DD298424A5 - METHOD FOR OBTAINING ALKALINE PHOSPHATASE FROM KAELBERDARM - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Kaelberdarm-Mukosa oder -Inhalt. Dabei wird die wasserloesliche Enzymform durch eine waeszrige 2-Phasenverteilung vom Hauptanteil der Fremdproteine und noch vorhandener Zelltruemmer getrennt und das Enzym nach einer Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose durch Farbstoffligand-Affinitaetschromatographie gereinigt. Das mit einer hohen Ausbeute gewonnene Enzym besitzt die maximal erreichbare spezifische Aktivitaet und enthaelt keine stoerenden DNA-Endonukleasen und DNA-Nicking Aktivitaeten. Es ist sowohl fuer den Einsatz im Enzymimmunoassay als auch in der Gentechnik geeignet.{alkalische Phosphatase; Kaelberdarm; waeszrige 2-Phasenverteilung; Ionenaustausch-Chromatographie; Farbstoffligand-Affinitaetschromatographie; spezifische Aktivitaet; Enzymimmunoassay; Gentechnik}The invention relates to a method for obtaining alkaline phosphatase from calf intestinal mucosa or content. The water-soluble enzyme form is separated by a 2-phase aqueous dispersion from the main portion of the foreign proteins and cell trellis still present and the enzyme is purified by an ion exchange chromatography on DEAE-cellulose by dye ligand affinity chromatography. The high yield enzyme has the highest achievable specific activity and contains no interfering DNA endonucleases and DNA nicking activities. It is suitable for use in enzyme immunoassay as well as in genetic engineering {alkaline phosphatase; Kaelberdarm; aqueous 2-phase distribution; Ion exchange chromatography; Dye ligand affinity chromatography; specific activity; enzyme immunoassay; GMO}

Description

Anwendungsgebiete der ErfindungFields of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt. Das dabei gewonnene Enzympräparat eignet sich zur Anwendung in der Gentechnik, in der biochemischen Grundlagenforschung und als Marker für den Enzymimmunoassay in der biochemischen und klinisch-chemischen Analytik.The invention relates to a method for obtaining alkaline phosphatase from calf intestinal mucosa or content. The enzyme preparation obtained is suitable for use in genetic engineering, in basic biochemical research and as a marker for enzyme immunoassay in biochemical and clinical-chemical analysis.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm wird wegen ihrer hohen spezifischen Aktivität und Stabilität als Marker im Enzymimmunoassay eingesetzt. Neuerdings spielt das Enzym eine wichtige Rolle in der Gentechnik, wobei das Enzym für Sequenzierungs-, Mapping-, und Fingerprint-Analysen benötigt wird. Außerdem wird alkalische Phospatase zur Dephosphorylierung verschiedener Monophosphatester und von Substraten der Proteinkinasen in der Grundlagenforschung eingesetzt.Calf intestinal alkaline phosphatase is used as a marker in enzyme immunoassay because of its high specific activity and stability. Recently, the enzyme plays an important role in genetic engineering, which enzyme is needed for sequencing, mapping, and fingerprinting. In addition, alkaline phosphatase is used for the dephosphorylation of various monophosphate esters and substrates of protein kinases in basic research.

Die meisten bekannten Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus Kälberdarm sind relativaufwendige Mehrschrittverfahren. Sie beinhalten nach den notwendigen Solubilisierungsschritten fraktionierte Fällungen (P. Portmann, Hoppe-Seyler's Z. Phys.Most known methods of obtaining the enzyme from calf intestine are relatively expensive multi-step methods. They contain fractionated precipitates after the necessary solubilization steps (P. Portmann, Hoppe-Seyler's Z. Phys.

Chem., 309 [1957] 87-128), Kationaustausch-Chromatographie (P.Portmann, A. Jörg, K. Furrer, H.S.Walker, P. Leuthard,Chem., 309 [1957] 87-128), cation exchange chromatography (P. Portmann, A. Jörg, K. Furrer, H.S.Walker, P. Leuthard,

