DD298276A5 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF CYCLOSPORIN A - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A, einem mikrobiellen Wirkstoff, der als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden hat. Die Erfindung verfolgt das Ziel, das Produkt auf mikrobiellem Wege mit erhoehten Ausbeuten herzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird in der Weise geloest, dasz der neue Mikroorganismus Tolypocladium inflatum SF 136 aerob auf einem Medium fermentiert wird, welches organische Stickstoff-Substrate sowie Glukose oder Maltose und Salze enthaelt, und das gebildete Cyclosporin A aus Biomasse und Kulturfiltrat durch Extraktion mit organischen Loesungsmitteln isoliert sowie nachfolgend durch Chromatographie und Umkristallisation gereinigt wird.{Cyclosporin A; Immunsuppressivum; Stamm Tolypocladium inflatum SF 136; Fermentation; Isolierung; Reinigung; Biomasse; Kulturfiltrat}The invention relates to a process for the preparation of cyclosporin A, a microbial active ingredient which has found widespread use as an immunosuppressant in the therapy of organ transplants. The invention aims to produce the product in a microbial way with increased yields. The object associated with this objective is achieved by fermenting the novel microorganism Tolypocladium inflatum SF 136 aerobically on a medium containing organic nitrogen substrates as well as glucose or maltose and salts and the resulting cyclosporin A from biomass and culture filtrate by extraction isolated with organic solvents and subsequently purified by chromatography and recrystallization. {Cyclosporin A; immunosuppressant; Strain Tolypocladium inflatum SF 136; Fermentation; Insulation; Cleaning; biomass; culture}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege. Dieser mikrobiell gebildete Wirkstoff hat als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden.The invention relates to a process for the preparation of cyclosporin A by fermentation. This microbially produced active substance has been widely used as an immunosuppressant in the therapy of organ transplants.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.The field of application of the invention is thus in the microbiological pharmaceutical research and industry.

Charakteristik des bekannten Standes dar TechnikCharacteristic of the prior art

Mikrobielle Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege, nämlich durch die Kultivierung ausgewählter pilzlicher Mikroorganismen, sind seit 1975 bekannt (vgl. die Patentschriften CH 589716, CH 603790, DD 115695, DE 2455859 und AT 350716).Microbial processes for the production of cyclosporin A by fermentation, namely the cultivation of selected fungal microorganisms, have been known since 1975 (see the patents CH 589716, CH 603790, DD 115695, DE 2455859 and AT 350716).

Als wichtigste Mikroorganismen werden Stämme aus den Arten Tolypocladlum Inflatum sowie Cyllndrocarpon lucldum eingesetzt, die emers oder submers auf flüssigen komplexen Medien bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 2O⁰C bis 30°C kultiviert werden, wobei das gebildete Produkt aus der gewonnenen Biomasse wie auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit Methanol gewonnen wird. Ausgedehnte screening-Untersuchungen führten zur Auffindung zahlreicher weiterer pilzlicher Spezies mit Cyclosporin-Bildungsvermögen, die jedoch biotechnologisch bislang nicht genutzt werden, so unter anderen Tolypocladitim geodes, Fuearlum solanl, Trlchoderma vlride, Neoeosmospora vaslnf ecta, Isaria fellna, Vertlclllium spec, Paecllomyces spec, Acremonlum spec. (s.a. Anlage 1).The most important strains of microorganisms of the species Tolypocladlum inflatum and Cyllndrocarpon lucldum are used which emers or submerged in liquid complex media at pH values in the range from pH 3.2 to pH 7.5 and at temperatures of 2O ⁰ C to 30 ° C are cultivated, wherein the product formed is recovered from the recovered biomass as well as from the culture filtrate by extraction with methanol. Extensive screening studies have led to the discovery of numerous other fungal species with cyclosporin-forming capacity, which are, however, not yet used biotechnologically, so among other Tolypocladitim geodes, Fuearlum solanl, Trlchoderma vlride, Neoeosmospora vaslnf ecta, Isaria fellna, Vertlclllium spec, Paecllomyces spec, Acremonlum spec. (see Annex 1).

