DD299660A5

DD299660A5 - FACTOR-REGULATED GENE EXPRESSION

Info

Publication number: DD299660A5
Application number: DD34440689A
Authority: DD
Inventors: Tadatsugu Taniguchi; Takashi Fujita
Original assignee: Tadatsugu Taniguchi,Jp
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-22
Publication date: 1992-04-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hestellung eines gewuenschten pharmazeutisch aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die entweder durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer das gewuenschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen fuer ein Protein enthaelt, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer das gewuenschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Sequenz enthaelt, die ein Gen fuer ein Protein enthaelt, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) enthaelt, wobei das Gen fuer das gewuenschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1-Proteins ist. Fig. 7 B{Proteinherstellung; DNA-Sequenz codiert Protein mit Interferon-Regulatorsequenz * DNA-Sequenz codiert mit pharmazeutisch aktivem Protein; Cytokine; t-PA}The invention relates to a method for the production of a desired pharmaceutically active protein, characterized by the cultivation of host cells, which are transformed either by a vector containing at the same time a DNA sequence containing a gene for the desired pharmaceutically active protein and a gene for A protein containing the action of an interferon regulatory sequence (IRF-1) or transformed by two vectors, one containing a DNA sequence encoding one gene for the desired pharmaceutically active protein and the other containing a DNA Sequence containing a gene for a protein containing the action of an interferon regulatory sequence (IRF-1), wherein the gene for the desired protein is in each case under the control of the IRF-1 protein. Fig. 7B {protein production; DNA sequence encodes protein with interferon regulatory sequence * DNA sequence encoded with pharmaceutically active protein; cytokines; t-PA}

Description

Hierzu 15 Seiten ZeichnungenFor this 15 pages drawings

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch die Kultivierung von Wirtszellen, die durch DNA-Moleküle transformiert werden, die für ein gewünschtes Protein unter der Kontrolle dieses IRF-1-aktiven Proteins codieren.The present invention relates generally to the regulation of gene expression. More particularly, it relates to a method of producing a desired protein by culturing host cells transformed by DNA molecules encoding a desired protein under the control of that IRF-1 active protein.

Die Transkription von Genen in Säugetierzellen wird durch komplexe Mechanismen reguliert, in denen die Wechselwirkungen der Regulations-DNA-Sequenzen mit den trans-wirkenden DNA-Bindungsproteinen eine zentrale Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription stellen die für Interferone (IFN) codierenden Gene ein Merkmal dar, das vielen Cotykingenen eigen i Jt; die Transkription dieser Gene wird in einem transienten Zustand nach verschiedenen extrazellulären Signalen induziert. Es ist bereits gut dokumentiert worden, daß die Transkription der Gene für IFN-a und IFN-ß in einer Vielzahl von Zellen durch Viren wirksam induziert wird, während die Transkription des für IFN-γ codierenden Gens in T-Lymphozyten (T-Zellen) nach mitogener Stimulierung induziert wird (siehe Weissmann und Weber, 1986; Taniguchi, 1988). IFN-ß, ein Cytokin, das ursprünglich wegen seiner potenten antiviralen Wirksamkeit identifiziert wurde, scheint auch eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung zu spielen. In diesem Zusammenhang scheinen neben Viren und poly(rl):poly(rC), die die bekannten Induktoren des IFN-ß-Gens sind, auch viele Cytokine wie der koloniöstimulierende Faktor-1 (CSF-1) (Moore u. a., 1984; Warren und Ralf, 1986; Resnitzky u. a., 1986), der Tumornekrose-Faktor (TNF) (Onozaki u.a., 1988); der plättchenstämmige Wachstumsfaktor (PDGF) (ZuIIo u.a., 1985) und die IFN (Kohase u. a„ 1987) IFN-ß in bestimmten Zellen zu induzieren, was vermuten läßt, daß sie ähnliche oder identische Signale in die Zielzellen übertragen können.The transcription of genes in mammalian cells is regulated by complex mechanisms in which the interactions of the regulatory DNA sequences with the trans-acting DNA binding proteins play a central role. In the context of transcriptional regulation, the genes encoding interferons (IFN) are a feature common to many cotyk genes; the transcription of these genes is induced in a transient state after various extracellular signals. It has already been well documented that transcription of the genes for IFN-α and IFN-β is efficiently induced by viruses in a variety of cells, while transcription of the gene encoding IFN-γ into T lymphocytes (T cells) after mitogenic stimulation (see Weissmann and Weber, 1986, Taniguchi, 1988). IFN-β, a cytokine originally identified for its potent antiviral activity, also appears to play an important role in the control of cell growth and differentiation. In addition to viruses and poly (rl): poly (rC), which are the known inducers of the IFN-ß gene, many cytokines, such as colonic stimulating factor-1 (CSF-1) (Moore et al., 1984; Warren and Ralf, 1986; Resnitzky et al., 1986), Tumor Necrosis Factor (TNF) (Onozaki et al., 1988); platelet-derived growth factor (PDGF) (ZuIIo et al., 1985) and IFN (Kohase et al., 1987) induce IFN-β in certain cells, suggesting that they can transmit similar or identical signals to the target cells.

Es wurde auch gezeigt, daß die IFN-ß-Geninduktion durch Viren und poly(rl):poly(rC) auf der Transkriptionsebene stattfindet (Raji und Pitham 1983; Ohno und Taniguchi, 1983; Dinter u.a., 1983; Zinn u.a., 1983). So wurden cls-wirkende DNA-Sequenzen, die als induzierbare Verstärker fungieren, in der 5'-Flankenregion des Human-IFN-ß-Gens identifiziert (Fujita u.a., 1985,1987; Goodbourn u.a., 1985; Dinter und Hauser, 1987). Die induzierbare Verstärkerregion (d.h. -65 bis -105 in bezug auf die CAP-Stelle) enthält sich wiederholende Hexanucleotideinheiten, von denen einige tatsächlich in der induzierten Aktivierung der Transkription bei der Multimerisierung wirken (Fujita u. a., 1987). In Säugetierzellen wiez. B. Maus-L929-Zellen und Human-Zellen wurden ein Faktor, IRF-1, der spezifisch an die IFN-ß-Regulationssequenzen bindet, sowie die funktionellon, sich wiederholenden Hexanucleotidsequenzen, (AAGTGA)«, identifiziert. Es wurde festgestellt, daß der IRF-1 eine wesentliche Rolle bei der virusinduzierten Aktivierung der IFN-ß-Gentranskription durch Wechselwirkung mit den identifizierten cls-Elementen spielt. Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten pharmazeutischen aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die entweder durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen für ein Protein enthält, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Soquenz enthält, die ein Gen für ein Protein codiert, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) enthält, wobei das Gen für das gewünschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1 -Proteins ist.It has also been shown that IFN-β gene induction by viruses and poly (rl): poly (rC) occurs at the transcriptional level (Raji and Pitham 1983, Ohno and Taniguchi, 1983, Dinter et al., 1983, Zinn et al., 1983). , Thus, cls-acting DNA sequences acting as inducible enhancers have been identified in the 5 'flanking region of the human IFN-β gene (Fujita et al., 1985, 1987; Goodbourn et al., 1985, Dinter and Hauser, 1987). The inducible enhancer region (i.e., -65 to -105 relative to the CAP site) contains repeating hexanucleotide units, some of which actually act in the induced activation of transcription in multimerization (Fujita et al., 1987). In mammalian cells, e.g. Mouse L929 cells and human cells, a factor, IRF-1, which specifically binds to the IFN-.beta. Regulatory sequences, as well as the functionally repetitive hexanucleotide sequences, (AAGTGA), have been identified. It has been found that IRF-1 plays an essential role in virus-induced activation of IFN-β gene transcription through interaction with the identified cls elements. According to the present invention, there is provided a method of producing a desired pharmaceutical active protein characterized by culturing host cells transformed either by a vector which simultaneously contains a DNA sequence comprising a gene for the desired pharmaceutically active protein and a gene for a protein which has the effect of an interferon regulatory sequence (IRF-1), or is transformed by two vectors, one vector containing a DNA sequence encoding a gene for the desired pharmaceutically active protein, and the other vector containing a DNA sequence Containing a gene encoding a protein containing the action of an interferon regulatory sequence (IRF-1), wherein the gene for the desired protein is under control of the IRF-1 protein, respectively.

Vorzugsweise das Gen, das für das Protein, das die Wirkung einer IRF-1 hat, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines induziblen Promotors ist, beispielsweise virusinduzierbar, z. B. durch mitogene Stimulierung z. B. mittels Concanavalin A, induzierbar.Preferably, the gene which is under the control of a constitutive or an inducible promoter for the protein which has the action of an IRF-1, for example virus inducible, e.g. B. by mitogenic stimulation z. B. by Concanavalin A, inducible.

Vorzugsweise codiert das Gen für das IRF-1 aktive Protein für oder ist hybridisierbar an das DNA-Molekül, das für Human-IRF-1 oder Maus-IRF-1 codiert.Preferably, the gene for the IRF-1 active protein encodes or is hybridizable to the DNA molecule encoding human IRF-1 or mouse IRF-1.

Das Gen für das IRF-1 wirkende Protein, ist vorzugsweise eine, das für ein Protein codiert, das an die wiederholte Oligomersequenz AAGTGA und die „upstream"-Regulationselemente des Human-IFN-ß-Gens bindet, vcizugsweise daher das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine IRF-1 Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen enthält.The gene for the IRF-1 acting protein is preferably one encoding a protein that binds to the repeated oligomer sequence AAGTGA and the upstream regulatory elements of the human IFN-β gene, preferably therefore the gene for the desired one , pharmaceutically active protein comprises an IRF-1 binding site containing a plurality of repeating AAGTGA sequences.

Die Wirtszelle kann durch einen ersten Vektor transformiert werden, der ein Gen enthält, die für das IRF-1-aktive Protein codiert, und durch einen zweiten Vektor, der ein Gen enthält, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1 -aktiven Proteins codiert, für das das erste Gen codiert.The host cell can be transformed by a first vector containing a gene encoding the IRF-1 active protein and a second vector containing a gene encoding the desired pharmaceutically active protein under the control of the IRF-1 protein. 1-active protein encoded by the first gene.

Vorzugsweise wird die Wirtszulle durch einen Vektor transformiert, der das Gon enthält, das für das IRF-1 aktive Protein codiert, und ein Gen, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1-aktivon Proteins codiert. Eine bevorzugte DNA-Sequenz (die für Human-IRF-1 codiert) ist durch ein Strukturen gekennzeichnet, das die folgende Formel I hat:Preferably, the host gene is transformed by a vector containing the gon encoding the IRF-1 active protein and a gene encoding the desired pharmaceutically active protein under the control of the IRF-1 active protein. A preferred DNA sequence (encoding human IRF-1) is characterized by a structure having the following formula I:

FormellFormally

10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA

60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT

110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 . 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC160 170 180 190. 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG

260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC

310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA

360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA

410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT

460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC

510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA

610 C20 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT610 C20 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 QCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC660 670 680 690 700 QCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC

760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC

810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG

860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC

960 970 CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG960,970 CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Die DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturgc η gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterteThe DNA sequence may, for example, be characterized by a structure which has been explained in the preceding Formel sowie „upstream"· und „downstreanV'-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel Il hat:Formula and "upstream" and "downstreanV" flanking sequences as in formula II below:

FormelllFormelll

cgagccccgccgaaccgaggccacccggagccgtgcccagtccacgc cggccgtgcccggcggccttaagaaccaggcaaccactgccttcttccct cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg ccgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaaccgagccccgccgaaccgaggccacccggagccgtgcccagtccacgc cggccgtgcccggcggccttaagaaccaggcaaccactgccttcttccct cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg ccgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaac

60 70 80 90 10060 70 80 90 100

TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT 110 120 130 140 150

TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAGTGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG

160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC

610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT

660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC

960 970960 970

catccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa gctggacttctgtgggcccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctccttgggtcattgacctctcagggcctggcagg CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCT₁GGGa agatgaggttctgagaccagtgtatcaggtcagggacttggacaggagtc agtgtctggctttttcctctgagcccagctgcctggagagggtctcgctg tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa caccaatcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttggcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag aggtgtacactaacatttcccccgagctcttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa atatgtacatttgtctttttataaaaagtaaaattgttcatccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa gctggacttctgtgggcccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctccttgggtcattgacctctcagggcctggcagg CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCT ₁ GGGA agatgaggttctgagaccagtgtatcaggtcagggacttggacaggagtc agtgtctggctttttcctctgagcccagctgcctggagagggtctcgctg tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa caccaatcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttggcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag aggtgtacactaacatttcccccgagctcttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa atatgtacatttgtctttttataaaaagtaaaattgtt

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Eine weitere bevorzugte DNA-Sequenz (die für Maus-IRF-1 codiert) ist durch ein Strukturgen der folgenden Formel IIIAnother preferred DNA sequence (encoding mouse IRF-1) is represented by a structural gene of the following Formula III

gekennzeichnet:characterized:

Formel IIIFormula III

ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC' CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC AT.G AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GACATG CCA ATG CGC TGG ATTA ATCC ATG AGC TGG ATTA ATCC ATCC ATCC ATA ATCC ATA CTG TG ATC AAT AAA GAA ATG ATC ATC ATC ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGG CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC 'CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC AT.G AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC

CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGC GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG * CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAGCAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGC GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACG GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG * CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Eine derartige wie im vorhergehenden Absatz genannte DNA-Sequenz kann beispielsweise durch ein Strukturen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel IV hat:Such a DNA sequence as mentioned in the preceding paragraph may, for example, be characterized by a structure having the formula explained above and "upstream" and "downstream" flanking sequences as in the following formula IV:

Formel IVFormula IV

1 GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC1 GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC

6 0 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG6 0 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG

119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC

178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG

227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA227 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA

272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATΓ CCA272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATΓ CCA

317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC

3 62 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT3 62 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT

4 52 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG4 52 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG

4 97 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG ΑΛΑ GAG AGA AAG TCC AAG TCC4 97 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG ΑΛΑ GAG AGA AAG TCC AAG TCC

587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT

632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA

677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG

722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT

767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT

812 ATA CCA GAT AGC-ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC812 ATA CCA GAT AGC-ACC ACT GAT CTG ACT AAC CTA CAG GTG TCA CCC

857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG

902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG

94 7 CAC CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA94 7 CAC CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA

992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG 1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA 1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG 1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT 1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG 1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA 1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG 1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT 1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC

1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAGCTAGACTCC

1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC

1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA

13 9 9 GCTGGCCCTCACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT13 9 9 GCTGGCCCTCACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT

14 58 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 163 5 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCATTTATTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 208214 58 1517 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 1576 163 5 1694 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGC ATTTATTTA TA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 1989 2048 2082 TTTTATAAAAATTTAAGTTGTTTACAAAAAAAAAA

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, die IRF-1-Aktivität besitzen, schließen DNA-SequenzenDNA sequences of the invention encoding proteins having IRF-1 activity include DNA sequences

oukaryotischen Ursprungs ein, und zwar nicht nur Human- und Maus-, sondern auch Kücken-, Frosch- und Hefe-DNA-Sequunzen,oukaryotic origin, not only human and mouse, but also chick, frog, and yeast DNA sequences,

die mit den DNA-Sequenzen des vorgenannten Human- oder Maus-IRF-1 (Fig.I bis IV) hybridisieren und die für ein Protein mitwhich hybridize with the DNA sequences of the aforementioned human or mouse IRF-1 (Fig.I to IV) and that for a protein with

IRF-1 -Aktivität codieren.Encode IRF-1 activity.

Eine derartige cDNA-Sequenz, das an die cDNA von Maus-IRF-1 nach der Definition in Fig.4 A hybridisiert, wird im folgenden inSuch a cDNA sequence which hybridizes to the cDNA of mouse IRF-1 as defined in Fig. 4A is described below in

Formel lila vorgestellt.Formula purple presented.

