DD297446A5 - NANBV DIAGNOSTICS AND VACCINE - Google Patents

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DD297446A5
DD297446A5 DD90338836A DD33883690A DD297446A5 DD 297446 A5 DD297446 A5 DD 297446A5 DD 90338836 A DD90338836 A DD 90338836A DD 33883690 A DD33883690 A DD 33883690A DD 297446 A5 DD297446 A5 DD 297446A5
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hcv
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polypeptide
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Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
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Chiron Corporation,Us
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Abstract

Die Erfindung betrifft NANBV-Diagnostik und Vakzine. Der Anmelder hat ein neues Virus, das Hepatitis-C-Virus, entdeckt, das sich als das aetiologische Hauptagens der durch Blut uebertragenen NANBH erwiesen hat. Die Erfindung, die teilweise auf neuen HCV-Sequenzen und Polypeptiden beruht, umfaszt die Anwendung dieser neuen Sequenzen und Polypeptide bei Immunoassays, bei der Sondendiagnostik, bei der Anti-HCV-Antikoerper-Produktion, in der PCR-Technik und der DNA-Rekombinationstechnik. In die Erfindung mit inbegriffen sind neue immunogene Polypeptide, die in HCV-cDNA enthaltenden Klonen codiert sind, neue Methoden zur Reinigung eines immunogenen HCV-Polypeptids und "anti-sense"-Polynukleotide, die von der HCV-cDNA abgeleitet sind.{NANBV-Diagnostik; Vakzine; NANBH; Hepatitis-C-Virus; HCV-Sequenzen; Polypeptide; Immunoassay; immunogene Polypeptide; Reinigung eines immunogenen Polypeptids; "anti-sense"-Polynukleotide; HCV-cDNA}The invention relates to NANBV diagnostics and vaccines. The Applicant has discovered a new virus, the hepatitis C virus, which has been shown to be the major aetiological agent of blood-borne NANBH. The invention, which relies in part on novel HCV sequences and polypeptides, encompasses the use of these novel sequences and polypeptides in immunoassays, probe diagnostics, anti-HCV antibody production, the PCR technique, and recombinant DNA technology. Included in the invention are novel immunogenic polypeptides encoded in clones containing HCV cDNA, novel methods for purifying an immunogenic HCV polypeptide and anti-sense polynucleotides derived from the HCV cDNA. {NANBV- diagnostics; Vaccine; NANBH; ; Hepatitis C virus HCV sequences; polypeptides; immunoassay; immunogenic polypeptides; Purification of an immunogenic polypeptide; "Anti-sense" polynucleotides; HCV cDNA}

Description

Hierzu 40 Seiten ZeichnungenFor this 40 pages drawings

Die Erfindung betrifft Materialien und Methodologien zur Beherrschung der Ausbreitung der Hepatitis-Nicht-A-Nicht-B-Virusinfektion (NANBV-Infektion). Insbesondere betrifft sie Polynucleotide, die von dem Genom eines ätiologischen Agens der Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANBH), Hepatitis-C-Virus (HCV), abgeleitet sind, darin codierte Polypeptide und Antikörper gegen die Polypeptide. Diese Reagenzien sind als Screoning-Agenzien für HCV und die HCV-Infektion und als protektive Agenzien gegen die Krankheit von Nutzen.The invention relates to materials and methodologies for controlling the spread of hepatitis non-A non-B viral infection (NANBV infection). In particular, it relates to polynucleotides derived from the genome of a non-A non-B hepatitis (NANBH) etiological agent, hepatitis C virus (HCV), polypeptides encoded therein and antibodies to the polypeptides. These reagents are useful as screoning agents for HCV and HCV infection and as protective agents against the disease.

In der Anmeldung zitierte QuellenSources cited in the application Barr et el., Biotechniques 4 (1986) S. 428Barr et al., Biotechniques 4 (1986) p. 428 Botstein, Gene 8 (1979) S. 17Botstein, Gene 8 (1979) p. 17 Brinton, M. A. - In: The Viruses: The Togavlridae and Flaviviridae (Reihe hrsg. von Fraenkel-Conrat u. Wagner, Bd. hrsg. von Schlesinger u.Brinton, M.A. - In: The Viruses: The Togavlridae and Flaviviridae (series edited by Fraenkel-Conrat and Wagner, ed. By Schlesinger u. Schlesinger). Plenum Press, 1986-S.327-374Schlesinger). Plenary Press, 1986-S.327-374 Broach - In: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Bd. 1. Cold Spring Harbor Press, 1981. - S. 445Broach - In: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 1. Cold Spring Harbor Press, 1981. - p. 445 Broach et al., Meth.Enz.101 (1983) S.307Broach et al., Meth.Enz.101 (1983) p.307 Chang et al.. Nature 198 (1977) S. 1056Chang et al., Nature 198 (1977) p. 1056 Chirgwin et al.. Biochemistry 18 (1979) S. 5294Chirgwin et al. Biochemistry 18 (1979) p. 5294 Chomczynski u. Sacchl, Analytical Biochemistry 162 (1987) S. 156Chomczynski u. Sacchl, Analytical Biochemistry 162 (1987) p. 156 Clewell et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62 (1969) S. 1159Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969) p. 1159 Clewell.J.Bacteriol. 110 (1972) S.667Clewell.J.Bacteriol. 110 (1972) p.667 Cohen, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69 (1972) S.2110Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972) p.2110 Cousensetal.,Gene61 (1987) S.265Cousensetal., Gene61 (1987) p.265 De Boer et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 292 (1983) S. 128De Boer et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 292 (1983) p. 128 Dreesman et al., J.Infect. Disease 151 (1985) S.761Dreesman et al., J. Infect. Disease 151 (1985) S.761 Feinstone, S. M., Hoofnaglo, J.H., New Engl. J. Med.311 (1984) S. 185Feinstone, S.M., Hoofnaglo, J.H., New Engl. J. Med. 31 (1984) p. 185 Fields u. Knlpe- Fundamental Virology.-Raven Press, N.Y., 1986Fields u. Knlpe-Fundamental Virology.-Raven Press, N.Y., 1986 Fiers et al.. Nature 273 (1978) S. 113Fiers et al., Nature 273 (1978) p. 113 Gerety, R. J., et al. - In: Viral Hepatitis and Liver Disease, hrsg. von B. N. Vyas, J. L. Dienstag u. J. H. Hoofnagle. Grune and Stratton, Inc., 1984. -Gerety, R.J., et al. - In: Viral Hepatitis and Liver Disease, ed. by B.N. Vyas, J.L. J.H. Hoofnagle. Grune and Stratton, Inc., 1984. - Goeddel et al., Nucleic Acids Res.8 (1980) S.4057Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) p. 4057 Graham u. Van der Eb, Virology 52 (1978) S.546Graham u. Van der Eb, Virology 52 (1978) p.546 Grunstein u. Hogness, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73 (1975) S.3961Grunstein u. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1975) p. 3961 Grych et al.. Nature 316 (1985) S.74Grych et al., Nature 316 (1985) p.74 Gubler u. Hoffman, Gene 25 (1983) S. 263Gubler u. Hoffman, Gene 25 (1983) p. 263 Hahn, Virology 162 (1988) S. 167Hahn, Virology 162 (1988) p. 167 Hammering et al. - Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas, 1981Hammering et al. Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas, 1981 Han, Bi- chemistry 26 (1987) S. 1617Han, Biochemistry 26 (1987) p. 1617 Helfrr n,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1983)S.31Helfrr n, Proc.Natl.Acad.Sci.USA80 (1983) p.31 Hess et al., J.Adv.Enzyme Reg 7 (1968) S. 149Hess et al., J.Adv. Enzymes Reg. 7 (1968) p. 149 Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.75 (1978) S.1929Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1978) p.1929 Hiueman et al., J. Biol. Cham. 255 (1980) S. 2073Hiueman et al., J. Biol. Cham. 255 (1980) p. 2073 Holland et al.. Biochemistry 17 (1978) S.4900Holland et al. Biochemistry 17 (1978) p. 4900 Holland, J.BIol.Chem.256 (1981) S. 1385Holland, J. Biol. Chem. 256 (1981) p. 1385 Houghton et al., Nucleic Acids Res.9 (1981) S.247Houghton et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981) p.247 Hunyh, T. V., et al. - In: DNA Cloning Technique:. -A Practical Approach. - Hrsg. von D. Glover. Oxford: IRL Press, '385. - S.49-78Hunyh, T.V., et al. - In: DNA Cloning Technique :. -A Practical Approach. - Edited by D. Glover. Oxford: IRL Press, '385. - p.49-78

lmmun.Rev.62(1982)S.185lmmun.Rev.62 (1982) p.185

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Zitiurte Patente EPOPub.No.318216 PCT Pub.No. WO 89/04669 U.S.Patent No.4341761 U.S.Patent No.4399121 U.S.Patent No.4427763 U.S.Patent No.4444 887 U.S.Patent No.4468917 U.S.Patent No.4472500 U.S.Patent No.4491632 U.S.Patent No.4493890Zitiurte Patents EPOPub.No.318216 PCT Pub.No. WO 89/04669 U.S. Patent No. 4,334,161 U.S. Patent No. 4,399,121 U.S. Patent No. 4427763 U.S. Patent No. 4444,887 U.S. Patent No. 4468917 U.S. Patent No. 4472500 U.S. Patent No. 4,449,632 U.S. Patent No. 4,449,388

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANBH) ist eine übertragbare Krankheit oder Gruppe von Krankheiten, von denen angenommen wird, daß sie virusinduziert sind, und die sich von anderen Formen der mit Viren in Verbindung gebrachten Leberkrankheiten einschließlich derjenigen, die durch die bekannten Hepatitisviren, d. h. Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Hepatitis-Delta-Virus (HDV), verursacht werden, als auch von der Hepatitis unterscheiden lassen, die durch Cytomegalievirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert wird. NANBH wurde zuerst bei Individuen identifiziert, bei denen eine Transfusion durchgeführt worden war. Die Übertragung vom Menschen auf Schimpansen und die Serienpassage (serial passage) in Schimpansen lieferten den Beweis, daß NANBH auf ein übertragbares infektiöses Agens oder übertragbare infektiöse Agenzien zurückzuführen ist.Non-A-non-B hepatitis (NANBH) is a communicable disease or group of diseases believed to be virus-induced and different from other forms of viral-associated liver disease, including those caused by the virus known hepatitis viruses, d. H. Hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV) and hepatitis delta virus (HDV), are also caused to be distinguished from hepatitis by cytomegalovirus (CMV) or Epstein-Barr virus (EBV) is induced. NANBH was first identified in individuals undergoing transfusion. Transmission from humans to chimpanzees and serial passage in chimpanzees provided evidence that NANBH is due to a transmissible infectious agent or transmissible infectious agent.

Epidemiologisch erwiesen scheint, daß es drei NANBH-Typen gibt, und zwar den durch Trinkwasser übertragenen epidemischen Typ, den mit Blut oder Kanülen in Verbindung gebrachten Typ und den sporadisch auftretenden (community acquired) Typ. Die Zahl der als kausale Agenzien der NANBH in Frage kommenden Agenzien ist jedoch unbekannt.Epidemiologically, it appears that there are three types of NANBH, the epidemic type transmitted by drinking water, the type associated with blood or cannula, and the community-acquired type. However, the number of agents considered to be causal agents of NANBH is unknown.

Die klinische Diagnose und Identifizierung der NANBH erfolgte bisher hauptsächlich durch Ausschluß anderer viraler Marker. Zu den Verfahren für den Nachweis von mutmaßlichen NANBV-Antigenen und Antikörpern gehören die Agargeldiffusion, die Überwanderungselektrophorese, die Immunofluoreszenzmikroskopie, Immunelektronenmikroskopie, der Radiok munoassay und der heterogene Enzymimmunoassay. Keiner dieser Assays hat sich jedoch als hinreichend empfindlich, spezifisch und reproduzierbar für die Anwendung als diagnostischer Test für NANBH erwiesen.The clinical diagnosis and identification of NANBH has so far mainly been done by excluding other viral markers. Methods for the detection of putative NANBV antigens and antibodies include agar gel diffusion, over-migration electrophoresis, immunofluorescence microscopy, immunoelectron microscopy, radioimmunoassay and heterogeneous enzyme immunoassay. However, none of these assays has proven to be sufficiently sensitive, specific and reproducible for use as a diagnostic test for NANBH.

Früher bestanden weder Klarheit noch Übereinstimmung hinsichtlich der Identität oder Spezifik der Antigen-Antikörper-Systeme, die mit den Agenzien der NANBH verbunden sind. Dies war zum mindesten teilweise auf die vorausgehende oder Coinfektion durch HBV mit NANBV bei Individuen und die bekannte Komplexität der löslichen und in Partikeln auftretenden, mit HBV verbundenen Antigene wie auch iuf die Integration der HBV-DNA in das Genom der Leberzellen zurückzuführen. Zusätzlich begeht die Möglichkeit, daß NANBH durch mehr als ein infektiöses Agens verursacht wird, und die Möglichkeit der NANBH-Fehldiagnosr. Darüber hinaus ist unklar, was die serologischen Assays im Serum von Patienten mit NANBH nachweisen. Angenommen wurde, daß die Agargeldiffussion und Überwanderungselektrophorese Autoimmunantworten oder nichtspezifische Protcinwech elwirkungen, die manchmal zwischen Serumproben auftreten, nachweisen, und daß sie keine spezifischen NANBV-Antigen-Antikörper-Reaktionen darstellen. Der Immunofluoreszenztest und der heterogene Enzymimmunoassy und der Radioimmunoassay scheinen niedrige Werte eines rheumafaktorähnlichen Materials nachzuweisen, das häufig im Serum von Patienten mit NANBH wie auch bei Patienten mit anderen hepatischei. <nd nichthepatischen Erkrankungen zugegen ist. Ein Teil der nachgewiesenen Reaktionsfähigkeit kann Antikörper-Wirt-bestimmte (antibody to host-determined) zytoplasrnatische Antigene darstellen.Previously, there was neither clarity nor consistency in the identity or specificity of the antigen-antibody systems associated with the agents of NANBH. This was due, at least in part, to the precursor or co-infection by HBV with NANBV in individuals and the known complexity of the soluble and particulate HBV-associated antigens, as well as the integration of HBV DNA into the genome of liver cells. In addition, the possibility of NANBH being caused by more than one infectious agent and the possibility of NANBH misdiagnosis. In addition, it is unclear what the serological assays in the serum of patients with NANBH demonstrate. It has been suggested that agar-gel and immigration electrophoresis detect autoimmune responses or nonspecific protein interactions sometimes occurring between serum samples, and that they do not represent specific NANBV antigen-antibody responses. The immunofluorescence assay and the heterogeneous enzyme immunoassay and radioimmunoassay appear to detect low levels of rheumatoid factor-like material commonly found in the serum of patients with NANBH as well as in patients with other hepatic. and non-hepatic diseases. Part of the demonstrated reactivity may be antibody-host-determined cytoplasmic antigens.

Es hat eine Reihe von NANBV-Anwärtern gegeben. Siehe z. B. die Literaturstudien von Prince (1983). Feinstone und Hoofnagle (1984) und Overby (1935,1986,1987) und den Artikel von Iwarson (1987). Es gibt jedoch keinen Beweis, daß einer dieser Anwärter das ätiologische Agens der NANBH darstellt.There have been a number of NANBV candidates. See, for example, For example, the literature studies by Prince (1983). Feinstone and Hoofnagle (1984) and Overby (1935, 1986, 1987) and the article by Iwarson (1987). However, there is no evidence that any of these candidates represents the etiologic agent of NANBH.

Der Bedarf an empfindlichen, spezifischen Methoden für das Screening und die Identifizierung der Träger von NANBV und von durch NANBV infiziertem Blut und Blutprodukten ist bedeutend. Posttransfusionshepatitis (PTH) kommt bei annähernd 10% der Transfusionspatienten vor, und NANBH macht bis zu 90% diesor Fälle aus. Das Hauptproblem bei dieser Krankheit ist die häufige Progression zu einer chronischen Leberschädigung (25-55%).The need for sensitive, specific methods for screening and identifying carriers of NANBV and NANBV-infected blood and blood products is important. Posttransfusion hepatitis (PTH) occurs in approximately 10% of transfusion patients, and NANBH accounts for up to 90% of these cases. The main problem with this disease is the frequent progression to chronic liver damage (25-55%).

Die sorgfältige Behandlung der Patienten und die Vorbeugung der NANBH-Übertranung durch Blut und Blutprodukte oder durch engen Personenkontakt erfordern zuverlässige Screening-, Diagnose- und Progn jsemittel, um Nucleinsäuren, Antigene und Antikörper mit Bezug auf NANBV nachzuweisen. Außerdem werden wirksame Vakzine und immunotherapeutische Mittel für die Prophylaxe und/oder Behandlung der Krankheit benötigt.Careful treatment of patients and NANBH blood and blood product prevention or close personal contact require reliable screening, diagnostic and predictive tools to detect nucleic acids, antigens and antibodies related to NANBV. In addition, effective vaccines and immunotherapeutic agents are needed for the prophylaxis and / or treatment of the disease.

Der Anmelder hat ein neues Virus, das Hepatitis-C-Virus (HCV), entdeckt, das sich als das ätiologische Hauptagens der hämatogenen (blood-borne) NANBH (BB-NANBH) erwiesen hat. Die erste Arbeit des Anmelders, die eine partielle genomische Sequenz des Prototyp-HCV-lsolats, CDC/HCV1 (auch HCV1 genannt), beinhaltet, wird in der EPO-Veröffentlichung Nr. 318 216 (veröffentlicht am 31. Mai 1989) und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/04669 (veröffentlicht am 1 .Juni 1989) beschrieben. Die Offenbarungen dieser Patentanmeldungen und alle entsprechenden nationalen Patentanmeldungen sind hier durch Bezugnahme einbezogen. Diese A^., Meldungen unterrichten u. a. über DNA-Rekombinationsmethoden zur Klonierung und Expression von HCV-Sequenzen, HCV-Polypeptide, HCV-immunodiagnostische Techniken, HCV-sondendiagnostische Techniken, Anti-HCV-Antikörper und Methoden zur Isolierung neuer HCV-Sequenzen einschließlich Sequenzen neuer HCV-Isolate.The Applicant has discovered a new virus, the hepatitis C virus (HCV), which has proved to be the main aetiological agent of the blood-borne NANBH (BB-NANBH). Applicant's first work, which includes a partial genomic sequence of the prototype HCV isolate, CDC / HCV1 (also called HCV1), is described in EPO Publication No. 318,216 (published May 31, 1989) and PCT Publication No. WO 89/04669 (published on June 1, 1989). The disclosures of these patent applications and all corresponding national patent applications are incorporated herein by reference. These A ^., Messages teach u. a. on recombinant DNA methods for the cloning and expression of HCV sequences, HCV polypeptides, HCV immunodiagnostic techniques, HCV diagnostic techniques, anti-HCV antibodies and methods for the isolation of new HCV sequences, including sequences of novel HCV isolates.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Die Erfindung beruht teilweise auf neuen HCV-Sequenzen und Polypeptiden, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318 216 oder in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/04669 nicht offenbart werden. Mit eingeschlossen in die Erfindung ist die Anwendung dieser neuen Sequenzen und Polypeptide u.a. in der Immunodiagnostik, Sondendiagnostik, Anti-HCV-Antikörper-Gewinnung, PCR-Technik und DNA-Rekombinationstechnik. Mit eingeschlossen in die Erfindung werden auch neue Immunoassays, die auf der Immunogenität der hier offenbarten HCV-Polypeptide beruhen. Der neue hier beanspruchte Gegenstand hat, sowohl er unter Anwendung von Techniken entwickelt wurde, die z. B. in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben wurden, ein Prioritätsdatum, das jener Veröffentlichung oder einem Zweitstück derselben vorhergeht. Somit macht die Erfindung neue Zusammensetzungen und Methoden verfügbar, die für das Screenen von Proben auf HCV-Antigene und Antikörper und für die Behandlung von HCV-lnfektionen von Nutzen sind.The invention is based in part on novel HCV sequences and polypeptides not disclosed in EPO Pub. No. 3,118,216 or in PCT Publication No. WO 89/04669. Included in the invention is the use of these novel sequences and polypeptides, i.a. in immunodiagnostics, probe diagnostics, anti-HCV antibody recovery, PCR technique and recombinant DNA technology. Also included in the invention are novel immunoassays based on the immunogenicity of the HCV polypeptides disclosed herein. The new article claimed here has both been developed using techniques which are e.g. As described in EPO Pub. No. 3,182,216, a priority date preceding that publication or a second piece thereof. Thus, the invention provides novel compositions and methods useful for screening samples for HCV antigens and antibodies and for the treatment of HCV infections.

Demgemäß stellt einen Aspekt der Erfindung ein rekombinantes Polynucleotid dar, das eine von HCV-cDNA abgeleitete Sequenz umfaßt, wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh ist oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist. Einen anderen Aspekt der Erfindung stellt ein gereinigtes Polypeptid dar, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop umfaßt, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist. Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein immunogenes Polypeptid dar, das durch eine. <t einem rekombinanten Expressionsvektor transformierte Zelle erzeugt wird, der ein ORF einer von HCV-cDNA abgeleiteten DNA umfaßt, wobei die HCV-cDNA aus einer Sequenz besteht, die von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33coder Klon 40b oder Klon 33boder Klon 25coder Klon 14coder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleitet ist, und wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit einem erwünschten Wirt verträglich ist.Accordingly, one aspect of the invention is a recombinant polynucleotide comprising a HCV cDNA-derived sequence, wherein the HCV cDNA is present in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh or wherein the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17. Another aspect of the invention is a purified polypeptide comprising an epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17. Another aspect of the invention is an immunogenic polypeptide that is characterized by a. a cell transformed into a recombinant expression vector comprising an ORF of HCV cDNA-derived DNA, the HCV cDNA consisting of a sequence derived from the HCV cDNA sequence in clone CA279a or clone CA74a or clone 13i or Clone CA290a or clone 33c or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone 33f or clone 33g or clone 39c or clone 15e, and wherein the ORF is operably linked to a control sequence that is compatible with a desired host.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Peptid, das einen HCV-Epitop umfaßt, wobei das Peptid die Formel AAx-AAyAnother aspect of the invention is a peptide comprising an HCV epitope wherein the peptide is of the formula AA x -AAy

hat, worin χ und y die in Fig. 17 angegebenen Aminosäurenummern bezeichnen, und wobei das Peptid aus der ausin which χ and y denote the amino acid numbers indicated in Fig. 17, and wherein the peptide is selected from

AA1-AA25,AA1-AA50/AA1-AA84,AA9-AA177,AA1-AA10,AA5··AA20,AA20-AA25,AA35-AA45,AA50-. 100,AA40-AA1-AA25, AA1-AA50 / AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5 ·· AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-. 100, AA40- AA90,AA45-AA65,AA65-AA75(AA80-AA90,AA99-AA120,AA9&-AA110,AA105-AA120,AA100-AA1M,AA150-AA200,AA90, AA45-AA65, AA65-AA75 ( AA80-AA90, AA99-AA120, AA9 & -AA110, AA105-AA120, AA100-AA1M, AA150-AA200, AA155-AA170, AA19O-AA21O, AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250--AA300, AA290-AA330, AA290-AA155-AA170, AA19O-AA21O, AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250- AA300, AA290-AA330, AA290- AA305, AA30O-AA350, AA310-AA330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA40i>-AA415,AA305, AA30O-AA350, AA310-AA330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA40i> -AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, ΑΑ440-ΛΑ460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500-AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, ΑΑ440-ΛΑ460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500- AA550, AA511-AA690, AA515-AA550, AA550-AA600, Aa 550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650,AA550, AA511-AA690, AA515-AA550, AA550-AA600, AA 550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650, AA600-AA625, AA635-AA665, ΑΑ650-ΑΑ70Ό, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725-AA600-AA625, AA635-AA665, ΑΑ650-ΑΑ70Ό, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725- AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA900-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, AA920-AA990,AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA900-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, AA920-AA990, AA850-AA900, AA920-AA945, AA940-M965, AA970-AA990, AA95O-AA1000, AA1 000-ΑΛ1060, AAI000-AA1025,AA850-AA900, AA920-AA945, AA940-M965, AA970-AA990, AA95O-AA1000, AA1000-ΑΛ1060, AAI000-AA1025, AA1 000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075-AA1175, AA1050-AA1 200, AA1070-AA1100, AA1100-AA1 000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075-AA1175, AA1050-AA1 200, AA1070-AA1100, AA1100- AA1130, AA1140-AA1165, AA1192-AA1457, AA1195-AA1 250, AA1200-AA1 225, AA1225-AA1250, AA1 250-AA1300,AA1130, AA1140-AA1165, AA1192-AA1457, AA1195-AA1 250, AA1200-AA1 225, AA1225-AA1250, AA1 250-AA1300, AA1 260-AA1310, AA1260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1 310, AA1310-AA1340, AA1345-AA1 260-AA1310, AA1260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1 310, AA1310-AA1340, AA1345- AA1405, AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA1365-AA1380, AA1380-AA1405, AA14C0-AA1450, AA1450-AA1500,AA1405, AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA1365-AA1380, AA1380-AA1405, AA14C0-AA1450, AA1450-AA1500, AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1 500-AA1550, AA1500-AA1 515, AA1 515-AA1 550, AA1550-AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1 500-AA1550, AA1500-AA1 515, AA1 515-AA1 550, AA1550- AA1600, AA1 545-AA1560, AA1569-AA1931, AA1 570-ΛΑ1 590, AA1 595-AA1610, AA1 590-AA1650, AA1 610-AA1645,AA1600, AA1 545-AA1560, AA1569-AA1931, AA1 570-ΛΑ1 590, AA1 595-AA1610, AA1 590-AA1650, AA1 610-AA1645, AA1 650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1 690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745-AA1 650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1 690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745- AA1770, AA1750-AA1800, AA1775-AA1810, AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920,AA1770, AA1750-AA1800, AA1775-AA1810, AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920, AA1916-AA2021, AA192O-AA1940, AA1949-AA2124, AA1950-AA2000, AA1950-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000-AA1916-AA2021, AA192O-AA1940, AA1949-AA2124, AA1950-AA2000, AA1950-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000- AA2050, AA2005-AA2025, AA2020-AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA2054-AA2223, AA 2 070-AA 2100,AA2050, AA2005-AA2025, AA2020-AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA2054-AA2223, AA 2 070-AA 2100, AA2100-M2150,M215&-AA2200,AA2200-AA2250,AA2200-AA2325,AA2250-AA2330,AA2255-AA2270,AA2265-AA2100-M2150, M215 & -AA2200, AA2200-AA2250, AA2200-AA2325, AA2250-AA2330, AA2255-AA2270, AA2265- AA2280<AA228O-AA2290,AA2287-AA2385#AA2300-AA2350,AA229O-AA231O,AA2310-AA2330,AA233O-AA2350,AA2280 < AA228O-AA2290, AA2287-AA2385 # AA2300-AA2350, AA229O-AA231O, AA2310-AA2330, AA233O-AA2350, AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA 2 345-AA 2 375, AA2370-AA2410, AA 2 371-AA 2 502, AA2400-AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA 2 345-AA 2 375, AA2370-AA2410, AA 2 371-AA 2 502, AA2400- AA2450,AA2400-AA2425/AA2415-AA2450,AA2445-AA2500,AA2445-AA2475,AA2470-AA2490,AA2500-AA2550,AA2450, AA2400-AA2425 / AA2415-AA2450, AA2445-AA2500, AA2445-AA2475, AA2470-AA2490, AA2500-AA2550, AA2505-AA2540/AA2535-AA2560,AA2550-AA2600,AA2560-AA2580/AA2600-AA2650,AA2605-AA2620,AA2620-AA2505-AA2540 / AA2535-AA2560, AA2550-AA2600, AA2560-AA2580 / AA2600-AA2650, AA2605-AA2620, AA2620- AA 2 650, AA 2 640-AA 2 660, AA 2 650-AA 2 700, AA 2 655-AA 2 670, AA 2 670-AA 2 700, AA 2 700-AA 2 750, AA 2 740-AA 2 760,AA 2 650, AA 2 640-AA 2 660, AA 2 650-AA 2 700, AA 2 655-AA 2 670, AA 2 670-AA 2 700, AA 2 700-AA 2 750, AA 2 740-AA 2 760, AA2750-AA2800,AA2755-AA2780,AA2780-AA2830,AA2785-AA2810,AA2796-AA2886,AA2810-AA2825,AA2800-AA2750-AA2800, AA2755-AA2780, AA2780-AA2830, AA2785-AA2810, AA2796-AA2886, AA2810-AA2825, AA2800- AA2850/AA.2850-AA2900,AA2850-AA2865,AA2885-AA2905,AA2900-AA2950,AA2910-AA2930,AA2925-AA2950,AA2850 / A A .2850-AA2900, AA2850-AA2865, AA2885-AA2905, AA2900-AA2950, AA2910-AA2930, AA2925-AA2950, AA2945-Ende (C'-terminal) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.AA2945 end (C'-terminal) existing group is selected. Ein weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein monoklonaler Antikörper dar, der gegen ein Epitop gerichtet ist, das in HCV-cONAAnother aspect of the invention is a monoclonal antibody directed against an epitope expressed in HCV cONA

codiert ist, wobei die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenzist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a Klon 84a oder Klon CA15f>e oder Klon 167 boder Klon pi 14 oder Klon CA216aoder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.which is from a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17, or clone 13i or clone 26j or clone 59a clone 84a or clone CA15f> e or clone 167b or clone pi14 or Clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh.

-!inen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Präparat von gereinigten polyklonalen Antikörpern der, die gegen ein Polypeptidgerichtet sind, das aus einem Epitop besteht, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch dieIn a further aspect of the invention, a preparation of purified polyclonal antibodies directed against a polypeptide consisting of an epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is derived from a by the

Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 13 i oder Klon 26j oderNucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Fig. 17, or in clone 13i or clone 26j or Klon 59a oder Klon 84s oder Klon CA 156θ oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder KlonClone 59a or clone 84s or clone CA 156θ or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone

ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh.

Einen '/eiteren Aspekt der Erfindung stellt eine Polynucleotidsonde für HCV dar, wobei die Sonde aus einer HCV-SequenzA further aspect of the invention is a polynucleotide probe for HCV, wherein the probe is from an HCV sequence

besteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet ist, die durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 inderived from an HCV cDNA sequence represented by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in

Fig. 17 angegeben ist, oder von dem Komplement der HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet ist.Fig. 17, or derived from the complement of the HCV cDNA sequence. Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Kit zur Analyse von Proben auf die Gegenwart von Polynucleotiden aus dem HCV,Another aspect of the invention is a kit for analyzing samples for the presence of polynucleotides from the HCV,

der eine Polynucleotidsonde umfaßt, die eine Nucleotidsequenz von etwa 8 oder mehr Nucleotiden enthält, wobei diewhich comprises a polynucleotide probe containing a nucleotide sequence of about 8 or more nucleotides, said

Nucleotidsequenz von der HCV-cDNA abgeleitet ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866Nucleotide sequence is derived from the HCV cDNA, one of the nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866

in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei die Polynucleotidsonde in einem geeigneten Container enthalten ist.in Fig. 17, wherein the polynucleotide probe is contained in a suitable container.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antigens, der einenAnother aspect of the invention is a kit for the analysis of samples for the presence of an HCV antigen comprising a Antikörper enthält, der immunologisch mit einem HCV-Antigen reagiert, wobei das Antigen ein Epitop enthält, das in HCV-cDNAContaining antibody which immunologically reacts with an HCV antigen, the antigen containing an epitope expressed in HCV cDNA

codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, oderwobei die HCV-cDNA in Klon 13ioderKlon 26j oder Klon 59a oder Klon 84aoderKlonCA156eoderKlon167boderKlonpi14aoder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh ist.or the HCV cDNA can be encoded in clone 13 or 26 clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167b or clonepi14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Kit zur Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikörpers dar, der einAnother aspect of the invention is a kit for analyzing samples for the presence of an HCV antibody comprising

antigenes Polypeptid umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch dieantigenic polypeptide containing an HCV epitope encoded in HCV cDNA, which is derived from one by the

Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder in Klon 13i oder Klon 26j oderNucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Fig. 17 or in clone 13i or clone 26j or Klon 59 a oder Klon 84 a oder Klon CA 156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14 a oder Klon CA 290 a oder Klon ag 30 a oder Klon 205 aClone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA 290a or clone ag 30a or clone 205a

oder Klon 18g oder Klon 16jh ist.or clone 18g or clone 16jh.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Kit zur Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikörpers, der einAnother aspect of the invention is a kit for analyzing samples for the presence of an HCV antibody comprising

antigenes Polypeptid umfaßt, das von HCV-cDNA in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13! oder Klon CA290a oderantigenic polypeptide derived from HCV cDNA in clone CA279a or clone CA74a or clone 13! or clone CA290a or

Klon 33C oder Klon 40b oder Klon 33b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 39c oder Klon 15eClone 33C or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone 33f or clone 39c or clone 15e

exprimiert ist, wobei das antigene Polypeptid in einem geeigneten Container vorhanden ist.is expressed, wherein the antigenic polypeptide is present in a suitable container.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von HCV-Nucleinsäuren in einer Probe dar, das folgendesAnother aspect of the invention is a method for detecting HCV nucleic acids in a sample which comprises

umfaßt:comprising:

(a) Umsetzung der Nucleinsäuren der Probe mit einer Polynucleotidsonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenzbesteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet ist, die von der durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, und wobei die Umsetzung unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines(a) Reaction of the nucleic acids of the sample with a polynucleotide probe for HCV, which probe consists of an HCV sequence derived from an HCV cDNA sequence, which is different from that indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG. 17, and wherein the reaction takes place under conditions which require the formation of a

Polynucleotid-Duplexes zwischen der Sonde und der HCV-Nucleinsäure aus der Probe gestatten; (b) Nachweis eines in Stufe (a)Allow polynucleotide duplexes between the probe and the HCV nucleic acid from the sample; (b) proof of one in step (a)

gebildeten Polynucleotid-Duplexes, der die Sonde enthält.formed polynucleotide duplex containing the probe.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Immunoassay für den Nachweis eines HCV-Antigens, der folgendes umfaßt: (a) Inkubation einer Probe, von der angenommen wird, daß sie ein HCV-Antigen enthält, mit einem Antikörper, der gegen ein HCV-Epitop gerichtet ist, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von der durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz Ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 2C5a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben; und (b) Nachwels eines in Stufe (a) gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexes, der den Antikörper enthält.Another aspect of the invention is an immunoassay for the detection of an HCV antigen which comprises: (a) incubating a sample suspected of containing an HCV antigen with an antibody directed against an HCV epitope which is encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is from the sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Fig. 17, or the sequence set forth in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 2C5a or clone 18g or clone 16jh, and wherein the incubation is under conditions which prevent the formation of an antigen Allow antibody complex; and (b) detecting an antibody-antigen complex formed in step (a) containing the antibody.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Immunoassay für den Nachweis von Antikörpern, die gegen ein HCV-Antigen gerichtet sind, der folgendes umfaßt:Another aspect of the invention is an immunoassay for the detection of antibodies directed against an HCV antigen comprising:

(a) Inkubation einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Anti-HCV-Antikörpor enthält, mit einem Antigenpolypeptid, das oin E oitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCv-i INA von der durch die ι iucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8.-,. 3 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13 i oder Klon 26j oder Klon 59 a oder Klon 84 a ooerKion CA 156e oder Klon 167boderKlon pi14aoder Klon CA216aoder Klon CA 290 a oder Klon ag30aoderKlon 205aoder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten; und Nachweis eines in Stufe (a) gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexes, der das Antigenpolypeptid enthält.(a) incubating a sample suspected of containing anti-HCV antibody with an antigen polypeptide containing o inop which is encoded in HCV cDNA, wherein the HCv-i INA is different from that obtained by the ι nucleotide numbers -319 to 1348 or 8.- ,. 3 to 8866 in Fig. 17 or is the sequence set forth in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84 a or CA 154e or clone 167b or clone pi14a or clone CA216a or clone CA 290 a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, and wherein the incubation is under conditions permitting the formation of an antigen-antibody complex; and detecting an antibody-antigen complex formed in step (a) containing the antigenic polypeptide.

Einen weiteren Aspekt stellt ein Vakzin zur Behandlung der HCV-lnfektion dar, das ein immunogenes Polypeptid umfaßt, welches ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13i oder Klon 26 j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel vorhanden ist.Another aspect is a vaccine for the treatment of HCV infection comprising an immunogenic polypeptide containing an HCV epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is derived from one represented by nucleotide numbers -319 to 1348 or Or is the sequence described in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or Clone 205a or clone 18g or clone 16jh, and wherein the immunogenic polypeptide is present in a pharmacologically effective dose in a pharmaceutically acceptable vehicle.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen HCV dar, das die Applikation eines isolierten immunogenen Polypeptide bei einem Individuum umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon CA279a oder Klon CA 74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33coder Klon 40boder Klon 33boder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8·'oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e vorhanden ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel vorhanden ist.Another aspect of the invention is a method of producing antibodies to HCV comprising applying an isolated immunogenic polypeptide to an individual containing an HCV epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is from a 17 or 8659-8866 in FIG. 17 or is the sequence described in clone CA279a or clone CA 74a or clone 13i or clone CA290a or clone 33c or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or Clone 8 '' or clone 33f or clone 33g or clone 39c or clone 15e, and wherein the immunogenic polypeptide is present in a pharmacologically effective dose in a pharmaceutically acceptable vehicle.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein „anti-sense"-Polynucleotid, das von HCV-cDNA abgeleitet ist, wobei die HCV-cDNA die in Fig. 17 dargestellte ist.Another aspect of the invention is an antisense polynucleotide derived from HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is that shown in FIG.

Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des gereinigten Fusionspolypeptids C100-3, dar, das folgendes umfaßt:A further aspect of the invention is a process for the preparation of the purified fusion polypeptide C100-3, comprising:

(a) Bereitstellung eines rohen Zell-Lysats, das das Polypeptid C100-3 enthält,(a) providing a crude cell lysate containing the polypeptide C100-3,

(b) Behandlung des rohen Zell-Lysats mit Aceton in einer Menge, die das Polypeptid fällt,(b) treating the crude cell lysate with acetone in an amount that precipitates the polypeptide,

(c) Isolieren und Löslichmachen der gefällten Substanz,(c) isolating and solubilizing the precipitated substance,

(d) Isolieren des Polypeptids C100-3 durch Anlonenaustauschchromatographie und(d) isolating the polypeptide C100-3 by anion exchange chromatography and

(e) weitere Isolierung des Polypeptids C100-3 von Stufe (d) durch Gelfiltration.(e) further isolation of the polypeptide C100-3 of step (d) by gel filtration.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings

Fig. 1: zeigt die Sequenz der HCV-cDNA in Klon 12f und die darin codierten Aminosäuren.Fig. 1: shows the sequence of the HCV cDNA in clone 12f and the amino acids encoded therein.

Fig. 2: zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Klon k9—1 und die darin codierten Aminosäuren.Fig. 2: shows the HCV cDNA sequence in clone k9-1 and the amino acids encoded therein.

Fig. 3: zeigt die Sequenz von Klon 15e und die darin codierten Aminosäuren.Figure 3: shows the sequence of clone 15e and the amino acids encoded therein.

Fig. 4: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 13 i, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mitFigure 4: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone 13i, the amino acids encoded therein and the sequences labeled with

Klon 12f überlappenClone 12f overlap

Fig. 5: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 26j, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die Klon 13t Fig. 5: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone 26j, the amino acids encoded therein and the sequences clone 13t

überlappenoverlap

Fig, 6: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 59a, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit Figure 6: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA 59a, the amino acids encoded therein and the sequences labeled with

den Klonen 26j und K9-1 überlappenoverlap clones 26j and K9-1

Fig. 7: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA84a, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit Figure 7: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA84a, the amino acids encoded therein and the sequences labeled with

Klon CA59a überlappenClone CA59a overlap

Fig. 8: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 156e, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die Fig. 8: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA 156e, the amino acids encoded therein and the sequences which

mit Klon CA84a überlappenoverlap with clone CA84a

Fig. 9: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 167 b, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die Fig. 9: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA 167b, the amino acids encoded therein and the sequences which

Klon CA156e überlappenClone CA156e overlap

Fig. 10: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA216a, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung mit Fig. 10: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA216a, the amino acids encoded therein and the overlap with

Klon CA 167 bClone CA 167 b

Fig. 11: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA290a, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung mit KlonCA216a. Fig. 11: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA290a, the amino acids encoded therein and the overlap with clone CA216a.