Die beschriebenen Kultivierungsbedingungen erlauben gemäß der Fachliteratur nach 10- bis 15tägiger Fermentation Leistungen von 250Mg Cyclosporin A/ml, durch gezielte Mediumsveränderungen auch Werte bis zu 600pg/ml (Symp. on Overproduction of Microbial Products, Budejovice, Juli 1988).The cultivation conditions described allow, according to the literature after 10 to 15 days fermentation achievements of 250Mg Cyclosporin A / ml, by targeted medium changes also values up to 600pg / ml (Symp. On Overproduction of Microbial Products, Budejovice, July 1988).

Entwicklungen in Richtung Festbett-Fermentation tragen bislang nur Prinziplösungscharakterohne biotechnologische Relevanz. Charakteristisch für das verwendete biologische Material ist die Bildung von 4cm bis 4,5cm großen, weißen, ungefalteten Kolonien in der Oberflächenkultur. Diese morphologische Eigenart muß in Verbindung mit dem relativ geringen biosynthetischen Leistungsvermögen als Nachteil für eine ökonomisch effektive Herstellung von Cyclosporin A angesehen werden, da die geringe morphologische Differenzierung eine umfangreiche Wertbestimmung in der Selektion urforderlich macht und die Wachstumsintensität des stammspezifischen Mycels besondere Prozeßanforderungen wegen der Rheologie der Fermentationslösung stellt.Developments in the direction of fixed-bed fermentation have so far only been of principle-solution character without biotechnological relevance. Characteristic of the biological material used is the formation of 4cm to 4.5cm large, white, unfolded colonies in the surface culture. This morphological peculiarity, in conjunction with the relatively low biosynthetic capacity, must be considered to be detrimental to economically effective production of cyclosporin A, since the low morphological differentiation requires extensive value determination in selection and the growth intensity of the strain specific mycelium has particular process requirements due to the rheology of the Fermentation solution provides.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung verfolgt das Ziel, Cyclosporin A auf mikrobiellem Wege in erhöhten Ausbeuten herzustellen.The invention aims to produce cyclosporin A by microbial route in increased yields.

-2- 298 276 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 298 276 Presentation of the Essence of the Invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, gestützt auf den Einsatz eines neuen pilzlichen Mikroorganismus ein technologischThe invention is based on the object, based on the use of a new fungal microorganism a technological

effektives mlkrobielles Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe Cyclosporin A in guten Ausbeuten hergestellt werden kann.to describe an effective microbial process by means of which cyclosporin A can be prepared in good yields.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst: Unter aeroben und sterilen Fermentationsbedingungen wird derAccording to the invention, the object is achieved as follows: Under aerobic and sterile fermentation conditions, the Mikroorganismus Tolypocladlum Inflatum SF136 in einem flüssigen Submersmedium, welches eine organischeMicroorganism Tolypocladlum inflatum SF136 in a liquid submucosal medium containing an organic Stickstoffquelle, Glukose oder Maltose sowie Mineralsalze enthält, bei Temperaturen von 20°C bis 3O⁰C sowie einer AcicMät vonNitrogen source, glucose or maltose and mineral salts, at temperatures of 20 ° C to 3O ⁰ C and an AcicMät of

pH 3,2 bis pH 7,5 für die Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen kultiviert.pH 3.2 to pH 7.5 for a period of 10 days to 15 days cultivated.

Der Stamm SF136 ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie undThe strain SF136 is in the depository for microorganisms of the GDR, Central Institute of Microbiology and

experimentelle Therapie der AdW, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer IMET 43868 hinterlegtworden.experimental therapy of AdW, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, under the registration number IMET 43868.

Die Fermentation erfolgt in den Stufen der Vorzucht und der Hauptkultivierung.The fermentation takes place in the stages of pre-breeding and main cultivation. Sporensandkonserven des genannten Stammes werden auf einem Agar-Nährmedium, welches Glukose als KohlenstoffquelleSporensandkonserven said strain are on an agar nutrient medium, which glucose as a carbon source

und (NH₄I₂SO₄ als Stickstoffquelle enthält, ausgeplattet und für die Dauer von 10 Tagen bis 12 Tagen bei 24 "C bis 25°C bebrütet.and (NH ₄ I ₂ SO ₄ as nitrogen source, flattened and incubated for 10 days to 12 days at 24 ° C to 25 ° C.

