DE10006147A1 - Process for the preparation of monoglycosidated flavonoids - Google Patents

Abstract

The invention relates to a method for producing monoglycosidated flavonoids by enzymatic hydrolysis of rutinosides, using an enzyme immobilized on a carrier for the enzymatic hydrolysis. The inventive method reduces the costs for the enzymes, and simultaneously provides for a high degree of automation associated and an optimized space/time yield.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutinosiden. Dabei wird der Rhamno­ serest der Rutinoside enzymatisch abgespalten.The present invention relates to a method for producing monoglycosidated Flavonoids through enzymatic hydrolysis of rutinosides. The Rhamno Serest of the rutinosides are cleaved off enzymatically.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Rutinoside solche Verbindungen bezeichnet, die einen zuckerfreien Bestandteil enthalten, an welchen ein Rest der For­ mel (I)
In the context of the present invention, rutinosides are compounds which contain a sugar-free constituent to which a radical of the formula (I)

über eine glycosidische Bindung gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei den Rutinosiden um Flavonoide mit der in Formel (I) dargestellten bisglycosidischen Einheit. Rhamnose und/oder die entsprechenden Glucopyranoside können aus den Rutinosiden gewonnen werden. Die Glucopyranoside leiten sich von den Rutinosiden dadurch ab, daß sie anstelle des Rests der Formel (I) einen Rest der Formel (I*)
is bound via a glycosidic bond. For example, the rutinosides are flavonoids with the bisglycosidic unit shown in formula (I). Rhamnose and / or the corresponding glucopyranosides can be obtained from the rutinosides. The glucopyranosides are derived from the rutinosides in that instead of the radical of the formula (I) they contain a radical of the formula (I *)

enthalten, der an den zuckerfreien Bestandteil gebunden ist. Beispielsweise können aus Rutin sowohl Rhamnose als auch Isoquercetin gewonnen werden. included, which is bound to the sugar-free ingredient. For example, from Rutin both rhamnose and isoquercetin can be obtained.  

Rhamnose ist ein Monosaccharid, welches in der Natur weit verbreitet, allerdings zu­ meist nur in geringen Mengen vorkommt. Eine wichtige Quelle für Rhamnose sind z. B. die glycosidischen Reste natürlicher Flavonoide, wie Rutin, aus welchen die Rhamnose durch Glycosidspaltung gewonnen werden kann. Rhamnose spielt beispielsweise eine wichtige Rolle als Ausgangsstoff für die Darstellung von künstlichen Aromastoffen, wie Furaneol.Rhamnose is a monosaccharide, which is widely used in nature, however mostly occurs only in small quantities. An important source of rhamnose are e.g. B. the glycosidic residues of natural flavonoids, such as rutin, from which the rhamnose can be obtained by glycoside cleavage. For example, Rhamnose plays one important role as a raw material for the representation of artificial flavorings, like furaneol.

Isoquercetin ist ein monoglycosidiertes Flavonoid der folgenden Strukturformel (II)
Isoquercetin is a monoglycosidated flavonoid of the following structural formula (II)

Als Flavonoide (lat. flavu = gelb), die in Pflanzen weit verbreitete Farbstoffe sind, werden z. B. Glycoside von Flavonen, denen das Grundgerüst des Flavons (2-Phenyl-4H-1- benzopyran-4-on) gemeinsam ist, bezeichnet.As flavonoids (lat. Flavu = yellow), which are widely used dyes in plants e.g. B. Glycosides of flavones, to which the basic structure of flavones (2-phenyl-4H-1- benzopyran-4-one) is common.

Der zuckerfreie Bestandteil der Flavonoide ist das sogenannte Aglykon. Isoquercetin ist beispielsweise ein Glycosid des Aglykons Quercetin (2-(3,4-Dihydrophenyl)-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on), welches sich von Flavon durch das Vorhandensein von fünf Hydroxylgruppen unterscheidet. Im Isoquercetin ist der Kohlenhydratrest Glucose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercetins gebunden. Isoquercetin wird z. B. als Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid oder 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(β-D- glucopyranosyloxy)-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on bezeichnet. Es ist aber bei­ spielsweise auch unter dem Namen Hirsutrin bekannt. The sugar-free component of the flavonoids is the so-called aglycon. Isoquercetin is for example, a glycoside of the aglycone quercetin (2- (3,4-dihydrophenyl) -3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one), which differs from flavone by the presence differs from five hydroxyl groups. The carbohydrate residue is in isoquercetin Glucose bound to the hydroxyl group in position 3 of the quercetin. Isoquercetin z. B. as quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside or 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3- (β-D- called glucopyranosyloxy) -5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. But it is known for example also under the name Hirsutrin.  

Flavonoide bzw. Flavonoidgemische werden beispielsweise in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie verwendet und gewinnen dort zunehmend an Bedeutung. Besonders monoglycosidierte Flavonoide, wie z. B. Isoquercetin, zeichnen sich durch eine gute Aufnahmefähigkeit im menschlichen Körper aus.Flavonoids or flavonoid mixtures are used, for example, in food and Cosmetics industry uses and are becoming increasingly important there. Especially monoglycosidated flavonoids such as e.g. B. isoquercetin, are characterized by a good Receptivity in the human body.

Ein Beispiel für ein natürlich vorkommendes Flavonoid mit bisglycosidischer Einheit ist Rutin, welches folgende Strukturformel (III) besitzt:
An example of a naturally occurring flavonoid with a bisglycosidic unit is rutin, which has the following structural formula (III):

Rutin ist wie Isoquercetin ebenfalls ein Glycosid des Aglykons Quercetin, wobei der Kohlenhydratrest Rutinose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercetins gebun­ den ist. Der Kohlenhydratrest im Rutin besteht aus einer in 1- und 6-Stellung verknüpf­ ten Glucose- und einer teminal gebundenen Rhamnose- bzw. 6-Deoxymannose-Einheit. Rutin wird z. B. als Quercetin-3-O-β-D-rutinosid oder 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-{[6-O- (6-deoxy-α-mannopyranosol)-β-D-glucopyranosyl]oxy}-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran- 4-on bezeichnet. Es ist jedoch beispielsweise auch unter den Namen Sophorin, Birutan, Rutabion, Taurutin, Phytomelin, Melin oder Rutosid bekannt.Like isoquercetin, rutin is also a glycoside of the aglycon quercetin Carbohydrate residue rutinose bound to the hydroxyl group in position 3 of quercetin that is. The carbohydrate residue in rutin consists of a link in the 1- and 6-position ten glucose and one teminally bound rhamnose or 6-deoxymannose unit. Rutin is e.g. B. as quercetin-3-O-β-D-rutinoside or 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3 - {[6-O- (6-deoxy-α-mannopyranosol) -β-D-glucopyranosyl] oxy} -5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran 4-on designated. However, it is also known, for example, under the names Sophorin, Birutan, Rutabion, Taurutin, Phytomelin, Melin or Rutosid known.

Rutin bildet mit drei Molekülen Kristallwasser blaßgelbe bis grünliche Nadeln. Wasser­ freies Rutin hat die Eigenschaft einer schwachen Säure, wird bei 125°C braun und zersetzt sich bei 214-215°C. Rutin, das in vielen Pflanzenarten - häufig als Begleiter des Vitamins C - vorkommt, z. B. in Zitrusarten, in gelben Stiefmütterchen, Forsythien-, Aka­ zienarten, verschiedene Solanum- und Nicotiana-Arten, Kapern, Lindenblüten, Johanniskraut, Tee usw., wurde 1842 aus der Gartenraute (Ruta graveolens) isoliert. Rutin kann auch den Blättern des Buchweizens und der ostasiatischen Färberdroge Wei-Fa (Sophora japonica, Fabaceae), die 13-27% Rutin enthält, gewonnen werden.With three molecules of water of crystallization, rutin forms pale yellow to greenish needles. Water Free rutin has the property of a weak acid, turns brown at 125 ° C and decomposes  at 214-215 ° C. Rutin, which is found in many plant species - often as a companion to the Vitamins C - occurs e.g. B. in citrus, in yellow pansies, forsythia, Aka Zienarten, various Solanum and Nicotiana species, capers, linden flowers, St. John's wort, tea, etc., was isolated in 1842 from the garden rhombus (Ruta graveolens). Rutin can also be the leaves of buckwheat and the East Asian dye drug Wei-Fa (Sophora japonica, Fabaceae), which contains 13-27% rutin, can be obtained.

