erfindung sowie die Verwendung in der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und/oder Pharmaindustrie oder in der Humanmedizin.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien
kodierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine sowie Verfahren zu
deren Isolierung. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren
zur Herstellung von L-Serin.
Aminosäuren, wie beispielsweise L-Glutamat, L-Lysin oder auch verzweigtkettige L-
Aminosäuren sind in den letzten Jahren zunehmend in den Focus wirtschaftlichen
Interesses gerückt. Dies gilt gleichermaßen auch für die Aminosäure L-Serin, die
nicht nur als Vorstufe zur Synthese der aliphatischen Aminosäuren L-Glycin oder L-
Cystein, sondern auch zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin dient.
Hierbei wird für die Aminosäure L-Serin insbesondere in der Nahrungsmittel-
Futtermittel- und Pharmaindustrie sowie in weiten Bereichen der Humanmedizin ein
zunehmend wirtschaftliches Potential gesehen.
Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sind in der Literatur zahlreich
beschrieben. Auch sind bereits Fermentationen coryneformer Bakterien zur
Herstellung von L-Serin bekannt. So ist beispielsweise ein Stamm von
Corynebacterium glycinophilum in der Lage L-Serin aus Glycin und Kohlenhydraten
zu bilden (Kubota K, Kageyama K, Shiro T und Okumura S (1971) Journal of General
Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I,
Yamada K und Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology
18: 365). An der Umsetzung von Glycin zu L-Serin ist hier das Enzym L-Serin-
Hydroxymethyltransferase beteiligt (Kubota K und Yokozeki K (1989) Journal of
Fermentation and Bioengeneering, 67 (6): 387-390). Die verwendeten
Bakterienstämme weisen ferner einen verminderten Serin-Abbau auf, der auf eine
Verringerung der Aktivität des Enzyms L-Serin-Dehydratase zurückzuführen ist
(Kubota K, Kageyama K, Shiro T und Okumura S (1971) Journal of General
Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K (1985) Agricultural Biological
Chemistry, 49: 7-12).
Weiterhin ist die fermentative Herstellung von L-Serin aus Methanol und Glycin mit
Hilfe methylotropher Bakterien, beispielsweise der Gattung Hyphomicrobium bei
Izumi Y, Yoshida T, Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A und
Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432 beschrieben.
In den zuvor genannten Fällen ist allerdings der Zusatz der Aminosäure Glycin als
Vorstufe für die Bildung der Aminosäure L-Serin ausgehend von Kohlenhydraten
erforderlich.
Demgegenüber sind bereits Verfahren zur Fermentation coryneformer Bakterien
bekannt, die L-Serin direkt aus Kohlenhydraten, ohne zusätzliche Beigabe weiterer
Vorstufen produzieren können. So sind z. B. Bakterienstämme der Gattung
Corynebacterium und insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum bei
Yoshida H und Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48: 201-208
beschrieben, die durch eine ungerichtete Mutagenese erhalten wurden und sich u. a.
dadurch auszeichnen, daß sie resistent gegenüber den L-Serin-Analoga Serin-
Hydroxamat bzw. β-Chloroalanin sind. Dies führt u. a. dazu, daß der
Stoffwechselfluß vermehrt in Richtung L-Serin Biosynthese fließen kann, da die
Aktivität der entsprechenden Enzyme einer geringeren Endprodukthemmung
unterliegen.
Aus der EP 0 931 833 sind ferner Bakterienstämme der Spezies Brevibacterium
flavum bekannt, die ebenfalls durch ungerichtete Mutagenese erhalten wurden und
aufgrund dessen Defekte im Serin-Abbau aufweisen. Ferner weisen die dort
beschriebenen Stämme ein verändertes serA-Gen auf, welches für eine feedback
desensitive 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodiert. Zusätzlich enthalten diese
Stämme die aus dem heterologen Organismus Escherichia coli stammenden Gene
serB und serC, die für die Enzyme Phosphoserin-Phosphatase bzw. Phosphoserin-
Aminotransferase kodieren. Das hier beschriebene System weist somit eine hohe
Komplexizität hinsichtlich der Vielzahl zusätzlich eingeführter, z. T. heterologer
Genstrukturen auf, verbunden mit einer genetischen Unbestimmtheit der
Bakterienstämme hinsichtlich der eingangs erwähnten ungerichteten Mutagenese.
Dies birgt die Gefahr einer relativ hohen Instabilität solcher Bakterienstämme im
Verlauf eines Produktionsverfahrens im großtechnischen Maßstab in sich. Ferner ist
beschrieben, daß durch die hier dargestellten Bakterienstämme lediglich eine um
den Faktor 2 bis maximal Faktor 5 gesteigerte L-Serin-Produktion erreicht wird. Dies
kann u. a. in einer suboptimalen Expression heterologer Gene begründet sein.
Ein weiterer Nachteil heterologer Systeme liegt in der geringen Akzeptanz von
Fremd-DNA enthaltenden Systemen, insbesondere zur Produktion von medizinisch,
pharmakologisch und Nahrungsmittel-relevanten Substanzen.
Folglich ist die Verfügbarkeit der entscheidend an der Biosynthese von L-Serin
beteiligten Gene aus coryneformen Bakterien zum Einsatz in einem homologen
System wünschenswert.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein System zur Verfügung zu stellen,
das die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist und eine verbesserte
Produktion von L-Serin oder davon ableitbaren Stoffwechselprodukten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäure
kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase enthaltend ein Gen serB ausgewählt
aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 1 oder 5 (Fig. 1) sowie einer isolierten
Nukleinsäure kodierend für eine Phosphoserin-Aminotransferase enthaltend ein Gen
serC ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 3 oder 7 (Fig. 1) oder
ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenzen oder mit diesen
hybridisierende Nukleotidsequenzen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie
aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder
Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder
Brevibacterium flavum isoliert werden. Beispiele für in Stammkulturen hinterlegte
Wildtypen coryneformer Bakterien sind Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium
melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. Beispiele für zur Herstellung von L-
Serin geeignete Mutanten oder Produktionsstämme sind Corynebacterium
glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 und
Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. Die vorliegende Erfindung wird durch
die Angabe der zuvor genannten Bakterienstämme näher charakterisiert, die jedoch
nicht limitierend wirkt.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist
erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder
doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte,
modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer
schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen
gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente
Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz,
beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die
gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit
natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie
künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den
Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber
hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte
Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität
oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche
oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin
die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen,
Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf
Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen
können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des
Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen
der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins
betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen.
Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur
ausüben.
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die
vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der
Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer
solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen
kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-
Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren
Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder
verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung,
solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln.
Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung
von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten
Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind
kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz
gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden.
Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden
vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene
des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den
erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen
hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß
substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein,
die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische
Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen.
Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise
10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch
sogenannte Primer oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen)
vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream)
Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit
regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität
oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für
regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren,
Terminatoren oder Translationsverstärker.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Genstruktur enthaltend
wenigstens eine der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen kodierend für eine
Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase sowie mit diesen
operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der
kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung
beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer
regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine
Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen
kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein
oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich
jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden
Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um
einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm
unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert
werden kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid)
induzierbarer Promotor genannt (Eikmanns, B. J. et al., 1991, Gene, 102: 93-98).
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors
mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen
Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis,
E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind.
Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente
Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens
eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine
Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase, mit diesen
operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche
Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation
innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom.
Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art
enthalten.
Als Vektoren eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden
(Process Biochem 33 (1998) 147-161). Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B.
pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al.,
Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1
oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160),
oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-
124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise
verwendet werden. Diese Aufzählung ist für die vorliegende Erfindung jedoch nicht
limitierend.
Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können
entsprechende Sonden oder auch Primer synthetisiert und dazu verwendet werden,
beispielsweise mit Hilfe der PCR-Technik analoge Gene aus anderen
Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien zu amplifizieren und isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung
und/oder Isolierung von Genen kodierend für an der Biosynthese von L-Serin
beteiligte Proteine, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur
Detektion geeignete Markierung enthält. Bei der Sonde kann es sich um einen
Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz, beispielsweise aus einem
konservierten Bereich handeln, der z. B. eine Länge von 10 bis 30 oder bevorzugt 12
bis 15 Nukleotiden aufweist und unter stringenten Bedingungen spezifisch mit
homologen Nukleotidsequenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind
aus der Literatur zahlreich bekannt.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im Handbuch
von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland, 1994) oder beispielsweise im Handbuch "The DIG System
Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Roche Diagnostics (Mannheim,
Deutschland) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology
(1991) 41: 255-260).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Phosphoserin-Phosphatase
oder ein Teil davon kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 1 oder 5 (Fig. 1) oder
deren Variationen der zuvor beschriebenen Art. Die vorliegende Erfindung betrifft
ebenso eine Phosphoserin-Phosphatase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt
aus den Sequenzen gemäß der SEQ ID No 2 oder 6 oder einer modifizierten Form
dieser Polypeptidsequenzen oder Isoformen davon oder Mischungen daraus.
Ebenso ist eine Phosphoserin-Aminotransferase oder ein Teil davon kodiert durch
eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen
gemäß den SEQ ID No 3 oder 7 (Fig. 1) oder deren Variationen der zuvor
beschriebenen Art. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Phosphoserin-
Phosphatase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß
der SEQ ID No 4 oder 8 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenzen
oder Isoformen davon oder Mischungen daraus.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie aus
coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder
Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder
Brevibacterium flavum stammen.
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und
Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur
aufweisen.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen
Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des
Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die
Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von
Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten
der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch
Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein,
abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der
erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem
Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Ferner sind Polypeptide mit der Funktion einer Phosphoserin-Phosphatase oder
Phosphoserin-Aminotransferase Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer
Aminosäuresequenz derart verändert sind, daß sie gegenüber regulatorisch
wirkenden Verbindungen, beispielsweise die sie in ihrer Aktivität regulierenden
Stoffwechsel-Endprodukte desensitiv sind (feedback-desensitiv).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Übertragung wenigstens einer
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder eines Teils davon kodierend
für eine Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase, ein Allel,
Homolog oder Derivat davon in ein homologes Wirtssystem. Dies schließt auch die
Übertragung eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein
homologes Wirtssystem ein. Diese Übertragung von DNA in eine Wirtzelle erfolgt
nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die
Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch
Elektroporation genannt.
Unter einem homologen Wirtssystem sind Mikroorganismen zu verstehen, die alle
einer verwandten Familie angehören. Erfindungsgemäß sind hierunter coryneforme
Bakterien zu verstehen, in die die erfindungsgemäß aus coryneformen Bakterien
isolierten Nukleinsäuren eingebracht werden. Ein aus einer erfolgreich
durchgeführten Nukleinsäureübertragung resultierender transformierter
Mikroorganismus unterscheidet sich somit von dem entsprechend nicht
transformierten Mikroorganismus dadurch, daß er zusätzliche Nukleinsäuren der
erfindungsgemäßen Art enthält und entsprechend zur Ausprägung bringen kann.
Stellvertretend für ein geeignetes homologes Wirtssystem sei das Bakterium
Corynebacterium glutamicum und bevorzugt der Stamm ATCC 13032 genannt,
welches unter Standardbedingungen wie folgt kultiviert werden kann:
Die Kultivierung erfolgt in 500 ml Schüttelkolben bei 120 Umdrehungen/min und
30°C, wobei pro Kolben 50 ml Kulturmedium eingesetzt werden. Die Beimpfung des
Kulturmediums erfolgt durch Zugabe einer Bakterien-(Vor)-Kultur des Stammes
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, der zuvor unter gleichen Bedingungen
über einen Zeitraum von 12-16 Stunden gezüchtet wurde, wobei eine optische Dichte
der beimpften Kulturmedium im Bereich von 0,7 bis 1,5 eingestellt wird.
Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium, wie z. B. LB-
Medium (T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder auch
ein Mineralsalzmedium, wie z. B. CGXII-Medium (Keilhauer, C. et al. 1993, J.
Bacteriol., 175: 5593-5603) geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die
Bakteriensuspension geerntet und zur weiteren Untersuchung, beispielsweise zur
Transformation oder zur Isolierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden
eingesetzt werden.
Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere coryneforme Bakterienstämme
angewendet werden. Dabei werden als Wirtssysteme Bakterien der Gattung
Corynebacterium oder Brevibacterium bevorzugt. Innerhalb der Gattung
Corynebacterium wird besonders die Art Corynebacterium glutamicum und innerhalb
der Gattung Brevibacterium besonders die Art Brevibacterium flavum bevorzugt. Zu
den Vertretern dieser Gattungen zählen zum einen Stämme, die in ihren
Eigenschaften als Wildtyp charakterisiert sind. Hier sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC
14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium
acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC
14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und Brevibacterium divaricatum
ATCC 14020 zu nennen.
Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch Bakterienstämme ein, die
sich als L-Serin produzierende Mutanten oder Produktionsstämme auszeichnen.
Diese können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische
oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden. Beispiele für
erfindungsgemäß geeignete Stämme sind u. a. Corynebacterium glutamicum ATCC
21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 und Brevibacterium ketoglutamicum
ATCC 21222. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Beispiele an
Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen genetisch veränderten
Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form wenigstens eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure der zuvor beschriebenen Art, welche im Vergleich
zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt
exprimiert wird und/oder deren Kopienzahl erhöht ist. Ebenso umfaßt die vorliegende
Erfindung einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer
Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art. Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus auch ein genetisch veränderter
Mikroorganismus enthaltend wenigstens ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit der
Funktion einer Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase der
zuvor beschriebenen Art, welches eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht
genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist. Ein
erfindungsgemäß genetisch veränderter Mikroorganismus zeichnet sich ferner
dadurch aus, daß er ein coryneformes Bakterium, bevorzugt der Gattung
Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Spezies
Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum ist.
Prinzipiell können Gene durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise die
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen
Nukleotidsequenzen (Primern) amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die
Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter
Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien in konservierten Bereichen der
Gene und/oder unter Berücksichtigung des GC-Gehalts der DNA des zu
untersuchenden Mikroorganismus. Diese Methode weist jedoch eine Reihe von
Nachteilen auf, die beispielsweise in der Fehlerhaftigkeit der PCR-Methode selbst
begründet liegen oder darin, daß die zu identifizierenden Gensequenzen geringere
Homologien zu den bereits bekannten Sequenzen aufweisen als anzunehmen ist.
Dies kann zu einer unspezifischen oder sogar ausbleibenden Hybridisierung der
eingesetzten Primer an die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz führen.
Eine weitere Vorgehensweise zur Isolierung von kodierenden Nukleotidsequenzen ist
die Komplementation von sogenannten Defekt-Mutanten des zu untersuchenden
Organismusses, die zumindest phänotypisch einen Funktionsverlust in der Aktivität
des zu untersuchenden Gens oder entsprechenden Proteins aufweisen. Unter einer
Komplementation ist die Aufhebung des Gendefektes der Mutante und weitgehende
Wiederherstellung des ursprünglichen Erscheinungsbildes vor der Mutatgenese zu
verstehen, die durch die Einbringung funktioneller Gene oder Genfragmente aus dem
zu untersuchenden Mikroorganismus erreicht wird.
Ein klassisches Mutagenese-Verfahren zur Herstellung von Defektmutanten ist
beispielsweise die Behandlung der Bakterienzellen mit Chemikalien wie z. B. N-
Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder UV-Bestrahlung. Derartige Verfahren zur
Mutationsauslösung sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A
Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992))
oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American
Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.
Nachteilig ist hierbei eine Zeit- und kostenintensive Selektion der Mutanten mit dem
gewünschten Phänotyp sowie die Tatsache, daß die isolierten Mutanten genetisch
undefiniert sind, da die Mutagenese ungerichtet erfolgt. Letzeres führt häufig zu
unerwarteten Problemen, beispielsweise hinsichtlich der Stabilität dieser Mutanten im
Rahmen eines Produktionsverfahrens im großtechnischen Maßstab.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung
von kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus coryneformen Bakterien zur Verfügung
zu stellen, welches die genannten Nachteile nicht mehr aufweist. Die
erfindungsgemäße Lösung wird durch die nachfolgende Beschreibung näher
erläutert.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren, wobei ein coryneformes Bakterium erzeugt wird, welches durch
Transposon-Mutagenese erzeugte Defekte in den Genen serB und serC aufweist.
Bei der Methode der Transposon-Mutagenese wird die Eigenschaft eines
Transposons ausgenutzt, welches in DNA-Sequenzen zu "springen" und dadurch die
Funktion des betreffenden Gens zu stören bzw. auszuschalten vermag.
Beispiele für Transposons coryneformer Bakterien sind nachfolgend aufgeführt. So
wurde aus dem Corynebacterium xerosis Stamm M82B das Erythromycinresistenz-
Transposon Tn5432 (Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179) und das
Chloramphenicolreistenz-Transposon Tn5546 isoliert. Tauch et al. (Plasmid (1995)
34: 119-131 und Plasmid (1998) 40: 126-139) zeigten, daß eine Mutagenese mit
diesen Transposons möglich ist. Weiterhin wurde aus Corynebacterium glutamicum
ATCC 31831 die Insertionssequenz IS31831 isoliert (Vertes et al., Molecular
Microbiology (1994) 11: 739-746). Durch Kombination von IS31831 mit dem
Kanamycinresistenzgen aphA wurde das künstliche Transposon Tn31831 konstruiert
(Vertes et al., Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405). Vertes et al.
(Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405) und Jaeger et al. (FEMS
Microbiology Letters (1995) 126: 1-6) demonstrierten die Anwendung dieser
Transposons bei den Stämmen Brevibacterium flavum MJ233C und
Corynebacterium glutamicum ATCC 13058.
Ein anderes Transposon ist das Transposon Tn5531, das bei Ankri et al. (Journal of
Bacteriology (1996) 178: 4412-4419) beschrieben wird und beispielhaft im Laufe der
vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. In einer besonderen Ausführungsvariante
der vorliegenden Erfindung wird hierzu der Corynebacterium glutamicum Stamm
ATCC 14752 einer entsprechenden Mutagenese unterworfen. Wahlweise eignet sich
auch der Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 13032. Das Transposon
Tn5531 enthält das aph3 Kanamycinresistenzgen und kann in Form des
Plasmidvektors pCGL0040 (Fig. 2) verabreicht werden. Die Nukleotidsequenz des
Transposons Tn5531 ist unter der Zugangsnummer (accession number) U53587 bei
dem National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) frei
verfügbar. Die vorliegende Erfindung wird durch die Aufzählung der zuvor genannten
Transposons näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.
Im Anschluß an die Transposon-Mutagenese wird eine in dem/n gewünschten
Genen defekte Mutante selektioniert. Eine im serB- und/oder serC-Gen defekte
Mutante wird erfindungsgemäß daran erkannt, daß sie auf Minimalmedium mit L-
Serin gutes Wachstum aber auf Minimalmedium ohne L-Serin jedoch schlechtes
Wachstum zeigt.
Die entsprechend selektionierten Dekfektmutanten coryneformer Bakterienstämme
werden anschließend für die Klonierung und Sequenzierung des serB-, und serC-
Gens eingesetzt.
Die Klonierung der Gene kann beispielsweise durch Komplementation der
Defektmutanten erfolgen. Hierzu wird eine Genbank von der DNA des zu
untersuchenden coryneformen Bakteriums angelegt. Das Anlegen von Genbanken
ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als
Beispiele sind das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die
Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch
von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) genannt. Bathe et al. (Molecular and General Genetics,
252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-
12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575)
angelegt wurde. Erfindungsgemäß eignen sich solche Vektoren, die in coryneformen
Bakterien, vorzugsweise Corynebacterium glutamicum, replizieren. Derartige
Vektoren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiel sei der
Plasmidvektor pZ1 genannt, der bei Menkel et al. (Applied and Environmental
Microbiology (1989) 64: 549-554) beschrieben ist.
Die Genbank wird anschließend mittels Transformation, erfindungsgemäß bevorzugt
durch Elektroporation in den im serB- oder serC-Gen defekten und zuvor
beschriebenen Bakterienstamm überführt. Nach an sich bekannten Methoden
werden diejenigen transformierten Bakterien ausgewählt, die die Fähigkeit besitzen
in Abwesenheit von L-Serin auf Minimalmedium zu wachsen. Die aus diesen
selektionierten Transformanden re-isolierten DNA-Fragmente der ursprünglich
eingesetzten Genbank können anschließend einer Sequenzanalyse unterzogen
werden.
In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung kann aufgrund der
durch Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 erzeugten Defektmutanten eines
coryneformen Bakteriums wie z. B. den Stämmen ATCC 14752serB::Tn5531 und
ATCC 14752serC::Tn5531 das serB::Tn5531-Allel bzw. das serC::Tn5531-Allel direkt
unter Ausnutzung des in dem Transposon enthaltenen Kanamycinresistenzgens
aph3 kloniert und isoliert werden. Hierzu verwendet man bekannte Klonierungs-
Vektoren wie z. B. pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 und Yanisch-
Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119) oder pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE und
Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19: 34; Kobs G (1995) Promega Notes
55: 28; Promega Cooperation, Madison, USA). Als Wirtssysteme zur Klonierung
eignen sich besonders solche Escherichia coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von
Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-
4649) beschrieben wurde. Die Selektion auf Transformanden erfolgt in Gegenwart
von Kanamycin.
Die aus den erhaltenen Transformanden isolierte DNA, welche die interessierenden
Gene enthält, wird anschließend sequenziert. Hierzu kann die von Sanger et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
USA (1977) 74: 5463-5467) beschriebene Dideoxy-Kettenabbruchmethode
verwendet werden. Hiernach erhält man die stromaufwärts und stromabwärts des
Tn5531-Insertionsortes enthaltenen Gene. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen
werden dann mit kommerziell erhältlichen Sequenzanalyse-Programmen wie z. B.
dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR,
Madison, USA) oder dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0, EMBL, Heidelberg,
Deutschland) analysiert und zusammengefügt. Auf die zuvor beschriebene Weise
wurden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren des serB- und serC-Gens
coryneformer Bakterien isoliert und deren Sequenz bestimmt.
Überraschender Weise haben Homologievergleiche mit bekannten Sequenzen
ergeben, daß das von serB kodierte Polypeptid eine moderate Ähnlichkeit zu der
Phosphoserin-Phosphatase aus Escherichia coli aufweist, während das von serC
abgeleitete Polypeptid nur geringe, wenn auch signifikante Ähnlichkeit zu der
Phosphoserin-Aminotransferase von Escherichia coli aufweist. Auch zu bekannten
Phosphoserin-Phosphatasen bzw. Phosphoserin-Aminotransferasen aus anderen
Organismen (z. B. Hefe) weisen die gefundenen corynebacteriellen Gene nur
geringe bis moderate Ähnlichkeit auf. Lediglich die abgeleiteten
Polypeptidsequenzen der mutmaßlichen serB- und serC-Gene aus Mycobacterium
tuberculosis zeigen hohe Ähnlichkeit zu den corynebacteriellen Proteinen. Das
Ergebnis eines solchen Homologievergleichs ist in Tabelle 2 dargestellt. Darüber
hinaus ergibt die Nukleotidsequenz der coryneformen Gene, daß die in EP 0 931 833
verwendeten PCR-Primer zwar für die Amplifizierung der Gene aus Escherichia coli
jedoch aufgrund der besagten geringen Sequenzähnlichkeit nicht für die Isolierung
der coryneformen serB und serC Gene geeignet sind.