Formellilaformula Purple

10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

. 50 60 70 80 90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG, 50 60 70 80 90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA'100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA '

140 150 160 - 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC140 150 160 - 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 '250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC230 240 '250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

. 280 290 300 310, 280 290 300 310

ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCCATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

370 380 390 400370 380 390 400

aaaggaaagaaaccaaagacagaäa'a'agaagagagagttaagcac,aaaggaaagaaaccaaagacagaäa'a'agaagagagagttaagcac,

410 420 _ 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA410 420 _ 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

4G0 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA4G0 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG500 510 520 530 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 57.0 · 5GO TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC550 560 57.0 · 5GO TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT590 600 610 620 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT

680 690 700 710 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC680 690 700 710 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC770 780 790 800 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840 . 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG820 830 840. 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 " 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT860 x 870 880 "890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCeCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCeCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGT1040 GTCAAGAGCTGT

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Diese DNA-Sequenz kann beispiolswoise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterteThis DNA sequence may, for example, be characterized by a structural gene which has been explained in the preceding

Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Rankensequenzen wie in der folgenden Formel IVa hat.Formula and "upstream" and "downstream" Rankensequenzen as in the following formula IVa has.

Formel IVaFormula IVa

tctcacccaagccggggatctcacccaagccgggga

ctaacttttagttttgctcctgcgattattcaactgacgggcttt catttccattttacacaccctaacaacactcacaccttgcgggat tgtattggtagcgtggaaaa.aaaaaaagcacattgagagggtaccctaacttttagttttgctcctgcgattattcaactgacgggcttt catttccattttacacaccctaacaacactcacaccttgcgggat tgtattggtagcgtggaaaa.aaaaaaagcacattgagagggtacc

IO · 20 30 40IO · 20 30 40

ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60 70 80 SO ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG50 60 70 80 SO ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA

140 150 160 ' 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC140 150 160 '170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

190 200 210 20 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA190 200 210 20 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA

230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

280 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC280 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC

370 3SO 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC.370 3SO 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC.

410 420 _ 430 440 450 ATCAAXAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA410 420 _ 430 440 450 ATCAAXAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA

460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG

550 560 570 58C TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC550 560 570 58C TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

680 690 700 710 ' 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC680 690 700 710 '720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760730 740 750 760

AGTCATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGGAGTCATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 810770 780 790 800 810

AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAACAGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

8Π 830 840 8508Π 830 840 850

ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAGACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 ' 890 900860 × 870 880 × 890 900

CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCTCCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940910 920 930 940

TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCCTACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 930 990950 960 970 930 990

CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACCCCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC

1000 1010 1020 10201000 1010 1020 1020

CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGTCGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT

1040 GTCAAGAGCTGTT AAGCCTTTGACTC7CCCTGGTGG7T.GT7GGGA1040 GTCAAGAGCTGTT AAGCCTTTGACTC7CCCTGGTGG7T.GT7GGGA

TTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGT ATT AT ATTA7T-TTTTTTTCTTAGCTTTGTGTTGTTCTTTGTTTGT ATT AT ATTA7T-TTTT

TTCTCTATGATACCTATCTTAGACACATCTAAGGGAGAAAGCCTTTTCTCTATGATACCTATCTTAGACACATCTAAGGGAGAAAGCCTT

GACGATAGATTATTGATTGCTGTGTCCAACTCCAGAGCTGGAGCTGACGATAGATTATTGATTGCTGTGTCCAACTCCAGAGCTGGAGCT

TCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATGTCTTCTTAACTCAGGACTCCAGCCCCCCCCCCCCCTCGGTAGATG

CGTATCTCTAGÄACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAGCGTATCTCTAGÄACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG

TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGAGGTGCfGCGTTGCCTTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGAGGTGCfGCGTTGCC

TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGGTACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG

AGAAAATGTGAACTAGCTGGAATTTTTTTATTCTTGTGAATATGTAGAAAATGTGAACTAGCTGGAATTTTTTTATTCTTGTGAATATGT

acatagggcagtacgagcaatgtcgcgggctgcttctgcaccttaacatagggcagtacgagcaatgtcgcgggctgcttctgcacctta

tcttgaagcacttacaataggccttcttgtaatcttgctctcctt cacagcacactcggcgaccccttctgtgtccactaccccactacc cacccctccctcctcaacccctccatcccggtcctctatgcgccc cttccccccaaccaatcccatcacaacctcttacctatcctttcc ctcccaaccccttctatcccagcccaccacctaccccactcctcc ccaactcctccattctagcccattacccacgcctctctcctcagc ccagcctaccccatcccaccctgttcctttcctccagtttcctct cctcaaaggcaaggctctacatcttggaggaggaggaggagaaga aaatgagtttcttcaccgctgtcccattttaagactgcttgaata ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg tacaaaggaaaactgtcatggaaatattatgcaaattcccagatc tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagcttttttatcttgaagcacttacaataggccttcttgtaatcttgctctcctt cacagcacactcggcgaccccttctgtgtccactaccccactacc cacccctccctcctcaacccctccatcccggtcctctatgcgccc cttccccccaaccaatcccatcacaacctcttacctatcctttcc ctcccaaccccttctatcccagcccaccacctaccccactcctcc ccaactcctccattctagcccattacccacgcctctctcctcagc ccagcctaccccatcccaccctgttcctttcctccagtttcctct cctcaaaggcaaggctctacatcttggaggaggaggaggagaaga aaatgagtttcttcaccgctgtcccattttaagactgcttgaata ataaaaaaaaatctttctaatctgctatgcttgaatggcacgcgg tacaaaggaaaactgtcatggaaatattatgcaaattcccagatc tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagctttttta

tttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttatatttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttata

attttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatcattttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatc

-14- 299 CCTTGTGGCACATTTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGmAAAAAIA299 CCTTGTGGCACATTTTTTTTTAATTTTGTAAAGGTGmAAAAIA

ACTTTTATGAGCTCATGTAGCAATCAAATTATCCTGTGGATTGATACTTTTATGAGCTCATGTAGCAATCAAATTATCCTGTGGATTGAT

AATAAATGAATATGGTATATAGTTAAAGATTTTAAAAAAAAAAAAAATAAATGAATATGGTATATAGTTAAAGATTTTAAAAAAAAAAAA

oder eine degenerierte Variante davon.or a degenerate variant of it.

Im folgenden wird die Isolierung von cDNA-Molekülen aus Humanzellen und Mauszellen beschrieben, die für Human- und Maus-IRF-1 codieren, bzw. aus Mauszellen und Hefe, die an die cDNA von Maus-IRF-1 und Human-IRF-1 hybridisieren.The following describes the isolation of cDNA molecules from human and mouse cells encoding human and mouse IRF-1 and mouse cells and yeast, respectively, to mouse IRF-1 and human IRF-1 cDNA hybridize.

Das recombinante DNA-Molekül kann auch eine Promotor- und Regulationssequenz wie in der folgenden Formol V entholten:The recombinant DNA molecule may also provide a promoter and regulatory sequence as in the following Formol V:

Formel VFormula V

PstlPstI

CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299 CTGCAG AAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299

GC Box 1 GC Box 2 GC Box 1 GC Box 2

CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAA'GGGGCGcfccCCGCGGTAGCCCCJGGGGCGCJTGGCGCGGCAGGGGAGTGGAGTGGAGCAA ' GGGGCGcfc cCCGCGGTAGCCCC JGGGGCGCJ TGGCGCGG

GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC -193GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC -193

CAAT BoxCAAT box

AACAGCCTGATTTCCCCGAÄATGATGAGGCCGAGTGGGCCAATGGGCGCGCAGGAGCG -135AACAGCCTGATTTCCCCGAÄATGATGAGGCCGAGTG GGCCAAT GGGCGCGCAGGAGCG -135

kleine CAP-Stelle ' I 'small CAP site 'I'

.GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21.GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21

große CAP-Stelle plRF-Llarge CAP site plRF-L

ttcgcggcgccgcggactcgccagtgcgcaccactccttcgtcgaggtaIggacgtgctttcgcggcgccgcggactcgccagtgcgcaccactccttcgtcgaggtaIggacgtgct

-19 +1-19 +1

TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG +39TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG +39

CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCGCTTCGTG + 97

CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA + 155

PstlPstI

TCGCTCCTGCAG +213 +225TCGCTC CTGCAG +213 +225

oder eine degenerierte Variante davon.'or a degenerate variant of it. '

Ein Vektor kann für die Expression eines pharmazeutisch aktiven Proteins wie beispielsweise eines Cytokins oder eines Plasminogenaktivators vorgesehen sein und wird in dieser Form vorzugsweise ein Strukturgen für ein pharmazeutisch aktives Protein operabel gebunden an eine Promotorregion des Gens für dieses Protein einschließlich einer Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Molekül enthalten.A vector may be for expression of a pharmaceutically active protein such as a cytokine or a plasminogen activator, and in this form is preferably operably linked to a structural gene for a pharmaceutically active protein to a promoter region of the gene for that protein including a binding site for the IRF-1 -active molecule included.

Somit kann der Vektor eine wie im vorgegangenen erläuterte DNA-Sequenz und ein Strukturgen für ein gewünschtes pharmazeutisch aktives Protein unter der K jntrolle des IRF-1-aktiven Proteins, für das diese DNA-Sequenz codiert, enthalten. InThus, the vector may contain a DNA sequence as described hereinbefore and a structural gene for a desired pharmaceutically active protein under the control of the IRF-1 active protein encoded by that DNA sequence. In

einem derartigen rekombinanten DNA-Molekül befindet sich das für das IRF-1-aktive Molekül codierende Gen vorzugsweiseSuch a recombinant DNA molecule is preferably the gene coding for the IRF-1 active molecule

unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder noch besser eines induzierbaren Promotors. Vorzugsweise schließt dasunder the control of a constitutive promoter or even better an inducible promoter. Preferably this includes

Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein eine IRF-Bindungsstelle ein, die repetitive AAGTGA-Sequenzen enthält.For the desired pharmaceutically active protein, gene an IRF binding site containing AAGTGA repetitive sequences. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle, z. B. eine Bakterienzelle z. B. E.coli, oder eine Hefezolle oder eineThe present invention also includes a host cell, e.g. B. a bacterial cell z. B. E. coli, or a Hefezolle or a Säugetierzelle ζ. B. eine CHO-ZeIIe oder eine Mauszelle z. B. L929, die durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach der imMammalian cell ζ. B. a CHO cell or a mouse cell z. B. L929 produced by a recombinant DNA molecule according to the im Vorangegangenen erläuterten Bedeutung transformiert wurden. Idealerweise wird die Wirtszelle aus einer Zellinio ausgewählt,Previous explained meaning have been transformed. Ideally, the host cell is selected from a cell line,

die keine oder im wesentlichen keine endogene IRF-1-Aktivität zeigt.which shows no or substantially no endogenous IRF-1 activity.

Alternativ für die Produktion eines pharmazeutisch aktiven Proteins kann eine Wirtszelle transformiert sein durch ein erstesAlternatively, for the production of a pharmaceutically active protein, a host cell may be transformed by a first DNA-Mc lekül oder einen Vektor, die eine für ein Protein mit IRF-1 -Aktivität codierende Sequenz enthalten, und durch ein zweitesA DNA molecule or a vector containing a sequence coding for a protein having IRF-1 activity, and a second one

separates DNA-Molekül oder einen Vektor, die ein Gen enthalten, das unter der Kontrolle des IRF-1 -aktiven Proteins, für das dasa separate DNA molecule or vector containing a gene that is under the control of the IRF-1 active protein for which the

erste DNA-Molekül codiert, für ein gewünschtes, pharmazeutisch aktives Protein codiert. Vorzugsweise umfaßt das erste, für dasencoding the first DNA molecule encoded for a desired pharmaceutically active protein. Preferably, the first comprises, for

IRF-1-aktive Molekül codierende DNA-Molekül einen konstitutiven Promotor oder am besten eine induzierbareIRF-1-active molecule-encoding DNA molecule is a constitutive promoter or best an inducible Promotorsequenz, die operabel ist. Das zweite DNA-Molekül enthält vorzugsweise auch eine Bindungsstelle für das diePromoter sequence that is operable. The second DNA molecule preferably also contains a binding site for the

repetitiven AAGTGA-Sequenzen enthaltende IRF-1-aktive Protein.repetitive AAGTGA sequences containing IRF-1-active protein.

Das IRF-1 -aktive Protein oder das pharmazeutisch aktive Protein kann durch Kultivierung der transformierten Zelle und IsolierungThe IRF-1 active protein or the pharmaceutically active protein can be obtained by culturing the transformed cell and isolating

des erzeugten Proteins auf herkömmliche Weise hergestellt werden.produced protein in a conventional manner.

Die Wirtszellen werden geeigneterweise durch Behandlung in einer Art und Weise, die dem Promotor entspricht, der operabel anThe host cells are suitably operably treated by treatment in a manner corresponding to the promoter

das für den IRF-1 codierenden Gen gebunden ist, induziert, wie in" folgenden erläutert wird.the gene coding for the IRF-1 is induced as explained in the following.

Ein bevorzugtes Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Fo, mal Vl:A preferred protein with an IRF-1 activity has the following Fo, sometimes Vl:

Formel VlFormula Vl

Met Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu GIu Met Gin He Asn Ser Asn Gin He Pro GIy Leu He Trp He Asn Lys GIu GIu Met He Phe Gin lie Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His GIy Trp Asp He Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala He His Thr GIy Arg Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn Phe Arg Cys AIa Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ser Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu Pro Pro Leu Thr Arg Asn GIn Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser Pro Asp Thr Phe Ser Asp GIy Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser Leu Ser GIu Trp His Met GIn Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr Asp Leu Tyr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIy AIa AIa Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys Leu Phe GIu GIn Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp GIy Lys GIy Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr GlN Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu He Asp Ser Pro Arg GIy Asp He GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thr GIu Met Lys Asn Met Asp Ser He Met Trp Met Asp Ser Leu Leu GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa ProMet Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Giu Met Gin He Asn Ser Asn Gin He Pro Giu Leu He Trp He Asn Lys Giu Giu Met He Phe Gin lie Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His Giy Trp Asp He Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala He His Thr GIy Arg Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ser Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu Pro Pro Leu Thr Arg Asn GIn Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser Pro Asp Thr Phe Ser Asp GIY Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser Leu Ser GIu Trp His Met GIn Met Asp He He Pro Asp Ser Thr Thr Asp Leu Tyr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIy AIa Ala Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys Leu Phe GIu GIn Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp G Iy Lys GIy Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr Gln Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu He Asp Ser Pro Arg GIy Asp He GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thr GIu Met Lys Asn Met Asp Ser He Met Trp Met Asp Ser Leu Lei GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa Pro

Ein weiteres bevorzugt js Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Formel VII: Formel VIIAnother preferred js protein having an IRF-1 activity has the following Formula VII: Formula VII

MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMetMetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet

GlnlleAsnSerAsnGlnrieProGlyLeuIleTrpHeAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspHeAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspHeGluGluVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProProGlnlleAsnSerAsnGlnrieProGlyLeuIleTrpHeAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspHeAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro LysThrTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAspHeGluGluVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgMetLeuProPro

LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuPrcAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAspGluAspGIuGIuGIyLysLeuPro GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys LysGluGluProGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg LeuProSerIIeGInAIaIleProCysAlaProLeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLeuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuPrcAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal SerProMetProSerlleSerGluAlaThrThrAspGluAspGIuGIuGIyLysLeuPro GluAspIleMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSerValTyrGlyAspPheSerCys LysGluGluProGluIleAspSerProGlyGlyAspIleGlyLeuSerLeuGlnArgVal PheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrpLeuAspSerLeuLeuThrProValArg LeuProSerIIeGInAIaIleProCysAlaPro

Noch ein weiteres bevorzugtes Protein, das durch die cDNA-Sequenz der Formel lila codiert wird, hat die folgende Formel VIII.Yet another preferred protein encoded by the cDNA sequence of formula IIIa has the following formula VIII.