Es ist wünschenswert, sowohl Rhamnose als auch monoglycosidierte Flavonoid aus natürlichen Rohstoffen, beispielsweise aus Flavonoiden mit einer bisglycosidischen Ein­ heit, herzustellen. In diesem Zusammenhang ist z. B. die Spaltung von Rutinosiden zu Rhamnose und den entsprechenden Glucopyranosiden interessant.It is desirable to have both rhamnose and monoglycosidated flavonoid natural raw materials, for example from flavonoids with a bisglycosidic one to manufacture. In this context, e.g. B. the cleavage of rutinosides Rhamnose and the corresponding glucopyranosides interesting.

Enzymatisch katalysierte Darstellungen von Rhamnose sind in der Literatur beschrie­ ben. Beispielsweise sind in der EP-A-0317033 ein Verfahren zur Herstellung von L-Rhamnose beschrieben, wobei die rhamnosidische Bindung von Glycosiden, die Rhamnose in terminaler Position gebunden halten, durch enzymatische Hydrolyse er­ reicht wird. Bei dieser Spaltung wird das Substrat üblicherweise als Suspension in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Jedoch sind diese Reaktionen zumeist wenig selektiv. Beispielsweise entsteht aufgrund der bisglycosidischen Struktur des Kohlenhydratrestes im Rutin oft eine Mischung der beiden Monosaccharide Glucose und Rhamnose. Zudem entstehen zumeist hohe Anteile am Aglykon Quercetin sowie weitere unerwünschte Ne­ benprodukte.Enzymatically catalyzed representations of rhamnose are described in the literature ben. For example, EP-A-0317033 describes a process for the production of L-rhamnose described, the rhamnosidische binding of glycosides, the Keep rhamnose bound in the terminal position by enzymatic hydrolysis is enough. In this cleavage, the substrate is usually used as a suspension in one performed aqueous medium. However, these reactions are mostly not very selective. For example, due to the bisglycosidic structure of the carbohydrate residue in rutin often a mixture of the two monosaccharides glucose and rhamnose. In addition mostly high proportions of Aglykon quercetin as well as other undesirable Ne arise products.

Weiterhin werden enzymatisch katalysierte Spaltungen von Rutin auch in der JP-A-01213293 beschrieben. Allerdings verlaufen derartige in wäßrigen Medien durch­ geführte Reaktionen zumeist ebenfalls wenig selektiv.Furthermore, enzymatically catalyzed cleavages of rutin are also used in the JP-A-01213293. However, such run through in aqueous media conducted reactions mostly also not very selective.

Diese vorstehend beschriebenen Verfahren verwenden das Enzym in Lösung, d. h. na­ tiv. Dabei wird das Enzym direkt der Reaktionslösung zugegeben. Obwohl diese Verfah­ ren im Labormaßstab durchführbar sind, sind sie für eine technische Anwendung nicht praktikabel, da das Enzym aus der Reaktionslösung zur erneuten Verwendung nicht zurückgewonnen werden kann. Der einmalige Gebrauch dieser teuren Enzyme ist je­ doch bei einer technischen Anwendung nicht wirtschaftlich.These methods described above use the enzyme in solution, i.e. H. well tiv. The enzyme is added directly to the reaction solution. Although this procedure ren are feasible on a laboratory scale, they are not for a technical application practical because the enzyme from the reaction solution is not reusable  can be recovered. The one-time use of these expensive enzymes is ever but not economical for a technical application.

Es ist bekannt, daß Enzyme technisch einsetzbar sind, indem sie an einen Träger ge­ bunden werden. Dieses Verfahren wird als "Immobilisieren" bezeichnet. Unter dem Be­ griff "immobilisierte Enzyme" werden durch die European Federation of Biotechnology (1983) alle Enzyme zusammengefaßt, ". . . die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt" (Helmut Uhlig, Technische Enzyme und ihre Anwendung, Carl Hanser Verlag, München/Wien, 1991, S. 198). Trotz dieses Vorteils ist eine Immo­ bilisierung jedoch nicht für alle Enzymprozesse geeignet und hat sich bisher auch nur begrenzt durchgesetzt. Insbesondere finden nur zwei immobilisierte Enzyme großtech­ nisch Anwendung: Die Glucoseisomerisierung mit immobilisierter Glucoseisomerase und die Penicillin-G-Spaltung mit immobilisierter Penicillinamidase. Oft können immobili­ sierte Enzymverfahren nicht gegenüber den freien Enzymen oder chemischen Verfah­ ren bestehen. Oft sind auch die Enzyme oder die Reaktionsbedingungen für eine Im­ mobilisierung nicht geeignet. Es gibt also keine Universalmethode für das Immobili­ sieren, und jedes Enzym muß individuell betrachtet werden.It is known that enzymes can be used industrially by ge on a carrier be bound. This process is called "immobilization". Under the Be "Immobilized enzymes" are handled by the European Federation of Biotechnology (1983) summarized all the enzymes "... That are in a state that is their Reuse allowed "(Helmut Uhlig, Technical Enzymes and their Application, Carl Hanser Verlag, Munich / Vienna, 1991, p. 198). Despite this advantage is a real estate However, bilization is not suitable for all enzyme processes and so far has only been limited enforcement. In particular, only two immobilized enzymes find large technology nisch application: glucose isomerization with immobilized glucose isomerase and penicillin G cleavage with immobilized penicillin amidase. Often, immobili enzyme processes compared to free enzymes or chemical processes ren exist. Often the enzymes or the reaction conditions for an Im mobilization not suitable. So there is no universal method for immobilization sieren, and each enzyme must be considered individually.

Beispielsweise kommt es in wäßrigen Systemen, wie sie für die Funktionstüchtigkeit von Enzymen wichtig sind, zu Löslichkeitsproblemen bei Rutinosiden, die bei der enzymati­ schen Hydrolyse als Substrat dienen. Diese Reaktion wird deshalb vorzugsweise mit einer übersättigten Substratlösung, d. h. als Rutinosidsuspension, durchgeführt. Bei ei­ ner übersättigten Lösung, in der das Substrat als Feststoff vorliegt, ist jedoch eine An­ wendung der Immobilisierungstechniken unmöglich. Es mangelt dabei an der Selektivität zwischen Rohstoff und Produktpartikeln und feststoffgebundenem Enzym.For example, it occurs in aqueous systems such as those for the functionality of Enzymes are important to solubility problems with rutinosides, which in the enzymati hydrolysis serve as a substrate. This reaction is therefore preferred a supersaturated substrate solution, i.e. H. as a rutinoside suspension. With egg However, a supersaturated solution in which the substrate is present as a solid is an option immobilization techniques impossible. The selectivity is lacking between raw material and product particles and solid-bound enzyme.

Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Enzymen zur Verfügung zu stellen, das im technischen Maß­ stab angewendet werden kann, wobei hohe Enzymkosten vermieden werden und gleichzeitig ein hoher Automatisierungsgrad verbunden mit einer hohen Raum/Zeit- Ausbeute und einer hohen Produktivität und Selektivität erreicht wird. It is therefore the object of the present invention to produce a method of monoglycosidated enzymes to provide that on an industrial scale stab can be applied, avoiding high enzyme costs and at the same time a high degree of automation combined with a high space / time Yield and high productivity and selectivity is achieved.  

