DD300491A7 - Verfahren zur herstellung von kontrollmaterial zum nachweis von loeslichen fibrinmonomerenkomplexen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kontrollmaterial zum Nachweis von loeslichen Fibrinmonomerenkomplexen. Sie dient dazu, die Brauchbarkeit von Reagenz zum Nachweis von loeslichen Fibrinmonomerenkomplexen zu kontrollieren und den Gebrauchswert dieses Testes zu erhoehen. Die Herstellung des Kontrollmaterials erfolgt erfindungsgemaesz dadurch, dasz man aus Rinder- oder Humanblut gewonnenes Zitratplasma fuer das LFMK-negative Kontrollplasma sofort mit Na ind 2EDTA und Aprotinin stabilisiert bzw. dasz diese Stabilisierung fuer das LFMK-positive Kontrollplasma nach Inkubation des Plasmas mit Thrombin und nachfolgender Inhibition des Thrombins mit Hirudin sowie Zusatz von Na ind 2EDTA und Aprotinin erfolgt. Das Kontrollplasma wird vorteilhaft in Glasflaschen abgefuellt und lyophilisiert.{Fibrinmonomerenkomplexe; Nachweis; Stabilisierung; Kontrollplasma; Gebrauchswerterhöhung}
Description
Die Erfindung findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik von Blutgerinnungsstörungen in Verbindung mit einem Reagens zum Nachweis von löslichen Fib'inmonomerkomplexen (LFMK). Insbesondere dient die Erfindung dazu, die Brauchbarkeit von Reagens zum Nachweis von LFMK zu kontrollieren und den Gebrauchswert dieses Testes zu erhöhen. Ein exakter Nachweis der LFMK im Blut ist Voraussetzung für die effektive Therapie zahlreicher Grunderkrankungen, die mit einer Störung des Gerinnungssystems einhergehen.
Nach dem Verfahren von Largo (Blood 47 [1976] S.991-1002) werden Fibrinmonomere als harnstofflösliche Substanzen der Fibrinpolymerisation gewonnen und Plasma zum Zwecke der Präparation eines Standardmaterials zugemischt. Dieses Verfahren führt zu instabilen Zwischenprodukten, so daß ein Gerinnen der Fibrinmonomere nicht verhindert werden kann. Es ist auch bekannt, Thrombin mit sehr geringer Aktivität 5 min oder länger auf Zitratplasma einwirken zu lassen, wodurch die Präparation von LFMK-positivem Kontrollmaterial möglich ist. Dieses Material ist jedoch instabil, d. h. innerhalb von einigen Minuten bis Stunden kommt es trotz Inhibition des Thrombins mittels Hirudin zur Gerinnung des Materials. (Z. Bl. Pharma. Pharmakother. Lab. diagn. 127 [1988] S.71-74).
Die Präparation von LFMK-negativem Kontrollrnaterial wird erschwert durch die Tatsache, daß bei der üblichen Blutentnahme nach AB (D. L.) - DDR eine Aktivierung des Gerinnungssystems nicht sicher verhindert werden kann. Bei Anwesenheit der Kalziumionen des Zitratplasmas kommt es dann je nach Stärke der Gerinnungsaktivierung zur Bildung von Thrombin und schließlich von LFMK.
Wohl sind einige Stabilisatoren für LFMK wie Hexamethylenglycol und Natriumbromid (R. H. Huseby, N. U, Bang in N. U. Bang, F. K. Beller, E. Deutsch, E. F. Mammen Thrombosis and bleeding disordere Georg Thieme Stuttgart, Academic Press New York, London 1971 Chapter IV S. 227-228) beschrieben, jedoch iüt die Verfügbarkeit dieser Substanzen begrenzt. Andere Antikoagulantien wie Na2EDTA werden für spezielle Anwendungen im Blutspendedienst verwendet, jedoch ist ihr Einsatz zum Zweck der Gewinnung eines Kontrollmaterials für den LFMK-Nachweis nicht bekannt.
