DD298269A5

DD298269A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF FOREIGN PROTEINS IN ANIMAL CELLS

Info

Publication number: DD298269A5
Application number: DD32025288A
Authority: DD
Inventors: Michael Strauss; Andre Lieber; Udo Kiessling; Mathias Platzer; Helga Waehlte
Original assignee: Zi F. Molekularbiologie,De
Priority date: 1988-09-29
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1992-02-13

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in tierischen Zellen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die biotechnologische Produktion von Wirkstoffen und Vakzinen. Es werden Helferzellen fuer die Erreichung einer maximalen Genkopiezahl sowie zur effektiven Expression heterologer Promotoren mit einer prokaryotischen Polymerase hergestellt. Dieses doppelte Helferzellsystem mit einem UEberschusz an RNA-Polymerase und regulierbarer Kopiezahl des Fremdgens unter Kontrolle eines prokaryotischen Promoters gestattet die maximale Synthese eines Fremdgenprodukts in permanenten Zellen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dasz die prokaryotische Polymerase im Zellkern der Wirtszelle wahlweise durch Induktion der Vektorreplikation mit Genkopien gesaettigt wird und durch Ruecknahme der Induktion eine Erholung der Zellen gewaehrleistet ist. Dadurch kann fuer jedes Genprodukt ein optimales Langzeit-Produktionsschema individuell festgelegt werden.{Fremdproteine; Zellen, tierische; Helferzellen; Genkopiezahl, maximale; Promotoren, heterologe; Polymerase, prokaryotische; Induktion; Vektorreplikation}The invention relates to a process for the production of foreign proteins in animal cells. Field of application of the invention is the biotechnological production of active substances and vaccines. Helper cells are produced to achieve maximum gene copy number and to effectively express heterologous promoters with a prokaryotic polymerase. This dual helper cell system with an excess of RNA polymerase and a controllable copy number of the foreign gene under the control of a prokaryotic promoter allows for the maximum synthesis of a foreign gene product in permanent cells. The invention is characterized in that the prokaryotic polymerase in the cell nucleus of the host cell is optionally saturated by induction of vector replication with gene copies and recovery of the cells is ensured by the withdrawal of the induction. As a result, an optimal long-term production scheme can be determined individually for each gene product. Cells, animal; Helper cells; Gene copy number, maximum; Promoters, heterologous; Polymerase, prokaryotic; Induction; Vector replication}

Description

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Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in tierischen Zellen, das zur maximalen Expression fremder Gene geeignet ist. Diese neuartige Wirts-Vektor-System findet Anwendung bei der biotechnologischen Produktion von Wirkstoffen und Vakzinen.The invention relates to a method for the production of foreign proteins in animal cells, which is suitable for the maximum expression of foreign genes. This novel host-vector system finds application in the biotechnological production of drugs and vaccines.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die Verwendung tierischer Zellinien ist in dor biotechnologischen Wirkstoff- und Vakzineproduktion seit vielen Jahren üblich. Durch Einführung der entsprechenden Gene läßt sich der Ertrag gegenüber natürlicherweise produzierten Zellinien häufig, aber nicht immer, wesentlich steigern. Die Effektivität der Produktbildung durch fremde Gene wird durch drei Parameter bestimmt: (1) die Transkription (mRNA-Synthese), (2) die Translation (Proteinsynthese) und (3) den Proteintransport. Während der Transport zum größten Teil von der Struktur des Proteins selbst abhängig ist und damit kaum beeinflußbar zu sein scheint, sind die beiden anderen Parameter teilweise von den das Strukturgen flankierenden DNA-Sequeruan, aber auch von der Verfügbarkeit zellulärer Transkriptionsfaktoren abhängig. Der Promotor des Fremdgens konkurriert mit den zellulären Genen um diese Faktoren und um die RNA-Polymerase. Damit wird das Ausmaß der Transkription auf ein Niveau begrenzt, daß nicht wesentlich über dem von effektiv abgelesenen zellulären Genen liegt und z. B. weit hinter der Expression viraler Gene bei einer Virusinfektion zurückbleibt. Letzteres schließt aber auch Amplifikation durch Replikation ein und endet letztendlich mit dem Zclltod.The use of animal cell lines has been common in biotechnological drug and vaccine production for many years. By introducing the appropriate genes, the yield can be increased significantly, but not always substantially, over naturally produced cell lines. The effectiveness of product formation by foreign genes is determined by three parameters: (1) transcription (mRNA synthesis), (2) translation (protein synthesis), and (3) protein transport. While most of the transport depends on the structure of the protein itself and thus appears to be hardly influenced, the other two parameters depend in part on the DNA sequencan flanking the structural gene, but also on the availability of cellular transcription factors. The promoter of the foreign gene competes with the cellular genes for these factors and for the RNA polymerase. Thus, the level of transcription is limited to a level not significantly above that of effectively read cellular genes, e.g. B. remains far behind the expression of viral genes in a viral infection. The latter, however, also includes amplification by replication and ultimately ends with Zclltod.