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutionosiden, worin für die enzymati­ sche Hydrolyse ein Enzym, das auf einem Träger immobilisiert ist, verwendet wird.This object is achieved by a process for the production of monoglycosidated Flavonoids by enzymatic hydrolysis of Rutionosiden, wherein for the enzymati hydrolysis, an enzyme immobilized on a support is used.

Überraschend wurde gefunden, daß trotz einer geringen Löslichkeit von Rutinosiden eine enzymatische Hydrolyse mit einem immobilisierten Enzym möglich ist. Durch die Immobilisierung kann das Verfahren kontinuierlich und mit einer hohen Effektivität im Vergleich zu der Reaktion mit dem nativen Enzym durchgeführt werden. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß eine hohe Au­ tomatisierung des gesamten Verfahrens einschließlich der Rückführung des Lösungs­ mitttels sowie der Überwachung der Enzymaktivität möglich ist.Surprisingly, it was found that despite the low solubility of rutinosides enzymatic hydrolysis with an immobilized enzyme is possible. Through the The process can be immobilized continuously and with high effectiveness in Comparison to the reaction can be carried out with the native enzyme. That invented Process according to the invention is particularly characterized in that a high Au Automation of the entire process, including return of the solution means and monitoring of enzyme activity is possible.

In Abb. 1 wird als Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens die kontinuierliche Herstellung von Isoquercetin aus Rutin dargestellt.In Fig. 1, the continuous production of isoquercetin from rutin is shown as an example of the method according to the invention.

Geeignete Rutinoside für das erfindungsgemäße Verfahren sind jene, die als zucker­ freien Bestandteil oder Aglykon einen 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-on-Grundkörper enthalten, der in der Position 3 einen Rest der Formel (I) trägt und dessen Phenylgrup­ pen, abgesehen von der Position 3, auch ein- oder mehrfach durch -OH oder -O(CH₂)_n-H, wobei n 1 bis 8 bedeutet, substituiert sein können. n bedeutet vorzugs­ weise 1.Suitable rutinosides for the process according to the invention are those which contain a 2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one base body as a sugar-free constituent or aglycon, which bears a radical of the formula (I) in position 3 and its phenyl group pen, apart from position 3, can also be substituted one or more times by -OH or -O (CH ₂ ) _n -H, where n is 1 to 8. n preferably means 1.

Die Substitution des 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-on-Grundkörpers durch -OH und/oder -O(CH₂)_n-H tritt bevorzugt in den Positionen 5, 7, 3' und/oder 4' auf.The substitution of the 2-phenyl-4H-1-benzopyran-one base body by -OH and / or -O (CH ₂ ) _n -H preferably occurs in positions 5, 7, 3 'and / or 4'.

Besonders bevorzugt werden Rutinoside verwendet, die durch die Formel (A) dargestellt werden:
Rutinosides, which are represented by the formula (A), are particularly preferably used:

worin R H, OH oder OCH₃ darstellt.wherein RH, OH or OCH represents ₃ .

Die Verbindung, worin R H darstellt, wird als Kämpferolrutinosid bezeichnet; das Ru­ tinosid, worin R OCH₃ darstellt, ist als Isorhamnetinrutinosid bekannt. Die Verbindung, worin R OH bedeutet, wird als Rutin bezeichnet. Demzufolge können gemäß dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren aus Kämpferolrutinosid Rhamnose und Kämpferolglucosid, aus Rutin Rhamnose und Isoquercetin und aus Isorhamnetinrutinosid Rhamnose und Isorhamnetinglycosid erhalten werden.The compound in which RH represents is referred to as fighter olrutinoside; the ru tinoside, wherein R represents OCH ₃ , is known as isorhamnetin rutinoside. The compound in which R is OH is called rutin. Accordingly, rhamnose and fighter olglucoside, from rutin rhamnose and isoquercetin, and from isorhamnetin rutinoside rhamnose and isorhamnetin glycoside can be obtained according to the process of the invention.

Besonders bevorzugt wird das Rutinosid Rutin verwendet.The rutinoside rutin is particularly preferably used.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können die Rutinoside in reiner Form oder auch als Gemische von Rutinosiden eingesetzt werden. Ebenfalls können die Rutinoside mit anderen Flavonoiden oder mit Rückständen aus der Rutino­ sidproduktion verunreinigt sein, ohne daß die Reaktion negativ beeinflußt wird. The rutinosides in can be used as starting material for the process according to the invention pure form or as mixtures of rutinosides. Likewise the rutinosides can be mixed with other flavonoids or with residues from the rutino be contaminated without negatively affecting the reaction.  

Als Enzyme für die enzymatische Hydrolyse der Rutinoside können übliche Hydrolasen verwendet werden, die in der Lage sind, den Rhamnoserest der Rutinoside abzuspal­ ten. Vorzugsweise werden Hydrolasen, die aus dem Stamm Penicillium decumbens gewonnen werden, verwendet. Besonders bevorzugt werden als Enzyme α-L- Rhamnosidasen verwendet, da diese eine hohe Selektivität für die Hydrolyse des Rhamnoserestes besitzen. Geeignete α-L-Rhamnosidasen sind beispielsweise Hesperidinase, Naringinase, sowie jene, die in Kurosawa et al. (1973), J. Biochem., Bd. 73: 31-37 beschrieben werden. Es ist besonders bevorzugt, das Enzym Hesperidi­ nase zu verwenden.Common hydrolases can be used as enzymes for the enzymatic hydrolysis of the rutinosides can be used, which are able to split off the rhamnose residue of the rutinosides Hydrolases, which are derived from the Penicillium decumbens strain, are preferred won, used. Particularly preferred enzymes are α-L- Rhamnosidases used because this has a high selectivity for the hydrolysis of Own rhamnose residues. Suitable α-L-rhamnosidases are for example Hesperidinase, naringinase, and those described in Kurosawa et al. (1973) J. Biochem. 73: 31-37. It is particularly preferred the enzyme hesperidi to use nose.

Sowohl die Rutinoside als auch die Enzyme für das erfindungsgemäße Verfahren können als Handelsprodukte erworben werden. Ebenfalls ist es möglich, die Ausgangs­ stoffe und Enzyme nach allgemein bekannten Methoden zu gewinnen oder herzustellen.Both the rutinosides and the enzymes for the process according to the invention can be purchased as commercial products. It is also possible to start to obtain or manufacture substances and enzymes using generally known methods.

Das Enzym wird auf einem geeigneten Träger immobilisiert. Dabei können übliche Trä­ ger, wie Kieselgel, beispielsweise handelsübliche sphärische oder handelsübliche ge­ brochene Kieselgele, z. B. Lichrosorb®, Lichroprep®, Lichrospher® und Trisoperl®, und handelsübliche polymere Träger, z. B. Eupergit®, Fractogel® und Fractoprep®, zum Ein­ satz kommen. Kieselgel gilt als bevorzugtes Trägermaterial. Der Enzymträger besitzt üblicherweise die folgenden Eigenschaften: Die Teilchengröße des Trägers beträgt vor­ zugsweise 0,005 bis 1 mm, noch bevorzugter 0,01 bis 0,5 mm. Der Porendurchmesser liegt üblicherweise im Bereich von 10 bis 4000 nm, wobei ein relativ großer Poren­ durchmesser von 2 bis 4 µm besonders bevorzugt ist. Durch eine ausreichend große Porengröße kann sichergestellt werden, daß das Enzym ohne Aktivitätsverlust auf dem Träger Platz findet. Die Partikeloberfläche beträgt vorteilhafterweise 40 bis 100 m²/g, und das Porenvolumen wird vorzugsweise aus einem Bereich von 0,5 bis 3 ml/g ausge­ wählt.The enzyme is immobilized on a suitable carrier. In this case, conventional carriers such as silica gel, for example commercially available spherical or commercially available broken silica gels, for. B. Lichrosorb®, Lichroprep®, Lichrospher® and Trisoperl®, and commercially available polymeric supports, e.g. B. Eupergit®, Fractogel® and Fractoprep®, are used. Silica gel is the preferred carrier material. The enzyme carrier usually has the following properties: The particle size of the carrier is preferably 0.005 to 1 mm, more preferably 0.01 to 0.5 mm. The pore diameter is usually in the range from 10 to 4000 nm, a relatively large pore diameter of 2 to 4 μm being particularly preferred. A sufficiently large pore size can ensure that the enzyme can be placed on the support without loss of activity. The particle surface is advantageously 40 to 100 m ² / g, and the pore volume is preferably selected from a range of 0.5 to 3 ml / g.