Formel VIIIFormula VIII

"MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln"MetProValGluArgMetArgMetArgProTrpLeuGluGluGln

IleAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGluIleAsnSerAsnThrlleProGlyLeuLysTrpLeuAsnLysGlu

LysLysIlePheGlnlleProTrpMetKisAlaAUArsHlsGly TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPheArsAsnTrpAlal IeLysLysIlePheGlnlleProTrpMetKisAlaAUArsHlsGly TrpAspValGluLysAspAlaProLeuPheArsAsnTrpAlal Ie

'HisThrGlyLysHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys'HisThrGlyLysHisGlnProGlylleAspLysProAspProLys

ThrTrpLysAlaAsiiPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsp i'leGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAlaThrTrpLysAlaAsiiPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsp i'leGluGluValLysAspArgSerlleLysLysGlyAsnAsnAla

PheArgValTi'rArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHisPheArgValTi'rArgMetLeuProLeuSerGluArgProSerLys LysGlyLysLysProLysThrGluLysGluGluArgValLysHis

IleLysGlnGluProVälGluSerSerLeuGIyLeuSerAsnGly ValSerGlyPheSerProGIuTyrAlaVälLeuThrSerAlalleIleLysGlnGluProVälGluSerSerLeuGIyLeuSerAsnGly ValSerGlyPheSerProGIuTyrAlaValLeuThrSerAlalle

-17- 299 LysAsnGluVal AspSerThrValAsn Il ell eVal VaIGIyGi η-17- 299 LysAsnGluVal AspSerThrValAsn Il ell eVal VaIGIyGi η

SerHisLeuAspSerAsnlleGluAspGlnGluIleValThrAsn ProProAspIleCysGlnValValGluValThrThrGluSerAsp AspGlnProValSerHetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSerSerHisLeuAspSerAsnLleGluAspGlnGluIleValThrAsn ProProAspIleCysGlnValValGluValThrThrGluSerAsp AspGlnProValSerHetSerGluLeuTyrProLeuGlnSer

ProValSerSerTyr.AlaGiuSerGluThrThrAspSerV'alAla SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArgProValSerSerTyr.AlaGiuSerGluThrThrAspSerV'alAla SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg

Ser 11 eGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGl yThrArsAsn ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsriLysSer 11 eGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGl yThrArsAsn ThrTyrLeuLeuLeProSerMetAlaThrPheValThrSerAsRIlys

ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro TyrAsnSerSerTrpProProPheThrÄspLeuProLeuProAlaProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro TyrAsnSerSerTrpProProPheThrÄspLeuProLeuProAla

ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr ArgAlaSerValIleLysLysThrSerAspIleThrGlnAlaArg ValLysSerCysProValThrProThrProSerSerArgProAspArgGluThr ArgAlaSerValIleLysLysThrSerAspIleThrGlnAlaArG ValLysSerCys

Im Folgenden wird die molekulare Clonierung und Charakterisierung von Maus- und Human-cDNA, die für DNA-bindende Proteine, die die IRF-I-Aktivität besitzen, codieren, beschrieben.The following describes the molecular cloning and characterization of mouse and human cDNA encoding DNA binding proteins possessing IRF-I activity.

Eine bemerkenswerte Sequenzerhaltung ist zwischen den Maus- und Human-IRF-1-Molekülen ersichtlich, './ie sich aus der Analyse der clonierten cDNAs ergab. Weiterhin zeigt sich, daß die Expression des für IRF-1 codierenden Gens durch das Newcastle-Virus (NVD) und durch Concanavalin A (Con A) in Maus-L929-Zellen bzw. Milzlymphozyten induziert wird.Remarkable sequence conservation is evident between the mouse and human IRF-1 molecules, as revealed by the analysis of the cloned cDNAs. Furthermore, expression of the gene coding for IRF-1 is shown to be induced by Newcastle virus (NVD) and concanavalin A (Con A) in mouse L929 cells and spleen lymphocytes, respectively.

1. Clonierung und Expression von IRF-I-DNA in E. coli1. Cloning and expression of IRF-I DNA in E. coli

A. PoIy(A)⁺RNA wurde aus nichtinduziertenMaus-L929-Zellen isoliert und für die Synthese von cDNA (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987) verwendet. Die entstandene cDNA wurde anschließend an einen EcoRI-geschnittenen Agt11 -Vektor cloniert, und eine cDNA-Bibliothek wurde nach dem Standardverfahren von Huynh u. a., 1985, mittels E.coli ^Y1090 als Wirtsstamm konstruiert.A. poly (A) ⁺ RNA was isolated from uninduced mouse L929 cells and used for the synthesis of cDNA (according to the method of Aruffo and Seed, 1987). The resulting cDNA was then cloned on an EcoRI cut Agt11 vector and a cDNA library was constructed according to the standard method of Huynh et al., 1985, using E. coli ^Y 1090 as a host strain.

Die entstandene Xg111-Bibliothek wurde anschließend mittels der multimerisierten (4 mal) AAGTGA-Sequenz (im folgenden als das Cl-Oligomer bezeichnet; Fujita u.a., 1987) als Sonde gescreent.The resulting Xg111 library was then screened by the multimerized (4 times) AAGTGA sequence (hereinafter referred to as the Cl oligomer; Fujita et al., 1987) as a probe.

Bei diesem Screening-Verfahren wurde E.coil Y1090, durch die rekombinanten Agtl 1-Phagen infiziert, auf rechteckige PlattenIn this screening procedure, E. coil Y1090, infected by the recombinant Agtl 1 phage, was grown on rectangular plates

von 10x 13cm ausgestrichen. Die Platten wurden dann bei 12°C 4 bis 5 Stunden, wenn ungefähr 20000 Plaques/Platte zu sehen waren, inkubiert.struck out of 10x 13cm. The plates were then incubated at 12 ° C for 4 to 5 hours when approximately 20,000 plaques / plate were seen.

Die Membranfilter zum Screenen waren entweder aus Nylon (Nytran; Schloicher & Schnell) odor Nitrocellulose (Schleicher & Schnell). Die Filter wurden in 1OmM IPTG (zur Induktion der LacZ-Genexpression in den entsprechenden Phagenplaques) getaucht und an der Luft getrocknet, dann über die Platten gelegt und 2,5 Stunden bei 37⁰C inkubiert.The membrane filters for screening were either nylon (Nytran; Schloicher & Schnell) or nitrocellulose (Schleicher & Schnell). The filters were immersed in 1OmM IPTG (for the induction of lacZ gene expression in the appropriate phage plaques) and air dried, then placed over the plates and incubated for 2.5 hours at 37 ⁰ C.

Die Plaques werden nur ein Protein erzeugen, für das die cDNA codieit, wenn die cDNA mit dem LacZ-Gen Im Rahmen ist.The plaques will only produce a protein coded for by the cDNA when the cDNA is in frame with the LacZ gene.

Die Filter werden entfernt, 20 Minuten bei 4°C gekühlt und dann ohno Trocknen gescreent.The filters are removed, cooled at 4 ° C for 20 minutes and then screened without drying.

Die Membranfilter wurden dann wie folgt für den Test vorbereitet:The membrane filters were then prepared for the test as follows:

Aus Maus-L929-Zellen wurde der Kernextrakt hergestellt und auf die Membranen getüpfelt (in einer Menge, die etwa 10pg Protein entsprach).From mouse L929 cells, the nuclear extract was prepared and spotted onto the membranes (in an amount equivalent to about 10 μg of protein).

Vor der DNA-Bindung wurde ein Bindungspuffer, der aus 1OmM Hopes, pH 7,5,5,OmM NaCI, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% Glycerol bestand, zugesetzt. 5% fettfreios Milchpulver (Yukijurishi Inc.) wurde zu dem Puffer gegeben, und die Filter wurden in diesem Gemisch 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert und anschließend 1 Minute im gleichen Puffer, der jedoch kein Milchpulver enthielt, gespült.Prior to DNA binding, a binding buffer consisting of 10 mM Hopes, pH 7.5.5, OmM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% glycerol was added. 5% fat-free milk powder (Yukijurishi Inc.) was added to the buffer and the filters were incubated in this mixture for 1 hour at 4 ° C and then rinsed for 1 minute in the same buffer but containing no milk powder.

Die Filter wurden dann in Bindungspuffer (1 ml) inkubiert, der 350pg/ml Lachssperma-DNA mit oiner durchschnittlichen Länge von etwa 300bp und die "P-markierte Sonde aus CI-Oligomer-DNA (10^ecpm/ml; spezifische Aktivität 2000cpm/f Mol) enthielt (siehe Fujita u.a., 1987). Die Sonden-DNA wurde mit T4-Kinase an den 5'-Termini [γ-³²Ρ)ΑΤΡ endmarkiert.The filters were then incubated in binding buffer (1 ml) containing 350 μg / ml salmon sperm DNA with an average length of about 300 bp and the P-labeled probe from CI oligomer DNA (10 ^e cpm / ml, specific activity 2000 cpm / ml). f mol) (see Fujita et al., 1987) .The probe DNA was end-labeled with T4 kinase at the 5'-termini [γ- ³² Ρ) ΑΤΡ.

Nach der Bindung wurden die Filter bei Raumtemperatur mit dem Bindungspuffer 1 bis 2 Stünden lang gewaschen (10 ml Filter), wobei der Bindungspuffer mehrere Male gewechselt wurde. Die Filter wurden dann an dor Luft getrocknet und autoradiographisch untersucht. Bei diesem Test ergaben die Nylonmembranen, jedoch nicht die Nitrocellulosemembranen, ein positives Signal, was durch Zugabe von überschüssigem nichtmarkiertem Cl-Oligomer spezifisch inhibiert wurde.After binding, the filters were washed at room temperature with the binding buffer for 1 to 2 hours (10 ml filter), changing the binding buffer several times. The filters were then dried in air and autoradiographed. In this test, the nylon membranes, but not the nitrocellulose membranes, gave a positive signal, which was specifically inhibited by the addition of excess unlabeled Cl oligomer.

\uf diese Weise wurden etwa 1,4x 10'Rekombinanten gescreent. Unter den 32 positiven Phagenclonen, die beim ersten Screenen identifiziert wurden, war ein Clon (der als AL28-8 bezeichnet wurde), der wiederholt in aufeinanderfolgenden Screeningdurchgängen an die Sonden-DNA band.In this way about 1.4x 10 'recombinants were screened. Among the 32 positive phage clones identified on the first screen was a clone (designated AL28-8) that repeatedly bound to the probe DNA in successive rounds of screening.

2. Herstellung und Reinigung von Protein in transferiertem E.coil2. Preparation and purification of protein in transferred E. coil

Lysogene Bakterienclone wurden durch Transfektion von E. coli Y1089 mit AL 28-8 hergestellt. Die über Nacht stehengelassenen Lysogene, die AL 28-8 enthielten, wurden zu 1% in 400 ml L-Brühe eingeimpft. Die Bakterien wurden bei 31 °C gezüchtet, bis OD₆Oo gleich 1 war. Die Temperatur wurde dann für 20 Minuten auf 42⁰C erhöht. IPTG wurde dann zu 1OmM zugegeben, und nach weiterer 20minütiger Inkubation bei 38⁰C wurden die Kulturen schnell pelletiert und in 10ml Lysispuffer suspendiert, der aus 2OmM Hepes pH 7,9,0,2mM EDTA, 0,5mM Spermidin, 0,15mM Spermin, 0,1 mM DTT, 10% Glycerol, 0,5mM Phenylmethyonylsulfonylfluorid (PMSF), 1 pg/ml Pepstatin A, 1 Mg/ml Leupeptin, 500 μ Μ L-l-Tosylamid-2-phenylethylchloromethylbenzamidin, 1OmM N.atriummoiybdat, 2mM Natriumpyrophosphat und 2mM Natriumorthovanadat bestand. Die Zellsuspensionen wurden drei schnellen Gefrier/Auftau-Zyklen ausgesetzt und anschließend bei 30000U min'¹ Lysogenic bacterial clones were prepared by transfecting E. coli Y1089 with AL 28-8. The overnight lysogens containing AL 28-8 were inoculated to 1% in 400 ml L broth. The bacteria were grown at 31 ° C until OD ₆ Oo was equal to 1. The temperature was then raised to 42 ^° C. for 20 minutes. IPTG was then added to 1OmM, and after further 20 minutes of incubation at 38 ⁰ C, the cultures were rapidly pelleted and suspended in 10 ml lysis buffer consisting of 2OmM Hepes pH 7,9,0,2mM EDTA, 0.5 mM spermidine, spermine 0.15mm , 0.1mM DTT, 10% glycerol, 0.5mM Phenylmethyonylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 pg / ml Pepstatin A, 1mg / ml Leupeptin, 500μl L-tosylamide-2-phenylethylchloromethylbenzamidine, 10mM Sodium Molybdate, 2mM Sodium pyrophosphate and 2 mM sodium orthovanadate. The cell suspensions were subjected to three rapid freeze / thaw cycles and then at 30000 rpm ' ¹

I Stunde lang bei 4⁰C mittels eines Beckman 50Ti Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entweder direkt für einen Gelverzögerungstest (siehe unten) verwendet oder weiter gereinigt.Long I hour centrifuged rotor at 4 ⁰ C using a Beckman 50Ti. The supernatant was either used directly for a gel delay test (see below) or further purified.

Die weiterr Reinigung wurde folgendermaßen ausgeführt:The further cleaning was carried out as follows:

Etwa 4ml Überstand wurden auf eine poly(di-C):poly(di-C)-Säule mit einem Bettvolumen von 2ml und mit Lysepuffer äquilibrieit, aufgegeben. Das Durchflußmaterial (4 ml) wurde dann auf eine DE 52 (Whatman) Säule mit einem Bettvolumen von 2ml und n<it Puffer Z (25mM Hepes, pH 7,8,12,5mM MgCI₂,1 mM DTT, 20% Glycerol, 0,1 % NP-40,0,5mM PMSF) äquilibriert, aufgegeben. Die DNA-Bindungsaktivität wurde durch den 0,1m KCI enthaltenden Puffer Z eluiert. DasEluat (etwa 4ml) wurde weiter mit Centrion-10 (Amicon) eingeengt. Die Endkonzentration des Proteins betrug 28mg/ml.Approximately 4 ml of supernatant was applied to a poly (di-C): poly (di-C) column with a bed volume of 2 ml and equilibrated with lysis buffer. The flow through (4 ml) was then applied to a DE 52 (Whatman) column with a bed volume of 2 ml and n <it buffer Z (25 mM Hepes, pH 7.8, 12.5 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 20% glycerol, 0.1% NP-40, 5mM PMSF) equilibrated, abandoned. DNA binding activity was eluted by Buffer Z containing 0.1m KCl. The eluate (about 4 ml) was further concentrated with Centrion-10 (Amicon). The final concentration of the protein was 28 mg / ml.

3. Charakterisierung des Proteinprodukts des Clons AL28-8 (1) Gelverzögerungstost3. Characterization of the Protein Product of Clone AL28-8 (1) Gel delay

Lysogene Bakterienclon·?, die AL28-8 enthielten, wurden durch Transfektion von E.coli Y1089 hergestellt und wurden induziert, um die cloniertecDNA in großen Mengen mittels des Verfahrens von Huynh u.a., 1985, zu exprimieren. Lysogene Clone, die in der gleichen Art und Weise hergestellt und behandelt worden waren, denen das cDNA-lnsert (als A6 bezeichnet) fehlt, wurden als Kontrolle benutzt.Lysogenic bacterial clones containing AL28-8 were prepared by transfecting E. coli Y1089 and were induced to express the cloned cDNA in large quantities by the method of Huynh et al., 1985. Lysogenic clones prepared and treated in the same manner lacking the cDNA insert (designated A6) were used as controls.

Aus den induzierten Lysogenkulturen wurden Extrakte hergestellt, die je 3μο Protein enthielten (vier Präparate, die als XL28-8a, AL28-8b und A6a und A6'j bezeichnet wurden).From the induced lysogen cultures extracts were prepared containing 3μ each protein (four preparations designated XL28-8a, AL28-8b and A6a and A6'j).

Kernextrakt (3pg Protein) wurde ebenfalls aus Maus-L929-Zellen hergestellt.Nuclear extract (3pg protein) was also prepared from mouse L929 cells.

Die Extrakte wurden mi' 1 f mol gekennzeichneter C1 -Oligomer-Sonde nach obiger Beschreibung mit einer spezifischen Aktivität von 8000cpm/f mol inkubiert.The extracts were incubated with 1 f mol of labeled C1 oligomer probe as described above with a specific activity of 8000 cpm / fmole.