Dies verdeutlicht einmal mehr den Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der
Transposon-Mutagenese zur Klonierung der Gene serB und serC aus coryneformen
Bakterien.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur mikrobiellen
Herstellung von L-Serin, wobei wenigstens eine der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren, isoliert aus einem coryneformen Bakterium, in einen homologen
Mikroorganismus übertragen und dort exprimiert wird, wobei die Genexpression
und/oder die Aktivität des entsprechend kodierten Polypeptids gegenüber dem
entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöht ist, dieser
genetisch veränderte Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von L-Serin
eingesetzt wird und das entsprechend gebildete L-Serin aus dem Kulturmedium
isoliert wird.
Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl
der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder
Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts
des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression
mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die
stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren
ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Serin-
Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der
mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte
können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im
Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des
Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus, des
Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der
betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und
Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al.
(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)),
Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al.
(Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent
4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei
LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der
Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in
der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer
(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie.
Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im
fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Serin kultiviert werden. Eine
Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener
Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology"
der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B.
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B.
Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol
und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische
Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische
Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten
Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen
zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontroüe der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle
der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um
aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige
Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur
liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an L-Serin gebildet hat. Dieses
Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse der L-Serin-Bildung kann durch Anionenaustauschchromatographie mit
anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al.
(Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed
phase HPLC erfolgen so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174) beschrieben.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-
Serin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um die
zuvor bereits näher beschriebenen Vertreter coryneformer Bakterien handeln.
Eine Auswahl an Ergebnissen der Fermentation ist in Tabelle 3 dargestellt. Hierbei
zeichnen sich die erfindungsgemäß genetisch veränderten Mikroorganismen durch
eine wesentlich verbesserte L-Serin-Produktion gegenüber den entsprechend nicht
transformierten Mikroorganismen (Wildtypen) oder den Mikroorganismen aus, die
lediglich den Vektor ohne Gen-Insert enthalten.
In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung ist gezeigt, daß
die Überexpression des homologen serB-Gens in C. glutamicum ATCC 13032
(13032 (pVWEx1serB)) zu einer wenigstens 4-fachen Steigerung der L-Serin-
Akkumulation im Medium im Vergleich zu den Kontrollstämmen führt. Durch die
Überexpression des homologen serC-Gens (13032 (pVWEx2serC)) kann eine
wenigstens 20-fache Steigerung der L-Serin-Akkumulation erreicht werden. Durch
die gemeinsame Überexpression beider Gene serB und serC in einem homologen
System ist eine noch weitere Steigerung der L-Serin-Produktion zu erwarten.
Bemerkenswert ist hier vor allen Dingen, daß die Steigerung der L-Serin-
Akkumulation bereits mit dem Wildtyp Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
erreicht wird. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines homologen Aminosäure-
Produktionsstammes kann somit eine noch weiter gesteigerte L-Serin-Produktion
erreicht werden.
Unter Aminosäure-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung
Corynebacterium glutamicum-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu
verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart
verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese
von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering).
Beispielsweise sind bei diesen Aminosäure-Produktionsstämmen ein oder mehrere
Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und
entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges
(Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die
vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Aminosäure-
Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder homologer
Organismen. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme
umfaßt, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen
Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe-Arten nach
gängigen Methoden herstellen kann.
Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Aminosäure-Produktionsstämme umfaßt,
bei denen der Abbau von L-Serin verändert, bevorzugt abgeschwächt ist. Dies kann
beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an L-Serin
degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der auf zuvor beschriebene
Weise hergestellten L-Aminosäuren zum Einsatz in der Nahrungsmittel-, Futtermittel-
und/oder Pharmaindustrie oder in der Humanmedizin. Darüber hinaus finden die
erfindungsgemäß hergestellte Aminosäure L-Serin Verwendung als Vorstufe für die
Synthese von L-Glycin, L-Cystein und/oder L-Tryptophan und/oder davon ableitbaren
Stoffwechselprodukten.
Nachfolgend wird die vorliegenden Erfindung durch Beispiele näher erläutert, die
jedoch nicht limitierend sind:
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur
Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook
et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory
Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht
anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.
Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 wurde einer Mutagenese mit
dem Transposon Tn5531 unterworfen, dessen Sequenz unter der Accession-
Nummer U53587 in der Nukleotid-Datenbank des National Center for Biotechnology
Information (Bethesda, USA) hinterlegt ist. Aus dem Methylase-defekten Escherichia
coli-Stamm GM2929pCGL0040 (Escherichia coli GM2929: Palmer et al., Gene
(1994) 143: 1-12) wurde das Plasmid pCGL0040 isoliert, welches das
zusammengesetzte Transposon Tn5531 enthält (Ankri et al., Journal of Bacteriology
(1996) 178: 4412-4419). Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 14752
wurde mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61:
329-334) mit dem Plasmid pCGL0040 transformiert. Klone, bei denen das
Transposon Tn5531 ins Genom integriert war, wurden anhand ihrer
Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten
identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese
Weise wurden 1800 Klone erhalten, welche auf verzögertes Wachstum in
Anwesenheit von Seryl-Alanin überprüft wurden. Dazu wurden alle Klone einzeln auf
CGXII-Minimalmedium-Agarplatten mit und ohne 2 mM Seryl-Alanin übertragen. Das
Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium CGXII
(Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), enthielt aber zusätzlich 25 µg/mL
Kanamycin und 15 g/L Agar. Die Zusammensetzung des von Keilhauer et al.
beschriebenen Mediums ist in Tabelle 1 dargestellt.