Fig. 12: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon ag 30a und die Überlappung mit Klon CA290a. Fig. 13: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA205a und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in KlonFig. 12: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone ag 30a and the overlap with clone CA290a. Fig. 13: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone CA205a and the overlap with the HCV cDNA sequence in clone

CA290aCA290a

Fig. 14: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 18g und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in Fig. 14: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone 18g and the overlap with the HCV cDNA sequence in FIG

Klon ag30aClone ag30a

Fig. 15: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 16jh, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung von Nucleotiden mit der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 15e. Fig. 15: shows the nucleotide sequence of HCV cDNA in clone 16jh, the amino acids encoded therein and the overlap of nucleotides with the HCV cDNA sequence in clone 15e.

Fig. 16: zeigt das ORF von HCV-DNA, abgeleitet von den Klonen pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1,12f, 14i, 11 b, 7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26gund15e.Fig. 16: shows the ORF of HCV DNA derived from clones pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35 , 36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26gund15e.

Fig. 17: zeigt den codierenden Strang der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die von den oben beschriebenen Klonen abgeleitet ist, und die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 veröffentlicht ist. Dia Klone, von denen die Sequenz abgeleitet wurde, sind b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA21Ga, pi 14a, CA 167b, CA 156θ, CA84a,CA59a,K9-1 (auch k9-1 genannt), 26j, 131,12^141,11^7^76,8^330,40^37^35,36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a und 16jh. Die drei horizontalen Striche in der Figur oberhalb der Sequenz geben die Position des mutmaßlichen Methionin-Initiationscodons an; die beiden vertikalen Striche geben die ersten und . letzten Nucleotide der veröffentlichten Sequenz an. Die Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Polyproteins, das in der HCV-cDNAcodiert ist.Figure 17: shows the coding strand of the compiled HCV cDNA sequence derived from the above-described clones and the compiled HCV cDNA sequence published in EPO Pub. No. 3,182,116. Dia clones from which the sequence was derived are b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA21Ga, pi14a, CA167b, CA156θ, CA84a, CA59a, K9-1 (also called k9-1), 26j, 131 , 12 ^ 141,11 ^ 7 ^ 76,8 ^ 330,40 ^ 37 ^ 35,36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a and 16y. The three horizontal bars in the figure above the sequence indicate the position of the putative methionine initiation codon; the two vertical bars give the first and. last nucleotides of the published sequence. The figure also shows the amino acid sequence of the putative polyprotein encoded in the HCV cDNA.

Fig. 18: ist ein Diagramm der immunologischen Kolonie-Screening-Methode, die bei antigenen Kartierungsuntersuchungen angewendet wird.Fig. 18 is a diagram of the immunological colony screening method used in antigenic mapping studies.

Fig. 19: zeigt die Hydrophobieprofile von Polyproteinen, die im HCV und im West-Nile-Virus codiert sind.Fig. 19: shows the hydrophobicity profiles of polyproteins encoded in HCV and West Nile virus.

Fig. 20: Ist eine Darstellung (tracing) des Hydrophilie/Hydrophobieprofils und des antigenen Index des mutmaßlichen HCV-Polyproic'ns.Fig. 20: Is a representation (tracing) of the hydrophilicity / hydrophobicity profile and the antigenic index of the putative HCV polyprocosis.

Fig. 21: zeigt die konservierten colinearen Peptide in HCV und Flaviviren.Fig. 21: shows the conserved colinear peptides in HCV and flaviviruses.

Verfahren zur Durchführung der ErfindungMethod for carrying out the invention

I. DefinitionenI. Definitions

Der Terminus „Hepatitis-C-Virus" wurde von den Fachleuten für ein bislang unbekanntes ätiologisches Agens der NANBH reserviert. Demgemäß bezieht sich der Terminus „Hepatitis-C-Virus" (HCV) hier auf ein NANBH verursachendes Agens, das früher als NANBV und/oder BB-NANBV bezeichnet wurde. DieTermini HCV, NANBVu.id BB-NANBV werden hier als Synonyme benutzt. In Erweiterung dieser Terminologie wird die durch das HCV verursachte und früher als NANB-Hepatitis (NANBH) bezeichnete Krankheit als Hepatitis C bezeichnet. Die Termini NANBH und Hepatitis C können hier als Synonyme verwendet werden.The term "hepatitis C virus" has been reserved by those skilled in the art for a hitherto unknown etiological agent of NANBH, and accordingly, the term "hepatitis C virus" (HCV) refers to a NANBH-causing agent formerly known as NANBV and or BB-NANBV. The terms HCV, NANBVu.id BB-NANBV are used here as synonyms. In extension of this terminology, the disease caused by HCV, formerly known as NANB hepatitis (NANBH), is called hepatitis C. The terms NANBH and hepatitis C can be used as synonyms here.

DerTerminus „HCV" bezeichnet hier eine Virusspezies, deren pathogene Stämme NANBH verursachen, und attenuiorte Stämme oder fehlerhafte interferierende Partikeln, die davon abgeleitet sind. Wie nachstehend gezeigt wird, besteht das HCV-Genom aus RNA. Bekannt ist, daß RNA-haltige Viren relativ hohe Geschwindigkeiten der spontanen Mutation aufweisen, d. h. laut Berichten in der Größenordnung von 10~3 bis 10"4 je aufgenommenes Nucleotid (Fields u. Knipe, 1986). Daher gibt es multiple Stämme, die virulent oder avirulent sein können, innerhalb der unten beschriebenen HCV-Spezies. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden ermöglichen die Propagation, Identifizierung, den Nachweis und die Isolierung der verschiedenen HCV-Stämme oder -Isolate. Außerdem erlaubt die hie: gemachte Offenbarung die Präparation von diagnostischen Mitteln und Vakzinen für die verschiedenen Stämme wie auch Zusammensetzungen und Methoden, die bei Screening-Verfahren für antivirale Agenzien für pharmakologische Zwecke, z.B. Agenzien, die die Replikation des HCV inhibieren, von Nutzen sind.The term "HCV" refers herein to a virus species whose pathogenic strains cause NANBH and attenuated strains or defective interfering particles derived therefrom. As will be shown below, the HCV genome consists of RNA have high rates of spontaneous mutation, ie, reportedly on the order of 10 ~ 3 to 10 "4 each recorded nucleotide (Fields u. Knipe, 1986). Thus, there are multiple strains that may be virulent or avirulent within the HCV species described below. The compositions and methods described herein enable the propagation, identification, detection and isolation of the various HCV strains or isolates. In addition, the disclosure herein permits the preparation of diagnostic agents and vaccines for the various strains, as well as compositions and methods useful in screening procedures for antiviral agents for pharmacological purposes, eg, agents that inhibit replication of HCV.

Die hier verfügbar gemachten Informationen sind - auch wenn sie vom Prototyp-Stamm oder -Isolat des HCV, nachstehend als CDC/HCV1 (auch HCV1 genannt) bezeichnet, abgeleitet sind - ausreichend, um es dem Virus-Systematiker zu erlauben, andere Stämme zu identifizieren, die zu der Spezies gehören. Die hier verfügbar gemachten Informationen lassen die Annahme zu, daß das HCV ein den Flaviviren ähnliches Virus ist. Die Morphologie und Zusammensetzung der Flaviviruspartikeln sind bekannt und werden von Brinton (1986) diskutiert. Was die Morphologie betrifft, so enthalten die Flaviviren im allgemeinen ein zentrales Nucleocapsid, das von einer Lipiddoppelschicht umgeben ist. Die Virionen sind sphärisch und haben einen Durchmesser von etwa 40-50nm. Ihre Innenkörper (cores) haben einen Durchmesser von etwa 25-30nm. An der Außenfläche der Virionpeplos befinden sich Oberflächenprojektionen von etwa 5-1 Onm Länge mit terminalen Knobs von etwa 2 nm Durchmesser. Verschiedene HCV-Stämme oder -Isolate enthalten wahrscheinlich Variationen an der Aminosäure und den Nucleinsäuren im Vergleich zum Prototyp-Isolat HCV1. Es wird erwartet, daß viele Isolate beträchtliche Homologie (d. h. über 40%) in der Gesamtaminosäuresequenz im Vergleich zu HCV1 zeigen. Es kann jedoch auch festgestellt werden, daß es andere weniger homologe HCV-lsolate gibt. Diese wären als HCV-Stämme nach verschiedenen Kriterien wie einem ORF von annähernd 9000 Nucleotiden bis annähernd 12000 Nucleotiden, die ein Polyprotein von ähnlicher Größe wie das HCV1 codieren, ein codiertes Polyprotein von ähnlichem hydrophobem und antigenem Charakter wie beim HCV1, und der Gegenwart von colinearen Paptidsequenzen, die mit HCV1 konserviert sind, zu definieren. Außerdem wäre das Genom eine Plusstrang-RNA. HCV codiert zum mindesten ein Epitop, das immunologisch mit einem Epitop in dem HCV-Genom identifizierbar ist, von dem die hier beschriebenen cDNAs abgeleitet sind; vorzugsweise ist das Epitop in einer hier beschriebenen Aminosäuresequenz enthalten. Das Epitop ist im Vergleich zu anderen bekannten Flaviviren für das HCV einmalig. Die Einmaligkeit des Epitops kann durch seine immunologische Reaktivität mit anti-HCV-Antikörpern und die mangelnde immunologische Reaktivität mit Anitkörpern auf andere Flavivirusspezies bestimmt werden. Verfahren zur Bestimmung der immunologischen Reaktivität sind im Fachgebiet bekannt, z. B. Bestimmung durch Radioimmunoassay, ELISA und Hämagglutination, und verschiedene Beispiele für geeignete Techniken für Assays werden hier beschrieben.The information provided herein, although derived from the HCV prototype strain or isolate, hereafter referred to as CDC / HCV1 (also called HCV1), is sufficient to allow the virus systematist to identify other strains that belong to the species. The information provided here suggests that HCV is a virus similar to flaviviruses. The morphology and composition of the flaviviral particles are known and discussed by Brinton (1986). As far as the morphology is concerned, the flaviviruses generally contain a central nucleocapsid surrounded by a lipid bilayer. The virions are spherical and have a diameter of about 40-50nm. Their inner bodies (cores) have a diameter of about 25-30nm. On the outer surface of the Virionpeplos are surface projections of about 5-1 onm length with terminal Knobs of about 2 nm in diameter. Various HCV strains or isolates likely contain variations in the amino acid and nucleic acids compared to the prototype isolate HCV1. Many isolates are expected to show considerable homology (i.e., over 40%) in the total amino acid sequence compared to HCV1. However, it can also be stated that there are other less homologous HCV isolates. These would be identified as HCV strains by various criteria, such as an ORF of approximately 9000 nucleotides to approximately 12000 nucleotides encoding a polyprotein of similar size to HCV1, an encoded polyprotein of similar hydrophobic and antigenic character as in HCV1, and the presence of colinear To define paptide sequences conserved with HCV1. In addition, the genome would be a plus strand RNA. HCV encodes at least one epitope that is immunologically identifiable with an epitope in the HCV genome from which the cDNAs described herein are derived; Preferably, the epitope is included in an amino acid sequence described herein. The epitope is unique to HCV in comparison to other known flaviviruses. The uniqueness of the epitope can be determined by its immunological reactivity with anti-HCV antibodies and its lack of immunological reactivity with antibodies to other flavivirus species. Methods for determining immunological reactivity are known in the art, e.g. Determination by radioimmunoassay, ELISA and hemagglutination, and various examples of suitable techniques for assays are described herein.

Ergänzend zu dem oben Gesagten sind die folgenden Parameter der Nucleinsäurehomologie und der Aminosäurohomologie entweder allein oder kombiniert bei der Identifizierung eines Stamms oder Isolats als HCV anwendbar. Da HCV-Stämme und -isolate evolutionär verwandt sind, ist zu erwarten, daß die Gesamthomologie der Genome auf dem Nucleotidniveau vermutlich etwa 40% oder größer, wahrscheinlich etwa 60% oder größer und noch wahrscheinlicher etwa 80% oder größer sein wird; zusätzlich ist zu erwarten, daß entsprechende benachbarte Sequenzen von mindestens etwa 13 Nucleotiden vorliegen. Die Übereinstimmung zwischen der genomischen Sequenz des mutmaßlichen HCV-Stamms und der CDC/HCV 1-cDNA-Sequenz kann nach im Fachgebiet bekannten Techniken bestimmt werden. Beispielsweise kann sie durch direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotide von dem mutmaßlichen HCV und der hier beschriebenen HCV-cDNA-Sequenz(en) bestimmt werden. Sie kann beispielsweise auch durch Hybridisierung der Polynucleotide unter Bedingungen bestimmt werden.In addition to the above, the following parameters of nucleic acid homology and amino acid homology, either alone or in combination, are useful in identifying a strain or isolate as HCV. Since HCV strains and isolates are evolutionarily related, it is expected that the total homology of the genomes at the nucleotide level will probably be about 40% or greater, probably about 60% or greater, and more likely about 80% or greater; in addition, it is expected that corresponding adjacent sequences of at least about 13 nucleotides will be present. The correspondence between the genomic sequence of the putative HCV strain and the CDC / HCV 1 cDNA sequence can be determined by techniques known in the art. For example, it can be determined by directly comparing the sequence information of the polynucleotide from the putative HCV and the HCV cDNA sequence (s) described herein. It can also be determined, for example, by hybridization of the polynucleotides under conditions.

die stabile Duplexe zwischen homologen Regionen bilden (z. B. jene, die vor der S,-Digestion benutzt würden), worauf Digestion mit (einer) einzelsträngigen spezifischen Nuclease(n) folgt, woran sich Größenbestimmung der digerierten Fragmente anschließt. Wegen der evolutionären Verwandtschaft der HCV-Stämme oder -Isolate sind die mutmaßlichen HCV-Stämme oder -Isolate durch ihre Homologie auf dem Polypeptldniveau identifizierbar. Im allgemeinen wird angenommen, daß die HCV-Stämme oder -Isolate zu mehr als etwa 40% homolog sind, wahrscheinlich zu mehr als etwa 70% homolog sind und noch wahrscheinlicher zu mehr als etwa 80% hc;nolog sind, und einige können auf dem Polypeptidniveau sogar zu mehr als etwa 90% homolog sein. Die Techniken zur Bestimmung der Aminosäuresequenzhomologie sind im Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz direkt bestimmt und mit den hier verfügbar gemachten Sequenzen verglichen werden. Zum anderen kann die Nucleotidsequenz des genomischen Materials des mutmaßlichen HCV (gewöhnlich über ein cDNA-Zwischenprodukt) bestimmt werden, die darin codierte Aminosäuresequenz kann bestimmt werden, und die entsprechenden Regionen können verglichen werden.forming stable duplexes between homologous regions (e.g., those used prior to S, digestion), followed by digestion with single-stranded specific nuclease (s), followed by sizing of the digested fragments. Because of the evolutionary relatedness of the HCV strains or isolates, the putative HCV strains or isolates are identifiable by their homology at the polypeptide level. In general, it is believed that the HCV strains or isolates are more than about 40% homologous, are likely to be more than about 70% homologous, and more likely to be greater than about 80% hc; nolog, and some may be present on the Polypeptide level even more than about 90% homologous. The techniques for determining amino acid sequence homology are known in the art. For example, the amino acid sequence can be determined directly and compared to the sequences made available here. On the other hand, the nucleotide sequence of the genomic material of the putative HCV (usually via a cDNA intermediate) can be determined, the amino acid sequence encoded therein can be determined, and the corresponding regions can be compared.

Ein Polynucleotid, „abgeleitet von" einer bestimmten Sequenz, bezieht sich hier auf eine Polynucleotidsequenz, die aus einer Sequenz von ungefähr mindestens etwa 6 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nucleotiden, besser mindestens etwa 10-12 Nucleotiden und am besten etwa 15-20 Nucleotiden besteht, die einer Region der bestimmten Nucleotidsequenz entsprechen. „Entsprechen(d)" bedeutet homolog mit oder komplementär zu der bestimmten Sequenz. Vorzugsweise ist die Sequenz der Region, von der das Polynucleotid abgeleitet ist, homolog mit oder komplementär zu einer Sequenz, die für ein HCV-Genom einmalig ist. Ob eine Sequenz für das HCV-Genom einmalig ist oder nicht, kann durch in Fachkreisen bekannte Techniken bestimmt werden. Beispielsweise kann dio Sequenz mit Sequenzen in Datenbanken, z. B. einer Genbank, verglichen werden, um zu bestimmen, ob sie in einen nicht infizierten Wirt oder anderen Organismen vorhanden ist. Die Sequenz kann auch mit den bekannten Sequenzen anderer viraler Agenzien unter Einschluß derjenigen, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis induzieren, z.B. HAV, HBV und HDV, und mit anderen Vertretern der Flaviviren verglichen werden. Die Übereinstimmung oder Nichtübereinstimmung der abgeleiteten Sequenz mit anderen Sequenzen kann auch durch Hybridisierung unter den geeigneten kontrollierten Bedingungen (stringency conditions) bestimmt werden. Hybridisierungstechniken zur Bestimmung der Komplementaritäi von Nucleinsäuresequenzen sind im Fachgebiet bekannt und werden nachstehend diskutiert. Siehe auch z. B. Maniatis et al. (1982). Ferner kann die fehlende Übereinstimmung der Duplex-Polynucleotide, die durch Hybridisierung gebildet wurden, nach bekannten Techniken bestimmt werden, die z. B. die Digestion mit einer Nuclease wie der Nuclease S1 einschließen, die spezifisch Einzelstrangbereiche in Duplex-Polynucleotiden digeriert. Regionen, von denen typische DNA-Sequenzen „abgeleitet" werden können, umfassen z.B. Regionen, die spezifische Epitope codieren, und nichttranskribierte und/oder nichttranslatierte Regionen, ohne daß sie sich darauf beschränken.A polynucleotide "derived from" a particular sequence herein refers to a polynucleotide sequence consisting of a sequence of approximately at least about 6 nucleotides, preferably at least about 8 nucleotides, more preferably at least about 10-12 nucleotides, and most preferably about 15-20 nucleotides corresponding to a region of the particular nucleotide sequence. "Matching (d)" means homologous with or complementary to the particular sequence. Preferably, the sequence of the region from which the polynucleotide is derived is homologous with or complementary to a sequence unique to an HCV genome. Whether or not a sequence is unique to the HCV genome can be determined by techniques known in the art. For example, the sequence with sequences in databases, for. A library, to determine if it is present in an uninfected host or other organisms. The sequence may also be linked to the known sequences of other viral agents, including those known to induce hepatitis, e.g. HAV, HBV and HDV, and to be compared with other representatives of the flaviviruses. Matching or disagreement of the deduced sequence with other sequences can also be determined by hybridization under the appropriate stringency conditions. Hybridization techniques for determining the complementarity of nucleic acid sequences are known in the art and are discussed below. See also z. B. Maniatis et al. (1982). Furthermore, the mismatch of the duplex polynucleotides formed by hybridization can be determined by known techniques, e.g. For example, digestion may include digestion with a nuclease such as nuclease S1, which specifically digests single stranded regions into duplex polynucleotides. Regions from which typical DNA sequences can be "derived" include, for example, but are not limited to, regions that encode specific epitopes and non-transcribed and / or untranslated regions.

Das abgeleitete Polynucleotid ist nicht notwendigerweise physisch von der dargestellten Nucleotidsequenz abgeleitet, kann aber auf jede Weise erzeugt werden, z. B. durch chemische Synthese oder DNA-Replikation oder Umkehrtranskription oder Transkription. Ferner können Kombinationen der Regionen, die der der bestimmten Sequenz entsprechen, auf im Fachgebiet bekannten Wegen modifiziert werden, um mit einer vorgesehenen Verwendung vereinbar zu sein.The deduced polynucleotide is not necessarily physically derived from the nucleotide sequence shown, but can be generated in any manner, e.g. By chemical synthesis or DNA replication or reverse transcription or transcription. Further, combinations of the regions corresponding to those of the particular sequence may be modified in a manner known in the art to be compatible with an intended use.

Ähnlich bezieht sich ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, „abgeleitet von" einer bestimmten Nucleinsäureseque />z, auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die mit der eines in der Sequenz codierten Polypeptide identisch ist, oder einen Teil desselben, wobei der Teil aus mindestens 3-5 Aminosäuren und besonders bevorzugt aus mindestens 8-10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt aus mindestens 11-15 Aminosäuren besteht oder mit einem in der Sequenz codierten Polypeptid immunologisch identifizierbar ist.Similarly, a polypeptide or amino acid sequence "derived from" a particular nucleic acid sequence refers to a polypeptide having an amino acid sequence identical to or part of a polypeptide encoded in the sequence, which portion comprises at least 3-5 amino acids, and more preferably at least 8-10 amino acids, and even more preferably at least 11-15 amino acids, or is immunologically identifiable with a polypeptide encoded in the sequence.

Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid ist nicht notwendigerweise aus einer bestimmten Nuclainsäuresequenz, z. B. den hier beschriebenen HCV-cDNA-Sequenzen, oder aus einem HCV-Genom translatiert; es kann auf jede Weise erzeugt werden, incl. z. B. durch chemische Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressionssystems oder Isolierung aus mutierten HCV. Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid kann ein Analogon oder mehrere Analoga der Aminosäuren oder nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuren in seiner Sequenz enthalten. Verfahren zum Inserieren von Analoga der Aminosäuren in eine Sequenz sind im Fachgebiet bekannt. Es kann auch eine oder mehrere Markierungen enthalten, die in Fachkreisen bekannt sind.A recombinant or derived polypeptide is not necessarily of a particular nucleanic acid sequence, e.g. B. the HCV cDNA sequences described herein, or translated from an HCV genome; it can be generated in any way, incl. By chemical synthesis or expression of a recombinant expression system or isolation from mutated HCV. A recombinant or derived polypeptide may contain one or more analogues of the amino acids or non-naturally occurring amino acids in its sequence. Methods of inserting analogs of the amino acids into a sequence are known in the art. It may also contain one or more markers known in the art.

Der Terminus „rekombinantes Polynucleotid" bedeutet hier ein Polynucleotid genomischen, cDNA-, halbsynthetischen oder synthetischen Ursprungs, das auf Grund seines Ursprungs oder der Manipulation (1) nicht mit dem gesamten Polynucleotid oder einem Teil eines Polynucleotide assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) an ein Polynucleotid gebunden ist, das von dem verschieden ist, an das es in der Natur gebunden ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt. Der Terminus „Polynucleotid" bezieht sich hier auf eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Terminus bezieht son nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt dieser Terminus doppelsträngige und einzelsträngige DNA und doppelsträngige und einzelsträngige RNA ein. Er umfaßt auch bekannte Modifizierungstypen, z. B, im Fachgebiet bekannte Markierungen, Methylierung, „Caps", Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nucleotide mit einem Analogon, Internucleotidmodifikationen wie z. B. jene mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Bindungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate usw.), jene, die anhängende Teile enthalten, z. B. Proteine (incl. z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly. L Lysin usw.), jene mit interkalierenden Agenzien (z.B. Acridin, Psoralen usw.), jene, die Chelatbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxydative Metalle usw.), jene, die Alkylierungsmittel enthalten, jene mit modifizierten Bindungen (z.B. alpha-anomere Nucleinsäuren usw.) und nichtmodifizierte Formen des Polynucleotide. Der Terminus „gereinigtes virales Polynucleotid" bezieht sich auf ein HCV-Genom oder ein Fragment desselben, das im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 50%, bevorzugt weniger als etwa 70% und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 90% zellulärer Komponenten enthält, mit denen das virale Polynuclaotid natürlich assoziiert ist. Techniken zur Reinigung von viralen Polypeptiden sind im Fachgebiet bekannt, und Beispiele für diese Techniken werden nachstehend diskutiert. Der Terminus „gereinigtes virales Polynucleotid" bezieht sich auf ein HCV-Genom oder ein Fragment desselben, das im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 20%, bevorzugt weniger als etwa K0% und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 70% der Polypeptide enthält, mit denen das virale Polynucleotid natürlich assoziiert ist. Techniken zur Reinigung viraler Polynucleotide von Viruspartikeln sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z. B. die Spaltung der Partikel mit einem chaotropen Agens und die Trennung des/der Polynucleotids/Polynucleotide und Polypeptide du ch lonenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentation nach der Dichte.As used herein, the term "recombinant polynucleotide" means a polynucleotide of genomic, cDNA, semisynthetic or synthetic origin that by its origin or manipulation (1) is not associated with the entire polynucleotide or a portion of a polynucleotide with which it is naturally (2) is bound to a polynucleotide different from that to which it is attached in nature, or (3) is not found in nature The term "polynucleotide" as used herein refers to a polymeric form of Nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term only refers to the primary structure of the molecule. Thus, this term includes double-stranded and single-stranded DNA and double-stranded and single-stranded RNA. It also includes known modification types, e.g. B, markers known in the art, methylation, "caps", substitution of one or more naturally occurring nucleotides with an analog, internucleotide modifications such as those with uncharged bonds (e.g., methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoamidates, carbamates, etc.) and with charged bonds (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.), those containing pendant moieties, e.g., proteins (including, for example, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly L Lysine, etc.), those with intercalating agents (eg, acridine, psoralen, etc.), those containing chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, boron, oxidative metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, alpha- anomeric nucleic acids, etc.) and unmodified forms of the polynucleotide The term "purified viral polynucleotide" refers to a HCV genome or fragment thereof that is substantially free, i. H. less than about 50%, preferably less than about 70%, and even more preferably less than about 90%, of cellular components with which the viral polynuclotide is naturally associated. Techniques for purifying viral polypeptides are known in the art, and examples of these techniques are discussed below. The term "purified viral polynucleotide" refers to a HCV genome or fragment thereof that is substantially free, ie, contains less than about 20%, preferably less than about K0%, and even more preferably less than about 70%, of the polypeptides Techniques for purifying viral polynucleotides of virus particles are known in the art and include, for example, cleavage of the particles with a chaotropic agent and separation of the polynucleotide / polynucleotides and polypeptides of ion exchange chromatography, Affinity chromatography and sedimentation by density.

„Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zellinien", „Zellkulturen" und andere derartige Termini, die Mikroorganismen oder höhere eukaryontische Zellinien bezeichnen, die als einzellige Gebilde kultiviert wurden, beziehen sich auf Zellen, die als Reziplenten für rekombinante Vektor- oder andere Transfer-DNA benutzt werden können oder wurden, und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert wurde. Es versteht sich, daß die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle nicht unbedingt in der Morphologie oder im genomischen oder gesamten DNA-Komplement vollständig identisch mit dem ursprünglichen Elternteil ist, was auf natürliche, zufällige oder beabsichtigte Mutation zurückzuführen ist."Recombinant host cells", "host cells", "cells", "cell lines", "cell cultures" and other such termini which refer to microorganisms or higher eukaryotic cell lines cultured as single-celled entities refer to cells recited as recombinant Vector or other transfer DNA can or may be used, and includes the progeny of the original cell that has been transfected It is understood that the progeny of a single parent cell are not necessarily completely identical in morphology or in genomic or total DNA complement with the original parent, which is due to natural, accidental or intentional mutation.

Ein „Replikon" ist ein genetisches Element, z. B. sin Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid usw., das sich als autonome Einheit der Polynucleotidreplikation in einer Zelle verhält, d. h. zur Replication unter seiner eigenen Kontrolle in der Lage ist.A "replicon" is a genetic element, such as a plasmid, a chromosome, a virus, a cosmid, etc. that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication in a cell, ie, capable of replication under its own control ,

Ein „Vektor" ist ein Replikon, an das ein anderes Polynuclr,otidsegment gebunden ist, um die Replikation und/oder Expression des gebundenen Segments herbeizuführe:.A "vector" is a replicon to which another polynucleotide is bound, otidsegment, to bring about the replication and / or expression of the bound segment :.

„Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden Sequenzen zu bewirken, an die sie ligiert sind. Die Natur dieser Kontrollsequenzen ist in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus verschieden, in Prokaryonten gehören zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen der Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle und Terminatoren; in Eukaryonten gehören zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren, Terminatoren und manchmal Verstärker. Der Terminus „Kontrollsequenz" soll mindestens alle Komponenten enthalten, deren Gegenwart für die Expression notwendig ist, und kann zusätzliche Komponenten enthalten, deren Gegenwart vorteilhaft ist, z. B. Leader-Sequenzen."Control sequence" refers to polynucleotide sequences necessary to effect the expression of the coding sequences to which they are ligated The nature of these control sequences is different depending on the host organism, in prokaryotes such control sequences generally include the promoter, which In eukaryotes, such control sequences generally include promoters, terminators, and sometimes enhancers The term "control sequence" is intended to include at least all components whose presence is necessary for expression and may contain additional components whose presence is beneficial , z. B. Leader sequences.

„Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Juxtaposition (Anlagerung), bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die an eine codierende Sequenz „operabel gebunden" ist, ist in einer solchen Weise ligiert, daß die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen vereinbar sind."Operably linked" refers to a juxtaposition (attachment) in which the components so described are in a relationship that allows them to function in their intended manner: a control sequence that is "operably linked" to a coding sequence, is ligated in such a manner that expression of the coding sequence is achieved under conditions consistent with the control sequences.

Ein „open reading frame" (ORF) (offene Leseraster) ist eine Region einer Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert; diese Region kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine gesamte codierende Sequenz darstellen.An "open reading frame" (ORF) is a region of a polynucleotide sequence encoding a polypeptide, which region may be part of a coding sequence or an entire coding sequence.

Eine „codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, dio in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter Regulations-Sequenzen gestellt wird. Die Begrenzungen der codierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon am B'-Ende und ein Translations-Stoppcodon am 3'-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein.A "coding sequence" is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and / or translated into a polypeptide when placed under the control of appropriate regulatory sequences The boundaries of the coding sequence are translated by a translation start codon at the B 'end and a translation stop codon at the 3'-end A coding sequence may include, but is not limited to, mRNA, cDNA and recombinant polynucleotide sequences.

„Immunologisch identifizierbar mit/als" bezieht sich auf die Gegenwart eines Epitops und Polypeptide (von Epitopen und Polypeptiden), die auch in dem (den) bestimmten Polypeptid(en), gewöhnlich HCV-Proteinen, zugegen sind. Die immunologische Identität kann durch Antikörperbindung und/oder Konkurrenz bei der Bindung bestimmt werden; diese Techniken sind in Fachkreisen bekannt und werden nachstehend veranschaulicht."Immunologically identifiable with / as" refers to the presence of an epitope and polypeptides (of epitopes and polypeptides) that are also present in the particular polypeptide (s), usually HCV proteins. The immunological identity may be due to antibody binding and / or competition in binding, these techniques are known in the art and are illustrated below.

„Epitop" bezieht sich hier auf eine antigene Determinante eines Polypeptids; ein Epitop könnte 3 Aminosäuren in einer räumlichen Konformation enthalten, die einmalig für das Epitop ist, im allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens 5 derartigen Aminosäuren und gewöhnlich aus mindestens 8-10 derartigen Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der räumlichen Konformation der Aminosäuren sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z. B. die Röntgenkristallographie und die zweidimensionalc NMR.As used herein, "epitope" refers to an antigenic determinant of a polypeptide; an epitope could contain 3 amino acids in a spatial conformation unique to the epitope, generally an epitope consists of at least 5 such amino acids, and usually at least 8-10 such amino acids Methods for determining the spatial conformation of the amino acids are known in the art and include, for example, X-ray crystallography and two-dimensional NMR.

Ein Polypeptid ist „immunologisch reaktiv" mit einem Antikörper, wenn es sich wegen der Antikörpererkennung eines spezifischen Epitops, das im Polypeptid enthalten ist, an einen Antikörper bindet. Die immunologische Reaktivität kann bestimmt werden durch Antikörperbindung, insbesondere durch die Kinetik der Antikörperbindung, und/oder durch Konkurrenz bei der Bindung, wobei als „Konkurrent(en)" ein bekanntes Polypeptid (Polypeptide) verwendet wird, das ein Epitop enthält, gegen das der Antikörper gerichtet ist. Die Techniken, mit denen bestimmt werden kann, ob ein Polypeptid mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, sind im Fachgebiet bekannt.A polypeptide is "immunologically reactive" with an antibody when it binds to an antibody because of the antibody recognition of a specific epitope contained in the polypeptide.The immunological reactivity can be determined by antibody binding, especially by the kinetics of antibody binding, and / or by competition in binding, using as a "competitor (s)" a known polypeptide (polypeptides) containing an epitope against which the antibody is directed. The techniques by which it can be determined whether a polypeptide is immunologically reactive with an antibody are known in the art.

Der Terminus „immunogenes Polypeptid" bedeutet hier ein Polypeptid, das eine zelluläre und/oder humorale Antwort entweder allein oder gebunden an einen Carrier in Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans auslöst.As used herein, the term "immunogenic polypeptide" means a polypeptide that elicits a cellular and / or humoral response either alone or bound to a carrier in the presence or absence of an adjuvant.

Der Terminus „Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und nicht auf die spezifische Länge des Produkts; so gehören Peptide, Oligopeptide und Proteine zum Definitionsbereich des Polypeptids. Dieser Terminus bezieht sich auch nicht auf Postexpressionsmodifikationen des Polypeptids, z.B. Glycosilierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dgl., oder schließt diese aus. Einbezogen in die Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (inkl. z. B. nicht in der Natur vorkommende Aminosäuren usw.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie andere im Fachgebiet bekannte Modifikationen, die natürlich vorkommen und nicht in der Natur vorkommen.The term "polypeptide" refers to a polymer of amino acids rather than the specific length of the product, such as peptides, oligopeptides, and proteins are within the scope of the polypeptide, nor does it refer to post-expression modifications of the polypeptide, eg, glycosylations, acetylations, phosphorylations and the like, and include, for example, polypeptides containing one or more analogues of an amino acid (including, for example, non-naturally occurring amino acids, etc.), polypeptides having substituted bonds, and others in the art known modifications that occur naturally and do not occur in nature.

„Transformation" bezieht sich hier auf die Insertion eines exogenen Polynucleotide in eine Wirtszelle, unabhängig vom Insertionsverfahren, z. B. direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung (f-mating) oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nichtintegrierter Vektor erhalten bleiben, z. B. ein Plasmid, oder anderenfalls in das Wirtsgenom integriert werden."Transformation" refers herein to the insertion of an exogenous polynucleotide into a host cell, regardless of the insertion method, eg, direct uptake, transduction, f-mating, or electroporation The exogenous polynucleotide can be retained as a non-integrated vector. For example, a plasmid or otherwise integrated into the host genome.

„Behandlung" bezieht sich hierauf Prophylaxe und/oder Therapie."Treatment" refers to prophylaxis and / or therapy.

Ein „Individuum" bedeutet hier Wirbeltiere, insbesondere Vertreter der Spezies Säugetiere, und umfaßt Haustiere, Tiere für den Sport und Primaten einschließlich Menschen.An "individual" here means vertebrates, in particular representatives of the species mammals, and includes domestic animals, animals for sport and primates including humans.

Ein „codierender Strang" einer Nucleinsäure, in dem hier benutzten Sinn, enthält die Sequenz, die Sequenzhomologie zu der von mRNA aufweist. Der „anti-sense-Strang" enthält eine Sequenz, die komplementär zu der des „codiei enden Strangs" ist.A "coding strand" of nucleic acid, as used herein, contains the sequence that has sequence homology to that of mRNA. The "antisense strand" contains a sequence that is complementary to that of the "coding strand".

Ein „Plusstrang-Genom" eines Virus ist hier ein solches, bei dem das Genom, entweder RNA oder DNA, einzelsträngig ist und (ein) virale(s) Polypeptid(e) codiert. Beispiele für Plusstrang-RNA-Viren sind Togaviren, Coronaviren, Retroviren, Picornaviren und Caliciviren. Inbegriffen sind auch die Flaviviren, die früher als Togaviren klassifiziert wurden. Siehe Fields u. Knipe (1986).Here, a "plus-strand genome" of a virus is one in which the genome, either RNA or DNA, is single-stranded and encodes a viral polypeptide (s). "Examples of positive-strand RNA viruses are togaviruses, coronaviruses , Retroviruses, picornaviruses and caliciviruses, including the flaviviruses, formerly classified as togaviruses, see Fields and Knipe (1986).

Eine „antikörperhaltige Körperkomponema" bezieht sich hier auf eine Komponente des Körpers eines Individuums, die Quelle der interessierenden Antikörper ist. Antikörperhaltige Korperkomponenten sind im Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Plasma, Serum, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lymphe, die äußeren Sektionen des Respirations-, Intestinal-Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutzellen und Myelome.Antibody-containing body components are known in the art and include, but are not limited to, eg, plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymph , the outer sections of the respiratory, intestinal urogenital tract, tears, saliva, milk, white blood cells and myelomas.

„Gereinigtes HCV" bezieht sich hier auf ein Präparat von HCV, das aus den Zellbestandteilen, mit denen das Virus normalerweise assoziiert ist, und aus anderen Typen von Viren, die im infizierten Gewebe zugegen sein können, isoliert wurde. Die Techniken zurAs used herein, "purified HCV" refers to a preparation of HCV that has been isolated from the cell constituents with which the virus is normally associated and from other types of viruses that may be present in the infected tissue

Virusisoliarung sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. Zentrifugieren und Affinitätschromatographie. Ein Verfahren zurVirusisoliarung are known in the art and include z. Centrifugation and affinity chromatography. A procedure for Präparation von gereinigtem HCV wird nachstehend diskutiert.Preparation of purified HCV is discussed below. Der Terminus „HCV-Partikeln" umfaßt hier das gesamte Virion wie auch Partikeln, die Zwischenprodukte der Virionbildung sind.The term "HCV particles" here includes the entire virion as well as particles that are intermediates of virion formation. HCV-Partikeln haben im allgemeinen ein oder mehr HCV-Proteine, die mit der HCV-Nucleinsäure assoziiert sind.HCV particles generally have one or more HCV proteins associated with the HCV nucleic acid. Der Terminus „Sonde" bezieht sich hier auf ein Polynucleotid, das mit einer Sequenz in einer Targetregion eine HybridstrukturThe term "probe" as used herein refers to a polynucleotide having a sequence in a target region of a hybrid structure

bildet, was auf die Komplementarität von mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in der Targetregionzurückzuführen ist. Die Sonde enthält jedoch keine Sequenz, die zu der/den Sequenz(on) komplementär ist, die zum Starten derwhich is due to the complementarity of at least one sequence in the probe with a sequence in the target region. However, the probe does not contain a sequence that is complementary to the sequence (on) used to start the

Polymerase-Kettenreaktion benutzt wird/werden.Polymerase chain reaction is / are used. Der Terminus ,Targetregion" bezieht sich hier auf eine Region der Nucleinsäure, die zu verstärken und/oder nachzuweisen ist.The term "target region" as used herein refers to a region of the nucleic acid that is to be amplified and / or detected. Der Terminus „Virus-RNA", der HCV-RNA einschließt, bezieht sich hier auf die RNA des Virusgenoms, Fragmente desselben,The term "virus RNA", which includes HCV RNA, refers here to the RNA of the virus genome, fragments thereof, Transkripte dessolben und davon abgeleitete mutierte Sequenzen.Transcripts of the same and mutant sequences derived therefrom. Der Terminus „biologische Probe" bezieht sich hier auf eine aus einem Individuum isolierte Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe,The term "biological sample" here refers to a tissue or fluid sample isolated from an individual,

wozu z.B. Plasma, Serum, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lymphe, die äußeren Sektionen der Haut, des Respirations-, Intestinei-und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organe und auch Proben der In-vitro-Zellkulturbestandteile(inkl. ein konditioniertes Medium, das aus dem Wachstum von Zellen im Zellkulturmedium resultiert, mutmaßlich virusinfiziertewhere for example Plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymph, outer skin, respiratory, intestinal and urogenital tracts, tears, saliva, milk, blood cells, tumors, organs and also samples of in vitro cell culture components (incl. a conditioned medium resulting from the growth of cells in the cell culture medium is suspected of being virus infected

Zellen, rekombinante Zellen und Zellkomponenten, aber nicht auf diese beschränkt) gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein.But not limited to cells, recombinant cells, and cell components) include but are not limited to. II. Beschreibung der ErfindungII. Description of the invention

Bei der praktischen Ausführung der Erfindung werden - wenn nicht anders angegeben - übliche Techniken der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der DNA-Rekombination und der Immunologie angewendet, die in Fachkreisen bekannt sind. Derartige Techniken werden in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe z. B. Maniatis, Fitsch u. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I u. Il (Hrsg. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Hrsg. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hrsg. B.D. Hamas u. S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (Hrsg. R. I. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IR Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Reihe: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors fo- Mammalian Cells (Hrsg. J. H. Miller u. M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 u. Bd. 155 (Hrsg. Wu u. Grossmann bzw. Wu), Mayer u. Walker, Hrsg. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practics, 2.Aufl. (Springer Ve, lag, N. Y.), und Handbook of Experimental Immunology, Bd. MV (Hrsg. D. M. Weir und C. C. Blackwell, 1986). Alle sowohl vor- als auch nachstehend erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen werden hiermit durch Bezugnahme einbezogen.The practice of the invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology, microbiology, recombinant DNA and immunology, which are known in the art. Such techniques are fully described in the literature. See, for example, B. Maniatis, Fitsch u. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I u. Il (ed. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Eds., M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (ed B.D. Hamas and S.J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (Ed. R.I. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IR Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Series: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors foMammalian Cells (ed., J.H. Miller and M.P.Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. Vol. 155 (eds. Wu u. Grossmann and Wu), Mayer u. Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practics, 2nd ed. (Springer Ve, supra, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Vol. MV (eds. D.M. Weir and C.C. Blackwell, 1986). All patents, patent applications and publications mentioned above as well as below are hereby incorporated by reference.

