DD295855A5 - PROCESS FOR PREPARING MARKED NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES AND OLIGONUCLEOTIDES USING FLUORESCENT COLORING MATERIALS - Google Patents

PROCESS FOR PREPARING MARKED NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES AND OLIGONUCLEOTIDES USING FLUORESCENT COLORING MATERIALS Download PDF

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DD295855A5
DD295855A5 DD32467288A DD32467288A DD295855A5 DD 295855 A5 DD295855 A5 DD 295855A5 DD 32467288 A DD32467288 A DD 32467288A DD 32467288 A DD32467288 A DD 32467288A DD 295855 A5 DD295855 A5 DD 295855A5
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oligonucleotides
nucleosides
fluorescein
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DD32467288A
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Manfred Palissa
Frank Schubert
Dieter Cech
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Fzb Biotechnik Gmbh,De
Humboldt-Universitaet Zu Berlin,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer einsetzbar sind. Erfindungsgemaesz werden die fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide durch Umsetzung herkoemmlich geschuetzter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide in aprotischen Loesungsmitteln wie Pyridin oder Acetonitril, mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein bzw. Fluorescein-O-hydroxyalkylethern mit einem Alkylspacer von 1 bis 6 Mehtylengruppen, und einem Dihalogen-tetraalkyldisiloxan als Linker hergestellt. Die Verbindung zwischen Fluoreszenzfarbstoff und Nucleosid, Nucleotid und Oligonucleotid erfolgt ueber eine substituierte Siloxanbruecke. Die markierten Stoffe sind mit ueblichen Techniken nachweisbar.{nichtradioaktive Markierung; Fluoreszenz; Nucleoside; Nucleotide; Oligonucleotide; Silyllinker; Festphasenmethode; Schutzgruppen; Fluorescein; Fluoresceinmethylester}The invention relates to a process for preparing labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides using fluorescent dyes which are useful in genetic engineering and molecular biology as probes and primers. According to the invention, the fluorescently labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides are prepared by reacting commercially protected nucleosides, nucleotides and oligonucleotides in aprotic solvents such as pyridine or acetonitrile with a fluorescent xanthene dye, preferably fluorescein or fluorescein O-hydroxyalkyl ethers having an alkyl spacer of from 1 to 6 methylene groups, and a dihalo-tetraalkyldisiloxane prepared as a linker. The connection between fluorescent dye and nucleoside, nucleotide and oligonucleotide is via a substituted siloxane bridge. The labeled substances can be detected by conventional techniques. {Nonradioactive labeling; Fluorescence; nucleosides; nucleotides; oligonucleotides; Silyllinker; Solid phase method; Protecting groups; fluorescein; Fluoresceinmethylester}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer einsetzbar sind.The invention relates to a process for preparing labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides using fluorescent dyes which are useful in genetic engineering and molecular biology as probes and primers.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Bisherige Verfahren zur chemischen nichtradioaktiven Markierung von Nucleosides Nucleotiden und Oligonucleotiden erfordern die Einführung spezieller Ankergruppen. Dies können Aminogruppen sein, die relativ aufwendig, entwedor in Form des 2',&'-Didesoxy-5'-aminothymidins (Smith, L.M.; Fung, S.; Hunkapiller, M.W.; Hunkapiller, T.J., und Hood, L.E.; Nucl. Acids Res. 13 [1985] 2399), verschiedener Alkylaminogruppen, die über eine Phosphorsaurediesterbindung (Tanaka, T.; Sakata,T.; Fujimoto, K., und Ikehara, M.; Nucl. Acids Res. 15 [1987] 6209) oder die heterocyclische Base (Sarfati, S. R.; Pochet, S.; Gureiro, C; Nansame, A.; Huynh-Dlnh,T., u.-\d Igolen, J.; Tetrahedron43 [1987] 3491); Prober,Ü.M.; Trainor,G.L.; Dans, R.L.; Hobbs, F. W.; Robertson, C. W.; Cagursky, R. J.; Cocuzza, A. J.; Jensen, M. Α.; Baumeister, K.; Science 238 [1987) 336) in das Oligonucleotid eingeführt werden und Sulfhydrylgruppen (DE-OS 3642939, Sproat, B.) sein.Previous methods for chemically non-radioactive labeling of nucleosides nucleotides and oligonucleotides require the introduction of specific anchor groups. These may be amino groups which are relatively expensive, either in the form of 2 ', &' - dideoxy-5'-aminothymidine (Smith, LM, Fung, S., Hunkapiller, MW, Hunkapiller, TJ, and Hood, LE, Nucl. Acids Res., 13 [1985], 2399), various alkylamino groups linked via a phosphoric acid diester bond (Tanaka, T. Sakata, T., Fujimoto, K., and Ikehara, M. Nucl. Acids Res. 15 [1987] 6209) or the heterocyclic base (Sarfati, SR; Pochet, S .; Gureiro, C; Nansame, A .; Huynh-Dlnh, T., u.-d Igolen, J .; Tetrahedron 43 [1987] 3491); Prober, asl .; Trainor, G.L .; Dans, R.L .; Hobbs, F.W .; Robertson, C.W .; Cagursky, R.J .; Cocuzza, A.J .; Jensen, M. Α .; Baumeister, K .; Science 238 [1987] 336) are introduced into the oligonucleotide and sulfhydryl groups (DE-OS 3642939, Sproat, B) be.