J. F. Sudan, F. Perriard, J. F. Comment, G. Leva und J. P. Nell, Separatum, Helvetica Chim. Acta, 65 [1982] 2668-2681), Äff inKätschromatographie (M.Landt, S.C.Boltz und L. G. Butler, Biochem., 17 [1978] 915-919; EP-PS 0064378) und Immunosorptionschromatographie (DD-PS 0159993; DD-PS 0246686; EP-PS 0151320). Für die Gewinnung einer in der Gentechnik einsetzbaren alkalischen Phosphatase sind auf Grund der in den biologischen Ausgangsmaterialien vorhandenen störenden Fremdaktivitäten weitere spezielle chromatographische Schritte wie die Gelfiltration notwendig.J.F. Sudan, F. Perriard, J.F. Comment, G. Leva and J.P. Nell, Separatum, Helvetica Chim. Acta, 65 [1982] 2668-2681), Äff in Kätschromatographie (M.Landt, SC Boltz and LG Butler, Biochem., 17 [1978] 915-919; EP-PS 0064378) and immunosorbent chromatography (DD-PS 0159993; DD- PS 0246686; EP-PS 0151320). For the production of an alkaline phosphatase which can be used in genetic engineering, further special chromatographic steps, such as gel filtration, are necessary on account of the interfering foreign activities present in the biological starting materials.

Fraktionierte Fällungen mittels Salz oder organischer Lösungsmittel verlangen eine Reihe von Zentrifugationsschritten. Auf Grund der verfügbaren Zentrifugen liegt der Zeitbedarf bei etwa 45 Minuten pro Trennschritt. Außerdem lassen sich Fest/ Flüssig-Trennschritte nicht kontinuierlich gestalten. Fällungen mittels organischer Lösungsmittel wirken denaturierend und stellen zusätzlich besondere Anforderungen an den Brandschutz und belasten das Abwasser.Fractional precipitation by means of salt or organic solvents requires a series of centrifugation steps. Due to the available centrifuges, the time required is about 45 minutes per separation step. In addition, solid / liquid separation steps can not be made continuous. Precipitations by means of organic solvents have a denaturing effect and in addition make special demands on the fire protection and burden the wastewater.

Die meisten der beschriebenen Affinitätssorbentien sind sehr teuer, bedingen komplizierte chemische Verfahren zu ihrer Herstellung und besitzen oft eine geringe Bindungskapazität. Für die Immunosorptions-Verfahren ist die Herstellung und die Auswahl geeigneter Antikörper und deren kovalente Kopplung an das Trägermaterial notwendig. Immunoadsorptionsgele zeigen auf Grund der chemischen Natur des Liganden eine hohe Instabilität und eine deutliche Abnahme der Bindungskapazität bei mehrfachem Gebrauch. Die Desorption des Antikörper-Enzymkomplexes führt oft zur partiellen Inaktivierung der alkalischen Phosphatase.Most of the described affinity sorbents are very expensive, require complicated chemical processes for their preparation and often have a low binding capacity. For the immunosorbent methods, the preparation and selection of suitable antibodies and their covalent coupling to the carrier material is necessary. Due to the chemical nature of the ligand, immunoadsorbent gels show a high instability and a marked decrease in the binding capacity in multiple uses. The desorption of the antibody-enzyme complex often leads to the partial inactivation of the alkaline phosphatase.

Trotz des beschriebenen großen Aufwandes und der damit verbundenen hohen Kosten werden diese Verfahren mangels geeigneter Alternativlösungen zur Herstellung kommerzieller Enzympräparate angewendet (DD-PS 0159993; DD-PS 0246686).Despite the great expense described and the associated high costs, these methods are used for lack of suitable alternative solutions for the preparation of commercial enzyme preparations (DD-PS 0159993, DD-PS 0246686).

Der Einsatz von wäßrigen 2-Phasensystemen zur Proteinanreicherung ist seit einiger Zeit bekannt. Von der Vielzahl möglicher 2-Phasensysteme haben Polyethylenglycol (PEG)/Dextran- und PEG/Salz-Systeme die größte Bedeutung erlangt. Allerdings kann nicht in jedem Fall, auch bei Optimierung aller Verteilungsparameter, eine gewünschte Phasenverteilung der Proteine erreicht werden (H. Walther, D. E. Brooks und D. Fisher (Eds.), Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Theory, Methods, Uses and Application in Biotechnology, [1985], Academic Press, Orlando).The use of aqueous 2-phase protein enrichment systems has been known for some time. Of the multitude of possible 2-phase systems, polyethylene glycol (PEG) / dextran and PEG / salt systems have gained the greatest importance. However, a desired phase distribution of the proteins can not always be achieved, even if all distribution parameters are optimized (H. Walther, DE Brooks and D. Fisher (Eds.), Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Theory, Methods, Uses and Application in Biotechnology, [1985], Academic Press, Orlando).