Es muß eine Lösung gefunden werden, die zwar eine stärkere Transkription - als normalerweise in tierischen Zellen üblich erlaubt, aber gleichzeitig das Ausmaß der Amplifikation durch regulierte Replikation in Grenzen hält, so daß die Langzeitkultivierung maximal produzierender Zellen möglich wird.A solution must be found which, while permitting greater transcription than usual in animal cells, will at the same time limit the extent of amplification through regulated replication, thus permitting the long-term cultivation of maximally producing cells.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Zie< der Erfindung besteht in der Erzeugung von tierischen Zeilklonen für die Herstellung beliebiger Fremdproteine, die maximale Fremdproteinausbeuten liefern und gleichzeitig für die Langzeitkultivierung geeignet sind.The object of the invention is the production of animal cell clones for the production of any foreign proteins that provide maximum foreign protein yields and are simultaneously suitable for long-term cultivation.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Aufgt be der Erfindung ist es, prinzipiell nutzbares System zur Fremdgenexpression in tierischen Zellen zu schaffen, bei dem die Ablesung des Fremdgens von der zellulären Transkriptionsmaschinerie weitgehend unabhängig ist und gleichzeitig eine maximale und regulierbare Kopiezahl des Fremdgens erreicht wird.Aufgt be the invention is to provide in principle usable system for foreign gene expression in animal cells, in which the reading of the foreign gene of the cellular transcription machinery is largely independent and at the same time a maximum and regulable copy number of the foreign gene is achieved.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem zunächst ein die Replikation stimulierendes virales Gen unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors in tierische Zellen eingebracht wird. Die gewonnenen Zellen erhalten durch einen weiteren Gentransfer ein prokaryotisches RNA-Polymerase-Gen, das durch Anfügung eines Kernlokalisierungssignals und eines tierischen Promotors in den Zellen exprimiert wird und den Transport seines Produkts in den Zellkern gestattet. In diese Zellen wird anschließend ein Vektor eingebracht, der eine virale Replikationsstartsequenz, ein Selektionsgen und einen zur RNA-Polymeras'e homologen prokaryotischen Promotor enthält und bei dem ein Fremdgen unter Kontrolle des prokaryotischen Promotors gebracht wurde. Durch Induzierung des regulierbaren Promotors vor dem Replikationsgen wird die Replikation des Vektors stimuliert, wodurch eine große Zahl von Genkopien zur Transkription mit der prokaryotischen Polymerase verfügbar wird. Durch Entzug des Induktors wird die Replikation wieder gedrosseltThe object is achieved according to the invention by first introducing a replication-stimulating viral gene into animal cells under the control of a regulatable promoter. The cells obtained, by further gene transfer, receive a prokaryotic RNA polymerase gene which is expressed by the addition of a nuclear localization signal and an animal promoter in the cells and allows the transport of its product into the cell nucleus. A vector is then introduced into these cells, which contains a viral replication start sequence, a selection gene and a prokaryotic promoter which is homologous to the RNA polymerase and in which a foreign gene has been brought under the control of the prokaryotic promoter. By inducing the regulatable promoter in front of the replication gene, replication of the vector is stimulated, thereby making available a large number of gene copies for transcription with the prokaryotic polymerase. Withdrawal of the inductor restricts replication