Die nützlichen Materialien und Prozesse der Erfindung werden durch die Bereitstellung einer Familie von Nucleotidsequenzen ermöglicht, die aus cDNA-Banken isoliert wurden, die HCV-cDNA-Sequenzen enthalten. Diese cDNA-Banken wurden von Nucleinsäuresequenzen abgeleitet, die im Plasma eines HCV-infizierten Schimpansen vorhanden sind. Die Konstruktion einer dieser Banken, der „c"-Bank (ATCC No.40394), wurde in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. Verschiedene hier beschriebene Klone, die HCV-cDNA enthalten, wurden aus der „c"-Bank erhalten. Obwohl andere hier beschriebene Klone aus anderen HCV-cDNA-Banken erhalten wurden, wurde die Präsenz der Klone, die die Sequenzen in der „c"-Bank enthalten, bestätigt. Wie in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 diskutiert, hat die Familie der aus der „c"-Bank isolierten HCV-cDNA-Sequenzen ihren Ursprung nicht beim Menschen oder Schimpansen und zeigt keine signifikante Homologie mit Sequenzen, die im HCV-Genom enthalten sind.The useful materials and processes of the invention are made possible by the provision of a family of nucleotide sequences isolated from cDNA libraries containing HCV cDNA sequences. These cDNA libraries were derived from nucleic acid sequences present in the plasma of an HCV-infected chimpanzee. The construction of one of these banks, the "c" bank (ATCC No. 40394), was described in EPO Publication No. 318216. Several clones described herein containing HCV cDNA were obtained from the "c" bank , Although other clones described herein were obtained from other HCV cDNA libraries, the presence of the clones containing the sequences in the "c" bank was confirmed As discussed in EPO Publication No. 3,182,116, the family of HCV cDNA sequences isolated from the "c" bank do not originate in humans or chimpanzees and show no significant homology with sequences contained in the HCV genome.

Die Verfügbarkeit der hier beschriebenen HCV-cDNAs gestattet, Polynucleotidsonden zu konstruieren, die als Reagenzien für den Nachweis von viralen Polynucleotiden in biologischen Proben einschließlich Spenderblut brauchbar sind. Beispielsweise ist es möglich, aus den Sequenzen DNA-Oligomere von etwa 8-10 Nucleotiden oder größere zu synthetisieren, die als Hybridisierungssonden brauchbar sind, um die Gegenwart von HCV-RNA z. B. in Spenderblut, Seren von Individuen, von denen vermutet wird, daß sie das Virus beherbergen, oder Zellkultursystemen nachzuweisen, in denen das Virus repliziert wird. Außerdem gestatten die cDNA-Sequenzen auch die Konstruktion und Produktion von HCV-spezifischen Polypeptiden, die als diagnostische Reagenzien auf die Gegenwart von Antikörpern brauchbar sind, die während der HCV-lnfektion gebildet wurden. Antikörper zu gereinigten Polypeptiden, die von den cDNAs abgeleitet sind, können auch verwendet werden, um Virusantigene in biologischen Proben einschließlich z. B. Spenderblutproben, Seren von Patienten mit NANBH und in Gewebekultursystemen nachzuweisen, die für die HCV-Replikation benutzt werden. Außerdem sind die hier offenbarten immunologenen Polypeptide, die in Teilen des in Fig. 17 dargestellten ORF der HCV-cDNA codiert sind, auch für HCV-Screening, Diagnose und Behandlung und für die Bildung von Antikörpern von Nutzen, die auch für diese Zwecke brauchbar sind.The availability of the HCV cDNAs described herein allows to construct polynucleotide probes useful as reagents for the detection of viral polynucleotides in biological samples, including donor blood. For example, it is possible to synthesize from the sequences DNA oligomers of about 8-10 nucleotides or larger, which are useful as hybridization probes to detect the presence of HCV RNA, e.g. In donor blood, sera from individuals suspected of harboring the virus, or cell culture systems in which the virus is replicated. In addition, the cDNA sequences also permit the construction and production of HCV-specific polypeptides useful as diagnostic reagents for the presence of antibodies produced during HCV infection. Antibodies to purified polypeptides derived from the cDNAs may also be used to target viral antigens in biological samples, including e.g. To detect donor blood samples, sera from patients with NANBH, and tissue culture systems used for HCV replication. In addition, the immunoligoid polypeptides disclosed herein, which are encoded in portions of the HCV cDNA ORF shown in Figure 17, are also useful for HCV screening, diagnosis and treatment, and for the generation of antibodies that are also useful for these purposes ,

Außerdem ermöglichen die hier beschriebenen neuen cDNA-Sequenzen die weitere Charakterisierung des HCV-Genoms. Polynucleotidsonden und Primer, die von diesen Sequenzen abgeleitet sind, können benutzt werden, um in cDNA-Banken vorhandene Sequenzen zu verstärken und/oder cDNA-Banken auf zusätzliche überlappende cDNA-Sequenzen zu screenen, die ihrerseits benutzt werden können, um stärker überlappende Sequenzen zu erhalten.In addition, the new cDNA sequences described herein allow further characterization of the HCV genome. Polynucleotide probes and primers derived from these sequences can be used to amplify sequences present in cDNA libraries and / or to screen cDNA libraries for additional overlapping cDNA sequences, which in turn can be used to assign more overlapping sequences receive.

Wie nachstehend und in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 gezeigt wird, scheint das Genom des HCV im wesentlichen aus einem großen offenen Leseraster (ORF) zu bestehen, das ein großes Polyprotein codiert.As shown below and in EPO Pub. No. 3,182,116, the genome of HCV appears to consist essentially of a large open reading frame (ORF) encoding a large polyprotein.

Die hier verfügbar gemachten HCV-cDNA-Sequenzen, die von diesen Sequenzen abgeleiteten Polypeptide und die hier beschriebenen immunogenen Polypeptide sowie auch die Antikörper, die gegen diese Polypeptide gerichtet sind, sind auch von Nutzen bei der Isolierung und Identifizierung des/der durch Blut übertragenen NANBV-(BB-NANBV)-Agens/Agenzien. Beispielsweise können Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, die in von den cDNA abgeleiteten Polypeptiden enthalten sind, bei auf der Affinitätschromatographie beruhenden Prozessen benutzt werden, um das Virus zu isolieren. Anderenfalls können die Antikörper benutzt werden, um mit anderen Techniken isolierte Viruspartikeln zu identifizieren. Die Virtisantigene und das genomische Material innerhalb der isolierten Viruspartikeln können dann weiter charakterisiert werden. Zusätzlich zu dem Vorstehenden gestatten die nachstehend verfügbar gemachten Informationen die Identifizierung weiterer HCV-Stämme oder -Isolate. Die Isolierung und Charakterisierung der zusätzlichen HCV-Stämme oder -Isolate kann durchThe HCV cDNA sequences provided herein, the polypeptides derived from these sequences, and the immunogenic polypeptides described herein as well as the antibodies directed against these polypeptides are also useful in isolating and identifying the blood-borne NANBV - (BB-NANBV) -Agens / agents. For example, antibodies directed against HCV epitopes contained in cDNA-derived polypeptides can be used in affinity chromatography-based processes to isolate the virus. Otherwise, the antibodies can be used to identify isolated virus particles using other techniques. The virtis antigens and the genomic material within the isolated virus particles can then be further characterized. In addition to the above, the information provided below permits the identification of additional HCV strains or isolates. The isolation and characterization of the additional HCV strains or isolates can be accomplished by

Isolierung der Nucleinsäuren aus Körperkomponenten, die Viruspartikeln und/oder Virus-RNA enthalten, Schaffung von cDNA-Bankf, η unter Verwendung von Polynucleotidsonden, die auf den nachstehend beschriebenen HCV-cDNA-Sonden beruhen, Screenen der Banken hinsichtlich Klonen, die nachstehend beschriebene HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, und Vergleich der HCV-cDNAs aus den neuen Isolaten mit den nachitehend beschriebenen cONAs erreicht werden. Die darin oder im Virusgenom codierten Polypeptide können hinsichtlich der immunologischen Kreuzreaktivität unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Polypeptide und Antikörper überwacht werden. Stämme oder Isolate, die zu den Parametern des HCV passen, die vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben wurden, sind leicht identifizierbar. Andere Verfahren zur Identifizierung der HCV- Stämme werden für Fachleute- ausgehend von den hier verfügbar gemachten Informationen - klar.Isolating the nucleic acids from body components containing virus particles and / or viral RNA, creating cDNA library, η using polynucleotide probes based on the HCV cDNA probes described below, screening the banks for cloning, the HCV described below contain cDNA sequences, and comparison of HCV cDNAs from the new isolates can be achieved with the cONAs described below. The polypeptides encoded therein or in the viral genome can be monitored for immunological cross-reactivity using the polypeptides and antibodies described above. Strains or isolates that fit the parameters of the HCV described in the Definitions section above are easily identifiable. Other methods of identifying HCV strains will be apparent to those skilled in the art, based on the information provided herein.

Isolierung der HCV-cDNA-SequenzenIsolation of HCV cDNA sequences

Die nachstehend beschriebenen neuen HCV-cDNA-Sequenzen erwei'jrn die Sequenz der cDNAauf das HCV-Genom, über das in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 berichtet wurde. Die Sequeni^n, die in den Klonen b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi 14a, CA 167b, CA 156β, CA84a und CA59a vorliegen, befinden sich stromaufwärts von der dargestellten Sequenz und liefern zusammengestellt (compiled) die Nucleotide Nr. 1310 bis 1348 der zusammengesetzten HCV-cDNA-Sequenz. (Die negative Nummer an einem Nucleotid gibt seine Entfernung stromaufwärts von dem Nucleotid an, das das mutmaßliche Methionin-Initiationscodcn startet.) Die Sequenzen, die in den Klonen b5e und 16jh vorliegen, liegen stromabwärts von der dargestellten Sequenz und ergeben die Nucleotide Nr.8659 bis 8866 der zusammengesetzten Sequenz. Die zusammengesetzte HCV-cDNA-Sequenz, die die Sequenzen in den obenerwähnten Klonen einschließt, zeigt Fig. 17. Die hier beschriebenen neuen HCV-cDNAs wurden aus einer Reihe von HCV-cDNA-Banken isoliert, die die „c"-Bank einschließen, die in lambda gt 11 (ATCC Nr. 40394) vorhanden ist. Die HCV-cDNA-Banken wurden unter Verwendung von Poolserum von einem Schimpansen mit chronischer HCV-lnfektion konstruiert, das einen hohen Titer des Virus hat, d. h. mindestens 10e infektiöse Schimpansendosen/ml (chimp infectious doses/ml - CID/ml). Das Poolserum wurde zur Isolierung der Viruspartikeln benutzt; die aus diesen Partikeln isolierten Nucleinsäuren wurden als Matrize bei der Konstruktion von cDNA-Banken zu dem Virusgenom benutzt. Die Verfahren zur Isolierung der mutmaßlichen HCV-Partikeln und zur Konstruktion der „c'-HCV-cDNA-Bank werden in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. Andere Verfahren für die Konstruktion von HCV-cDNA-Banken sind im Fachgebiet bekannt, und einige dieser Verfahren werden nachstehend in den Beispielen beschrieben. Die Isolierung der Sequenzen erfolgte durch Screenen der Banken unter Verwendung synthetischer PoK -<ucleotidsonden, deren Sequenzen von der 5'-Region und der 3'-Region der bekannten HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet wurden. Die Beschreibung der Methode zur Wiedergewinnung (retrieval) der cDNA-Sequenzen ist hauptsächlich von historischem Interesse. Die resultierenden Sequenzen (und ihre Komplemente) werden hier verfügbar gemacht, und die Sequenzen oder ein Teil derselben können unter Anwendung von Synthesemethoden oder durch eine Kombination von Synthesemethoden mit der Wiedergewinnung von Teilsequenzen unter Anwendung von Methoden hergestellt werden, die den hier beschriebenen ähneln.The new HCV cDNA sequences described below provide the sequence of the cDNA for the HCV genome reported in EPO Pub. No. 3,182,116. The sequences present in clones b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156β, CA84a, and CA59a are upstream of the sequence shown and are compiled Nucleotides Nos. 1310 to 1348 of the assembled HCV cDNA sequence. (The negative number on a nucleotide indicates its distance upstream of the nucleotide that starts the putative methionine initiation code.) The sequences present in clones b5e and 16jh are downstream of the depicted sequence, yielding nucleotides # 8659 to 8866 of the assembled sequence. The composite HCV cDNA sequence, including the sequences in the above-mentioned clones, is shown in FIG. 17. The novel HCV cDNAs described herein have been isolated from a number of HCV cDNA libraries that include the "c" bank, present in lambda gt 11 (ATCC No. 40394) The HCV cDNA libraries were constructed using pool serum from a chimpanzee with chronic HCV infection having a high titer of the virus, ie at least 10 e infectious chimpanzee doses. The pool serum was used to isolate the virus particles, and the nucleic acids isolated from these particles were used as template in the construction of cDNA libraries to the virus genome The procedures for isolating the putative HCV Particles and for construction of the "c" HCV cDNA library are described in EPO Publication No. 318216. Other methods for the construction of HCV cDNA libraries are known in the art, and are common These methods are described below in the Examples. The isolation of the sequences was accomplished by screening the libraries using synthetic PoK nucleotide probes whose sequences were derived from the 5 'region and the 3' region of the known HCV cDNA sequence. The description of the retrieval method of the cDNA sequences is mainly of historical interest. The resulting sequences (and their complements) are made available herein, and the sequences or part thereof can be prepared using synthetic methods or by a combination of partial-sequence recovery synthetic methods using methods similar to those described herein.

Präparation von viralen Polypeptiden und FragmentenPreparation of viral polypeptides and fragments

Die Verfügbarkeit der HCV-cDNA-Sequenzen oder der davon abgeleiteten Nucleotidsequenzen (einschließlich Segmente und Modifikationen der Sequenz) gestattet die Konstruktion von Expressionsvektoren, die antigen aktive Regionen des Polypeptids codieren, das in einem Strang codiert ist. Diese antigen aktiven Regionen können von Coat- oder Peplos-Antigenen oder von Core-Antigenen oder von Nichtstrukturantigenen einschließlich z.B. Polynucleotid-Bindungsproteinen, Polynucleotiöpolymerase(n) und anderen Virusproteinen abgeleitet sein, die für die Replikation und/oder den Aufbau der Viruspartikel erforderlich sind. Fragmente, die die erwünschten Polypeptide codieren, werden von den cDNA-Klonen unter Anwendung herkömmlicher Restriktionsdigestions- oder Synthesemethoaen abgeleitet und in Vektoren ligiert, die z. B. Teile von Fusionssequenzen wie ß-Galactosidase oder Superoxiddismutase (SOD), vorzugsweise SOD, enthalten können. Methoden und Vektoren, die für die Herstellung von Polypeptiden brauchbar sind, die Fusionssequenzen der SOD enthalten, werden in der EPO-Veröffentlichung Nr. 196056 beschrieben, die am 1 .Oktober 1986 veröffentlich wurde. Vektoren für die Expression von Fusionspolypeptiden von SOD und HCV-Polypeptiden, die in einer Reihe von HCV-Klonen codiert sind, werden nachstehend in den Beispielen beschrieben. Jeder erwünschte Teil der HCV-cDNA, der ein offenes Leseraster in einem codierenden Strang enthält, kann als rekombinantes Polypeptidd, z. B. ein reifes (mature) oder Fusionsprotein, erhalten werden; alternativ kann ein Polypeptid, das in der cDNA codiert ist, durch chemische Synthese verfügbar gemacht werden.The availability of the HCV cDNA sequences or the nucleotide sequences derived therefrom (including segments and modifications of the sequence) permits the construction of expression vectors encoding antigenically active regions of the polypeptide encoded in a strand. These antigenically active regions may be derived from coat or peplos antigens or from core antigens or non-structural antigens including e.g. Polynucleotide binding proteins, Polynucleotiöpolymerase (s) and other virus proteins that are required for the replication and / or construction of the virus particles. Fragments encoding the desired polypeptides are derived from the cDNA clones using conventional restriction digestion or synthesis methods and ligated into vectors, e.g. B. parts of fusion sequences such as ß-galactosidase or superoxide dismutase (SOD), preferably SOD can contain. Methods and vectors useful for the production of polypeptides containing SOD fusion sequences are described in EPO Pub. No. 196056, published October 1, 1986. Vectors for the expression of fusion polypeptides of SOD and HCV polypeptides encoded in a series of HCV clones are described below in the Examples. Any desired portion of the HCV cDNA containing an open reading frame in a coding strand may be expressed as a recombinant polypeptide, e.g. A mature or fusion protein; alternatively, a polypeptide encoded in the cDNA can be made available by chemical synthesis.

Die DNA, die das erwünschte Polypeptid codiert, sei es in fusioniertet' oder reifer Form und mit oder ohne Signalsequenz für die Sekretion, kann in Expressionsvektoren ligiert werden, die für einen passenden Wirt geeignet sind. Sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Wirtsysteme werden gegenwärtig bei der Bildung rekombinanter Polypeptide verwendet, und eine Zusammenfassung der üblicheren Kontrollsysteme und Wirtszellen folgt nachstehend. Das Polypeptid wird danach aus Iy -ierten Zellen oder aus dem Kulturmedium isoliert und dem Verwendungszweck entsprechend gereinigt. Die Reinigung kann nach im Fachgebiet bekannten Techniken erfolgen, z.B. durch differentielle 'Extraktion, Salzfraktionierung, Chromatographie an lopinaustauscherharzen, Aifinitätschromatographie, Zentrifugiertί und dgl. Siehe z.B. Methods in Enzymology hinsichtlich einer Vielzahl von Proteinreinigungsverfahren. Derartige Polypeptide können als diagnostische Mittel verwendet werden, oder jene, die die Neutralisation der Antikörper bewirken, können zu Vakzinen formuliert werden. Antikörper, die gegen diese Polypeptide gebildet werden, können auch als Diagnostika oder für die passive Immunotherapie verwendet werden. Außerdem sind - wie nachstehend ausgeführt wird - Antikörper zu diesen Polypeptiden für Hie Isolierung und Identifizierung von HCV-Partikeln brauchbar.The DNA encoding the desired polypeptide, whether in fused or mature form and with or without signal sequence for secretion, can be ligated into expression vectors suitable for an appropriate host. Both eukaryotic and prokaryotic host systems are currently used in the production of recombinant polypeptides and a summary of the more common control systems and host cells follows below. The polypeptide is then isolated from Iy-cells or from the culture medium and purified according to the intended use. Purification may be by techniques known in the art, e.g. by differential 'extraction, salt fractionation, chromatography on lopine exchange resins, affinity chromatography, centrifuged' and the like. See e.g. Methods in Enzymology for a variety of protein purification methods. Such polypeptides can be used as diagnostic agents, or those that cause neutralization of the antibodies can be formulated into vaccines. Antibodies formed against these polypeptides can also be used as diagnostics or for passive immunotherapy. In addition, as set forth below, antibodies to these polypeptides are useful for isolation and identification of HCV particles.

Präparation von antigenen Polypeptiden und Konjugaten mit dem CarrierPreparation of antigenic polypeptides and conjugates with the carrier

Eine antigene Region eines Polypeptids ist im allgemeinen relativ klein - typischerweise 8-10 Aminosäuren oder weniger lang. Fragmente von nur 5 Aminosäuren können eine antigene Region charakterisieren. Diese Segmente können Regionen des HCV-Antigens entsprechen. Dementsprechend können bei Verwendung der HCV-cDNAs als Basis CHfKs1 die kurze Segmente von HCV-Polypeptiden codieren, rekombinant entweder als Fusionsproteine oder als isolierte Polypeptide exprimiert werden. Ferner können kurze Aminosäuresequenzen bequem durch chemische Synthese erhalten werden. In Fällen, in denen dasAn antigenic region of a polypeptide is generally relatively small - typically 8-10 amino acids or less in length. Fragments of only 5 amino acids can characterize an antigenic region. These segments may correspond to regions of the HCV antigen. Accordingly, using the HCV cDNAs as a basis, CHfKs 1 can encode the short segments of HCV polypeptides, can be recombinantly expressed either as fusion proteins or as isolated polypeptides. Furthermore, short amino acid sequences can be conveniently obtained by chemical synthesis. In cases where that

synthetisierte Polypeptid richtig konfiguriert ist, um das richtige Epitopzu liefern, aber zu klein ist, um immunogen zu sein, kann das Polypeptid an einen geeigneten Carrier gebunden werden.synthesized polypeptide is properly configured to provide the correct epitope, but too small to be immunogenic, the polypeptide can be bound to a suitable carrier.

Eine Reihe von Techniken zur Gewinnung einer solchen Bindung sind im Fachgebiet bekannt, wozu die Bildung von Disulfidbindundsn unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyi)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC von der Pierce Company, Rockford, lllionis) gehören (wenn dem Peptid eine Sulfhydrylgruppe fehlt, kann diese durch Addition eines Cysteinrests beigesteuert werden). Diese Reagenzien bilden eine Disulfidbindung zwischen sich und den Peptiolcysteinresten an einem Protein und eine Amidbindung über die ε-Aminogruppe an einem Lysin oder eine andere freie Aminogruppe in dem anderen. Eine Anzahl solcher Disulfid/Amid bildender Agenzien ist bekannt. Siehe z.B. Immun. Rev. 62 (1982) S. 185. Andere bifunktionelle Verknüpfungsagenzien bilden anstelle einer Disulfidbindung einen Thioether. Viele dieser Thioether bildenden Agenzien sind handelsüblich, und zu ihnen gehören die reaktionsfähigen Ester der 6-Maleimidocapronsäure, der 2-Brimessigsäure, der 2-lodessigsäure, der 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1 -carbonsäure und dgl. Die Carboxylgruppen können durch Kombination mit Succinimid oder 1 -Hydroxyl^-nitro-'tsulfonsäure, Natriumsalz aktiviert werden. Weitere Methoden zur Verknüpfung von Antigenen verwenden das Rotavirus/ „binding peptide"-System, das in der EPO-Veröffentlichung Nr. 259149 beschrieben wird, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme einbezogen wird. Die vorstehende Aufstellung ist nicht als vollständig zu betrachten, und Modifikationen der genannten Verbindungen können natürlich verwendet werden.A number of techniques for obtaining such linkage are known in the art, including the formation of Disulfidbindun d sn using N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) and succinimidyl 4- (N-maleimidomethyi) cyclohexane 1-carboxylate (SMCC from Pierce Company, Rockford, Illionis) (if the peptide lacks a sulfhydryl group, it may be contributed by addition of a cysteine residue). These reagents form a disulfide bond between one another and the peptiol cysteine residues on one protein and an amide bond via the ε-amino group on a lysine or other free amino group in the other. A number of such disulfide / amide-forming agents are known. See eg Immune. Rev. 62 (1982) p. 185. Other bifunctional linking agents form a thioether instead of a disulfide bond. Many of these thioether forming agents are commercially available, and include the reactive esters of 6-maleimidocaproic acid, 2-B r imessigsäure, 2-iodoacetic acid, 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylic acid and the like. Carboxyl groups may be activated by combination with succinimide or 1-hydroxy-nitro-s-sulfonic acid, sodium salt. Other methods for linking antigens utilize the rotavirus / "binding peptide" system described in EPO Publication No. 259149, the disclosure of which is incorporated herein by reference The above list is not to be considered as exhaustive, and modifications of Of course, these compounds can be used.

Verwendet werden kann jeder Carrier, der nicht selbst die Produktion von für den Wirt schädlichen Antikörpern induziert. Geeignete Carrier sind typischerweise große, langsam inetabolisierte Makromoleküle wie Proteine; Polysaccharide wie Latex funktionalisierte Sepharose, Agarose, Cellulose, Celluloseperlen und dgl.; polymere Aminosäuren wie Polyglutaminsäure, Polylysin und dgl.; Aminosäure-Copolymere; und inaktive Viruspartikeln. Besonders nützliche Proteinsubstrate sind Serumalbumine, „keyhole limpef-Hämocyanin, Immunoglobulinmoleküle, Thyreoglobulin, Ovalbumin, Tetanustoxoid und andere in Fachkreisen gut bekannte Proteine.Any carrier that does not itself induce the production of host-damaging antibodies can be used. Suitable carriers are typically large, slowly inetabolised macromolecules such as proteins; Polysaccharides such as latex functionalized sepharose, agarose, cellulose, cellulose beads and the like; polymeric amino acids such as polyglutamic acid, polylysine and the like; Amino acid copolymers; and inactive virus particles. Particularly useful protein substrates are serum albumins, keyhole limpef hemocyanin, immunoglobulin molecules, thyroglobulin, ovalbumin, tetanus toxoid, and other proteins well known in the art.

Neben den Virusproteinen von voller Länge sind Polypeptide, die verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen enthalten, die mindestens ein virales Epitop codieren, brauchbare immunologische Reagenzien. Beispielsweise können Polypeptide, die derartige verkürzte Sequenzen enthalten, als Reagenzien bei einem Immunoassay verwendet werden. Diese Polypeptide sind auch Anwärter für Untereinheitsantigene in Zusammensetzungen für die Antiserumproduktion oder Vakzine. Während diese verkürzten Sequenzen durch verschiedene bekannte Behandlungen von natürlichem Virusprotein erzeugt werden können, wird es im allgemeinen bevorzugt, synthetische oder rekombinante Polypeptide herzustellen, die eine HCV-Sequenz enthalten. Polypeptide, die diese verkürzten HCV-Sequenzen enthalten, können vollständig aus HCV-Sequenzen (ein oder mehrere Epitop(e), entweder benachbart oder nicht benachbart) oder HCV-Sequenzen und heteroiogen Sequenzen in einem Fusionsprotein hergestellt werden. Zu den brauchbaren heteroiogen Sequenzen gehören Sequenzen, die für die Sekretion aus einem rekombinanten Wirt sorgen, die immunologische Reaktivität des/der HCV-Epitops/HCV-Epitope erhöhen oder die Verknüpfung eines Polypeptide mit einem Immunoassay-Träger oder einem Vakzine-Carrier erleichtern. Siehe z. B. EPO-Veröffentlichung 116201, U.S.-Pat.4722840, EPO-Veröffentlichung 259149, U.S.-Pat.4629783, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme einbezogen werden.In addition to full length viral proteins, polypeptides containing truncated HCV amino acid sequences encoding at least one viral epitope are useful immunological reagents. For example, polypeptides containing such truncated sequences can be used as reagents in an immunoassay. These polypeptides are also candidates for subunit antigens in compositions for antiserum production or vaccines. While these truncated sequences can be generated by various known treatments of natural viral protein, it is generally preferred to produce synthetic or recombinant polypeptides containing an HCV sequence. Polypeptides containing these truncated HCV sequences can be made entirely from HCV sequences (one or more epitope (s), either contiguous or non-contiguous) or HCV sequences and heteroiogenic sequences in a fusion protein. Useful heteroiogenic sequences include sequences that provide for secretion from a recombinant host, enhance immunological reactivity of the HCV epitope / HCV epitope, or facilitate linkage of a polypeptide with an immunoassay carrier or vaccine carrier. See, for example, EPO Publication 116201, U.S. Pat. No. 4,722,840, EPO Publication 259149, U.S. Pat. No. 4,629,783, the disclosures of which are incorporated herein by reference.

Die Größe der Polypeptide, die die verkürzten HCV-Sequenzen enthalten, kann in weiten Grenzen variieren, wobei die minimale Größe eine Sequenz von genügender Größe ist, um ein HCV-Epitopzu liefern, während die maximale Größe nicht kritisch ist. Der Einfachheit halber liegt die maximale Größe gewöhnlich nicht wesentlich über der für die Schaffung der gewünschten HCV-Epitope und Funktion(en) der heteroiogen Sequenz, falls vorhanden, erforderlichen. Typischerweise variiert die verkürzte HCV-Aminosäuresequenz in der Länge zwischen etwa 5 und etwa 100 Aminosäuren. Besonders typisch ist jedoch eine HCV-Sequenz von maximal etwa 50 Aminosäuren Länge, vorzugsweise von maximal etwa 30 Aminosäuren Länge. Es ist gewöhnlich wünschenswert, HCV-Sequenzen von mindestens etwa 10,12 oder 15 Aminosäuren bis maximal etwa 20 oder 25 Aminosäuren zu wählen.The size of the polypeptides containing the truncated HCV sequences can vary widely, with the minimum size being a sequence of sufficient size to provide an HCV epitope, while the maximum size is not critical. For simplicity, the maximum size is usually not significantly greater than that required to provide the desired HCV epitopes and function (s) of the heteroiogenic sequence, if any. Typically, the truncated HCV amino acid sequence varies in length between about 5 and about 100 amino acids. However, an HCV sequence of at most about 50 amino acids in length, preferably of at most about 30 amino acids in length, is particularly typical. It is usually desirable to choose HCV sequences of at least about 10, 12 or 15 amino acids to a maximum of about 20 or 25 amino acids.

Verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen, die Epitope enthalten, können auf verschiedenen Wegen identifiziert werden. Beispielsweise kann die ganze Virusproteinsequenz durch Herstellung einer Serie kurzer Peptide gescreent werden, die zusammen die ganze Proteinsequenz überspannen. Ein Beispiel für das Antigen-Screening der Regionen des HCV-Polypro'.oir.s wird nachstehend gegeben. Außerdem wäre es z. B. ausgehend von lOOmer Polypeptiden Routinearbeit, jedes Polypeptid auf die Gegenwart eines/von Epitops/Epitopen zu testen, die die erwünschte Reaktivität zeigen, und dmn nacheinander kleinere und überlappende Fragmente von einem identifizierten lOOmer zu testen, um das interessierende Epitop zu kartieren. Das Screenen solcher Peptide bei einem Immunoassay ist im Fachgebiet bekannt. Es ist auch bekannt, eine Computeranalyse einer Proteinsequenz durchzuführen, um potentielle Epitope zu identifizieren, und dann Oligopeptide, die die identifizierten Regionen enthalten, für das Screenen herzustellen. Eine solche Computeranalyse der HCV-Aminosäuresequenz zeigt Fig. 20, in der der hydrophile/hydrophobe Charakter über dem Antigsn-Index dargestellt ist. Die Aminosäuren sind vom Start-MET (Position 1) numeriert, wie dies Fig. 17 zeigt. Fachleute erkennen, daß eine solche Computeranalyse der Antigenität nicht immer ein Epitop identifiziert, das tatsächlich existiert, und fälschlicherweise eine Proteinregion als epitophaltig identifizieren kann. Beispiele für brauchbare HCV-Aminosäuresequenzen, die von Expressionsvektoren exprimiert werden, die aus den Klonen 5-1-1,81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, CA 167 b bestehen, werden nachstehend beschrieben. Andere Beispiele für HCV-Aminosäuresequenzen, die - wie hier beschrieben - von Nutzen sein können, werden unten dargestellt, b's versteht sich, daß diese Peptide ein Epitop nicht unbedingt genau kartieren und auch eine HCV-Sequenz enthalten können, die nicht immunogen ist. Diese nicht immunogenen Teile der Sequenz können - wie vorstehend beschrieben - unter Anwendung herkömmlicher Techniken definiert und von den beschriebenen Sequenzen deletiert werden. Ferner können zusätzliche verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen, die ein Epitop enthalten oder immunogen sind, wie vorstehend beschrieben, identifiziert werden. Die folgenden Sequenzen werden durch die Aminosäurenummer (d. h. „AAn") angegeben, wobei η die in Fig. 17 angegebene Aminosäurenummer ist:Truncated HCV amino acid sequences containing epitopes can be identified in several ways. For example, the entire viral protein sequence can be screened by producing a series of short peptides which together span the entire protein sequence. An example of the antigen screening of the regions of HCV-Polypro'.oir.s is given below. It would also be z. For example, starting from 10000 polypeptides, routine work is to test each polypeptide for the presence of epitope / epitope (s) exhibiting the desired reactivity and to successively test smaller and overlapping fragments from an identified 100mer to map the epitope of interest. The screening of such peptides in an immunoassay is known in the art. It is also known to perform a computer analysis of a protein sequence to identify potential epitopes and then to produce oligopeptides containing the identified regions for screening. Such a computer analysis of the HCV amino acid sequence is shown in FIG. 20, in which the hydrophilic / hydrophobic character is shown above the Antigsn index. The amino acids are numbered from the starting MET (position 1), as shown in FIG. 17. Those skilled in the art will recognize that such computer analysis of antigenicity does not always identify an epitope that actually exists and may erroneously identify a protein region as epitope-containing. Examples of useful HCV amino acid sequences expressed by expression vectors derived from clones 5-1-1,81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f , 33g, C39c, C40b, CA 167b are described below. Other examples of HCV amino acid sequences which may be useful as described herein are set forth below, it being understood that these peptides may not necessarily accurately map an epitope and may also contain an HCV sequence that is not immunogenic. These non-immunogenic portions of the sequence may be defined as described above using conventional techniques and deleted from the described sequences. Further, additional truncated HCV amino acid sequences containing or immunogenic to an epitope may be identified as described above. The following sequences are indicated by the amino acid number (i.e., "AAn"), where η is the amino acid number indicated in Figure 17:

AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA20-AA25; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-AA90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150; AA150-AA200; AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA22O-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA29O-AA33O; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA20-AA25; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-AA90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150; AA150-AA200; AA155 AA170-; AA190-AA210; AA200-AA250; AA22O-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA29O-AA33O; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;

AA400-AA450; AA405-AA415; AA416-AA425; AA425-AA435; AA437-AA582; AA450-AA500; AA440-AA460; AA460-AA470; AA475 AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA55O-AA625; AA575-AA605; AA585-AA600; AA60O-AA650; AA600-AA625; AA63&-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA70O-AA725; AA700-AA750; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA825-AA850; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA90O; AA920-AA945; AA940-AA965; AA970-AA990; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1025; AAI000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1040-AA1055; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100-AA1130; AA1140-AA1165; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225-AA1250; AA125O-AA1300; AA1260-AA1310; AA126Q-AA1280; AA126fr-AA1428; AA1300-AA1350; AA129O-AA1310; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA134^-AA1365; AA135Ö-AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-AA1500; AA1460-AA1475; AA1475-AA1 515; AA1475-AA1 500; AA1 500-AA1550; AA1 500-AA1 515; AA1 515-AA1 550; AA1 550-AA1600; AA1545-AA1560; AA1 569-AA1931; AA1 570-AA1690; AA1 595-AA1 610; AA1 590-AA1650; AA1610-AA1645; AA165O-AA1690; AA1685-AA1770; AA1689-AA1805; AA1690-AA1720; AA1694-AA1735; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775-AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900-AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950-AA2000; AA1950-AA1985; AA1980-AA2000; AA2000-AA2050; AA2005-AA2025; AA2020-AA2045; AA2045-AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA 2100-AA 2150; AA 2150-AA 2 200; AA2200-AA2250; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2255-AA2270; AA2265-AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA229O-AA2310; AA2310-AA2330; AA2330-AA2350; AA2350-AA2400; AA2348-AA2464; AA2345-AA2415; AA2345-AA23/5; AA2370-AA2410; AA2371-AA2502; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445-AA2500; AA2445-AA2475; AA2470-AA2490; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2535-AA2560; AA2550-AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2605-AA2620; AA2620-AA2650; AA2640-AA2660; AA2650-AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2740-AA2760; AA2750-AA2800; AA27 * /*A2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796-AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA285C; AA<:J50-AA2900; AA2850-AA2865; AA2885-AA2905; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; AA2945-Ende (C'-terminal).AA400-AA450; AA405-AA415; AA416-AA425; AA425-AA435; AA437-AA582; AA450-AA500; AA440-AA460; AA460-AA470; AA475 AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA55O-AA625; AA575-AA605; AA585-AA600; AA60O-AA650; AA600-AA625; AA63 &-AA665;AA650-AA700;AA645-AA680; AA700 AA750; AA70O-AA725; AA700 AA750; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA825-AA850; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA90O; AA920-AA945; AA940-AA965; AA970-AA990; AA950-AA1000; AA1000 AA1060; AA1000 AA1025; AAI000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1040-AA1055; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100-AA1130; AA1140-AA1165; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225-AA1250; AA125O-AA1300; AA1260-AA1310; AA126Q-AA1280; AA126fr-AA1428; AA1300-AA1350; AA129O-AA1310; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA134 ^ -AA1365; AA135Ö-AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-AA1500; AA1460-AA1475; AA1475-AA1 515; AA1475-AA1 500; AA1 500-AA1550; AA1 500-AA1 515; AA1 515-AA1 550; AA1 550-AA1600; AA1545-AA1560; AA1 569-AA1931; AA1 570-AA1690; AA1 595-AA1 610; AA1 590-AA1650; AA1610-AA1645; AA165O-AA1690; AA1685-AA1770; AA1689-AA1805; AA1690-AA1720; AA1694-AA1735; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775-AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900-AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950-AA2000; AA1950-AA1985; AA1980-AA2000; AA2000 AA2050; AA2005-AA2025; AA2020-AA2045; AA2045-AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA 2100-AA 2150; AA 2150-AA 2 200; AA2200-AA2250; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2255-AA2270; AA2265-AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA229O-AA2310; AA2310-AA2330; AA2330-AA2350; AA2350-AA2400; AA2348-AA2464; AA2345-AA2415; AA2345-AA23 / 5; AA2370-AA2410; AA2371-AA2502; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445-AA2500; AA2445-AA2475; AA2470-AA2490; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2535-AA2560; AA2550-AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2605-AA2620; AA2620-AA2650; AA2640-AA2660; AA2650-AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2740-AA2760; AA2750-AA2800; AA27 * / * A2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796-AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA285C; A A <: J50-AA2900; AA2850-AA2865; AA2885-AA2905; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; AA2945 end (C'-terminal).

Die vorstehenden HCV-Aminosäuresequenzen können als diskrete Peptide oder eingebaut in ein größeres Polypeptid hergestellt werden, und, wie hier beschrieben, Verwendung finden. Weitere Polypeptide, die verkürzte HCV-Sequenzen enthalten, werden in den Beispielen beschrieben.The foregoing HCV amino acid sequences can be prepared as discrete peptides or incorporated into a larger polypeptide and used as described herein. Other polypeptides containing truncated HCV sequences are described in the Examples.

Die beobachtete Verwandtschaft der mutmaßlichen Polyproteine des HCV und der Flaviviren gestattet eine gewisse Vorhersage der mutmaßlichen Domänen der „nichtstrukturellen" (NS) HCV-Proteine. Die Lage der einzelnen NS-Proteine in dem mutmaßlichen Flavivirus-Präkursorpolyprotein ist recht gut bekannt. Außerdem stimmt diese auch mit den beobachteten Gesamtf'uktuationen im Hydrophobieprofil des Polyproteins überein. Es ist erwiesen, daß NS5 der Flaviviren die Virionpolymerase codiert und daß NS1 einem Komplementfixationsantigen entspricht, da-s sich als ein wirksamer Vakzin bei Tieren erwiesen hat. Vor kurzem wurde gezeigt, daß NS3 eine flavivirale Proteasefunktion innewohnt. Auf Grund der beobachteten Ähnlichkeiten zwischen HCV und den Flaviviren, die nachstehend beschrieben werden, sind Schlußfolgerungen hinsichtlich der annähernden Lage der entsprechenden Proteindomänen und Funktionen im HCV-Polyprotein möglich. Die Expression der Polypeptide, die diese Domänen enthalten, in einer Vielzahl rekombinanter Wirtszellen, inkl. z. B. Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Wirbeltierzellen, sollte wichtige immunologische Reagenzien hervorbringen, die zur Diagnose, zum Nachweis und für Vakzine verwendet werden können.The observed relationship of the putative polyproteins of HCV and flaviviruses allows some prediction of the putative domains of the "non-structural" (NS) HCV proteins, and the location of the individual NS proteins in the putative flavivirus precursor polyprotein is quite well known It has also been shown that NS5 of the flaviviruses encode the virion polymerase and that NS1 corresponds to a complement fixation antigen, thus proving to be an effective vaccine in animals Because of the observed similarities between HCV and the flaviviruses described below, conclusions can be made as to the approximate location of the corresponding protein domains and functions in the HCV polyprotein: the expression of polypeptides containing these domains en, in a variety of recombinant host cells, incl. Bacteria, yeast, insect and vertebrate cells should produce important immunological reagents that can be used for diagnosis, detection and vaccines.