Etwa seit 1972 werden verstärkt trägerimmobilisierte Textilfarbstoffe zur chromatographischen Anreicherung von Proteinen eingesetzt. Dabei wurden auch trägerfixierte Triazinfarbstoffe der allgemeinen StrukturSince about 1972, carrier-immobilized textile dyes have been increasingly used for the chromatographic enrichment of proteins. In this case, carrier-fixed triazine dyes of the general structure were also

-N-ft-N-ft

Z = reaktive GruppeZ = reactive group

R = sulfonierte, aromatische RingeR = sulfonated, aromatic rings

zur Reinigung der alkalischen Phosphatase benutzt. Ein darauf basierendes Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus Kälberdarm brachte gegenüber den bereits erwähnten Lösungen bezüglich des Zeitaufwandes und der Kosten keine wesentlichen Verbesserungen (J. Kirchberger und G. Kopperschläger, Prop. Biochem., 12 [1982] 29-47 und J. Kirchberger, Dissertation zur Promotion A, 1983). Der derzeitige Erkenntnisstand auf dem Gebiet der Farbstoffiigand-Affinitätschromatographie erlaubt jedoch keine allgemeingültigen Voraussagen über die Eignung eines Farbstoffes als Ligand zur selektiven Bindung der zu gewinnenden Proteine. Deshalb müssen aus der Vielzahl der von der chemischen Industrie angebotenen Textilfarbstoffe die für den speziellen Zweck geeigneten Farbstoff-Liganden durch Screening-Methoden ausgewählt werden.used for the purification of alkaline phosphatase. A method based thereon for the production of the enzyme from calf intestine brought about no significant improvements compared to the solutions mentioned above with regard to the expenditure of time and the costs (J. Kirchberger and G. Kopperschläger, Prop. Biochem., 12 [1982] 29-47 and J. Kirchberger , Doctoral Thesis on Doctorate A, 1983). The current state of knowledge in the field of dye-affinity affinity chromatography, however, does not allow any general predictions about the suitability of a dye as a ligand for the selective binding of the proteins to be obtained. Therefore, from the variety of textile dyes offered by the chemical industry, the dye ligands suitable for the particular purpose must be selected by screening methods.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung Ist es, alkalische Phosphatase mit einer hohen spezifischen Aktivität, frei von DNA-Endonukleasen und DNA-Nicking-Aktivitäten, in großen Mengen und mit geringem Zeit- und Kostenaufwand aus Kläberdarm-Mukosa oder -Inhalt zu gewinnen.OBJECT OF THE INVENTION It is to obtain alkaline phosphatase with a high specific activity, free of DNA endonucleases and DNA-nicking activities, in large quantities and with little expenditure of time and money from the intestinal mucosa or content.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat die Aufgabe, für die Gewinnung alkalischer Phosphatase aus Kälber-Mukosa oder -Inhalt ein möglichst einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren hoher Ausbeute zu entwickeln, wobei das dabei gewonnene Enzym eine hohe spezifische Aktivität, frei von Fremdaktivitäten, besitzt.The object of the invention is to develop a very simple, rapid and inexpensive process of high yield for the recovery of alkaline phosphatase from calf mucosa or content, the enzyme thus obtained having a high specific activity, free from foreign activities.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß aus dem Butanolextrakt von Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt noch vorhandene Zelltrümmer und der Hauptanteil der Fremdproteine durch eine wäßrige 2-Phasenverteilung entfernt, die PEG-haitige Oberphase einer lonenaustautsch-Chromatoyraphie an DEAE-Cellulose unterworfen und das Enzym an einem trägerimmobilisierten Farbstoff-Liganden adsorbiert sowie unter Einsatz von Phosphat spezifisch desorbiert wird. Überraschenderweise ermöglicht das erfindungsgemrße 2-Phasensystem, bestellend aus 8-10% (w/w) PEG 4000 bzw. PEG 6000,0,5-2% (w/w) Dextran (M, = 30000-70000), Puffer (vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5,2 mM MgCI₂) und bis zu 75% (w/w) Butanolextrakt (50001E bzw. 1 g Protein pro 100g System), die Entfernung partikulärer Zellbestandteile und eines großen Teils der Fremdproteine in einem Schritt ohne Zentrifugation. Allerdings kann durch den Einsatz geringer Zentrifugalkräfte (3000xg) die Phasentrennung in einer Minute erfolgen. Günstig ist auch der Einsatz von Flüssig/Flüssig-Separatoren, er erlaubt eine kontinuierliche Prozeßgestaltung. Das führt zu einer bemerkenswerten Zeiteinsparung und ermöglicht die Gewinnung des Enzyms mit hoher Ausbeute.According to the invention the object is achieved in that from the butanol extract of calf intestinal mucosa or content still existing cell debris and the majority of the foreign proteins removed by an aqueous 2-phase distribution, subjected to the PEG-haitige upper phase of a Lonenaustautsch-Chromatoyraphie DEAE-cellulose and the Enzyme adsorbed on a carrier-immobilized dye ligand and desorbed specifically using phosphate. Surprisingly, the 2-phase system according to the invention, consisting of 8-10% (w / w) PEG 4000 or PEG 6000.0.5-2% (w / w) dextran (M, = 30000-70000), enables buffers (preferably 10 mM Tris / HCl, pH 7.5.2 mM MgCl ₂ ) and up to 75% (w / w) butanol extract (5000 μl or 1 g protein per 100 g system), the removal of particulate cell constituents and a large part of the foreign proteins in one Step without centrifugation. However, by using low centrifugal forces (3000xg), the phase separation can take place in one minute. It is also beneficial to use liquid / liquid separators, it allows a continuous process design. This results in a remarkable saving of time and enables the recovery of the enzyme with high yield.