Folgende erfindungsgemäße Verfahrensschritte werden durchgeführt: The following method steps according to the invention are carried out:

1. Das als Replikationsgen verwendete T-Antigen-Gen eines Papuvavirus wird ohne eigenen Promotor isoliert und an einen fremden Promotor gekoppelt, der vorzugsweise durch Glukokor llkosteroidhormone regulierbar ist. Dabei wird bevorzugt das Groß-T-Antigen-Gen des Polyomavirus sowie der Promotor des Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV) verwendet. Die resultierende Rekombinante (z.B. pLT2-MMTV2, WP C12N/315016.8) wird zusammen mit einem Selektionsgen, bevorzugt dem Metallothionein-Gen in Form von pMT-l (Glanville et al. [1981] Nature 292,267), in eine beliebige tierische Zellinie transfiziert. Bei Verwendung des Polyoma-Groß-T-Antigens werdon Nagerzellinien (Maus, Ratte, Hamster) eingesetzt. Nach der Transfektion wird auf Anwesenheit des Metallothionein-Gens mit Schwermetallen, bevorzugt mit Cadmiumsulfat, selektiert. In den gewonnenen Zellkolonien wird T-Antigen mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen und zwar sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Induktors für den Promotor, z. B. Dexamethasone (10⁸M) im Falle des MMTV-Promotors. Ein Zellklon mit möglichst großer Differenz zwischen nichtinduziertem und induziertem T-Antigen wird für die weiteren Arbeiten ausgewählt.1. The T antigen gene used as a replication gene Papuvavirus is isolated without its own promoter and coupled to a foreign promoter, which is preferably regulated by glucocorticoid hormones. In this case, preferably the large T-antigen gene of the polyomavirus and the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter are used. The resulting recombinant (eg pLT2-MMTV2, WP C12N / 315016.8) is transfected into any animal cell line together with a selection gene, preferably the metallothionein gene in the form of pMT-1 (Glanville et al. (1981) Nature 292, 267). When using the polyoma large T antigen, rodent cell lines (mouse, rat, hamster) are used. After transfection, the presence of the metallothionein gene with heavy metals, preferably with cadmium sulfate, is selected. In the cell colonies obtained, T antigen is detected by immunofluorescence, both in the presence and absence of the inducer for the promoter, e.g. B. dexamethasone (10 ⁸ M) in the case of the MMTV promoter. A cell clone with the greatest possible difference between uninduced and induced T antigen is selected for further work.

2. In den ausgewählten Zellklon wird ein modifiziertes prokaryotisches RNA-Polymerase-Gen eingebracht.2. A modified prokaryotic RNA polymerase gene is introduced into the selected cell clone.

Das RNA-PoIymeras3-Gen, bevorzugt das des Phagen T7, wird zuvor am N-Terminus durch Anfügen eines eukaryotischen Kernlokalisierungssignals und eines tierischen Promotors modifiziert. Dabei wird vorzugsweise das Kernlokalisierungssignal des T-Antigens von Virus SV40 in Form einer synthetisch hergestellten DNA-Sequenz und der Promotor des Metallothionein-Gens verwendet. Oie bevorzugt synthetisch hergestellte DNA-Sequenz kodiert die Aminosäuresequenz: Met-Asp-Lys-Val-Phe-Arg-Asn-Se'-Ser-Arg-Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-Arg-Leu-Asp.The RNA polymerase 3 gene, preferably that of phage T7, is previously modified at the N-terminus by adding a nuclear eukaryotic signal and an animal promoter. Preferably, the nuclear localization signal of the T antigen of virus SV40 in the form of a synthetically produced DNA sequence and the promoter of the metallothionein gene is used. The preferred synthetic DNA sequence encodes the amino acid sequence: Met-Asp-Lys-Val-Phe-Arg-Asn-Se'-Ser-Arg-Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val Glu-Arg-Leu-Asp.