Von den entstandenen Einzelkolonien werden die 0,5cm bis 1,0cm im Durchmesser großen, an der Unterseite dunkelbraunOf the resulting colonies are the 0.5 cm to 1.0 cm in diameter, dark brown at the bottom

pigmentierten Exemplare entnommen und nach Übertragung auf Mineralsalz-Glukose-Agar zur Ausbildung von mindestens4cm großen Einzelarealen in die erste Vorzuchtpassage übertragen. Diese besteht aus 100-ml-Steilbrustflaschen oder 500-ml-taken from pigmented specimens and transferred after transfer to mineral salt-glucose agar to form at least 4cm large individual areas in the first pre-breeding passage. This consists of 100 ml steep breast bottles or 500 ml

Erlenmeyerkolben, die 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inoculummedium enthält Glukose oder MaltoseErlenmeyer flasks containing 20% of their volume as seed medium. The inoculum medium contains glucose or maltose

als Kohlenstoffquelle, organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach der Beimpfung für die Dauer von48 Stunden bis 72 Stunden bei 24⁰C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger mit 180rpm bis 240rpm geschüttelt. Nach Ausreifen desas a carbon source, organic nitrogen substrates and mineral salts and is shaken after inoculation for 48 hours to 72 hours at 24 ⁰ C to 25 ⁰ C on a rotary oscillator with 180rpm to 240rpm. After maturing of

Inoculums erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung der zweiten Anzuchtpassage in einer Menge von 10% des Mediumvolumens.Inoculums, if appropriate, the inoculation of the second propagation passage in an amount of 10% of the medium volume. Diese Vorzuchtstufe besteht aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die wiederum 20% ihres Volumens als Medium enthalten.This pre-breeding stage consists of 500 ml Erlenmeyer flasks, which in turn contain 20% of their volume as medium. Nach 48stündiger Kultivierung unter den o.a. Bedingungen wird das Hauptkulturmedium mit 5% bis 10% der AnzuchtkulturAfter 48 hours of cultivation under the o.a. Conditions become the main culture medium with 5% to 10% of seed culture

beimpft und für die Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen unter Rundschütteln oder Rühren und Belüften kultiviert. Während desinoculated and cultured for a period of 10 days to 15 days with shaking round or stirring and aerating. During the

Fermentationsprozesses erfolgt zunächst die Bildung der Biomasse, der die Synthese des Cyclosporins A folgt.Fermentation process is initially the formation of biomass, which follows the synthesis of cyclosporin A. Aus dem ausgetragenen Fermentationsahsatz wird das Produkt -.wie nachstehend noch detaillierter dargestellt - durchFrom the discharged Fermentationsahsatz the product is - as shown in more detail below - by Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und nachfolgender adsorptive* Anreicherung und Reinigung gewonnen. Unter denExtraction with organic solvents and subsequent adsorptive enrichment * and purification. Among the

angeführten Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze in der genannten Zeit Leistungen von 800 bis 1200 pg/mlstated conditions reach the fermentation approaches in the said time achievements of 800 to 1200 pg / ml

Cyclosporin A, welches analytisch durch Einsatz der HPLC erfaßt wird. Die Fermentationslösung weist zum Erntezeitpunkt eineCyclosporin A, which is detected analytically by the use of HPLC. The fermentation solution has a harvest time

rötlich-braune bis schwarz-braune Färbung bei pH-Werten von über 5,0 auf.reddish-brown to black-brown coloration at pH values above 5.0.

Die Isolierung des Cyclosporin A wird in der Weise durchgeführt, daß das Peptid aus dem Kulturfiltrat mit organischen, mitThe isolation of the cyclosporin A is carried out in such a way that the peptide from the culture filtrate with organic, with Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln und aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbarenWater not or only slightly miscible solvents and from the biomass with water miscible or poorly miscible Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der vereinigten Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren LösungsmittelExtracting solvents, after concentrating the combined extracts with a water-immiscible solvent

reextrahiert, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne gebracht wird. Bevorzugtkommen in dieser Extraktionsstufe die Lösungsmittel Aceton, Essigester und/oder Butylacetat zur Anwendung. Anschließendwird das Rohprodukt in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wieder aufgenommen und säulenchromatographischunter Verwendung von Aluminiumoxid als Adsorbens und Chloroform als Eluent gereinigt.reextracted, dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and brought to dryness in a vacuum rotary evaporator. The solvents acetone, ethyl acetate and / or butyl acetate are preferably used in this extraction stage. Subsequently, the crude product is taken up in an organic non-polar solvent and purified by column chromatography using alumina as the adsorbent and chloroform as the eluent.

