DD295871A5 - METHOD FOR MICROBIAL PRODUCTION OF CYCLOSPORINS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Cyclosporinen insbesondere von Cyclosporin A. Aufgrund der spezifischen immunsupressiven Wirkung des Peptidantibiotikums Cyclosporin A findet es in der Humanmedizin vor allem in der Transplantationschirurgie Anwendung. Durch Zusatz geringer Mengen grenzflaechenaktiver Substanzen werden Cyclosporinbildner, wie beispielsweise der an sich bekannte Produktionsstamm Tolypocladium inflatum GAMS, zu einer wesentlich gesteigerten Synthese des Antibiotikums befaehigt.{mikrobielles Verfahren; Peptidantibiotikum; Cyclosporin A; Detergenzien; Cyclosporinbildner; Tolypocladium inflatum}The invention relates to a process for the microbial production of cyclosporins, in particular cyclosporin A. Due to the specific immunosuppressive effect of the peptide antibiotic cyclosporin A, it is used in human medicine, especially in transplantation surgery. By adding small amounts of surface-active substances, cyclosporin formers, such as, for example, the production strain Tolypocladium inflatum GAMS, which is known per se, are capable of a significantly increased synthesis of the antibiotic {microbial process; Peptide antibiotic; Cyclosporin A; detergents; Cyclosporinbildner; Tolypocladium inflatum}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Cyclosporinen. Aus dieser Gruppe zyklischer Peptide hat insbesondere das Cyclosporin A aufgrund seiner vielgestaltigen Wirkungen auf biologische Systeme Bedeutung erlangt. Dazu gehören die entzündungshemmenden, immunsupressiven, antifungalen und antiparasitären Eigenschaften des Wirkstoffes. Die spezifische, immunsuppressive Wirkung von Cyclosporin A wird weltweit in der Transplantationschirurgie und bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen genutzt.The invention relates to a method for the microwave production of cyclosporines. From this group of cyclic peptides in particular cyclosporin A has gained importance because of its multiform effects on biological systems. These include the anti-inflammatory, immunosuppressant, antifungal and antiparasitic properties of the drug. The specific, immunosuppressive effect of cyclosporin A is used worldwide in transplantation surgery and in the treatment of autoimmune diseases.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die technische Gewinnung der Cyclosporine, welche aus 11 aliphatischen Aminosäuren aufgebaut sind, erfolgt in Submerskultur durch einen Pilz der Art Tolypocladium inflatum GAMS (CH-PS 603790). Als Hauptkomponente eines natürlichen Vorkommens verschiedener Cyclosporinverbindungen wird das Cyclosporin A mit einer Ausbeute von 150 bis 200mg Cyclosporin A pro Liter Kultursuspension gebildet (DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol. 3 [1976], 125-133). Der Wirkstoff verbleibt im Myzel und wird nur in sehr geringen Mengen im umgebenden Medium nachgewiesen.The technical production of cyclosporins, which are composed of 11 aliphatic amino acids, takes place in Submerskultur by a fungus of the species Tolypocladium inflatum GAMS (CH-PS 603790). Cyclosporin A is formed as the main component of a natural occurrence of various cyclosporin compounds with a yield of 150 to 200 mg cyclosporin A per liter of culture suspension (DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol.3 [1976], 125-133). The drug remains in the mycelium and is detected only in very small amounts in the surrounding medium.