Nach vollständiger Abspaltung aller Schutzgruppen, wobei Sulfhydrylgruppen spezielle Abspaltungsbedingungen erfordern, werden die aufgereinigten Nucieinsäurederivate in einem zusätzlichen Reaktionsschrict mit einer aktivierten Spezies des Markers umgesetzt (beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat) und wiederum das Substrat vom Reagenz chromatographisch gereinigt.Upon complete removal of all protecting groups, with sulfhydryl groups requiring specific cleavage conditions, the purified nucleic acid derivatives are reacted in an additional reaction step with an activated species of the label (e.g., fluorescein isothiocyanate) and again the substrate is chromatographically purified from the reagent.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, Nucleoside, Nucleotide und Oligonucelotide mit geringem Arbeitsaufwand, ohne Nutzung von Ankergruppen, in guten Ausbeuten mit Fluophoron zu markieren.The object of the invention is to label nucleosides, nucleotides and oligonucelotides in good yields with fluophorone with little labor, without the use of anchor groups.

Darlogung des Wesens der ErfindungDarling of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung nichtn dioaktiv markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotido zu entwickeln, das die Einführung von Fluophoren auf einfachem Wege ohne Nutzung zusätzlicher Ankergruppen und spezieller Schutzgruppentechniken durch die Verwendung von Linkern gestattet. Erfindungsgemäß werden dio fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotido der allgemeinen Formel IThe invention has for its object to develop a method for the production of nichtn dioaktiv marked nucleosides, nucleotides and oligonucleotides, which allows the introduction of fluophors in a simple way without the use of additional anchor groups and special protection group techniques through the use of linkers. According to the invention, the fluorescence-labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides of the general formula I

1 ?3 S ß1? 3 S ß

FO-(X)n-O-Si-O-Si-FO- (X) n -O-Si-O-Si

s'- {R5°-V°N s ' - { R 5 ° -V ° N

R2 R 2

— Z-, R.O- Z-, RO

F = fluoreszierender Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein oder substituiertes Fluorescein,F = fluorescent xanthene dye, preferably fluorescein or substituted fluorescein,

Ri, Rj, Ra, R4 = Alkyl-, substituiertes Alkyl-, Aryl-, substituiertes Aryl-, Alkoxy-, substituiertes Alkoxy-, Aryloxy- bzw. substituiertes Aryloxy- und bei R5 = a, Re = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R8 = a, R5 = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat oder R5 = R6 — a sowieRi, Rj, Ra, R4 = alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, alkoxy, substituted alkoxy, aryloxy or substituted aryloxy and in R5 = a, Re = alkyl, aryl, Acyl, phosphate, substituted phosphate, phosphite, substituted phosphite, phosphonate, or when R 8 = a, R 5 = alkyl, aryl, acyl, phosphate, substituted phosphate, phosphite, substituted phosphite, phosphonate or R 5 = R6 - a as well

B = Heterocyclus mit einem 1"1UNn- bzw. Pyrimidingrundkörper ist, durch Umsetzung herkömmlich geschützter Nucleoside, Nucleotide oder Oligonucleotide der allgemeinen Formel Il mit der für Rs und R3 genannten Bedeutung,B is heterocycle having a 1 " 1 UNn or pyrimidine skeleton, by reacting conventionally protected nucleosides, nucleotides or oligonucleotides of the general formula II with the meaning given for Rs and R3,