LFMK-positives und negatives Kontrollmaterial soll aus leicht zugänglichen Blutbestandteilen hergestellt werden, wobei fürdas LFMK-positive und -negative Kontrollmaterial eine Stabilität von mindestens 1 Jahr gewährleistet werden soll. Da nur in lyophilisierter Form Plasmapräparate als Kontrollmaterial ohne zusätzlichen Aufwand dem Anwender zur Verfügung gestellt werden können, sollen derartige Lyophilisate die genannten Stabilitätsansprüche erfüllen, wobei die Auflösung der Lyophilisate vollständig erfolgen muß und die gelösten Materialien 1 Stunde stabil sein sollen.
mit dem Nachweis für LFMK eine Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung dieses Testsystems e/lauben.
gelöst, daß aus Rinder- oder Humanblut gewonnenes Zitratplasma für das LFMK-negative Kontrollplasma sofort mit Na2EDTAund Aprotinin stabilisiert wird bzw. daß diese Stabilisierung für das LFMK-positive Kontrollmaterial nach Inkubation des Plasmasmit Thrombin und nachfolgender Inhibition des Thrombins mit Hirudin erfolgt.
2,5g Na2EDTA. 2H2O und 1,25Mio E Aprotinin als Stabilisator vorlegt, 91 Rinderblut hinzufügt und das Plasma durch
2000 ±200ATE Hirudin.
bestehend aus Na2EDTA 2H2O als wäßrige Lösung 100g/l und Aprotinin gelöst in isotonischer Kochsalzlösung = 25000 E/mlzugefügt wird. Eine Lyophilisierung der Kontrollplasmen vervollständigt deren Stabilität. Zum Nachweis von I.FMKbeispielsweise mit Hilfe des Netropsin-Präzipitationstestes wird zur Überprüfung der Reagenzienqualität ein im Testausfallpositives und negatives Kontrollmaterial durch Zusatz von Stabilisatoren und Lyophilisation präpariert. Dabei ist zur Gewinnungvon LFMK-negativem Kontrollmaterial eine Blockierung der Plättchenaggregation, der Fibrinpolymerisation, von in Spurenvorhandenen LFMK und der Fibrinolyse notwendig.
1. die Blockierung des zur Herstellung von LFMK benötigten Thrombins (Gerinnungsenzym),
2. die Inhibition des dabei ebenfalls entstehenden Plasmins (Fibrinolyseenzym),
3. der weitgehende Entzug von Kalziumionen, um die Fibrinpolymerisation zu verhindern.
Bei der Präparation von LFMK-negativem Kontrollmaterial wird erfindungsgemäß die Hemmung der Plättchenaggregation und der Fibrinpolymerisation durch nahezu vollständigen Entzug der Kalziumionen bei Zusatz von Na2EDTA · 2 H2O zur Natriumzitratlösung - als übliches Antikoagulans - in einer Konzentration von 2,5 ± 0,25g Na2EDTA 2 H2O zu 11 Natriumzitrat-RL (AB (D. L.] - DDR) erreicht. (E. Perlick, A. Bergmann Gerinnungslaboratorium in Klinik und Praxis 2. Auflage, VEB Georg Thieme, Leipzig 1971, S. 444-445; M. Furlan, C. Rupp, E. A. Beck, L. Svendsen Effect of calcium and synthetic peptides on fibrin polymerisation, Thromb Haemostas [Stuttgart] 47 [1982] S. 118-121)
Zusätzlich werden 1,25 ± 0,125Mio ATrE Aprotinin zur protektiven Piasmininhibition (Fibrinolyse) zugegeben. Dieses Stabilisatorgemisch (Natriumzitrat + Na2EDTA + Aprotinin) ist ausreichend für die Stabilisierung von 9I Frischblut, wobei dieses Blut sowohl bovinen als auch humanen Ursprungs sein kann.
Die Mischung des Blutes mit dem Antikoagulans muß schonend (möglichst ohne Schaumbildung) erfolgen. Gebildeter Schaum ist mechanisch abzutrennen. Die Plasmagewinnung erfolgt zunächst nach AB (D. L.) - DDR, wobei eine weitergehende Thrombozytenentfernung (Thrombozytenkonzentration = SGpt/l) durch zusätzliche Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei 15000RZB über 10min oder 10000 RZB über 20min erreicht wird. Dies ist erforderlich, da Thrombozyten das Kontrollmaterial trüben können und fpei der weiteren Verarbeitung gerinnungsaktivierende Inhaltsstoffe freisetzen. Anschließend erfolgt die Lyophilisation in Glasflaschen. Vor der Lyophilisation ist es möglich, die Plasmen 3Od bei -2O0C einzufrieren. Durch den Wasserentzug wird eine sehr gute Stabilität bei +40C erreicht.