Jeder Extrakt wurde auoh einem Vergleichstest unterzogen, in dem eine kompetitive DNA in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubationskultur gegeben wurde.Each extract was subjected to a comparative test in which a competitive DNA at various concentrations was added to the incubation culture.

Die Ergebnisse dos Tests sind in Fig. 1 dargestellt, in der die verschiedenen Bahnen folgendem entsprechen:The results of the tests are shown in Fig. 1, in which the different lanes correspond to the following:

Bahn ExtraktTrain extract

1 nichts1 nothing

4 A6bmit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarHortem Cl-Oligomer4 A6b with 10OO-fold molar excess of nonmarH ClM oligomer

5 A6b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiei iem C5A-Oligomer*5 A6b with 10OO-fold molar excess of nonmarker C5A oligomer *

6 AL 28-8 a6 AL 28-8 a

7 AL 28-8 b7 AL 28-8 b

8 AL28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 1-Oligomer8 AL28-8b with 10000 molar excess of unlabelled C 1 oligomer

9 AL28-8b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer* 10 L929-Zelle9 AL28-8b with 10OO-fold molar excess of unlabeled C5A oligomer * 10 L929 cell

I1 L929-Zelle mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C 1-OligomerI1 L929 cell with 10,000 fold molar excess of unlabeled C 1 oligomer

12 L929-Zelle mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer*12 L929 cell with 10,000 fold molar excess of unlabelled C5A oligomer *

• Das in Fujita u.a., 1985 beschriebene C5A-Oligomer ist eine 6mal wiederholte GAAA-Sequenz.The C5A oligomer described in Fujita et al., 1985 is a 6-fold repeated GAAA sequence.

Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß Gebundene Sonden in den Bahnen β, 7,9,10 und 12 nachweisbar sind.From Fig. 1 it can be seen that bound probes are detectable in the lanes β, 7, 9, 10 and 12.

Wie In Fig. 1 gezeigt wird, ergaben Proteinextrakte aus den XL28-8-Lysogenen verschobene Bahnen (Bahnen 6 und 7), derenAs shown in Fig. 1, protein extracts from the XL28-8 lysogens gave displaced lanes (lanes 6 and 7) whose

Erscheinen durch den Überschuß an nichtmarkierter C 1-Oligomer-DNA inhibiert war, jedoch nicht in dom gleichen Maße wie bei C5A-Oligomer (Bahnen 8 und 9).Appearance was inhibited by the excess unlabelled C 1 oligomer DNA, but not to the same extent as C5A oligomer (lanes 8 and 9).

Im Gegensatz zu den XL28-8-stämmigen Proteinen ergaben diejenigen, die aus den induzierten X6-stämmigen Lysogenen hergestellt worden waren, keine derartigen verschobenen Banden (Bahnen 2-5). Die verschobenen Banden sind dicht bei denen von natürlichem IRF-1 aus Maus-L929-Zellen (Bahnen 10 und 12) zu sehon. Die in den beiden Reihen der verschobenen fanden existierenden Unterschiede sind als eine Folge der unterschiedlichen Mengen an Protein, das an di j Sonden-DNA gebunden ist, zusehen.In contrast to the XL28-8-derived proteins, those made from the induced X6-derived lysogens did not give rise to such shifted bands (lanes 2-5). The shifted bands are close to those of natural IRF-1 from mouse L929 cells (lanes 10 and 12). The differences found in the two sets of displaced exist as a result of the different amounts of protein bound to the probe DNA.

Weiter wird festgestellt, daß die verschobenen Banden nur bei den Proteinen aus IPTG-induzierten Y 1089-Zollen, die mit XL 28-8 transfektiert waren, nachweisbar waren.It is further noted that the shifted bands were detectable only on the proteins from IPTG-induced Y 1089 cells transfected with XL 28-8.

(II) DNAase-Fußspuranalyse(II) DNAase footprint analysis

Die Fußspurenanalyse wurde durchgeführt, um die Bindungseigenschaften des durch XL28-8-cDNA codierton Proteins an eine DNA, die für die IFN-ß-Gen-„upstream"-Region codiert, zu testen.Footprint analysis was performed to test the binding properties of the protein encoded by XL28-8 cDNA to a DNA encoding the IFN-β gene "upstream" region.

Das durch XL28-8-cDNA codierte Protein wurde aus dem induzierten Lysogen extrahiert und teilweise durch Säulenchromatographie wie oben beschrieben gereinigt und auf seine Bindungseigonschaften an eine DNA, die die IFN-ß-Gen-The protein encoded by XL28-8 cDNA was extracted from the induced lysogen and partially purified by column chromatography as described above and assayed for its binding to a DNA encoding the IFN-β gene.

„upstream"-Region enthält, geprüft. ·Contains "upstream" region, checked. ·

Die Sonden-DNAs wurden als Sall-Hindlll-Fragmente hergestellt, die aus p-125cat (das das Wildtyp IFN-ß-Gon enthält) und p-125 DPcat (das ein mutiertes IFN-ß-Gon enthält) isoliert wurden. Das Plasmid p-125cat wurde als p-105cat konstruiert (FujitaThe probe DNAs were prepared as SalI-HindIII fragments isolated from p-125cat (containing the wild-type IFN-β-gon) and p-125 DPcat (containing a mutant IFN-β-gon). The plasmid p-125cat was constructed as p-105cat (Fujita

u. a., 1987), mit der Ausnahme, daß das Fragment BamHI(-125)-Tagl (+19) aus pSE-125 (Fujita u.a., Cell, Bd. 41, S.489-496,1985) verwendet wurde. Das Plasmid p-125DPcat, das Punktmutationen innernalb der IFN-ß-Regulationselemente trägt, wurde durch synthetische ortsspezifische Oligonucieotidmutagenese an p-125cat wie bei Hatakeyama u. a., Proc. Natl. Aced. Sei. USA, Bd.83, S.9650-9654,1986) beschrieben, gewonnen. Beide DNAs wurden durch (y-³²P]ATP mittels T4-Kinase an der Hindlll-Stelle markiert.et al., 1987), except that the fragment BamHI (-125) -Tagl (+19) from pSE-125 (Fujita et al., Cell, Vol. 41, pp. 489-496, 1985) was used. The plasmid p-125DPcat, which carries point mutations innernalb of the IFN-.beta. Regulatory elements, was isolated by synthetic site-directed oligonucleotide mutagenesis on p-125cat as in Hatakeyama et al., Proc. Natl. Aced. Be. USA, Vol. 83, pp. 9650-9654, 1986). Both DNAs were labeled by (γ- ³² P] ATP using T4 kinase at the HindIII site.

4f. Mol Sonden-DNA (spezifische Aktivität 3OOOcpm/f. Mol) wurden in 20μΙ Reaktionsgemisch, das 25 mM Tris-HCI, pH 7,9, 6,25mM MgCI₂,5OmM KCI, 1 mM EDTA, 0,5mM DTT, 10% Glycerol, 2% Polyvinylalkohol enthielt, mit oder ohne 280Mg gereinigtes Protein inkubiert.4f. Moles of probe DNA (specific activity 3OOOcpm / fmole) were dissolved in 20μΙ reaction mixture containing 25mM Tris-HCl, pH 7.9, 6.25mM MgCl ₂ , 50mM KCl, 1mM EDTA, 0.5mM DTT, 10% Glycerol containing 2% polyvinyl alcohol, incubated with or without 280 μg purified protein.

In dem Test wurden 5x 10~⁴ Einheiten DNAaso I (Worthington) zugefügt und 1 Minute bei 25°C inkrbiert.In the test were 5x 10 ^-4 units DNAaso I (Worthington) was added and inkrbiert 1 minute at 25 ° C.

Fig. 2 zeigt Autoradiogramme dor aus den Proben gewonnenen DNA-Fragmente, die während der folgenden Verfahren gewonnen wurden. Auf der linken Seite von Fig. 2 ist der Teil der DNA-Sequenz der Wildtyp-IFN-ß-Sonde dargestellt, und auf der rechten Seite der Teil der DNA-Sequenz der mutierten IFN-ß-Sonde.Fig. 2 shows autoradiograms of the DNA fragments obtained from the samples obtained during the following procedures. On the left side of Fig. 2 the part of the DNA sequence of the wild-type IFN-β probe is shown, and on the right side the part of the DNA sequence of the mutated IFN-β probe.

1. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten (siehe Methods in Enzymology, Bd. 65, S.499-560) - das Ergebnis wird in Bahn 1 gezeigt.1. The wild type IFN-β probe was cut by A + G reactions (see Methods in Enzymology, Vol. 65, p.499-560) - the result is shown in lane 1.

2. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde teilweise durch DNAase I ohne Schutz digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 2 gezeigt.2. The wild-type IFN-β probe was partially digested by DNAase I without protection - the result is shown in lane 2.

3. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und dann mit DNAase i digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 3 gezeigt.3. The wild type IFN-β probe was reacted with the protein and then digested with DNAase i - the result is shown in lane 3.

4. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein in Gegenwart eines 10OOfachen molaren Überschusses an nichtmarkiertem C 1-Oligomer umgesetzt und anschließend mit DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 4 gezeigt.4. The wild-type IFN-β probe was reacted with the protein in the presence of a 10 000-fold molar excess of unlabeled C 1 oligomer and then digested with DNAase I - the result is shown in lane 4.

5. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und anschließend durch DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 5 gezeigt.5. The mutant IFN-β probe was reacted with the protein and then digested with DNAase I - the result is shown in lane 5.

6. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde durch A + G-Reaktionen geschnitten - das Ergebnis wird in Bahn 6 gezeigt.6. The mutant IFN-β probe was cut by A + G reactions - the result is shown in lane 6.

In Fig. 2 werden die in den Bahnen 3 und 5 gefundenen geschützten Regionen entsprechend den auf der linken bzw. rechten Seite des Autoradiogramms dargestellten Sequenzen gezeigt. Die Hexamermotive sind eingerahmt.In Fig. 2, the protected regions found in lanes 3 and 5 are shown according to the sequences shown on the left and right sides of the autoradiogram, respectively. The hexamers are framed.

Aus den Ergebnissen in Fig. 2 ist ersichtlich, daß die geschützte Region den Nucleotiden -100 bis -64 entspricht und dies die Region ist, die durch aus L929-Zellen gewonnene IRF-1 geschützt wird. Der Schutz wurde durch die Verwendung von überschüssigem nichtmarkiertem C1 -Oligomer (Bahn 4) aufgehoben. Bei Verwendung geringerer Proteinkonzentration wurde auch . estgestellt, daß die das AAGTGA-Motiv (-80 bis -70) enthaltende Region bevorzugt geschützt war.From the results in Fig. 2, it can be seen that the protected region corresponds to nucleotides -100 to -64 and this is the region protected by IRF-1 derived from L929 cells. The protection was abolished by the use of excess unlabeled C1 oligomer (lane 4). Also, using lower protein levels became. It was found that the region containing the AAGTGA motif (-80 to -70) was preferentially protected.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Protein eine höhere Affinität zu der das AAGTGA-Motiv enthaltenden Region und eine geringere Affinität zu der Nachbarregion hat.These results show that the protein has a higher affinity for the region containing the AAGTGA motif and a lower affinity for the neighboring region.

Das rr\utierte IFN-ß-Gensegment trägt T- G-Mutationen an den Positionen -106, -100, -73 und -67. In den Vergleichsbahnen 5 und 2 unter den gleichen Testbedingungen erscheint der durch die rekombinanten Proteine gewährte Schutz an der nichtmutierten Region eingeschränkt (Bahn 2). Diese Beobachtung stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Einführung dieser Mutationen zu einer drastischen Reduzierung (20fach) der Induzierbarkeit der Transkription durch NDV in L929-Zellen führt und daß die In-vitro-Bindung von IRF-1 an das mutierte IFN-ß-Gen nur in der nichtmutierten Region feststellbar war.The disrupted IFN-ß gene segment carries T-G mutations at positions -106, -100, -73, and -67. In Comparative Examples 5 and 2 under the same test conditions, protection afforded by the recombinant proteins is restricted at the unmutated region (lane 2). This observation is consistent with the observation that the introduction of these mutations leads to a drastic reduction (20-fold) in the inducibility of NDV transcription in L929 cells and that the in vitro binding of IRF-1 to the mutant IFN-β Gene was detectable only in the non-mutated region.

Weiter zeigt die Verwendung des C1-Oligomers, daß das Protein spezifisch die Region schützt, die die Oligomersequenzen enthält. Dieser Schutz entspricht vollkommen dem, der durch nativen IRF-1, der aus L-929-Zellen stammt, gewährt wird.Further, the use of the C1 oligomer indicates that the protein specifically protects the region containing the oligomeric sequences. This protection is completely equivalent to that afforded by native IRF-1 derived from L-929 cells.

3. DNA-Konkurrenztest3. DNA competition test

Dieser Test wird ausgeführt, um die Affinität des rekombinanten Proteins zu verschiedenen DNA-Sequenzen einschließlich einigen bekannten Transkriptionsregulations-DNA-Sequonzen zu untersuchen. Das Verfahren wird folgenderweise durchgeführt:This assay is performed to examine the affinity of the recombinant protein for various DNA sequences, including some known transcriptional regulatory DNA sequences. The procedure is carried out as follows:

Das Hindlll-Sall-Fragment der IFN-ß-Sonde wurde aus p-125cat isoliert (siehe Fujita u. a., 1987); dieses Fragment enthält die Human-IFN-ß-Gensequenz von +19 bis -125. Die DNA wurde an den 3'-Termini durch Füllen beider Enden mit Ia-³²P) dCTP mittels Klenow-Fragment markiert.The HindIII-SalI fragment of the IFN-β probe was isolated from p-125cat (see Fujita et al., 1987); this fragment contains the human IFN-β gene sequence from +19 to -125. The DNA was labeled at the 3 'termini by filling both ends with Ia- ³² P) dCTP using Klenow fragment.

Die spezifische Aktivität der Sonden-DNA betrug 8000cpm/f. Mol,The specific activity of the probe DNA was 8000 cpm / f. mol,

Die Gelverzögerungstests wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.The gel delay tests were performed under the conditions described above.

In den Durchläufen des Konkurrenztests wurde, wie in Fig. 3 gezeigt, die DNA mit dem Protein in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Konkurrenz-DNAs in dem Bindungsgemisch umgesetzt.In the runs of the competition test, as shown in Figure 3, the DNA was reacted with the protein in the presence of various concentrations of competitor DNAs in the binding mixture.

Der Bildungswert des Komplexes wurde durch densitometrische Analyse des Autoradiogramms quantitativ bestimmt. Die Komplexbildung in Abwesenheit von Konkurrenz-DNA wurde öls 100%angenommen.The formation value of the complex was quantified by densitometric analysis of the autoradiogram. Complex formation in the absence of competing DNA was assumed to be 100% oil.

Die Struktur der Konkurrenz-DNAs sah folgendermaßen aus:The structure of the competing DNAs looked like this:

a) AP-1: eine synthetische DNA mit folgender Sequenza) AP-1: a synthetic DNA with the following sequence

5¹CTAGA(TGACTCAIeG 3' 3¹T(ACTGAGT)₆CCTAg 5'5 ¹ CTAGA (TGACTCAIeG 3 '3 ¹ T (ACTGAGT) ₆ CCTAg 5'

b) TNF: 37bp lange synthetische DNA, die von +1162 bis +2116 (siehe Nedwin u.a., 1985) des ersten TNF-a-Introns reicht;b) TNF: 37bp synthetic DNA ranging from +1162 to +2116 (see Nedwin et al., 1985) of the first TNF-a intron;

c) Maus-Η 2-D^d: 37 bp lange synthetische DNA, die das von Korber u. a., 1988 beschriebene IRS-Elemont (-159 bis -123) umfaßt;c) mouse-2-D ^d : 37 bp synthetic DNA comprising the IRS Elemont (-159 to -123) described by Korber et al., 1988;

d) Human-IFN-α: 46bp lange synthetische DNA, die dem Virus-Antwortelement (Virus Response Element) entspricht (siehe Ryals u.a., 1985).d) Human IFN-α: 46bp long synthetic DNA corresponding to the virus response element (see Ryals et al., 1985).