Die Agarplatten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum nach 12, 18 und 24
Stunden untersucht. Es wurden zwei Transposonmutanten erhalten, die mit Seryl-
Alanin vergleichbar mit dem Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC
14752 wuchsen, in Abwesenheit von Seryl-Alanin aber kein Wachstum zeigten. Auch
mit Serin allein wuchsen die Mutanten, so daß gezeigt war, daß es sich um Serin
auxotrophe Mutanten handelt, die einen Defekt im Serin-Stoffwechsel aufweisen
müssen. Diese Mutanten wurde als ATCC 14752ser1::Tn5531 und ATCC
14752ser2::Tn5531 bezeichnet.
Um die stromaufwärts des Transposons Tn5531 gelegenen Insertionsorte in den
beschriebenen Mutanten zu klonieren, wurde zunächst die chromosomale DNA
dieser Mutantenstämme wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87)
beschrieben isoliert und 400 ng davon mit der Restriktionsendonuklease XbaI
geschnitten. Der vollständige Restriktionsansatz wurde in den ebenfalls mit XbaI
linearisierten Vektor pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) der Firma
Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) ligiert. Mit dem gesamten
Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al.,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
USA (1990) 87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Dower et al.,
Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformanden, bei denen auf dem
Vektor pUC18 die Insertionsorte des Transposons Tn5531 kloniert vorlagen, wurden
anhand ihrer Carbenicillin- und Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin und
25 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus jeweils drei der
Transformanden wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse die
Größen der klonierten Inserts bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der Insertionsorte
auf den Plasmiden mit einem ca. 10 kb großen Inserts im Falle von ser1::Tn5531,
bzw. 4,5 kb großen Insert im Falle von ser2::Tn5531 wurden nach der Dideoxy-
Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
Hierzu wurden jeweils zunächst ca. 600 bp der beiden Inserts ausgehend von
folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC
CCA GG-3'. Mittels Primer-Walking wurden dann jeweils Sequenzverlängerungen
durchgeführt, sodaß insgesamt ca. 1,4 kb des Inserts aus ser1::Tn5531, bzw. 1,2 kb
des Inserts aus ser2::Tn5531 sequenziert werden konnten. Die Analyse mit dem
Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR,
Madison, USA) ergab, daß in beiden Fällen das Transposon in den Beginn eines
offenen Leserahmens inseriert war.
Zur Identifizierung der stromabwärts des Transposons gelegenen Insertionsorte
wurde die chromosomale DNA der Mutanten mit der Restriktionsendonuklease
EcoRI geschnitten und in den mit EcoRI linearisierten Vektor pUC18 ligiert. Die
weitere Klonierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die
Nukleotidsequenzen der Insertionsorte auf einem der Plasmide ausgehend von
ser1::Tn5531 mit einem ca. 6,5 kb großen Insert, bzw auf einem der Plasmide
ausgehend von ser2::Tn5531 mit einem ca. 5,0 kb großen Insert wurden nach der
Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-
5467). Hierzu wurden ca. 400 bp des Inserts aus ser1::TN5531, bzw. ca. 220 bp des
Inserts aus ser2::Tn5531 ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer
sequenziert: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.
Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit dem Programmpaket Lasergene
(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert und
zusammengefügt. Die Nukleotidsequenzen sind als SEQ-ID-No. 1 und SEQ-ID-No. 3
wiedergegeben. Die Analyse ergab die Identifizierung von jeweils einem offenen
Leseraster von 1209 bp für ser1::Tn5531, und das entsprechende Gen wurde als
ser8 bezeichnet, und von 1128 bp Länge für ser2::Tn5531, und das entsprechende
Gen wurde als serC-Gen bezeichnet. Die dazugehörigen Genprodukte umfassen 403
und 376 Aminosäuren und sind als SEQ-ID-No. 2 und SEQ-ID-No. 4 wiedergegeben.
Die Gene serB, und serC wurden in den Escherichia coli Klonierungsvektor pGEM-T
(Zhou M-Y, Clark SE und Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19: 34; Kobs G
(1995) Promega Notes 55: 28; Promega Cooperation, Madison, USA) kloniert. Die
Klonierung wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurden durch eine
Polymerasekettenreaktion (PCR) jeweils die Gene aus Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 mittels folgender aus SEQ-ID-No. 1 bzw. SEQ-ID-No. 3 abgeleiteter
Oligonukleotid-Primer amplifiziert.
serB-forward:
5'-GCAGAGGCACACACTGGAC-3'
serB-reverse:
5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3'
serC-forward:
5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3'
serC-reverse:
5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3'
serB-forward:
5'-GCAGAGGCACACACTGGAC-3'
serB-reverse:
5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3'
serC-forward:
5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3'
serC-reverse:
5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3'
Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM Deoxynukleotid
triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM des entsprechenden
Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer
hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR
System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem
Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden
Bedingungen durchgeführt: 94°C für 60 Sekunden, 56°C für 90 Sekunden und 72°C
für 2 Minuten.
Das amplifizierte etwa 1,7 kb große serB- Fragment sowie das amplifizierte etwa 1,3 kb
große serC-Fragment wurden dann im folgenden mit Hilfe des Promega PCR
Cloning Kits nach Angaben des Herstellers mit dem Vektor pGEM-T ligiert. Mit
beiden Ligationsansätzen wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al.,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanden wurden anhand ihrer
Ampicillinresistenz auf 50 µg/mL Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert:
Aus jeweils 10 der Transformanden wurden die Plasmide präpariert und durch
Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein der 1,7 kb bzw. 1,3 kb PCR-Fragmente
als Inserts überprüft. Die so entstandenen rekombinanten Plasmide werden im
folgenden mit pGEM-TserB und pGEM-TserC bezeichnet.