Wäßrige 2-Phasensysteme sind generell durch eine hohe Kapazität gekennzeichnet. Durch das hier eingesetzte System können beispielsweiseunter Verbrauch von 200g PEG 4000 und 10g Dextran M70 1000000IE bzw. 10g Protein aufgearbeitet werden. In der Literatur publizierte Kostenanalysen zeigen, daß der Einsatz von wäßrigen 2-Phasensystemen zur Enzymextraktion als erster, Schritt gegenüber Fest/Flüssig-Separationen in jedem Fall kostengünstiger ist.Aqueous 2-phase systems are generally characterized by a high capacity. By using the system used here, for example, with consumption of 200 g PEG 4000 and 10 g Dextran M70, 1000000 IE or 10 g protein can be worked up. Cost analyzes published in the literature show that the use of aqueous 2-phase systems for the extraction of enzymes as a first, step against solid / liquid separations is in each case more cost-effective.

Die PEG-haltige Oberphase des 2-Phasensystems wird nach einer Verdünnung mit destilliertem Wasser (mindestens im Verhältnis 1:3) unmittelbar mit der DEAE-Cellulose in Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, gerührt. Die Bindung des Enzyms an DEAE-Cellulose wird durch in der Lösung enthaltenes PEG nicht beeinflußt, so daß Dialyse-Schritte entfallen und die lonenaustausch-Chromatographie im Batch-Verfahren bei erneuter Zeiteinsparung durchgeführt werden kann. Nach der Entfernung des bei der lonenaustausch-Chromatographie nicht gebundenen Proteins durch Waschen der DEAE-Cellulose mit Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, erfolgt die Desorption des Enzyms durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 5OmM NaCI in 1OmM Tris/HCI, pH 8,0,2mM MgCI₂.After dilution with distilled water (at least in the ratio 1: 3), the PEG-containing upper phase of the 2-phase system is stirred directly with the DEAE-cellulose in buffer, preferably 10 mM Tris / HCl, pH 8.0.2 mM MgCl ₂ . The binding of the enzyme to DEAE-cellulose is not affected by PEG contained in the solution, so that dialysis steps are eliminated and the ion exchange chromatography in a batch process can be carried out with renewed time savings. After removal of the protein not bound in the ion exchange chromatography by washing the DEAE-cellulose with buffer, preferably 10 mM Tris / HCl, pH8.0.2 mM MgCl ₂ , the desorption of the enzyme is carried out by increasing the ionic strength, preferably 50 mM NaCl in 10 mM Tris / HCl, pH 8.0, ₂ mM MgCl ₂ .