Obwohl die nichtstrukturellen Proteinregionen der mutmaßlichen Polyproteine des hier beschriebenen HCV-lsolats und der Flaviviren eine gewisse Ähnlichkeit zu haben scheinen, besieht geringere Ähnlichkeit zwischen den mutmaßlichen Strukturregionen nach dem N-Ende hin. In dieser Region besteht eine größere Divergenz in der Sequenz, und das hydrophobe Prom beider Regionen zeigt zudem geringere Ähnlichkeit. Diese „Divergenz" beginnt in der N-terminalen Renion der mutmaßlichen NS1 -Domäne im HCV und erstreckt sich bis zum angenommenen N-Ende. Nichtsdestoweniger kann es noch möglich sein, die annähernde Lage der mutmaßlichen Nucleocapsiddomänd (N-terminale Grunddomäne) und der E 'im allgemeinen hydrophoben)-Domäne innerhalb des HCV-Polyproteins vorherzusagen. In den Beispielen beruhen die Vorhersagen auf den im hydrophoben Profil des HCV-Polyproteins beobachteten Änderungen und der Kenntnis von der Lage und vom Charakter der Flavivirusproteine. Nach diesen Vorhersagen ist es möglich, die annähernden Regionen des HCV-Polyproteins zu identifizieren, die nützlichen immunologischen Reagenzien entsprechen könnten. Beispielsweise ist von den E- und NS1-Proteinen der Flaviviren bekannt, daß sie als protektive Vakzine wirksam sind. Diese Regionen und einige, die sich in dem hier beschriebenen HCV-lsolat als antigen erwiesen haben, beispielsweise jene im mutmaßlichen NS3, C und NS5, müßten auch diagnostische Reagenzien liefern. Außerdem können auch Lage und Expression der viral-codierten Enzyme die Bewertung der antiviralen Ezyminhibitoren, d. h. z. B. der Inhibitoren, die die Enzymaktivität auf Grund einer Wechselwirkung mit dem Enzym selbst verhindern, oder Substanzen, die die Expression des Enzyms verhindern können (z. B. „antisense"-RNA oder andere Arzneimittel, die mit der Expression interferieren), zulassen.Although the nonstructural protein regions of the putative polyproteins of the HCV isolate and flaviviruses described herein appear to have some similarity, less similarity is seen between the putative structural regions after the N-terminus. In this region, there is greater divergence in the sequence, and the hydrophobic prom of both regions also shows less similarity. This "divergence" begins in the N-terminal renion of the putative NS1 domain in the HCV and extends to the supposed N-terminus, however, it may still be possible to approximate the approximate location of the putative nucleocapsiddomand (N-terminal base domain) and the E In the examples, the predictions are based on the changes observed in the hydrophobic profile of the HCV polyprotein and the knowledge of the location and character of the flavivirus proteins, according to these predictions it is possible to predict the overall hydrophobic domain within the HCV polyprotein. For example, the E and NS1 proteins of the flaviviruses are known to be effective as protective vaccines, these regions and some of those described herein HCV isolate, for example, those in the putative NS3, C and NS5, would also have to provide diagnostic reagents. In addition, the location and expression of the virally-encoded enzymes may also facilitate the evaluation of the antiviral enzyme inhibitors, i. H. z. Inhibitors which prevent enzyme activity due to interaction with the enzyme itself, or substances which may prevent the expression of the enzyme (eg, "antisense" RNA or other drugs interfering with expression) ,

Preparation von Hybridpartikel-Immunogenen, die HCV-Epltope enthaltenPreparation of Hybrid Particle Immunogens Containing HCV Epltopes

Die Immunogenität der Epitope des HCV kann auch erhöht werden, indem sie in Säugetier- oder Hefesystemen hergestellt werden, die mit partikelformenden Proteinen wie z. B. solchen, die mit Hepatitis-B-Oberflächenantigen assoziiert sind, fusioniert oder aufgebaut (assembled) sind. Konstrukte (constructs), bei denen das NANBV-Epitop direkt an die partikelformendes Protein codierenden Sequenzen gebunden ist, produzieren Hybride, die immunogen in bezug auf das HCV-Epitop sind. Ferner enthalten alle hergestellten Vektoren gegenüber HBV spezifische Epitope, die unterschiedliche Immunogenitätsgrade haben w'e z.B. das pre-S-Peptid. Somit sind die Partikeln, die aus partikelformendem Protein konstruiert wurden und HCV-Sequenzen enthalten, in bezug auf HCV und HBV immunogen.The immunogenicity of the epitopes of HCV can also be increased by making them in mammalian or yeast systems which are loaded with particle-forming proteins, such as e.g. For example, those associated with hepatitis B surface antigen are fused or assembled. Constructs in which the NANBV epitope is directly linked to the particle-forming protein-encoding sequences produce hybrids that are immunogenic with respect to the HCV epitope. Further, all vectors produced contain HBV-specific epitopes having different immunogenicity levels, e.g. the pre-S peptide. Thus, the particles constructed from particle-forming protein and containing HCV sequences are immunogenic with respect to HCV and HBV.

Gezeigt wurde, daß Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBSAg) sowohl in S.cerevisiae (Valenzuela, P., 1982) als auch z.B. in Säugerzellen (Valenzuela, P., et al., 1984) zu Partikeln geformt und aufgebaut wird. Es wurde aufgezeigt, daß die Bildung solcher Partikeln die Immunogenität der monomeren Untereinheit erhöht. Die „constructs" können auch das immunodominante Epitop des HBSAg enthalten, das die 55 Aminosäuren der presurface-Region (pre-S-Region) umfaßt.It has been shown that hepatitis B surface antigen (HBSAg) is found in both S. cerevisiae (Valenzuela, P., 1982) and e.g. in mammalian cells (Valenzuela, P., et al., 1984) is formed into particles and built up. It has been shown that the formation of such particles increases the immunogenicity of the monomeric subunit. The constructs may also contain the immunodominant epitope of HBSAg, which includes the 55 amino acids of the presurface region (pre-S region).

Neurath et al. (1984). „Constructs" der pre-S-HBSAg-Partikel, die in Hefe exprimierbar sind, werden in der EP0174444, veröffentlicht am 19. März 1986, offenbart; Hybriden, die heterologe virale Sequenzen für die Hefeexpression enthalten, werden in der EPO 175261, veröffentlicht am 26. März 1966, offenbart. Diese „constructs" können auch in Säugetierzellen wie Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) exprimiert werden, wobei ein SV40-Dihydrofolatreduktasevektor verwendet wird (Michelle et al., 1984).Neurath et al. (1984). "Constructs" of the pre-S-HBSAg particles expressible in yeast are disclosed in EP0174444, published March 19, 1986. Hybrids containing heterologous viral sequences for yeast expression are published in EPO 175261 on March 26, 1966. These "constructs" can also be expressed in mammalian cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, using an SV40 dihydrofolate reductase vector (Michelle et al., 1984).

Ferner können Teile der partikelformendes Protein codierenden Sequenz durch Codons ersetzt werden, die ein HCV-Epitop codieren. Bei diesem Ersatz können Regionen, die nicht erforderlich sind, um die Aggregation der Einheiten zur Bildung von immunogenen Partikeln in Hefe oder Säugetieren zu vermitteln, deletiert werden, so daß zusätzliche HBV-antigene Orte von der Konkurrenz mit dem HCV-Epitop eliminiert werden.Further, portions of the particle-forming protein coding sequence may be replaced by codons encoding an HCV epitope. In this replacement, regions that are not required to mediate aggregation of the immunogenic particle-forming moieties in yeast or mammals can be deleted so that additional HBV-antigenic sites are eliminated from competition with the HCV epitope.

Präparation von VakzinenPreparation of vaccines

Vakzine können aus einem oder mehreren immunogenen Polypeptiden hergestellt werden, die von HCV-cDNA abgeleitet sind, einschließlich der in den Beispielen beschriebenen cDNA-Sequenzen. Die beobachtete Homologie zwischen HCV und Flaviviren liefert Informationen in bezug auf die Polypeptide, die besonders wirksam als Vakzine sein können, wie auch die Regionen Jis Günoms, in dem sie codiert sind. Die allgemeine Struktur des Flavivirus-Genoms wird bei Rice et al. (1986) diskutiert. Von der Flavivirus-genomischen-RNA wird angenommen, daß sie die einzige virusspezifische m-RNA-Spezies ist, und sie wird in die drei viralen Strukturproteine, d.h. C, M und E sowie zwei große Nichtstrukturproteine, NS4 und NS5, und einen komplexen Satz kleinerer Nichtstrukturproteine translatiert. Es ist bekannt, daß größere neutralisierende Epitope für Flaviviren im E-Protein (Hüllprotein) angesiedelt sind (Roehring, 1986). Somit können Vakzine aus rekombinanten Polypeptiden bestehen, die Epitope von HCV-E enthalten. Diese Polypeptide können in Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzellen exprimiert oder anderenfalls aus Viruspräparaten isoliert werd..n. Es wird auch erwartet, daß die anderen Strukturproteine ebenfalls Epitope enthalten können, die protektive Anti-HCV-A .tiköi per verursachen. Somit können Polypeptide, die die Epitope von E, C und M enthalten, allein oder kombiniert in HCV-Vakzinen verwendet werden.Vaccines may be prepared from one or more immunogenic polypeptides derived from HCV cDNA, including the cDNA sequences described in the Examples. The observed homology between HCV and flaviviruses provides information regarding the polypeptides that may be particularly effective as vaccines, as well as the regions of Jis Günom in which they are encoded. The general structure of the flavivirus genome is described in Rice et al. (1986). The flavivirus genomic RNA is believed to be the only virus-specific mRNA species and is inserted into the three viral structural proteins, i. C, M and E as well as two large nonstructural proteins, NS4 and NS5, and a complex set of minor nonstructural proteins translated. It is known that larger neutralizing epitopes for flaviviruses are located in the E protein (envelope protein) (Roehring, 1986). Thus, vaccines may consist of recombinant polypeptides containing epitopes of HCV-E. These polypeptides can be expressed in bacterial, yeast or mammalian cells or else isolated from virus preparations. It is also expected that the other structural proteins may also contain epitopes that cause protective anti-HCV A .tiköi. Thus, polypeptides containing the epitopes of E, C and M can be used alone or in combination in HCV vaccines.

Ergänzend zu Vorstehendem wurde gezeigt, daß die Immunisierung mit NS1 (Nichtstrukturprotein 1) zum Schutz gegen Gelbfieber führt (Schlesinger et al,, 1986). Dies trifft zu, obwohl die Immunisierung keine neutralisierenden Antikörper hervorbringt. Es ist somit wahrscheinlich, daß HCV-NS1 auch gegen HCV-lnfekticn schützt, insbesondere, da dieses Protein hoch konserviert unter den Flaviviren zu sein scheint. Außerdem zeigt sich auch, daß Nichtstrukturproteine gegen virale Pathogenität schützen können, selbst wenn sie nicht die Produktion von neutralisierenden Antikörpern verursachen. Die in den Beispielen enthaltenen Informationen hinsichtlich der Immunogenität der aus Monierten HCV-cDNA exprimierten Polypeptide, die die verschiedenen Regionen des HCV-ORF überspannen, gestatten auch Voraussagen in bezug auf ihre Verwendung in Vakzinen.In addition to the above, immunization with NS1 (non-structural protein 1) has been shown to protect against yellow fever (Schlesinger et al., 1986). This is true, although immunization does not produce neutralizing antibodies. Thus, it is likely that HCV NS1 also protects against HCV infections, particularly since this protein appears to be highly conserved among the flaviviruses. In addition, it also shows that non-structural proteins can protect against viral pathogenicity, even if they do not cause the production of neutralizing antibodies. The information provided in the Examples regarding the immunogenicity of the polypeptides expressed from the cloned HCV cDNA spanning the various regions of the HCV ORF also allow for predictions regarding their use in vaccines.

In Anbetracht des Gesagten können multivalente Vakzine gegen HCV aus einem oder mehreren Epitopen von einem oder mehreren Strukturproteinen und/oder einem oder mehreren Epitopen von einem oder mehreren Nichtstrukturproteinen bestehen. Diese Vakzine können z.B. aus rekombinanten HCV-Polypeptiden und/oder Polypeptiden bestehen, die aus den Virionen isoliert sind. Insbesondere wird an Vakzine gedacht, die ein oder mehrere der folgenden HCV-Proteine oder davon abgeleitete Untereinheitenantigene enthalten: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 und NS5. Besoonders bevorzugt sind Vakzine, die E und/oder NS1 oder Untereinheiten derselben umfassen.In view of the foregoing, multivalent vaccines against HCV may consist of one or more epitopes of one or more structural proteins and / or one or more epitopes of one or more non-structural proteins. These vaccines may e.g. consist of recombinant HCV polypeptides and / or polypeptides isolated from the virions. In particular, vaccines containing one or more of the following HCV proteins or subunit antigens derived therefrom are envisioned: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 and NS5. Particularly preferred are vaccines comprising E and / or NS1 or subunits thereof.

Die Präparation von Vakzinen, die immunogene(s) Polypeptid(e) als wirksame(n) Bestandteil(e) enthalten, ist dem Fachmann bekannt. Typischerweise werden derartige Vakzine als zur Injektion geeignete Präparate hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste, zum Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Injektion geeignete Formen können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert oder das Protein in Liposome eingekapselt sein. Die wirksamen immunoganen Bestandteile sind oft mit Trägerstoffen gemischt, die pharmazeutisch annehmbar und mit dem wirksamen Bestandteil verträglich sein. Geeignete Trägerstoffe sind beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dgl. und Kombinationen davon. Ferner kann das Vakzin - falls erwünscht - geringere Mengen an Hilfsstoffen wie Netzmitteln oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und/oder Adjuvanzien enthalten, die die Wirksamkeit des Vakzins verstärken. Beispielsweise für Adjuvanzien, die wirksam sein können, sind - ohne Beschränkung auf diese -Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramy! -threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, auch als nor-MDP bezeichnet), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-snglycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835 A, als MTP-PE bezeichnet) und RIBI, das drei aus Bakterien extrahierte Komponenten, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalose-Dimycolat und Zellwandskeleton (MPL + TDM + CWS), in einer 2proz. Squalen/Tween 80-Emulsion enthält. Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann durch Messung der Men'j^ der Antikörper bestimmt werden, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine HCV-Antigensequenz enthält, die aus der Applikation dieses Polypeptids in Vakzinen herrührt, die ebenfalls aus den verschiedenen Adjuvanzien bestehen.The preparation of vaccines containing immunogenic polypeptide (s) as active ingredient (s) is known to those skilled in the art. Typically, such vaccines are prepared as injectable preparations, either as liquid solutions or suspensions; solid forms suitable for dissolving or suspending in liquid prior to injection may also be prepared. The preparation may also be emulsified or the protein encapsulated in liposomes. The active immunogenic ingredients are often mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Suitable carriers are, for example, water, physiological saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like, and combinations thereof. Further, if desired, the vaccine may contain minor amounts of excipients such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents and / or adjuvants that enhance the effectiveness of the vaccine. For example, for adjuvants that may be active, including but not limited to, aluminum hydroxide, N-acetyl-muramy! threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, also referred to as nor-MDP), N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D -isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-snglycero-3-hydroxy-phosphoryloxy) -ethylamine (CGP 19835 A, referred to as MTP-PE) and RIBI, the three components extracted from bacteria, monophosphoryl Lipid A, trehalose dimycolate and cell wall skeleton (MPL + TDM + CWS), in a 2% proc. Squalene / Tween 80 emulsion contains. The efficacy of an adjuvant may be determined by measuring the amount of antibodies directed against an immunogenic polypeptide containing an HCV antigenic sequence resulting from the application of this polypeptide to vaccines also consisting of the various adjuvants.

Die Vakzine werden üblicherweise parenteral, durch Injektion, beispielsweise entweder subkutan oder intramuskulär, appliziert. Weitere Zubereitungen, die sich für andere Appiikationsarton eignen, umfassen Suppositorien und in gewissen Fällen orale Zubereitungen. Für Suppositorien können zu den herkömmlichen Bindemitteln und Trägerstoffen z. B. Polyalkylonglycole oder Triglyceride gehören; solche Suppositorien können aus Mischungen geformt werden, die 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1 %-2% wirksamen Bestandteil enthalten. Orale Zubereitungen enthalten solche normalerweise verwendeten Trägerstoffe wie z.B. pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Saccharin-Natriumsalz, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dgl. Diese Zusammensetzungen erhalten die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, langsam wirkenden Formulierungen oder Pulvern und enthalten 10%-95%, vorzugsweise 25%-70%, wirksamen Bestandteil.The vaccines are usually administered parenterally by injection, for example, either subcutaneously or intramuscularly. Other preparations suitable for other types of application include suppositories and, in some cases, oral preparations. For suppositories to the conventional binders and excipients z. Polyalkylonglycols or triglycerides; such suppositories may be formed from mixtures containing from 0.5% to 10%, preferably 1% -2% active ingredient. Oral preparations contain such normally used excipients as e.g. pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, saccharin sodium salt, cellulose, magnesium carbonate and the like. These compositions take the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, slow-acting formulations or powders and contain 10% -95%, preferably 25% -70% active ingredient.

Für die Vakzinformulierung können die Proteine in neutraler oder Salzform vorliegen. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören die Säureadditionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Peptids gebildet werden) und die mit anorganischen Säuren wie z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Maleinsäure und dgl. gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(lll)-hydroxid und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dgl. abgeleitet sein.For the vaccine formulation, the proteins may be in neutral or salt form. The pharmaceutically acceptable salts include the acid addition salts (which are formed with the free amino groups of the peptide) and those with inorganic acids such as. Hydrochloric acid or phosphoric acid or organic acids such as acetic, oxalic, tartaric, maleic and the like. Salts formed with the free carboxyl groups may also be derived from inorganic bases such as e.g. Sodium, potassium, ammonium, calcium or iron (III) hydroxide and such organic bases as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine and the like.

Dosierung und Applikation der VakzineDosage and application of the vaccine

Die Vakzine werden in einer Weise, die mit der Dosiszubereitung vereinbar ist, in einer solchen Menge appliziert, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam ist. Die zu applizierende Menge, die im allgemeinen im Bereich von 5 Mikrogramm bis 250 Mikrogramm Antigen je Dosis liegt, ist von dem zu behandelnden Individuum, von der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern und vom erwünschten Schutzgrad abhängig. Die genauen Wirkstoffmengen, die appliziert werden müssen, können vom Ermessen des praktischen Arztes abhängen und individuell verschieden sein.The vaccines are administered in a manner consistent with the dosage preparation in an amount which is prophylactically and / or therapeutically effective. The amount to be administered, which generally ranges from 5 micrograms to 250 micrograms of antigen per dose, will depend on the individual being treated, the ability of the individual's immune system to synthesize antibodies, and the degree of protection desired. The exact quantities of the drug to be administered may depend on the judgment of the practitioner and be individually different.

Das Vakzin kann nach einem Einzeldosierungsschema oder vorzugsweise nach einem Mehrfachdosierungsschema gegeben werden. Ein Mehrfachdosierungsschema ist ein Schema, bei dem eine Erstimpfkur mit 1-10 getrennten Dosen erfolgen kann, denenweitere Dosen folgen, die in späteren Zeitintervallen, die zur Aufrechterhaltung und/oder Vei Stärkung der Immunantwort erforderlich sind, gegeben werden, z. B. nach 1-4 Monaten für eine zweite Dosis, und gegebenenfalls (eine) nachfolgende Dosis/Dosen nach einigen Monaten. Das Dosierungsregime wird auch - zum mindesten teilweise - c'urch die Bedürfnisse des Individuums bestimmt und liegt im Ermessen des praktischen Arztes.The vaccine may be given after a single dosage regimen or, preferably, a multi-dosage regimen. A multiple-dose regimen is a regimen in which initial vaccination may be at 1-10 divided doses followed by further doses given at later time intervals required to maintain and / or enhance the immune response, e.g. After 1 to 4 months for a second dose, and, optionally, subsequent dose (s) after a few months. The dosage regimen is also determined, at least in part, by the needs of the individual and is at the discretion of the practitioner.

Ferner kann das Valain, welches das/die immunogene/n HCV-Antigen(e) enthält, in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Agenzien, z. B. Immunglobulinen, appliziert werden.Further, the valaine containing the immunogenic HCV antigen (s) may be used in conjunction with other immunoregulatory agents, e.g. As immunoglobulins are applied.

Präparation von Antikörpern gegen HCV-EpitopePreparation of antibodies against HCV epitopes

Die in der beschriebenen Weise hergestellten immunogenen Polypeptide werden benutzt, um sowohl polygonale als auch monoklonal Antikörper zu produzieren. Wenn polygonale Antikörper erwünscht sind, wird ein ausgewähltes Säugetier (z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd etc.) mit einem immunogenen Polypeptid immunisiert, das ein HCV-Epitop/HCV-Epitope trägt. Von dem immunisierten Tier wird Serum gesammelt und nach bekannten Verfahren behandelt. Wenn das Serum, das polygonale Antikörper zu einem HCV-Epitop enthält, Antikörper zu anderen Antigenen enthält, können die polyklonalen Antikörper durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden. Techniken zur Produktion und Verarbeitung polyklonaler Antisera sind in Fachkreisen bekannt. Siehe z.B. Mayer und Walker (1987).The immunogenic polypeptides prepared in the manner described are used to produce both polygonal and monoclonal antibodies. When polygonal antibodies are desired, a selected mammal (e.g., mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with an immunogenic polypeptide carrying an HCV epitope / HCV epitope. Serum is collected from the immunized animal and treated by known methods. When the serum containing polygonal antibody to an HCV epitope contains antibodies to other antigens, the polyclonal antibodies can be purified by immunoaffinity chromatography. Techniques for the production and processing of polyclonal antisera are known in the art. See, e.g. Mayer and Walker (1987).

Alternativ können polygonale Antikörper aus einem Säugetier isoliert werden, das zuvor mit HCV infiziert wurde. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Reinigung von Antikörpern zu HCV-Epitopen aus Serum von einem infizierten Individuum, das auf der Affinitätschromatographib beruht und bei dem ein Fusionspolypeptid von SOD und einem im cDNA-Klon 6-1-1 codierten Polypeptid verwandet wird, wird in der EPO-Veröffentlichung Nr. 318 216 gegeben.Alternatively, polygonal antibodies can be isolated from a mammal that has previously been infected with HCV. An example of a method for purifying antibodies to HCV epitopes from serum from an infected individual based on affinity chromatography, which uses a fusion polypeptide of SOD and a polypeptide encoded in cDNA clone 6-1-1, is described in U.S. Pat EPO Publication No. 318,216.

Monoklonal Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, können vom Fachmann ebenfalls leicht produziert werden. Die allgemeine Methodologie zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridome ist gut bekannt. Immortale antikörperproduzierende Zellinien können durch Zellfusion und auch durch andere Techniken wie die direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus geschaffen werden. Siehe z. B. M.Schreier et al. (1980); Hammerlingetal. (1981); Kennett et al. (1980); siehe auch U.S.-Patente 4341761,4399121,4427783,4444 887, 4466917,4472500,4491632 und 4493890. »Panels" monoklonaler Antikörper, die gegen HCV-Epitope produziert wurden, können auf verschiedene Eigenschaften gescreent werden, d.h. auf Isotyp, Epitop-Affinität usw.Monoclonal antibodies directed against HCV epitopes can also be readily produced by one skilled in the art. The general methodology for producing monoclonal antibodies by hybridomas is well known. Immortal antibody-producing cell lines can be created by cell fusion and also by other techniques such as direct transformation of B lymphocytes with oncogenic DNA or transfection with Epstein-Barr virus. See, for example, M.Schreier et al. (1980); Hammerlingetal. (1981); Kennett et al. (1980); See also U.S. Patents 4,341,761, 4,399,121, 4,427,783, 4,444,887, 4,466,917, 4,447,200, 4,449,632 and 4,493,890. Panels of monoclonal antibodies raised against HCV epitopes can be screened for various properties, ie, isotype, epitope affinity etc.

Sowohl monoklonal als auch polygonale Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, sind besonders nützlich bei der Diagnose, und die neutralisierenden Antikörper sind bei der passiven Immunotherapie von Nutzen. Monoklonal Antikörper können insbesondere verwendet werden, um Anti-idiotyp-Antikörper zu schaffen.Both monoclonal and polygonal antibodies directed against HCV epitopes are particularly useful in diagnosis, and the neutralizing antibodies are useful in passive immunotherapy. Monoclonal antibodies, in particular, can be used to create anti-idiotype antibodies.

Anti-Idiotyp-Antikörper sind Immunglobuline, die ein „inneres Bild" des Antigens des infektiösen Agens tragen, gegen das der Schutz brwünscht ist. Siehe z. B. Nisonoff, A., et al. (1981) und Dressman et al. (1985).Anti-idiotypic antibodies are immunoglobulins that carry an "inner picture" of the antigen of the infectious agent against which protection is desired, See, e.g., Nisonoff, A., et al., (1981) and Dressman et al. 1985).

Techniken zur Schaffung von Anti-Idiotyp-Antikörpern sind in Fachkreisen bekannt. Siehe z. B. Grzycn (1985), MacNamara et al. (1984) und Uytdehaag et al. (1985). Diese Anti-Idiotyp-Antikörper können für die Behandlung und/oder Diagnose der NANBH wie auch für einen Aufschluß über die immunogenen Regionen der HCV-Antigene von Nutzen sein.Techniques for creating anti-idiotype antibodies are known in the art. See, for example, Grzycn (1985), MacNamara et al. (1984) and Udtdehaag et al. (1985). These anti-idiotype antibodies may be useful for the treatment and / or diagnosis of NANBH, as well as for the detection of the immunogenic regions of HCV antigens.

Ein Fachmann wird auch erkennen, daß eine Vielzahl von Antikörpertypen, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, produziert worden kann. Der Terminus „Antikörper" bezieht sich hier auf ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, die aus mindestens einer Antikörper-Bindungsstelle (antibody combining site) bestehen. Eine „Antikörper-Bindungsstelle" oder „Bindungsdomäne" wird aus der Faltung von variablen Dämonen eines Antikörper-Moleküls gebildet, um dreidimensionale Bindungsräume mit einer inneren Oberflächengestalt und Ladungsverteilung komplementär zu den Merkmalen eines Epitops eines Antigens zu bilden, wodurch eine immunologische Reaktion mit dem Antigen gestattet wird. Eine Antikörper-Bindungsstelle kann aus einer schweren und/oder leichten Kettendomäne (VH bzw. VL) gebildet werden, die hypervariable Schleifen bilden, die zur Antigen-Bindung beitragen. Der Terminus „Antikörper" umfaßt z. B. Wirbeltierantikörper, Hybridantikörper, chimäre Antikörper, veränderte Antikörper, monovalente Antikörper, die Fab-Proteine und Einzeldomänen-Antikörper.One skilled in the art will also recognize that a variety of antibody types directed against HCV epitopes have been produced. The term "antibody" as used herein refers to a polypeptide or group of polypeptides consisting of at least one antibody combining site An "antibody binding site" or "binding domain" is obtained from the folding of variable demons of an antibody Molecule to form three-dimensional binding spaces with an internal surface shape and charge distribution complementary to the characteristics of an epitope of an antigen, thereby allowing an immunological reaction with the antigen An antibody binding site may consist of a heavy and / or light chain domain (VH or TK) VL) that form hypervariable loops that contribute to antigen binding. Vertebrate antibodies, hybrid antibodies, chimeric antibodies, altered antibodies, monovalent antibodies, the Fab proteins and single domain antibodies.

Ein „Einzeldomänen-Antikörper" (dAb) ist ein Antikörper, der aus einer VH-Domäne besteht, die immunologisch mit einem designierten Antigen reagiert. Ein dAb enthält keine VL-Domäne, kann aber andere Antigen-Bindungsdomänen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie in Antikörpern existieren, z. B. die kappa- und lambda-Domäne. Methoden zur Herstellung von dAb sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Ward et el. (1989).A "single domain antibody" (dAb) is an antibody that consists of a VH domain that is immunologically reactive with a designated antigen A dAb does not contain a VL domain, but may contain other antigen binding domains known to be of interest. that they exist in antibodies such as the kappa and lambda domains Methods for the production of dAb are known in the art See, for example, Ward et al., (1989).

Antikörper können auch aus VH- und VL-Domänen sowie auch aus anderen bekannten Antigen-Bindungsdomänen bestehen. Beispiele für diese Antikörpertypen und Methoden und ihrer Herstellung sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. U. S.Patent 4816467, das hier durch die Bezugnahme einbezogen wird) und umfassen folgendes.Antibodies may also consist of VH and VL domains as well as other known antigen-binding domains. Examples of these types of antibodies and methods and their preparation are known in the art (see, e.g., U.S. Patent 4,816,467, incorporated herein by reference) and include the following.

Beispielsweise bezieht sich der Terminus „Wirbeltierantikörper" auf Antikörper, die Tetramere oder Aggregate derselben sind, die leichte und schwere Ketten umfassen, die gewöhnlich in einer „Y"-Konfiguration aggregiert sind und die kovalente Bindungen zwischen den Ketten haben können oder nicht. Bei Wirbeltierantikörpern sind die Aminosäuresequenzen aller Ketten eines speziellen Antikörpers mit den Ketten homolog, die in einem Antikörper gefunden wurden, der durch den Lymphozyten produziert wurde, der diesen Antikörper in situ oder in vitro produziert (z. B. in Hybridomen). Wirbeltitrantikörper enthalten typischerweise native Antikörper, z. B. gereinigte polygonale Antikörper und monoklonal Antikörper. Beispiele für Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper werden nachstehend beschrieben.For example, the term "vertebrate antibody" refers to antibodies that are tetramers or aggregates thereof, which include light and heavy chains that are usually aggregated in a "Y" configuration and that may or may not have covalent bonds between the chains. In vertebrate antibodies, the amino acid sequences of all chains of a particular antibody are homologous to the chains found in an antibody produced by the lymphocyte producing this antibody in situ or in vitro (e.g., in hybridomas). Vertebral body antibodies typically contain native antibodies, e.g. B. purified polygonal antibodies and monoclonal antibodies. Examples of methods for producing these antibodies are described below.

„Hybridantikörper" sind Antikörper, bei denen ein Paar schwerer und leichter Ketten homolog mit denen in einem ersten Antikörper ist, während das andere Paar schwerer und leichter Ketten homolog mit denen in einem anderen zweiten Antikörper ist. Typischerweise bindet jedes dieser beiden Paare verschiedene Epitope, insbesondere an verschiedenen Antigenen. Dies führt zu der Eigenschaft der „Bivalenz", d. h. zu der Fähigkeit, zwei Antigene gleichzeitig zu binden. Solche Hybride können auch bei Verwendung von Chimären Ketten gebildet werden, wie nachstehend gezeigt wird."Hybrid antibodies" are antibodies in which a pair of heavy and light chains are homologous with those in a first antibody, while the other pair of heavy and light chains are homologous with those in another second antibody, Typically, each of these two pairs bind different epitopes. especially on different antigens, leading to the property of "bivalence", d. H. to the ability to bind two antigens simultaneously. Such hybrids can also be formed using chimeric chains, as shown below.

„Chimäre Antikörper" sind Antikörper, in denen die schweren und/oder leichten Ketten Fusionsproteine sind. Typischerweise ist die konstante Domäne der Ketten aus einer speziellen Spezies und/oder Klasse, und die variablen Domänen sind aus einer anderen Spezies und/oder Klasse. Ebenfalls mit inbegriffen ist jeder Antikörper, in dem eine oder beide der schweren oder leichten Ketten aus Kombinationen von Sequenzen zusammengesetzt ist/sind, die die Sequenzen in Antikörpern aus verschiedenen Quellen nachahmen (mimicking), sei es, daß diese Quellen nach dem Ursprung verschiedene Klassen oder verschiedene Spezies sind, und sei es, daß der Fusionspunkt an der variablen/konstanten Grenze liegt oder nicht. Somit ist es möglich, Antikörper zu produzieren, in denen weder die konstante noch die variable Region bekannte Antikörpersequenzen nachahmen. Es wird dann z. B. möglich, Antikörper zu konstruieren, deren variable Region eine höhere spezifische Affinität für ein spezielles Antigen hat oder deren konstante Region eine erhöhte Komplementfixation hervorrufen kann, oder andere Verbesserungen an den Eigenschaften vorzunehmen, die eine spezielle konstante Region besitzt."Chimeric antibodies" are antibodies in which the heavy and / or light chains are fusion proteins Typically, the constant domain of the chains is of a particular species and / or class, and the variable domains are of a different species and / or class Included is any antibody in which one or both of the heavy or light chains are / are composed of combinations of sequences that mimic the sequences in antibodies from different sources, whether these sources have different classes or classes of origin different species, whether or not the point of fusion is at the variable / constant limit, it is thus possible to produce antibodies in which neither the constant nor the variable region mimic known antibody sequences. possible to construct antibodies whose variable region has a higher specific affinity for a particular A or whose constant region may cause increased complement fixation, or make other improvements to the properties that a particular constant region possesses.

Ein anderes Beispiel stellen „veränderte Antikörper" dar; dies bezieht sich auf Antikörper, in denen die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz in einem Wirbeltierantikörper variiert worden ist. Unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken können Antikörper neu konstruiert (redesigned) werden, um die erwünschten Charakteristiken zu erhalten. Es gibt viele mögliche Variationen, und sie reichen von der Veränderung einer oder mehrerer Aminosäuro/n bis zur vollständigen Neukonstruktion einer Region, z. B. der konstanten Region. Veränderungen in der konstanten Region erfolgen im allgemeinen, um die erwünschten zellulären Prozeßcharakteristiken zu erreichen, z. B. Änderungen in der Komplementfixation, Wechselwirkung mit Membranen und andere Effektor-Funktionen. Änderungen in der variablen Region können vorgenommen werden, um die Antigenbindungs-Charakteristiken zu ändern. Der Antikörper kann auch konstruiert (engineered) werden, um die spezifische Zufuhr eines Moleküls oder einer Substanz zu einer spezifischen Zelle oder einem Gewebeort zu unterstützen. Die erwünschten Veränderungen können nach in der Molekularbiologie bekannten Techniken, z. B. Rekombinationstechniken, durch ortsspezifische Mutagenese usw., vorgenommen werden.Another example is "altered antibodies", which refers to antibodies in which the naturally occurring amino acid sequence has been varied in a vertebrate antibody Using recombinant DNA techniques, antibodies can be redesigned to obtain the desired characteristics There are many possible variations, ranging from the alteration of one or more amino acids to the complete redesign of a region, eg, the constant region, Changes in the constant region generally occur to achieve the desired cellular process characteristics For example, changes in complement fixation, interaction with membranes and other effector functions, changes in the variable region can be made to alter the antigen binding characteristics, and the antibody can also be engineered to provide specific delivery a mole eküls or a substance to a specific cell or tissue site. The desired changes may be made by techniques known in molecular biology, e.g. B. recombination techniques, by site-specific mutagenesis, etc., are made.

Ein weiteres Beispiel sind „monovalente Antikörper", das sind Aggregate, die aus einem schwere Kette/leichte Kette-Dimer bestehen, das an die Fc-Region (d. h. konstante Region) einerzweiten schweren Kette gebunden ist. Dieser Antikörpertyp entgeht der antigenon Modulation. Siehe z. B. Glennie et al. (1982).Another example is "monovalent antibodies," aggregates consisting of a heavy chain / light chain dimer attached to the Fc region (ie, constant region) of a second heavy chain. This type of antibody escapes antigenic modulation for example, Glennie et al., (1982).

In die Definition der Antikörper mit inbegriffen sind auch die „Fab"-Fragmente der Antikörper. Die „Fab"-Region sind jene Teile der schweren und leichten Ketten, die den Sequenzen annähernd äquivalent oder analog sind, die den verzweigten Teil der schweren und leichten Kette umfassen und von denen gezeigt wurde, daß sie eine immunologische Bindung an ein spezifiziertes Antigen aufweisen, denen aber der Effektor-Fc-Teil fehlt. „Fab" umfaßt Aggregate einer schweren und einer leichten Kette (gemeinhin als Fab' bekannt) sowie Tetra mere, die 2 H- und 2 L-Ketten enthalten (als F[ab)2 bezeichnet), die in der Lage sind, selektiv mit einem bestimmten Antigen oder einer Antigenfamilie zu reagieren. „Fab"-Antikörper können in Untergruppen analog den vorstehend beschriebenen unterteilt werden, d. h. „Wirbet.ier-Fab", „Hybrid-Fab", „chimäre Fab" und „veränderte Fab". Verfahren zur Produktion von „Fab"-Fragmenten sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. Hroteolyse und Synthese nach Rekombinationstechniken.Included in the definition of the antibodies are also the "Fab" fragments of the antibodies The "Fab" region are those parts of the heavy and light chains that are approximately equivalent or analogous to the sequences that make up the branched part of the heavy and light Chain and which have been shown to immunologically bind to a specified antigen but lack the effector Fc portion. "Fab" includes heavy and light chain aggregates (commonly known as Fab ') and tetra mers containing 2 H and 2 L chains (termed F [ab) 2 ) which are capable of selective coupling with "Fab" antibodies may be divided into subgroups analogous to those described above, ie "Wirbetier Fab", "hybrid Fab", "chimeric Fab" and "altered Fab". Methods for the production of "Fab" fragments are known in the art and include, for example, hryoteolysis and synthesis by recombinant techniques.

Ii. H. Diagnostische Ollgonucleotldsonden und KitsIi. H. Diagnostic Oligonucleotide Probes and Kits

Unter Verwendung der offenbarten Teile der isolierten HCV-cDNA als Basis können Oligomere aus annähernd 8 oder mehr Nucleotiden entweder durch Exzision oder synthetisch hergestellt werden, die mit dem HCV-Genom hybridisieren und bei der Identifizierung des/der viralen Agens/Agenzien, des weiteren Charakterisierung des/der viralen Genoms/Genome sowie beim Nachweis des Virus/der Viren in erkrankten Individuen von Nutzen sind. Die Sonden für HCV-Polynucleotide (natürlich oder abgeleitet) haben eine Länge, die den Nachweis von einmaligen viralen Sequenzen durch Hybridisierung gestattet. Während &-8 Nucleotide eine brauchbare Länge darstellen können, werden Sequenzen von 10-12 Nucleotiden bevorzugt, und etwa 20 Nucleotide scheinen optimal zu sein. Vorzugsweise werden diese Sequenzen von Regionen abgeleitet, dbnen die Heterogenität fehlt. Diese Sonden können mit Hilfe von Routinemethoden einschließlich der Methoden zur automatisierten Oligonucleotidsynthese hergestellt werden. Unter den brauchbaren Sonden befinden sich z. B. die von den neu isolierten, hier beschriebenen Klonen abgeleiteten sowie die verschiedenen Oligomere, die beim Sondieren der cDNA-Banken brauchbar sind, wie nachstehend dargestellt. Ein Komplement zu irgendeinem einmaligen Teil des HCV-Genoms ist hinreichend. Für die Verwendung als Sonden ist die vollständige Komplementarität erwünscht, obwohl sie unnötig sein kann, wenn die Länge des Fragments vergrößert wird.Using the disclosed portions of the isolated HCV cDNA as a base, oligomers of approximately 8 or more nucleotides can be prepared, either by excision or synthetically, which hybridize to the HCV genome and in the identification of the viral agent (s) for further characterization of the viral genome / genome and the detection of the virus (s) in diseased individuals. The probes for HCV polynucleotides (natural or derived) have a length that allows detection of unique viral sequences by hybridization. While & -8 nucleotides can be of useful length, sequences of 10-12 nucleotides are preferred, and about 20 nucleotides appear to be optimal. Preferably, these sequences are derived from regions lacking heterogeneity. These probes can be prepared by routine methods including methods for automated oligonucleotide synthesis. Among the useful probes are z. Those derived from the newly isolated clones described herein, as well as the various oligomers useful in probing the cDNA libraries, as shown below. A complement to any unique part of the HCV genome is sufficient. For use as probes, complete complementarity is desired, although it may be unnecessary if the length of the fragment is increased.

