DD297190A5 - METHOD FOR THE ENZYMATIC PREPARATION OF INDOLPYRUVATE - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Indolpyruvat, einer Biochemikalie, die fuer Forschungen auf dem Gebiet des Tryptophanstoffwechsels und des Metabolismus anderer Indolverbindungen verwendet werden kann. Zur enzymatischen Herstellung der erfindungsgemaeszen Verbindung wird ein aufbereiteter Enzymrohextrakt aus der Hefe Candida maltosa (ZIMET HI 28) mit Tryptophanaminotransferase als dem wirksamen Enzym eingesetzt. Das waehrend der enzymatischen Umsetzung von Tryptophan mit 2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor und Pyridoxalphosphat als Coenzym gebildete Indolpyruvat wird durch Aufarbeitung mit verschiedenen Anreicherungs- und Reinigungsverfahren (Extraktion; Saeulenchromatographie; Umkristallisation) in reiner, kristalliner Form gewonnen.{Indolpyruvat; Biochemikalie; Candida maltosa (ZIMET HI 28); Tryptphanaminotransferase; Isolierung; Umkristallisation}The invention relates to a process for the enzymatic production of indolpyruvate, a biochemical which can be used for research in the field of tryptophan metabolism and the metabolism of other indole compounds. For the enzymatic preparation of the compound according to the invention, a processed enzyme crude extract from the yeast Candida maltosa (ZIMET HI 28) with tryptophanaminotransferase is used as the active enzyme. The indolpyruvate formed during the enzymatic reaction of tryptophan with 2-oxoglutarate as amino group acceptor and pyridoxal phosphate as coenzyme is obtained by working up with various enrichment and purification processes (extraction, column chromatography, recrystallization) in pure, crystalline form {indole pyruvate; biochemical; Candida maltosa (ZIMET HI 28); Tryptphanaminotransferase; Insulation; recrystallization}

Description

Preparation de» Enzym»Preparation DE »Enzyme» Zur Gewinnung des Enzyms Ti yptophanamlnotransferase wurde die Hofe Candida maltosa (ZIMET Hl 28) in einem flüssigenTo obtain the enzyme typtophanamlnotransferase, the farm Candida maltosa (ZIMET HI 28) was grown in a liquid Vollmedium mit 10g Glucose, 10g Pepton und 5g Hefeextrakt kultiviert. Nach 24 Stunden Wachstum bei 30⁰C in SchüttelkolbenComplete medium cultured with 10 g glucose, 10 g peptone and 5 g yeast extract. After 24 hours of growth at 30 ⁰ C in shake flasks

auf einer Schüttelmaschine wurden die Zellen aur.der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation(15Min.) bei 10000 χ gabgetrennt.on a shaking machine, the cells were separated from the culture broth by centrifugation (15 min.) at 100 ° C.

Für die Enzympräparation wurden die geernteten Zellen aus 16 Kolben vereinigt und mit 1 Oj inM Tris/HCI-Puffor (pH 8,5)For the preparation of the enzyme, the harvested cells were combined from 16 flasks and treated with 1 μl of tris / HCl-Puffor (pH 8.5).

gewaschen (suspendiert und erneut abzentrlfuglert) und nach Resuspenslon Im gleichen Puffer mittels einer X-Presse 2mal aufgebrochen.washed (suspended and again abzentrlfuglert) and after Resuspenslon broken in the same buffer by means of an X-press 2 times.

Alle weiteren Schritte zur Enzympräparation wurden bei 4⁰C durchgeführt. Das Homogenat wurde bei 20000 χ g 10 MinutenAll further steps for the enzyme preparation were carried out at 4 ^° C. The homogenate was at 20,000 g for 10 minutes

zentrifugiert und der Überstand bis zu einer Konzentration von 1,8M (40% Sättigung) mit festem (NHJ₂SO₄ versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung 10 Minuten bei 16000 χ g zentrifugiert, und zum Überstand wurde erneut Ammoniumsulfat bis zu einer Gesamtkonzentration von 3,15 M (70% Sättigung) zugesetzt.centrifuged and the supernatant was added to solid (NH ₂ SO ₄ ) to a concentration of 1.8M (40% saturation) After 30 minutes the solution was centrifuged for 10 minutes at 16000 g and the supernatant was again ammonium sulfate to a total concentration of 3.15M (70% saturation).