Die Rekombinprtte mit modifiziertem RNA-Polymerase-Gen (z. B. pMTT7 N, Abb. 1) wird zusammen mit einem anderen Selektionsger, als unter Punkt 1 beschrieben, vorzugsweise dem Hygromyzin-Resistenzgen in Form des Plasmids pY3 (Blochlinger und Diggelmann (1984] Mol.Cell. Biol.4,1929) in den ausgewählten Zellklon transfiziert. Nach Selektion mit Hygrcmyzin werden Kolonien isoliert und auf Vorhandensein der modifizierten RNA-Polymerase im Zellkern geprüft, bevorzugt m ttels Immunfluoreszenz und in vitro Transkription mit Kernextrakten. So wird die erfindungsgemäße Expressions; ellinie PMLTT7 N erhalten, die in Kombination mit einem geeigneten Vektor zur Expression von Fremdgenen eingesetzt wird. Die erfindungsgemäße Zellinie PMLTT7 N wurde im Zentralinstitut für Molekularbiologie in der Hinterlegungsstelle für Zellinien unter der Nr. 0382 hinterlegt.The recombinant strain with modified RNA polymerase gene (eg pMTT7 N, FIG. 1) together with another selection gene, as described under point 1, preferably the hygromycin resistance gene in the form of the plasmid pY3 (Blochlinger and Diggelmann (1984 After selection with hygrmycin, colonies are isolated and assayed for the presence of the modified RNA polymerase in the cell nucleus, preferably by immunofluorescence and in vitro transcription with nuclear extracts PMLTT7 N expression line according to the invention, which is used in combination with a suitable vector for the expression of foreign genes The cell line PMLTT7 N according to the invention was deposited in the Central Institute for Molecular Biology in the depository for cell lines under the number 0382.

3. Der Vektor wird hergestellt, indem in ein bekanntes bakterielles Plasmid, bevorzugt ein pUC-Plasmid, nacheinander 3 Komponenten kloniert werden: Erstens ein Selektionsgen, bevorzugt das neo-Gen (Southern und Berg [1982) J.Mol. Appl.Genet. 1,327); Zweitens die Replikationsstart-Sequenz des unter Punkt 1 gewählten Papovavirus, bevorzugt des Polyomavirus; Drittens der zum Punkt 2 gewällten RNA-Polymerase-Gen homologen Promotor, bevorzugt ein auf der Basis bekannter Sequenzen (Dunn und Studier (19831 J.Mol. Biol. 166,477) synthetisierter T7-Promotor. Hinter dem Promotor befinden sich mehrere Restriktionsorte zur Klonierung von Frem^genen (Abb. 2).3. The vector is prepared by sequentially cloning into a known bacterial plasmid, preferably a pUC plasmid, 3 components: First, a selection gene, preferably the neo gene (Southern and Berg [1982] J. Mol. Appl.Genet. 1.327); Secondly, the replication start sequence of the papovavirus selected under point 1, preferably of the polyomavirus; Third, the RNA polymerase gene homologous promoter targeted for point 2, preferably a T7 promoter synthesized on the basis of known sequences (Dunn and Studier (19831 J. Mol., Biol., 166, 477).) Behind the promoter are several restriction sites for the cloning of Alienated (Fig. 2).