Zur Verwendung derartiger Sonden als diagnostisches Mittel kann die zu analysierende biologische Probe wie z. B. Blut oder Serum - falls erwünscht - behandelt werden, um die enthaltenen Nucleinsäuren zu extrahieren. Die resultierende Nucleinsi'ure aus der Probe kann der Gelelektrophorese oder anderen Techniken zur Trennung nach der Größe unterworfen werden; alterna iv kann die Nucleinsäureprobe ohne Trennung nach der Größe Dot-Blotting unterzogen werden. Die Sonden werden dann markiei t. Geeignete Markierungen und Methoden zum Markieren der Sonden sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel radioaktive Markierungen, die durch „nick'-Translation oder durch „Kinasieren" (kinasing) eingesetzt werden, mit Biotin markierte, fluoreszenzmarkierte Sonden und chemilumineszenzmarkierte Sonden. Die aus der Probe extrahierten Nucleinsäuren werden dann mit der markierten Sonde unter geeigneten stringenten (streng kontrollierten) Hybridisierungsbedingungen behandelt, und Polynucleotidduplexe, die die Sonde enthalten, werden nachgewiesen.To use such probes as a diagnostic agent, the biological sample to be analyzed, such as. For example, blood or serum, if desired, may be treated to extract the contained nucleic acids. The resulting nucleic acid from the sample may be subjected to gel electrophoresis or other size separation techniques; Alternatively, the nucleic acid sample can be dot-blotted without size separation. The probes are then marked. Suitable labels and methods for labeling the probes are known in the art and include, for example, radioactive labels employed by nick translation or kinasing, biotin labeled fluorescent labeled probes, and chemiluminescent labeled probes Sample extracted nucleic acids are then treated with the labeled probe under appropriate stringent (tightly controlled) hybridization conditions, and polynucleotide duplexes containing the probe are detected.

Die Sonden können vollständig komplementär zum HCV-Genom hergestellt werden. Daher sind gewöhnlich hochstringente Bedingungen erwünscht, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden. Hochstringente Bedingungen sollten jedoch nur angewendet werden, wenn die Sonden Regionen des viralen Genoms komplementär sind, denen Heterogenität fehlt. Die strenge Kontrolle (stringency) der Hybridisierung wird durch eine Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschvorgangs bestimmt, zu denen die Temperatur, die lonenstärke, die Zeitdauer und die Formamidkonzentration gehören. Diese Faktoren werden z. B. bei T. Maniatis (1982) beschrieben.The probes can be made completely complementary to the HCV genome. Therefore, high stringency conditions are usually desirable to avoid false positives. However, high stringency conditions should only be used if the probes are complementary to regions of the viral genome lacking heterogeneity. Stringency of hybridization is determined by a number of factors during hybridization and during the wash, including temperature, ionic strength, time duration, and formamide concentration. These factors are z. As described by T. Maniatis (1982).

Im allgemeinen wird erwartet, daß die HCV-Genomsequenzen im Serum von infizierten Individuen auf einem relativ niedrigen Niveau vorkommen, d.h. etwa 10a—103 infektiöse Schimpansendosen (CID) je ml. Dieses Niveau kann erfordern, daß Verstärkungstechniken bei Hybridisierungsassays angewendet werden. Diese Techniken sind in Fachkreisen bekannt. Beispielsweise benutzt das „Biobridge"-System der Enzo Biochemical Corporation terminale Desoxynucleotidtransferase, um unmodifizierte 3'-Poly-dT-Tails an eine DNA-Sonde anzuhängen. Die poly-dT-getailte Sonde wird an eine Target-Nucleotic'sequenz und dann an eine mit Biotin modifizierte poly-A-Sequenz hybridisiert. Die PCT-Anmeldung 84/03520 und EPA 124221 beschreiben eine DNA-Hybridisierungsassay, bei dem (1) Analyt an eine einzelsträngige DNA-Sonde hybridisiert (annealed) wird, die zu einem enzymmarkierten Oligonucleotid komplementär ist, und (2) der resultierende getaute Duplex an ein enzymmarkiertes Oligonucleotid hybridisiert wird. Die EPA 204510 beschreibt einen DNA-Hybridisierungsassay, bei dem Analyt-DNA in Kontakt gebracht wird mit einer Sonde, die einen Tail wie z. B. einen Poly-dT-Tail hat, einen Verstärker-Strang, der eine Sequenz aufweist, die an den Tail der der Sonde hybridisiert, z. B. eine Poly-A-Sequenz, und die in der Lage ist, eine Vielzahl von markierten Strängen zu binden. Eine besonders erwünschte Technik kann zunächst die Verstärkung der Target-HCV-Sequenzen in Seren auf etwa das 1000Ofache umfassen, d.h. annähernd 10* Sequenzen/ml. Dies kann z. B. durch die PolymerasekettenreaktionstechniMPCR-Technik) erreicht werden, die von Saiki et al. (1986), Mullis, U. S.-Patent 4683195, und Mullis et al., U. S.-Patent 4683202 beschrieben wird. Die verstärkte(n) Sequenz(en) können dann durch einen Hybridisierungsassay nachgewiesen werden, der in der EP 317077, veröffentlicht am 24. Mai 1989, beschrieben wird. Diese Hybridisierungsassays, die Sequenzen auf einem Niveau von 10Vml nachweisen sollen, nutzen Nucleinsäure-Multimere, die sich an einzelsträngige Analyt-Nucleinsäure binden, und die sich auch an eine Vielzahl von einzelsträngigen markierten Oligonucleotiden binden.Generally, the HCV genome sequences are expected to occur in the serum of infected individuals at a relatively low level, ie, about 10 a -10 3 infectious chimpanzee doses (CID) per ml. This level may require that enhancement techniques be used in hybridization assays. These techniques are known in the art. For example, Enzo Biochemical Corporation's "Biobridge" system utilizes terminal deoxynucleotide transferase to attach unmodified 3'-poly-dT tails to a DNA probe, and the poly-dT tailed probe is ligated to a target nucleotide sequence and then to PCT Application 84/03520 and EPA 124221 describe a DNA hybridization assay in which (1) analyte is annealed to a single-stranded DNA probe that becomes an enzyme-labeled oligonucleotide (2) the resulting duplex is hybridized to an enzyme-labeled oligonucleotide EPA 204510 describes a DNA hybridization assay in which analyte DNA is contacted with a probe containing a tail such as a poly -dT-tail has an amplifier strand having a sequence that hybridizes to the tail of the probe, e.g., a poly-A sequence, and that is capable of producing a plurality of labeled strs nts to bind. A particularly desirable technique may first comprise amplifying the target HCV sequences in sera to about 1000X, ie, approximately 10 * sequences / ml. This can be z. By the polymerase chain reaction technology) disclosed by Saiki et al. (1986), Mullis, U.S. Patent 4,683,195, and Mullis et al., U.S. Patent 4,683,202. The amplified sequence (s) can then be detected by a hybridization assay described in EP 317077, published May 24, 1989. These hybridization assays, which are intended to detect sequences at a level of 10Vml, utilize nucleic acid multimers that bind to single-stranded analyte nucleic acid and that also bind to a variety of single-stranded labeled oligonucleotides.

Ein geeigneter Lösungsphasen-Sandwichassay, der mit markierten Polynucleotidsonden benutzt werden kann, und die Verfahren zur Herstellung der Sonden werden in der EPO 225807, veröffentlicht am 16. Juni 1987, beschrieben. Die Sonden können in Diagnose-Kits verpackt werden. Diagnose-Kits enthalten die Sonden-DNA, die markiert sein kann; alternativ kann die Sonden-DNA unmarkiert sein, und die Bestandteile für die Markierung können in dem Kit in gesonderten Containern aufgenommen werden. Der Kit kann auch andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für ein spezielles Hybridisierungsprotokoll benötigt werden, z. B. Standards, sowie Anweisungen für die Testdurchführung.A suitable solution-phase sandwich assay that can be used with labeled polynucleotide probes and the methods of making the probes are described in EPO 225807, published June 16, 1987. The probes can be packaged in diagnostic kits. Diagnostic kits contain the probe DNA that can be labeled; alternatively, the probe DNA may be unlabelled and the components for labeling may be included in the kit in separate containers. The kit may also contain other suitably packaged reagents and materials needed for a particular hybridization protocol, e.g. Standards, and instructions for performing the test.

Immunoassay und Diagnose-KitsImmunoassay and diagnostic kits

Sowohl die Peptide, die immunologisch mit Serum, das HCV-Antikörper enthält, reagieren, z. B. jene, die durch die nachstehend in den Beispielen beschriebene antigene Screening-Methode nachgewiesen werden, sowie jene, die von den in den Beispielen beschriebenen Klonen abgeleitet oder in ihnen codiert sind, und Zusammensetzungen derselben als auch die Antikörper, die gegen die HCV-spezifischen Epitope in diesen Polypeptiden gebildet werden, sind bei Immunoassays brauchbar, um die Gegenwart von HCV-Antikörpern oder die Gegenwart des Virus und/oder von viralen Antigenen in biologischen Proben nachzuweisen. Die Gestaltung (design) der Immunoassays unterliegt sehr vielen Variationen, von denen viele im Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann der Immunoassay ein virales Epitop nutzen; alternativ kann der Immunoassay eine Kombination von viralen Epitopen nutzen, die von diesen Quellen abgeleitet sind; diese Epitope können von den gleichen oder von verschiedenen viralen Polypeptiden abgeleitet sein und in gesonderten rekombinanten oder natürlichen Polypeptiden oder zusammen in den gleichen rekombinanten Polypeptiden vorliegen. Er kann z.B. einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein virales Epitop/gegen virale Epitope gerichtet ist, eine Kombination von monoklonalen Antikörpern, die gegen Epitope eines viralen Antigens gerichtet sind, monoklonale Antikörper, die gegen Epitope von verschiedenen viralen Antigenen gerichtet sind, polyklonale Antikörper, die gegen das gleiche virale Antigen gerichtet sind, oder polygonale Antikörper, die gegen verschiedene virale Antigene gerichtet, nutzen. Die Protokolle können z. B. auf der Konkurrenz (competition) oder der direkten Reaktion oder Assays vom Sandwichtyp beruhen. Die Protokolle können auch z. B. feste Träger nutzen oder durch Immunpräzipitation erstellt werden. Die meisten Assays schließen die Verwendung eines markierten Antikörpers oder Polypeptide ein; die Markierungen können z. B. fluoreszierende, chemilumineszente, radioaktive oder Farbstoffmoleküle sein. Bekannt sind auch Assays, die die Signale von der Sonde verstärken; Beispiele hierfür sind Assays mit Biotin und Avidin und enzymmarkierte und vermittelte Immunoassays wie ELISA.Both the peptides that immunologically react with serum containing HCV antibody, e.g. Those detected by the antigenic screening method described below in the Examples, as well as those derived from or encoded by the clones described in the Examples, and compositions thereof as well as the antibodies directed against the HCV. specific epitopes in these polypeptides are useful in immunoassays to detect the presence of HCV antibodies or the presence of the virus and / or viral antigens in biological samples. The design of immunoassays is subject to many variations, many of which are known in the art. For example, the immunoassay can use a viral epitope; alternatively, the immunoassay may utilize a combination of viral epitopes derived from these sources; these epitopes may be derived from the same or different viral polypeptides and may be present in separate recombinant or natural polypeptides or together in the same recombinant polypeptides. He can e.g. a monoclonal antibody directed against a viral epitope / against viral epitopes, a combination of monoclonal antibodies directed against epitopes of a viral antigen, monoclonal antibodies directed against epitopes of various viral antigens, polyclonal antibodies directed against the are directed to the same viral antigen, or use polygonal antibodies directed against various viral antigens. The logs can z. Based on competition or direct response or sandwich type assays. The logs can also z. B. use solid carriers or created by immunoprecipitation. Most assays involve the use of a labeled antibody or polypeptides; the markers can z. As fluorescent, chemiluminescent, radioactive or dye molecules. Also known are assays that amplify the signals from the probe; Examples include assays with biotin and avidin and enzyme-labeled and mediated immunoassays such as ELISA.

Einige antigene Regionen des mutmaßlichen Polyproteins wurden kartiert und durch Screenen der Antigenität der bakteriellen Expressionsprodukte von HCV-cDNAs, die Teile des Polyproteins codieren, identifiziert. Siehe Beispiele. Andere antigene Regionen des HCV können durch Expression der Teile der HCV-cDNAs in anderen Expressionssystemen einschließlich Hefesystemen und Zellsystemen, die von Insekten und Wirbeltieren abgeleitet sind, nachgewiesen werden. Ferner führen Untersuchungen, die einen Antigenitäts-Index und ein Hydrophobie/Hydrophilie-Profil liefern, zu Informationen hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit für die Antigenität einer Region.Several antigenic regions of the putative polyprotein were mapped and identified by screening the antigenicity of the bacterial expression products of HCV cDNAs encoding portions of the polyprotein. See examples. Other antigenic regions of the HCV may be detected by expression of the portions of the HCV cDNAs in other expression systems including yeast systems and cell systems derived from insects and vertebrates. Furthermore, assays that provide an antigenicity index and a hydrophobicity / hydrophilicity profile give information on the probability of antigenicity of a region.

Die Untersuchungen über das antigene Kartieren durch Expression von HCV-cDNAs zeigten, daß eine Reihe von Klonen, die diese cDNAs enthalten, Polypeptide exprimierte, die immunologisch mit Serum von Individuen mit NANBH reaktionsfähig waren. Kein einziges Polypeptid war immunologisch mit allen Seren reaktionsfähig. Fünf dieser Polypeptide waren sehr immunogen, insofern als Antikörper zu den HCV-Epitopen in diesen Polypeptiden in vielen verschiedenen Patientenseren nachgewiesen wurden, obwohl die Überlappung beim Nachweis nicht vollständig war. Somit lassen die Ergebnisse über die Immunogenität der Polypeptide, die in den verschiedenen Klonan codiert sind, schließen, daß wirksame Nachweissysteme die Verwendung von Epitop-"Panels" einschließen können. Die Epitope im „Panel" können zu einem oder multiplen Polypeptiden konstruiert werden.Antigenic mapping studies by expression of HCV cDNAs revealed that a number of clones containing these cDNAs expressed polypeptides that were immunologically reactive with serum from individuals with NANBH. No single polypeptide was immunologically reactive with all sera. Five of these polypeptides were very immunogenic in that antibodies to the HCV epitopes in these polypeptides were detected in many different patient sera, although the overlap on detection was incomplete. Thus, the results on the immunogenicity of the polypeptides encoded in the various clonans suggest that effective detection systems may include the use of epitope "panels". The epitopes in the panel can be constructed into one or more polypeptides.

Kits, die für die Immunodiagnose geeignet sind und die geeigneten markierten Reagenzien enthalten, werden durch Verpackung der geeigneten Materialien einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide, die HCV-Epitope oder gegen HCV-Epitope gerichtete Antikörper enthalten, in geeignete Container zusammen mit den übrigen Reagenzien und Materialien, die für die Assaydurchführung erforderlich sind, sowie eines geeigneten Satzes von Assayvorschriften zusammengestellt.Kits suitable for immunodiagnosis and containing appropriate labeled reagents are prepared by packaging the appropriate materials, including polypeptides of the invention containing HCV epitopes or antibodies directed against HCV epitopes, into suitable containers together with the remaining reagents and materials. required for assay performance and a suitable set of assay protocols.

Weitere Charakterisierung des HCV-Genoms, der Virionen und vlralen Antigene du. oh Verwendung der Sonden, die von der cDNA zum vlralen Genom abgeleitet sindFurther characterization of the HCV genome, virions and viral antigens using the probes derived from the cDNA to the viral genome

Die HCV-cDNA-Sequenz-lnformation in den neu isolierten Klonen, die in den Beispielen beschrieben werden, kann benutzt werden, um weitere Informationen über die Sequenz des HCV-Genoms und für die Identifizierung und Isolierung des HCV-Agens zu gewinnen, und trägt somit zu einer Charakterisierung einschließlich der Natur des Genoms, der Struktur der Viruspartikel und der Natur der Antigene bei, aus denen es zusammengesetzt ist. Diese Information kann ihrerseits zu zusätzlichen Polynucleotidsonden, vom HCV-Genom abgeleiteten Polypeptiden und Antikörpern führen, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, die von Nutzen für die Diagnose und/oder Behandlung von durch HCV verursachter NANBH wären. Die cDNA-Sequenz-lnformation in den obenerwähnten Klonen ist von Nutzen für die Konstruktion von Sonden für die Isolierung von zusätzlichen cDNA-Sequenzen, die von noch nicht definierten Regionen des HCV-Genoms der HCV-Genome abgeleitet sind, von denen diecDNAs in den hier und in der EP 0316218 beschriebenen Klonen abgeleitet sind. Beispielsweise können markierte Sonden, die eine Sequenz von annähernd 8 oder mehr Nucleotiden und vorzugsweise 20 oder mehr Nucleotiden enthalten, die von Regionen nahe den 5'-Enden oder 3'-Enden der in Fig. 17 dargestellten zusammengesetzten HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet sind, benutzt werden, um überla spende cDNA-Sequenzen aus HCV-cDNA-Banken zu isolieren. Alternativ könnte die Charakterisierung der genomischen Segmente aus dem/den viralen Genom/en erfolgen, das/die aus den gereinigten HCV-Partikoln isoliert wurden. Verfahren zur Reinigung von HCV-Partikeln und zum Nachweis derselben während der Reinigung werden nachstehend beschrieben. Verfahren zur Isolierung von Polynucleotidgenomen aur Viruspartikeln sind im Fachgebiet bekannt, und ein anwendbares Verfahren ist das in der EP 0218316 beschriebene. Die isolierten genomischen Segmente können dann Moniert und sequenziert werden. Ein Beispiel für diese Technik, das die Amplifikation der zi; klonierenden Sequenzen nutzt, wird nachstehend beschrieben und lieferte Klon 16jh.The HCV cDNA sequence information in the newly isolated clones described in the Examples can be used to obtain and support more information about the sequence of the HCV genome and for the identification and isolation of the HCV agent thus characterizing, including the nature of the genome, the structure of the virus particles and the nature of the antigens of which it is composed. This information, in turn, may lead to additional polynucleotide probes, HCV genome-derived polypeptides, and antibodies directed against HCV epitopes useful for the diagnosis and / or treatment of HCV-induced NANBH. The cDNA sequence information in the above-mentioned clones is useful for the construction of probes for the isolation of additional cDNA sequences derived from as yet undefined regions of the HCV genome of the HCV genomes, of which the cDNAs are as described herein and are derived from clones described in EP 0316218. For example, labeled probes containing a sequence of approximately 8 or more nucleotides and preferably 20 or more nucleotides derived from regions near the 5 'ends or 3' ends of the composite HCV cDNA sequence shown in Figure 17 can be derived , can be used to isolate überla donating cDNA sequences from HCV cDNA libraries. Alternatively, the genomic segment characterization could be from the viral genome (s) isolated from the purified HCV particles. Methods of purifying HCV particles and detecting them during purification are described below. Methods for isolating polynucleotide genomes from virus particles are known in the art, and an applicable method is that described in EP 0218316. The isolated genomic segments can then be cloned and sequenced. An example of this technique, which is the amplification of zi; cloning sequences is described below and provided clone 16jh.

Methoden zur Konstruktion von cDNA-Banken sind im Fachgebiet bekannt und werden vor· und nachstehend diskutiert; ein Verfahren zur Konstruktion von HCV-cDNA-Banken im lambda-gt 11 wird in der EP 0 318 216 diskutiert. cDNA-Banken, die für das Screenen mit Nucleinsäuren von Nutzen sind, können jedoch auch in anderen im Fachgebiet bekannten Vektoren, z. B. lambdagt 10, konstruiert werden (Huynh et al., 1985).Methods for constructing cDNA libraries are known in the art and are discussed above and below; a method for the construction of HCV cDNA libraries in lambda gt 11 is discussed in EP 0 318 216. However, cDNA libraries useful for nucleic acid screening may also be used in other vectors known in the art, e.g. B. lambdagt 10 (Huynh et al., 1985).

Screening auf antivlrale Agenzien für HCVScreening for antiviral agents for HCV

Die Verfügbarkeit von Zellkultur- und tierischen Modellsystemen für HCV macht es möglich, auf antivirale Agenzien zu screenen, die die HCV-Replikation inhibieren, und speziell auf jene Agenzien, die vorzugsweise Zellwachstum und Zellvermehrung zulassen, während sie die Virusreplikation inhibieren. Diese Screening-Methoden sind in Fachkreisen bekannt. Im allgemeinen werden die antiviralen Agenzien bei einer Vielzahl von Konzentrationen auf ihre Wirkung auf die Verhinderung der Virusreplikation ir> Zellkultursystemen, die die Virusreplikation unterstützen, und danach auf Inhibierung der Infektiosität und viralen Pathogenität (und eines niedrigen Niveaus der Toxizität) in einem tierischen Modellsystem getestet. Die hier verfügbar gemachten Methoden und Zusammensetzungen für den Nachweis von HCV-Antigenen und HCV-Polynucleotiden sind von Nutzen für das Screenen von antiviralen Agenzmn, weil sie eine Alternative und vielleicht sensitivere Mittel für den Nachweis der Wirkung des Agens auf die Virusreplikation alc der Zell-Plaque-Assay oder der ID60-Assay darstellen. Beispielsweise können die hier beschriebenen HCV-Polynucleotidsonden benutzt werden, um die Menge der in einer Zellkultur produzierten viralen Nucleinsäure quantitativ zu bestimmen. Dies könnte z. B. durch Hybridisierung oder Konkurrenzhybridisierung der infizierten Zell-Nucleinsäuren mit einer markierten HCV-Polynucleotidsonde erfolgen. Zum Beispiel können auch Anti-HCV-Antikörper benutzt werden, um HCV-Antigen/e in der Zeilkultur unter Anwendung der hier beschriebenen Immunoassays zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Da es wünschenswert sein kann, die HCV-Antigene in der infizierten Zellkultur durch einen Konkurrenzassay quantitativzu bestimmen, sind die in den hier beschriebenen HCV-cDNAs codierten Polypeptide ferner bei diesen Konkurrenzassays von Nutzen. Im allgemeinen würde ein rekombinantes HCV-Polypeptid, das von der HCV-cDNA abgeleitet ist, markiert, und die Inhibierung der Bindung dieses markierten Polypeptide an ein HCV-Polypeptid aufgrund des im Zellkultursystem produzierte Antigens würde überwacht. Außerdem sind diese Techniken in den Fällen besonders nützlich, in denen das HCV zur Replikation in einer Zellinie ohne Verursachung von Zelltod in der Lage sein kann.The availability of cell culture and animal model systems for HCV makes it possible to screen for antiviral agents that inhibit HCV replication, and specifically those agents that preferentially allow cell growth and proliferation while inhibiting viral replication. These screening methods are known in the art. In general, antiviral agents are tested at a variety of concentrations for their effect on preventing viral replication in cell culture systems that support viral replication, and then on inhibiting infectivity and viral pathogenicity (and low levels of toxicity) in an animal model system , The methods and compositions provided herein for the detection of HCV antigens and HCV polynucleotides are useful for screening antiviral agents because they provide an alternative and perhaps more sensitive means for demonstrating the effect of the agent on virus replication of the cell Plaque assay or the ID 60 assay. For example, the HCV polynucleotide probes described herein can be used to quantify the amount of viral nucleic acid produced in a cell culture. This could be z. By hybridization or competitive hybridization of the infected cell nucleic acids with a labeled HCV polynucleotide probe. For example, anti-HCV antibodies can also be used to identify and quantify HCV antigen (s) in cell culture using the immunoassays described herein. Since it may be desirable to quantify the HCV antigens in the infected cell culture by a competition assay, the polypeptides encoded in the HCV cDNAs described herein are also useful in these competition assays. In general, a recombinant HCV polypeptide derived from the HCV cDNA would be labeled and the inhibition of binding of this labeled polypeptide to an HCV polypeptide due to the antigen produced in the cell culture system would be monitored. In addition, these techniques are particularly useful in cases where HCV may be capable of replicating in a cell line without causing cell death.

Die antiviralen Agenzien, die mit Hilfe dieser Methoden auf Wirksamkeit getestet werden können, sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. jene, die mit Virion-Komponenten und/oder zellulären Komponenten in Wechselwirkung treten, die für die Bindung und/oder Replikation des Virus notwendig sind. Zu den typischen antiviralen Agenzien können ζ. Β Inhibitoren der Virion-Polymerase und/oder Protease(n) gehören, die für die Spaltung der Präkursor-Polypeptide notwendig sind. Andere antivirale Agenzien können jene umfassen, die mit Nucleinsäuren zur Verhinderung der Virusreplikation, z. B. „anti-sense"-Polynucleotide usw., zusammenwirken.The antiviral agents that can be tested for efficacy using these methods are well known in the art and include, for example: Those which interact with virion components and / or cellular components necessary for the binding and / or replication of the virus. Typical antiviral agents can be ζ. Include inhibitors of virion polymerase and / or protease (s) necessary for cleavage of the precursor polypeptides. Other antiviral agents may include those coupled with nucleic acids to prevent virus replication, e.g. Antisense polynucleotides, etc., cooperate.

„Anti-sense"-Polynucleotid-Moleküle bestehen aus einer komplementären Nucleotidsequenz, die es ihnen gestattet, spezifisch an bestimmte Regionen von Genomen oder RNAs zu hybridisieren. „Anti-sense"-Polynucleotide können z.B. Moleküle, die die Proteintranslation durch Bindung an mRNA blockieren, oder Moleküle umfassen, die dio Replikation von Virus-RNA durch Transkriptase verhindern. Sie können auch Moleküle einschließen, die Agenzien (nichtkovalent oder kovalent gebunden) tragen, die die Virus-RNA veranlassen, inaktiv zu sein, indem sie z. B. Spaltungen (scissions) in der Virus-RNAverursachen. Sie können sich auch an zelluläre Polynucleotide binden, die die virale Infektiosität, das Replikationsvermögen oder die Chronizität verstärken und/oder für diese erforderlich sind. „Anti-sense"-Moleküle, die an HCV-abgeleitete RNAs hybridisieren sollen, können ausgehend von der hier verfügbar gemachten Sequenzinformation der HCV-cDNA konstruiert (designed) werden. Die antiviralen Agenzien, die auf „Anti-sense"-Polynucleotiden für HCV basieren, können so konstruiert werden, daß sie mit hoher Spezifität binden, von erhöhter Löslichkeit sind, stabil sind und niedrige Toxizität aufweisen. Daher können sie in spezialisierten Systemen, z. B. Liposomen, oder durch Gentherapie geliefert werden. Ferner können sie Analoge, angelagerte Proteine, substituierte oder veränderte Bindung zwischen den Basen usw. umfassen."Antisense" polynucleotide molecules consist of a complementary nucleotide sequence that allows them to specifically hybridize to particular regions of genomes or RNAs. "Antisense" polynucleotides can be e.g. Molecules that block protein translation by binding to mRNA, or molecules that prevent the replication of virus RNA by transcriptase. They may also include molecules carrying agents (non-covalently or covalently bound) that cause the viral RNA to be inactive, e.g. B. causing scissions in the viral RNA. They may also bind to cellular polynucleotides that enhance and / or are required for viral infectivity, replicability, or chronicity. Anti-sense molecules to hybridize to HCV-derived RNAs can be designed based on the HCV cDNA sequence information provided herein: The antiviral agents based on "anti-sense" polynucleotides for HCV can be engineered to bind with high specificity, are of increased solubility, stable and low in toxicity. Therefore, in specialized systems, e.g. As liposomes, or be supplied by gene therapy. Further, they may include analogs, attached proteins, substituted or altered binding between the bases, etc.

Andere Arzneimitteltypen können auf Polynucleotiden basieren, die wichtige Kontrollregionen des HCV-Genoms „nachahmen" und die auf Grund ihrer Wechselwirkungen mit den Schlüsselkomponenten das Systems, das für die virale Infektiosität oder Replikation verantwortlich ist, therapeutisch wirksam sein können.Other drug types may be based on polynucleotides that "mimic" important control regions of the HCV genome and that, because of their interactions with the key components, may be therapeutically effective in the system responsible for viral infectivity or replication.

Allgemeine MethodenGeneral methods

Die allgemeinen Techniken, die bei der Extraktion des Genoms aus einem Virus, bei der Herstellung und Sondierung einer cDNA-Bank, beim Sequenzieren von Klonen, bei der Konstruktion von Expressionsvektoren, bei der Zelltransforn ,non, bei der Durchführung von immunologischen Assays wie Radioimmunoassays und ELISA, für das Zellwachstum in einer Kultur und dgl. angewendet werden, sind in Fachkreisen bekannt, und Laborhandbücher mit einer Beschreibung dieser Techniken stehen zur Verfügung. Als allgemeine Richtschnur werden jedoch im folgenden einige Quellen, die gegenwärtig für derartige Verfahren verfügbar sind und für Materialien, die bei ihrer Ausführung von Nutzen sind, dargestellt.The general techniques used in the extraction of the genome from a virus, in the production and probing of a cDNA library, in the sequencing of clones, in the construction of expression vectors, in cell transfusion, in the performance of immunological assays such as radioimmunoassays and ELISA, used for cell growth in culture and the like, are well known in the art, and laboratory manuals describing these techniques are available. However, as a general guide, some sources currently available for such methods and materials useful in their execution are presented below.

Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen können zur Expression der erwünschten codierenden Sequenzen benutzt werden, wenn geeignete Kontrollsequenzen, die mit dem vorgesehenen Wirt verträglich sind, verwendet werden. Von den prokaryontischen Wirten wird E. coil besonders häufig verwendet. Zu den Expressionskontrollsequenzen für Prokaryonten gehören Promotoren, die wahlfrei Operatorteile enthalten, und Ribosomen-Bindungsstellen. Transfervektoren, die mit prokaryontischen Wirten verträglich sind, werden gewöhnlich z. B. von pBR 322 abgeleitet, einem Plasmid, das Operone enthält, die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz verleihen, und den verschiedenen pUC-Vektoren, die ebenfalls Sequenzen enthalten, die antibiotische Resistenz-Marker übertragen. Diese Marker können benutzt werden, um durch Selektion erfolgreiche Transformanten zu erhalten. Die gewöhnlich benutzten prokaryontischen Kontrollsequenzen umfassen die ß-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1977), das Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1980) und den lambda-abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribooomen-Bindungsstelle (Shimatake et al., 1981) und den Hybridtac-Promotor (De Boer et al., 1983) abgeleitet von Sequenzen der trp- und lac-UVB-Promotoren. Die vorstehend genannten Systeme sind mit E. coil besonders verträglich; falls erwünscht, können andere prokaryontische Wirte wie Bacillus- oder Pseudomonas-Sta'mme mit entsprechenden Kontrollsequenzen benutzt werden.Both prokaryotic and eukaryotic host cells may be used to express the desired coding sequences if appropriate control sequences compatible with the intended host are used. Of the prokaryotic hosts, E. coil is used most frequently. The expression control sequences for prokaryotes include promoters that optionally contain operator moieties and ribosome binding sites. Transfer vectors that are compatible with prokaryotic hosts are commonly used e.g. Derived from pBR 322, a plasmid containing operons conferring ampicillin and tetracycline resistance and the various pUC vectors which also contain sequences conferring antibiotic resistance markers. These markers can be used to obtain successful transformants by selection. The commonly used prokaryotic control sequences include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems (Chang et al., 1977), the tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., 1980), and the lambda-derived P L. Promoter and the N-gene ribooome binding site (Shimatake et al., 1981) and the hybrid tac promoter (De Boer et al., 1983) derived from sequences of the trp and lac UVB promoters. The above systems are particularly compatible with E. coli; if desired, other prokaryotic hosts such as Bacillus or Pseudomonas strains may be used with appropriate control sequences.

Zu den eukaryontischan Wirten zählen Hefe- und Säugetierzellen in Kultursystemen. Saccharomyces cerevlslae und Saccharomyces carlsbergensls sind die gebräuchlichsten Hefewirte und geeignete pilzliche Wirte. Mit Hefe verträgliche Vektoren tragen Marker, die die Selektion von erfolgreichen Transformanten durch Übertragung der Prototrophie auf auxotrophe Mutanten oder der Resistenz gegen Schwermetalle auf Wildtyp-Stämme gestatten. Mit Hefe verträgliche Vektoren können den 2-Mikron-Replikationsstartpunkt (Broach et al., 1983), die Kombination von CEN 3 und ARS 1 oder andere Mittel zur Gewährleistung der Replikation wie Sequenzen verwenden, die im Einbau eines geeigneten Fragments in das Wirtszellgenom resultieren. Kontrollsequenzen für Hefevektoren sind im Fachgebiet bekannt und umfassen Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) einschließlich des Promotors für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman, 1980). Terminatoren können auch mit inbegriffen sein, z.B. die vom Enolase-Gen abgeleiteten (Holland, 19R1). Besonders nützliche Kontrollsysteme sind jene, die den Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Promotor (GAPDH-Promotor) oder den Alkoholdehydrogenase-regulierbaren Promotor (ADH-regulierbaren Promotor), Terminatoren, ebenfalls von GAPDH abgeleitet, und eine Leader-Sequenz des Hefe-a-Faktors, falls Sekretion erwünscht ist, umfassen. Ferner können die Transkriptionsregulationsregion und die Transkriptionsinitiationsregion, die operabel verbunden sind, dergestalt sein, daß sie im Wildtyp-Organismus nicht natürlich assoziiert sind. Diese Systeme werden in der EPO 120551, veröffentlicht am 3.Oktober 1984, in der EPO 116201, veröffentlicht am 22. August 1984, und in der EPO 164556, veröffentlicht am 18.Dezember 1985, eingehend beschrieben, die alle an den hier angegebenen Zessionar abgetreten wurden und hiermit durch Bezugnahme einbezogen werden.Among the eukaryotic fish hosts yeast and mammalian cells are in culture systems. Saccharomyces cerevlslae and Saccharomyces carlsbergensls are the most common yeast hosts and suitable fungal hosts. Yeast-tolerated vectors carry markers that allow the selection of successful transformants by transfer of prototrophy to auxotrophic mutants or resistance to heavy metals on wild-type strains. Yeast-tolerated vectors may use the 2-micron origin of replication (Broach et al., 1983), the combination of CEN 3 and ARS 1, or other means of ensuring replication, such as sequences resulting in the incorporation of a suitable fragment into the host cell genome. Control sequences for yeast vectors are known in the art and include promoters for the synthesis of glycolytic enzymes (Hess et al., 1968, Holland et al., 1978) including the promoter for 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman, 1980). Terminators may also be included, e.g. those derived from the enolase gene (Holland, 19R1). Particularly useful control systems are those which contain the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (GAPDH promoter) or the alcohol dehydrogenase-regulatable promoter (ADH-regulatable promoter), terminators, also derived from GAPDH, and a leader sequence of the yeast. a factor, if secretion is desired. Further, the transcriptional regulatory region and the transcriptional initiation region, which are operably linked, may be such that they are not naturally associated in the wild-type organism. These systems are described in detail in EPO 120551, published October 3, 1984, EPO 116201, published August 22, 1984, and EPO 164556, published December 18, 1985, all of which are assigned to the assignee hereof have been assigned and are hereby incorporated by reference.

Säugerzellinien, die als Wirt für die Expression zur Verfügung stehen, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen viele immortalisierte Zellinien aus der American Type Culture Collection (ATCC) incl. HeLa-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), Babyhamsternierunzellen (BHK-Zellen) und eine Reihe anderer Zellinien. Geeignete Promotoren für Säugerzellon sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt und umfassen virale Promotoren wie die aus Simianvirus 40 (SV40) (Fiers, 1978) Rous-Sarkomvirus (RSV), Adenovirus (ADV) und dem bovinen Papillomvirus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequanzen und Poly-A-Additionssequenzen erfordern; Enhancersequenzfan, die die Expression vergrößern, können ebenfalls mit inbegriffen sein, und Sequenzen, die die Amplifikation des Gens bewirken, können ebenfalls erwünscht sein. Diese Sequenzen sind in Fachkreisen bekannt. Für die Replikation in Säugerzellen geeignete Vektoren können virale Replikons oder Sequenzen enthalten, die die Integration der geeigneten NANBV-Epitope codierenden Sequenzen in das Wirtsgenom garantieren.Mammalian cell lines available as a host for expression are known in the art and include many immortalized cell lines from the American Type Culture Collection (ATCC) including HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, baby hamster ovary (BHK) cells. Cells) and a number of other cell lines. Suitable promoters for mammalian cell are also known in the art and include viral promoters such as simian virus 40 (SV40) (Fiers, 1978) Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus (ADV), and bovine papilloma virus (BPV). Mammalian cells may also require terminator sequences and poly A addition sequences; Enhancer sequence fans that increase expression may also be included, and sequences that effect the amplification of the gene may also be desirable. These sequences are known in the art. Vectors suitable for replication in mammalian cells may contain viral replicons or sequences which guarantee the integration of the appropriate NANBV epitope-encoding sequences into the host genome.

Die Transformation kann nach jeder bekannten Methode zur Einführung von Polynucleotiden in eine Wirtszelle erfolgen, eingeschlossen z. B. die Verpackung des Polynucleotide in ein Virus und Transduktor) einer Wirtszelle mit dem Virus und durch direkte Aufnahme des Polynucleotide. Das Transformationsverfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Beispielsweise wird die Transformation von E.coli-Wirtszellen mit lambda-gt 11-haltigen BB-NANBV-Sequenzen nachstehend im Abschnitt Beispiele diskutiert. Die bakterielle Transformation durch direkte Aufnahme umfaßt im allgemeinen die Behandlung mit Calcium- oder Rubidiumchlorid (Cohen, 1972; Maniatis, 1982). Hefetransformation durch direkte Aufnahme kann mit Hilfe der Methode von Hinnen et al. (1978) durchgeführt werden. Säugertransformationen durch direkte Aufnahme können unter Anwendung der Calciumphosphatfällung von Graham und Van der Eb (1978) oder den verschiedenen bekannten Modifikationen dieser Methode durchgeführt werden.Transformation may be by any known method for introducing polynucleotides into a host cell, including, for example, The packaging of the polynucleotide into a virus and transductor) of a host cell with the virus and by direct uptake of the polynucleotides. The transformation method depends on the host to be transformed. For example, the transformation of E. coli host cells with lambda gt 11-containing BB-NANBV sequences is discussed below in the Examples section. Bacterial transformation by direct uptake generally involves treatment with calcium or rubidium chloride (Cohen, 1972, Maniatis, 1982). Yeast transformation by direct uptake can be determined by the method of Hinnen et al. (1978). Direct uptake mammalian transformations can be performed using calcium phosphate precipitation by Graham and Van der Eb (1978) or the various known modifications of this method.

Die Vektorkonstruktion bedient sich in Fachkreisen bekannter Techniken. Die ortsspezifische DNA-Spaltung erfolgt durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen, die im allgemeinen durch den Hersteller dieser handelsüblichen Enzyme vorgeschrieben werden. Im allgemeinen wird etwa 1 Mikrogramm Plasmid oder DNA-Sequenz durch 1 Enzymeinheit in etwa 20 Mikroliter Pufferlösung durch 1-2 h Inkubation bei 380C gespalten. Nach der Inkubation mit dem Restriktionsenzym wird das Protein durch Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA durch Fällung mit Ethanol zurückgewonnen. Die gespaltenen Fragmente können unter Anwendung der Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese entsprechend den allgemeinen Verfahren in Methods in Enzymology 65 (1980) S.499-560 getrennt werden. Spaltfragmente mit kohäsiven Enden können durch Verwendung von E.coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der geeigneten Desoxynucleotid-triphosphate (dNTPs), die in der Mischung vorhanden sind, glattendig sein. Verwendet werden kann auch S 1-Nuclease, was zur Hydrolyse aller einzelsträngigen DNA-Teile führt.The vector construction uses techniques known in the art. Site-specific DNA cleavage is accomplished by treatment with appropriate restriction enzymes under conditions generally dictated by the manufacturer of these commercial enzymes. In general, about 1 microgram of plasmid or DNA sequence is cleaved by 1 enzyme unit in about 20 microliters of buffer solution by incubation at 38 ° C. for 1-2 hours. After incubation with the restriction enzyme, the protein is removed by phenol / chloroform extraction and the DNA recovered by precipitation with ethanol. The cleaved fragments can be separated using polyacrylamide gel or agarose gel electrophoresis according to the general procedures in Methods in Enzymology 65 (1980) p. 499-560. Cohesive-ended fission fragments may be blunt-ended by using E. coli DNA polymerase I (Klenow) in the presence of the appropriate deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) present in the mixture. It is also possible to use S 1 nuclease, which leads to the hydrolysis of all single-stranded DNA parts.