θ) Hexamersequenzen C1, C2, C3, Cd und C5A.θ) hexamer sequences C1, C2, C3, Cd and C5A.

Die Sequenzen C1 und C5A sind die oben beschriebenen. Die Sequenzen C2, C3 und C4 sina die in Cell, 49,352-367 (1987) beschriebenen. Sie stellen die SequenzenSequences C1 and C5A are those described above. Sequences C2, C3 and C4 are those described in Cell, 49, 353-367 (1987). They represent the sequences

AAATGA - C 2 AAGGGA - C3und AAAGGA - C4AAATGA - C 2 AAGGGA - C3 and AAAGGA - C4

f) dielFN-ß-Gensequenzvon +19 bis -66.f) the DIFF-β gene sequence from +19 to -66.

Die linke Tafel in Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Hexamerwiederholungen als Konkurrenten verwendet wurden. Die mittlere Tafel zeigt die Ergebnisse, wenn Human-IFN-Gensegmente als Konkurrenton eingesetzt wurden, und die rechte Tafel zeigt die entsprechenden Ergebnisse, wenn die in der Tafel angegebenen unterschiedlichen DNA-Segmente verwendet wurden.The left panel in Fig. 3 shows the results obtained when the hexamer repeats were used as competitors. The middle panel shows the results when human IFN gene segments were used as competitor clay and the right panel shows the corresponding results when the different DNA segments indicated in the panel were used.

Aus den Ergebnissen in Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Erscheinen der verschobenen Bande durch die Hexamersequenzen in dieser Reihenfolge der Wirksamkeit C1-C2-C3-C4 verdrängt wurde, jedoch signifikant nicht verdrängt wurdo durch C 5 A. Es kann auch beobachtet werden, daß die synthetischen DNA-Segmente, die die Regulationselemente von entweder Human-IFN-a1 oder Maus-H-2D^d-Genen umfassen, zu einer kompetitiven Aktivität Anlaß geben. Dies ist insbesondere interessant, da das DNA-Segment des H-2 D^d-Gens die sogenannte IFN-Antwortsequenz (IRS) enthält, die als ein Verstärker fungiert, wenn die Zellen auf IFN reagieren (Sugita u.a., 1987; Israel u.a., 1986; Korber u.a., 1988).It can be seen from the results in Figure 3 that the appearance of the shifted band by the hexamer sequences was displaced in this order of activity C1-C2-C3-C4 but was not significantly displaced by C 5 A. It can also be observed that the synthetic DNA segments comprising the regulatory elements of either human IFN-a1 or murine H-2D ^d genes give rise to competitive activity. This is particularly interesting since the DNA segment of the H-2 D ^d gene contains the so-called IFN response sequence (IRS), which acts as an enhancer when the cells respond to IFN (Sugita et al., 1987, Israel et al., 1986 Korber et al., 1988).

Tatsächlich werden ähnliche oder gleiche Sequenzmotive wie auf dem IFN-ß-Gen in vielen Promotorsequenzen der IFN-induzierbaren Gene gefunden, wo Kernfaktoren spezifisch zu binden scheinen (Korber u. a., 1988; Lery u.a., 1988). Die in Fig. 3 gegebenen Ergebnisse ähneln sehr denen, die gewonnen werden, wenn der Test unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von natürlichem, aus L929-Zellen produziertem Protein wiederholt wird.In fact, similar or identical sequence motifs as on the IFN-β gene are found in many promoter sequences of the IFN-inducible genes where nuclear factors appear to bind specifically (Korber et al., 1988, Lery et al., 1988). The results given in Figure 3 are very similar to those obtained when the assay is repeated under the same conditions using natural protein produced from L929 cells.

Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNAStructure of cDNA encoding mouse IRF-I

Die DNA-Sequenz der clonierten DNAs wurde entweder durch die Didesoxymethode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) oder durch das Standardverfahren von Maxam und Gilbert, 1980) bestimmt.The DNA sequence of the cloned DNAs was determined either by the dideoxy method (SEQUENASE, United States Biochemical, Inc.) or by the standard method of Maxam and Gilbert, 1980).

Das AL2ß-8-lnsert in E.coli Y1089 wurde folgendermaßen isoliert: Die Phagen-DNA wurde durch das Standardverfahren hergestellt und die DNA wurde durch EcoRI digeriert, dann wurde die aus der Phagen-DNA ausgeschnittene cDNA mit Hilfe der Didesoxymethode (Sequenase: United States Biochemical Inc.) isoliert und sequenziert. Die Länge des cDNA-lnserts in AL28-8 betrug 1,8kb. Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte einen großen offenen Leserahmen in Phase mit dem ß-Galactosidgen.The AL2β-8 insert in E. coli Y1089 was isolated as follows: The phage DNA was prepared by the standard method and the DNA was digested with Eco RI, then the cDNA excised from the phage DNA was purified by the dideoxy method (Sequenase: United States Biochemical Inc.) isolated and sequenced. The length of the cDNA insert in AL28-8 was 1.8kb. Nucleotide sequence analysis showed a large open reading frame in phase with the β-galactoside gene.

Zum Screenen von Clonen, die größere cDNA-lnserts enthalten, wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert mit L929-Zellenstämmiger poly(A)*RNA und in den Vektor CDM 3 cloniert nach dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd.84, S.8573,1987) und Seed (Nature, Bd.329, S. 840-842,1987).For the screening of clones containing larger cDNA inserts, double-stranded cDNA was synthesized with L929 cell-derived poly (A) * RNA and cloned into the vector CDM 3 according to the method of Aruffo and Seed (Proc Natl Acad. USA, Vol. 84, p.8573, 1987) and Seed (Nature, Vol.329, pp. 840-842, 1987).

Die rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm MC1061/p3 eingeführt (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, liehe oben), und die Clone der cDNA wurden mittels AL28-8-stämmiger ("P-markierter)-cDNA-Sonde unter strongen Bedingungen für DNA-DNA-Hybridisierung gescreent (Kashima u.a., Nature, Vol.313, S.402-404,1985), und ein Clon pIRF-L wurde zur weiteren Untersuchung selektioniert.The recombinant plasmids were introduced into the E. coli strain MC1061 / p3 (according to the method of Aruffo and Seed, supra), and the clones of the cDNA were digested using AL28-8-derived ("P-labeled") cDNA probe strict conditions for DNA-DNA hybridization were screened (Kashima et al., Nature, Vol. 313, pp. 402-404, 1985), and a clone pIRF-L was selected for further study.

Das gewünschte cDNA-lnsert von pIRF-L wurde durch Digestion mit Hindlll und Xbal gewonnen und durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Sequenz wird in Formel IV und in Fig.4 gezeigt.The desired cDNA insert of pIRF-L was obtained by digestion with HindIII and XbaI and sequenced by the methods described above. The sequence is shown in Formula IV and in FIG.

Es stellte sich heraus, daß die cDNA-Sequenz aus XL 28-8 eine identische Sequenz in der überlappenden Region enthielt, mit der Ausnahme, daß ein Α-Rest zwischen den Nucleotiden 1773 und ISI fehlte.It was found that the XL 28-8 cDNA sequence contained an identical sequence in the overlapping region, except that a Α residue was missing between nucleotides 1773 and ISI.

Die 5'- und 3'-Termini der AL28-8-stämmigen cDNA sind durch Pfeile in Fig.4 gekennzeichnet. Die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die möglicherweise die mRNA-lnstabilität übertragen, sind eingerahmt.The 5 'and 3' termini of the AL28-8-derived cDNA are indicated by arrows in FIG. The sequences ATTTATTTA and ATTTA, possibly conferring mRNA instability, are boxed.

Wie aus Fig.4 A ersichtlich wird, war die cDNA der Maus-cDNA, die von pIRF-L abgeleitet war, 198 bp lang und damit 20 bp länger als die von \L28-8-cDNA in den 5'- bzw. 3'-Regioneii.As can be seen from Fig. 4A, the cDNA of the mouse cDNA derived from pIRF-L was 198 bp long and thus 20 bp longer than that of \ L28-8 cDNA in the 5 'and 3, respectively '-Regioneii.

Die Analyse der Genom-DNA-Sequenz, die die Promotorregion dieses Gens enthält, zeigt, daß die cDNA von pIRF-L etwa 30bp von der größeren CAP-Stelle fehlt, siehe unten und Formel V und Fig. 7.Analysis of the genomic DNA sequence containing the promoter region of this gene shows that the pIRF-L cDNA lacks about 30bp from the larger CAP site, see below and Formula V and Figure 7.

Die unmittelbare „upstreanV'-Sequenz des ersten ATG-Codons, GGACCATGC, paßt gut in die Kozaksche Consensus-Sequenz GCC§CCATGG für die Translationsinitationsstelle.The immediate upgrace sequence of the first ATG codon, GGACCATGC, fits well into the Kozak consensus sequence GCC§CCATGG for the translation initiation site.

Eine ATG-Sequenz im Rahmen wurde in der „upstreanV'-Sequenz von der oben erwähnten ATG-Sequenz aus nicht gefunden, was bestätigt, daß dies tatsächlich das Initationscodon für die IRF-l-mRNA ist.An ATG sequence in the frame was not found in the "upstate V" sequence from the ATG sequence mentioned above, confirming that this is indeed the initiation codon for the IRF-1 mRNA.

Wie bereits erwähnt, wurde in der Nucleotidsequenz keine Differenz zwischen den cDNAs von XL28-8 und pIRF-L innerhalb der überlappenden Regionen gefunden, mit Ausnahme eines Nucleotide in der S'-nichtcodierenden Region.As already mentioned, no difference was found in the nucleotide sequence between the cDNAs of XL28-8 and pIRF-L within the overlapping regions, except for one nucleotide in the S 'noncoding region.

Die Maus-IRF-I bestand damit aus 329 Aminosäuren mit einer berechneten relativen Molekülmasse von 37,3KD. Kanonische N-Glycosylierungsstellen erscheinen nicht in der Sequenz.The mouse IRF-I thus consisted of 329 amino acids with a calculated molecular weight of 37.3KD. Canonical N-glycosylation sites do not appear in the sequence.

Zu anderen bekannten Proteinen wurde bei Recherchen in Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,Other known proteins have been found in searches in Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,

D. C.) und bei erst kürzlich veröffentlichten Sequenzen keine signifikante Homologie nachgewiesen.D. C.) and in recently published sequences no significant homology detected.

Die Hydropathieanalyse nach Kyte und Doolittle, 1982, zeigt, daß das Protein als Ganzes hoch hydrophil ist (Fig.4B).The hydropathy analysis according to Kyte and Doolittle, 1982, shows that the protein as a whole is highly hydrophilic (FIG. 4B).

Die Untersuchung der abgeleiteten Primärsequenz des Maus-IRF-I zeigt die folgenden Merkmale:Examination of the deduced primary sequence of the mouse IRF-I reveals the following features:

Die endständige Aminohälfte, zur Aminosäure 140 verlängert, ist reich an Lysin (Lys) und Arginin (Arg). Tatsächlich sind 31 dor 39 Lys- und Arg-Reste in dieser Region lokalisiert. Im untoren Teil von Fig.4B ist im Diagramm eine Zusammenfassung der Lokalisierung der basischen Aminosäuren (Arg, Lys) (nach obon gerichtete Säulen) und der sauren Aminosäuren (Asp, GIu) (nach unten gerchtete Säulen) dargestellt.The terminal amino moiety, extended to amino acid 140, is rich in lysine (Lys) and arginine (Arg). In fact, 31 dor 39 Lys and Arg residues are located in this region. In the untorn part of Fig. 4B, there is shown in the diagram a summary of the localization of the basic amino acids (Arg, Lys) (after obove-directed columns) and the acidic amino acids (Asp, Glu) (down-oriented columns).

Wie in Fig.4B gezeigt, weist diese Region eine starke Hydrophilie auf und wird als die Region angesehen, die hauptsächlich für die IRF-I-Bindung an die spezifischen DNA-Sequenzen verantwortlich ist.As shown in Fig. 4B, this region has a strong hydrophilicity and is considered to be the region mainly responsible for IRF-I binding to the specific DNA sequences.

In diesem Zusammenhang waren die für viele DNA-bindenden Proteine charakteristischen Motive wie Zinkfinger und Helix/ Helix-Motive (Pabo und Sauer, 1984, Evans und Hollenberg, 1988) in dem IRF-I-Protein nicht nachweisbar.In this context, motifs characteristic of many DNA-binding proteins, such as zinc finger and helix / helix motifs (Pabo and Sauer, 1984, Evans and Hollenberg, 1988) were undetectable in the IRF-I protein.

Im Gegensatz dazu zeigt der Rest des Moleküls (d.h. die endständige Carboxylhälfte einen relativen Überfluß an Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (GIu), Serin (Ser) und Threonin (Thr). Von 189 Aminosäuren (von Aminosäure 140 bisIn contrast, the remainder of the molecule (i.e., the terminal carboxyl half shows a relative abundance of aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), serine (Ser), and threonine (Thr).) Of 189 amino acids (from amino acids 140 to

329) sind 33 (17%) saure Aminosäuren und 36 (19%) sind Ser und Thr. Beachtenswert ist, daß ein Cluster von 5 aufeinanderfolgenden sauren Aminosäuren in den Aminosäuren 227 bis 231 gefunden wurde. Ser und Thr scheinon viele Cluster zu bilden (Aminosäureregion bei 153-156,190-192, 206-208, 220-222; die hier als die S-T-Regionen bezeichnet werden). Die S-T-Regionen werden durch kleine offene Rechtecke in der unteren Tafel von Fig.4 B dargestellt.329) are 33 (17%) acidic amino acids and 36 (19%) are Ser and Thr. Notably, a cluster of 5 consecutive acidic amino acids was found in amino acids 227 to 231. Ser and Thr seem to form many clusters (amino acid region at 153-156, 190-192, 206-208, 220-222, which are referred to herein as the S-T regions). The S-T regions are represented by small open rectangles in the lower panel of Fig. 4B.

Struktur der Human-IRF-I codierenden cDNAStructure of human IRF-I coding cDNA

Nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise für Maus-IRF-I wurde Human-IRF-l-cDNA cloniert undAfter the mouse IRF-I procedure described above, human IRF-1 cDNA was cloned and

sequenziert. 'sequenced. '

Eine Human-cDNA-Bibliothek wurde durch Synthetisierung von cDNA mittels poly(A)*RNA aus einer Human-T-Zellinie Jurkat hergestellt. Die doppelsträngige cDNA-Syntheεο und anschließende Clonierung in den Plasmidvektor CDM8 wurde entsprechend dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc.Natl. Acad.Sci., USA, Bd.84, S.8573-8577,1987) und Seed (Nature, Bd. 329, S. 840-842,1987) durchgeführt.A human cDNA library was prepared by synthesizing cDNA using poly (A) * RNA from a human T cell line Jurkat. The double-stranded cDNA synthesis and subsequent cloning into the plasmid vector CDM8 was performed according to the method of Aruffo and Seed (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 84, p.8573-8577, 1987) and Seed (Nature, Vol 329, pp. 840-842, 1987).

Die rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm MC 1061/p 3 mittels dos Verfahrens von Aruffo und Seed (siehe oben) eingeführt.The recombinant plasmids were introduced into the E. coli strain MC 1061 / p 3 by the method of Aruffo and Seed (see above).

Die Clone, die mit Maus-IRF-l-cDNA kreuzhybridisieren, wurden zum Screenen mit \L 2G-8-cDNA ("P-markiert) als Sonde unter wenig strengen Bedingungen für die DNA-DNA-Hybridisierung verwendet. Die angewandten Bedingungen waren genau die gleichen wie bei Kashima u.a. (Nature, Bd.313, S.402-404,1985) beschrieben.The clones that cross-hybridize with mouse IRF-1 cDNA were used to screen \ "L" 2G-8 cDNA ( \ "P-labeled) as a probe under less stringent conditions for DNA-DNA hybridization exactly the same as in Kashima et al. (Nature, Vol.313, pp. 402-404, 1985).

Aus den positiven Clonen wurde Clon pHIRF31, der das längste cDNA-lnsert enthielt, selektioniert.From the positive clones, clone pHIRF31 containing the longest cDNA insert was selected.