(R5)HO(R 5) HO

(H)IU) b(H) IU) b

in einem aprotischen Lösungsmittel mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein bzw. substituiertes Fluorescein und einem Dihalogendisiloxan als Linker hergestellt, das Reaktionsgemisch nach üblichen Methoden aufgearbeitet und gereinigt sowie die vorhandenen Schutzgruppen in üblicher Weise abgespalten werden. Die Einsatzstoffe kommen vorzugsweise in equimolarem Verhältnis zur Anwendung.prepared in an aprotic solvent with a fluorescent xanthene dye, preferably fluorescein or substituted fluorescein and a Dihalogendisiloxan as a linker, the reaction mixture worked up and purified by conventional methods and the existing protecting groups are cleaved in a conventional manner. The starting materials are preferably used in equimolar ratio to the application.

Als Dihalogendisiloxane werden bevorzugt Dichlordisiloxano verwendet. Die Reaktion findet bei Temperaturen zwischen O0C und 50°C, insbesondere bei Raumtemperatur statt. Die Reaktionsdauer beträgt 12 h bis 48 h, bevorzugt 20 h bis 24 h.As Dihalogendisiloxane Dichlordisiloxano be used preferably. The reaction takes place at temperatures between O 0 C and 50 ° C, in particular at room temperature. The reaction time is 12 h to 48 h, preferably 20 h to 24 h.

Als dipolar aprotisches Lösungsmittel wird beispielsweise Pyridin oder Acetonitril verwendet.As a dipolar aprotic solvent, for example, pyridine or acetonitrile is used.

Zur vorstehenden Reaktion können Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, die δ'-substituiert als auch 3'-substituiert sind, vorzugsweise 3'-substituierte Pyrimidln- bzw. Purinderivate eingesetzt werden.For the above reaction, nucleosides, nucleotides and oligonucleotides which are δ'-substituted as well as 3'-substituted, preferably 3'-substituted pyrimidine derivatives or purine derivatives can be used.

Nach vollständiger Reaktion {dünnschichtchromatographische Reaktionskontrolle) wird das Reaktionsgemisch nach üblichen Methoden aufgearbeitet, indem zunächst das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das zurückbleibende Öi zwischen Wasser und Chloroform verteilt wird. Die Chloroformphase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Eine säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel führt zum Zielprodukt I.After complete reaction {thin-layer chromatography reaction control), the reaction mixture is worked up by conventional methods by first removing the solvent in vacuo and distributing the residual oil between water and chloroform. The chloroform phase is dried with anhydrous sodium sulfate. A column chromatographic purification on silica gel leads to the target product I.

Im Anschluß daran können unter milden alkalischen oder sauren Bedingungen am Nucleosid, Nucleotid oder Oligonucleotid befindliche Schutzgruppen abgespalten werden und die markierten Verbindungen über für Nucleinsäuren typische Verfahren, beispielsweise Gelchromatographie, goreinigt werden.Following this, protective groups present on the nucleoside, nucleotide or oligonucleotide may be cleaved under mild alkaline or acidic conditions and the labeled compounds gorinated via nucleic acid-typical procedures, such as gel chromatography.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine einfache Möglichkeit zur Einführung von Fluophoren in Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide dar. Es zeichnet sich dadurch aus, daß ausgehend von einem nach üblichen Verfahren synthetisierten Oligonucleotid, ohne Nutzung zusätzlicher Ankergruppen im Kohlenhydrat als auch in der heterocyclischen Base, die Einführung von Fluophoren direkt im Anschluß an die Oligonucleotidsynthese möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine milde Reaktionsführung aus.The process according to the invention represents a simple possibility for introducing fluorophores into nucleosides, nucleotides and oligonucleotides. It is characterized in that, starting from an oligonucleotide synthesized by conventional methods, without the use of additional anchor groups in the carbohydrate and in the heterocyclic base of fluorophores directly following oligonucleotide synthesis. The inventive method is characterized by a mild reaction.