Die Adsorption des Enzyms erfolgt danach an einem trägerimmobilisierten Farbstoff-Liganden, wobei der Farbstoff-Ligand kovalent an wasserunlösliche, hydrophile Trägermaterialien, vorzugsweise Sepharose, gekoppelt wird. Aus einer Vielzahl (41) getesteter Farbstoffe wurden Liganden der allgemeinen StrukturThe adsorption of the enzyme is then carried out on a carrier immobilized dye ligand, wherein the dye ligand is covalently coupled to water-insoluble, hydrophilic support materials, preferably Sepharose. From a large number (41) of tested dyes were ligands of the general structure

i-HN ψ tyti MH-i—Rhimψ tyti MH-i-R

Z = reaktive GruppeZ = reactive group R = sulfonierte, aromatische RingeR = sulfonated, aromatic rings

davon insbesondere Reactive Blue 171 (International Colour Index, 1975), als besonders geeignet ermittelt. Überraschenderweise konnten die bisher für die Af finitätschromatographie der alkalischen Phosphatase eingesetzten Farbstoffe die mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Liganden erzielten Parameter (Bindungskapazität, Selektivität) nicht erreichen. Reactive Blue 171 -Sepharose läßt sich ohne größeren präparativen Aufwand kostengünstig herstellen, ist trotz häufigen Gebrauchs über Jahre stabil, läßt sich einfach regenerieren und zeigt keine Abnahme der Bindungskapazität. Das Waschen dor mit alkalischer Phosphatase beladenen Reactive Blue 171-Sepharose zur Entfernung eines Teils des bei der Farbstoffligand-Affinitätschromatographie gebundenen Fremdproteins durch Erhöhung der lonenstärke (vorzugsweisethereof especially Reactive Blue 171 (International Color Index, 1975), found particularly suitable. Surprisingly, the dyes used to date for the affinity chromatography of the alkaline phosphatase could not reach the parameters achieved with the ligand used according to the invention (binding capacity, selectivity). Reactive Blue 171 -Sepharose can be produced inexpensively without major preparative effort, is stable for many years despite frequent use, can be easily regenerated and shows no decrease in binding capacity. Washing the alkaline phosphatase-loaded Reactive Blue 171-Sepharose to remove a portion of the foreign protein bound in dye-ligand affinity chromatography by increasing the ionic strength (preferably

7OmM NaCI) des Chromatcgraphio-Puffers (vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2mM MgCI₂) erhöht die spezifische Aktivitätdes Enzyms wesentlich. Der Einsatz von Kaliumphosphat (vorzugsweise 2-SmM in 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂) erlaubtdie kostengünstige aber spezifische Elution des Enzyms mit hoher Ausbeute und spezifischer Aktivität.7 mM NaCl) of the chromatographic buffer (preferably 10 mM Tris / HCl, pH 7.5.2 mM MgCl ₂ ) substantially increases the specific activity of the enzyme. The use of potassium phosphate (preferably 2-SmM in 10 mM Tris / HCl, pH 7.5.2 mM MgCl ₂ ) allows inexpensive but specific elution of the enzyme with high yield and specific activity.

Die Aufbewahrung des gereinigten Enzyms erfolgt beispielsweise in 30 mM Triethanolamin/HCI, pH 7,5,3 M NaCI, 1mM MgCI₂,The storage of the purified enzyme is carried out, for example, in 30 mM triethanolamine / HCl, pH 7.5.3 M NaCl, 1 mM MgCl ₂ ,

0,1 mM ZnCI₂ oder in 85% gesättigter Amoniumsulfat-Lösung bei 4⁰C. Die Gesamtausbeute des Verfahrens liegt deutlich überden in der Literatur angegebenen Ausbeuten von 40%. Die spezifische Aktivität der gewonnenen alkalischen Phosphataseentspricht der maximal erreichbaren.0.1 mM ZnCl ₂ or in 85% saturated ammonium sulfate solution at 4 ⁰ C. The overall yield of the process is well above the reported yields of 40% in the literature. The specific activity of the recovered alkaline phosphatase corresponds to the maximum achievable.