Aus dem kristallinen Reinprodukt, das nach Abdestillieren des Lösungsmittels der vereinigten Cyclosporin A-Frak(ionen derFrom the crystalline pure product which, after distilling off the solvent, the combined cyclosporin A Frak (ion of Säulenchromatographie resultiert, wird das Cyclosporin A durch Umfallen bzw. Umkristallisieren als kristalline ReinsubstanzColumn chromatography results, the cyclosporin A by reprecipitation or recrystallization as a crystalline pure substance

erhalten.receive.

Eigenschaften des Cyclosporin A:Properties of cyclosporin A: Farblose, mikrokristalline Substanz aus Ether/Hexan, [al⁰ - -244 ± 4° (CHCI₃)Colorless, microcrystalline substance of ether / hexane, [al ⁰ - 244 ± 4 ° (CHCl ₃ ) Elementaranalyse: C 61,9; H 9,5; N 12,6;Elemental analysis: C 61.9; H 9.5; N 12.6; Summenformel: C₆₂Hi₁INn.Molecular formula: C ₆₂ Hi ₁ INn. Die Identität des Produktes wurde des weiteren durch vergleichende spektroskopische (IR, MS, ¹H-, ¹³C-NMR) Messungen sowieThe identity of the product was further determined by comparative spectroscopic (IR, MS, ¹ H, ¹³ C-NMR) measurements as well

durch vergleichende chromatographische (DC, HPLC) Untersuchungen mit authentischem Cyclosporin A bzw. durch Vergleichmit den entsprechenden Daten in der Literatur (E.Rüegger et al. 1976, HeIv. Chim. Acta 59, S. 1075) gesichert.by comparative chromatographic (TLC, HPLC) studies with authentic cyclosporin A or by comparison with the corresponding data in the literature (E. Rüegger et al., 1976, HeIv. Chim. Acta 59, p.

Die Vorteile des hier beschriebenen Herstellungsverfahrens für Cyclosporin A werden zusammenfassend gesehenThe advantages of the production process for cyclosporin A described herein are summarized

- in der Bereitstellung eines neuen Mikroorganismus, der neben dem Cyclosporin A keine weiteren, von diesem Wirkstoff schwer abtrennbaren Substanzen ins Fermentationsmedium abgibt bzw. in der Biomasse anreichert;- In the provision of a new microorganism, in addition to the Cyclosporin A no further, difficult to separate from this drug substances in the fermentation medium or accumulates in the biomass;

- in den erzielbaren hohen mikrowellen Ausbeuten;- in the achievable high microwave yields;

- in der einfachen Isolierung des Cyclosporin A in nahezu quantitativen Ausbeuten sowie- In the simple isolation of cyclosporin A in almost quantitative yields as well

- in der einfach durchzuführenden Reinigung, die bei nur geringen Ausbeuteverlustan an Wirkstoff leicht zugängliche und billige Einsatzstoffe erfordert.- In the easy to carry out cleaning, which requires easily accessible and inexpensive starting materials with only low yield loss of active ingredient.

AusführungsbolspieleAusführungsbolspiele Beispiel 1example 1 Sporensandkonserven des Stammes Tolypocladlum Inflatum SF136 werden auf Glukose-Mineralsalzagar aufgebracht, derSpore sand preserves of the strain Tolypocladlum inflatum SF136 are applied to glucose mineral salt agar, which

folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):has the following composition (g / l):

Glukose 40, (NH₄J₂SO₄ 3, KH₂PO₄1, KCI 0,25, MgSO₄ · 7H₂O 0,25, CaCO₃ 3,5, Agar 20; pH 5,3 bis 5,6(Sterilisation 30min 12O⁰C).Glucose 40, (NH ₄ J ₂ SO ₄ 3, KH ₂ PO ₄ 1, KCl 0.25, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.25, CaCO ₃ 3.5, agar 20, pH 5.3 to 5.6 (Sterilization 30min 12O ⁰ C). Nach Bebrütung der Petrischalen bei 24°C bis 25⁰C für die Dauer von 10 Tagen bis 12 Tagen werden von den entstandenenAfter incubation of the Petri dishes at 24 ° C to 25 ⁰ C for a period of 10 days to 12 days are from the resulting Einzelkolonien 0,5cm bis 1,0cm große Exemplare ausgehoben, sofern sie eine bis zu 5cm große Aufhellungszone im AgarSingle colonies 0.5cm to 1.0cm large specimens excavated, provided they have a up to 5cm large brightening zone in agar

aufweisen und auf Petrischalen mit gleichartigem Agar übertragen. Auf diesen entstehen innerhalb von 10 Tagen bis 15 Tagenand transferred to Petri dishes with similar agar. These arise within 10 days to 15 days