Nach weiteren 30 Minuten wurde abzentrifigiert und das erhaltene Sediment wurde in 10OmM Tris/HCI-Puffer, pH 8,5, der 40%After a further 30 minutes, the mixture was centrifuged off and the resulting sediment was poured into 10 mM Tris / HCl buffer, pH 8.5, containing 40%. Volumenanteil Glycerol enthielt, aufgenommen. Dieser Enzymrohextrakt konnte bei -2O⁰C mehrere Monate ohneVolume fraction contained glycerol. This enzyme crude extract could be at -2O ⁰ C for several months without Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.Loss of activity are kept. Protein·, Tryptophan· und EnzymaktivitatsbestlmmungProtein, Tryptophan and Enzyme Activity Assessment

Die Proteinbestimmung im Enzymrohextrakt erfolgte nach LOWRY et al. (J. Biol. Chem. 193,265-275,1951) mit Rinderserumalbumin als Standard. Die Tryptophankonzentration in den Ansätzen wurde nach einer Methode von MESSINEO und MUSARRA (Int. J. Biochem. 3,700-704,1972) mit Abänderungen nach BODE et al. (Cell. Mol. Biol. 26,615-620,1980) bestimmt.Protein determination in the crude enzyme extract was carried out according to LOWRY et al. (J. Biol. Chem. 193, 265-275, 1951) with bovine serum albumin as standard. The tryptophan concentration in the batches was determined by a method of MESSINEO and MUSARRA (Int J. Chemochem 3,700-704, 1972) with modifications according to BODE et al. (Cell Mol. Biol., 26, 615-620, 1980).

Das Standardreaktion&medium zur Bestimmung der Tryptophanaminotransferase-Aktivität enthielt nach entsprechenden Vorversuchen40MMolL-Tryptophan,80pMol2-Oxoglutarat,0,iMMolPyridoxalphospat, 100MolTris-HCI-Puffer(pH8,1)unddie notwendige Menge Enzymextrakt (2,5mg/ml Protein) in einem Endvolumen von 1 ml. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte durch Messer, des gebildeten Indolpyruvats (GORDON, S.A., PALEG, L.G.: Physiol. Plantarum 10,3&-47,1957). Zu diesem Zweck wurden dem Reaktionsmedium nach 2 Stunden Inkubation bei 37⁰C 1,5ml Salkowski-Reagenz (1 ml 0,5M FeCI₃ + 50ml Perchlorsäure, 35% Volumenanteil) zugesetzt. Proben mit einem zu hohen Gehalt an Indolpyruvat (mehr als 30OnMoI) mußten vor Zugabe des Reagenz entsprechend verdünnt werden. Die Messung erfolgte nach 30 Minuten bei 530 nm.The standard reaction & medium for assaying tryptophan aminotransferase activity contained, according to preliminary experiments, 40 mMol L-tryptophan, 80 Pmol 2-oxoglutarate, 0.1 mM MolPyridoxal phosphate, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1) and the necessary amount of enzyme extract (2.5 mg / ml protein) in a final volume of 1 The activity was determined by Messer, the indolpyruvate formed (GORDON, SA, PALEG, LG: Physiol Plantarum 10.3 & -47.1957). For this purpose, the reaction medium were taken at 2 hours incubation at 37 ⁰ C 1.5 ml Salkowski reagent (1 ml 0.5M FeCl ₃ + 50ml perchloric acid, 35% by volume) was added. Samples containing too much indole pyruvate (more than 30 oM mol) had to be diluted appropriately before adding the reagent. The measurement was carried out after 30 minutes at 530 nm.

Enzymatlsche Herstellung und Isolierung des IndolpyruvatsEnzyme derivatives Preparation and isolation of indole pyruvate

Für die enzymatische Herstellung des Indolpyruvats wurde ein Reaktionsansatz von 100 ml Gesamtvolumen verwendet, der entsprechend dem beschriebenen Standardreaktionsmedium zur Bestimmung der Enzymaktivität zusammengesetzt war (4OmM L-Typrophan, 8OmM 2-Oxoglutarat, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 10OmM Tris-HCI-Puffer, pH8,1,2,5mg/ml Protein). Nach 2stündiger Inkubation bei 37⁰C wurde das Reaktionsmedium mit konz. HCI auf pH 2 angesäuert und danach 20 Minuten bei 16000 χ g zentrifugiert. Der Überstand wurde 2mal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden bei 30⁰C eingeengt und der verbleibende Rückstand in 10ml Ethanol ,in diesem und in allen weiteren Schritten wurden Ethanol mit 50% Volumenanteil verwendet) aufgenommen. Diese Ethanol-Lösung wurde auf eine Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form) gegeben. Nach Waschen der Säule mit 30ml Ethanol wurde mit 200 ml eines Gradienten (0-0,5 M) Essigsäure in Ethanol eluiert. Es wurden Fraktionen von 6,6ml gesammelt. Die r-idktionen, die Indolpyruvat enthielten, wurden vereinigt, und bei 3O⁰C eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethanol aufgenommen, erneut eingeengt, und dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach Resuspenslon des verbleibenden Rückstandes in Ethanol und langsamer Evaporation der Ethanol-Lösung bildeten sich bräunliche Kristalle. Es wurden 590mg Indolpyruvat erhalten, was einer Ausbeute von 72% (Masseanteil) entspricht.For the enzymatic preparation of indolpyruvate, a reaction mixture of 100 ml total volume was used, which was composed according to the described standard reaction medium for determining the enzyme activity (4OmM L-Typrophan, 8OmM 2-oxoglutarate, 0.1 mM pyridoxal phosphate, 10OmM Tris-HCl buffer, pH8.1, 2, 5 mg / ml protein). After 2 hours of incubation at 37 ⁰ C, the reaction medium with conc. HCI acidified to pH 2 and then centrifuged for 20 minutes at 16000 g. The supernatant was extracted twice with ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts were concentrated at 30 ⁰ C and the remaining residue in 10 ml of ethanol, in this and in all other steps, ethanol were used with 50% by volume). This ethanol solution was added to a column (2 × 10 cm) of DEAE Sephadex A-25 (acetate form). After washing the column with 30 ml of ethanol, it was eluted with 200 ml of a gradient (0-0.5 M) of acetic acid in ethanol. Fractions of 6.6 ml were collected. The r-idktionen that Indolpyruvat were pooled, and concentrated at 3O ⁰ C. The residue was taken up in ethanol, reconcentrated, and this step was repeated once more. After Resuspenslon of the remaining residue in ethanol and slow evaporation of the ethanol solution, brownish crystals formed. 590 mg indole pyruvate was obtained, which corresponds to a yield of 72% (mass fraction).