4. Das Fremdgen wird ohne eignen Promotor in einen Restriktionsort hinter den synthetischen Promotor kloniert, und die resultierende Rekombinante wird in die Expressionszellen transfiziert. Durch Selektion mit Geneticin werden Kolonien erhalten, in denen der Vektor extrachromosomal repliziert und das Fremdgen von der modifizierten Polymerase abgelesen wird. Die Genkopiezahl und damit auch die Expression wird durch Stimulierung der T-Antigen-Synthese mit dem entsprechenden Induktor, bevorzugt Dexamethason, erhöht. Zellen werden in der Massenkultur mehrere Tage im induzierten Zustand gehalten, und das Produkt wird aus dem Kulturmedium gewonnen. Zur Regenerierung der Zellen wird gegebenenfalls für mehrere Tage die Hormoninduktion abgesetzt.4. The foreign gene is cloned without a suitable promoter in a restriction site behind the synthetic promoter, and the resulting recombinant is transfected into the expression cells. By selection with geneticin, colonies are obtained in which the vector is replicated extrachromosomally and the foreign gene is read from the modified polymerase. The gene copy number and thus the expression is increased by stimulating the T-antigen synthesis with the corresponding inducer, preferably dexamethasone. Cells are maintained in the induced state for several days in mass culture, and the product is recovered from the culture medium. To regenerate the cells, the hormone induction is optionally discontinued for several days.

Als Fremdgene können beliebige Wirkstoffgene, wie z.B. dasjenige für Wachstumshorm, Gewebeplasminogenaktivator, Interleukine, Interferone, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Erythropoietin u.a. oder virale Antigen-Gene wie diejenigen des Hepatitis-Virus, des Influenza-Virus, AIDS-Virus,Maul- und Klauen-Seuche-Virus u. a. einkloniert und verwendet werden.As foreign genes, any active substance genes, such as that for growth hormone, tissue plasminogen activator, interleukins, interferons, growth factors, blood coagulation factors, erythropoietin, and the like. or viral antigen genes such as those of the hepatitis virus, influenza virus, AIDS virus, foot-and-mouth disease virus and the like. a. be cloned and used.

Der Vorteil der Erfindung besteht in einer von der zellulären Expressionsmaschinerie weitgehend unabhängigen Ablesung desThe advantage of the invention consists in a largely independent of the cellular expression machinery reading of the Fremdgens sowie einer besseren Ausnutzung der Transkriptionsfähigkeit der prokaryotischön Polymerase durch Erhöhung derFremdgens and a better exploitation of the transcription ability of the prokaryotic polymerase by increasing the Genkopiezahl. Dadurch, daß die prokaryotische Polymerase im Zellkern der Wirtszelle wahlweise durch Induktion derGene copy number. The fact that the prokaryotic polymerase in the cell nucleus of the host cell optionally by induction of the Vektorreplikation mit Genkopien gesättigt wird utid durch Rücknahme der Induktion eine Erhöhung der Zellen gewährleistet ist,Vector replication is saturated with gene copies utid is ensured by withdrawal of induction an increase in cells

kann für jedes Genprodukt ein optimales Langzeit-Produktionsschema indiviuell festgelegt werden.For each gene product, an optimal long-term production scheme can be defined individually.

Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird damit ein prinzipiell nutzbares System zur Fremdproteinsynthese in tierischen ZellenThe solution according to the invention thus becomes a system which can be used in principle for foreign protein synthesis in animal cells

bereitgestellt. Die erfindungsgemäß hergestellten Zeilklone liefern maximale Fremdproteinausbeuten und sind gleichzeitig fürdie Langzeitkultivierung geeignet.provided. The cell clones prepared according to the invention provide maximum foreign protein yields and are at the same time suitable for long-term cultivation.