Für die Herstellung von LFMK-positivem Kontrollmaterial wird die Blutentnahme zunächst nach AB (D. L.) - DDR durchgeführt. Für die weitere Verarbeitung zu Zitratplasma gilt das für das negative Kontrollmaterial festgelegte Verfahren (Zentrifugation nach AB (D. L.) - DDR und zum Thrombozytenentzug anschließend 15000RZB10' bzw. 10000 RZB über 20'). Ein Zusatz von Na2EDTA · 2H2O und Aprotinin vor dem Abschluß der Thrombineinwirkung hat sich als ungünstig erwiesen, da oft instabile Kontrollplasmen resultieren, die noch vor Abschluß einer ausreichenden LFMK-Bildung Trübungen zeigten. Optimale LFMK-positive Kontrollplasmen (deutlich im Netrcpsin-Präzipitationstest positiv und dabei bei Raumtemperatur und eingefroren sowie lyophilisiert ausreichend stabil) erhält man bei folgenden Verfahren, das für Rinder- und Humanzitratplasma gleichermaßen anwendbar ist.
Zunächst wird ein Kleinversuch durchgeführt, um die optimale Einwirkungszeit von Thrombin zu ermitteln. Ziel ist dabei, einen LFMK-positiven Testausfall zu erreichen, ohne daß die Gerinnung eintritt. Der Kleinversuch wird mit 10 ml Plasma a nalog wie f ür das eigentliche Kontrollmaterial (Großansatz) durchgeführt. Wie im Vorversuch ermittelt, wird dann Thrombin vom Rind (Thrombin für Testzwecke VEB AWD gelöst in isotonischer Kochsalzlösung nach AB [D. L.] - DDR als Thrombin-RL+ mit etwa 2,5NIH/ml) mit dem Zitratplasma inkubiert (50 NIH Thrombin/I Plasma sind dabei optimal). Die Fibrinogen-Fibrin-Umwandlung wird vor der Gerinnung mit Hirudin (2000 ± 200ATE/I Plasma sind optimal) gestoppt. Danach werden 500 + 50 mg Na2EDTA und 250000 ATrE Aprotinin unter Rühren zugesetzt. Hirudin inhibiert dabei als spezifischer Inhibitor des Thrombins dieses vollständig und bleibend. Durch Na2EDTA wird in erster Linie durch Kalziumbindung die Fibrinpolymerisation weitgehend gehemmt. (M. Furlan, C. Rupp, E. A. Beck, L. Svendsen Effect of calcium and synthetic peptides on fibrin polymerisation Thromb Haemostas [Stuttgart] 47 [1982] S. 118-121)
Außerdem soll Na2EDTA den Faktor V, Faktor VIII und Faktor XIII abbauen. Aprotinin wirkt als spezifischer Piasmininhibitor (F.Markwardt, G.Vogel, Antithrombotika, VEB Volk und Gesundheit, Berlin 1982, S.92-03) und verhindert den proteolytischen Abbau der LFMK. Die stabilisierten Kontrollplasmen werden in Glasflaschen mit Lyostopfen abgefüllt und innerhalb von 3 h nach der LFMK-Bildung lyophilisiert. In Tabelle 1 wird ein Überblick über die Stabilität der Kontrollmaterialien als Lyophilisat und als gelöstes Lyophilisat im Vergleich zu unstabilisierten (ohne Na2EDTA und Contrykal) Lyophilisaten gegeben.
1. LFMK-negatives Kontrollmaterial
In einen markierten Plasteeimer (Strichmarke bei 101 Füllstand) werden erfindugnsgemäß 11 Natriumzitrat-RL (AB [D. L.)), 1,25MioATrE/ otinin(Contrykal* VEB AWD) und 2,5g Na2EDTA (Chelaplex III) vorgelegt, wobei das Na2EDTA unter Rühren in der Natriumzitrat-RL zu lösen ist. In diese Lösung wird im freien Strahl 9I Rinderblut einfließen gelassen. Zwischen Betäuben des Tieres und der Punktion zur Blutgewinnung darf höchstens 1 min vergehen. Auf ein gutes, aber vorsichtiges Durchmischen ist zu achten (Schaumbildung vermeiden). Umgehend nach der Blutentnahme wird das Rinderblut zuerst nach den Vorschriften des AB (D. L.) zentrifugiert (RZB = 1000-2000,10min). Das Plasma wird abgetrennt und erneut 10 min bei RZB = 15000 oder 20min bei RZB - 10000 in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Das so gewonnene Plasma ist bei -20°C bis zu 4 Wochen stabil und kann nach Auftauen nach dieser Zeit oder innerhalb von 3 h nach der Blutgewinnung in Glasflaschen mit Lyostopfen lyophilisiert werden.