Claims (4)

Verfahren zur aromatischen Herstellung von Indolpyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß L-Tryptophan mitProcess for the aromatic preparation of indole pyruvate, characterized in that L-tryptophan with 2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym und derTryptophanaminotransferase aus Candida maltose (ZIMET Hl 28) in einem gepufferten Reaktionsmedium umgesetzt und das gebildete Indolpyruvat durch Extraktion, Säulenchromatographie und mehrfache Umkristallisation in reiner, kristalliner Form gewonnen wird.2-Oxoglutarate as amino group acceptor using Pyridoxalphosphat as coenzyme and the Triptopanaminotransferase from Candida maltose (ZIMET Hl 28) reacted in a buffered reaction medium and the Indolpyruvat formed by extraction, column chromatography and repeated recrystallization in pure, crystalline form. Hierzu 4 Seiten ZeichnungenFor this 4 pages drawings Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Indolpyruvat Ist eine Biochemikalie, die In wissenschaftlichen Einrichtungen für Forschungsuntersuchungen zum Stoffwechsel der essentiellen Aminosäure Tryptophan und von dieser abgeleiteter wichtiger Verbindungen (Alkaloide, Phytohormone) eingesetzt wird.Indolpyruvate is a biochemical used in scientific research facilities for the metabolism of the essential amino acid tryptophan and its derived important compounds (alkaloids, phytohormones). Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art Indolpyruvat Ist ein-, Biochemikalie, die für wichtige l.aboruntersuchungen zum Stoffwechsel der Aminosäure Tryptophan und ande^rer bedeutsamer Indolverbindungen oft benötigt wird. Diese Biochemikalie wird bisher nur durch aufwendige chemische Synthese aus schwer zugänglichen Ausgangsstoffen hergestellt (SHAW, K. N. F., MC MILLAN, A., GUDMUNDSON, A. G., ARMSTRONG. M. D.: J. Organ. Chem. 23,1171-1178,1953; BENTLEY, J. A., FARRAR, K. R., KONSLEY, S., SMITH, G. F., TAYLOR, W. C: Biochem. J.64,44-49,1956). Patente, die sich auf die Herstellung von Indolpyruvat beziehen, wurden nicht gefunden. Die Biochemikalienfirma Fluka, die in ihrem Katalog 1990/91 Indolpyruvat anbietet, verweist indirekt auf die oben genannten Herstellungsmöglichkeiten (Beil 22, III/IV, 1128)Indolpyruvat is-a, biochemical, tryptophan and ande ^r for important l.aboruntersuchungen the metabolism of the amino acid it important indole compounds is often needed. This biochemical is hitherto produced only by complicated chemical synthesis from hard-to-reach starting materials (SHAW, KNF, MC MILLAN, A., GUDMUNDSON, AG, ARMSTRONG, MD: J. Organ. Chem., 23, 11171-1178, 1953, BENTLEY, JA , FARRAR, KR, KONSLEY, S., SMITH, GF, TAYLOR, W. C: Biochem J. 64, 44-49, 1956). Patents relating to the production of indole pyruvate have not been found. The biochemical company Fluka, which offers indole pyruvate in its catalog 1990/91, indirectly refers to the above mentioned production possibilities (Annex 22, III / IV, 1128) Ziel der ErfindungObject of the invention Es ist das Ziel der Erfindung, ein einfaches enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Indolpyruvat zu entwickeln, um diese Biochemikalie für analytische Untersuchungen zum Stoffwechsel der biotechnologisch bedeutsamen Aminosäure Tryptophan und für von dieser Aminosäure abgeleitete Verbindungen zu gewinnen.It is the object of the invention to develop a simple enzymatic process for the production of indole pyruvate in order to obtain this biochemical for analytical studies on the metabolism of the biotechnologically important amino acid tryptophan and for compounds derived from this amino acid. Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Aufgabe der Erfindung ist es, ein geeignetes enzymatisches Herstellungsverfahren zu entwickeln, um Indolpyruvat aus einfachen Ausgangsstoffen in wenigen Schritten zu produzieren. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem dafür als Enzym die Tryptophanaminotransferase aus der Hefe Candida maltose (ZIMET Hl 28) eingesetzt wird, die L-Tryptophan in einem geeigneten Reaktionsmedium zu Indolpyruvat umzusetzen vermag. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß mit einem aufbereiteten Enzymrohextrakt unter Zusatz von 2-Oxoglutarat und Pyrisoxalphosphat in einem gepufferten, flüssigem Medium aus L-Tryptophan Indolpyruvat gebildet und danach isoliert, gereinigt und kristallin gewonnen wird.The object of the invention is to develop a suitable enzymatic production process in order to produce indole pyruvate from simple starting materials in a few steps. According to the invention, the object is achieved by using the enzyme tryptophan aminotransferase from the yeast Candida maltose (ZIMET HI 28), which is capable of converting L-tryptophan to indole pyruvate in a suitable reaction medium. The inventive method is based on that indolpyruvate is formed with a prepared enzyme crude extract with the addition of 2-oxoglutarate and pyrisoxal phosphate in a buffered, liquid medium from L-tryptophan and then isolated, purified and recovered in crystalline form. Ausführungsbeispielembodiment Dio Erfindung ist dargelegt in den Figuren 1-4.The invention is set forth in FIGS. 1-4. Fig. 1: Zeitlicher Verlauf der enzymatischen Conversion (·) von L-Tryptophan (O) zu Indolpyruvat durch die AminotransferaseFig. 1: Time course of the enzymatic conversion (·) of L-tryptophan (O) to indole pyruvate by the aminotransferase vonCandia maltosa.
Fig. 2: Conversion (·) von L-Tryptophan zu Indolpyruvat (O) durch die Aminotransferase von Candida maltosa in AbhängigkeitfromCandia maltosa.
Fig. 2: Conversion (·) of L-tryptophan to indole pyruvate (O) by the aminotransferase of Candida maltosa in dependence von der Konzentration des 2-Oxoglutarats; Konzentration von L-Tryptophan: 8OmM; Pyridoxalphospat: 0,1 mM. Fig.from the concentration of 2-oxoglutarate; Concentration of L-tryptophan: 8OmM; Pyridoxalphospate: 0.1 mM. FIG. 3: Conversion (·) von L-Tryptophan zu Indolpyruvat (O) durch die Aminotransferase von C. maltosa in Abhängigkeit von3: Conversion (·) of L-tryptophan to indole pyruvate (O) by the aminotransferase of C. maltosa as a function of der L-Tryptophan-Konzentration; Konzentration von 2-Oxoglutarat: 8OmM; Pyridoxalphosphat: 0,1 mM. Fig.the L-tryptophan concentration; Concentration of 2-oxoglutarate: 8OmM; Pyridoxal phosphate: 0.1 mM. FIG. 4: Chromatographie von Indolpyruvat auf einer Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form).4: Chromatography of indole pyruvate on a 2x10 cm column of DEAE-Sephadex A-25 (acetate form). Das erfindungsgemäßo Verfahren zur Herstellung von Indolpyruvat beruht darauf, daß L-Tryptophan in einem gepufferten Medium mit 2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor und Pyridoxalphosphat als Coenzym enzymatisch umgesetzt und das gebildete Indolpyruvat aus dem Medium isoliert, gereinigt und in kristalliner Form gewonnen wird. In unserem Beispiel wird als Enzym die Tryptophanaminotransferase der Hefe Candida maltosa (ZIMET Hl 28) in Form eines aufbereiteten Rohextraktes für die katalytische Umsetzung verwendet.The erfindungsgemäo process for the preparation of indolpyruvate based on the fact that L-tryptophan is enzymatically reacted in a buffered medium with 2-oxoglutarate as Aminogruppenacceptor and pyridoxal phosphate as coenzyme and isolated Indolpyruvat from the medium, purified and recovered in crystalline form. In our example, the enzyme tryptophan aminotransferase of the yeast Candida maltosa (ZIMET HI 28) is used in the form of a processed crude extract for the catalytic conversion.