Einzelareale von mindestens 4cm Durchmesser, von denen die Randgebiete als Impfmaterial für die Anzucht dienen. DurchSingle areas of at least 4cm in diameter, of which the peripheral areas serve as a seed for inoculation. By Übertragung eines ca. 1,0cm² großen Rasenstückes werden die Anzuchtkolben beimpft, die in 100-ml-Steilbrustflaschen 20mlTransmission of an approximately 1.0cm ² large piece of grass, the inoculation flasks are inoculated in the 100 ml Steilbrustflaschen 20ml

des folgenden Mediums enthalten (g/l):of the following medium (g / l):

Glukose 50, Kaseinpepton 10, KH₂PO₄1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6 (Sterilisation 30min 12O⁰C).Glucose 50, casein peptone 10, KH ₂ PO ₄ 1, KCl 2.5 ad 11 aqua dest .; pH 5.3 to 5.6 (sterilization 30min 12O ⁰ C).

Nach 72stündiger Kultivierung bei 24⁰C bis 25°C auf einem Rundschwingtisch (180 rpm bis 220rpm) dient die Anzuchtpassage der Beimpfung der Hauptkultur. Diese enthält in E j-ml-Erlenmeyerkolben Jeweils 100ml des nachfolgenden Mediums (g/l): Maltose 75, Kaseinpepton 25, KH₂PO₄1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dost, sowie 1,2-Propandiol 0,5% v/v; pH 5,3 bis 5,C (Sterilisation 30min 12O⁰C). Die Vorkultur wird in einer Menge von 5% auf die Hauptkultur übertragen. Die Kultivierung erfolgt 15 Tage lang bei 24⁰C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger (180rpm-220rpm). Nach Beendigung der Fermentation wird die entstandene Biomasse durch Zentrifugation von der Kulturlösung abgetrennt und im Verhältnis 0,5:1 (v/v) mit Aceton versetzt. Nach gründlichem Aufrühren wird mindestens 24 Stunden lang die Biomasse im Aceton belassen und dann zur Wertbestimmung verwendet. Diese erfolgt in an sich bekannter Weise nach Überführung des Produktes in Chloroform, Entwässerung, Trocknung und Wiederaufnahme in Acetonitril zwecks Beschickung der HPLC-Säulen. Die Leistung derartiger Fermentationsansätze beträgt 800 Mg/m| bis 1200 Mg/ml Cyclosporin A.After 72 hours of cultivation at 24 ⁰ C to 25 ° C on a rotary table (180 rpm to 220rpm), the seedling passage of the inoculation of the main culture. This contains in E j-ml Erlenmeyer flask 100 ml each of the following medium (g / l): maltose 75, casein peptone 25, KH ₂ PO ₄ 1, KCl 2.5 ad 11 Aqua dost, and 1,2-propanediol 0.5 % v / v; pH 5.3 to 5, C (sterilization 30min 12O ⁰ C). The preculture is transferred to the main culture in an amount of 5%. The culture is carried out for 15 days at 24 ⁰ C to 25 ⁰ C on a rotary oscillator (180rpm-220rpm). After completion of the fermentation, the resulting biomass is separated by centrifugation from the culture solution and treated in the ratio 0.5: 1 (v / v) with acetone. After thorough stirring, the biomass is left in acetone for at least 24 hours and then used for the determination of value. This is carried out in a conventional manner after conversion of the product into chloroform, dehydration, drying and reuptake in acetonitrile to charge the HPLC columns. The performance of such fermentation approaches is 800 Mg / m | to 1200 mg / ml cyclosporin A.