Die bei dieser „Eintopfreaktion" entstehenden Produkte sind in hoher Reinheit und mit guten Ausbeuten erhältlich. Die Bindung zwischen Fluophor und Nucleosid, Nucleotid und Oligonucleotid ist stabil gegenüber milden sauren und milden alkalischen Einflüssen und erlaubt die Abspaltung von an Nucleosiden, Nucleotiden und Oligonucleotiden vorhandenen Schutzgruppen. Die dargestellten Stoffe sind neuartig und können als DNA-Sonden oder als Primer in der Gentechnik und Molekularbiologie zum Einsatz kommen.The products of this "one-pot reaction" are available in high purity and in good yields.The bond between the fluorophore and nucleoside, nucleotide and oligonucleotide is stable to mild acidic and mild alkaline influences and allows cleavage of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides The substances presented are novel and can be used as DNA probes or as primers in genetic engineering and molecular biology.

Die fluorimetrische Bestimmung der erfindungsgemäß markierten Verbindungen kann mit der bisher üblicherweise für fluoreszenzmarkierte Oligonucfeotide genutzte Technik erfolgen.The fluorimetric determination of the compounds labeled according to the invention can be carried out with the technique hitherto usually used for fluorescently labeled oligonucleotides.

AusführungsboispleleAusführungsboisplele

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne sie zu beschränken.The invention will be explained with reference to embodiments, without limiting it.

Beispiel 1example 1

253mg (0,73mmol) 3'-O-Benzoylthymidin und 269mg (0,73mmol) Fluoresceinmethylester werden mit Pyridin codestilliert und in 5 ml trockenem Pyridin aufgenommen. Nach Zugabe von 0,231 ml (0,73 mmol) 1,3-DiChIOr-IjI ,3,3-tetraisopropyldisiloxan wird die I ösung 24 h bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels Dü'inschichtchromatographie (Laufmittel: Chloroform/Methanol, 9/1, v/v). Die Reaktionsmischung wird eingeengt und mit Toluen codestilliert. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen, mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, die organische Phase mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es erfolgt die Reinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Chloroform mit steigendem Methanolgehalt) Ausbeute: 336mg (47,6% d. Theorie) S'-O-Benzoyl-ö'-O-e-O-d.i.SiS-tetraisopropyldisilox-I.S-diyD-fluoresceinmethylester-thymidin 1H-NMR, Massenspektrum253 mg (0.73 mmol) of 3'-O-benzoylthymidine and 269 mg (0.73 mmol) of fluorescein methyl ester are codistilled with pyridine and taken up in 5 ml of dry pyridine. After addition of 0.231 ml (0.73 mmol) of 1,3-DiChIOr-IjI, 3,3-tetraisopropyldisiloxane the solution is stirred for 24 h at room temperature with exclusion of moisture. The reaction is monitored by means of thin layer chromatography (mobile phase: chloroform / methanol, 9/1, v / v). The reaction mixture is concentrated and codistilled with toluene. The residue is taken up in chloroform, washed with saturated sodium bicarbonate solution, the organic phase is dried with anhydrous sodium sulfate and concentrated. Purification by column chromatography on silica gel (eluent: chloroform with increasing methanol content) Yield: 336 mg (47.6% of theory) of S'-O-benzoyl-O'-OeOd.i.SiS-tetraisopropyldisilox-IS-diyD- fluorescein methyl ester thymidine 1 H-NMR, mass spectrum

Beispielexample

41 mg (0,1 mmol) ß-O-Hydroxyethyl-fluoresceinmethylester und 35mg (0,1 mmol) 3'-0-Benzoylthymidin werden mit Pyridin codestilliert und in 3ml trockenem Pyridin aufgenommen. Nach Zugabe von 0,031 ml (0,1 mmol) 1,3-Dichlor-i,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan wird die Lösung bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Reaktionskontrolle und Aufarbeitung erfolgt wie unter Beispiel I.Ausbeute: 58 mg (58% d. Theorie) 3'-0-Benzoyl-5'-0-6-0-ethoxy-(1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-I.S-diyD-fluoresceinmethylester-thymidin41 mg (0.1 mmol) of β-O-hydroxyethyl-fluorescein methyl ester and 35 mg (0.1 mmol) of 3'-O-benzoylthymidine are codistilled with pyridine and taken up in 3 ml of dry pyridine. After addition of 0.031 ml (0.1 mmol) of 1,3-dichloro-i, 1,3,3-tetraisopropyldisiloxane, the solution is stirred at room temperature with exclusion of moisture. Reaction control and work-up are carried out as in Example I. Yield: 58 mg (58% of theory) of 3'-O-benzoyl-5'-O-6-O-ethoxy- (1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-IS -diyD-fluoresceinmethylester-thymidine