Ligationen werden unter Anwendung von Standard-Puffer- und Temperaturbedingungen und Verwendung von T4-DNA-Ligas. und ATP durchgeführt; Ligationen kohäsiver Enden erfordern weniger ATP und weniger Ligase als Ligationen glatter Enden.Ligations are made using standard buffer and temperature conditions and using T4 DNA ligase. and ATP performed; Ligation of cohesive ends requires less ATP and less ligase than smooth-ended ligations.

Wenn Vektorfragmente als Teil einer Ligationsmiscbung verwendet werden, wird das Vektorfragment oft mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um das 5'-Phosphat zu er.'.fernen und die Re-Ligation des Vektors auf diese Weise zu verhindern; alternativ kann die Restriktionsenzymverdauung unerwünschter Fragmente zur Verhinderung der Ligation angewendet werden.When vector fragments are used as part of a ligation mixture, the vector fragment is often treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP) or calf intestinal alkaline phosphatase to remove the 5'-phosphate and re-ligate the vector in this manner prevent; alternatively, restriction enzyme digestion of unwanted fragments may be used to prevent ligation.

Ligationsmischungen werden in geeignete Kloniurungswirte wie E.coli transformiert, und erfolgreiche Transformanten werden z. B. durch Antibiotikaresistenz selektioniert und auf die richtige Konstruktion gescreent.Ligation mixtures are transformed into suitable cloning hosts, such as E. coli, and successful transformants are grown e.g. B. selected by antibiotic resistance and screened for the correct construction.

Synthetische Oligonucleotide können mit Hilfe eines automatischen Oligonucleotid-Synthesizers nach Warner (1984) hergestellt werden. Falls erwünscht, können die synthetischen Stränge durch Behandlung mit Polynucleotid-Kinase in Gegenwart von 32P-ATP mit 32P markiert werden, wobei für die Reaktion Standardbedingungen angewendet werden. DNA-Sequenzen mit Einschluß der aus cDWA-Banken isolierten können nach bekannten Techniken inkl. der ortsspezifischen Mutagenese, wie sie von Zoller (1982) beschrieben wurde, modifiziert werden. Die zu modifizierende DNA wird- kurz gesagt- in den Phagen als einzelsträngige Sequenz verpackt und mit DNA-Polymerase in eine doppelsträngige DNA umgewandelt, wobei als Prin.er ein synthetisches Oligonucleotid verwendet wird, das zu dom Teil der DNA, der zu modifizieren ist, komplementär ist und die erwünschte Modifikation in seiner eigenen Sequenz aufweist. Die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien, die Replikationen jedes Strangs des Phagen enthalten, werden in Agar plattiert, um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen mit der mutierten Sequenz, und die restlichen 50% haben die ursprüngliche Sequenz.Synthetic oligonucleotides can be made using an automatic Oligonucleotide Synthesizer according to Warner (1984). If desired, the synthetic strands can be labeled with 32 P by treatment with polynucleotide kinase in the presence of 32 P-ATP using standard conditions for the reaction. DNA sequences including those isolated from cDWA libraries can be modified according to known techniques including site-directed mutagenesis as described by Zoller (1982). Briefly, the DNA to be modified is packaged into the phage as a single-stranded sequence and converted into double-stranded DNA with DNA polymerase, using as its precursor a synthetic oligonucleotide that is part of the DNA to be modified. is complementary and has the desired modification in its own sequence. The resulting double-stranded DNA is transformed into a phage-bearing host bacterium. Cultures of the transformed bacteria containing replications of each strand of the phage are plated in agar to obtain plaques. Theoretically, 50% of the new plaques contain phage with the mutated sequence and the remaining 50% have the original sequence.

Replikate der Plaques werden an eine markierte synthetische Sonde bei Temperaturen und unter Bedingungen hybridisiert, die die Hybridisierung mit dem richtigen Strang, aber nicht mit der unmodifizierten Sequenz gestatten. Die Sequenzen, die durch Hybridisierung identifiziert wurden, werden zurückgewonnen und kloniert.Replicas of the plaques are hybridized to a labeled synthetic probe at temperatures and under conditions that permit hybridization with the correct strand but not the unmodified sequence. The sequences identified by hybridization are recovered and cloned.

DNA-Banken können nach dem Verfahren von Grunstein und Hognoss (1975) sondiert werden. Bei diesem Verfahren wird die zu sondierende DNA- kurz gesagt-auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert, denaturiert und mit einem Puffer prähybridisiert, der 0-50% Formamid, 0,75m NaCI, 75mmol Na-Citrat, je0,02% (w/v) Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, 50mmol Na-Phosphat (pH 6,5), 0,1 % SDS und 100Mg/ml Carrier denaturierte DNA enthält. Der prozentuale Formamidgehalt des Puffers sowie die Zeit- und Temperaturbedingungen der Prä-Hybridisierung und der nachfolgenden Hybridisierung hängen von der erforderlichen strengen Kontrolle (stringency) ab. Oligomc ι Sonden, die weniger streng kontrollierte Bedingungen erfordern, werden im allgemeinen bei geringen Formamidgehalten, niedrigeren Temperaturen und längeren Hybridisierungszeiten verwendet. Sonden, die mehr als 30 oder 40 Nucleotide enthalten wie die von cDNA oder genomischen Sequenzen abgeleiteten erfordern im allgemeinen höhere Temperaturen, z. B. etwa 40-42°C und einen hohen Formamidgehalt, z. B. 50%. Nach der Prä-Hybridisierung wird die 5'-32P-markierte Oligonucleotidsondezu dem Puffer gegeben, und die Filter werden in dieser Mischung unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Nach dem Waschen werden die behandelten Filter der Autoradiographie unterworfen, um die Lage der hybridisierten Sonde zu zeigen; DNA in entsprechenden Lagen auf den ursprünglichen Agrarplatten wird als Quelle der erwünschten DNA benutzt.DNA libraries can be probed by the method of Grunstein and Hognoss (1975). In this method, the DNA to be probed is briefly immobilized on nitrocellulose filters, denatured and prehybridized with a buffer containing 0-50% formamide, 0.75m NaCl, 75mmol Na citrate, each 0.02% (w / v) bovine serum albumin , Polyvinylpyrrolidone and Ficoll, 50mmol Na phosphate (pH 6.5), 0.1% SDS and 100mg / ml carrier denatured DNA. The percent formamide content of the buffer and the time and temperature conditions of pre-hybridization and subsequent hybridization depend on the requisite strictness (stringency). Oligomc ι probes requiring less stringent controlled conditions are generally used at low formamide levels, lower temperatures and longer hybridization times. Probes containing more than 30 or 40 nucleotides, such as those derived from cDNA or genomic sequences, generally require higher temperatures, e.g. B. about 40-42 ° C and a high formamide content, for. B. 50%. After pre-hybridization, the 5'- 32 P-labeled oligonucleotide probe is added to the buffer and the filters are incubated in this mixture under hybridization conditions. After washing, the treated filters are subjected to autoradiography to show the location of the hybridized probe; DNA in appropriate locations on the original agar plates is used as the source of the desired DNA.

Für routinemäßige Vektc Konstruktionen werden die Ligatiohsgemische in den E.coli-Stamm HB101 oder einen anderen geeigneten Wirt transformiert, und erfolgreiche Transformanten werden durch Antibiotikaresistenz oder andere Marker selektioniert. Plasmide aus den Transformanten werden danach nach dem Verfahren von Clewell et al. (1969) hergestellt, worauf gewöhnlich die Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, 1972) folgt. Die DNA wird isoliert und analysiert, gewöhnlich durch Restriktionsenzymanalyse und/oder Sequenzierung. Die Sequenzierung kann nach der Didesoxy-DN VSequenzierungsmethode von Sanger et al. (1977) in der durch Messing n* !. (1981) weitergeführten Beschreibung oder nach der Methode von Maxam et al. (1980) erfolgen. Probleme mit der Bandenku, npression, die manchmal in GC-reichen Regionen beobachtet werden, wurden durch Verwendung von T-Desazoguanosin nach Barr et al. (1986) überwunden.For routine vector constructions, the ligate mixtures are transformed into the E. coli strain HB101 or other suitable host, and successful transformants are selected by antibiotic resistance or other markers. Plasmids from the transformants are then purified by the method of Clewell et al. (1969), followed usually by chloramphenicol amplification (Clewell, 1972). The DNA is isolated and analyzed, usually by restriction enzyme analysis and / or sequencing. Sequencing can be performed according to the dideoxy-DN VSequencing method of Sanger et al. (1977) in the by brass n *!. (1981) or by the method of Maxam et al. (1980). Problems with banding, which are sometimes observed in GC-rich regions, were confirmed by using T-desazoguanosine according to Barr et al. (1986).

Die enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) kann zur Messung von Antigen- oder Antikörperkonzentrationen benutzt werden. Diese Methode ist von der Konjugation eines Enzyms an ein Antigen oder einen Antikörper abhängig und nutzt die gebundene Enzymaktivität als quantitative Markierung. Um den Antikörper zu messen, wird das bekannte Antigen an einer festen Phase (z. B. Mikroplatte oder Plastikschale) fixiert, mit Testserumverdünnungen inkubiert, gewaschen, mit Anti-Immunglobulin, das mit einem Enzym markiert ist, inkubiert und erneut gewaschen. Enzyme, die für die Markierung geeignet sind, sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. Meerrettichperoxydase. Die an die feste Phase gebundene Enzymaktivität wird durch Zugabe des spezifischen Substrats und kolorimetrische Bestimmung der Produktbildung oder Substratverwertung gemessen. Die gebundene Enzymaktivität ist eine direkte Funktion der gebundenen Antikörpermenge. Um das Antigen zu messen, wird ein bekannter spezifischer Antikörper an der festen Phase fixiert, das antigenhaltige Testmaterial wird zugegeben, nach der Inkubation wird die feste Phase gewaschen, und ein zweiter enzymmarkierter Antikörper wird zugefügt. Nach dem Waschen wird Substrat zugegeben, und die Enzymaktivität wird kolorimetrisch bewertet und auf die Antigenkonzentration bezogen.The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used to measure antigen or antibody levels. This method depends on the conjugation of an enzyme to an antigen or an antibody and uses the bound enzyme activity as a quantitative label. To measure the antibody, the known antigen is fixed to a solid phase (eg, microplate or plastic dish), incubated with test serum dilutions, washed, incubated with anti-immunoglobulin labeled with an enzyme, and washed again. Enzymes suitable for labeling are known in the art and include e.g. B. horseradish peroxidase. The enzyme activity bound to the solid phase is measured by addition of the specific substrate and colorimetric determination of product formation or substrate utilization. The bound enzyme activity is a direct function of the amount of antibody bound. To measure the antigen, a known specific antibody is fixed to the solid phase, the antigen-containing test material is added, after incubation the solid phase is washed, and a second enzyme-labeled antibody is added. Subsequent to washing, substrate is added and enzyme activity is assessed colorimetrically and based on the antigen concentration.

BeispieleExamples

Nachstehend beschrieben werden Beispiele für die Erfindung, die nur der Veranschaulichung dienen und den Geltungsbereich der Erfindung nicht einschränken. Im Lichte der vorliegenden Offenbarung wird der Fachmann zahlreiche Ausführungsformen erkennen, die in den Geltungsbereich der Patentansprüche fallen.The following are examples of the invention which are given by way of illustration only and are not intended to limit the scope of the invention. In the light of the present disclosure, those skilled in the art will recognize numerous embodiments that fall within the scope of the claims.

Isolierung und Sequenz der überlappenden HCV-cDNA-Klone 131,26], CA59a, CA84a, CA156e, und CA 167b Die Klone 13i, 26j, CA59a, CA156e, und CA167b wurden aus der lambda-gt11-Bank isoliert, die HCV-cDNA (ATCC Nr.40394) enthält, deren Präparation in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 (veröffentlicht am 31. Mai 1989) und WO 89/04669 (veröffentlicht am I.Juni 1989) beschrieben wird. Das Screening der Bank erfolgte mit den nachstehend beschriebenen Sonden unter Anwendung der bei Haynh (1985) beschriebenen Methode. Die Frequenzen, mit denen die positiven Klone mit den jeweiligen Sonden auftraten, lagen bei etwa 1 in 50000. Die Isolierung von Klon 13i erfolgte unter Verwendung einer synthetischen Sonde, die von der Sequenz von Klon 12f abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:Isolation and Sequence of Overlapping HCV cDNA Clones 131,26], CA59a, CA84a, CA156e, and CA 167b Clones 13i, 26j, CA59a, CA156e, and CA167b were isolated from the lambda gt11 library, the HCV cDNA (ATCC No. 40394), the preparation of which is described in EPO Publication No. 318216 (published May 31, 1989) and WO 89/04669 (published June 1, 1989). Screening of the library was done with the probes described below using the method described by Haynh (1985). The frequencies at which the positive clones appeared with the respective probes were about 1 in 50,000. Isolation of clone 13i was accomplished using a synthetic probe derived from the sequence of clone 12f. The sequence of the probe was:

5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.5 'GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.

Die Isolierung von Klon 26j erfolgte unter Verwendung einer Sonde, die von der 5'-Region von Klon K9-1 abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:Isolation of clone 26j was performed using a probe derived from the 5 'region of clone K9-1. The sequence of the probe was:

5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.5 'TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.

Die Isolierungsverfahren für Klon 12f und Klon k9-1 (auch als K9-1 bezeichnet) werden in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben, und ihre Sequenzen zeigen Fig. 1 bzw. Fig.2. Die HCV-cDNA-Sequenzen der Klone 13i und 26j zeigen Fig.4 bzw. Fig.5. Ebenfalls dargestellt sind die darin codierten Aminosäuren sowie die Überlappung von Klon 13i mit Klon 12f und die Überlappung von Klon 26j mit Klon 13 i. Die Sequenzen für diese Klone bestätigten die Sequenz von Klon K9-1. Klon K9-1 war aus einer anderen HCV-cDNA-Bank isoliert worden (siehe EPO 218316).The isolation procedures for clone 12f and clone k9-1 (also referred to as K9-1) are described in EPO Pub. No. 3,182,116, and their sequences are shown in Figs. 1 and 2, respectively. The HCV cDNA sequences of clones 13i and 26j are shown in Fig. 4 and Fig. 5, respectively. Also shown are the amino acids encoded therein and the overlap of clone 13i with clone 12f and the overlap of clone 26j with clone 13i. The sequences for these clones confirmed the sequence of clone K9-1. Clone K9-1 had been isolated from another HCV cDNA library (see EPO 218316).

Klon CA 59 a wurde unter Verwendung einer auf der Sequenz der 5'-Region von Klon 26j basierenden Sonde isoliert. Die Sequenz dieser Sonde war:Clone CA 59 a was isolated using a probe based on the sequence of the 5 'region of clone 26j. The sequence of this probe was:

5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.5 'CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.

Eine von der Sequenz von Klon CA 59 a abgeleitete Sonde wurde verwendet, um Klon CA84 a zu isolieren. Die Sequenz der für diese Isolierung verwendeten Sonde war:A probe derived from the sequence of clone CA 59 a was used to isolate clone CA84 a. The sequence of the probe used for this isolation was:

5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.5 'AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.

Klon CAi66e wurde unter Verwendung einer von der Sequenz von Klon CA84a abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:Clone CAi66e was isolated using a probe derived from the sequence of clone CA84a. The sequence of the probe was:

5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.5 'ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.

Klon CA 167 b wurde unter Verwendung einer von der Sequenz von Klon CA156e abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:Clone CA 167b was isolated using a probe derived from the sequence of clone CA156e. The sequence of the probe was:

5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.5 'TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.

Die Nucleotidsequonzen der HCV-cDNAs in den Klonen CA59a, CA84a, CA156e und CA 167 b zeigen die Fig.6,7,8 bzw. 9. Die darin codierten Aminosäuren sowie die Überlappung mit den Sequenzen der betreffenden Klone sind ebenfalls in den Figuren dargestellt.The nucleotide sequences of the HCV cDNAs in clones CA59a, CA84a, CA156e and CA 167b are shown in Figs. 6, 7, 8 and 9, respectively. The amino acids encoded therein and the overlap with the sequences of the relevant clones are also shown in the figures ,

Aufbau der „pl'-HCV-cDNA-BankConstruction of the "pl" HCV cDNA Bank

Eine HCV-cDNA-Bank- die „pi"-Bank-wurde aus der gleichen Partie des infektiösen Schimpansenplasmas, die für die Konstruktion der lambda-gt 11-HCV-cDNA-Bank (ATCC Nr.40394) benutzt wurde, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben wird, und unter Anwendung der im wesentlichen gleichen Techniken konstruiert. Bsi der Konstruktion der pi-Bank wurde jedoch eine Primer-Extensionsmethode angewendet, bei der der Primer für die Umkehrtranskriptase auf der Sequenz von Klon CA59 A beruhte. Die Sequenz des Primers war:An HCV cDNA library, the "pi" bank, was prepared from the same lot of infectious chimpanzee plasma used for the construction of the lambda gt 11 HCV cDNA library (ATCC No. 40394), which is described in U.S. Pat However, in constructing the pi-Bank, a primer extension method was employed in which the reverse transcriptase primer was based on the sequence of clone CA59A. The sequence of the primer was:

5' GGT GAC GTG GGTTTC 3'.5 'GGT GAC GTG GGTTTC 3'.

Isolierung und Sequenz von Klon pi14aIsolation and Sequence of Clone pi14a

Das Screenen der oben beschriebenen „pi"-HCV-cDNA-Bank mit der für die Isolierung von Klon CA 167 b (siehe oben) verwendeten Sonde lieferte Klon pi 14 a. Der Klon enthält etwa 800 Basenpaare der cDNA, die die Klone CA 167 b, CA 156e, CA84 a und CA50a überlappt, die aus der lambda-gt 11 -HCV-cDNA-Bank (ATCC Nr. 40394) isoliert wurden. Ferner enthält der Klon pi 14 a etwa 250 Basenpaare der DNA, die stromaufwärts der HCV-cDNA in Klon CA 167 b liegen.Screening of the above-described "pi" HCV cDNA library with the probe used to isolate clone CA 167b (see above) yielded clone pi 14a. The clone contains approximately 800 base pairs of cDNA containing clones CA 167 b, CA 156e, CA84a and CA50a isolated from the lambda gt 11 HCV cDNA library (ATCC No. 40394) Furthermore, clone pi 14a contains about 250 base pairs of DNA upstream of the HCV cDNA located in clone CA 167b.

Isolierung und Sequenz der Klone CA216a, CA290a und ag30aIsolation and Sequence of Clones CA216a, CA290a and ag30a Ausgehend von der Sequenz von Klon CA 167b wurde eine synthetische Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:Starting from the sequence of clone CA 167b, a synthetic probe of the following sequence was prepared:

5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'5 'GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'

Die obige Sonde wurde benutzt, um zu screenen, was Klon CA216a lieferte, dessen HCV-Sequenzen Fig. 10 zeigt. Ausgehend von der Sequenz von Klon CA216a wurde eine andere Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:The above probe was used to screen, yielding clone CA216a whose HCV sequences Fig. 10 shows. Starting from the sequence of clone CA216a, another probe of the following sequence was prepared:

5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 31 5 'TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3 1

Das Screenen der lambda-gt 11-Bank (ATCC Nr.40394) mit dieser Sonde lieferte Klon CA290a, dessen HCV-Sequenzen Fig. 11Screening of the lambda gt 11 library (ATCC # 40394) with this probe yielded clone CA290a, its HCV sequences Fig. 11

zeigt.shows.

Bei einem Parallelversuch wurde eine Primer-Extensions-cDNA-Bank unter Verwendung von Nucleinsäure aufgebaut, die ausIn a parallel experiment, a primer extension cDNA library was constructed using nucleic acid consisting of

dem gleichen infektiösen Plasma extrahiert worden war, das in der oben beschriebenen ursprünglichen lambda-gt 11-cDNA-extracted from the same infectious plasma as described in the original lambda gt 11 cDNA

Bank verwendet worden war. Der verwendete Primer beruhte auf der Sequenz der Klone CA216a und CA290a:Bank had been used. The primer used was based on the sequence of clones CA216a and CA290a:

5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'5 'GAA GCC GCA CGT AAG 3'

Die cDNA-Bank wurde unter Anwendung von Verfahren aufgebaut, die den zuvor für die Banken beschriebenen ähnelten, die bei der Isolierung der Klone pi 14a und k9-1 benutzt wurden. Die zum Screenen dieser Bank verwendete Sonde beruhte auf der Sequenz von Klon CA290 a;The cDNA library was constructed using procedures similar to those previously described for the banks used in the isolation of clones pi 14a and k9-1. The probe used to screen this library was based on the sequence of clone CA290a;

5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'5 'CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'

Klon ag30a wurde aus der neuen Bank mit der obigen Sonde isoliert und enthielt etwa 670 Basenpaare der HCV-Sequenz, siehe Fig. 12. Ein Teil dieser Sequenz überlappt die HCV-Sequenz der Klone CA216a und CA290 a. Etwa 300 Basenpaare der ag30a-Sequenz liegen jedoch stromaufwärts der Sequenz von Klon CA290a. Die nichtüberlappende Sequenz zeigt Startcodon C) und Stoppcodons, die den Start des HCV-ORF anzeigen können. Ebenfalls in Fig. 12 dargestellt sind mutmaßliche kleine codierte Peptids (Φ Φ), die bei der Regulation der Translation eine Rolle spielen können, sowie die mutmaßliche erste Aminosäure des mutmaßlichen Polypeptide (/) und stromabwärts darin codierte Aminosäuren.Clone ag30a was isolated from the new library with the above probe and contained about 670 base pairs of the HCV sequence, see Figure 12. Part of this sequence overlaps the HCV sequence of clones CA216a and CA290a. However, about 300 base pairs of the ag30a sequence are upstream of the sequence of clone CA290a. The non-overlapping sequence shows start codon C) and stop codons that can indicate the start of the HCV ORF. Also shown in Figure 12 are putative small coded peptides (Φ Φ) that may play a role in the regulation of translation, as well as the putative first amino acid of the putative polypeptide (/) and amino acids encoded downstream therein.

Isolierung und Sequenz von Klon CA205 aIsolation and Sequence of Clone CA205 a Der Klon CA205a wurde aus der ursprünglichen lambda-gt 11 -Bank (ATCC Nr. 40394) unter Verwendung einer synthetischen,The clone CA205a was prepared from the original lambda gt 11 library (ATCC No. 40394) using a synthetic,

von der HCV-Sequenz in Klon CA290a (Fig. 11) abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:isolated from the HCV sequence in clone CA290a (Figure 11). The sequence of the probe was:

5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.5 'TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.

Die in Fig. 13 dargestellte Sequenz der HCV-cDNA in CA205a überlappt mit den cDNA-Sequenzen in den Klonen ag30a und CA290 a. Die Überlappung der Sequenz mit der von CA290a ist durch die punktierte Linie über der Sequenz dargestellt (die Figur zeigt auch die mutmaßlichen Aminosäuren, die in diesem Fragment codiert sind).The sequence of the HCV cDNA in CA205a shown in Figure 13 overlaps with the cDNA sequences in clones ag30a and CA290a. The overlap of the sequence with that of CA290a is shown by the dotted line above the sequence (the figure also shows the putative amino acids encoded in this fragment).

Wie an den HCV-cDNA-Sequenzen iii den Klonen CA205a und ag 30a beobachtet, scheint das mutmaßliche HCV-Polyprotein am ATG-Startcodon zu beginnen; die HCV-Sequenzen in beiden Klonen enthalten einen „in-frame" aneinanderstoßenden Doppel-Stoppcodon (TGATAG) zweiundvierzig Nucleotide strom aufwärts von diesem ATG. Das HCV-ORF scheint nach diesen Stoppcodons zu beginnen und sich über mindestens 8907 Nucleotide zu erstrecken (siehe die in Fig. 17 dargestellte zusammengesetzte HCV-cDNA).As observed on the HCV cDNA sequences iii clones CA205a and ag 30a, the putative HCV polyprotein appears to begin at the ATG start codon; the HCV sequences in both clones contain an in-frame contiguous double stop codon (TGATAG) forty-two nucleotides upstream of this ATG The HCV ORF appears to begin after these stop codons and extend for at least 8907 nucleotides (see U.S. Pat in Fig. 17 shown composite HCV cDNA).

Isolierung und Sequenz von Klon 18gIsolation and sequence of clone 18g Ausgehend von d jr Sequenz von Klon ag 30a (siehe Fig. 12) und einem überlappenden Klon aus der ursprünglichen lambda-gt-Starting from the sequence of clone ag 30a (see Figure 12) and an overlapping clone from the original lambda gt.

11 -Bank (ATCC Nr. 40394) - CA 230 a - wurde eine synthetische Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:11 Bank (ATCC No. 40394) - CA 230 a - a synthetic probe of the following sequence was prepared:

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.5 'CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.

Das Screenen der ursprünglichen lambda-gt 11-HCV-cDNA-Bank mit der Sonde lieferte Klon 18g, dessen HCV-cDNA-Sequenz Fig. 14 zeigt. In der Figur ebenfalls dargestellt sind die Überlappung mit Klon ag30a und mutmaßliche Polypeptide, die in der HCV-cDNA codiert sind.Screening of the original lambda gt 11 HCV cDNA library with the probe yielded clone 18g, whose HCV cDNA sequence shows Figure 14. Also shown in the figure are the overlap with clone ag30a and putative polypeptides encoded in the HCV cDNA.

Die cDNA in Klon 18g (C 18g oder 18g) überlappt die in den oben beschriebenen Klonen ag30a und CA205a. Die Sequenz von C 18g enthält auch die in Klon ag30a beobachtete Doppel-Stoppcodonregion. Die Polynucleotidregion stromaufwärts von diesen Stoppcodons stellt wahrscheinlich einen Teil der 5'-Region des HCV-Genoms dar, die kurze ORFs enthalten kann und die durch direktes Sequenzieren des gereinigten HCV-Genoms bestätigt werden kann. Diese mutmaßlichen kleinen codierten Peptide können eine regulatorische Rolle bei der Translation spielen. Die Region des HCV-Genoms stromaufwärts von der durch C 18g verkörperten kann für die Sequenzanalyse unter Anwendung von im wesentlichen der gleichen Technik isoliert werden, die in der EPO 318216 für die Isolierung der cDNA-Sequenzen stromaufwärts der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 12f beschrieben wird. Im wesentlichen werden kleine synthetische Oligonucleotid-Primer der Umkehrtranskriptase, die auf der Sequenz von C18g basieron, synthetisiert und verwendet, um die entsprechende Sequenz in der HCV-genomischen RNA zu binden. Die Primersequenzen sind proximal zu dem bekannten 5'-Ende von C18g gelegen, aber hinreichend stromabwärts, um die Konstruktion (design) von Sondensequenzen stromaufwärts von den Primersequenzen zu erlauben. Angewendet werden bekannte Standardmethoden für das Priming und Klonieren.The cDNA in clone 18g (C 18g or 18g) overlaps those in clones ag30a and CA205a described above. The sequence of C18g also contains the double-stop codon region observed in clone ag30a. The polynucleotide region upstream of these stop codons probably represents part of the 5 'region of the HCV genome, which may contain short ORFs and which can be confirmed by direct sequencing of the purified HCV genome. These putative small coded peptides may play a regulatory role in translation. The region of the HCV genome upstream of that represented by C18g can be isolated for sequence analysis using essentially the same technique described in EPO 318216 for the isolation of cDNA sequences upstream of the HCV cDNA sequence in clone 12f is described. In essence, small synthetic oligonucleotide primers of reverse transcriptase based on the sequence of C18g are synthesized and used to bind the corresponding sequence in the HCV genomic RNA. The primer sequences are located proximal to the known 5 'end of C18g, but sufficiently downstream to allow design of probe sequences upstream of the primer sequences. Applied standard methods for priming and cloning are used.

Di« resultierenden cDNA-Banken werdon mit Sequenzen stromaufwärts der Priming-Orte (gemäß Ableitung von der ermittelten Sequenz von C18g) gescreent. Die HCV-genomische RNA wird entweder aus Plasma- oder Leberproben von Individuen mit NANBH gewonnen. Da das HCV ein den Flaviviren ähnliches Virus zu sein scheint, kann das 5'-Ende des Genoms mit einer „cap"-Struktur modifiziert werden. Bekannt ist, daß Flavivirus-Genome 5'-terminale „cap"-Strukturen enthalten (Yollow Fever virus) (Gelbfiebervirus), Rice et al., 1988; Dengue-Virus, Hahn et al., 1988; Japanese Enzephalitis Virus, 1987).The resulting cDNA libraries are screened with sequences upstream of the priming sites (as deduced from the determined sequence of C18g). HCV genomic RNA is recovered from either plasma or liver samples from individuals with NANBH. Since the HCV appears to be a flavivirus-like virus, the 5 'end of the genome can be modified with a "cap" structure It is known that flavivirus genomes contain 5'-terminal "cap" structures (Yollow Fever virus) (yellow fever virus), Rice et al., 1988; Dengue virus, Hahn et al., 1988; Japanese Encephalitis Virus, 1987).

Isolierung und Sequenz der Klone aus der beta-HCV-cDNA-BankIsolation and sequence of the clones from the beta HCV cDNA library

Klone, die für die 3'-terminale Region des HCV-Genoms repräsentative cDNA enthalten, wurden aus einer cDNA-Bank isoliert, die aus dem ursprünglichen infektiösen Schimpansenplasma-Pool konstruiert wurde, der für den Aufbau der HCV-cDNA-lambdagt11-8ank (ATCC Nr.40394), beschrieben in der EPO-VeröffentlichungNr.318216, benutzt wurde. Um die DNA-Bank aufzubauen, wurde aus dem Plasma extrahierte RNA mit poly rA unter Verwendung von poly(rA)-Polymerase „geteilt", und diecDNA wurde unter Verwandung von Oligo-(dT)12-i8 als Primer fürdie Umkehrtranskriptase synthetisiert. Die resultierende RNA:cDNA-Hybride wurde mit RNAase H digeriert und in doppelsträngige HCV-cDNA umgewandelt. Die resultierende HCV-cDNA wurde in lambdagt 10 Moniert, wobei im wesentlichen die bei Huynh (1985) beschriebene Technik angewendet und die Beta-(oder b-)HCV jDNA-Bank gebildet wurde. Angewendet wurden folgende Verfahren.Clones containing cDNA representative of the 3'-terminal region of the HCV genome were isolated from a cDNA library constructed from the original chimpanzee infectious plasma pool useful for construction of the HCV cDNA lambda tag (Fig. ATCC No. 40394) described in EPO Publication No. 3,182,216. To construct the DNA library, RNA extracted from the plasma was "split" with poly rA using poly (rA) polymerase, and the cDNA was synthesized using oligo (dT) 12 -i8 as a primer for the reverse transcriptase resulting RNA: cDNA hybrid was digested with RNAase H and converted to double-stranded HCV cDNA The resulting HCV cDNA was cloned in lambda tag using essentially the technique described in Huynh (1985) and the beta (or b ) HCV jDNA bank was formed.

Eine aliquote Menge (12ml) Plasma wurde mit Proteinase K behandelt und mit einem gleichen Volumen Phenol, gesättigt mit 0.05M Tris-Cl vom pH 7,5,0,05% (v/v) ß-Mercaptoethanol, 0,1 % (w/v) Hydroxychinolin und 1 mM EDTA, extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase wurde mit dem Phenoigemisch erneut extrahiert, gefolgt von 3 Extraktionen mit einem 1:1-Gemisch, das Phenol und Chloroform :lsoamylalkohol (24:1) enthielt, gefolgt von 2 Extraktionen mit einem Gemisch ausAn aliquot (12ml) of plasma was treated with Proteinase K and an equal volume of phenol saturated with 0.05M Tris-Cl pH 7.5,05% (v / v) β-mercaptoethanol, 0.1% ( w / v) hydroxyquinoline and 1mM EDTA. The resulting aqueous phase was re-extracted with the phenol mixture, followed by 3 extractions with a 1: 1 mixture containing phenol and chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), followed by 2 extractions with a mixture of

Chloroform und Isoamylalkohol (1:1). Anschließend an die Einstelluno der wäßrigen Phase auf 20OmM in bezug auf NaCI wurden die Nucleinsäuren in der wäßrigen Phase über Nacht bei -200C mit 2,5 Volumina kaltem absolutem Ethanol gefällt. Die Niederschläge wurden durch 40 min Zentrifugieren mit 10OOrpm (min"') gesammelt, mit 70%igem Ethanol mit einem Gehalt von 2OmM NaCI und mit 100%igem kaltem Ethanol gewaschen, 5min in einem Exslkkator getrocknet und in Wasser gelöst. Die isolierten Nucleinsäuren aus dem infektiösen Schimpansenplasma-Pool wurden mit poly rA unter Verwendung von poly-A-Polymerase in Gegenwart von humanem Plazenta-Ribonuclease-Inhibitor (HPRI) (bezogen von Jo; Amersham Corp.) geteilt, wobei MS 2 RNA als Carrier verwendet wurde. Isolierte Nucleinsäuren, die denen in 2 ml Plasma äquivalent waren, wurden in einer Lösung inkubiert, die TMN (50mM Tris-HCI vom pH 7,9,1OmM MgCI2,250mM NaCI, 2,5mM MnCI2,2mM Dithiothreitol (DTT)), 40 mikromolaves a-|32p]-ATP, 20 Einheiten HRPI (Amersham Corp.) und etwa 9 bis 10 Einheiten RNase-freie po!y-A-Polymerase (BRL) enthielt. Die Inkubation dauerte 10min bei 37°C, und die Reaktionen wurden mit EDTA (Endkonzentration etwa 25OmM) gestoppt. Die Lösung wurde mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform und dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, und die Nucleinsäuren wurden über Nacht bei -200C mit 2,5 Volumina Ethanol in Gegenwart von 20OmM NaCI gefällt.Chloroform and isoamyl alcohol (1: 1). Following the Einstelluno the aqueous phase to 20OmM with respect to NaCl, nucleic acids were cold absolute ethanol precipitated in the aqueous phase overnight at -20 0 C with 2.5 volumes. The precipitates were collected by centrifugation at 10 ° C. for 40 minutes, washed with 70% ethanol containing 2OmM NaCl and 100% cold ethanol, dried in a desiccator for 5 minutes and dissolved in water The infectious chimpanzee plasma pool was split with poly rA using poly A polymerase in the presence of human placenta ribonuclease inhibitor (HPRI) (purchased from Jo, Amersham Corp.) using MS 2 RNA as a carrier Nucleic acids equivalent to those in 2 ml of plasma were incubated in a solution containing TMN (50mM Tris-HCl pH 7.9, 0.1mM MgCl 2 , 250mM NaCl, 2.5mM MnCl 2 , 2 mM dithiothreitol (DTT)), 40 micromolaves a- | 32 p ] -ATP, 20 units of HRPI (Amersham Corp.), and about 9 to 10 units of RNase-free polyA polymerase (BRL) .The incubation lasted 10 min at 37 ° C, and the reactions were stopped with EDTA (final concentration about 25 oMM) The solution was washed with extracted the same volume of phenol / chloroform and the same volume of chloroform, and the nucleic acids were precipitated overnight at -20 0 C with 2.5 volumes of ethanol in the presence of 20OmM NaCl.

Isolierung von Klon b5aIsolation of clone b5a

Die beta-HCV-cDNA-Bar.k wurde durch Hybridisierung unter Verwendung einer synthetischen Sonde gescreent, die eine Sequenz auf der Basis der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 15e hatte. Die Isolierung von Klon 15e wird in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben, und seine Sequenz zeigt Fig.3. Die Sequenz der synthetischen Sonde war:The beta HCV cDNA Bar.k was screened by hybridization using a synthetic probe that had a sequence based on the HCV cDNA sequence in clone 15e. The isolation of clone 15e is described in EPO Pub. No. 3,182,116, and its sequence is shown in FIG. The sequence of the synthetic probe was:

5' ATT GCG AGA TCTACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.5 'ATT GCG AGA TCTACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.

Das Screenen der Bank lieferte Klon beta-5a (b5a), dereine HCV-cDNA-Region von annähernd 1000 Basenpaaren enthält. Die 5'-Region dieser cDNA überlappt die Klone 35f, 19g, 26g und 15e (diese Klone werden oben beschrieben). Die Region zwischen der 3'-terminalen poly-A-Sequenz und der 3'-Sequenz, die Klon 15e überlappt, enthält annähernd 200 Basenpaare. Dieser Klon gestattet die Identifizierung einer Region der 3'-terminalen Sequenz des HCV-Genoms.Die Sequenz von b5a ist in der Sequenz der HCV-cDNA in Klon 16jh (nachstehend beschrieben) enthalten. Außerdem liegt die Sequenz auch in CC34a vor, isoliert aus der ursprünglichen lambda-gt11-Bank (ATCC Nr.40394). (Die ursprüngliche lambdagt 11 -Bank wird hier auch als „C-Bank bezeichnet.)Screening of the library yielded clone beta-5a (b5a) containing an HCV cDNA region of approximately 1000 base pairs. The 5 'region of this cDNA overlaps clones 35f, 19g, 26g and 15e (these clones are described above). The region between the 3'-terminal poly A sequence and the 3 'sequence that overlaps clone 15e contains approximately 200 base pairs. This clone allows identification of a region of the 3'-terminal sequence of the HCV genome. The sequence of b5a is included in the sequence of the HCV cDNA in clone 16jh (described below). In addition, the sequence is also present in CC34a isolated from the original lambda gt11 library (ATCC # 40394). (The original lambdagt 11 bank is also referred to herein as a "C-bank.")