Beispiel 2Example 2 Nach Selektion des Leistungsmaterials gemäß Beispiel 1 und analoger Anzucht werden Hauptkulturen in 500-ml-After selection of the performance material according to example 1 and analogous cultivation, main cultures are cultivated in 500 ml Erlenmeyerkolben beimpft, die jeweils 100ml des nachfolgenden Mediums enthalten (g/l):Inoculated with Erlenmeyer flasks containing 100 ml each of the following medium (g / l): Maltose 80, Kaseinpepton 20, (NH₄J₂SO₄ 5, KH₂PO₄1, KCI 0,5, MgSO₄ · 7H₂O 0,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6 (SterilisationMaltose 80, casein peptone 20, (NH ₄ J ₂ SO ₄ 5, KH ₂ PO ₄ 1, KCl 0.5, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.5 ad 11 aq., PH 5.3 to 5.6 ( sterilization

3OmIn 12O⁰C).3OmIn 12O ⁰ C).

Die Kulturbrühe weist nach 11 tägiger Kultivierung und analytischer Bestimmung gemäß Beispiel 1 einen Gehalt von 1150pg/mlAfter 11 days of culture and analytical determination according to Example 1, the culture broth has a content of 1150 pg / ml Cyclosporin A auf.Cyclosporin A on.

2 Liter der auf diese Weise gewonnenen Kulturbrühe werden separiert; hierbei werden 120g Biomasse und 1,81 Kulturfiltraterhalten. Die Biomasse wird 2mal mit je 0,31 Aceton 12 Stunden unter Rühren extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und das2 liters of the culture broth thus obtained are separated; 120 g biomass and 1.81 culture filtrate are obtained. The biomass is extracted twice with 0.31 acetone for 12 hours with stirring, the extracts are combined and the

Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C bis zur wäßrigen Phase abdestilliert. Das Kulturfiltrat wird 2mal mit je 200ml CHCI₃ extrahiert,Distilled solvent in vacuo at 30 ⁰ C to the aqueous phase. The culture filtrate is extracted twice with 200 ml CHCl ₃ each,

die vereinigten Chloroformextrakte werden im Vakuumrotationsverdampfer bet 3O⁰C eingedampft, mit dem Extrakt derthe combined chloroform extracts are evaporated in a vacuum rotary evaporator, 3O ⁰ C, with the extract of

Biomasse vereinigt und nach Zusatz von 0 S I Wasser 2mal mit je 200ml Chlorofom reextrahiert. Die vereinigten ReextrakteCombined biomass and after addition of 0 S I water reextracted twice with 200 ml Chlorofom. The united Reextrakte

werden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuumrotationsverdampfer bei 30°C abdestilliert, derdunkelgefärbte ölige Rückstand in wenig Chloroform aufgenommen und an Aluminiumoxid (neutral AK St. I) mit Chloroformchromatographiert. Fraktionen, die DC-einhei\liches Cyclosporin A enthalten, werden vereinigt, im Vakuumrotationsverdampferbei 30°C eingedampft, der schwach gelb gefärbte ölige Rückstand in wenig Chloroform aufgenommen und ein zweites Mal anare dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ , the solvent distilled off in a vacuum rotary evaporator at 30 ° C, the dark-colored oily residue taken up in a little chloroform and chromatographed on aluminum oxide (neutral AK pc. I) with chloroform. Fractions containing TLC-containing cyclosporin A are pooled, evaporated in a rotary vacuum evaporator at 30 ° C, the pale yellow colored oily residue taken up in a little chloroform and re-added a second time

Aluminiumoxid mit Chloroform chromatographiert. Die Fraktionen, die DC-einheitliches Cyclosporin A enthalten, werdenAlumina chromatographed with chloroform. The fractions containing DC-uniform cyclosporin A are

vereinigt, im Vakuumrotationsverdampfer bei 30°C eingedampft, und der nahezu farblose ölige Rückstand wird mit 40ml Hexanverrührt, wobei sich das Cyclosporin A in kristalliner Form abscheidet. Man beläßt die Cyclosporin A-Hexansuspension12 Stunden bei -5⁰C, saugt anschließend das Cyclosporin A ab, wäscht das Produkt mit kaltem Hexan und trocknet 5 Stundenbei 5O⁰C im Hochvakuum.combined, evaporated in a vacuum rotary evaporator at 30 ° C, and the nearly colorless oily residue is stirred with 40 ml of hexane, wherein the cyclosporin A is deposited in crystalline form. It leaves the cyclosporin A-Hexansuspension12 hours at -5 ⁰ C, and then sucks the cyclosporin A, washed with cold hexane and the product is dried 5 hours at 5O ⁰ C under high vacuum.