Die gewünschte cDNA-Soquenz von Clon pHIRF31 wurde durch Digestion der Plasmid-DNA durch Xhol isoliert und danach durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Struktur des Human-IRF-I-Gens wird in Formel Il und Fig.8 gezeigt.The desired cDNA sequence of clone pHIRF31 was isolated by digestion of the plasmid DNA by Xhol and then sequenced by the methods described above. The structure of the human IRF-I gene is shown in formula II and FIG.

Die Sequenzen für das abgeleitete Maus- und Human-IRF-I sind zum Vergleich in Fig. 5 untereinander dargestellt.The sequences for the deduced mouse and human IRF-I are shown for comparison in Fig. 5 with each other.

Die Analyse der Human-DNA zeigte, daß diese IRF-I um vier Aminosäuren kürzer ist als die iviaus-IRF-l.The analysis of human DNA showed that this IRF-I is four amino acids shorter than the iviaus-IRF-1.

Die starke Erhaltung der Aminosäuresequenzen läßt sich zwischen den beiden IRF-I-Molekülen erkennen. Insbesondere 133 der 140 Aminosäuren (95%) der Aminoendhälften können als gleich angesehen werden.The strong conservation of amino acid sequences can be seen between the two IRF-I molecules. In particular, 133 of the 140 amino acids (95%) of the amino end moieties can be considered equal.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die obigen Beobachtungen zeigen, daß IRF-I eine neue Klasse von DNA-bindendem Protein ist.In summary, the above observations indicate that IRF-I is a new class of DNA-binding protein.

Es sei auch darauf hingewiesen, daß die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die in vielen Cytokin- und Protoonkogen-mRNAs gefunden werden, in der3'-nichttranslatierten Region der Maus-IRF-l-cDNA vorhanden sind und daß auch die Sequenz ATTTA in der entsprechenden Region der Human-IRF-l-cDNA gefunden wird. Von diesen Sequenzen nimmt man an, daß sie in der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression eine Rolle spielen, indem sie der mRNA Instabilität übertragen (Shaw und Kamen, 1986; Caput u.a., 1986).It should also be noted that the ATTTATTTA and ATTTA sequences found in many cytokine and proto-oncogene mRNAs are present in the 3 'untranslated region of the mouse IRF-1 cDNA and that the ATTTA sequence is also present in the corresponding Region of the human IRF-1 cDNA is found. These sequences are believed to play a role in the post-transcriptional regulation of gene expression by conferring instability on mRNA (Shaw and Kamen, 1986, Caput et al., 1986).

Das Plasmid plRF-L wurde in E.coli MC 1061/p3 transferiert, das als E.coli MC106/p3 (plRF-L) am Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2005 hinterlegt wurde.The plasmid plRF-L was transferred to E. coli MC 1061 / p3, identified as E. coli MC106 / p3 (plRF-L) at the Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1 - Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, according to the terms of the Budapest Treaty on August 19, 1988 under No. Ferm BP-2005 deposited.

Das Plasmid plRF31 wurde in gleicherweise in E.coli MC1061/p3 transfektiert, das als E.coli MC106/p3 (plRF,-31) am FRI entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2006 hinterlegt wurde.The plasmid plRF31 was similarly transfected into E. coli MC1061 / p3 deposited as E. coli MC106 / p3 (plRF, -31) on the FRI according to the terms of the Budapest Treaty on August 19, 1988 under No. Ferm BP-2006 has been.

Regulation des IRF-GensRegulation of the IRF gene

1. Expression der IRF-l-mRNA1. Expression of IRF-1 mRNA

In Anbetracht der Tatsache, daß IRF-I Affinitäten zu Regulationssequen?en von anderen Genen als dem IFN-ß-Gen beweist und somiran der Regulation einer Reihe von Genen in verschiedenen Zelltypen beteiligt ist, wurde die Expression der IRF-l-mRNA in Mauszellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen stammten, mit Maus-cDNA als Sonde untersucht. Zur Herstellung dieser Sonde wurde M13 mp 10 Phagen-DNA (siehe unten), die den codierenden Strang von IRF-I-Gen-Pstl-Fragment enthielt, als Matrize zur Synthetisierung der ³²P-markierten „anti-sense" DNA verwendet. Das Produkt wurde durch EcoRI digeriert, und die Sonden-DNA wurde, wie bei Fujitau.a, (1985) beschrieben, isoliert.In view of the fact that IRF-I affords affinities for regulatory sequences of genes other than the IFN-β gene and is involved in the regulation of a number of genes in different cell types, expression of the IRF-1 mRNA in mouse cells , which were derived from various tissues and organs, examined with mouse cDNA as a probe. To prepare this probe, M13mp 10 phage DNA (see below) containing the coding strand of IRF-I gene PstI fragment was used as a template to synthesize the ³² P-labeled "anti-sense" DNA Product was digested by EcoRI and the probe DNA was isolated as described in Fujitau.a, (1985).

Die gesamte RNA wurde nach dem bewährten Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, isoliert.Total RNA was isolated by the well-established method of Aruffo and Seed, 1987.

Die Blot-Analyse wurde dann im wesentlichen wie bei Thomas (1980) beschrieben durchgeführt, der Röntgenfilm wurde 3 Tage belichtet, und die Ergebnisse sind in Fig. 6A gezeigt. Die verschiedenen Bahnen stellen die Ergebnisse der Durchgänge dar, bei denen Ganzzell-RNA aus den folgenden Geweben verwendet wurde:The blot analysis was then performed essentially as described by Thomas (1980), the X-ray film was exposed for 3 days, and the results are shown in Fig. 6A. The different lanes represent the results of the runs using whole cell RNA from the following tissues:

Bahn 1 HirnLane 1 brain

Bahn 2 HerzTrain 2 heart

Bahn 3 LeberLane 3 liver

Bahn 4 LungeLane 4 lungs

Bahn 5 Milz (nicht stimuliert)Lane 5 spleen (not stimulated)

Bahn 6 ThymusTrack 6 thymus

Bahn 7 NiereLane 7 kidney

Bahn 8 MuskelLane 8 muscle

Bahn 9 DarmLane 9 intestine

Bahn 10 Milz (nicht stimuliert)Lane 10 spleen (not stimulated)

Bahn 11 ConA-stimulierte MilzLane 11 ConA-stimulated spleen

In den Durchgängen für jode Bahn wurdon 5pg der Ganzzell-RNA verwendet, mit Ausnahme von Bahn 8, boi der nur 1,2Mg RNA verwendet wurden.5pg of whole cell RNA was used in the passageways for the iodine lane, except for lane 8, which used only 1.2 μg of RNA.

Aus Fig.6A ist ersichtlich, daß eine Bande, die etwa 2,0kb entsprach, in don moisten RNA-Probon durch diose Blot-Analyso nachgewiesen wurde, obwohl der mRNA-üxprossionswort niedrig zu sein schien. Es ist bemerkenswert, daß dur Expressionswert von mRNA In den Lymphozyton aus der Milz nach der Stimulierung durch ConA (Bahn 11) drastisch zunahm.From Figure 6A, it can be seen that a band corresponding to about 2.0 kb was detected in most RNA sample by the blot analysis, although the mRNA expression appeared to be low. It is noteworthy that the expression level of mRNA in the lymphocyte from the spleen increased dramatically after stimulation by ConA (lane 11).

In einem weiteren Test wurden Maus-L929-Zellen durch NDV induziert wie im vorangegangenen boschriobon (Fujita u. a., 1985), und die Zytoplasma-RNA wurde nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, alle drei Stunden nach der Infoktir -xtrahiert.In another assay, mouse L929 cells were induced by NDV as in the previous boschriobon (Fujita et al., 1985), and the cytoplasmic RNA was extracted by the method of Aruffo and Seed, 1987, every three hours after the infoctir.

Sonden-DNAs wurden aus den folgenden verschiedenen Sequenzen hergestellt und durch die „multiprime"-Markierungsreaktion (Amersham) markiert, und zwarProbe DNAs were prepared from the following different sequences and labeled by the "multiprime" labeling reaction (Amersham)

(i) ein 1,8kb EcoRI-Fragment aus AL28-8 (spezifische Aktivität 2x IO'cpm/μο); (ii) ein 0,5kb BamHI-Bg 11l-Fragment aus einem Maus-IFN-ß-Genomclon (spezifische Aktivität 5x 10^ecpm/pg) und (iii) ein 2,0kb BamHI-Pvull-Fragment eines Clons, das ein Human-ß-Actinpsoudogon enthalt (spozifische Aktivität 5x 10⁸cpm/pg).(i) a 1.8kb EcoRI fragment from AL28-8 (specific activity 2x IO'cpm / μο); (ii) a 0.5kb BamHI-Bg 11I fragment from a mouse IFN-β genome clone (specific activity 5x10 ^e cpm / pg) and (iii) a 2.0kb BamHI-Pvull fragment from a clone containing a Human β-actin psoudogone (spo specific activity 5x 10 ⁸ cpm / pg).

Die Ergebnisse sind in Fig.6B dargestellt. Die Blot-Analyso wurde wie oben beschrieben durcligoiuhrt, wobei das Vorfahron von Thomas (1930) angewandt wurde.The results are shown in Fig. 6B. The blot analysis was done as described above, using the ancestor of Thomas (1930).

Jede Bahr erhielt 10pg Zytoplasma-RNA. Dor Röntgenfilm wurde 3 Stunden belichtet. Die densitomotrische Analyse zeigte, daß die IRF-l-n'DRNA9-12 Stunden nach der NDV-Infektion um das 25fache zunahm.Each Bahr received 10pg of cytoplasmic RNA. Dor Röntgenfilm was exposed for 3 hours. The densitomotrische analysis showed that the IRF-l-n'DRNA9-12 hours after the NDV infection increased by 25 times.

Obwohl die Zunahme an mRNA drastisch ist, ist es ein transientes Ereignis, es erreicht seinen Höhepunkt bei 9 bis 12 Stunden und gleicht sich 12 Stunden nach der Induktion aus. Die mRNA-Anraicherung geht der Anreicherung an IFN-ß-mRNA voraus; wie aus Fig. 6B ersichtlich ist, läßt sich die Induktion von IRF-l-mRNA beroits 3 Stunden nach der NDV-Infektion beobachten, während die IFN-ß-mRNA bei gleichen Blot-Bedingungen für beide RNAs erst 6 Stunden danach nachwoisbar ist.Although the increase in mRNA is dramatic, it is a transient event, peaking at 9 to 12 hours and leveling out 12 hours after induction. The mRNA enrichment precedes the enrichment of IFN-ß mRNA; As can be seen from FIG. 6B, the induction of IRF-1 mRNA can be observed three hours after the NDV infection, while the IFN-β mRNA can be nachwoisbar for the same blot conditions for both RNAs until six hours later.

DerlRF-l-PromotorDerlRF-l promoter

Wie im vorangogangenen demonstriert wurde, wird das IRF-I-Gon transkriptionell durch verschiedene Agenzien wie Viren und Mitogene reguliert.As demonstrated in the preceding, the IRF-I gon is transcriptionally regulated by various agents, such as viruses and mitogens.

Die Souther-Blot-Analyse der Chromosomen-DNA zeigte, daß das IRF-I-Gen gespleißt werden kann und nicht in der Maus „multimembered" ist.Souther blot analysis of chromosomal DNA showed that the IRF-I gene can be spliced and not "multimembered" in the mouse.

Eine λ-Phagenbibliothek, die Baby-Maus-DNA enthielt, wurde nach den Clonen gescreent, die die IRF-I-Promotorsequenz enthalten, wobei die gleiche λ L28-8stämmige cDNA-Sonde wie oben verwendet wurde. Es wurdon vier positive Clone identifiziert, von denen bei allen die gleiche Genom-DNA festgestellt wurde und eine davon für die weitere Analyse verwendet wurde (Xg 14-2). Ein Pstl-Fragment wurde in die Pst-I-Stelle von pUC 19 subcloniert, um p19IRFP zu konstruieren.A λ phage library containing baby mouse DNA was screened for the clones containing the IRF-I promoter sequence, using the same λ L28- 8 strain cDNA probe as above. Four positive clones were identified, all of which detected the same genomic DNA and one was used for further analysis (Xg 14-2). A PstI fragment was subcloned into the Pst I site of pUC 19 to construct p19IRFP.

Die gleiche DNA wurde danach in die Pstl-Stolle von M13 mp 10 und M 13mp11 cloniert, die zur Erzeugung von DNA für die Sequenzanalyse verwendet wurden.The same DNA was then cloned into the PstI sites of M13 mp10 and M13mp11, which were used to generate DNA for sequence analysis.

Die Nucleotidsequenzanalyse des Pstl-Fragmonts aus den obengenannten Clonen wurde wie bereits beschrieben durchgeführt.Nucleotide sequence analysis of the PstI fragment from the above clones was performed as previously described.

Große und kleine CAP-Stellen wurden durch Sl-Kartierungsanalyse identifiziert.Large and small CAP sites were identified by Sl-mapping analysis.

Die bestimmte Sequenz wird in Fig.7A gezeigt. Wie daraus ersichtlich ist, paßt die „downstream"-Sequenz der DNA ausgezeichnet zu der von plRF-L abgeleiteten cDN A.The particular sequence is shown in Fig. 7A. As can be seen, the "downstream" sequence of the DNA excellently matches the cDN A derived from plRF-L.

Die S1 -Nucleaseanalyse zeigt das Vorhandensein von zwei CAP-Stellen für die IRF-l-mRNA, in der sich die größere Stelle etwa 20 Nucleotide „downstream" von der kleineren Stelle befindet. Typische TATA-Boxsequenzen sind in der „upstreanV'-Region des Gens nicht vorhanden. In Anbetracht der ungewöhnlichen Fülle an CpG-Sequenzen stellt diese Region wahrscheinlich eine „HTF-Insel" dar (Bird, 1986).The S1 nuclease analysis shows the presence of two CAP sites for the IRF-1 mRNA in which the larger site is located about 20 nucleotides downstream of the smaller site Typical TATA box sequences are in the upstate V region In view of the unusual abundance of CpG sequences, this region probably represents an "HTF island" (Bird, 1986).

Die Promotorregion enthält zwei GC-Boxen und eine CAAT-Box (siehe Fig. 7 a); die ersteren Boxen müßten SpI binden (Kadogan u.a., 1986) und die letzteren CP-1 oder CP-2(Chodosh u.a., 1988).The promoter region contains two GC boxes and a CAAT box (see Figure 7 a); the former boxes would have to bind SpI (Kadogan et al., 1986) and the latter CP-1 or CP-2 (Chodosh et al., 1988).

Das die Promotorsequenzen enthaltende Pstl-Fragment wurde dann auf folgende Art und Weise auf seine Reaktivität als Antwort auf extrazelluläre Signale, z. B. Virusinduzierbarkeit, getestet.The PstI fragment containing the promoter sequences was then assayed for reactivity in response to extracellular signals, e.g. Virus inducibility.

Ein chimäres Gen wurde konstruiert, in dem ein Reportergen, unc¹ zwar ein bakterielles Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)-Gen „downstream" vom Pstl-Segment anstieß. Dies geschah durch Ausschneiden eines Pstl-Fragmentes aus P19IRFP (siehe oben) durch BamHI und Hindlll und Clonierung des erhaltenen Fragmentes in das Bglll-Hindlll-Rückgratfragment von pA,_ocat₂ (Rosenthal u.a., 1983), um plRFcat herzustellen.A chimeric gene was constructed in which a reporter gene, unc ¹ namely a bacterial chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene "downstream" nudged by the PstI segment. This was done by excising a PstI fragment from P19IRFP (see above) by BamHI and HindIII and cloning the resulting fragment into the Bglll-HindIII backbone fragment of pA, _o cat ₂ (Rosenthal et al., 1983) to produce plRFcat.