Das Enzym kann kovalent oder adsorptiv gekuppelt werden. Generell ist eine kovalente Kupplung vorzuziehen. Beispiele einer kovalenten Kupplung beinhalten eine Epoxidie­ rung, eine Carbodiimidmethode, Silanisierung, eine Bromcyanmethode, eine Glutardialdehydvernetzung oder eine Dicresylchloridmethode (siehe Biotransformations and Enzyme Reactions, Bommarius, A. S., Biotechnology (2. Aufl.), Bd. 3, S. 427-465, zusammengestellt von Stephanopoulos, G., VCH Weinheim, Deutschland, 1993, Walt, D. R. et al., trends in analytical chemistry, Bd. 13, Nr. 10, 1994, N. H. Park, H. N. Chang; J. Ferment. Technol., Bd. 57 (4), 310-316, 1979, M. Puri et al.; Enz. Microb. Technol., 18, 281-285, 1996 und H-Y. Tsen; J. Ferment. Technol., 62 (3), 263-267, 1984). Zur Durchführung dieser Verfahren ist es notwendig, daß der Träger mit entsprechenden funktionellen Gruppen oberflächenmodifiziert wird. Die funktionelle Gruppe kann am Träger entweder durch Copolymerisation mit funktionellen Monomeren oder durch Po­ lymeranalogumsetzung vollzogen werden. Besonders bevorzugt ist eine Oberflächen­ modifikation mit Aminoresten oder eine Diolmodifizierung.The enzyme can be coupled covalently or adsorptively. Generally is a covalent Prefer clutch. Examples of covalent coupling include epoxidation tion, a carbodiimide method, silanization, a cyanogen bromide method, a glutardialdehyde crosslinking  or a dicresyl chloride method (see Biotransformations and Enzyme Reactions, Bommarius, A.S., Biotechnology (2nd ed.), Vol. 3, pp. 427-465, compiled by Stephanopoulos, G., VCH Weinheim, Germany, 1993, Walt, D.R. et al., Trends in analytical chemistry, Vol. 13, No. 10, 1994, N.H. Park, H.N. Chang; J. Ferment. Technol., Vol. 57 (4), 310-316, 1979, M. Puri et al .; Enz. Microb. Technol., 18, 281-285, 1996 and H-Y. Tsen; J. Ferment. Technol., 62 (3), 263-267, 1984). For Carrying out these procedures it is necessary that the carrier with appropriate functional groups is surface modified. The functional group can on Carriers either by copolymerization with functional monomers or by Po lymer analogue implementation. A surface is particularly preferred modification with amino residues or a diol modification.

Die enzymatische Hydrolyse findet in einem geeigneten Reaktor statt, der vorzugsweise zur kontinuierlichen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Es ist vorteilhaft, eine handelsübliche Säule zu verwenden. Im kleinen Maßstab kann bei­ spielsweise eine Säule, wie sie für die präparative HPLC verwendet wird, eingesetzt werden. Der Reaktor, insbesondere die Säule, sollte einen hohen hydraulischen Wir­ kungsgrad aufweisen. Dies kann durch die Zahl der theoretischen Böden quantifiziert werden. Deshalb ist es von Vorteil, daß es zu einem intensiven Kontakt der Rohstofflö­ sung mit der Oberfläche des Immobilisats kommt, um die wirksame Nutzung des En­ zyms zu gewährleisten und eine hohe Produktivität zu erreichen. Die erwähnte präpara­ tive HPLC-Säule erfüllt diese Anforderungen und ist ebenfalls mit der entsprechenden Technik mit Peripherie (Pumpen, Ventile, Steuerung) ausgestattet. Es ist ebenfalls von Vorteil, daß hierfür bereits Detektionstechniken, wie UV- oder RI-Detektionstechniken entwickelt wurden, so daß, wenn erwünscht, die Messung und Regelung des Umsatz­ grades der Reaktion automatisiert durchgeführt werden kann.The enzymatic hydrolysis takes place in a suitable reactor, which is preferably is suitable for the continuous implementation of the method according to the invention. It it is advantageous to use a commercially available column. On a small scale, at for example, a column such as that used for preparative HPLC become. The reactor, especially the column, should have a high hydraulic efficiency have degree of efficiency. This can be quantified by the number of theoretical floors become. Therefore, it is advantageous that there is an intensive contact of the raw materials solution with the surface of the immobilizate comes to the effective use of the En to ensure zyms and achieve high productivity. The preparation mentioned tive HPLC column meets these requirements and is also compatible with the corresponding Technology equipped with peripherals (pumps, valves, control). It is also from Advantage that this already involves detection techniques such as UV or RI detection techniques have been developed so that, if desired, the measurement and control of sales degree of reaction can be carried out automatically.

Das Immobilisat wird vor der Reaktion auf übliche Weise in den Reaktor gepackt.The immobilizate is packed into the reactor in the usual way before the reaction.

Das umzusetzende Rutinosid wird in den Reaktor, vorzugsweise die Säule, üblicherwei­ se in Form einer Lösung gespeist. Dabei sollte die Rutinosidlösung vollkommen fest­ stofffrei sein. Es ist dabei von Vorteil, das Rutinosid mit dem Lösungsmittel in einem Tank, vorzugsweise unter Rühren und/oder Erwärmen, vorzulösen, um eine optimale Löslichkeit zu erreichen. Wenn notwendig, kann außerdem eine Vorfiltration der Lösung durchgeführt werden, um mögliche Feststoffe zu entfernen. Das Lösungsmittel ist vor­ zugsweise ein wäßriges System, um die Enzymaktivität zu gewährleisten und mögliche Denaturierungen zu verhindern. Um die Lösung der Rutinoside zu gewährleisten, kön­ nen zusätzlich weitere Lösungsmittel zugegeben werden. Vorzugsweise wird das erfin­ dungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel durchgeführt.The rutinoside to be reacted is usually in the reactor, preferably the column se fed in the form of a solution. The rutinoside solution should be completely solid be free of substances. It is advantageous to combine the rutinoside with the solvent in one  Pre-dissolve tank, preferably with stirring and / or heating, in order to achieve an optimal To achieve solubility. If necessary, pre-filtration of the solution can also be carried out be carried out to remove possible solids. The solvent is in front preferably an aqueous system to ensure enzyme activity and possible To prevent denaturation. To ensure the solution of the rutinosides, NEN additional solvents are added. This is preferably invented Process according to the invention in the presence of a solvent mixture of water and performed at least one organic solvent.

Das oder die zusätzlich vorhandenen organischen Lösungsmittel umfassen sowohl or­ ganische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, als auch organische Lösungs­ mittel, die nicht mit Wasser mischbar sind.The organic solvent or solvents additionally present include both or ganic solvents that are miscible with water, as well as organic solutions agents that are not miscible with water.