Massenspektrummass spectrum

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter1. A method for producing labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides under Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide der allgemeinen Formel IUse of fluorescent dyes, characterized in that the fluorescently labeled nucleosides, nucleotides and oligonucleotides of general formula I FO -(XL-O —Si — 0—Si —FO - (XL-O-Si - 0-Si - " I I"I R2 \ R 2 \ F = fluoreszierender Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein oder substituiertes Fluorescein, X = CH2F = fluorescent xanthene dye, preferably fluorescein or substituted fluorescein, X = CH 2 η = Obis 6η = Obis 6 Rn R2/ R3/ R4 = Alkyl-, substituiertes Alkyl-, Aryl-, substituiertes Aryl-, Alkoxy-, substituiertes Alkoxy-, Aryloxy- bzw. substituiertes Aryloxy- und bei R5 = a, R6 = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat,R n R 2 / R 3 / R 4 = alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, alkoxy, substituted alkoxy, aryloxy or substituted aryloxy and R 5 = a, R 6 = alkyl, aryl , Acyl, phosphate, substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R6 = a, R5 = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat,substituted phosphite, phosphonate, or when R 6 = a, R 5 = alkyl, aryl, acyl, phosphate, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R6 = a, R5 = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat oder R5 = R6 = a sowiesubstituted phosphate, phosphite, substituted phosphite, phosphonate, or when R 6 = a, R 5 = alkyl, aryl, acyl, phosphate, substituted phosphate, phosphite, substituted phosphite, phosphonate or R 5 = R 6 = a and B = Hetorocyclus mit einem Purin- bzw. Pyrimidingrundkörper ist, durch Umsetzung herkömmlich geschützter Nucleoside, Nucleotide oder Oligonucleotide der allgemeinen Formel Il mit der für R5 bzw. R6 angegebenen Bedeutung, in einem aprotischen Lösungsmittel mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff und einem Dihalogendisiloxan als Linker hergestellt werden und die Aufarbeitung und Reinigung sowie Abspaltung der Schutzgruppen nach üblichen Methoden erfolgt.B = heterocycle having a purine or pyrimidine skeleton, by reacting conventionally protected nucleosides, nucleotides or oligonucleotides of the general formula II with the meaning given for R 5 or R 6 in an aprotic solvent with a fluorescent xanthene dye and a dihalogen disiloxane as linker are prepared and the workup and purification and removal of the protective groups by conventional methods. B
(RB
(R (H)R.O(H) R.O 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleoside, Nucleotide oder
Oligonucleotide sowohl 5'-substituierte als auch 3'-substituierte, vorzugsweise 3'-substituierte
Pyrimidin- bzw. Purinderivate eingesetzt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that as nucleosides, nucleotides or
Oligonucleotides both 5'-substituted and 3'-substituted, preferably 3'-substituted
Pyrimidine or purine derivatives are used. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß als aprotische Lösungsmittel Pyridin oder Acetonitril verwendet werden.3. Process according to claims 1 to 2, characterized in that are used as aprotic solvent pyridine or acetonitrile. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszierende
Xanthenfarbstoffe vorzugsweise Fluorescein bzw. O-Hydroxyalkylether des Fluoresceins mit einem Alkylspacer von 1 bis 6 Methylengruppen zur Reaktion gebracht werden.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that as a fluorescent
Xanthenfarbstoffe preferably fluorescein or O-hydroxyalkyl ether of fluorescein are reacted with an alkyl spacer of 1 to 6 methylene groups. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Silylierungsmittel
bevorzugt Dichlordisiloxane eingesetzt werden.5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the silylating agent
Dichlorodisiloxanes are preferably used. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei
Temperaturen von 0cC bis 500C, insbesondere bei Raumtemperatur, und in einem Zeitraum von
12h bis 48h, bevorzugt 20h bis 24h, stattfindet.6. Process according to claims 1 to 5, characterized in that the reaction at
Temperatures of 0 c C to 50 0 C, especially at room temperature, and in a period of
12h to 48h, preferably 20h to 24h, takes place.
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