Verschiedene weitere Konstrukte wurden folgendermaßen hergestellt:Various other constructs were prepared as follows:

plRFAcat wurde durch Digerieren des ρ 19IRFP-stämmigen BamHI-Hindlll-Fragmentes mit Haelll hergestellt, dessen einzelne Erkennungsstelle bei -30 bis -35 von der größeren CAP-Stelle (Fig.5 A) liegt. Das entstandene Haelll-Hindlll-Fragment wurde mit BGIII-Hindlll-Rückgratfragment von pA,_ocat₂ und der folgenden synthetischen DNA ligiert:plRFAcat was prepared by digesting the ρ19IRFP-derived BamHI-HindIII fragment with Haelll, the single recognition site of which is located at -30 to -35 from the larger CAP site (Fig.5A). The resulting Haelll HindIII fragment was ligated to BGIII HindIII backbone fragment of pA, _o cat ₂ and the following synthetic DNA:

5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3' 3¹GATCTAAaGAAGCGC 5'5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3 '3 ¹ GATCTAAaGAAGCGC 5'

Damit enthielten sowohl plRFcat als auch plRFAcat Sequenzen bis zu -320 bzw, -48 von der größeren CAP-Stolle aus.Thus, both plRFcat and plRFAcat contained sequences up to -320 and -48 from the larger CAP cleat.

p-125cat enthält die Promotorsequenz des Human-IFN-ß-Gens wie bei Fujita u.a., 1987, beschrieben.p-125cat contains the promoter sequence of the human IFN-β gene as described in Fujita et al., 1987.

pSV2cat ist in Gorman u.a., Science, Bd.221, S. 551-553 beschrieben.pSV2cat is described in Gorman et al., Science, Vol.221, pp. 551-553.

Als Referenzgen wurde pSRVgpt verwendet (siehe Gorman u.a., s.o.).As a reference gene, pSRVgpt was used (see Gorman et al., Supra).

Die unterschiedlichen Gene wurden mittels der Calcium-Phosphat-Methode (Fujita u.a., 1985) in Maus-L929-Zellen transferiert.The different genes were transferred to mouse L929 cells by the calcium phosphate method (Fujita et al., 1985).

5 χ 10^e Zellen wurden mit 7,5pg des das CAT-Reportergen und 2,5pg pRSVgpt enthaltenden Testplamids transferiert. Die Zellen wurden durch NDV induziert oder „mock"-induziert und anschließend dem Enzym-Test wie bei Fujita u.a., 1985, beschrieben unterzogen.5 × 10 ^e cells were transferred with 7.5 μg of the test reporter gene containing the CAT reporter gene and 2.5 μg pRSVgpt. The cells were induced or "mocked" by NDV and then subjected to the enzyme assay as described by Fujita et al., 1985.

Zur Berechnung der relativen CAT-Aktivität wurde die CAT-Aktivität aus den „mock"-induzierten Zellen, die mit pSV2cat transferiert waren, als 100% angenommen. Jede CAT-Aktivität wurde durch Ecogpt der entsprechenden Proben normalisiert (Mulligan und Berg, Proc.Natl. Acad.Sci.USA, Bd.78, S.2072-2076). Die Proben, in denen CAT unter dem Hintergrundwert lag, wurden mit b. b. (below background level) gekennzeichnet.To calculate relative CAT activity, CAT activity from the mock-induced cells transferred to pSV2cat was assumed to be 100%. Each CAT activity was normalized by Ecogpt of the respective samples (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad.Sci.USA, Vol.78, p.2072-2076). The samples in which CAT was below background were labeled bb (below background level).

Die Ergebnisse sind in Fig.7 B dargestellt.The results are shown in Fig. 7B.

Es ist erkennbar, daß die Transfektion von plRFcat in Maus-L929 die Expression der CAT-Aktivität mit niedrigem WertIt can be seen that transfection of plRFcat into mouse L929 low expression CAT activity

verursachte. Der CAT-Expressionswort wurde erhöht, wenn die transfoktiorton Zollon durch NDV stimuliert wurden. Die Dolotion der 300-bp-„upstnam"-Soquonz dos IRF-I-Gons (plRFAcat) hob faktisch sowohl die konstitutive als auch die induzierto Expression dos CAT-Gens auf. Dios zoigt, daß dio Promotorsoquonz innorhalb dor 300-bp-„upstroam"-Rogion Mögt und virusinduzierbar ist.caused. The CAT expression word was increased when the transfoktiorton Zollon were stimulated by NDV. The 300-bp "upstamp" soquone IRF-I-Gons (plRFAcat) dollopion effectively abrogated both constitutive and induced expression of the CAT gene, which predicts that the promoter oquone would be within 300-bp- " upstroam "-Rogion like and is virus-inducible.

Konstruktion von ExpresslonsplasmldonConstruction of expresslonsplasmldon

1. Phagon-DNA von Clon M.28-8 wurdo durch EcoRI digeriert, und das Insort wurdo gowonnon. Dio EcoRI-Stollon clor cD^Awurden durrh T4-DNA-Polymoraso goglnttot und anschlioßond mit synthetischen Adaptor-DNAs, dio dio1. Phong DNA from clone M. 28-8 was digested with Eco RI and the insort was gowonnon. Dio EcoRI-Stollon clor cD ^ A durrh T4 DNA polymoraso was goglnttot and contected with synthetic adapter DNAs, dio dio

Sequenz pGATCCATTGTGCTGG und pCCAGCACAATG besaßen, ligiort, s. Aruffo und Soed 1987.Sequence pGATCCATTGTGCTGG and pCCAGCACAATG possessed, ligiort, s. Aruffo and Soed 1987. Nach Entfernung der synthetischen DNAs durch gradiento Zontrifugierung mit 5-20% Kaliumacotat (Aruffo und Sood, 1987)After removal of the synthetic DNAs by gradiento zontrifugation with 5-20% potassium acotate (Aruffo and Sood, 1987)

wurde die IRF-l-cDNA mit den an boidon Enden geknüpften Adaptor-DNAs mit BstXI-goschnittonor CDMe-Voktor-DNA liyiort(Seed, B, Nature, Bd.329,S.840-842,1987). üio Plasmido plRF-S und plRF-A, dio die IRF-l-cDNA in der „sonso"- und „antisonso"·For example, the IRF-1 cDNA with the adapter DNAs attached to boidon ends was ligated with BstXI-blotted CDMe-Voktor DNA (Seed, B, Nature, Vol.329, pp. 840-842, 1987). Plasmid plRF-S and plRF-A, the IRF-1 cDNA in the "sonso" and "antisonso"

Ausrichtung in bezug auf den CMV-Promotor enthielten, wurden isoliert.Orientation with respect to the CMV promoter were isolated. Jode Plasmid-DNA wurdo ontwodor mit p-55cat odor p55CIB (Fujita u.a., 1987) in L929-Zollon co-transfoktiort und dor CAT·Jode plasmid DNA was co-transfected with p-55cat or p55CIB (Fujita et al., 1987) in L929-inchone and the CAT · Expressionswert wurde bestimmt.Expression value was determined. Die Ergebnisse sind in Tabollo 1 unton dargostollt:The results are shown in Tabollo 1 unton: Tabelle 1 «Table 1 "

Transfektierte PlasmideTransfected plasmids Induktion durch NDVInduction by NDV CAT-Aktivität (% Umwandlung)CAT activity (% conversion) plRF-S p-55catplRF-S p-55cat -- <1%<1% plRF-S P-55CIBplRF-S P-55CIB —- 50%50% Experiment 1Experiment 1 plRF-A p-55catplRF-A p-55cat -- < 1 %<1% piRF-ApIRF-A -- <1%<1% plRF-S P-55CIBplRF-S P-55CIB —- 1,7%1.7% plRF-S P-55CIBplRF-S P-55CIB ++ 3,6%3.6% Experiment 2Experiment 2 plRF-A P-55CIBplRF-A P-55CIB -- <0,1%<0.1% >> plRF-A p-boCIBplRF-A p-boCIB ++ <0,1%<0.1%

Die DNA-Transfektionsoffizienz hängt vom Zustand der Rezipientenzellen (in diesem Fall Maus-L929-Zellon) ab. Die Effizienz warThe DNA transfection efficiency depends on the condition of the recipient cells (in this case mouse L929 cell). The efficiency was

in Experiment 2 viel niedriger als in Experiment 1, der CAT-Expressionswert ist daher vergleichsweise niedriger als inin Experiment 2 much lower than in Experiment 1, the CAT expression value is therefore comparatively lower than in

Experiment 2.Experiment 2. Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die signifikante CAT-Aktivität nur in durch p-55CIB und p-IRF-S transferiertenAs can be seen from the above table, the significant CAT activity was only in p-55CIB and p-IRF-S transferred Zellen nachweisbar. Sie zeigen, daß dor IRF-I an die wiederholten (8mal) AAGTGA-Sequenzen, die „upstream" des CAT-Gens inCells detectable. They show that the IRF-I binds to the repeated (8 times) AAGTGA sequences upstream of the CAT gene in P-55CIB vorhanden sind, bindet ι I daher dio Transkription des distalen CAT-Gens fördert.P-55CIB are present, ι I therefore binds dio transcription of the distal CAT gene promotes. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, iß der CAT-Expressionswert durch Infektion der transferierten Zellen mit NDV (Tabelle 1)The results further show that the CAT expression value is due to infection of the transferred cells with NDV (Table 1).

erhöht wird (um mehr als das doppelte), was zeigt, daß die Kontrolle der Genexpression durch unterschiedliche Stimuli wiebeispielsweise Viren möglich ist.is increased (more than double), indicating that the control of gene expression by different stimuli such as viruses is possible.

2. Ein Expessionsplasmid für die Produktion eines Proteins, das aus IRF-I-DNA bindender Domäne und2. An expession plasmid for the production of a protein consisting of IRF-I DNA binding domain and

Transkriptionsaktivierungsdomäne von Hofe-GAL4 bestand, wurde folgendermaßen konstruiert:Transcriptional activation domain of Hof-GAL4 was constructed as follows: Das Plasmid plRF-S wurde durch Hindill und Pstl digeriert, und das cDNA-lnsert wurde isoliert. Dio cDNA wurde durch DralllThe plasmid plRF-S was digested by HindIII and PstI and the cDNA insert was isolated. Dio cDNA was synthesized by Dralll

digeriert, und das Hindlll-Dralll-Fragm nt (etwa 550bp) wurdo gewonnen und als Fragment A bezeichnet.and the HindIII-twisted fragment (about 550bp) was recovered and designated fragment A.

Der Expressionsvektor CDM 8 wurde durch Hindill und Xbal digeriert, und dio Rückgrat-DNA wurde isoliert und als Fragment BThe expression vector CDM 8 was digested by HindIII and XbaI, and the backbone DNA was isolated and fragmented as B

bezeichnet.designated.

Die für die Hefe-GAL4-Transkriptionsaktiviorungsdomäne codierende DNA wurde aus Plasmid pRB968 folgendermaßen isoliertThe DNA encoding the yeast GAL4 transcriptional activation domain was isolated from plasmid pRB968 as follows

(Ma und Ptashne, 1987):(Ma and Ptashne, 1987):

Die pRB968-DNA wurde zuerst mit Hindill digeriert, und die Enden wurden durch T<1-DNA-Polymerase geglättet. SynthetischeThe pRB968 DNA was first digested with HindIII and the ends were blunted by T <1 DNA polymerase. synthetic Xba-I-Linker-DNA wurde zu dor DNA gegeben, und dio DNA wurdo dann durch Pvull und Xbal digeriert.Xba I linker DNA was added to the DNA and the DNA was then digested by Pvull and XbaI. Das entstandene ca. 600bρ lange Pvull-Xbal-DNA-Fragment wurde gewonnen und als Fragment C bezeichnet.The resulting approximately 600b p long Pvull-XbaI DNA fragment was recovered and designated as fragment C. Zusätzlich wurdo eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz hergestellt:In addition, a synthetic DNA having the following sequence was prepared:

(5'IGTGTCGTCCAGO') (3')GCACACAGCAGGTC(5')(5'IGTGTCGTCCAGO ') (3') GCACACAGCAGGTC (5 ')

und als Fragment D bezeichnet.and designated as fragment D.

Ein ^xpressionsvektor plRFGAL4 wurde durch Ligation der Fragmente A, B, C und D konstruiert. Als Kontrollplasmid wurde Plasmid plRFAGAL4 durch Ligation der Fragmente A, B₁C und oiner synthetischen DNA mit der folgenden Sequenz konstruiert:An expression vector plRFGAL4 was constructed by ligation of fragments A, B, C and D. As a control plasmid, plRFAGAL4 was constructed by ligation of fragments A, B ₁ C and a synthetic DNA having the following sequence:

(B'IGTGTCTGACAGO¹) (3')GCACACAGATGTC(5·)(B'IGTGTCTGACAGO ¹ ) (3 ') GCACACAGATGTC (5x)

Da ein Terminatortriplett, TGA, im Rahmen zwischen den IRF-I- und GAL4-Sequenzen in plRFAGAL4 vorhanden ist, müßle dem exprimierten Protein die GAL4-Aktivioiungsdomäno fehlen.Since a terminator triplet, TGA, is present in the frame between the IRF-I and GAL4 sequences in plRFAGAL4, the expressed protein must lack the GAL4 activation domain.

Um die funktionellen Eigenschaften des Plasmids zu testen, das für den chimören Transkriptionsfaktor codiert, wurden plRFGAL4 und plRFAGAL4 beide mit p-55CIB in L929-Zellen cotransfektiert, und die CAT-Expression wurde überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt:To test the functional properties of the plasmid encoding the chimeric transcription factor, plRFGAL4 and plRFAGAL4 were both cotransfected with p-55CIB into L929 cells and CAT expression was monitored. The results are shown in Table 2 below:

Tabelle 2Table 2

Transferiertes Plasmid CAT-Aktivität (% Umwandlung)Transferred plasmid CAT activity (% conversion)

plRF-S 2,0%plRF-S 2.0%

P-55CIBP-55CIB

plRF-A <0,2%plRF-A <0.2%

P-55CIBP-55CIB

plRFGAL 1,4%plRFGAL 1.4%

P-55CIBP-55CIB

plRFGAL4 <0,2%plRFGAL4 <0.2%

P-55CIBP-55CIB

Wirtszellen waren Maus-L929-Zellen. Die Zellen waren nicht durch NDV induziert.Host cells were mouse L929 cells. The cells were not induced by NDV.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Expression eines Zielgens (wie beispielsweise Gene, die für ein Interleukin, ein Interferon (α, β und γ), einen plasminogenen Aktivator, Erythropoietin, Granulozytkolonie-stimulierenden Faktor, Insulin, Human-Wachstumshormon oder Superoxiddismutase (oder Mutanten der Humangene) durch IRF-I erhöht werden kann.The results show that the expression of a target gene (such as genes encoding an interleukin, an interferon (α, β and γ), a plasminogen activator, erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor, insulin, human growth hormone or superoxide dismutase (or mutants the human) can be increased by IRF-I.

Solche Zielgene wie die oben erwähnten, wie Interferongene, z. B. IFN-a, IFN-ß, IFN-γ, IFN-omega und plasminogene Aktivatoren,Such target genes as those mentioned above, such as interferon genes, e.g. IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-omega and plasminogen activators,

z. B. t-PA, pro Urokinase oder Urokinase usw. können auch wirkungsvoller exprimiert werden, indem Promotoren eingeführt werden, die mit unterschiedlich langen Erkennungssequenzen für IRF-I, z. B. AAGTGA, verschmolzen sind.z. As t-PA, per urokinase or urokinase, etc. can also be expressed more effectively by promoters are introduced with different lengths of recognition sequences for IRF-I, z. B. AAGTGA, are fused.

Die Zielgene können beispielsweise in unterschiedliche Wirtszellen zusammen mit entweder intakten IRF-I- oder Chimären IRF-I-Genen eingeführt werden. Durch Verlängerung der IRF-I-Erkennungsstellen-DNA, z. B. durch Erhöhung der Anzahl der AAGTGA-Wiederholungen und des Expressionswertes des Transkriptionsfaktors, läßt sich ein hoher Expressionswert der Zielgene erreichen.For example, the target genes can be introduced into different host cells along with either intact IRF-I or chimeric IRF-I genes. By extension of the IRF-I recognition site DNA, z. B. by increasing the number of AAGTGA repeats and the expression value of the transcription factor, a high expression level of the target genes can be achieved.