Die Ermittlung der Nukleotidsequenzen der 1,7 kb bzw. 1,3 kb PCR-Fragmente in
Plasmid pGEM-TserBexp bzw. Plasmid pGEM-TserCexp wurden nach der Dideoxy-
Kettenabbruchmethode von Sanger et al. durchgeführt (Proceedings of the National
Acaderny of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
Hierzu wurden die vollständigen Inserts von pGEM-TserB und pGEM-TserC mit Hilfe
folgender Primer der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland)
sequenziert.
Universal-Primer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverse-Primer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
Universal-Primer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverse-Primer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
Die Nukleotidsequenz des Inserts in dem Plasmid pGEM-TserB ist als SEQ-ID-No. 5,
die des Inserts in dem Plasmid pGEM-TserC als SEQ-ID-No. 7 wiedergegeben. Die
erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket Lasergene
(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert. Die
Analyse ergab die Identifizierung von jeweils einem offenen Leseraster von 1209 bp,
und 1128 bp Länge. Die entsprechenden Gene wurden als serB und serC
bezeichnet. Die dazugehörigen Genprodukte kodieren für Polypeptide, die 403 bzw.
376 Aminosäuren lang sind, und die als SEQ-ID-No. 6 und SEQ-ID-No. 8
wiedergegeben sind.
Zur Untersuchung der Auswirkung der Überexpression der Gene für die
Phosphoserin-Phosphatase serB und die Phosphoserin-Aminotransferase serC auf
die Serin-Produktion wurden die Expressionsvektoren pVWEXI (Wendisch, V.,
Dissertation Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997; vermittelt eine Kanamycin-
Resistenz) und pVWEX2 (Wendisch, V., Dissertation Heinrich-Heine Universität,
Düsseldorf, 1997; vermittelt eine Tetracyclin-Resistenz) verwendet, die eine IPTG-
induzierbare Expression (Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring
Harbour Laboratory Press) erlauben. In den Vektor pVWEXI wurde das serB Gen
und in den Vektor pVWEX2 das serC Gen promotorlos hinein kloniert. Dazu wurden
zunächst folgende Primer synthetisiert:
serB-exp-for:
5'-ATCTAGAATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3'
serB-exp-rev:
5'-AGGATCCTTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3'
serC-exp-for:
5'-AGCATGCATGCCCGAAGACATGACCG-3'
serc-exp-rev:
5'-ATCTAGATTACTTCCTTGCAAAACCGC-3'
serB-exp-for:
5'-ATCTAGAATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3'
serB-exp-rev:
5'-AGGATCCTTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3'
serC-exp-for:
5'-AGCATGCATGCCCGAAGACATGACCG-3'
serc-exp-rev:
5'-ATCTAGATTACTTCCTTGCAAAACCGC-3'
Mittels PCR wurde das promotorlose serB-Gen als ein 1226 bp großes Fragment
(SEQ-ID-No. 5 Basen 382 bis 1594) und das promotorlose serC-Gen als 1157 bp
Fragment (SEQ-ID-No. 7 Basen 132 bis 1261) aus chromosomaler DNA von
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 amplifiziert. Die Primer wurden so
gewählt, daß Primer serB-exp-for eine XbaI-Schnittstelle vermittelt, Primer serB-exp-
rev eine BamHI-Schnittstelle, Primer serC-exp-for eine SphI-Schnittstelle und Primer
serC-exp-rev eine XbaI-Schnittstelle. Die isolierten PCR-Produkte wurden zunächst
wie oben beschrieben in den Vektor pGEM-T kloniert, und die Plasmide pGEM-
TserBexp und pGEM-TserC-exp erhalten. Anschließend wurde das promotorlose
serB-Gen mittels XbaI-BamHI-Restriktion aus dem Vektor pGEM-TserBexp
ausgeschnitten, und in den entsprechend mit XbaI-BamHI linearisierten Vektor
pVWEX1 ligiert. Das promotorlose serC-Gen wurde nach SpeI-XbaI-Restriktion aus
dem Vektor pGEM-TserBexp ausgeschnitten und in den mit XbaI linearisierten
Vektor pVWEX2 ligiert. Die erhaltenen Konstrukte pVWEX1 serB (Fig. 3) und
pVWEX2serC (Fig. 4) wurden durch Restriktion getestet.
Die Plasmide pVWEX1-serB und pVWEX2-serC wurden jeweils einzeln durch
Elektroporation in den Wildtyp Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 13032
eingebracht, resultierend in den Stämmen C. glutamicum 13032(pVWEX1 serB) und
C. glutamicum 13032(pVWEX2serC). Als Negativ-Kontrolle wurde der Wildtyp
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sowie der C. glutamicum-Stamm ATCC
enthaltend den Vektoren pVWEX1 ohne Insert kultiviert. Die L-Serinausscheidung
wurde anschließend von allen zuvor genannten Stämmen bestimmt und vergleichend
in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Dazu wurden die Stämme in Komplexmedium (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory
manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press; mit 50 µg/l Kanamycin, 25 µg/l
Tetracyclin bzw. 50 µg/l Kanamycin und 25 µg/l Tetracyclin) gezüchtet, und das
Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) jeweils aus den
Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich das/die
entsprechende(n) Antibiotika sowie 200 µg/ml IPTG. Nach Kultivierung für 24
Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute
wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Bestimmung der
Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitchromatographie (J
Chromat (1983) 266: 471-482).