2. LFMK-positives Kontrollmaterial
In einen Plasteeimer (Strichmarke bei 10l Füllstand) werden erfindungsgemäß 11 Natriumzitrat-RL (AB [D. L.]) vorgelegt. In diese Lösung wird im freien Strahl 9I Rinderblut einfließen gelassen. Zwischen Betäuben des Tieres und Punktion zur Blutgewinnung darf höchstens 1 min vergehen. Durchmischen und Zentrifugaiion analog wie für LFMK-negatives Kontrollmaterial. Das so gewonnene Plasma kann bei -20°C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden. Frisch gewonnenes Rinderplasma ist innerhalb von 3h und aufgetautes Plasma sofort weiterverarbeiten. Dabei wird 11 Rinderplasma auf 370C erwärmt und mit 50 NIH Thrombin (Thrombin für Testzwecke - vom Rind, VEB AWD) versetzt (z. B. 20 ml Thrombin-RL+ It. AB [D. L.J, Thrombinkonzentration etwa 2,5NIH/ml, Normalplasmathrombinzeit It. AB = 17,0s). Nach einer im Vorversuch (mit 10ml Plasma) erprobten, für die jeweilige Plasmacharge spezifischen Zeit (dabei ist LFMK positiv, das Plasma aber nicht geronnen) wird Hirudinlösung mit insgesamt 2000ATE unter Rühren zugesetzt. Jetzt erfolgt die Zugabe von 500 mg Na2EDTA · 2H2O und danach von 250000 ATrE Aprotinin, jeweils in gelöster Form (Contrykal 25000 ATrE/ml in isotonischer Kochsalzlösung, Na2EDTA 2H2O = 100g/l in Wasser). Auf eine gleichmäßige Durchmischung der Zusätze mit dem Plasma ist zu achten. Die Lyoph;''nation in Glasflaschen schließt sich unmittelbar an.
mit Stabilisatoren ohne Stabilisatoren
gelöstes Lyophilisat ä1h gelöstes LyophilisatLFMK-positiv
gelöstes Lyophilisat a 1h bei Auflösen geronnen
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Kontrollmaterial für den Nachweis von löslichen Fibrinmonomerenkomplexen (LFMK) vorzugsweise mit Hilfe des Netropsin-Präzipitaticnstestes, dadurch gekennzeichnet, daß aus Rinder- oder Humanblut gewonnenes Zitratplasma für das LFMK-negative Kontrollplasma sofort mit Na2EDTA und Aprotinin stabilisiert wird, bzw. daß diese Stabilisierung für das LFMK-positive Kontrollmaterial nach Inkubation des Plasmas mit Thrombin und nachfolgender Inhibition des Thrombins mit Hirudin erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Gewinnung von LFMK-negativem Kontrollmaterial 11 Natriumzitrat-RL (A.B.-DDR), 2,5g Na2EDTA · 2H2O und 1,25Mio E Aprotenin als Stabilisator vorlegt, 91 Rinderblut hinzufügt und das Plasma durch Zentrifugation gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von LFMK-positivem Kontrollmaterial der Stabilisatorzusatz erst nach einer im Vorversuch ausgetesteten optimalen Einwirkungszeit von 50 NIH Thrombin pro Liter Zitratplasma und 2000 + 200 ATE Hirudin erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß nach Inkubation des Plasmas mit Thrombin und Hirudin der Stabilisator, bestehend aus Na2EDTA · 2 H2O als wäßrige Lösung lOOg/l und Aprotenin gelöst in isotonischer Kochsalzlösung - 25000E/ml zugefügt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kontrollmaterial in Glasflaschen lyophilisiertwird.
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DD32693789A DD300491A7 (de) | 1989-03-28 | 1989-03-28 | Verfahren zur herstellung von kontrollmaterial zum nachweis von loeslichen fibrinmonomerenkomplexen |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19855819A1 (de) * | 1998-12-03 | 2000-10-05 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilisierung von Cytokeratin enthaltenden Kalibratoren |
-
1989
- 1989-03-28 DD DD32693789A patent/DD300491A7/de not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE19855819A1 (de) * | 1998-12-03 | 2000-10-05 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilisierung von Cytokeratin enthaltenden Kalibratoren |
DE19855819C2 (de) * | 1998-12-03 | 2001-02-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilisierung von Cytokeratin enthaltenden Kalibratoren |
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