Geeignete Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren sind Nitrile, wie Acetoni­ tril, Amide, wie Dimethylformamid, Ester, wie Essigsäureester, insbesondere Essigsäu­ remethylester oder Essigsäureethylester, Alkohole, wie Methanol oder Ethanol, Ether, wie Tetrahydrofuran oder Methyl-tert-butylether und Kohlenwasserstoffe, wie Toluol. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines oder mehrerer der organischen Lösungsmittel Essigsäureester, Methanol, Ethanol, Methyl-tert-butylether oder Toluol durchgeführt. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart eines oder mehrerer Essigsäureester, insbesondere in Gegenwart von Essigsäuremethylester, zusätzlich zu Wasser durchgeführt.Suitable solvents for the process according to the invention are nitriles, such as acetoni tril, amides such as dimethylformamide, esters such as acetic acid esters, especially acetic acid remethyl ester or ethyl acetate, alcohols, such as methanol or ethanol, ether, such as tetrahydrofuran or methyl tert-butyl ether and hydrocarbons such as toluene. The process according to the invention is preferred in the presence of one or more of the organic solvents acetic acid ester, methanol, ethanol, methyl tert-butyl ether or toluene. The method according to the invention is particularly preferred in the presence of one or more acetic acid esters, especially in the presence of Methyl acetate, in addition to water.

Geeignete Volumenverhältnisse von Wasser zu organischem Lösungsmittel für das er­ findungsgemäße Verfahren sind Verhältnisse von 1 : 99 bis 99 : 1. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Volumenverhältnissen von Wasser zu organischem Lösungsmittel von 20 : 80 bis 80 : 20, insbesondere mit Volumenverhältnissen von 50 : 50 bis 70 : 30 durchgeführt.Suitable volume ratios of water to organic solvent for which he Processes according to the invention are ratios of 1:99 to 99: 1. This is preferably Process according to the invention with volume ratios of water to organic Solvents from 20:80 to 80:20, in particular with volume ratios of 50:50 until 70:30.

Die Menge an Rutinosid in dem Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch für das erfin­ dungsgemäße Verfahren ist abhängig von der Löslichkeit des Rutinosids in dem Lö­ sungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch. Zur optimalen Durchführung des erfindunsge­ mäßen Verfahrens sollte das Rutinosid gut löslich sein. Deshalb wird vorzugsweise mit einer untersättigten Lösung gearbeitet. Üblicherweise beträgt die Menge an Rutinosid im Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch 0,001 bis 5 g/l, vorzugsweise 0,05 bis 2 g/l, noch bevorzugter 0,1 bis 1,5 g/l.The amount of rutinoside in the solvent or solvent mixture for the inventions The method according to the invention depends on the solubility of the rutinoside in the solution solvent or solvent mixture. For optimal implementation of the invention According to the process, the rutinoside should be readily soluble. Therefore, preferably with  an unsaturated solution. Usually the amount of rutinoside is Solvent or solvent mixture 0.001 to 5 g / l, preferably 0.05 to 2 g / l, more preferably 0.1 to 1.5 g / l.

Das Verhältnis von Rutinosid zu Immobilisat bzw. Enzym hängt von der Lebensdauer des Enzyms in der Säule und seiner Aktivität in immobilisierter Form ab.The ratio of rutinoside to immobilizate or enzyme depends on the lifespan of the enzyme in the column and its activity in immobilized form.

Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 80°C durchgeführt. Bevorzugt ist eine Temperatur von 30 bis 60°C, insbesondere ist eine Temperatur von 40 bis 50°C von Vorteil, um einer möglichen Zerstörung des Enzyms entgegenzuwirken und gleichzeitig eine hohe Löslichkeit des Rutinosids zu gewährleisten.The reaction is usually carried out at a temperature of 15 to 80 ° C. A temperature of 30 to 60 ° C. is preferred, in particular a temperature of 40 to 50 ° C is an advantage to counteract possible destruction of the enzyme while ensuring a high solubility of the rutinoside.

Wenn die Reaktionstemperatur zu niedrig ist, läuft die Reaktion durch absinkende Enzymaktivität mit einer unangemessenen langsamen Reaktionsgeschwindigkeit ab. Außerdem verringert sich die Löslichkeit des Rutinosids derart, daß unnötig hohe Lö­ sungsmittelmengen notwendig werden. Wenn die Reaktionstemperatur dagegen zu hoch ist, wird das Enzym, welches ein Protein ist, denaturiert und somit deaktiviert.If the reaction temperature is too low, the reaction proceeds by falling Enzyme activity with an inadequate slow reaction rate. In addition, the solubility of the rutinoside is reduced in such a way that unnecessarily high sol amounts of liquid become necessary. If the reaction temperature increases is high, the enzyme, which is a protein, is denatured and thus deactivated.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden soll, kann der Reaktor mit einer Temperiereinrichtung versehen werden. Übliche Temperiereinrichtungen beinhalten ein Heizschlangensystem oder Doppelmantel. Es ist weiterhin von Vorteil, wenn das umzusetzende Rutinosid und insbesondere die Rutino­ sidlösung vor Eintritt in den Reaktor temperiert wird. Zu diesem Zweck ist es üblich, daß die Rutinosidlösung aus einem temperierten Tank, der auf die für die Reaktion ge­ wünschte Temperatur eingestellt ist, gespeist wird. Alternativ kann die einzuspeisende Lösung durch einen beheizbaren Schlauch geleitet werden, um die gewünschte Tempe­ ratur vor Eintritt in den Reaktor einzustellen. Durch die Temperierung können ebenfalls mögliche Auskristallisierungen des Rutinosids vermieden werden. If the method according to the invention is carried out at an elevated temperature the reactor can be equipped with a temperature control device. Usual Temperature control devices include a heating coil system or double jacket. It is furthermore advantageous if the rutinoside to be reacted and in particular the rutino is tempered before entering the reactor. For this purpose it is common for the rutinoside solution from a temperature-controlled tank, which is used for the reaction desired temperature is set, is fed. Alternatively, the one to be fed Solution passed through a heated tube to the desired tempe temperature before entering the reactor. The tempering can also possible crystallization of the rutinoside can be avoided.  

Geeignete pH-Werte für das erfindungsgemäße Verfahren sind pH-Werte zwischen 3 und 8. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei pH-Werten von 3 bis 7 durchgeführt, insbesondere bei pH-Werten von 3 bis 6. Weiterhin bevorzugte pH-Werte können jedoch je nach verwendetem Enzym innerhalb der gegebenen Gren­ zen variieren. Beispielsweise sind pH-Werte von 3,8 bis 4,3 bei Verwendung des En­ zyms Hesperidinase ganz außerordentlich bevorzugt.Suitable pH values for the process according to the invention are pH values between 3 and 8. The process according to the invention is preferably carried out at pH values of 3 to 7 carried out, in particular at pH values from 3 to 6. Further preferred However, depending on the enzyme used, pH values can vary within the given range zen vary. For example, pH values of 3.8 to 4.3 are when using the En enzyme hesperidinase is extremely preferred.

Vorzugsweise wird das Verfahren derart ausgeführt, daß der pH-Wert mit Hilfe eines Puffersystems eingestellt wird. Prinzipiell können alle gängigen Puffersysteme, die zur Einstellung der obengenannten pH-Werte geeignet sind, verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch wäßriger Citratpuffer verwendet.The method is preferably carried out in such a way that the pH is adjusted using a Buffer system is set. In principle, all common buffer systems used for Setting the above pH values are suitable, are used. Prefers however, aqueous citrate buffer is used.

Die Rutinosidlösung wird in den Reaktor, der das Immobilisat enthält, gegeben, um die enzymatische Hydrolyse durchzuführen. Diese Reaktion kann batchweise, d. h. diskonti­ nuierlich, oder kontinuierlich durchgeführt werden.The rutinoside solution is added to the reactor containing the immobilizate to obtain the perform enzymatic hydrolysis. This reaction can be carried out batchwise, i.e. H. discounts be carried out regularly or continuously.