(Ms erfindungsgemäße Verfahren kann für die Gewinnung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm-Mukosa aber auch-lihalt eingesetzt werden. Die Anwendung des Verfahrens ist ohne aufwendige Prozeßoptimierung auch im technologischen(The method according to the invention can also be used for the production of the alkaline phosphatase from calf intestinal mucosa, but also in the technological field without costly process optimization

Maßstab möglich. Überraschenderweise lassen sich im Anwendungsrahmen im Enzympräparat keine DNA-Endonukleasen undScale possible. Surprisingly, can be in the application frame in the enzyme preparation no DNA endonucleases and DrVA-Nicking-Aktivitäten nachweisen. Die in der Literatur beschriebenen zusätzlichen speziellen Verfahrensschritte zurDemonstrate DrVA nicking activities. The additional special process steps described in the literature for Herstellung eines solchen Präparates können deshalb eingespart werden.Production of such a preparation can therefore be saved. Die erfindungsgemäß gewonnene alkalische Phosphatase eignet sich auf Grund der besonders hohen Reinheit vor allem zurThe alkaline phosphatase obtained according to the invention is particularly suitable for the very high purity Anwendung in der Gentechnik, in der biochemischen Grundlagenforschung sowie als Marker für den Enzymimmunoassay in derApplication in genetic engineering, in basic biochemical research as well as a marker for the enzyme immunoassay in the

biochemischen und klinisch-chemischen Analytik.biochemical and clinical-chemical analysis.

Ausführungsbeispielembodiment Verfahren zur Gewinnung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm-MukosaMethod of obtaining alkaline phosphatase from calf intestinal mucosa Aus Kälberdünndarm (Duodenum oder oberes Jejunum) wird die Mukosa herausgeschabt und nach dem Homogenisieren inFrom calf small intestine (duodenum or upper jejunum) the mucosa is scraped out and after homogenizing in

1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂ (Puffer A) mit n-Butanol (Endkonzentration 35Vol.-%) 14h bei 4°C gerührt. Die wäßrige10 mM Tris / HCl, pH 7.5.2 mM MgCl ₂ (buffer A) with n-butanol (final concentration 35% by volume) for 14 h at 4 ° C stirred. The watery

Phase des Butanolextraktes wird unter Rühren bei 4°C mit festem PEG 4000 und entsprechenden Anteilen aus StammlösungenPhase of the butanol extract is stirred at 4 ° C with solid PEG 4000 and appropriate proportions from stock solutions

vor Dextran M70 und 20OmM Tris/HCI, pH7,5,4OmM MgCI₂ versetzt und 30 Minuten gerührt. Die Endzusammensetzung des2-Phasensystems beträgt 10Gew.-% PEG 4000,0,5Gew.-% Dextran M70,75Gew.-%Butanolextrakt (10g Protein/kg System) und1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂. Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation bei 3000xg innerhalb von 5 Minuten.before Dextran M70 and 20 mM Tris / HCl, pH7.5, 40 mM MgCl ₂ and stirred for 30 minutes. The final composition of the 2-phase system is 10 wt% PEG 4000.0.5 wt% dextran M70.75 wt% butanol extract (10g protein / kg system) and 10mM Tris / HCl pH7.5.2mM MgCl ₂ . The phase separation is carried out by centrifugation at 3000xg within 5 minutes.

Die PEG-haltige Oberphase wird 1:3 mit dest. Wasser verdünnt und mit DEAE-Cellulose, die mit 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2mMThe PEG-containing upper phase is 1: 3 with dist. Water and diluted with DEAE-cellulose containing 10 mM Tris / HCl, pH8.0.2 mM MgCI₂ (Puffer B) äquilibriert wurde, gerührt. Für 100000IE benötigt man 900g (Feuchtgewicht) DEAE-Cellulose. NachMgCl ₂ (Buffer B) was equilibrated, stirred. For 100000IE 900g (wet weight) DEAE-cellulose is needed. To Auswaschen des nichtgebundenen Proteins mit Puffer B wird die alkalische Phosphatase durch Waschen der DEAE-Cellulose mitWashing the unbound protein with buffer B, the alkaline phosphatase by washing the DEAE-cellulose with Puffer B, der zusätzlich 5OmM NaCI enthält, eluiert.Buffer B, which additionally contains 50 mM NaCl, elutes. Nach Dialyse gegen Puffer A wird die Enzymlösung mit Reactive Blue 171 -Sepharose 4B versetzt und nichtgebundenes ProteinAfter dialysis against buffer A, the enzyme solution is treated with Reactive Blue 171-Sepharose 4B and unbound protein

mit Puffer A ausgewaschen. Danach wird die Reactive Blue 171-Sepharose 4B mit Puffer A, der zusätzlich 7OmM NaCI enthält,gewaschen, bis kein Protein im Eluat mehr nachweisbar ist (E₂₈o„m < 0,02). Nach Entfernung des NaCI durch Waschen mitwashed out with buffer A. The Reactive Blue 171-Sepharose 4B is then washed with Buffer A, which additionally contains 7 mM NaCl, until no protein is detectable in the eluate (E ₂₈ o "m <0.02). After removal of NaCl by washing with