In Untersuchungen zur gerichteten Biosynthese produzierte der Pilz unter Zuführung spezieller Aminosäuren (8 g/l) zu einem Minimalmedium maximal 396mg Cyclosporin A pro Liter (KOBEL und TRABER, Europ. J. Appl. Microbiol. 14 [1982], 237-240). Dieses Ergebnis hat jedoch aus ökonomischen Gründen für industrielle Fermentationen keine Bedeutung erlangt. Unabhängig vom Wirkstoff Cyclosporin A sind in der Patentliteratur Verfahren zur Steigerung von Biosynthesen mit Hilfe des Einsatzes von grenzflächenaktiven Stoffen (Detergenzien) beschrieben, wie zum Beispiel für die Aminosäuren L-Lysin und L-Isoleucin (JP-PS 102853), L-Arginin (JP-PS 081 241), L-Glutaminsäure (JP-PS 096882) und L-Prolin (JP-PS 074925). GRÄFEet al. (DD-PS 231084) konnten in ähnlicher Weise durch Zusatz von Methanol zum Kulturmedium eine erhöhte Biosyntheserate für das Antibiotikum Griseochelin belegen.In targeted biosynthesis studies, the fungus produced a maximum of 396 mg cyclosporin A per liter (KOBEL and TRABER, Europ. J. Appl. Microbiol., 14, 1982, 237-240), supplying specific amino acids (8 g / L) to a minimal medium. However, this result has not gained importance for industrial fermentations for economic reasons. Regardless of the active substance cyclosporin A, the patent literature describes methods for increasing biosyntheses by the use of surfactants (detergents), for example for the amino acids L-lysine and L-isoleucine (JP-PS 102853), L-arginine (US Pat. JP-PS 081 241), L-glutamic acid (JP-PS 096882) and L-proline (JP-PS 074925). GRÄFE et al. (DD-PS 231084) could prove in a similar manner by adding methanol to the culture medium an increased rate of biosynthesis of the antibiotic griseochelin.

Während für alle genannten Verfahren ausschließlich Bakterien als Stoffproduzenten genutzt werden, konnten DESAI et al. (J. Ferment. Technol. 64, 6 [1986], 499-501) am Beispiel der Pilzgattung Claviceps durch exogene Zuführung bestimmter Detergenzien eine erhöhte Ausbeute für die Stoffgruppe der Mutterkornalkaloide erreichen, indem sowohl die Biomasseproduktion als auch die Ausschüttung der Metabolite ins Medium verbessert wurden.While only bacteria are used as pulp producers for all these processes, DESAI et al. (J. Ferment, Technol., 64, 6 [1986], 499-501) using the example of the fungus genus Claviceps by exogenous supply of certain detergents achieve an increased yield for the substance group of ergot alkaloids by both the biomass production and the release of the metabolites into the medium were improved.

Andererseits wird auch eine für Pilze auffallend wachstumshemmende Eigenschaft von grenzflächenaktiven Stoffen erwähnt (MADELIN, J. Appl. Bacteriol. 63 [1987], 47-52), die bis zur totalen Unterdrückung führen können.On the other hand, mention is also made of a fungus-striking growth-inhibiting property of surfactants (MADELIN, J. Appl. Bacteriol 63 [1987], 47-52), which can lead to total suppression.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, in einem bekannten Verfahren der Herstellung von Cyclosporin A die Produktivität des Mikroorganismus wesentlich zu steigern und damit die Voraussetzung für eine ökonomisch günstigere Produktion des Wirkstoffes zu schaffen.The aim of the invention is to substantially increase the productivity of the microorganism in a known process of the preparation of cyclosporin A and thus to create the conditions for an economically favorable production of the active ingredient.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein industriell anwendbares Verfahren zu beschreiben, das es gestattet, die biologische Ausbeute des Wirkstoffes Cyclosporin A in einem bekannten mikrobiologischen Verfahren wesentlich zu steigern. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man einen cyclosporinbildenden Stamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert, jedoch der Kultur eine grenzflächenaktive Substanz (Detergens) zusetzt. Als Detergenzien sind hierbei folgende Stoffe bevorzugt: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Ν,Ν-Diaethylacetamid und N-methyl-2-pyrrolidon.The invention has for its object to describe an industrially applicable method that allows to significantly increase the biological yield of the drug cyclosporin A in a known microbiological process. According to the invention the object is achieved by culturing a cyclosporin-forming strain in a conventional manner submerged, but the culture a surface-active substance (detergent) added. As detergents in this case the following substances are preferred: dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol, Ν, Ν-Diaethylacetamid and N-methyl-2-pyrrolidone.