Fig. 1: Nukleinsäuresequenzen enthaltend die Gene serB und serC sowie davon
abgeleitete Aminosäuresequenzen SerB und SerC aus Corynebacterium
glutamicum ATCC 14752 (SEQ ID No 1-4) und Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 (SEQ ID No 5-8)
Fig. 2: Schematische Darstellung des Vektors pCGL0040
Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Amp = β-Lactamase-Gen, welches Ampicillin-Resistenz vermittelt
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
Amp = β-Lactamase-Gen, welches Ampicillin-Resistenz vermittelt
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
Ferner sind Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegeben
Fig. 3: Schematische Darstellung des Vektors pVWEx1serB
Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
lacIq = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
Ptac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coli
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
lacIq = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
Ptac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coli
Ferner sind Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegeben
Fig. 4: Schematische Darstellung des Vektors pVWEx1 serC-1
Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
Tet = tetα1-Gen aus dem Plasmid pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), welches Tetracyclin-Resistenz vermittelt
lacIq = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
Ptac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coli
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
Tet = tetα1-Gen aus dem Plasmid pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), welches Tetracyclin-Resistenz vermittelt
lacIq = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
Ptac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coli
Ferner sind Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegeben
Tabelle 1: Zusammensetzung des Mineralsalz-Mediums CGXII zur Kultivierung von
coryneformen Bakterien
Tabelle 2: Vergleich der Ähnlichkeiten der Phosphoserin-Aminotransferase (PSAT;
serC) und der Phosphoserin-Phosphatase (PSP; serB) von
Corynebacterium glutamicum zu bekannten Phosphoserin-
Aminotransferasen und Phosphoserin-Phosphatasen anderer Organismen
Tabelle 3: Vergleichende Übersicht der Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand
des Corynebacterium glutamicum Wildtyps ATCC 13032 sowie der mit
den entsprechenden Plasmiden transformierten Corynebacterium
glutamicum Stämme ATCC 13032(pVWEX1), ATCC 13032(pVWEX1serB)
und ATCC 13032(pVWEX2serC)
Claims (20)
1. Isolierte Nukleinsäure kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase enthaltend
ein Gen serB ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 1 oder 5
oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenzen oder mit diesen
hybridisierende Nukleotidsequenzen.
2. Isolierte Nukleinsäure kodierend für eine Phosphoserin-Aminotransferase
enthaltend ein Gen serC ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No
3 oder 7 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenzen oder mit
diesen hybridisierende Nukleotidsequenzen.
3. Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium
oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum
oder Brevibacterium flavum isoliert werden.
4. Phosphoserin-Phosphatase oder ein Teil davon kodiert durch eine
Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3.
5. Phosphoserin-Phosphatase gemäß Anspruch 4 mit einer Aminosäuresequenz
ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No. 2 oder 6 oder einer
modifizierten Form dieser Polypeptidsequenzen oder Isoformen davon oder
Mischungen daraus.
6. Phosphoserin-Aminotransferase oder ein Teil davon kodiert durch eine
Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3.
7. Phosphoserin-Aminotransferase gemäß Anspruch 6 mit einer
Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No. 4
oder 8 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenzen oder Isoformen
davon oder Mischungen daraus.
8. Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß
sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder
Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder
Brevibacterium flavum stammen.
9. Genstruktur enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den
Ansprüchen 1 bis 3 sowie mit dieser operativ verknüpfte regulatorische
Sequenzen.
10. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1
bis 3 oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 9 sowie zusätzliche
Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszelle oder zur
Integration in das Wirtszell-Genom.
11. Genetisch veränderter Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form
wenigstens eine Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welche im
Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus
verstärkt exprimiert wird und/oder deren Kopienzahl erhöht ist.
12. Genetisch veränderter Mikroorganismus gemäß Anspruch 11 enthaltend in
replizierbarer Form eine Genstruktur gemäß Anspruch 9 oder einen Vektor
gemäß Anspruch 10.
13. Genetisch veränderter Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12
enthaltend wenigstens ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 4 bis 8, welches
eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten
Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist.
14. Genetisch veränderter Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13
dadurch gekennzeichnet, daß er ein coryneformes Bakterium ist, bevorzugt der
Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium.
15. Genetisch veränderter Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14,
dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bakterium der Spezies Corynebacterium
glutamicum oder Brevibacterium flavum ist.
16. Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen kodierend für an der
Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine gekennzeichnet dadurch, daß sie
ausgehend von Nukleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3
hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält.
17. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei ein coryneformes Bakterium erzeugt wird, welches durch Transposon-
Mutagenese erzeugte Defekte in den Genen serB und serC aufweist.
18. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) wenigstens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 isoliert aus einem coryneformen Bakterium in einen homologen Mikroorganismus übertragen und dort exprimiert wird, wobei die Genexpression und/oder die Aktivität des entsprechend kodierten Polypeptids gegenüber dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöht ist,
- b) dieser genetisch veränderte Mikroorganismus aus Schritt b) zur fermentativen Herstellung von L-Serin eingesetzt wird und
- c) das entsprechend gebildete L-Serin aus dem Kulturmedium isoliert wird.
19. Verwendung der nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 hergestellten L-
Aminosäuren zum Einsatz in der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und/oder
Pharmaindustrie oder in der Humanmedizin.
20. Verwendung der nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 hergestellten
Aminosäure L-Serin als Vorstufe für die Synthese von L-Glycin, L-Cystein
und/oder L-Tryptophan und/oder davon ableitbaren Stoffwechselprodukten.
Priority Applications (10)
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DE10044831A DE10044831A1 (de) | 2000-03-01 | 2000-09-11 | Verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter Mikroorganismus |
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PCT/EP2001/002283 WO2001064899A2 (de) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | Nukleotidsequenzen kodierend für proteine beteiligt an der biosynthese von l-serin, verbessertes verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter mikroorganismus |
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DE50107566T DE50107566D1 (de) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | Nukleotidsequenzen kodierend fur proteine beteiligt an der biosynthese von l-serin, verbessertes verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veranderter mikroorganismus |
JP2001563588A JP2003525046A (ja) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | L−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、l−セリンを微生物学的に製造するための改善された方法、ならびにこのために適切な遺伝子的に改変した微生物 |
DK01929377T DK1259622T3 (da) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | Nukleotidsekvenser, som koder for proteiner, der er involveret i biosyntese af L-serin, forbedret fremgangsmåde til mikrobiel fremstilling af L-serin samt en dertil egenet genetisk forandret mikroorganisme |
AT01929377T ATE305515T1 (de) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | Nukleotidsequenzen kodierend fur proteine beteiligt an der biosynthese von l-serin, verbessertes verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veranderter mikroorganismus |
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