Beispielsweise können die AAGTGA-Wiederholungssequenzen an einen geeigneten Promotor wie einen IFN-ß-Promotor oder einen frühen SV40-Virus-Promotor angrenzen. Ein Zielgen, z. B. ein t-PA-Ger. oder IFN-ß-Gen, kann „downstream" eines solchen Promotors verbunden werden; die Struktur eines derartig konstruierten Gens würde seinFor example, the AAGTGA repeat sequences may be adjacent to a suitable promoter such as an IFN-β promoter or an SV40 early virus promoter. A target gene, z. A t-PA device. or IFN-β gene, may be linked downstream of such a promoter, the structure of such a constructed gene would be

(AAGTGA)_x (Promotor) (Zielgen z.B. t-PA-Gen).(AAGTGA) _x (promoter) (target gene eg t-PA gene).

Ein derartiges.Gen könnte dann in CHO-Zellen, z.B. CHO DXBII-Zellen (dhfr-Stamm) eingeführt und in diesen verstärkt werden (Urlaub und Chasin, Proc.Natl., Acad.Sci., USA, Bd.77, S.421&-4220,1980).Such a gene could then be expressed in CHO cells, e.g. CHO DXBII cells (dhfr strain) are introduced and amplified (Urlaub and Chasin, Proc. Natl., Acad. Sci., USA, vol. 77, p.421 & 42201980).

Idealerweise wird, wie im vorangegangenen diskutiert wurde, eine Wirtszelle aus einer Zelle, die im wesentlichen keinen Wert einer endogenen IRF-I-Aktivität aufweist, gewählt. Das IRF-I-Gen, vorzugsweise entweder mit einem starken Promotor wie einem CMV-Promotor oder einem induzierbaren Promotor wie einem Metallothionein-Genpromotor, kann auf herkömmliche Art und Weise in die verschiedenen Wirtszellen eingeführt werden.Ideally, as discussed above, a host cell is selected from a cell that has substantially no value of endogenous IRF-I activity. The IRF-I gene, preferably either with a strong promoter such as a CMV promoter or an inducible promoter such as a metallothionein gene promoter, can be introduced into the various host cells in a conventional manner.

Das IRF-I-Gen kann co-eingeführt und zusammen mit dem Zielgen verstärkt werden. Auf alternative Waise können das IRF-I-Gen und das Zielgen getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.The IRF-I gene can be co-introduced and amplified together with the target gene. Alternatively, the IRF-I gene and the target gene can be introduced separately into the host cell.

In derartigen transferierten Zellen kann IRF-I entweder konnstitutiv (im Falle z. B. eines CMV-Promotors) oder induzierbar (im Fall z. B. des Metallothionein-Promotors wird durch zweiwertige Metalle wie Zink induziert) hergestellt werden. Der exprimierte IRF-I bindet an die AAGTGA-Wiederholungen und verstärkt das distale Zielgen, z. B. das t-PA-Gen oder das IFN-Gen.In such transferred cells, IRF-I can be produced either constitutively (in the case of, for example, a CMV promoter) or inducible (in the case of, for example, the metallothionein promoter is induced by divalent metals such as zinc). The expressed IRF-I binds to the AAGTGA repeats and enhances the distal target gene, e.g. The t-PA gene or the IFN gene.

Eine derartige Expression kann weiter durch ein Virus, z. B. NDV-Induktion, verstärkt werden, und wie aus Tabelle 1, Experiment 2, ersichtlich ist, erhöht diese Induktion die Aktivität des IRF-I.Such expression may be further affected by a virus, e.g. As NDV induction, and as can be seen from Table 1, Experiment 2, this induction increases the activity of IRF-I.

Maus-cDNA-Sequenz, die mit Maus-IRF-l-cDNA der Formel III kreuzhybridisiert Eine Maus-cDNA-Bibliothek wurde nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Die cDNA wurde durch das Standardverfahren synthetisiert. Dabei wurde Maus-L929-Zellen-stämmige mRNA verwendet, und die cDNA wurde durch das Standardverfahren in den Xgtll-Vektor inseriert. Die entstandene Xgtll-Bibliothek wurde dann zur Isolierung der cDNA-Clone gescreent, deren Insertc mit der oben beschriebenen Maus-IRF-l-cDNA folgendermaßen kreuzhybridisieren: Nitrocellulosefilter, die die Phagen-Plaque-DNAs enthalten, wurden in den folgenden Stufen inkubiert:Mouse cDNA Sequence Cross-Hybridized with Mouse IRF-1 cDNA of Formula III A mouse cDNA library was prepared according to the procedure described previously. The cDNA was synthesized by the standard method. In this case, mouse L929 cell-derived mRNA was used, and the cDNA was inserted into the Xgtll vector by the standard method. The resulting Xgtll library was then screened to isolate the cDNA clones whose inserts cross-hybridize with the mouse IRF-1 cDNA described above: Nitrocellulose filters containing the phage plaque DNAs were incubated in the following steps:

(1) in 3 χ SCC bei 65°C 30 Minuten lang und anschließend(1) in 3 χ SCC at 65 ° C for 30 minutes and then

(2) 60minütige Inkubation in 3 x SSC, das Denhartsche Lösung enthält (0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyiinylpyrrolidon 25), und anschließend(2) Incubate in 3x SSC containing Denhart's solution (0.2% bovine serum albumin, 0.2% Ficoll, 0.2% Polyiinyl pyrrolidone 25) for 60 minutes and then

(3) eine Vor-Hybridisierungsstufe, die aus der 12stündigen Inkuuaaon bei 65"C in einer Lösung, die 1M NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH 8,0,1OmM EDTA, 0,1 % SDS, 50\ig/m\ einzelsträngigeTräger-DNA (z.B. Lachssperma-DNA) und Denhartsche Lösung enthält, besteht und(3) a pre-hybridization step consisting of the 12-hour Inkuuaaon at 65 "C in a solution containing 1M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 0.1% SDS, 50 % contains single-stranded carrier DNA (eg salmon sperm DNA) and Denhart's solution, and

(4) die Inkubation der Stufe 3 wurde wiederholt, wobei ³²P-markierte Maus-IRF-l-cDNA als Sonde eingeführt wurde. Diese(4) the step 3 incubation was repeated by introducing ³² P-labeled mouse IRF-1 cDNA as a probe. These

cDNA-Sonde wurde als das von EcoRI geschnittene Insert aus λί-28-8 hergestellt und durch das Multiprime-Markierungssystem (siehe oben) translatiert. Die Inkubation wurde 12 Stunden lang bei 65⁰C durchgeführt.cDNA probe was prepared as the EcoRI cut insert from λί-28-8 and translated through the multiprime labeling system (see above). The incubation was carried out at 65 ^° C. for 12 hours.

Dann wurden die Filter gewaschen, kurz in 2 χ SCC-Lösung gespült und anschließend in 3 χ SCC-Lösung, die 0,1% SDS enthielt, 30 Minuten lang bei 65⁰C gewaschen. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt.The filters were then washed, rinsed briefly in 2 χ SCC solution and then washed in 3 χ SCC solution containing 0.1% SDS at 65 ^° C for 30 minutes. This procedure was repeated twice.

Einer der positiven Clone, der als PHH-45 bezeichnet wurde, wurde selektioniert und es zeigte sich, daß er cDNA enthielt, die nur einen Teil der Codiersequenz für einen IRF abdeckte.One of the positive clones, designated PHH-45, was selected and found to contain cDNA covering only part of the coding sequence for an IRF.

Das cDNA-lnsert in PHH-45 wurde deshalb isoliert und zum Screenen von Clonen verwendet, die größere Inserte enthielten, wieThe cDNA insert in PHH-45 was therefore isolated and used to screen clones containing larger inserts, such as

im vorangegangenen unter der Überschrift „Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA" für die Herstellung von plRF-L beschrieben wurde.described above under the heading "Structure of mouse IRF-I encoding cDNA" for the production of plRF-L.

Von den identifizierten positiven Clonen wurde der als plRF2-5 bezeichnete selektioniert und charakterisiert, wobei das im vorangegangenen für Maus-IRF-I beschriebene Verfahren angewandt wurde. Die komplette hybridisierende cDNA-Sequenz wird in Formel IVa gezeigt, und die Aminosäuresequenz des entsprechenden IRF-Proteins wird in Formel VIII dargestellt.Of the identified positive clones, the one designated as plRF2-5 was selected and characterized using the method described above for mouse IRF-I. The complete hybridizing cDNA sequence is shown in Formula IVa, and the amino acid sequence of the corresponding IRF protein is shown in Formula VIII.

Das Plasmid plRF2-5 wurde in E.coli MC 1061/p3 transferiert, das als E.coli am FRI entsprechend dem Budaposter Vertrag amThe plasmid plRF2-5 was transferred to E. coli MC 1061 / p3, which was used as E. coli at the FRI according to the Budapest Treaty on

22. November 1988 unter der Nr. FERM BP-2157 hinterlegt wurde.Filed November 22, 1988 under the number FERM BP-2157.

cDNA aus dem Hefegenom, die mit Human-IRF-l-cDNA-Sequenz hybridisiert Hefe-DNA wurde nach dem Standardverfahren hergestellt und mit EcoRI digeriert. 5μg der digerierten DNA wurden auf 0,8% Agarosegel gegeben und mittels Standardverfahren einer Elektrophorese und einem DNA-Biot-Test unterzogen.cDNA from the yeast genome hybridizing with human IRF-1 cDNA sequence Yeast DNA was prepared by the standard method and digested with EcoRI. 5 μg of the digested DNA was added to 0.8% agarose gel and subjected to electrophoresis and DNA biotestysis by standard methods.

Das geblottete Filter wurde bis auf folgende Ausnahme genau nach der Beschreibung im vorangegangenen Beispiel zur Isolierung von Maus-DNA, die mit Maus-IRF-I hybridisier*, behandelt:The blotted filter was treated exactly as described in the previous example for the isolation of murine DNA hybridizing with mouse IRF-I except for the following exception:

In Stufe (3) betrug die Inkubationstemperatur 55⁰C, und in Stufe (4) wurde die Inkubation ebenfalls bei 55°C ausgeführt, und die radioaktive Sonde war die aus pHIRF31 durch Digestion des Plasmids mit Xhol isolierte Human-IRF-l-cDNA, wobei diese Sonde wie im vorangegangenen Beispiel für Maus-IRF-I boschrieben markiert wurde. Das Filter wurde bei 55⁰C in 2 χ SSC gewaschen.In step (3) was the incubation temperature 55 ⁰ C, and in step (4) the incubation was also carried out at 55 ° C and the radioactive probe was from pHIRF31 isolated by digestion of the plasmid with Xho I human IRF-I cDNA , this probe being labeled as described in the previous example for mouse IRF-I. The filter was washed at 55 ^° C. in 2 × SSC.

Die positiven Clone wurden durch Autoradiographie identifiziert (siehe Fig. 10).The positive clones were identified by autoradiography (see FIG. 10).

UteraturangabenUteraturangaben

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten μι m ^eutisch aktiven Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Wirtszellen, die er'wndi durch einen Vektor transformiert sind, der gleichzeitig eine DNA-Soquenz enthält, die ein Gon für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein und ein Gen für ein Protein enthält, dos die Wirkung einer Interferon-Regulartorsequenz (IRF-I) hat, oder durch zwei Vektoren transformiert sind, wobei ein Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein codiert, und der andere Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Gen für ein Protein enthält, das die Wirkung einer Interferon-Rogulatorsequenz (IRF-1) enthält, wobei das Gen für das gewünschte Protein jeweils unter Kontrolle des IRF-1-Proteins ist.1. A method for producing a desired μι m ^ eutisch active protein, characterized by culturing host cells transformed er'wndi by a vector containing a DNA Soquenz simultaneously, a Gon for the desired pharmaceutically active protein and a Contains gene for a protein which has the effect of an interferon regulatory (IRF-I) sequence, or are transformed by two vectors, wherein one vector contains a DNA sequence encoding a gene for the desired pharmaceutically active protein, and the other Vector contains a DNA sequence containing a gene for a protein containing the action of an interferon-Rogulatorsequenz (IRF-1), wherein the gene for the desired protein is in each case under control of the IRF-1 protein.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle durch einen ersten Vektor transformiert wird, der das Gen enthält, das für das IRF-1-aktive Protein codiert, und durch einen zweiten Vektor, der ein Gen enthält, das für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein unter der Kontrolle des IRF-1-Proteins codiert, für das das erste Gen codiert.2. The method according to claim 1, characterized in that the host cell is transformed by a first vector which contains the gene coding for the IRF-1-active protein, and by a second vector containing a gene which is responsible for the desired pharmaceutically active protein encoded under the control of the IRF-1 protein encoded by the first gene.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle durch einen Vektor transformiert wird, der eine DNA-Sequenz enthält, die beide genannte Gene enthält.3. The method according to claim 1, characterized in that the host cell is transformed by a vector containing a DNA sequence containing both said genes.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Vektor oder einem der Vektoren das Gen, das das IRF-1-aktive Protein codiert, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines induziblen Promotors ist.4. The method according to claim 1, characterized in that in the vector or one of the vectors, the gene encoding the IRF-1-active protein is under control of a constitutive or an inducible promoter.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine IRF-1-Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen enthält.5. The method of claim 1 or 2, characterized in that the gene for the desired pharmaceutically active protein comprises an IRF-1 binding site containing a plurality of repeating AAGTGA sequences.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.A method according to any one of the preceding claims, characterized in that said DNA sequence coding for an IRF-1 active protein contains a sequence of the following formula or a degenerate variant thereof.

510 520 530 540 55^ AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT510 520 530 540 55 ^ AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT

860 870 880 890 .900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC860 870 880 890 .900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC

960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.A method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said DNA sequence coding for an IRF-1 active protein contains a sequence of the following formula or a degenerate variant thereof.

ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAGATG CCA ATG CGC TGG ATTA ATCC ATG AGC TGG ATTA ATCC ATCC ATCC ATA ATCC ATA CTG TG ATC AAT AAA GAA ATG ATC ATC ATC ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGC GCC ATC CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT CCTC CTC AGC AGC CTC TCT CGC TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCG GG TGG CAG CCG ACACAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine degenerierte Variante davon enthält.8. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said DNA sequence encoding an IRF-1-active protein contains a sequence of the following formula or a degenerate variant thereof.

10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG 10 · 20 30 40-ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG

50 60. 70 SO " 90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG50 60. 70 SO "90 ATAAATTCCAATACGAJACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG

100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCG'iCTCGGCACGGA"100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCG'iCTCGGCACGGA "

MQ 150 160 ' 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATCMQ 150 160 '170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC

230 240 250 2EO '-> 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC230 240 250 2EO '-> 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC

oso 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAA^GAAACAACGCCoso 290 300 310 ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAA ^ GAAACAACGCC

320 330 3'!0 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG320,330 3 '! 0 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG

37Ü 380 390 400 AAAGSAAAGAAACCAAAGACAGAÄAAÄGAAGAC^GAGTTAAGCAC.37Ü 380 390 400 AAAGSAAAGAAACCAAAGACAGAÄAAÄGAAGAC ^ GAGTTAAGCAC.

460 470 480 · 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA460 470 480. 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA

550 560 57.0 · 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC550 560 57.0 · 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC

590 600 ·. 610 · ' 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT590 600 ·. 610 x 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT

680 690 700 " 710 7*20 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC680 690 700 "710 7 * 20 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC

730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGArACCACACTGGAGGAAGAGG730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGArACCACACTGGAGGAAGAGG

770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC

820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG

860 · 870 880 ' 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT860 x 870 880 '890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT

910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC

950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGC_-AJGTCGGCCAGACCGGGAGACc950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGC _- AJGTCGGCCAGACCGGGAGACc

10 40
GTCAAGAGCTGT10 40
GTCAAGAGCTGT

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz, die für ein IRF-1-Protein codiert, eine Sequenz ist, die sich zu einer DNA-Sequenz hybridisiert, wie sie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert ist.9. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said DNA sequence encoding an IRF-1 protein, a sequence which hybridizes to a DNA sequence, as in one of claims 4 to 6 is defined.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzelle ist.10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the host cell is a bacterial, yeast or mammalian cell.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Protein ein Cytokin- oder Plasminogenaktivator ist.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the desired protein is a cytokine or plasminogen activator.