Ausbeute: 2,20g Cyclosporin A (94%iges Produkt) & 2,09g Cyclosporin A (100%iges Produkt) ^ 87% Ausbeute, bezogen aufYield: 2.20g Cyclosporin A (94% product) & 2.09g Cyclosporin A (100% product) → 87% yield, based on

den analytisch bestimmten Gehalt von 1,2 g Cyclosporin A/I KB in der Kulturbrühe.the analytically determined content of 1.2 g cyclosporin A / I KB in the culture broth.

Zur Feinstreinigung (100%iges Produkt) wird das Cyclosporin A aus Ether/Hexan umgefällt oder aus Aceton umkristallisiert und im Hochvakuum bei 5O⁰C getrocknet.To fine cleaning (100% product) is reprecipitated, the cyclosporin A from ether / hexane or recrystallized from acetone and dried under high vacuum at 5O ⁰ C.

Beispiel 3Example 3

2 Liter der nach Beispiel 2 gewonnenen Kulturbrühe (mit 1,2g Cyclosporin A/l) werden auf 20°C abgekühlt und separiert. Manerhält 250g feuchte Biomasse, die dreimal mit Essigester (2 χ 11 und 1 χ 200 ml) jeweils 1 Stunde ausgerührt wird. Dieabdekandierten Extrakte werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das so erhaltenebraungefärbte ölige Rohprodukt (8,9g) enthält 2,11 g Cyclosporin A (88% Ausbeute). Die Ausbeuten der e'nzelnen2 liters of the culture broth obtained according to Example 2 (with 1.2 g of cyclosporin A / l) are cooled to 20 ° C. and separated. It contains 250g wet biomass, which is stirred three times with ethyl acetate (2 χ 11 and 1 χ 200 ml) for 1 hour each. The decanted extracts are combined, dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The resulting brown colored oily crude product (8.9 g) contains 2.11 g of cyclosporin A (88% yield). The yields of the individual

Extraktionsstufen betragen bei der 1. Extraktion 75% (1,8g CyA), bei der 2.Extraktion 12%(u,3g CyA) unr ^: der 3.ExtraktionExtraction stages are 75% (1.8 g CyA) for the 1st extraction, and 12% (u, 3g CyA) for the 2nd extraction ^: the 3rd extraction

0,5% (0,01 g CyA).0.5% (0.01 g CyA).

Zur weiteren chromatographischen Reinigung des Cyclosporins A werden 60g Kieselgel (Korngröße 0,062 mm bis 0,2 mm) inFor further chromatographic purification of the cyclosporin A 60 g of silica gel (particle size 0.062 mm to 0.2 mm) in Chloroform eingeschlämmt und in eine Säule (2,5cm x 50cm) eingefüllt. 1,5g des erhaltenen Rohproduktes werden in 15mlChloroform slurried and filled into a column (2.5cm x 50cm). 1.5 g of the crude product obtained are dissolved in 15 ml Chloroform/Methanol (99:1, v/v) gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution wird mit dem gleichen LösungsmittelsystemChloroform / methanol (99: 1, v / v) dissolved and applied to the column. The elution is done with the same solvent system

durchgeführt. Die einzelnen Fraktionen zu jeweils 10ml werden dünnschichtchromatographisch überprüft. Die Cyclosporin A-enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.carried out. The individual fractions of 10 ml each are checked by thin-layer chromatography. The cyclosporin A-containing fractions are combined and the solvent distilled off in vacuo.

Ausbeute: 422mg (80%CyA = 338mg CyA) £ 95%Ausbeute.Yield: 422 mg (80% CyA = 338 mg CyA) 95% yield. Zur Feinreinigung erfolgt eine nochmalige Chromatographie an Kieselgel mit dem Elutionssystem Essigester/Isopropanol (95:5,For fine cleaning, a repeated chromatography on silica gel with the elution system ethyl acetate / isopropanol (95: 5,

v/v). Fraktionen, die DC-einheitliches Cyclosporin A enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Derverbleibende farblose Rückstand wird mit η-Hexan verrührt und über Nacht im Kühlschrank belassen. Das Cyclosporin A wirddann abgesaugt, mit kaltem Hexan gewaschen und über Calciumchlorid getrocknet; man erhält 95%iges Cyclosporin A.v / v). Fractions containing DC uniform cyclosporin A are combined and concentrated to dryness in vacuo. The remaining colorless residue is stirred with η-hexane and left in the refrigerator overnight. The cyclosporin A is then aspirated, washed with cold hexane and dried over calcium chloride; 95% cyclosporin A is obtained.