Es ist jedoch bevorzugt, die Reaktion kontinuierlich durchzuführen. Dabei wird die Ru­ tinosidlösung üblicherweise permanent und kontinuierlich mit einer geeigneten Pumpe durch den Reaktor, vorzugsweise eine Säule, gefördert. Durch die entsprechende Ein­ stellung der Fließgeschwindigkeit kann ein beliebig hoher Umsatzgrad erreicht werden. Normalerweise wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,001 bis 1 mm/s, bezogen auf den leeren Rohrquerschnitt der Säule, gearbeitet.However, it is preferred to carry out the reaction continuously. The Ru tinoside solution usually permanently and continuously with a suitable pump through the reactor, preferably a column. By the corresponding one setting the flow rate, any degree of turnover can be achieved. Usually with a flow rate of 0.001 to 1 mm / s, based on the empty pipe cross section of the column.

Die Aktivität des Enzyms in dem System nimmt erfahrungsgemäß mit der Zeit ab. Es ist deshalb notwendig, daß das Immobilisat in regelmäßigen Abständen ganz oder teilweise erneuert wird. Um einen Aktivitätsverlust der Enzyme auszugleichen, ist es vorteilhaft, den Umsatzgrad durch UV- oder RI-Detektion auszuwerten, so daß bei einer Änderung der Zusammensetzung eine Steuerung über die Pumpenleistung der Änderung entge­ gensteuert.Experience has shown that the activity of the enzyme in the system decreases over time. It is therefore necessary that the immobilized at regular intervals in whole or in part is renewed. In order to compensate for a loss of activity of the enzymes, it is advantageous evaluate the degree of conversion by UV or RI detection, so that in the event of a change the composition controls the pump output against the change controlled.

Nach Austritt der Reaktionslösung kann das erhaltene Produkt getrennt werden. Nach beendeter Reaktion besteht das Reaktionsgemisch hauptsächlich aus Lösungsmittel, nichtumgesetztem Rutinosid, Rhamnose, dem gewünschten monoglycosidierten Flavo­ noid und möglicherweise weiteren Zusätzen, wie Puffer. Die Isolierung des gewünschten Reaktionsprodukts erfolgt nach gängigen Methoden bei üblicher Aufarbeitung.After the reaction solution has emerged, the product obtained can be separated. To when the reaction is complete, the reaction mixture consists mainly of solvent,  unreacted rutinoside, rhamnose, the desired monoglycosidated flavo noid and possibly other additives such as buffers. The isolation of the desired The reaction product is carried out according to common methods with customary work-up.

Vorzugsweise wird das Produkt bei Aufkonzentrierung ausgefällt. Wenn das Lösungs­ mittel ein Lösungsmittelgemisch, enthaltend mindestens ein organisches Lösungsmittel, enthält, ist es bevorzugt, daß das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wird. Das auskristallisierende monoglycosidierte Flavonoid wird üblicherwei­ se vom restlichen Reaktionsgemisch durch eine Fest/Flüssigtrennung, wie Absaugen bzw. Filtration unter vermindertem Druck oder durch Abschleudern der ausgefallenen Kristalle, getrennt. Anschließend wird der Feststoff gewaschen, vorzugsweise mit Was­ ser und danach getrocknet. Die Reinheit des erhaltenen monoglycosidierten Flavonoids bei Einsatz von reinem Rutinosid ist normalerweise größer als 94%. Zur weiteren Reini­ gung kann das Endprodukt beispielsweise aus geeigneten Lösungsmitteln umkristalli­ siert werden, z. B. aus Wasser oder aus Lösungsmittelgemischen, bestehend aus Toluol und Methanol oder Wasser und Essigsäuremethylester.The product is preferably precipitated when concentrated. If the solution means a solvent mixture containing at least one organic solvent, contains, it is preferred that the organic solvent under reduced pressure is distilled off. The crystallizing monoglycosidated flavonoid is usually used se from the remaining reaction mixture by a solid / liquid separation, such as suction or filtration under reduced pressure or by centrifuging the precipitated Crystals, separated. The solid is then washed, preferably with what water and then dried. The purity of the monoglycosidated flavonoid obtained when using pure rutinoside is usually greater than 94%. To further Reini The final product can be recrystallized, for example, from suitable solvents be siert, z. B. from water or from solvent mixtures consisting of toluene and methanol or water and methyl acetate.

Die anfallende Menge an Lösungsmittel nach der Reaktion wird vorzugsweise zurück­ gewonnen, um die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu gewährlei­ sten. Diese Rezirkulation erfolgt üblicherweise kontinuierlich und automatisiert. Hierfür bieten sich handelsübliche Verdampferanlagen mit entsprechender Steuerung an. Han­ delt es sich bei dem einzusetzenden Lösungsmittel um ein Lösungsmittelgemisch aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel, ist es in der Regel nicht möglich, das Destillat sofort wieder für das Verfahren einzusetzen, da sich die Lö­ sungsmittelverhältnisse durch das Abdestillieren des organischen Lösungsmittels ver­ ändert haben. Durch automatische Qualitätsmessung und Korrektur kann das ge­ wünschte Lösungsmittelverhältnis dabei wiederhergestellt werden und das Lösungsmit­ tel somit rückgeführt werden.The amount of solvent obtained after the reaction is preferably returned won in order to guarantee the economy of the method according to the invention most. This recirculation is usually continuous and automated. Therefor commercially available evaporator systems with appropriate controls are available. Han the solvent to be used is a mixed solvent Water and at least one organic solvent, it is usually not possible to use the distillate again immediately for the process, since the Lö solvent ratios by distilling off the organic solvent have changed. This can be done by automatic quality measurement and correction desired solvent ratio to be restored and the solution with tel can thus be returned.

Weiterhin können bei der Aufkonzentrierung Membranprozesse oder Nanofiltration durchgeführt werden. Bei diesen Verfahren wird das Lösungsmittelgemisch ahne Ände­ rung der Zusammensetzung abgetrennt. Furthermore, membrane processes or nanofiltration can be used for the concentration be performed. In these processes, the solvent mixture without changes tion of the composition separated.  

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen. Sie sind jedoch keinesfalls als beschränkend zu betrachten.The following examples are intended to illustrate the present invention. However, you are by no means to be considered restrictive.

Beispiel 1example 1 Immobilisierung des Enzyms Hesperidinase auf einem KieselgelträgerImmobilization of the enzyme hesperidinase on a silica gel support 1) Trägeroberflächenkonditionierung zur Immobilisierung1) Carrier surface conditioning for immobilization 1.1) Eigenschaften des Trägermaterials1.1) Properties of the carrier material

Kieselgel LiChrospher SI500-SI1000
Durchmesser = 15-40 µm
Porendurchmesser = 300 Å
Partikeloberfläche = 80 m² Silica gel LiChrospher SI500-SI1000
Diameter = 15-40 µm
Pore diameter = 300 Å
Particle surface = 80 m ²

/g
Porenvolumen = 0,73 ml/g
Dichte = 2 g/ml/G
Pore volume = 0.73 ml / g
Density = 2 g / ml

1.2) Kieselgel-Aktivierung1.2) Silica gel activation

250 g Kieselgel werden mit genügend HCl (7%) in einer 1 L-Flasche vermengt und über Nacht stehen gelassen, um das Kieselgel zu befeuchten.250 g of silica gel are mixed with sufficient HCl (7%) in a 1 L bottle and poured over Let stand overnight to moisten the silica gel.

Anschließend wird die Kieselgelsuspension mit VE-Wasser chloridfrei gewaschen. Dazu muß man nach jeder Waschung den Überstand mit Salpetersäure und Silbernitrat te­ sten. Die Waschung wird wegen der Eigenschaften der Kieselgelpartikel auf einem ca. 24 cm-Durchmesser-Keramiktrichter durchgeführt.The silica gel suspension is then washed chloride-free with demineralized water. To the supernatant must be washed with nitric acid and silver nitrate after each wash most. The wash is due to the properties of the silica gel particles on one approx. 24 cm diameter ceramic funnel.