Als cyclosporinbildender Stamm kann beispielsweise der Mikroorganismus Tolypocladium inflatum GAMS eingesetzt werden, der beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena unter der Stammsammlungs-Nr. IMET 43889 hinterlegt wurde. Dabei bewirkt der Zusatz des Deterdens nicht etwa, wie zu erwarten war, eine erhöhte Ausschüttung des Cyclosporins aus dem Myzel in die Kulturlösung, sondern überraschenderweise eine drastische Erhöhung der Biosynthese von Cyclosporin A bei konstanter Biomasseproduktion.As a cyclosporin-forming strain, for example, the microorganism Tolypocladium inflatum GAMS can be used, which at the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy Jena under the strain collection no. IMET 43889 was deposited. The addition of the detergent does not cause, as was to be expected, an increased release of cyclosporin from the mycelium into the culture solution, but, surprisingly, a drastic increase in the biosynthesis of cyclosporin A with constant biomass production.

Eine möglicherweise verbesserte Extrahierbarkeit des Wirkstoffes vor der quantitativen Bestimmung konnte als Ursache durch parallele Untersuchung ausgeschlossen werden.A possibly improved extractability of the active substance before the quantitative determination could be excluded as cause by parallel investigation.

Die Kultivierung des Stammes Tolypocladium inflatum GAMS und seiner Mutante IMET 43889 wird wie folgt vorgenommen: The cultivation of the strain Tolypocladium inflatum GAMS and its mutant IMET 43889 is carried out as follows :

Auf geeigneten Agarmedien wird der Stamm innerhalb eines Zeitraumes von 10 bis 14 Tagen bei einer Temperatur von 24⁰C angezogen. Die von dieser Kultur gebildeten Sporen werden in ein flüssiges und steriles Medium übertragen, welches in Glaskolben maximal 18 Tage, vorzugsweise 12 bis 15 Tage geschüttelt wird.On suitable agar media, the strain is grown at a temperature of 24 ^° C. over a period of 10 to 14 days. The spores formed by this culture are transferred into a liquid and sterile medium, which is shaken in glass flasks for a maximum of 18 days, preferably 12 to 15 days.

Das Nährmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie verschiedenen Mineralsalzen. Als Kohlenstoffquellen können vor allem Maltose, Saccharose oder Glukose eingesetzt werden; als Stickstoffquelle eignen sich besonders komplexe Substrate wie zum Beispiel Peptone.The nutrient medium consists of a carbon and nitrogen source and various mineral salts. As carbon sources, especially maltose, sucrose or glucose can be used; Particularly suitable nitrogen sources are complex substrates such as peptones.

Die Zugabe der verschiedenen, jeweils vorher sterilisierten Detergenzien erfolgt zu Beginn der Hauptkultur.The addition of the different, previously sterilized detergents takes place at the beginning of the main culture.

Nach Beendigung der Fermentation erfolgt die Extraktion der Cyclosporine aus der Kultursuspension mit allgemein üblichen Methoden. Die exakte qualitative und quantitative Bestimmung wird chromatografisch (HPLC) gegen Standardsubstanz in Anlehnung an die Publikation von KREUZIG (J. Chromatography 290,1984,181-186) durchgeführt.After completion of the fermentation, the extraction of the cyclosporins from the culture suspension is carried out by commonly used methods. The exact qualitative and quantitative determination is carried out by chromatography (HPLC) against standard substance on the basis of the publication by KREUZIG (J. Chromatography 290, 1984, 181-186).

Ausführungsbeispielembodiment

500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben enthalten je 100ml Nährmedium mit folgender Zusammensetzung:500 ml Erlenmeyer wide-mouth flasks contain 100 ml of nutrient medium with the following composition:

75 g/l Maltose75 g / l maltose

25g/l Kaseinpepton25g / l casein peptone

1 g/l KH₂PO₄ 1 g / l KH ₂ PO ₄

2,5g/l KCL in entionisiertem Wasser, pH5,52.5 g / l KCL in deionized water, pH 5.5

Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension (1 · 10⁷ Sporen/ml) des Stammes Tolypocladium inflatum GAMS, Stamm IMET 43889, beimpft, welche mit steriler isotonischer Kochsalzlösung von einer 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes auf Malz-Agar hergestellt wird.Each flask is inoculated with a spore suspension (1 x 10 ⁷ spores / ml) of the strain Tolypocladium inflatum GAMS, strain IMET 43889, which is made with sterile isotonic saline from a 10 to 14 day old culture of the strain on malt agar.