Anlage 1Attachment 1

Species von cyclosporinbildenden Pilzen:Species of cyclosporin-forming fungi: Acremonium sp. S 42160/FAcremonium sp. S 42160 / F Paecilomycessp.S 84-21622/FPaecilomycessp. S 84-21622 / F Verticilliumsp.85-22022/F . hrcvciiqc μ μ iqqrVerticillium sp.85-22022 / F. hrcvciiqc μ μ iqqr

Isariafelina(DCperFR) ?!ί^4'«^Isariafelina (DCperFR)?! Ί ^ 4 '«^

Fr.,S249/F Sydowia 39,12-36Fr., S249 / F Sydowia 39,12-36

Neocosmosporavasinfecta E.F.Smith Tolypocladium geodes GAMS CBS 723.70Neocosmosporavasinfecta E.F. Smith Tolypocladium geodes GAMS CBS 723.70

TrichodermavirideTrichodermaviride GAUZE, G. F., et al. 1983,GAUZE, G.F., et al. 1983 Antibiotiki 28,243-245Antibiotics 28,243-245 Fusariumsolani SAWAI etal. 1981,Fusariumsolani SAWAI et al. 1981 Agric. Biol. Chem. 45,5,Agric. Biol. Chem. 45.5,

1223-12281223-1228

JP-138523JP-138523

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A durch sterile aerobe Fermentation eines Mikroorganismus über eine Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen auf einem Medium mit organischem Stickstoff-Substrat, Kohlehydraten und Mineralsalzen bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 2O⁰C bis 30⁰C sowie durch Gewinnung des Produkts aus Biomasse und Kulturfiltrat, gekennzeichnet dadurch, daß man1. A process for the preparation of cyclosporin A by sterile aerobic fermentation of a microorganism over a period of 10 days to 15 days on an organic nitrogen substrate medium, carbohydrates and mineral salts at pH values in the range of pH 3.2 to pH 7, 5 and at temperatures from 2O ⁰ C to 30 ⁰ C and by recovering the product from biomass and culture filtrate, characterized in that - für die über die Stufen der Vor- und Hauptkultur geführte Fermentation den Stamm Tolypocladlum Inflatum SF136 einsetzt sowie- for the pre-culture and main-culture fermentation using the Tolypocladlum Inflatum SF136 strain, and - im Aufarbeitungsteil des Verfahrens an eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln eine Reinigung durch Chromatographie und gegebenenfalls durch Umkristallisation anschließt.- In the workup part of the process to an extraction with organic solvents followed by purification by chromatography and optionally by recrystallization. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Vorkultivierungsstufe dunkelbraun pigmentierte Einzelkolonien von Stamm T.inflatum SF136, erhalten nach emerser Kultivierung auf Mineralsalzagar mit Ammoniumsalz als einziger Stickstoff- sowie Glukose als einziger Kohlenstoffquelle, einsetzt.2. The method according to claim 1, characterized in that in the Vorkultivierungsstufe dark brown pigmented individual colonies of strain T.inflatum SF136, obtained after emerser cultivation on mineral salt agar with ammonium salt as sole nitrogen and glucose as the sole carbon source, is used. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Vorkultivierungsstufe dunkelbraun pigmentierte Einzelkolonien von Stamm T.inflatum SF136, erhalten nach emerser Kultivierung auf Mineralsalzagar mit Ammoniumsalz als einziger Stickstoff- sowie Maltose als einziger Kohlenstoffquelle, einsetzt.3. The method according to claim 1, characterized in that in the Vorkultivierungsstufe dark brown pigmented individual colonies of strain T.inflatum SF136, obtained after emerser cultivation on mineral salt agar with ammonium salt as sole nitrogen and maltose as the sole carbon source, is used. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Extraktion des Cyclosporin A aus der Biomasse Aceton, Essigester und/oder Butylacetat verwendet.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that one uses for the extraction of cyclosporin A from the biomass acetone, ethyl acetate and / or butyl acetate. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man zur chromatographischen Reinigung des Cyclosporin A Aluminiumoxid als Adsorbens und Chloroform als Eluent verwendet.5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that one uses for the chromatographic purification of cyclosporin A alumina as adsorbent and chloroform as the eluent.