1.3) Oberflächenmodifiaktion mit Aminogruppen1.3) Surface modification with amino groups

Das säurebehandelte Kieselgel wird in einem 2 L-Dreihalskolben, der mit einem Rück­ flußkühler sowie einem Tropftrichter ausgestattet ist, zusammen mit genügend Wasser gemischt, so daß es rührfähig wird. Bei Raumtemperatur und guter Durchmischung tropft man 1 mmol/g Träger des 3-Aminopropyltrimethoxysilans (für 250 g Kieselgel braucht man 135 ml Lösung) mit einer Geschwindigkeit von ca. 5 Tropfen/s zu der Kie­ selgelsuspension zu. Anschließend wird die Suspension 2 Stunden bei 90°C gerührt. Danach wird die Suspension mit Eis gekühlt.The acid-treated silica gel is in a 2 L three-necked flask with a back flow cooler and a dropping funnel, along with enough water  mixed so that it becomes stirrable. At room temperature and good mixing dropwise 1 mmol / g carrier of 3-aminopropyltrimethoxysilane (for 250 g of silica gel you need 135 ml of solution) at a rate of approx. 5 drops / s to the jaw gel suspension too. The suspension is then stirred at 90 ° C. for 2 hours. The suspension is then cooled with ice.

Der Überstand muß mittels pH-Wert Messung auf mögliche Reste von 3-Amino­ propyltrimethoxysilan überprüft werden. Die Beadsuspension wird mit VE-Wasser so lange gewaschen, bis der pH-Wert konstant bleibt.The supernatant must be measured for possible residues of 3-amino by means of pH measurement propyltrimethoxysilane be checked. The bead suspension is so with deionized water washed for a long time until the pH remains constant.

1.4) Glutardialdehydbelegung1.4) Glutardialdehyde occupancy

Zu der erhaltenen Kieselgelsuspension wird Glutardialdehyd (GDA) in einer Konzentra­ tion von 1 mmol/g Träger (für 250 g Träger braucht man 13 ml 50%-ige GDA-Lösung) zugegeben. Die Suspension (plus etwas Wasser) wird 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer 1 L-Flasche gerollt. Am Anfang ist die Suspension gelb gefärbt, und am Ende wird sie dunkelrot.In a concentrate, glutardialdehyde (GDA) is added to the silica gel suspension obtained tion of 1 mmol / g carrier (for 250 g carrier you need 13 ml 50% GDA solution) admitted. The suspension (plus some water) is 2 hours at room temperature rolled in a 1 L bottle. At the beginning the suspension is colored yellow and at the end it turns dark red.

Anschließend wird der Überstand von jedem Waschen durch eine Fällungsreaktion mit Dinitrophenylhydrazin auf Glutardialdehydreste überprüft. Die Suspension wird sorgfältig gewaschen, bis der Test negativ ist.Subsequently, the supernatant from each wash with a precipitation reaction Dinitrophenylhydrazine checked for glutardialdehyde residues. The suspension will be careful washed until the test is negative.

2) Immobilisierung2) Immobilization 2.1) Hesperidinase2.1) hesperidinase Erste ProteinzugabeFirst addition of protein

3,8 g Hesperidinase werden in 500 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) gerührt. Zum besseren Lösen werden 300 µl Tenside (Tween 20) zugegeben. Anschließend wird die Enzymlösung filtriert. 3.8 g of hesperidinase are stirred in 500 ml of citrate / phosphate buffer (pH = 6.0). To the 300 μl of surfactants (Tween 20) are added to better solutions. Then the Filtered enzyme solution.  

In einer 1 L-Flasche werden ca. 230 g der unter 1.4) erhaltenen Kieselgelsuspension mit der Enzymlösung vermengt. Anschließend wird die Enzym-Trägersuspension ca. 40 Stunden bei Raumtemperatur gerollt.Approx. 230 g of the silica gel suspension obtained under 1.4) are also in a 1 L bottle mixed with the enzyme solution. Then the enzyme carrier suspension becomes approx. 40 Rolled for hours at room temperature.

Zweite ProteinzugabeSecond protein addition

ca. 0,76 g Hesperidinase (Amano) werden in 120 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) mit 60 µl Tensiden gerührt und später filtriert.Approx. 0.76 g hesperidinase (Amano) are mixed in 120 ml citrate / phosphate buffer (pH = 6.0) 60 µl of surfactants stirred and later filtered.

Die Enzymlösung wird in die vorstehend genannte 1 L-Flasche gegossen, und die En­ zymlösung wird bei Raumtemperatur gerollt.The enzyme solution is poured into the 1 L bottle mentioned above and the En enzyme solution is rolled at room temperature.

2.2) BSA (für den Trennungstest)2.2) BSA (for the separation test)

0,3 Biomex BSA (Rinderserumalbumin-Pulver) werden in 100 ml Citrat/Phosphatpuffer (pH = 6,0) gerührt. In einer 0,5 L-Flasche werden ca. 20 g der unter 1.4) erhaltenen Kieselgelsuspension mit der Proteinlösung vermengt, und 60 µl ProClin300 werden zu­ gegeben.0.3 Biomex BSA (bovine serum albumin powder) are in 100 ml citrate / phosphate buffer (pH = 6.0) stirred. Approx. 20 g of those obtained under 1.4) are in a 0.5 L bottle Mix the silica solution with the protein solution and add 60 µl ProClin300 given.

3) Proteinmengen- und Aktivitätsbestimmung3) Protein quantity and activity determination 3.1) Proteinmenge (mg Protein/ml)3.1) Amount of protein (mg protein / ml)

Der Proteingehalt einer Lösung wird mittels Bradford-Test bestimmt. Es wird das Stan­ dard-Assay durchgeführt. Dabei werden 20 µl Probe in 1 ml Bradford-Farbstoff-Reagenz (1 : 5 verdünnt) gemischt und nach 15 min im Photometer bei 595 nm gemessen.The protein content of a solution is determined using the Bradford test. It will be the Stan dard assay performed. 20 µl sample in 1 ml Bradford dye reagent (Diluted 1: 5) and measured after 15 min in a photometer at 595 nm.

Bei sehr geringen Proteinkonzentrationen muß das Microassay durchgeführt werden. Dabei werden 0,8 ml Probe in 0,2 ml Bradford-Farbstoff-Reagenz (konzentriert) gemischt und nach 15 min im Photometer bei 595 nm gemessen. The microassay must be carried out at very low protein concentrations. 0.8 ml of sample in 0.2 ml of Bradford dye reagent (concentrated) mixed and measured after 15 min in a photometer at 595 nm.  

3.2) Aktivität3.2) Activity

Die Aktivität einer Lösung wird durch die Reaktion mit einem Ersatzsubstrat gemessen. Für jede Probe nimmt man:
88 µl Citrat/Phosphatpuffer (pH = 4,0)
100 µl Probe
20 µl Probe
20 µl Ersatzsubstrat: p-Nitrophenyl-α-L-Rhamnosid (Rhamnosidase-Aktivität)
p-Nitrophenyl-α-L-Glucosid (Glucosidase-Akivität)The activity of a solution is measured by the reaction with a replacement substrate. For each sample one takes:
88 µl citrate / phosphate buffer (pH = 4.0)
100 µl sample
20 µl sample
20 µl replacement substrate: p-nitrophenyl-α-L-rhamnoside (rhamnosidase activity)
p-nitrophenyl-α-L-glucoside (glucosidase activity)

Diese 1 ml Lösung wird in einem Eppendorfreaktionsgefäß vermengt. Nach einer Inku­ bationszeit von je 2 und 5 min bei 40°C im Schüttler, werden je 100 µl des Reaktions­ gemisches mit 1 ml 1 M-Sodalösung vermengt. Dann wird die Konzentration von p-Nitrophenol im Photometer bei 400 nm gemessen. Die Aktivität errechnet sich durch Konzentrationsänderung von p-Nitrophenol pro Zeit.This 1 ml solution is mixed in an Eppendorf reaction vessel. After an Inku bation time of 2 and 5 min at 40 ° C in a shaker, 100 ul of the reaction mixed with 1 ml of 1 M soda solution. Then the concentration of p-Nitrophenol measured in a photometer at 400 nm. The activity is calculated Change in concentration of p-nitrophenol per time.