Puffer A wird das Enzym mittels 5mM Kaliumphosphat in Puffer A eluiert und mittels Dialyse gegen eine Lösung aus 3OmMBuffer A, the enzyme is eluted by means of 5 mM potassium phosphate in buffer A and by dialysis against a solution of 30 mM Triethanolamin, 3M NaCI, 1 mM MgCI₂,0,1 mM ZnCI₂ oder durch eine Ammoniumsulfatfällung (85% Sättigung) bei 4°CTriethanolamine, 3M NaCl, 1mM MgCl ₂ , 0.1mM ZnCl ₂ or by ammonium sulphate precipitation (85% saturation) at 4 ° C

stabilisiert.stabilized.

Das Enzym besitzt eine spezifische Aktivität von 2200IE/mg (25°C, p-Nitrophenylphosphat, 1 M Diethanolamin, 1 mM MgCI₂,The enzyme has a specific activity of 2200 IU / mg (25 ° C, p-nitrophenyl phosphate, 1 M diethanolamine, 1 mM MgCl ₂ ,

pH9,8). Die Gesamtausbeute des Verfahrens beträgt 60%. Das Enzympräparat enthält keine störenden DNA-Endonukleasen undpH9,8). The overall yield of the process is 60%. The enzyme preparation contains no interfering DNA endonucleases and

DNA-Nicking-Aktivitäten. Der Gehalt an Phosphodiesterase I (EC 3.1.4.1.) ist kleiner 0,01 %.DNA nicking activities. The content of phosphodiesterase I (EC 3.1.4.1.) Is less than 0.01%. Eine Übersicht der in den einzelnen Präparationsschritten erzielten Ergebnisse ist in Tabelle 1 zusammengefaßt.An overview of the results obtained in the individual preparation steps is summarized in Table 1. Tabelle 1Table 1 Verfahrensschema zur Gewinnung alkalischer Phosphatase aus KälberdarmProcess scheme for obtaining alkaline phosphatase from calf intestine

Reinigungsschrittcleaning step spezifischespecific Ausbeuteyield Anreicherungenrichment Aktivitätactivity (IE/mg)(IU / mg) (%)(%) (n-fach)(N-fold) RutanolextraktRutanolextrakt 55 100100 11 2-Phasenverteilung2-phase distribution 1010 8888 22 DEAE-CelluloseDEAE cellulose 100100 6868 2020 Blue171-SepharoseBlue171-Sepharose 22002200 6060 440440

Claims (10)

1. Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphataso aus Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt, dadurch gekennzeichnet, daß aus deren ßutanolextrakt noch vorhandene Zelltrümmer und der Hauptanteil der Fremdproteine durch wäßrige 2-Phasenverteilung entfernt, die PEG-haltige Oberphase einer lonenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose unterworfen und das Enzym an einem trägerämmobilisierten Farbstoff-Liganden adsorbiert und unter Einsatz von Phosphat spezifisch desorbiert wird.1. A process for the production of alkaline phosphatase from calf intestinal mucosa or content, characterized in that removed from the ßutanolextrakt still existing cell debris and the majority of foreign proteins by aqueous 2-phase distribution, the PEG-containing upper phase of an ion exchange chromatography on DEAE Cellulose is subjected and the enzyme adsorbed on a carrier-immobilized dye ligand and desorbed specifically using phosphate. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der wäßrigen 2-Phasenverteilung das 2-Phasensystem aus PEG 4000 bzw. PEG 6000, vorzugsweise 8-10%; w/w, Dextran M_r = 30000-70000, vorzugsweise 0,5-2%; w/w, Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5, 2mM MgCI₂, und bis zu 75%; w/w, Butanolextrakt(5000IE bzw. 1g Protein pro 100g System) besteht.2. The method according to claim 1, characterized in that in the aqueous 2-phase distribution, the 2-phase system of PEG 4000 or PEG 6000, preferably 8-10%; w / w, dextran M _r = 30000-70000, preferably 0.5-2%; w / w, buffer, preferably 10 mM Tris / HCl, pH 7.5, ₂ mM MgCl ₂ , and up to 75%; w / w, butanol extract (5000 IU or 1g protein per 100g system). 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen der Oberphase des 2-Phasensystems kontinuierlich durch eine Zonalzentrifugation oder einen Flüssig/ Flüssig-Separator erfolgt.3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the separation of the upper phase of the 2-phase system is carried out continuously by Zonalzentrifugation or a liquid / liquid separator. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die lonenaustausch-Chromatographie die PEG-haltige Oberphase des 2-Phasensystems ohne Dialyse nach einer Verdünnung mit destilliertem Wasser mindestens im Verhältnis 1:3 unmittelbar mit der DEAE-Cellulose in Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 8,0,2 mM MgCI₂, gerührt wird.4. The method according to claim 1, characterized in that for the ion exchange chromatography, the PEG-containing upper phase of the 2-phase system without dialysis after dilution with distilled water at least in the ratio 1: 3 directly with the DEAE-cellulose in buffer, preferably 1OmM Tris / HCl, pH 8.0.2 mM MgCl _{2 is} stirred. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach dar Entfernung des bei der lonenaustausch-Chromatographie nicht gebundenen Proteins durch Waschen der DEAE-Cellulose mit Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, die Desorption des Enzyms durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 5OmM NaCI in 1OmM Tris/HCI, pH 8,0, 2mM MgCI₂ erfolgt.5. Process according to claims 1 and 4, characterized in that after removal of the protein not bound in the ion exchange chromatography by washing the DEAE-cellulose with buffer, preferably 10 mM Tris / HCl, pH8.0.2 mM MgCl ₂ , the desorption of the enzyme by increasing the ionic strength, preferably 5OmM NaCl in 1OmM Tris / HCl, pH 8.0, 2mM MgCl ₂ takes place. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Farbstoffligand-Affinitätschromatographie Liganden der allgemeinen Formel:6. The method according to claim 1, characterized in that for dye ligand affinity chromatography ligands of the general formula: OH NH₁ OH NH ₁ ^Vn=n^YVN=n^ Vn = n ^ = n YVN Z = reaktive GruppeZ = reactive group R = sulfonierte, aromatische RingeR = sulfonated, aromatic rings vorzugsweise der Ligand Reaktive Blue 171 (International Colour Index 1975) eingesetzt werden.preferably the ligand reactive Blue 171 (International Color Index 1975) are used. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff-Ligand kovalent an wasserunlösliche, hydrophile Trägermaterialien, vorzugsweise Sepharose, gekoppelt wird.7. Process according to claims 1 and 6, characterized in that the dye ligand is covalently coupled to water-insoluble, hydrophilic support materials, preferably sepharose. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des bei der Farbstoffligand-Affinitätschromatographie gebundenen Fremdproteins durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 7OmM NaCI, des Chromatographie-Puffers, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5,2 mM MgCI₂, entfernt wird.8. The method according to claims 1,6 and 7, characterized in that a part of the bound in the dye ligand affinity chromatography foreign protein by increasing the ionic strength, preferably 7OmM NaCl, the chromatography buffer, preferably 1OmM Tris / HCl, pH 7.5 , 2 mM MgCl ₂ , is removed. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym spezifisch mit Kaliumphosphat, vorzugsweise 2-5mM in 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2mM MgCI₂, eluiert wird.9. The method according to claims 1 and 6 to 8, characterized in that the enzyme specifically with potassium phosphate, preferably 2-5mM in 1OmM Tris / HCl, pH7.5,2mM MgCl ₂ eluted. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Enzym in 30mM Triethanolamin/HCI, pH7,5,3M NaCI, 1 mM MgCI₂,0,1 M ZnCI₂ oder in 85% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung bei 4⁰C aufbewahrt wird.10. The method according to claims 1 to 9, characterized in that the purified enzyme in 30 mM triethanolamine / HCl, pH7.5.3M NaCl, 1 mM MgCl ₂ , 0.1 M ZnCl ₂ or in 85% saturated ammonium sulfate solution at 4 ⁰ C is stored.