Für verschiedene Proteine können Syntheseleistungen von mehr als 50pg/ml Medium/10⁶ Zellen/Tag erreicht werden.For different proteins, synthesis efficiencies of more than 50pg / ml medium / 10 ⁶ cells / day can be achieved.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in tierischen Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Rekombinante, die ein die Vektorreplikation stimulierendes virales Gen (Replikationsgen) unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors enthält, mittels Transfektion in tierische Zellen einbringt, die Zellklone mit möglichst großer Differenz zwischen nichtinduziertem und induziertem Replikationsgenprodukt selektiert, in einen ausgewählten Klon eine Rekombinante transfiziert, die ein mit einem tierischen Kernlokalisierungssignal modifiziertes prokaryotisches RNA-Polymerase-Gen, das an einen tierischen Promotor gekoppelt ist, enthält, einen Zellklon mit kernlokalisierter RNA-Polymerase selektiert, nachfolgend in diesen Zellklon einen Expressionsvektor einbringt, der eine virale Replikationsstartsequenz, ein Selektionsgen, einen zur RNA-Polymerase homologen prokaryotischen Promotor und unter Kontrolle dieses Promotors das für das entsprechende Fremdprotein kodierende Gen trägt, den Zellklon mit der höchsten Fremdproteinsynthese auswählt und unter Zugabe eines Induktors fermentiert.1. A process for the production of foreign proteins in animal cells, characterized in that a recombinant which contains a vector replication-stimulating viral gene (replication gene) under the control of a regulatable promoter by transfection into animal cells, the cell clones with the greatest possible difference between uninduced and induced replication gene product, transfecting into a selected clone a recombinant containing a prokaryotic RNA polymerase gene, coupled to an animal nuclear localization signal, coupled to an animal promoter, a cell clone with nuclear localized RNA polymerase, hereinafter referred to as Cell clone introduces an expression vector carrying a viral replication start sequence, a selection gene, a homologous to the RNA polymerase prokaryotic promoter and under control of this promoter which codes for the corresponding foreign protein gene , selects the cell clone with the highest foreign protein synthesis and fermented with the addition of an inducer.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Replikationsgen ein T-Antigen-Gen von Papovaviren verwendet wird und der Expressionsvektor die Replikationsstartsequenz eines Papovavirus trägt.2. The method according to claim 1, characterized in that a T-antigen gene of papovavirus is used as the replication gene and the expression vector carries the replication start sequence of a papovavirus.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Replikationsgen das Groß-T-Antigen-Gen von Polyomavirus verwendet wird und der Expressionsvektor die Replikationsstartsequenz des Polyomavirus trägt.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the replication gene, the large-T antigen gene of polyomavirus is used and the expression vector carries the replication start sequence of the polyomavirus.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als regulierbarer Promotor ein Glukokortikosteroid-stimulierbarer Promotor verwendet wird.4. The method according to claim 1, characterized in that a glucocorticosteroid-stimulable promoter is used as a regulatable promoter.

5. Verfahren nach Anpruch 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß als regulierbarer Promotor der des Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV-Promotor) verwendet wird.5. The method according to claims 1 and 4, characterized in that is used as the regulatable promoter of the mouse mammary tumor virus (MMTV promoter).

6. Verfahren nach Anspruch 1,3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß als Rekombinante mit Replikationsgen und regulierbarem Promotor das Plasmid pLT2-MMTV2 eingesetzt wird.6. The method according to claim 1,3 and 5, characterized in that the recombinant with replication gene and regulatable promoter, the plasmid pLT2-MMTV2 is used.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Transfektion der Rekombinante mit Replikationsgen und regulierbarem Promotor in tierischen Zellen in an sich bekannter Weise zusammen mit einem Selektionsgen durchgeführt wird.7. The method according to claim 1 and 6, characterized in that the transfection of the recombinant with replication gene and regulatable promoter in animal cells in a conventional manner is carried out together with a selection gene.

8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß als Selektionsgen das Metallothioneingen verwendet wird.8. The method according to claim 7, characterized in that the Metallothioneingen is used as selection gene.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als prokaryotisches RNA-Polymerase-Gen ein Phagen-RNA-Polymerase-Gen verwendet wird und der Expressionsvektor den entsprechend homologen prokaryotischen Promotor trägt.9. The method according to claim 1, characterized in that a phage RNA polymerase gene is used as the prokaryotic RNA polymerase gene and the expression vector carries the corresponding homologous prokaryotic promoter.