Nach zweitägiger Bebrütung bei einer Temperatur von 24"C auf einer Schüttelmaschine mit einer Frequenz von 190U · min"' wird die Vorkultur in ein neues Medium gleicher Zusammensetzung im Verhältnis 1:10 überführt und unter gleichen Bedingungen wie die Vorkultur weiter kultiviert.After incubation for two days at a temperature of 24 ° C. on a shaking machine with a frequency of 190 rpm, the preculture is transferred to a new medium of the same composition in the ratio 1:10 and further cultivated under the same conditions as the preculture.

Vor Beimpfung der Hauptkultur wird eine vorher sterilisierte grenzflächenaktive Substanz (gemäß Tabelle 1) in einer Konzentration von 0,5% (v/v) zugegeben.Prior to inoculation of the major culture, a previously sterilized surfactant (according to Table 1) is added at a concentration of 0.5% (v / v).

Am 15. Kulturtag konnten bei Zusatz spezieller Detergenzien Ausbeutesteigerungen gegenüber der Kontrolle (Ohne Zugabe von grenzflächenaktiven Substanzen) um das 4-bis 5fache erzielt werden.On the 15th day of culture, increases in yield compared to the control (without addition of surface-active substances) by 4 to 5 times could be achieved with the addition of special detergents.

Tabelle 1 faßt die eingesetzten Detergenzien sowie die dadurch erzielten Steigerungen in der Ausbeute an Wirkstoff Cyclosporin A zusammen.Table 1 summarizes the detergents used and the resulting increases in the yield of drug cyclosporin A together.

Tabelle 1Table 1

Steigerung der Ausbeute an Cyclosporin A durch Zusatz von Detergenzien Detergens Cyclosporin AIncrease in the yield of cyclosporin A by addition of detergents Detergent Cyclosporin A

(mg pro I Kulturlösung)*¹ (mg per liter of culture solution) * ¹

Kontrolle (ohne Detergens) 131 (177)Control (without detergent) 131 (177)

Dimethylformamid 179(237)Dimethylformamide 179 (237)

Dimethylsulfoxid 185(266)Dimethylsulfoxide 185 (266)

1,2-Propandiol 198(270)1,2-Propanediol 198 (270)

N,N-Diaethylacetamid 383(399)N, N-dimethylacetamide 383 (399)

N-methyl-2-pyrrolidon 616(717) * Angaben sind Mittelwerte identischer Versuchsansätze, Wertein Klammern = höchste erreichte Ausbeute.N-methyl-2-pyrrolidone 616 (717) * Data are mean values of identical experimental batches, value in brackets = highest yield achieved.

Claims (3)

Patentanspruch:Claim: 1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Cyclosporinen durch Submerskultur eines cyclosporinbildenden Stammes, dadurch gekennzeichnet, daß der Kultur eine grenzflächenaktive Substanz (Detergens) zugegeben wird.1. A process for the microwave production of cyclosporins by Submerskultur a cyclosporin-forming strain, characterized in that the culture of a surfactant (detergent) is added. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den als Detergens die folgende Substanzen einzeln oder in Kombination miteinander einsetzt: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Ν,Ν-Diaethylacetamid, N-methyl-2-pyrrolidon.2. The method according to claim 1, characterized in that one uses the following substances as a detergent, individually or in combination: dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol, Ν, Ν-Diaethylacetamid, N-methyl-2-pyrrolidone. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als cyclosporinbildender Mikroorganismus der Stamm Tolypocladium inflatum GAMS, IMET-Nr. 43889, eingesetzt wird.3. The method according to claim 1, characterized in that as a cyclosporin-forming microorganism, the strain Tolypocladium inflatum GAMS, IMET no. 43889, is used.