Isolierung und Sequenz der Klone, die durch PCR-Ampllflkatlon der 3'-Reglon des HCV-Genoms erzeugt wurden. Multiple cDNA-Klone wurden erzeugt, die von der 3'-Region des HCV-Genoms abgeleitete Nucleotidsequenzen enthalten. Dies erfolgte durch Amplifikation einer Targetregion des Genoms durch eine Polymerase-Kettenreaktionstechnik, die bei Saiki et al. (1986) und bei Saiki et al. (1988) beschrieben wird, und, wie nachstehend beschrieben, modifiziert wurde. Die HCV-RNA, die simplifiziert wurde, wurde aus dem ursprünglichen infektiösen Schimpansenplasma-Pool gewonnen, der für den Aufbau der in der EPO 318216 beschriebenen HCV-cDNA-lambda-gt 11-Bank (ATCC Nr.40394) verwendet wurde. Die Isolierung der HCV-RNA erfolgte, wie vorstehend beschrieben. Die isolierte RNA wurde am 3'-Ende mit ATP durch E.coll-poly-A-Polymerase entsprechend der Beschreibung bei Sippe! (1973) getailt, mit der Ausnahme, daß die aus dem Schimpansenserum isolierten Nucleinsäuren anstelle des Nucleinsäuresubstrats eingesetzt wurden. Die getaute RNA wurde dann durch Umkehrtranskriptase in cDNA umgekehrt transkribiert, wobei ein Oligo-dt-Primer-Adapter - im wesentlichen wie von Han (1987) beschrieben -verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Komponenten und die Sequenz des Primer-Adapters folgende waren:Isolation and Sequence of the Clones Generated by PCR Amplification of the 3 'Reglon of the HCV Genome. Multiple cDNA clones were generated containing nucleotide sequences derived from the 3 'region of the HCV genome. This was done by amplifying a target region of the genome by a polymerase chain reaction technique described in Saiki et al. (1986) and in Saiki et al. (1988) and modified as described below. The HCV RNA that was simplified was recovered from the original infectious chimpanzee plasma pool used to construct the HCV cDNA lambda gt 11 library (ATCC # 40394) described in EPO 318216. Isolation of HCV RNA was as described above. The isolated RNA was cloned at the 3 'end with ATP by E.coll poly-A polymerase as described by Sippe! (1973), with the exception that the nucleic acids isolated from the chimpanzee serum were used in place of the nucleic acid substrate. The thawed RNA was then reverse transcribed by reverse transcriptase into cDNA using an oligo dt primer adapter, essentially as described by Han (1987), except that the components and sequence of the primer adapter were as follows were:

Stuffer Not I SP6-Promotor PrimerStuffer Not I SP6 promoter primer AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T16 AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T 16 Die resultierende cDNA wurde der Amplifikation durch PCR unter Verwendung von zwei Primern unterworfen:The resulting cDNA was subjected to amplification by PCR using two primers: Primer SequencePrimer sequence JH32(30mer) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTACJH32 (30mer) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC JH11 (20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGAJH11 (20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA

Der Primer JH32 enthielt 20 Nucleotidsequenzen, die zum 5'-Ende der Targetregion in der cDNA hybridisierbar waren, mit einer geschätzten Tn, von 66°C. Der Primer JH11 war von einem Teil des Oligo-dt-Primer-Adapters abgeleitet; somit ist er spezifisch für das 3'-Ende der cDNA mit einer Tm von 640C. Beide Primer wurden so konstruiert, daß sie eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Notl am 5'-Ende zwecks Verwendung beim nachfolgenden Klonieren der amplifizierten HCV-cDNA hatten. Die PCR-Reaktion erfolgte durch Suspendieren der cDNA und der Primer in 100μΙ Reaktionsgemisch, das die vier Desoxynucleosid-triphosphate, Puffersalze und Metallionen und eine thermostabile DNA-Polymerase enthielt, die aus Thermus aquaticu: isoliert wurde (Taq-Polymerase), die sich in einem Perkin Eimer Cetus PCR Kit (N 801-0043 oder N 801-0055) befinden. Die PCR-Reaktion wurde über 35 Zyklen in einem Perkin Eimer Cetus DNA Thermal Cycler durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierungsstufe von 1,5min bei 940C, einer Hybridisierungsstufe von 2min bei 600C und einer Primer-Extensionsstufe von 3 min bei 720C. Die PCR-Produkte wurden der Southern-Blot-Analyse unterworfen, wobei eine 30-Nucleotid-Sonde, JH34, verwendet wurde, deren Sequenz auf der 3'-terminalen Region von Klon 15e basierte. Die Sequenz von JH34 ist folgende:The primer JH32 contained 20 nucleotide sequences hybridizable to the 5 'end of the target region in the cDNA, with an estimated T n of 66 ° C. The primer JH11 was derived from a portion of the oligo dt primer adapter; thus, it is specific for the 3 'end of the cDNA with a T m of 64 0 C. Both primers were designed to have a recognition site for the restriction enzyme NotI at the 5' end for the purpose of use in subsequent cloning of the amplified HCV-cDNA had. The PCR reaction was carried out by suspending the cDNA and the primers in 100 μl of reaction mixture containing the four deoxynucleoside triphosphates, buffer salts and metal ions and a thermostable DNA polymerase isolated from Thermus aquaticu: (Taq polymerase), which is located in a Perkin Elmer Cetus PCR Kit (N 801-0043 or N 801-0055). The PCR reaction was performed for 35 cycles in a Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Each cycle consisted of a denaturing step of 1.5 min at 94 0 C, a hybridization step of 2 min at 60 0 C and a primer extension step of 3 min at 72 0 C. The PCR products were subjected to Southern blot analysis, wherein a 30-nucleotide probe, JH34, whose sequence was based on the 3'-terminal region of clone 15e. The sequence of JH34 is as follows:

5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.5 'CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.

Die PCR-Produkte, die durch die HCV-cDNA-Sonde nachgewiesen wurden, lagen in einem Größenbereich von etwa 50 bis etwa 400 Basenpaaren.The PCR products detected by the HCV cDNA probe ranged in size from about 50 to about 400 base pairs.

Um die amplifizierte HCV-cDNA zu klonieren, wurden die PCR-Produkte mit Notl gespalten und durch Polyacrylamidgalelektrophorese nach derGröße selektioniert. DNA von über 300 Basenpaare wurden in die Notl-Stelle vonTo clone the amplified HCV cDNA, the PCR products were cleaved with NotI and selected by size by polyacrylamide electrophoresis. DNA of over 300 base pairs was added to the NotI site

pUC 18S Moniert. Der Vektor pUC18S wird durch Einschluß eines Not I-Polylinkers konstruiert, der zwischen die EcoRI- und die Sall-Stelle von pUC 18 Moniert wurde. Die Klone wurden unter Verwendung der JH 34-Sonde auf HCV-cDNA gescreent. Gewonnen und sequenziert wurde eine Reihe von positiven Klonen. Die Nucleotidsequenzen des HCV-cDNA-lnserts in einem dieser Klone, 16jh, und die darin codierten Aminosäuren zeigt Fig. 15. Eine Nudeotid-Heterogenität, die in der Sequenz der HCV-cDNA in Klon 16jh im Vergleich zu einem anderen Klon dieser Region nachgewiesen wurde, ist in der Figur dargestellt.pUC 18S Moniert. The vector pUC18S is constructed by inclusion of a Not I polylinker cloned between the EcoRI and Sall sites of pUC18. The clones were screened for HCV cDNA using the JH 34 probe. A number of positive clones were recovered and sequenced. The nucleotide sequences of the HCV cDNA insert in one of these clones, 16jh, and the amino acids encoded therein are shown in Figure 15. A nucleotide heterogeneity detected in the sequence of the HCV cDNA in clone 16jh compared to another clone of this region was, is shown in the figure.

Kompilierte HCV-cDNA-SequenzenCompiled HCV cDNA sequences

Eine HCV-cDNA-Sequenz wurde aus einer Serie von überlappenden Klonen kompiliert (zusammengestellt), die aus den verschiedenen oben beschriebenen HCV-cDNA-Banken abgeleitet wurden. In dieser Sequenz liegt die aus den Klonen b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi 14a, CA 167b, C.M56e, CA84a und CA59a gewonnene kompilierte HCV-cDNA-Sequenz stromaufwärts von der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO 318216 veröffentlicht ist und in Fig. 16 gezeigt wird. Die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die aus den Klonen b5a und 16jh erhalten wurde, liegt stromabwärts von der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO 318216 veröffentlicht ist.An HCV cDNA sequence was compiled (assembled) from a series of overlapping clones derived from the various HCV cDNA libraries described above. In this sequence, the compiled HCV cDNA sequence obtained from clones b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, C.M56e, CA84a and CA59a is upstream of the compiled HCV cDNA sequence , which is published in EPO 318216 and shown in FIG. The compiled HCV cDNA sequence obtained from clones b5a and 16jh lies downstream of the compiled HCV cDNA sequence published in EPO 318216.

Fig. 17 zeigt die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die von den oben beschriebenen Klonen abgeleitet ist und die in der EPO 318216 veröffentlichte kompilierte HCV-cDNA-Sequenz.Figure 17 shows the compiled HCV cDNA sequence deduced from the clones described above and the compiled HCV cDNA sequence published in EPO 318216.

Die Klone, von denen die Sequenz abgeleitet wurde, sind b 114 a, 18g, ag 30a, CA205a, CA290 a, CA216a, pi 14 a, CA 167 b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (auch k9-1 bezeichnet), 26j, 13i, 12f, 14i, 11 b, 7f, 7e, 8h, 33 c, 40b, 37b, 35,36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a und 16jh. In der Figur geben die drei Striche über der Sequenz die Position des mutmaßlichen Methionin-Initiationscodons an.The clones from which the sequence was derived are denoted b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (also k9-1) ), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a and 16jh. In the figure, the three bars above the sequence indicate the position of the putative methionine initiation codon.

Klon b 114a wurde unter Anwendung des vorstehend für Klon b5a beschriebenen Klonierungsverfahrens gewonnen, mit der Ausnahme, daß die Sonde eine synthetische Sonde war, die zum Nachweis von Klon 18g, siehe oben, benutzt wurde. Klon b 114a überlappt mit den Klonen 18g, ug30a und CA205a, mit der Ausnahme, daß Klon b 114a zwei zusätzliche Nucleotide stromaufwärts von der Sequenz in Klon 18g (d.h. 5'-CA) enthält. Diese beiden zusätzlichen Nucleotide wurden in die HCV-genomische Sequenz aufgenommen, die Fig. 17 zeigt.Clone b 114a was recovered using the cloning procedure described above for clone b5a, except that the probe was a synthetic probe used to detect clone 18g, supra. Clone b 114a overlaps clones 18g, ug30a, and CA205a except that clone b 114a contains two additional nucleotides upstream of the sequence in clone 18g (i.e., 5'-CA). These two additional nucleotides were included in the HCV genomic sequence shown in FIG. 17.

Obwohl einige der vorstehend beschriebenen Klone aus anderen als der ursprünglichen HCV-cDNA-lambda-gt 11-C-Bank (ATCC Nr.40394) gewonnen wurde, ist zu bemerken, daß diese Klone HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, die die HCV-cDNA-Sequenzen in der ursprünglichen Bank überlappen. Somit läßt sich im wesentlichen die gesamte HCV-Sequenz aus der ursprünglichen lambda-gt 11-C-Bank (ATCC Nr.40394) ableiten, die benutzt wurde, um den ersten HCV-cDNA-Klon (5-1-1) zu isolieren. Die Isolierung von Klon 5-1-1 wird in der EPO Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben.Although some of the clones described above were derived from cDNA other than the original HCV cDNA lambda gt 11-C library (ATCC No. 40394), it should be noted that these clones contain HCV cDNA sequences encoding the HCV cDNA. Overlap cDNA sequences in the original library. Thus, substantially all of the HCV sequence can be deduced from the original lambda gt 11-C library (ATCC # 40394) which was used to isolate the first HCV cDNA clone (5-1-1) , The isolation of clone 5-1-1 is described in EPO Pub. No. 3,182,116.

Reinigung des Fuslonspolypeptlds C100-3 (Alternativmethode)Cleaning the Fuslonpolypeptld C100-3 (alternative method)

Das Fusionspolypeptid C100-3 (auch als HCV c 100-3 und wahlfrei, als c 100-3 bezeichnet) besteht aus Superoxiddismutase (SOD) am N-Ende und einem „in-frame" C100-HCV-Polypeptid am C-Ende. Ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids durch Expression in Hefe und differentielle Extraktion der unlöslichen Fraktion der extrahierten Hefewirtszellen wird in der EPO 3'.8 J!16 beschrieben. Nachstehend wird eine Alternativmethode zur Herstellung dieses Fusionspolypeptids beschrieben. Bei dieser Methode wird das Antigen aus dem rohen Zell-Lysat mit Aceton gefällt; das mit Aceton gefällte Antigen wird danach der lonenaustauschchromatographie unterworfen und durch Gelfiltration weitergereinigt.The fusion polypeptide C100-3 (also referred to as HCV c 100-3 and optional, designated c 100-3) consists of N-terminal superoxide dismutase (SOD) and an in-frame C100 HCV polypeptide at the C-terminus. A method for producing the polypeptide by expression in yeast and differential extraction of the insoluble fraction of the extracted yeast host cells is described in EPO 3,8.816. An alternative method of preparing this fusion polypeptide is described below crude cell lysate is precipitated with acetone and the acetone-precipitated antigen is then subjected to ion exchange chromatography and further purified by gel filtration.

Das Fusionspolypeptid C100-3 (HCV dOO-3) wird im Hefestamm JSC308 (ATCC Nr. 20879) exprimiert, der mit pAB24C 100-3 (ATCC Nr. 67976) transformiert wurde; die transformierte Hefe wird unter Bedingungen vermehrt, die die Expression zulassen (d.h. Vermehrung in YEP mit 1 % Glucosegehalt). (Siehe EPO 318216). Ein Zell-Lysat wird durch Suspendieren der Zellen in Puffer A (2OmM Tris-HCI vom pH 8,0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF) hergestellt. Die Zellen werden durch Mahlen mit Glasperlen in einem Dynomill-Homogenisator oder einer gleichwertigen Vorrichtung zertrümmert. Der Grad der Zellzertrümmerung wird durch Auszählen der Zellen unter einem Mikroskop mit Phasenoptik überwacht. Die zertrümmerten Zellen erscheinen dunkel, während die lebenden Zellen von heller Farbe sind. Die Zahl der zertrümmerten Zellen in Prozent wird bestimmt. Wenn der Anteil der zertrümmerten Zellen annähernd 90% oder mehr beträgt, werden die Zelltrümmer von den Glasperlen durch Zentrifugieren getrennt, und die Glasperlen werden mit Puffer A gewaschen. Nach dem Vereinigen von Waschflüssigkeiten und Homogenat wird das unlösliche Material im Lysat durch Zentrifugieren gewonnen. Das Material im Pellet wird zur Entfernung der löslichen Proteine durch Suspendieren in Puffer B (5OmM Glycin, pH 12,0 1 mM DTT, 50OmM NaCI) und anschließend in Puffer C (5OmM Glycin, pH 10,0 1 mM DTT) gewaschen. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren zurückgewonnen und durch Suspendieren in Puffer C, der SDS enthält, löslich gemacht. Die Extraktlösung kann in Gegenwart von ß-Mercaptoethanol erwärmt und durch Ultrafiltration eingeengt werden. Das HCV c 100-3 im Extrakt wird mit kaltem Aceton gefällt. Falls erwünscht, kann der Niederschlag bei Temperaturen von etwa -150C oder darunter aufbewahrt werden.The fusion polypeptide C100-3 (HCV dOO-3) is expressed in the yeast strain JSC308 (ATCC No. 20879), which was transformed with pAB24C 100-3 (ATCC No. 67976); the transformed yeast is propagated under conditions allowing expression (ie, propagation in YEP with 1% glucose content). (See EPO 318216). A cell lysate is prepared by suspending the cells in buffer A (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). The cells are disrupted by grinding with glass beads in a Dynomill homogenizer or equivalent device. The degree of cell degeneration is monitored by counting the cells under a phased-optic microscope. The shattered cells appear dark, while the living cells are light in color. The number of smashed cells in percent is determined. When the content of the crushed cells is approximately 90% or more, the cell debris is separated from the glass beads by centrifugation, and the glass beads are washed with Buffer A. After combining wash liquors and homogenate, the insoluble material in the lysate is recovered by centrifugation. The material in the pellet is washed to remove the soluble proteins by suspending in buffer B (50 mM glycine, pH 12.0 1 mM DTT, 50 mM NaCl) and then in buffer C (50 mM glycine, pH 10.0 1 mM DTT). The insoluble material is recovered by centrifugation and solubilized by suspending in buffer C containing SDS. The extract solution can be heated in the presence of β-mercaptoethanol and concentrated by ultrafiltration. The HCV c 100-3 in the extract is precipitated with cold acetone. If desired, the precipitation at temperatures of about -15 0 C or can be kept lower.

Vor der lonenaustauschchromatographie wird das mit Aceton gefällte Material durch Zentrifugieren zurückgewonnen, und es kann unter Stickstoff getrocknet werden. Der Niederschlag wird in Puffer D (5OmM Glycin, pH 10,0,1 mM DTT, 7 M Harnstoff) suspendiert und zentrifugiert, um das unlösliche Material zu pelletieren. Das überstehende Material wird in eine Anionenaustauschsäule überführt, die zuvor mit Puffer D äquilibriert wurde. Die Fraktionen werden gesammelt und durch Ultraviolettabsorption oder Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Fraktionen, die das HCV-c 100-3-Polypeptid enthalten, werden „gepoolt".Prior to ion exchange chromatography, the acetone-precipitated material is recovered by centrifugation and it can be dried under nitrogen. The precipitate is suspended in buffer D (50 mM glycine, pH 10.0, 1 mM DTT, 7 M urea) and centrifuged to pellet the insoluble material. The supernatant material is transferred to an anion exchange column previously equilibrated with buffer D. The fractions are collected and analyzed by ultraviolet absorption or gel electrophoresis on SDS-polyacrylamide gels. The fractions containing the HCV c 100-3 polypeptide are pooled.

Um das HCV-c 100-3-PoIypeptid durch Gelfiltration zu reinigen, werden die „gepoolten" Fraktionen aus der lonenaustauschsäule in Gegenwart von ß-Mercaptoethanol und SDS erwärmt, und das Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wird in eine Gelfiltrationssäule überführt, die zuvor mit Puffer E (2OmM Tris-HCI, pH 7,0,1 mM DTT, 0,1 % SDS) äquilibriert wurde. Die Präsenz von HCV c100-3 in den eluierten Fraktionen sowie die Gegenwart von Verunreinigungen werden durch Gelelektrophorese an Polyacrylamidgelen in Gegenwart von SDS und Sichtbarmachung der Polypeptide bestimmt. Die Fraktionen, die gereinigtes HCV c100-3 enthalten, werden „gepoolt". HCV-c 100-3-reiche Fraktionen können durch wiederholte Gelfiltration weiter gereinigt werden. Wenn die Entfernung von Partikelmaterial erwünscht ist, kann das HCV-c 100-3-haltige Material durch ein O,22-M-Filter filtriert werden.To purify the HCV-c 100-3 polypeptide by gel filtration, the pooled fractions are heated from the ion exchange column in the presence of β-mercaptoethanol and SDS, and the eluate is concentrated by ultrafiltration The concentrate is transferred to a gel filtration column. which had previously been equilibrated with buffer E (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.1 mM DTT, 0.1% SDS). The presence of HCV c100-3 in the eluted fractions as well as the presence of impurities are monitored by gel electrophoresis on polyacrylamide gels in the presence of SDS and visualization of the polypeptides The fractions containing purified HCV c100-3 are pooled. HCV-c 100-3-rich fractions can be further purified by repeated gel filtration. If removal of particulate matter is desired, the HCV-c 100-3 containing material can be filtered through an O, 22-M filter.

Expression und Antigenität der In HCV-cDNA codierten Polypeptide In E. coil exprlmlerte PolypeptideExpression and Antigenicity of Polypeptides Encoded in HCV cDNA Polypeptides expressed in E. coli

Die Polypeptide, die in einer Reihe von HCV-cDNAs, die das HCV-genomische ORF überspannen, wurden in E.coli exprimiert und auf ihre Antigenität unter Verwendung von Serum getestet, das von einer Vielzahl von Individuen mit NANBH gewonnen wurde. Die Expressionsvektoren, die die Monierten HCV-cDNAs enthalten, wurden aus pSODcf 1 (Steimer et al., 1986) konstruiert. Um sicher zu sein, daß ein richtiges Leseraster erzielt wird, wurden drei gesonderte Expressionsvektoren - pcf 1 AB, pcf 1 CD und pcf 1EF- durch Ligation eines der drei Linker AB, CD und EF an ein BamHI-EcoRI-Fragment, abgeleitet durch Digerieren bis zur Vervollständigung des Vektors psODcf 1 mit EcoRI und BamHI, worauf Behandlung mit alkalischer Phosphatase folgte, geschaffen. Die Linker wurden aus den sechs Oligomeren A, B, C, D, E und F erzeugt. Jedes Oligomer wurde durch Behandlung mit Kinase in Gegenwart von ATP vor der Hybridisierung an sein komplementäres Oligomer phosphoryliert. Die Sequenzen der synthetischen Linker waren folgende:The polypeptides expressed in a series of HCV cDNAs spanning the HCV genomic ORF were expressed in E. coli and tested for their antigenicity using serum obtained from a variety of individuals with NANBH. The expression vectors containing the cloned HCV cDNAs were constructed from pSODcf 1 (Steimer et al., 1986). To be sure that a correct reading frame is achieved, three separate expression vectors - pcf 1 AB, pcf 1 CD and pcf 1EF- were ligated by ligation of one of the three linkers AB, CD and EF to a BamHI-EcoRI fragment until completion of the vector psODcf 1 with EcoRI and BamHI followed by treatment with alkaline phosphatase. The linkers were generated from the six oligomers A, B, C, D, E and F. Each oligomer was phosphorylated to its complementary oligomer by treatment with kinase in the presence of ATP prior to hybridization. The sequences of the synthetic linkers were as follows:

Name DNA-Sequenz (5'-» 3')Name DNA sequence (5'- »3 ')

A GATC CTG AAT TCC TGA TAAA GATC CTG AAT TCC TGA TAA

B GAC TTA AGG ACT ATT TTA AB GAC TTA AGG ACT ATT TTA A

C GATC CGA ATT CTG TGA TAAC GATC CGA ATT CTG TGA TAA

D GCT TAA GAC ACT ATT TTA AD GCT TAA GAC ACT ATT TTA A

E GATC CTG GAA TTC TGA TAAE GATC CTG GAA TTC TGA TAA

F GAC CTT AAG ACT ATT TTA AF GAC CTT AAG ACT ATT TTA A

Jeder der drei Linker zerstört die ursprüngliche EcoRI-Stelle und erzeugt eine neue EcoRI-Stelle innerhalb des Linkers, aber in einem anderen Leseraster. Daher befanden sich die HCV-cDNA-EcoRI-Fragmente, die aus den Klonen isoliert wurden, in drei verschiedenen Leserastern, wenn sie in den Expressionsvektor inseriert wurden.Each of the three linkers destroys the original EcoRI site and creates a new EcoRI site within the linker but in a different reading frame. Therefore, the HCV cDNA EcoRI fragments isolated from the clones were in three different reading frames when inserted into the expression vector.

Die HCV-cDNA-Fragmente in den bestimmten lambda-gt 11-Klonen wurden durch Digestion mit EcoRI ausgeschnitten; jedes Fragment wurde in pcf 1 AB, pcf 1 CD und pcf 1EF inseriert. Diese Expressionskonstrukte wurden danach in D1210-E.coli-Zellen transformiert, die Transformanten wurden Moniert, und die rekombinanten Bakterien aus jedem Klon wurden veranlaßt, die Fusionspoly peptide durch Vermehrung der Bakterien in Gegenwart von IPTG zu exprimieren.The HCV cDNA fragments in the particular λgt 11 clones were excised by digestion with EcoRI; each fragment was inserted into pcf 1 AB, pcf 1 CD and pcf 1EF. These expression constructs were then transformed into D1210 E. coli cells, the transformants were cloned, and the recombinant bacteria from each clone were caused to express the fusion polypeptides by propagation of the bacteria in the presence of IPTG.

Die Expressionsprodukte der angegebenen HCV-cDNAs wurden durch direktes immunologisches Screenen der Kolonien auf Antigenität getestet, wobei eine Modifikation des von Helfman et al. (1983) beschriebenen Verfahrens angewendet wurde. Wie Fig. 18 zeigt, wurden die Bakterien auf Nitrocellulosefiltern, die auf Ampicillin-Platten gelegt waren, plattiert, so daß etwa 1000 Kolonien je Filter entstanden. Die Kolonien wurden auf Nitrocellulosefilter replika-plattiert, und die „replice" wurden über Nacht in Gegenwart von 2mM IPTG und Ampicillin erneut vermehrt (regrown). Die Bakterienkolonien wurden lysiert, indem die Nitrocellulosefilter etwa 15 bis 20min in einer mit CHCI3-Dampf gesättigten Atmosphäre aufgehängt wurden. Jedes Filter wurde danach in einer gesonderten 100-mm-Petrischale untergebrächt, die 10ml 5OmM Tris-HCI vom pH 7,515OmM NaCI, 5mM MgCI2,3% (w/w) BSA, 40pg/ml Lysozym und 0,1 \igim\ DNase enthielt. Die Platten wurden mindestens 8 h bei Raumtemperatur schwach bewegt. Die Filter wurden in TBST (5OmM Tris-HCI vom pH 8,0,15OmM NaCI, 0,005% Tween 20) gespült. Nach dem Inkubieren wurden die Zellreste abgespült und in TBS (TBST ohne Tweed), das 10% Schafserum enthielt, inkubiert; inkubiert wurde 1 Stunde. Die Filter wurden danach in TBS mit vorbehandelten Seren von Individuen mit NANBH inkubiert; dazu gehörten: 3 Schimpansen, 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Seren in bezug auf Antikörper gegen HCV-C100-3-Polypeptid (beschrieben in der EPO 318216 und oben) (auch als C100 bezeichnet) positiv waren, 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper negativ waren, ein Rekonvaleszent, dessen Serum in bezug auf Anti-C 100-Antikörper negativ war, und 6 Patienten mit sporadisch auftretender (community acquired) NANBH, darunter einer, dessen Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper stark positiv waren, und einer, dessen Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper gerade noch positiv waren. Die in THS verdünnten Seren wurden durch Vorabsorption mit hSOD vorbehandelt. Die Filter mit den Seren wurden mindestens 2h inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Filter zweimal 30min mit TBST gewaschen. Die Markierung der exprimierten Proteine, an die die Antikörper in den Seren gebunden waren, erfolgte durch 2 h Inkubation mit 1251-markiertem Schaf-Antihuman-Antikörper. Nach dem Waschen wurden die Filter zweimal 30min mit TBST gewaschen, getrocknet und autoradiographiert.The expression products of the indicated HCV cDNAs were tested for antigenicity by direct immunological screening of the colonies using a modification of the method described by Helfman et al. (1983). As shown in Fig. 18, the bacteria were plated on nitrocellulose filters placed on ampicillin plates to give about 1000 colonies per filter. The colonies were replica-plated on nitrocellulose filters and the replicons were regrown overnight in the presence of 2 mM IPTG and ampicillin The bacterial colonies were lysed by placing the nitrocellulose filters in CHCI 3 vapor saturated for about 15 to 20 min Each filter was then submerged in a separate 100 mm Petri dish containing 10 ml of 50 mM Tris-HCl of pH 7.515 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 3% (w / w) BSA, 40 μg / ml lysozyme and 0, The plates were gently agitated for at least 8 h at room temperature The filters were rinsed in TBST (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 15 mM, NaCl, 0.005% Tween 20) After incubation, cell debris became rinsed and incubated in TBS (TBST without Tweed) containing 10% sheep serum, incubated for 1 hour, and the filters were then incubated in TBS with pretreated sera from individuals with NANBH, including: 3 chimpanzees, 8 patients with chronic NANBH, the Sera with respect to antibodies to HCV C100-3 polypeptide (described in EPO 318216 and supra) (also referred to as C100) were positive, 8 patients with chronic NANBH whose sera were negative with respect to anti-C 100 antibodies were a convalescent whose serum was negative for anti-C 100 antibody and 6 patients with sporadic (community acquired) NANBH, including one whose sera were highly positive for anti-C 100 antibody, and one whose sera were just still positive for anti-C 100 antibody. The sera diluted in THS were pretreated by hSOD pre-absorption. The filters with the sera were incubated for at least 2 hours. After incubation, filters were washed twice with TBST for 30 min. The labeling of the expressed proteins to which the antibodies were bound in the sera was carried out by incubation with 1251-labeled sheep antihuman antibody for 2 hours. After washing, the filters were washed twice with TBST for 30 minutes, dried and autoradiographed.

Von einer Reihe von Klonen (siehe unten) wurden Polypeptide exprimiert, die HCV-Epitope enthielten, die immunologisch mit Serum von Individuen mit NANBH reaktionsfähig wann. Fünf dieser Polypeptide waren sehr immunogen, sofern als Antikörper zu den HCV-Epitopen in diesen Polypeptiden in vielen verschiedenen Patientenseren nachgewiesen wurden. Die Klone, die diese Polypeptide codieren, und die Lage des Polypeptids in dem mutmaßlichen HCV-Polyprotein (in dem die Aminosäurenummern mit dem mutmaßlichen Initiationscodon beginnen) sind folgende: Klon 5-1-1, Aminosäuren 1694-1735; Klon C100, Aminosäuren 1569-1931; Klon 33c, Aminosäuren 1192-1457; KlonCA279a, Aminosäuren 1-84; und Klon CA290a, Aminosäuren 9-177. Die Lage der immunogenen Polypeptide in dem mutmaßlichen HCV-Polyprotein wird unmittelbar anschließend wiedergegeben.From a series of clones (see below), polypeptides were expressed that contained HCV epitopes that were immunologically reactive with serum from individuals with NANBH. Five of these polypeptides were very immunogenic when detected as antibodies to the HCV epitopes in these polypeptides in many different patient sera. The clones encoding these polypeptides and the location of the polypeptide in the putative HCV polyprotein (in which the amino acid numbers begin with the putative initiation codon) are as follows: clone 5-1-1, amino acids 1694-1735; Clone C100, amino acids 1569-1931; Clone 33c, amino acids 1192-1457; Clone CA279a, amino acids 1-84; and clone CA290a, amino acids 9-177. The location of the immunogenic polypeptides in the putative HCV polyprotein is displayed immediately thereafter.

-29- 297 446 Klone, die Polypeptide von erwiesener Reaktionsfähigkeit mit Seren von NANBH-Patlenten codieren-29- 297 446 clones encoding polypeptides of proven reactivity with sera of NANBH patents

Klon Lage im HCV-PolyproteinClone location in the HCV polyprotein

(Aminosäurenummer beginnend mit dem mutmaßlichen Initiator-Methionin)(Amino acid number starting with the putative initiator methionine)

CA 279 aCA 279 a 1-841-84 CA74aCA74a 437-582437-582 13i13i 511-690511-690 CA290aCA290a 9-1779-177 33c33c 1192-14571192-1457 40 b40 b 1266-14281266-1428 5-1-15-1-1 1694-17351694-1735 8181 1689-18051689-1805 33 b33 b 1916-20211916-2021 25c25c 1949-21241949-2124 14c14c 2054-22232054-2223 8f8f 2200-33252200-3325 33 f33 f 2287-23852287-2385 33g33g 2348-24642348-2464 39c39c 2371-25022371-2502 15e15e 2796-28862796-2886 C100C100 1 569-19311 569-1931

Die Ergebnisse hinsichtlich der Immun genität der in den verschiedenen untersuchten Klonen ccodierten Polypeptide weisen auf einen wirksamen Nachweis hin, und die Immunisierungssysteme können „Panels" der HCV-Polypeptide/Epitope enthalten.The results regarding the immunogenicity of the polypeptides ccoded in the various clones studied indicate effective detection, and the immunization systems may contain "panels" of the HCV polypeptides / epitopes.

Expression von HCV-EpItopen In HefeExpression of HCV Epitopes in Yeast

Drei verschiedene Hefe-Expressionsvektoren, die die Insertion von HCV-cDNA in drei verschiedene Leseraster gestatten, wurden konstruiert. Die Konstruktion eines der Vektoren - pAB 24C100-3-wird in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. In den nachstehenden Untersuchungen wurde die HCV-cDNA aus den oben verzeichneten Kloben in der Antigenitäts-Kartierungsuntersuchung unter Verwendung in der E.coli exprimierten Produkte mit der CIOO-HCV-cDNA ausgetauscht. Die Konstruktion der anderen Vektoren ersetzt den Adapter, der in den obigen E.coli-Untersuchungen beschrieben wird, durch einen der folgenden Adapter:Three different yeast expression vectors allowing the insertion of HCV cDNA into three different reading frames were constructed. The construction of one of the vectors - pAB 24C100-3 - is described in EPO Pub. No. 3,182,116. In the following studies, the HCV cDNA from the above-noted blocks in the antigenicity mapping study was replaced with the CIOO-HCV cDNA using products expressed in the E. coli. Construction of the other vectors replaces the adapter described in the above E. coli assays with one of the following adapters:

Adapter 1Adapter 1

ATT TTG AAT TCC TAA TGA GATT TTG AAT TCC TAA TGA G

AC TTA AGG ATT ACT CAG CT Adapter 2 AC TTA AGG ATT ACT CAG CT Adapter 2

AAT TTG GAA TTC TAA TGA GAAT TTG GAA TTC TAA TGA G AC CTT AAG ATT ACT CAG CT.AC CTT AAG ATT ACT CAG CT.

Die inserierte HCV-cDNA wird in Hefe, die mit den Vektoren transformiert ist, unter denn vorstehend für die Expression des Fusionspolypeptide C100-3 beschriebenen Expressionsbedingungen exprimiert. Die resultierenden Polypeptide werden unter Verwendung der Seren von Individuen mit NANBH gescreent, die oben für das Screenen von immunogenen Polypeptiden, die in E.coli exprimierten HCV-cDNAs codiert sind, beschrieben wurden.The inserted HCV cDNA is expressed in yeast transformed with the vectors under the expression conditions described above for the expression of the fusion polypeptide C100-3. The resulting polypeptides are screened using the sera of individuals with NANBH described above for the screening of immunogenic polypeptides encoded in E. coli expressed HCV cDNAs.

Vergleich des Hydrophobieprofils von HCV-Polyprotelnen mit West-Nile-Virus-Polyprotein und mit Dengue-Virus NS1 Das Hydrophieprofil eines HCV-Polyproteinsegments wurde mit dem eines typischen Flavivirus, des West-Nile-Virus, verglichen. Die Polypeptidsequenz des West-Nile-Virus-Polyproteins wurde von den bekannten Polynucleotidsequenzen abgeleitet, die die Nichtstrukturproteine dieses Virus codieren. Die HCV-Polyproteinsequenz wurde von der Sequenz überlappender cDNA-Klone abgeleitet. Die Profile wurden unter Anwendung eines Antigenprogramms bestimmt, das ein Fenster mit einer Breite von 7 Aminosäuren (die betreffende Aminosäure und 3 Reste auf jeder Seite) nutzt, um die durchschnittliche Hydrophobie um einen gegebenen Aminosäurerest festzustellen. Die Parameter, die die reaktive Hydrophobie für jeden Aminosäurerest angeben, stammen von Kyte und Doolittle (1982). Fig. 19 zeigt die Hydrophobieprofile der beiden Polyproteine; die Flächen, die den Nichtstrukturproteinen des West-Nile-Virus ns 1 bis ns5 entsprechen, sind in der Figur angegeben. Wie aus der Figur ersichtlich ist, besteht eine verbreitete Ähnlichkeit zwischen den Profilen des HCV-Polyproteins und des West-Nile-Virus-Polyproteins. Die Sequenz der Aminosäuren, die in der in Fig. 16 dargestellten 5'-Region der HCV-cDNA codiert sind, wurde mit der entsprechenden Region eines der vorstehend beschriebenen Stämme des Dengue-Virus in bezug auf das Profil von Regionen von Hydrophobie und Hydrophilie verglichen (keine Daten angegeben). Dieser Vergleich zeigt, daß die Polypeptide des HCV und des Dengue-Virus, die in dieser Region codiert sind, die der NS1 (oder einen Teil davon) codierenden Region entspricht, ein ähnliches Hydrophobie-/Hydrophilieprofil haben.Comparison of the Hydrophobicity Profile of HCV Polypropylene Tendrils with West Nile Virus Polyprotein and Dengue Virus NS1 The hydrophilic profile of a HCV polyprotein segment was compared to that of a typical flavivirus, West Nile virus. The polypeptide sequence of the West Nile virus polyprotein was derived from the known polynucleotide sequences encoding the non-structural proteins of this virus. The HCV polyprotein sequence was derived from the sequence of overlapping cDNA clones. The profiles were determined using an antigenic program utilizing a 7-amino-mer window (the relevant amino acid and 3 residues on each side) to determine the average hydrophobicity around a given amino acid residue. The parameters indicative of reactive hydrophobicity for each amino acid residue are from Kyte and Doolittle (1982). Fig. 19 shows the hydrophobicity profiles of the two polyproteins; the areas corresponding to the non-structural proteins of West Nile virus ns 1 to ns5 are shown in the figure. As can be seen from the figure, there is a widespread similarity between the profiles of the HCV polyprotein and the West Nile virus polyprotein. The sequence of amino acids encoded in the 5 'region of the HCV cDNA shown in Figure 16 was compared to the corresponding region of one of the dengue virus strains described above in terms of the profile of regions of hydrophobicity and hydrophilicity (no data given). This comparison demonstrates that the polypeptides of HCV and dengue virus encoded in this region correspond to the region encoding the NS1 (or portion thereof) have a similar hydrophobicity / hydrophilicity profile.

Die Ähnlichkeit der Hydrophobieprofile im Verein mit den früher in der EP 0218316 identifizierten Homologien in den Aminosäuresequenzen des HCV und des Dengue-Flavivirus deuten daraufhin, daß das HCV mit diesen Vertretern der Familie auf Flaviviren verwandt ist.The similarity of the hydrophobicity profiles in association with the homologies identified earlier in EP 0218316 in the amino acid sequences of HCV and dengue flavivirus indicate that HCV is related to flaviviruses with these family members.

Charakterisierung der mutmaßlichen Polypeptide, die Im HCV-ORF codiert sindCharacterization of putative polypeptides encoded in HCV ORF

Die Sequenz des codiorenden Strangs der HCV-cDNA, die Fig. 17 zeigt, wurde von den überlappenden HCV-cDNAs in den verschiedenen Klonen abgeleitet, die in der EPO 318216 und oben beschrieben werden. Es kann aus der Sequenz gefolgt werden, daß das HCV-Genom im wesentlichen ein langes kontinuierliches ORF enthält, das ein Polyprotein codiert. In der Sequenz entspricht die Nucleotidnummer 1 dem ersten Nucleotid des MET-Initiationscodons; die Nummern mit Minuszeichen geben an, daß die Nucleotide um diese Distanz in 5'-Richtung (stromaufwärts) entfernt sind, während Nummern mit Pluszeichen anzeigen, daß die Nucleotide um diese Distanz in 3'-Richtung (stromabwärts) angeordnet sind. Die zusammengesetzte Sequenz zeigt den codierenden Strang der HCV-cDNA. Die Aminosäuresequenz uuo mutmaßlichen HCV-Polyproteins, die von der Sequenz des codierenden Strangs der HC-cDNA abgeleitet ist, ist ebenfalls in Fig. 17 dargestellt, in der Position 1 mit dem mutmaßlichen Initiator-Methionin beginnt.The sequence of the codoing strand of the HCV cDNA shown in Figure 17 was derived from the overlapping HCV cDNAs in the various clones described in EPO 318216 and above. It can be followed from the sequence that the HCV genome essentially contains a long continuous ORF encoding a polyprotein. In the sequence, nucleotide number 1 corresponds to the first nucleotide of the MET initiation codon; the numbers with minus signs indicate that the nucleotides are removed by this distance in the 5 'direction (upstream), while numbers with plus signs indicate that the nucleotides are arranged by this distance in the 3' direction (downstream). The assembled sequence shows the coding strand of the HCV cDNA. The amino acid sequence of the putative HCV polyprotein derived from the sequence of the coding strand of the HC cDNA is also shown in Figure 17 in which position 1 begins with the putative initiator methionine.

Mögliche Proteindomänen des codierten HCV-Polyproteins sowie die annähernden Begrenzungen sind folgende (die in Anführungszeichen gesetzten Polypeptide sind jene, die in Flavivirus-Domäne codiert sind):Possible protein domains of the encoded HCV polyprotein and the approximate limitations are as follows (the quoted polypeptides are those encoded in Flavivirus domain):

MutmaßlicheDomäne Annähernde BegrenzungSuspected domain Approximate limit

(Aminosäurenummern)(Amino acid numbers)

„C" (Nucleocapsid-Protein)"C" (nucleocapsid protein) i-120i-120 „E"(Virion-Hüllprotein[e]"E" (virion envelope protein [e] undand mögliche Matrix-Proteine [M-ProteineJ)possible matrix proteins [M-proteinsJ) 120-400120-400 „NS1"{Komplementfixationsantigen?)"NS1" {Komplementfixationsantigen?) 400-660400-660 „NS2" (unbekannte Funktion)"NS2" (unknown function) 660-1050660-1050 „NS3" (Protease?)"NS3" (protease?) 1050-16401050-1640 „NS4" (unbekannte Funktion)"NS4" (unknown function) 1640-20001640-2000 „NS5"(Polvmerase)"NS5" (Polvmerase) 2000-?Ende2000? End

Zu bemerken ist jedoch, daß die Hydrophobieprofile (nachstehend beschrieben) zeigen, daß das HCV vom Flavivirus-Modell abweicht, insbesondere in bezug auf die Region stromaufwärts von NS 2. Außerdem sollen die angegebenen Begrenzungen keine unveränderlichen Grenzfestlegungen zwischen den mutmaßlichen Polypeptiden bedeuten.It should be noted, however, that the hydrophobicity profiles (described below) show that the HCV deviates from the flavivirus model, particularly with respect to the upstream region of NS 2. In addition, the limitations indicated are not intended to imply fixed limit definitions between the putative polypeptides.