10. Verfahren nach Anspruch 1 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß als prokaryotisches RNA-Poiymerase-Gen das des Bakteriophagen T7 verwendet wird und der Expressionsvektor einen Promotor des Bakteriophagen T7 trägt.10. The method according to claim 1 and 9, characterized in that the prokaryotic RNA Poiymerase gene of the bacteriophage T7 is used and the expression vector carries a promoter of bacteriophage T7.

11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als tierischer Promotor der Metallothionein-Promotor der Maus verwendet wird.11. The method according to claim 1, characterized in that the metallothionein promoter of the mouse is used as an animal promoter.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als tierisches Kernlokalisierungssignal 6in synthetisches Kernlokalisierungssignal, das vom Groß-T-Antigen des Virus SV40 abgeleitet ist, verwendet wird.12. The method according to claim 1, characterized in that is used as animal nuclear localization signal 6in synthetic nuclear localization signal derived from the major T-antigen of the SV40 virus.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 9-12, gekennzeichnet dadurch, daß als Rekombinante mit modifiziertem prokaryotischem RNA-Polymerase-Gen und tierischem Promotor die Rekombinante pMTT7 N (Abb. 1) eingesetzt wird.13. The method according to claim 1 and 9-12, characterized in that the recombinant pMTT7 N (Fig. 1) is used as a recombinant with modified prokaryotic RNA polymerase gene and animal promoter.

14. Verfahren nach Anspruch 12 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Rekombinante pMTT7N hergestellt wird durch Substitution des kleinen Bglll/Smal-Fra&ments des Plasmids pMK-deltaPvu mit dem kompletten T7-Polymerase-Gen, Herausspaltung des Bglll/Nrul-Fragments des Polymerase-Gens und Einbau an die Stelle des herausgespaltenten Fragments des synthetischen Kernlokalisierungssignals mit Bglll/Nrul-kompatiblen Enden.14. The method according to claim 12 and 13, characterized in that the recombinant pMTT7N is prepared by substitution of the small Bglll / SmaI fragment of the plasmid pMK-deltaPvu with the complete T7 polymerase gene, cleavage of the Bglll / Nrul fragment of the polymerase Gene and incorporation in place of the cleaved fragment of the synthetic nuclear localization signal with BglII / Nrul compatible ends.

15. Verfahren nach Anspruch 12 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß als synthetisches Kernlokalisierungssignal eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz Met-Asp-Lys-Val-Phe-Arg-Asn-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-Arg-Leu-Aspko iert, eingesetzt wird.15. The method according to claim 12 and 14, characterized in that as a synthetic nuclear localization signal, a nucleotide sequence having the amino acid sequence Met-Asp-Lys-Val-Phe-Arg-Asn-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Pro-Lys- Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-Arg-Leu-Aspko iert, is used.

16. Verfahren nach Anspruch 1 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß die flekombinante mit modifiziertem prokaryotischem RNA-Polymerase-Gen und tierischem Promotor in einen Zeilklon mit möglichst großer Differenz zwischen nichtinduzierter und induzierter Replikationsgen-Expression in an sich bekannter Weise zusammen mit einem anderen Selektionsgen als in den Ansprüchen 7 und 8 transfiziert wird.16. The method according to claim 1 and 13, characterized in that the flekombinante modified prokaryotic RNA polymerase gene and animal promoter in a cell clone with the greatest possible difference between uninduced and induced replication gene expression in a conventional manner together with another selection gene as transfected in claims 7 and 8.

17. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß als Selektionsgen das Hygromyzinresistenzgen verwendet wird.17. The method according to claim 16, characterized in that the hygromycin resistance gene is used as selection gene.

18. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß die Auswahl derZellklone mit kernlokalisierter RNA-Polymerase mittels Immunfluoreszenz und Polymerasetest durchgeführt wird.18. Method according to claim 1, characterized in that the selection of cell clones with nuclear-localized RNA polymerase is carried out by immunofluorescence and polymerase assay.

19. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch,daß der Expressionsvektor einen natürlichen oder synthetischen zur RNA-Polymerase homologen prokaryotischen Promotor trägt.19. The method according to claim 1, characterized in that the expression vector carries a natural or synthetic to RNA polymerase homologous prokaryotic promoter.

20. Verfahren nach Anspruch 1,3,10 und 19, gekennzeichnet dadurch, daß als Expressionsvektor ein Plasmid hergestellt wird, das die Replikationsstartsequenz des Polyomavirus, einen synthetischen T7-Phagen-Promotor und als Selektionsgen das neo-Gen trägt.20. The method according to claim 1, 3, 10 and 19, characterized in that an expression vector which produces a plasmid carrying the replication start sequence of the polyomavirus, a synthetic T7 phage promoter and, as selection gene, the neo gene is produced.

21. Verfahren nach Anspruch 1,9,19 und 20, gekennzeichnet dadurch, daß das für das entsprechende Fremdprotein kodierende Gen in den Expressionsvektor in einen Polylinker in Leserichtung hinter den Promotor kloniert wird.21. The method according to claim 1, 9, 19 and 20, characterized in that the gene coding for the corresponding foreign protein is cloned into the expression vector into a polylinker in the reading direction behind the promoter.

22. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Transfektion des Expressionsvektors in die Zeilklone mit Replikationsgen und kernlokalisierter RNA-Polymerase in an sich bekannter Weise durchgeführt und auf Vorhandensein des neo-Gens selektiert wird.22. The method according to claim 1, characterized in that the transfection of the expression vector is performed in the cell clones with replication gene and nuclear-localized RNA polymerase in a conventional manner and selected for the presence of the neo gene.

23. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Induktor zur Stimulierung der Vektorreplikation dem Medium Glukokortikosteroide zugesetzt werden.23. The method according to claim 1 and 4, characterized in that are added as an inducer for stimulating vector replication glucocorticosteroids the medium.

24. Verfahren nach Anspruch 1,5 und 23, gekennzeichnet dadurch, daß als Induktor 10~⁸ bis 10"⁶M Dexamethason zugesetzt werden.24. The method according to claim 1,5 and 23, characterized in that are added as an inductor 10 ~ ⁸ to 10 " ⁶ M dexamethasone.

25. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als tierische Zellen Zellinien oder Primärzellen beliebiger Spezies oder Organherkunft verwendet werden.25. The method according to claim 1, characterized in that are used as animal cells cell lines or primary cells of any species or origin of the organ.

26. Verfahren nach Anspruch 1,3 und 25, gekennzeichnet dadurch, daß als tierische Zellen Zellinien oder Primärzellen von Nagetieren eingesetzt werden.26. The method according to claim 1,3 and 25, characterized in that cell lines or primary cells of rodents are used as animal cells.

27. Verfahren nach Anspruch 1 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß in den Expressionsvektor als Fremdgen ein Wirkstoffgen wie dasjenige für Wachstumshormon, Gewebeplasminogenaktivator, Interleukine, Interferone, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Erythropoitin oder ein virales Antigen-Gen wie diejenigen des Hepatitis B-Virus, Influenza-Virus, AIDS-Virus, Maul- und Klauen-Seuche-Virus einkloniert wird.27. The method according to claim 1 and 21, characterized in that in the expression vector as a foreign gene, a drug gene such as that for growth hormone, tissue plasminogen activator, interleukins, interferons, growth factors, blood coagulation factors, erythropoietin or a viral antigen gene such as those of the hepatitis B virus, Influenza virus, AIDS virus, foot-and-mouth disease virus is cloned.

28. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Zellklon mit kernloalisierter RNA-Polymerase die Expressionszellinie PMLTT7N (ZIM-Hinterlegungsnummer ZIM-0382) selektiert wird.28. The method according to claim 1, characterized in that as a cell clone with nuclear-localized RNA polymerase, the expression cell line PMLTT7N (ZIM accession number ZIM-0382) is selected.