Die Aktivität eines Enzyms wird in Units (U) (= µmol umgesetztes Substrat je Minute) angegeben. The activity of an enzyme is expressed in units (U) (= µmol converted substrate per minute) specified.  

4) Ergebnisse4) Results

PROTEINGEHALT und AKTIVITÄTSWERTE (FREIE HESPERIDINASE) PROTEIN CONTENT and ACTIVITY VALUES (FREE HESPERIDINASE)

PROTEINGEHALT und AKTIVITÄTSWERTE (IMMOBILISIERTE HESPERIDINASE)PROTEIN CONTENT and ACTIVITY VALUES (IMMOBILIZED HESPERIDINASE)

• - Proteingehalt des Trägers ≅ 1,045 g gebundenes Protein- Protein content of the carrier ≅ 1.045 g bound protein
• - Auf den Träger sind 4,7 mg Protein/g Träger- There are 4.7 mg protein / g carrier on the carrier
• - 2% des zugegebenen Proteins wurden nicht gebunden- 2% of the added protein was not bound

Beispiel 2Example 2

Herstellung von Isoquercetin aus Rutin durch enzymatische Hydrolyse unter Verwendung eines Immobilisats.Production of isoquercetin from rutin by enzymatic hydrolysis under Use of a property.

In einem heizbaren 4,5 m³-Rührkessel (1) werden 3200 l VE-Wasser und 800 l 1-Propanol vorgelegt. Über die Dampfzufuhr (2) wird das Gemisch auf ca. 50-60°C er­ wärmt. Unter starkem Rühren wird der Lösung 8000 g Rutin, DAB zugegeben. Die Mi­ schung wird solange gerührt, bis sich das Rutin vollständig gelöst hat. Über eine Kreis­ laufpumpe und ein in die Leitung montiertes pH-Meter (3a) wird anschließend der pH- Wert kontrolliert und ggf. auf pH 4,0-4,5 eingestellt (mit H₃PO₄ und NaOH). Über das manuelle Ventil (4) kann auch zur Kontrolle und Konzentrationsbestimmung eine Probe entnommen werden.3200 l of demineralized water and 800 l of 1-propanol are placed in a heatable 4.5 m ³ stirred tank ( 1 ). The mixture is heated to approx. 50-60 ° C via the steam supply ( 2 ). 8000 g of rutin, DAB are added to the solution with vigorous stirring. The mixture is stirred until the rutin has completely dissolved. The pH value is then checked using a circuit pump and a pH meter ( 3 a) installed in the line and adjusted to pH 4.0-4.5 if necessary (with H ₃ PO ₄ and NaOH). A sample can also be taken via the manual valve ( 4 ) for checking and determining the concentration.

Zum Start der Reaktion wird die Lösung über einen Beutelfilter (5) und einen Kerzenfilter (6) der Kolbendosierpumpe (7) zugeführt. Der Beutelfilter hat dabei die Aufgabe, die größere Menge an ungelösten Bestandteilen aufzuhalten, während der Kerzenfilter die Lösung mit einer Feinheit von 0,2 µm reinigt.At the start of the reaction, the solution is fed to the piston metering pump ( 7 ) via a bag filter ( 5 ) and a candle filter ( 6 ). The bag filter has the task of stopping the larger amount of undissolved components, while the candle filter cleans the solution with a fineness of 0.2 µm.

Die Kolbendosierpumpe (7) fördert die Lösung durch einen heizbaren Schlauch, welcher die Lösung über ein Thermometer auf eine Temperatur von 40°C am Eingang der Säule einstellt, mit einem Fluß von 1 l/min in die Säule (9) (100 × 400 mm). Die Säule enthält 1,5 kg Immobilisat. Da der elektrisch beheizte Schlauch die Lösung nicht kühlen kann, ist die Temperatur im Rührkessel (1) so zu wählen, daß die Abkühlung auf dem Weg bis zur Pumpe bei maximalem Pumpfenfluß bis 40°C führt.The piston metering pump ( 7 ) conveys the solution through a heatable hose, which adjusts the solution to a temperature of 40 ° C. at the entrance of the column using a thermometer, with a flow of 1 l / min into the column ( 9 ) (100 × 400 mm). The column contains 1.5 kg of immobilizate. Since the electrically heated hose cannot cool the solution, the temperature in the stirred tank ( 1 ) should be selected so that cooling on the way to the pump leads to a maximum pump flow of up to 40 ° C.

Über ein manuelles Ventil (10) kann der Lösung nach Durchlaufen der Säule eine Probe entnommen werden, womit nochmals die Temperatur und der Umsatzgrad der Reaktion off-line gemessen werden können. Ist der gemessene Umsatzgrad geringer als gefor­ dert, wird die Flußrate der Pumpe entsprechend verringert. A sample can be taken from the solution after passing through the column via a manual valve ( 10 ), with which the temperature and the degree of conversion of the reaction can be measured off-line again. If the measured degree of conversion is lower than required, the flow rate of the pump is reduced accordingly.

Nach Durchlaufen der Säule ist die Reaktion vollständig abgelaufen, so daß die Lösung in das Auffanggefäß (11) geführt werden kann. Dort wird der Lösung über einen Kon­ densator (12) ca. 10-20% des Volumens entzogen. Dadurch wird der Gehalt an Pro­ panol deutlich gesenkt, wodurch die Löslichkeit des Isoquercetins stark sinkt. Durch nachträgliche Abkühlung sinkt die Löslichkeit weiter, so daß das Produkt ausfällt und im Beutefilter (13) abgetrennt werden kann. Von dort wird es zur weiteren Trocknung in einen Trockenschrank (14) überführt. Die Mutterlauge und das abdestillierte Kondensat werden gemeinsam zum erneuten Ansatz in den Rührkessel (1) zurückgeführt.After passing through the column, the reaction is complete, so that the solution can be fed into the collecting vessel ( 11 ). There the solution is removed via a condenser ( 12 ) about 10-20% of the volume. As a result, the Pro panol content is significantly reduced, which greatly reduces the solubility of the isoquercetin. Subsequent cooling further reduces the solubility, so that the product precipitates and can be separated off in the prey filter ( 13 ). From there it is transferred to a drying cabinet ( 14 ) for further drying. The mother liquor and the distilled-off condensate are returned together in the stirred tank ( 1 ) for fresh preparation.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden durch enzymatische Hydrolyse von Rutinosiden, dadurch gekennzeichnet, daß für die enzymatische Hy­ drolyse ein Enzym, das auf einem Träger immobilisiert ist, verwendet wird.1. A process for the preparation of monoglycosidated flavonoids by enzymatic hydrolysis of rutinosides, characterized in that an enzyme which is immobilized on a carrier is used for the enzymatic hydrolysis. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Rutinosid ein Ru­ tinosid der Formel (A)
worin R H, OH oder OCH₃ bedeutet,
verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a Ru tinoside of the formula (A) as rutinoside
where RH, OH or OCH is ₃ ,
is used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Rutinosid Ru­ tin verwendet wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that Ru as rutinoside tin is used. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine α-L-Rhamnosidase verwendet wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that as Enzyme an α-L-rhamnosidase is used. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Hesperidinase verwendet wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that as Enzyme hesperidinase is used. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf Kieselgel immobilisiert ist. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the Enzyme is immobilized on silica gel.   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Hydrolyse in Gegenwart eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the enzymatic hydrolysis in the presence of a solvent mixture of water and at least one organic solvent is carried out. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Reaktionstemperatur von 15 bis 80°C durchgeführt wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the Reaction is carried out at a reaction temperature of 15 to 80 ° C. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH-Wert von 3 bis 8 durchgeführt wird.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the Reaction is carried out at a pH of 3 to 8.