Das hydropile· und antigene Profil des PolypeptideThe hydrophilic and antigenic profile of the polypeptide

Die Hydrophile-/Hydrophobieprofile und der Antigenindex des mutmaßlichen Polyproteins, das in der in Fig. 16 dargestellten HCV-cDNA-Sequenz codiert ist, wurden durch Computer-Analyse bestimmt. Das Programm für Hydrophilie/Hydrophobie entsprach der obigen Beschreibung. Der Antigenindex ergibt sich aus einem Computerprogramm, das auf folgenden Kriterien beruht: 1) Oberflächenwahrscheinlichkeit, 2) Vorhersage der a-Helizität nach zwei verschiedenen Verfahren, 3) Vorhersage der ß-Faltblattregionen nach zwei verschiedenen Verfahren, 4) Vorhersage der U-Schleifen nach zwei verschiedenen Verfahren, 5) Hydrophilie/Hydrophobie und Flexibilität. Die Spuren der Profile, die durch die Computer-Analyse erzeugt wurden, zeigt Fig. 20. Beim Hydrophilieprofil bedeutet die Auslenkung über der Abszisse Hydrophilie und unter der Abszisse Hydrophobie. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Polypeptidregion antigen ist, wird gewöhnlich als zunehmend betrachtet, wenn eine Auslenkung über der Abszisse in das Hydrophilieprofil und/oder antigene Profil erfolgt. Zu bemerken ist jedoch, daß diese Profile nicht unbedingt Indikatoren für die Stärke der Immunogenität eines Polypeptids sind.The hydrophile / hydrophobicity profiles and the antigenic index of the putative polyprotein encoded in the HCV cDNA sequence shown in Figure 16 were determined by computer analysis. The program for hydrophilicity / hydrophobicity corresponded to the above description. The antigen index results from a computer program based on the following criteria: 1) surface probability, 2) prediction of a-helicity by two different methods, 3) prediction of β-sheet regions by two different methods, 4) prediction of U-loops by two different processes, 5) hydrophilicity / hydrophobicity and flexibility. The traces of the profiles produced by the computer analysis are shown in Fig. 20. In the hydrophilicity profile, the deflection above the abscissa is hydrophilicity and below the abscissa is hydrophobicity. The likelihood that a polypeptide region is antigenic is usually considered to be increasing when it is deflected over the abscissa into the hydrophilicity profile and / or antigenic profile. It should be noted, however, that these profiles are not necessarily indicators of the level of immunogenicity of a polypeptide.

Identifizierung der co-linearen Peptide in HCV und FlavivirenIdentification of co-linear peptides in HCV and flaviviruses Die Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Polyproteins, das in dem codierenden Strang der HCV-cDNA codiert ist, wurde mitThe amino acid sequence of the putative polyprotein encoded in the coding strand of the HCV cDNA was analyzed with

den bekannten Aminosäuresequenzen verschiedener Vertreter der Flaviviren verglichen. Der Vergleich zeigt, daß die Homologieunbedeutend ist, aber wegen der Regionen, in denen sie festgestellt wurde, ist sie wahrscheinlich signifikant. Fig. 21 zeigt diekonservierten co-linearen Regionen. Die Aminosäurenummern unter den Sequenzen stellen die Nummer in der mutmaßlichenthe known amino acid sequences of various representatives of the Flaviviren compared. The comparison shows that homology is insignificant, but it is likely to be significant because of the regions in which it was found. Fig. 21 shows the conserved co-linear regions. The amino acid numbers among the sequences represent the number in the suspected

HCV-Polyprotein dar (siehe Fig. 17).HCV polyprotein (see Fig. 17). Der Abstand dieser konservierten Motive ist zwischen Flaviviren und HCV ähnlich und deutet an, daß zwischen dem HCV undThe distance of these conserved motifs is similar between flaviviruses and HCV, suggesting that between the HCV and

diesen flaviviralen Agenzien eine gewisse Ähnlichkeit besteht.These flaviviral agents have a certain similarity.

Die nachfolgend verzeichneten Materialien sind entsprechend den Bestimmungen des Budapester Vertrages bei der AmericanThe following materials are in accordance with the provisions of the Budapest Treaty with the American Type Culture Collection (ATCC, 12301 Parklawn Dr., Rockvillo, Maryland 20852, hinterlegt worden und haben die folgendenType Culture Collection (ATCC, 12301 Parklawn Dr., Rockvillo, Maryland 20852, deposited and have the following Zugangsnummern erhalten.Receive access numbers.

Iambda-gt11Lambda gt11 ATCC-Nr.ATCC-No. HinterlegungstagLodgement HCV-cDNA-BankHCV cDNA library 4039440394 1. Dez. 1987Dec. 1, 1987 Klon 81Clone 81 4038840388 17. Nov. 1987Nov. 17, 1987 Klon 91Clone 91 4038940389 17. Nov. 1987Nov. 17, 1987 Klon 1-2Clone 1-2 4039040390 17. Nov. 1987Nov. 17, 1987 Klon 5-1-1Clone 5-1-1 4039140391 18. Nov. 1987Nov. 18, 1987 Klon12fKlon12f 4051440514 10. Nov. 1988Nov. 10, 1988 Klon35fKlon35f 4051140511 10.Nov.198810.Nov.1988 Klon15eKlon15e 4051340513 10. Nov. 1988Nov. 10, 1988 KlonK9-1KlonK9-1 4051240512 10. Nov. 1988Nov. 10, 1988 JSC303JSC303 2087920879 5. Mai 1988May 5, 1988 pS356pS356 6768367683 29. April 1988April 29, 1988

-31- 297 446 Ferner wurden am 11. Mai 1989 hinterlegt:-31- 297 446 Further, on May 11, 1989, it was deposited:

Stamm Linker ATCC-Nr.Strain linker ATCC no.

D1210 (Cf 1/5-1-1)D1210 (Cf 1 / 5-1-1) EFEF II ATCC-Nr.ATCC-No. 6796767967 D1210 (Cn/81)D1210 (Cn / 81) EFEF Die folgenden Abkömmlinge von Stamm D1210 wurden am 3.MaiThe following derivatives of strain D1210 were on May 3 6795667956 6796867968 D1210 (Cf1/CA74a)D1210 (Cf1 / CA74a) EFEF Stamm-AbkömmlingParent-child 6795267952 6796967969 D1210 (Cf1/35f)D1210 (Cf1 / 35f) ABFROM pCF1CS/C8fpCF1CS / C8F 6794967949 6797067970 D1210 (Cf1/279a)D1210 (Cf1 / 279a) EFEF pCF1AB/C12fpCF1AB / C12f 6795467954 6797167971 . D1210 (Cf1/C36), D1210 (Cf1 / C36) CDCD pCF1EF/14cpcf1EF / 14c 6795867958 6797267972 D1210 (Cf1/13i)D1210 (Cf1 / 13i) ABFROM pCF1EF/15epcf1EF / 15e 6795367953 6797367973 D1210 (Cf1/C33b)D1210 (Cf1 / C33b) EFEF pCF1AB/C25cpCF1AB / C25C 6705067050 6797467974 D1210 (CF 1/CA 29Oa)D1210 (CF 1 / CA 29Oa) ABFROM pCF1EF/C33cpcf1EF / C33c 6795167951 8797587975 HB101 (AB24/C100#3R)HB101 (AB24 / C100 # 3R) pCF1EF/C33fpcf1EF / C33f 6795567955 6797667976 pCF1 CD/33 gpCF1 CD / 33g 6795767957 1989 hinterlegt.Deposited in 1989. pCF1CD/C39cpCF1CD / C39c 6795967959 pCF1EF/C40bpcf1EF / C40B pCF1EF/CA167bpcf1EF / CA167b

Die folgenden Stämme wurden am 12. Mai 1989 hinterlegt: Stamm ATCC-Nr.The following strains were deposited on May 12, 1989: strain ATCC no.

Lambda gt 11 (C35)Lambda gt 11 (C35) 4060340603 Lambda gt 10 (beta-5 a)Lambda gt 10 (beta-5 a) 4060240602 D1210(C40b)D1210 (C40B) 6798067980 D1210IM16)D1210IM16) 6798167981

Nach Gewährung und Ausgabe dieser Anmeldung als Patent der Vereinigten Staaten werden alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit dieser hinterlegten Materialien unwiderruflich aufgehoben, und der Zugang zu den bezeichneten hinterlegten Materialien wird während des Abhängigseins der obengenannten Anmeldung demjenigen gestattet, der durch den Bevollmächtigten als dazu gemäß 37 CFR1.14 und 35 USC1.22 Berechtigten bestimmt wird. Außerdem werden die bezeichneten hinterlegten Materialien für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren, gerechnet vom Hinterlegungsdatum an, oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Nachfrage nach dem deponierten Material oder für die vollstreckbare Laufzeit des US-Patents erhalten, welcher (Zeitraum) auch immer der längere ist. Die hier genannten hinterlegten Materialien sind als Erleichterung gedacht und nicht erforderlich, um die Erfindung im Hinblick auf die hier gegebenen Beschreibungen in die Praxis umzusetzen, und ferner werden diese Materialien hier durch Bezugnahme einbezogen.Upon granting and issuance of this United States Patent Application, all restrictions on the availability of such deposited materials will be irrevocably lifted and access to the designated deposited materials will be permitted during the period of application of the above application to the one designated by the Agent as being required under 37 CFR1 .14 and 35 USC1.22 entitled. In addition, the designated deposited materials will be held for a period of thirty (30) years from the date of deposit, or for five (5) years after the last demand for the deposited material or for the enforceable duration of the US patent (period ) is always the longer one. The deposited materials referred to herein are intended as a relief and are not required to practice the invention in light of the descriptions herein, and further, these materials are incorporated herein by reference.

Technische AnwendbarkeitTechnical applicability

Die Erfindung mit ihren hier offenbarten verschiedenen Enthüllungen hat viele technische Anwendungen, u.a. die folgenden. Die HCV-cDNAs können verwendet werden, um Sonden für den Nachweis der HCV-Nucleinsäuren in Proben zu konstruieren. Die von den cDNAs abgeleiteten Sonden können verwendet werden, um HCV-Nucleinsäuren z. B. bei chemischen Synthesen nachzuweisen. Sie können auch verwendet werden bei Screening-Programmen auf antivirale Agenzien, um die Wirkung der Agenzien bei der Inhibierung der Virusreplikation in Zellkultursystemen und animalen Modellsystemen zu bestimmen. Die HCV-Polynucleotidsonden sind ferner beim Nachweis von viralen Nucleinsäuren beim Menschen von Nutzen und können somit als Grundlage für die Diagnose von HCV-lnfektionen beim Menschen dienen. Außerdem liefern die hier verfügbar gemachten cDNAs Informationen und ein Mittel für die Synthese von Polypeptiden, die Epitope des HCV enthalten. Diese Polypeptide sind beim Nachweis von Antikörpern gegen HCV-Antigene brauchbar. Eine Reihe von Immunoassays auf HCV-lnfektion, die auf HCV-Epitope enthaltenden rekombinanten Polypeptiden beruht, wird beschrieben und findet wirtschaftliche Anwendung bei der Diagnose von HCV-induzierter NANBH, beim Screenen von Blutspendern auf durch HCV verursachte infektiöse Hepatitis sowie zum Nachweis von verunreinigtem Blut von infektiösen Blutspendern. Die Virusantigene sind auch bei der Überwachung der Wirksamkeit von antiviralen Agenzien in animalen Modellsystemen von Nutzen. Ferner sind die von den hier offenbarten HCV-cDNAs abgeleiteten Polypeptide als Vakzine zur Behandlung von HCV-Infektio.en verwendbar.The invention with its various disclosures disclosed herein has many technical applications, i.a. the following. The HCV cDNAs can be used to construct probes for the detection of HCV nucleic acids in samples. The probes derived from the cDNAs can be used to detect HCV nucleic acids e.g. B. detect in chemical syntheses. They may also be used in antiviral agent screening programs to determine the effect of the agents in inhibiting virus replication in cell culture systems and animal model systems. The HCV polynucleotide probes are also useful in the detection of human viral nucleic acids and thus can serve as a basis for the diagnosis of HCV infections in humans. In addition, the cDNAs provided herein provide information and a means for the synthesis of polypeptides containing HCV epitopes. These polypeptides are useful in the detection of antibodies to HCV antigens. A number of immunoassays for HCV infection based on HCV epitope-containing recombinant polypeptides are described and find utility in the diagnosis of HCV-induced NANBH, in the screening of blood donors for HCV-induced infectious hepatitis and in the detection of contaminated blood of infectious blood donors. The virus antigens are also useful in monitoring the efficacy of antiviral agents in animal model systems. Further, the polypeptides derived from the HCV cDNAs disclosed herein are useful as vaccines for the treatment of HCV infections.

Die von den HCV-cDNAs abgeleiteten Polypeptide sind, abgesehen von den oben genannten Anwendungen, auch die für Bildung von Anti-HCV-Antikörpern von Nutzen. So können sie in Anti-HCV-Vakzinen verwendet werden. Die im Ergebnis einer Immunisierung mit den HCV-Polypeptiden produzierten Antikörper sind jedoch auch beim Nachweis der Präsenz von Virusantigenen in Proben brauchbar. So können sie verwendet werden, um die Produktion von HCV-Polypeptiden in chemischen Systemen zu testen. Die Anti-HCV-Antikörper können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit der antiviralen Agenzien beiApart from the above-mentioned applications, the polypeptides derived from the HCV cDNAs are also useful for the production of anti-HCV antibodies. So they can be used in anti-HCV vaccines. However, the antibodies produced as a result of immunization with the HCV polypeptides are also useful in detecting the presence of viral antigens in samples. Thus, they can be used to test the production of HCV polypeptides in chemical systems. The anti-HCV antibodies can also be used to increase the effectiveness of the antiviral agents

Screening-Programmen zu überwachen, bei denen diese Agenzien in Gewebekultursystemen getestet werden. Sie können ferner zur passiven Immunotherapie und zur Diagnose von durch HCV verursachter NANBH verwendet werden, indem sie den Nachweis des/der viralen Antigens/Antigene bei Blutspender und -empfängern gestatten. Eine andere wichtige Anwendung für die Anti-HCV-Antikörper liegt in der Affinitätschromatographie für die Reinigung des Virus und der viralen Polypeptide. Die Präparate des gereinigten Virus und viralen Polypeptids können in Vakzinen verwendet werden. Das gereinigte Virus kann jedoch auch von Nutzen sein für die Entwicklung von Zellkultursystemen, in denen das HCV repliziert. „Anti-sense"-Polynucleotide können als Inhibitoren der Virusreplikation verwendet werden.Monitor screening programs testing these agents in tissue culture systems. They may also be used for passive immunotherapy and for the diagnosis of NANBH caused by HCV, by allowing detection of the viral antigen (s) in blood donors and recipients. Another important application for the anti-HCV antibodies is in affinity chromatography for the purification of the virus and viral polypeptides. The preparations of the purified virus and viral polypeptide can be used in vaccines. However, the purified virus may also be useful for the development of cell culture systems in which the HCV replicates. Anti-sense polynucleotides can be used as inhibitors of viral replication.

Sowohl die natürlichen als auch die rekombinanten Anti-HCV-Antikörper und HCV-Polypeptide können zweckmäßig in Kits verpackt werden.Both the natural and the recombinant anti-HCV antibodies and HCV polypeptides may conveniently be packaged in kits.

Claims (34)

1. Rekombinantes Polynucleotid, das eine von HCV-cDNA abgeleitete Sequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist oder daß die HCV-cDNA von einer durdi die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.1. Recombinant polynucleotide containing a HCV cDNA-derived sequence, characterized in that the HCV cDNA in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167 b or clone pi 14a or clone CA216a or Clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, or that the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17. 2. Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Epitop des HCV codiert.2. Recombinant polynucleotide according to claim 1, characterized in that it encodes an epitope of HCV. 3. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder An ;pruch 2 umfaßt.3. Recombinant vector, characterized in that it comprises the polynucleotide according to claim 1 or claim 2. 4. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem Vektor nach Anspruch 3 transformiert ist.4. host cell, characterized in that it is transformed with the vector according to claim 3. 5. Rekombinantes Expressionssystem, das ein offenes Leseraster (ORF) der von dem rekombinanten Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 abgeleiteten DNA enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das ORF an eine Kontrollsequenz, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist, operabel gebunden ist.A recombinant expression system containing an open reading frame (ORF) of the DNA derived from the recombinant polynucleotide of claim 1 or claim 2, characterized in that the ORF is operably linked to a control sequence that is compatible with the desired host. 6. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem rekombinanten Expressionssystem nach Anspruch 5 transformiert ist.6. cell, characterized in that it is transformed with the recombinant expression system according to claim 5. 7. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die Zelle nach Anspruch 6 produziert ist.7. polypeptide, characterized in that it is produced by the cell according to claim 6. 8. Gereinigtes Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.8. A purified polypeptide containing an epitope encoded in HCV cDNA, characterized in that the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG. 9. Immunogenes Polypeptid, das durch eine mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierte Zelle produziert ist, der ein ORF einer von HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA aus einer von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13 i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40 b oder Klon 33 b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon S3f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleiteten Sequenz besteht und daß das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist.An immunogenic polypeptide produced by a cell transformed with a recombinant expression vector containing an ORF of HCV cDNA-derived DNA, characterized in that the HCV cDNA is selected from one of the HCV cDNA sequence in clone CA279a or Clone CA74a or clone 13i or clone CA290a or clone 33c or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone S3f or clone 33g or clone 39c or clone 15e, and that the ORF is operable a control sequence is compatible with the desired host. 10. Peptid, das ein HCV-Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid die Formel10. A peptide containing an HCV epitope, characterized in that the peptide has the formula /Λ/Λ y"™ΛΛΛΛ y/ Λ / Λ y "™ ΛΛΛΛ y hat, in der χ und y in Fig. 17 angegebene Aminosäurenummern bedeuten, und daß das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:has, in the χ and y in Fig. 17 indicated amino acid numbers, and that the peptide is selected from the group consisting of: AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA 45-AA 65, AA65-AA75, AA80-90, AA99-AA120, AA95-AA110,AA105-AA120,AA100-AA150,AA150-AA200,AA155-AA170,AA190-AA210,AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250-AA300, AA290-AA330, AA290-AA305, AA300-AA 350, AA 310-AA 330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA 405-AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, AA440-AA460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500-AA550, AA511-AA690, AA515-AA550, AA550-AA600, AA550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650, AA600-AA625, AA635-AA665, AA650-AA700, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725-AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA800-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, ΑΛ920-AA 990, AA850-AA900, AA920-AA945, AA940-AA965, AA970-AA990, AA950-AA1000, AA1000-AA1060, AA1000-AA1025, AA1000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075-AA1175, AA1050-AA1200, AA1070-AA1100, AA1100-AA1130, AA1140-AA116f>, AA1192-AA1457, AA1195-AA1250, AA1200-AA1225, AA1225-AA1250, AA1250-AA1300 AA1260-AA1310, AA1 260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1310, AA1310-AA1340, AA1345-AA1405, AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA13'.5-AA1380, AA1380-AA1405, AA1400-AA1450, AA1450-AA1500, AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1 500-AA1550, AA1500-AA1515, AA1515-AA1 550, AA1550-AA1600, AA1 545-AA1560, AA1 569-AA1931, AA1 570-AA1590, AA1595-AA1 610, AA1 590-AA1650, AA1610-AA1645, AA1 650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745-AA1770, AA175Γ-ΑΑ1800, AA1775-AA'i 810,AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA45-AA65, AA65-AA75, AA80-90, AA99-AA120, AA95-AA110, AA105-AA120, AA100-AA150, AA150-AA200, AA155-AA170, AA190-AA210, AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250-AA300, AA290- AA330, AA290-AA305, AA300-AA 350, AA 310-AA 330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA405-AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, AA440-AA460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500-AA550, AA511-AA690, AA515-AA550, AA550-AA600, AA550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650, AA600 AA625, AA635-AA665, AA650-AA700, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725-AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA800-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, AA920-AA950, AA850-AA965, AA920-AA990, AA950-AA965, AA970-AA990, AA950-AA1000, AA1000-AA1060, AA1000-AA1025, AA1000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075 -AA1175, AA1050-AA1200, AA1070-AA1100, AA1100-AA1130, AA1140-AA11 6f>, AA1192-AA1457, AA1195-AA1250, AA1200-AA1225, AA1225-AA1250, AA1250-AA1300 AA1260-AA1310, AA1 260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1310, AA1310-AA1340, AA1345-AA1405 , AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA13'.5-AA1380, AA1380-AA1405, AA1400-AA1450, AA1450-AA1500, AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1 500-AA1550, AA1500-AA1515, AA1515 -AA1 550, AA1550-AA1600, AA1 545-AA1560, AA1 569-AA1931, AA1 570-AA1590, AA1595-AA1 610, AA1 590-AA1650, AA1610-AA1645, AA1 650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745-AA1770, AA175Γ-ΑΑ1800, AA1775-AA'i 810, AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920, AA1916-AA2021, AA192O-AA1940, AA1 949-AA2124, AA1950-AA2000, AAI9I0-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000-AA2050, AA2005-AA2025, AA2020-AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA 2 054-AA 2 223, AA 2 070-AA 2100, AA 2100-AA 2150, AA 2150-AA 2 200, AA 2 200-AA 2 250, AA2200-AA2325, AA2250-AA2330, AA2255-AA2270, AA2265-AA2280, AA2280-AA2290, AA2287-AA2385, AA2300-AA2350, AA2290-AA2310, AA2310-AA2330, AA2330-AA2350, AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA2345-AA2375, AA2370-AA2410, AA2371-AA2502,AA2400-AA2450,AA2400-AA2425,AA2415-AA2450,AA2445-AA2500, AA 2 445-AA 2 475, AA 2 470-AA 2 490, AA 2 500-AA 2 550, AA 2 505-AA 2 540, AA 2 535-AA 2 560, AA 2 550-AA 2 600, AA 2 560-AA 2 580, AA 2 600-AA 2 650, AA 2 605-AA 2 620, AA 2 620-AA 2 650, AA2640-AA2660, AA2650-AA2700, AA2655-AA2670, AA2670-AA2700, AA2700-AA275O, AA2740-AA2760, AA2750-AA2800, AA2755-AA2780, AA2780-AA2830, AA2785-AA2810, AA2796-AA2886, AA2810-AA2825, AA2800-AA2850, AA 2 850-AA 2 900, AA 2 850-AA 2 865, AA2885-AA2905, AA2900-AA2950, AA2910-AA2930, AA2925-AA2950, AA2945-end (C-terminal). AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920, AA1916-AA2021, AA192O-AA1940, AA1 949-AA2124, AA1950-AA2000, AAI9I0-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000-AA2050, AA2005-AA2025, AA2020 -AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA 2 054-AA 2 223, AA 2 070-AA 2100, AA 2100-AA 2150, AA 2150-AA 2 200, AA 2 200-AA 2 250, AA2200-AA2325 , AA2250-AA2330, AA2255-AA2270, AA2265-AA2280, AA2280-AA2290, AA2287-AA2385, AA2300-AA2350, AA2290-AA2310, AA2310-AA2330, AA2330-AA2350, AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA2345 -AA2375, AA2370-AA2410, AA2371-AA2502, AA2400-AA2450, AA2400-AA2425, AA2415-AA2450, AA2445-AA2500, AA 2 445-AA 2 475, AA 2 470-AA 2 490, AA 2 500-AA 2 550 , AA 2 505-AA 2 540, AA 2 535-AA 2 560, AA 2 550-AA 2 600, AA 2 560-AA 2 580, AA 2 600-AA 2 650, AA 2 605-AA 2 620, AA 2 620-AA 2 650-AA2700, AA2655-AA2670, AA2670-AA2700, AA2700-AA275O, AA2740-AA2760, AA2750-AA2800, AA2755-AA2780, AA2780-AA2830, AA2785-AA2810, AA2796-AA2886 , AA2810-AA2825, AA2800-AA2850, AA 2,850-AA 2,900, AA 2,850-AA 2,865, AA2885-AA2905, AA2900-AA2950, AA2910-AA2930, AA2925-AA2950, AA2945-end (C-terminal). 11. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Peptid nach Anspruch 10 besteht.11. Polypeptide, characterized in that it consists of the peptide according to claim 10. 12. Immunogenes Polypeptid, das an ein festes Substrat gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid einem der Ansprüche 7 oder 8 oder 9 oder 10 oder 11 entspricht oder daß das Polypeptid auu einem in HCV-cDNA codierten Epitop besteht, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.12. An immunogenic polypeptide bound to a solid substrate, characterized in that the polypeptide corresponds to one of claims 7 or 8 or 9 or 10 or 11 or that the polypeptide consists of an epitope encoded in HCV cDNA, the HCV cDNA being cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG. 13. Monoklonaler Antikörper, der gegen ein in HCV-cDNA codiertes Epitop gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8886 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 131 oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167b oder Klon pi 14 oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 20Ba oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.A monoclonal antibody directed against an epitope encoded in HCV cDNA, characterized in that the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8886 in Figure 17, or that in clone 131 or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi 14 or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 20Ba or clone 18g or clone 16jh. 14. Präparat von gereinigten polyklonalen Antikörpern, die gegen ein Polypeptid gerichtet sind, das aus einem in der HCV-cDNA codierten Epitop besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 h oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.14. A preparation of purified polyclonal antibodies directed against a polypeptide consisting of an epitope encoded in the HCV cDNA, characterized in that the HCV cDNA is selected from a polypeptide represented by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG 17 or clone 167h or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh is. 15. Polynucleotidsonde für das HCV, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde aus einer von einer HCV-cDNA-Sequenz, die durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder8659 bis8866 in Fig. angegeben ist, oder von dem Komplement der HCV-cDNA-Sequenz abgeleiteten HCV-Sequenz besteht.A polynucleotide probe for HCV, characterized in that the probe is derived from any of a HCV cDNA sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Fig. 1 or the complement of the HCV cDNA sequence HCV sequence exists. 16. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart von Polynucleotiden aus dem HCV, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Polynucleotidsonde umfaßt, die eine Nucleotidsequenz von etwa 8 oder mehr Nucleotiden enthält, wobei die Nucleotidsequenz von der HCV-cDNA abgeleitet ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei die Polynucleotidsonde in einem geeigneten Container enthalten ist.A kit for the analysis of samples for the presence of polynucleotides from the HCV, characterized in that it comprises a polynucleotide probe containing a nucleotide sequence of about 8 or more nucleotides, the nucleotide sequence being derived from the HCV cDNA derived from a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Fig. 17, wherein the polynucleotide probe is contained in a suitable container. 17. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart einos HCV-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Antikörper enthält, der immunologisch mit einem HCV-Antigen reagiert, wobei das Antigen ein Epitcp enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, oder wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist.A kit for the analysis of samples for the presence of an HCV antigen, characterized in that it contains an antibody that immunologically reacts with an HCV antigen, said antigen containing an epitope encoded in HCV cDNA, which from a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17, or wherein the HCV cDNA is present in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh. 18. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß er ein antigenes Polypeptid umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8366 in Fig. 17 angegebener) Sequenz ist oder in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167boderKlon pi14aoderKlon CA 290 a oder Klon ag30aoderKlon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist.A kit for the analysis of samples for the presence of an HCV antibody, characterized in that it comprises an antigenic polypeptide containing an HCV epitope encoded in HCV cDNA, which may be replaced by a nucleotide number from -319 to 1348 or 8659-8366 in FIG. 17) or is present in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi14a or clone CA 290 a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh. 19. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikö rpers, dadurch gekennzeichnet, daß er ein antigenes Polypeptid umfaßt, das von HCV-cDNA in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13ioderKlon CA290a oder Klon 33CoderKlon 40boderKlon 33boderKlon 25coder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 39 coder Klon 15eexprimiert wurde, wobei das antigene Polypeptid in einem geeigneten Container vorhanden ist.19. Kit for the analysis of samples for the presence of an HCV antibody, characterized in that it comprises an antigenic polypeptide derived from HCV cDNA in clone CA279a or clone CA74a or clone 13 or clone CA290a or clone 33C or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone 33f or clone 39 of clone 15e, the antigenic polypeptide being present in a suitable container. 20. Verfahren zum Nachweis von HCV-Nucleinsäuren in einer Probe, gekonnzeichnet durch:20. A method for detecting HCV nucleic acids in a sample, characterized by: (a) Reaktion der Nucleinsäuren der Probe mit einer Polynucleotidsonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenz besteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz von der durch die Nucleotidnummern - 319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz abgeleitet ist, und wobei die Reaktion, unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Polynucleotid-Duplax zwischen der Sonde und der HCV-Nucleinsäure aus der Probe gestatten,(a) Reaction of the nucleic acids of the sample with a polynucleotide probe for HCV, which probe consists of an HCV sequence derived from an HCV cDNA sequence from that indicated by nucleotide numbers - 319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG Derived sequence, and wherein the reaction is under conditions permitting the formation of a polynucleotide Duplax between the probe and the HCV nucleic acid from the sample, (b) Nachweis eines Polynucleotid-Duplex, der in Schritt (a) gebildet wurde und die Sonde enthält.(b) Detecting a polynucleotide duplex formed in step (a) and containing the probe. 21. Immunoassay zum Nachweis eines HCV-Antigens, gekennzeichnet durch:21. Immunoassay for detecting an HCV antigen, characterized by: (a) Inkubation einer Probe, die vermutlich ein HCV-Antigen enthält, mit einem gegen ein in HCV-cDNA codierten HCV-Epitop gerichteten Antikörper, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und(a) incubating a sample suspected of containing an HCV antigen with an antibody directed against an HCV cDNA-encoded HCV epitope, the HCV cDNA of which has been identified by a nucleotide number of -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG 17 or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh and wherein the incubation is under conditions permitting the formation of an antigen-antibody complex, and (b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und den Antikörper enthält.(b) detection of an antibody-antigen complex formed in step (a) and containing the antibody. 22. Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern, die gegen ein HCV-Antigen gerichtet sind, gekennzeichnet durch:22. An immunoassay for the detection of antibodies directed against an HCV antigen characterized by: (a) Inkubation einer Probe, die vermutlich Anti-HCV-Antikörper enthält, mit einem Antigen-Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz odor die in Klon 13ioderKlon 26joderKlon 59aoderKlon 84aoderKlon CA 156e oder Klon 167boder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und(a) incubating a sample suspected of containing anti-HCV antibody with an antigenic polypeptide containing an epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is from one of nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in sequence indicated in Figure 17 or the sequence present in clone 13 or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, and incubation under conditions takes place, which allow the formation of an antigen-antibody complex, and (b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und das Antigen-Polypeptid enthält.(b) detection of an antibody-antigen complex formed in step (a) and containing the antigen polypeptide. 23. Immunoassay zum Nachweis von gegen ein HCV-Antigen gerichteten Antikörpern, gekennzeichnet durch:23. Immunoassay for the detection of antibodies directed against an HCV antigen, characterized by: (a) Inkubation einer Probe, die vermutlich Anti-HCV-Antikörper enthält, mit einem Polypeptid nach Anspruch 9 unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und(a) incubating a sample suspected of containing anti-HCV antibodies with a polypeptide of claim 9 under conditions which permit the formation of an antigen-antibody complex, and (b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und das Antigenpolypeptid enthält.(b) detection of an antibody-antigen complex formed in step (a) containing the antigenic polypeptide. 24. Vakzin zur Behandlung einer HCV-lnfektion, das ein immunogenes Polypeptid umfaßt, das ein in HCV-cDNA codiertes HCV-Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und daß das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff vorliegt.A vaccine for treating HCV infection comprising an immunogenic polypeptide containing an HCV cDNA-encoded HCV epitope, characterized in that the HCV cDNA is selected from a nucleotide number of -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG 17 or is the sequence present in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh and that the immunogenic polypeptide is present in a pharmacologically effective dose in a pharmaceutically acceptable carrier. 25. Verfahren zur Produktion von Antikörpern gegen das HCV, dadurch gekennzeichnet, daß einem Individuum ein isoliertes immunogenes Polypeptid verabreicht wird, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40b oder Klon 33b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e vorhandene Sequenz ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff vorliegt.A method of producing antibodies to HCV, comprising administering to an individual an isolated immunogenic polypeptide containing an epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is one of nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 or clone CA279a or clone CA74a or clone 13i or clone CA290a or clone 33c or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone 33f or clone 33g or clone 39c or clone 15e is present, and wherein the immunogenic polypeptide is present in a pharmacologically effective dose in a pharmaceutically acceptable carrier. 26. „Anti-sense"-Polynucleotid, das von HCV-cDNA abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA die in Fig. 17 dargestellte ist.26. An anti-sense polynucleotide derived from HCV cDNA, characterized in that the HCV cDNA is that shown in FIG. 27. Verfahren zur Herstellung des gereinigten Fusionspolypeptide C100-3, gekennzeichnet durch:27. A process for the preparation of the purified fusion polypeptides C100-3, characterized by: (a) Bereitstellung eines rohen Zell-Lysats, das das Polypeptid C100-3 enthält,(a) providing a crude cell lysate containing the polypeptide C100-3, (b) Behandlung des rohen Zell-Lysats mit einer solchen Acetonmenge, die das Polypeptid ausfällt,(b) treating the crude cell lysate with an amount of acetone which precipitates the polypeptide, (c) Isolieren und Löslichmachen des gefällten Materials,(c) isolating and solubilizing the precipitated material, (d)' Isolieren des Polypeptids C100-3 durch Anionenaustauschchromatographie, und (e) weitere Isolierung des Polypeptids C100-3 aL3 Schritt (d) durch Gelfiltration.(d) 'isolating the polypeptide C100-3 by anion exchange chromatography, and (e) further isolating the polypeptide C100-3 aL3 step (d) by gel filtration. 28. Verfahren zur Herstellung eines HCV-Polypeptids, gekennzeichnet durch:28. A method of producing a HCV polypeptide characterized by: (a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionssystem transformiert ist, das ein offenes Leseraster (ORF) der von der HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216aodbi Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit einem erwünschten Wirt verträglich ist, und(a) providing a host cell transformed with a recombinant expression system containing an open reading frame (ORF) of the HCV cDNA-derived DNA, the HCV cDNA in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or Clone CA156e or clone 167b or clone pi 14a or clone CA216aodbi clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, or wherein the HCV cDNA is of one of nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG. 17, wherein the ORF is operably linked to a control sequence that is compatible with a desired host, and (b) Inkubation der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des HCV-Polypeptids gestatten.(b) incubating the host cell under conditions permitting expression of the HCV polypeptide. 29. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen HCV-Polypeptids, gekennzeichnet durch:29. A method of producing an immunogenic HCV polypeptide characterized by: (a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist, der ein ORF der von der HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, wobei die HCV-cDNA aus einer Sequenz besteht, die von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40b oder Klon 33b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleitet ist, wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist, und(a) providing a host cell transformed with a recombinant expression vector containing an ORF of the DNA derived from the HCV cDNA, the HCV cDNA consisting of a sequence derived from the HCV cDNA sequence in clone CA279a or Clone CA74a or clone 13i or clone CA290a or clone 33c or clone 40b or clone 33b or clone 25c or clone 14c or clone 8f or clone 33f or clone 33g or clone 39c or clone 15e, wherein the ORF is operably linked to a control sequence which is compatible with the desired host, and (b) Inkubation der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des HCV-Polypeptids gestatten.(b) incubating the host cell under conditions permitting expression of the HCV polypeptide. 30. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Polynucleotid transformiert ist, das eine Sequenz von HCV-cDNA umfaßt, die von der HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh abgeleitet ist, oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, gekennzeichnet durch:30. A method of producing a host cell transformed with a recombinant polynucleotide comprising a sequence of HCV cDNA derived from the HCV cDNA in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA 156e or clone 167 b or clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, or wherein the HCV cDNA is from one indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG Sequence is characterized by: (a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die zur Transformation in der Lage ist,(a) providing a host cell capable of transformation (b) Bereitstellung des rekombinanten Polynucleotide, und(b) providing the recombinant polynucleotides, and (c) Inkubation von (a) mit (b) unter Bedingungen, die die Transformation der Wirtszelle mit dem Polynucleotid gestatten.(c) incubating (a) with (b) under conditions permitting transformation of the host cell with the polynucleotide. 31. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polynucleotide, das aus einer Sequenz von HCV-cDNA besteht, die von der HCV-cDNA in Klon 13 i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh abgeleitet ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, gekennzeichnet durch:31. A method of producing a recombinant polynucleotide consisting of a sequence of HCV cDNA derived from the HCV cDNA in clone 13i or clone 26j or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167b or clone pi 14a or Clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh, wherein the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17, characterized by: (a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Polynucleotid transformiert ist, und(a) providing a host cell transformed with the recombinant polynucleotide, and (b) Isolierung des Polynucleotide aus der Wirtszelle.(b) Isolation of the polynucleotides from the host cell. 32. Verfahren zur Herstellung von HCV-freiem Blut, gekennzeichnet durch:32. A method for producing HCV-free blood characterized by: (a) Bereitstellung einer Blutprobe, die vermutlich HCV und Anti-HCV-Antikörper enthält,(a) providing a blood sample suspected of containing HCV and anti-HCV antibodies, (b) Bereitstellung eines immunogenen Polypeptids, dac nach Anspruch 28 oder 29 hergestellt wurde,(b) providing an immunogenic polypeptide prepared according to claim 28 or 29, (c) Inkubation der Probe von (a) mit dem immunogenen Polypeptid von (b) unter Bedingungen, die die Bildung von Antikörper- HCV-Polypeptid-Komplexen i;estatten,(c) incubating the sample of (a) with the immunogenic polypeptide of (b) under conditions which permit the formation of antibody-HCV polypeptide complexes; (d) Nachweis der in Schritt (c) gebildeten Komplexe, und(d) detecting the complexes formed in step (c), and (e) Aufbewahrung des Blutes, bei dem in (d) keine Komplexe nachgewiesen wurden.(e) storage of the blood in which no complexes have been detected in (d). 33. Verfahren zur Herstellung von HCV-freiem Blut, gekennzeichnet durch:33. A process for the production of HCV-free blood characterized by: (a) Bereitstellung von Nucleinsäuren aus einer Blutprobe, die vermutlich HCV-Polynucleotide enthält,(a) providing nucleic acids from a blood sample suspected of containing HCV polynucleotides, (b) Bereitstellung einer Sonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenz besteht, die von einer HCV-cDNA abgeleitet ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist,(b) providing a probe for HCV, the probe consisting of an HCV sequence derived from an HCV cDNA which is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in Figure 17, (c) Reaktion von (a) mit (b) unter Bedingungen, die die Bildung eines Polynucleotid-Duplexes zwischen der Sonde und der HCV-Nucleinsäi're aus der Probe gestatten,(c) reacting (a) with (b) under conditions permitting the formation of a polynucleotide duplex between the probe and the HCV nucleic acid from the sample, (d) Nachweis eines Polynucleotide, das in Schritt (c) gebildet wurde und die Sonde enthält, und(d) detecting a polynucleotide formed in step (c) containing the probe, and (e) Aufbewahrung des Blutes, bei dem in (d) keine Komplexe nachgewiesen wurden.(e) storage of the blood in which no complexes have been detected in (d). 34. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms, das monoklonal Anti-HCV-Anti1 örper produziert, gekennzeichnet durch:34. A process for preparing a hybridoma which produces monoclonal anti-HCV örper 1, characterized by: (a) Immunisieren eines Individuums mit einem immunogenen Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei es sich bei der HCV-cDNA um die in Klon 13 i oder Klon 26] oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b odör Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh handelt oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. angegebenen Sequenz ist, oder(a) immunizing an individual with an immunogenic polypeptide containing an epitope encoded in HCV cDNA, wherein the HCV cDNA is as described in clone 13i or clone 26] or clone 59a or clone 84a or clone CA156e or clone 167 b odor clone pi 14a or clone CA216a or clone CA290a or clone ag30a or clone 205a or clone 18g or clone 16jh or wherein the HCV cDNA is of a sequence indicated by nucleotide numbers -319 to 1348 or 8659 to 8866 in FIG , or (b) Immunisieren eines Individuums mit einem nach Anspruch 29 hergestellten immunogenen Polypeptid,(b) immunizing an individual with an immunogenic polypeptide prepared according to claim 29, (c) Immortalisierung Antikörper-produzierender Zellen aus dem immunisierten Individuum,(c) immortalization of antibody-producing cells from the immunized individual, (d) Selektion einer immortalen Zelle, die Antikörper produziert, die mit einem HCV-Epitop in dem immunogenen Polypeptid von (a) oder (b) reagieren, und (e) Vermehrung der immortalen Zelle.(d) selecting an immortal cell that produces antibodies that react with an HCV epitope in the immunogenic polypeptide of (a) or (b), and (e) propagating the immortal cell.
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